CN113227351A - 用于改善糖果利用的工程微生物菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了能够由选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源生产乳酸的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中基因工程酵母包括至少一个异源DNA盒，所述至少一个异源DNA盒使得产生作为果糖输入子的蛋白。根据本发明的基因工程酵母菌株相比常规菌株具有改善的果糖利用并且以更快的速率使用果糖，从而允许更短的发酵时间和改善的经济性。

Description

用于改善糖果利用的工程微生物菌株

相关申请的交叉引用

不适用

关于联邦资助的研究或开发的声明

不适用

联合研究协议

不适用

序列表的参考

序列表通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于化学生产的微生物的基因工程领域。更具体地，本发明涉及使用选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源，使用基因修饰的微生物生产乳酸。

背景技术

本发明人和他人已经工程化改造了马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)菌株以生产D-乳酸或L-乳酸(对于两个代表性示例，见美国临时专利申请62/631,541和US 7,534,597)。在除了美国专利申请62/631,541之外的所有现有技术示例中，在生物发酵中都使用右旋糖作为碳源。然而，在泰国和东南亚以及其他温带或热带地区(比如，巴西、中美、印度、美国南方等)，用于生物发酵的优选碳源是来自甘蔗汁的二糖蔗糖。类似地，在制糖用甜菜生长的温带地区，蔗糖可为用于生物发酵的优选碳源。

马克斯克鲁维酵母，以及许多其他酵母，比如酿酒酵母，将转化酶分泌到发酵培养基或周质空间中，该酶将蔗糖切割成两种单糖，D-葡萄糖(D-葡萄糖，也称为右旋糖，为简洁起见，在下文中将简称为葡萄糖)和D-果糖(为简洁起见，在下文中将简称为果糖)。然后将两种单糖输入酵母细胞并且代谢。

大多数微生物，包括刚刚提及的两种酵母物种，当与葡萄糖和任何其他碳源(比如，果糖)的混合物一起存在时，优选代谢葡萄糖。这种优选通常通过压制或抑制非葡萄糖碳源的利用来实现，所述压制或抑制非葡萄糖碳源的利用是通过给出了多种名称的几种不同机制中的任一种，比如葡萄糖抑制、葡萄糖压制、分解代谢物抑制、碳分解代谢物抑制和诱导物排除。我们注意到，在使用我们的生产D-乳酸或L-乳酸的菌株之一和蔗糖作为碳源的大多数发酵中，在发酵结束时，通常为约48小时通常在发酵液中残留一些果糖(见，图17)。果糖浓度典型地从约1g/L至约20g/L变化，而葡萄糖浓度通常低于检测限。这种模式证明了平均而言果糖比葡萄糖利用更慢，因为蔗糖的切割产生了等摩尔量的葡萄糖和果糖。不希望残留果糖的存在，因为它是一种还原糖并且因此可以在“美拉德反应(MaillardReactions)”和/或焦糖化反应中与氨基化合物反应，从而产生不希望的黄色和棕色化合物，这些化合物难以在乳酸的下游处理中除去。此外，残留果糖为废碳的形式，因为将其从废物流中回收是不切实际的。如果能够以更快的速率利用果糖，就可从蔗糖获得更高产率的产物。因此，出于以下两个良好的原因，改善的果糖利用将是有用的，1)减少不期望的副产物，以及2)获得更高产率的期望产物。

在生产D-乳酸或L-乳酸的马克斯克鲁维酵母发酵中通常看到残留果糖，然后我们显示了，当酿酒酵母酿酒菌株在用于乙醇生产的蔗糖或葡萄糖和果糖的混合物上生长时，会发生相同的现象。在葡萄糖已经完全消耗时，我们发现了残留的果糖。

对于一些商业细菌发酵，蔗糖仍为优选的碳源，并且发生类似的问题，即，在葡萄糖被消耗之后在发酵液中保留了残留的果糖(例如，见US 9,845,513中的图1)。

我们将使用短语“果糖问题”或“该果糖问题”来意指下面的现象，其中微生物菌株平均而言以比其消耗果糖更快的速率消耗葡萄糖，或在生长或发酵过程中的某一阶段在包含葡萄糖和果糖的培养基中的生长或发酵过程中的任何其他时间以比其消耗果糖更快的速率消耗葡萄糖。葡萄糖和果糖的混合物可以在生长或发酵开始时存在于培养基中，或所述混合物可在生长或发酵过程中通过蔗糖的水解产生。因此，由于上述葡萄糖对果糖利用的抑制，当许多微生物物种在作为碳源的蔗糖上生长时，所得葡萄糖比所得果糖消耗得更快，这使得使用蔗糖或含有葡萄糖和果糖的混合物进行的商业发酵，需要比仅使用葡萄糖的发酵进行更长的时间，以使所有的糖都被消耗并且转化为希望的产物，比如乙醇、一种或多种丁醇异构体、D-乳酸、L-乳酸、琥珀酸，苹果酸、柠檬酸、类胡萝卜素、异戊二烯、脂质或任何其他具有商业上感兴趣的化学品。本发明的目的是通过任何合适的或期望的微生物菌株增加果糖利用速率，所述微生物菌株用于从选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源的发酵。

现有技术

发明人不知道出于改进果糖利用的目的的商业酵母菌株的任何工程化。在巴西简单运行使用甘蔗汁和糖蜜以及常规酵母菌株进行乙醇发酵直到已经消耗了所有糖。认为在Cargill和BioAmber的商业L-乳酸和琥珀酸发酵使用基于葡萄糖的工程化的东方伊萨酵母酵母(Issatchekia orientalis)作为唯一碳源，因为亲本菌株不使用蔗糖。Cargill已经提交了美国专利申请，其描述了向它们的东方伊萨酵母酵母琥珀酸生产者中加入转化酶基因，但是所得菌株明显具有如以上定义的“果糖问题”(见WO 2017/091610 A1的图1)。WO2017/091610 A1还公开了通过产生转化酶的酵母生产“乳酸”的概念。然而，WO 2017/091610 A1没有区分D-乳酸与L-乳酸并且没有公开如何工程化酵母菌株以使用蔗糖或包含葡萄糖和果糖的混合物经济地生产D-乳酸或L-乳酸，或如何在经济上有吸引力的方法中，使用蔗糖或包含葡萄糖和果糖的混合物，通过这种酵母生产D-乳酸或L-乳酸。此外，WO2017/091610 A1忽略了公开由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的工程化菌株生产L-乳酸的现有技术，其中编码丙酮酸脱羧酶的一个或多个基因已经被缺失并且天然地分泌转化酶(US 7,049,108 B2)。虽然US 7,049,108 B2公开了生产L-乳酸或D-乳酸的概念，但是公开的菌株和方法再一次现在允许经济上有吸引力的方法，该发可与当前的商业方法竞争，例如使用细菌如凝结芽孢杆菌作为生产生物的那些方法(Poudel，2016#124)；Michelson，2006#123)。用于生产乳酸的异构体的“经济上有吸引力的”方法是一种由酵母菌株进行的方法，该酵母菌株能够从蔗糖和/或葡萄糖和果糖的混合物以至少110g/L的滴度生产D-乳酸或L-乳酸，终pH小于3.7，在48小时或更短时间内，糖的产率为至少0.75g/g。

US 2011/0256598提出了来自大肠杆菌的岩藻糖：H+同向转运蛋白，用于增加微生物中果糖的输入，但是发明人没有表明这种输入子在酵母中的用途，所以不清楚它在酵母中是否起作用。

(Pina，2004#121)描述了从拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)克隆编码果糖转运体的基因，该基因被指定为FFZ1(果糖促进接合酵母)。显示转运蛋白在酿酒酵母中起作用。然而，作者没有提及在蔗糖或葡萄糖和果糖的混合物上的生长，或在葡萄糖存在下改善的果糖利用。

(Zhou，2017#1)还表明了由来自甘蓝假丝酵母(Candida magnoliae)的“ffziI”或“fsy1”编码的果糖输入子在酿酒酵母(S.cerevisiae)中的功能，并且提出了它们用于在设计为从棉子糖生产蜜二糖的菌株中帮助消耗果糖的用途，但是，作者也没有提及在蔗糖或葡萄糖和果糖的混合物上的生长，或在葡萄糖的存在下改善果糖利用。

因此，仍然需要当蔗糖或葡萄糖和果糖的混合物作为显著的碳源存在于发酵培养基中时，具有改善的果糖利用的微生物菌株。

发明内容

本发明的目的，即通过多种微生物菌株改善在存在葡萄糖的情况下果糖的利用，通过引入设计成表达来自鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的基因FFZ1(在下文中我们将其称为ZrFFZ1)的基因盒来实现，该酵母克隆自所谓的嗜果糖酵母，嗜果糖酵母为以比它消耗葡萄糖更快的速率天然消耗果糖的酵母。如何在期望的异源生物体中实现FFZ1基因的有用水平的表达(如通过在存在葡萄糖的情况下增加的果糖利用速率所测量的)不是显而易见的，如之前公开的来自拜耳接合酵母的FFZ1基因(其将被称为ZbFFZ1)在马克斯克鲁维酵母中在与包含ZrFFZ1基因的构建体平行的构建体中不是功能上可测量的。

在本文公开的发明中，有出人意料的发现，即向非嗜果糖酵母中添加表达的FFZ1基因相对于葡萄糖利用增加了它们的果糖利用速率，尽管亲本酵母菌株已经具有利用果糖的固有能力。这种改善对于在更短的发酵时间内更完全利用果糖是有用的。

本发明公开了基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，该酵母菌株能够由选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源生产乳酸，其中基因工程酵母包含至少一个异源DNA盒，所述至少一个异源DNA盒使得产生用作果糖输入子的蛋白。根据本发明的基因工程酵母菌株具有改善的果糖利用并且以比常规菌株更快的速率使用果糖以及以比常规菌株更快的速率使用果糖，从而能够实现更短的发酵时间和改善的经济性。

附图说明

图1、用于缺失NEJ1的DNA盒的结构。

图2、用于在染色体4上的ADH2基因座处整合和表达FFZ1的DNA盒的结构。

图3A和图3B、分别在12％蔗糖培养基中以及在6％葡萄糖和6％果糖培养基中，由衍生自MYR2785的含有设计为表达ZbFFZ1或ZrFFZ1的整合盒的菌株在BioLector发酵中使用的果糖与使用的葡萄糖的比率。

图4、pMS155的结构，其含有设计为用PaldhL表达盒替换SD1774中的三个EcldhA表达盒中任一个的盒，以将本发明的生产D-乳酸的菌株转化为生产L-乳酸的菌株。

图5、用于表达通过在KmADH6开放阅读框的中间插入而整合的ZrFFZ1的盒JSS89的结构。

图6、设计为表达在KmADH6处整合ZrFFZ1同时缺失KmADH6开放阅读框的盒JSS90的结构。

图7、通过含有JSS89或JSS90盒的菌株在含有12％蔗糖培养基的BioLector发酵中在75小时的[使用的果糖]/[使用的葡萄糖]。

图8、在用碳酸钙缓冲的摇瓶中生长96小时的含有整合的ZrFFZ1表达盒的生产L-乳酸的菌株的[使用的果糖]/[使用的葡萄糖]之比。

图9、在微需氧条件下在含有12％蔗糖的基本培养基中生长的Ethanol Red的糖的消耗。

图10、在微需氧条件下在含有6％果糖加6％葡萄糖的基本培养基中生长的Ethanol Red的糖的消耗。

图11、pRY789的结构，pRY789为含有用于在酿酒酵母的HO基因座处整合ZrFFZ1的盒的质粒。

图12、在微需氧条件下在含有6％果糖和6％葡萄糖的基本培养基中生长的没有引入或引入来自pRY789的ZrFFZ1表达盒的Ethanol Red的果糖和葡萄糖利用。

图13、7升发酵罐中菌株JSS1397和KMS1017的L-乳酸滴度的比较。

图14、菌株JSS1397和KMS1017的7升发酵罐中的果糖浓度的比较。

图15、7升发酵罐中菌株JSS1397和KMS1017的葡萄糖利用速率与果糖利用速率之比。

图16、7升发酵罐中L-乳酸滴度对pH，其中溶解度限制显示为实线。

图17、含有ZrFFZ1盒(菌株SD1755)、两个ZrFFZ1盒(MYR2879)和不含有这种盒(菌株MYR2785)的生产D-乳酸的酵母菌株在控制pH的7升发酵中的残留果糖浓度，初始分批进料为180g/L蔗糖。

图18、pBc-ldhL-OP2-int的结构，其含有设计为用BcldhL表达盒替换MYR2787中的三个EcldhA表达盒中任一个的盒，以将本发明的生产D-乳酸的菌株转化为生产L-乳酸的菌株。

图19、含有ZrFFZ1盒(菌株JSS1397)和不含有ZrFFZ1盒(菌株MYR2893)的生产L-乳酸的酵母菌株在控制pH的5升发酵中的残留果糖浓度，两者的初始分批进料为216.7g/L甘蔗汁。

图20、含有两个ZrFFZ1盒(菌株JSS1397)以及含有两个ZrFFZ1盒和KmRAG5(MYR3059)的生产L-乳酸的酵母菌株在控制pH的5升发酵中的残留果糖浓度，初始分批进料为150g/L蔗糖。

图21、含有两个ZrFFZ1盒(菌株JSS1397)以及含有两个ZrFFZ1盒和KmRAG5(菌株MYR3059)的生产L-乳酸的酵母菌株在控制pH的5升发酵中的L-乳酸浓度，初始分批进料为150g/L蔗糖。

具体实施方式

当存在果糖和葡萄糖的混合物时，相对少量的酵母物种相比葡萄糖更倾向于利用果糖。这种酵母称为“嗜果糖细胞(Fructophile)”，视为是“嗜果糖的(Fructophilic)”，或视为表现出“嗜果糖性(Fructophily)”。嗜果糖酵母的示例为接合酵母(Zygosaccharomyces)属的成员，比如鲁氏接合酵母(Z.rouxii)和拜耳接合酵母(Z.bailii)(Leandro，2014#6)、威克汉姆氏菌(Wickerhamiella)属/斯塔默氏菌(Starmerella)属或W/S进化枝的成员(Goncalves，2018#4)以及假丝酵母属(Candida)中的一些酵母，比如马氏假丝酵母(Candida magnoliae)(Zhou，2017#1))。

许多(如果不是全部的话)嗜果糖酵母的特有特征是FFZ1基因或其同源物。该组FFZ1基因及其同源物编码对果糖具有特异性的高容量但是低亲和力的单向转运体(也称为“促进的扩散子”或简称为“促进子”)。我们将这种果糖输入子蛋白称为Ffz1。Ffz1蛋白为膜蛋白，其用于促进果糖沿浓度梯度扩散进入细胞中，其后果糖可被代谢。野生型非嗜果糖酵母，比如马克斯克鲁维酵母(K.marxianu)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，由于具有己糖输入子和使用果糖的代谢途径而具有代谢果糖的能力。然而，如名字所暗示的，典型的己糖转运子(由比如来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的HXTn的基因编码，其中n为1至17的整数)及其同源物和类似物也转运葡萄糖，并且因为多种因素，包括基因表达的调节、蛋白质活性以及亲和力差异，大多数或所有的HTXn编码的己糖转运子相对于果糖更偏好葡萄糖。由于Hxtn输入子蛋白可帮助将葡萄糖和果糖两者扩散到细胞中，因此两种糖最终很大程度上在基于酿酒酵母的发酵中被消耗，在该发酵中果糖和葡萄糖都存在，比如甘蔗糖(和/或糖蜜)锡乙醇发酵。对于主要基于马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)的发酵，情况也是如此，它们也使用HTXn同源物用于己糖输入。然而，在这种发酵中，葡萄糖消耗速率通常高于果糖消耗速率。在任何情况下，对于一些工业发酵，比如生产比如商业上感兴趣的燃料乙醇、一种或多种丁醇异构体、D-乳酸、L-乳酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、类胡萝卜素、异戊二烯或脂质的产物的那些发酵，仍然需要通过增加不是天然嗜果糖的酵母菌种和菌株消耗果糖的速率来缩短发酵时间，尤其是当培养基中也存在葡萄糖时。

本文现将描述本公开的各种非限制性实施方式并且阐释在附图中。本领域普通技术人员将理解，可将结合一个非限制性实施方式描述或说明的特征、结构、组件或特性与一个或多个其他非限制性实施方式的特征、结构、组件或特性组合。这种组合旨在包括在本公开的范围内。本领域普通技术人员还将理解，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可修改或改变结合一或多个非限制性实施方式描述或阐释的特征、结构、组件或特性。

为了便于理解本发明，下面提供命名法的描述。

关于命名法，细菌基因或编码区通常用斜体小写字母命名，例如来自大肠杆菌的“ldhA”，而由该基因编码的酶或蛋白可用相同的字母命名，但是首字母为大写且不为斜体，例如“LdhA”。酵母基因或编码区通常用斜体大写字母命名，例如“PDC1”，而由该基因编码的酶或蛋白可以用相同的字母命名，但是首字母大写且不为斜体，例如“Pdc1”或“Pdc1p”，后者为在酵母中用于指定酶或蛋白的惯例的示例。“p”为由指定基因编码的蛋白的缩写。酶或蛋白也可用更多描述性名称来指代，例如D-乳酸脱氢酶或丙酮酸脱羧酶，分别指上述两个示例。由于历史上不同的来源、功能上冗余的基因、基因调控的不同或因为这些基因来自不同的物种，编码具有特定催化活性的酶的一个示例的基因或编码区可具有若干不同的名称。例如，编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因可命名为GPD1、GDP2或DAR1以及其他名称。为了具体指代特定基因来源的生物体，基因名称可指示属和种的两个字母作为开头。例如，KmURA3基因来源于马克斯克鲁维酵母，ScURA3基因来源于酿酒酵母，EcldhA基因来源于大肠杆菌，PaldhL基因来源于乳酸片球菌(Pediococcus acidilacti)，并且BcldhL来源于凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。对于在特定基因中含有突变或具有突变表型的酵母菌株，该基因或菌株通过小写斜体字母来命名，例如，ura3或ura3-用于缺少功能性URA3基因的菌株。

应注意，乳酸和任何乳酸类似物的所有异构体都可作为质子化酸(也称为游离酸)或离子化盐以固体、液体或溶液形式存在。在水溶液中，质子化和离子形式平衡共存。由于在每种情况下提及这种化合物的所有形式很复杂，因此任何提及的酸形式或盐形式(例如，D-乳酸(D-LAC)、D-乳酸盐、L-乳酸(L-LAC)、L-乳酸盐或D、L-β-氯乳酸盐)包括其所有形式或混合物。

为了便于理解本发明，以下定义了许多术语，并且其他术语可以在说明书的其他地方找到。

“酵母”意指能够在一些条件下以单细胞状态生长的任何真菌生物。一些酵母菌株也可在一些条件下(比如，在饥饿条件下)以菌丝状态或假菌丝(即，短菌丝)状态生长。尤其，酵母包括，但不限于，酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、耶氏酵母属(Yarrowia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和拉钱斯氏酵母属(Lachancea)的生物。

“盒(cassette)”或“表达盒”意指脱氧核糖核酸(DNA)序列，当将其引入在宿主生物中时，该序列能够编码、产生或过量产生，或可选地，消除或降低一种或多种期望蛋白质或酶的活性。用于产生蛋白或酶的盒典型地包括至少一个启动子、至少一个蛋白编码序列(也称为“开放阅读框”或“ORF”)并且任选地至少一个转录终止子。如果待表达的基因为异源的或外源的，则启动子和终止子通常源自两个不同的基因或异源基因，以防止与启动子或终止子所源自的天然基因发生双重重组。盒可任选地并且优选地在任一端或两端含有一个或两个侧翼序列，该侧翼序列与宿主生物体中的DNA序列(“靶标”序列)同源，使得该盒可与宿主生物体(与染色体或质粒)在靶序列处进行同源重组，使得盒在靶序列处被整合到所述染色体或质粒中。如果仅盒的一端含有侧翼同源性，则环形形式的盒可通过侧翼序列处的单一重组来整合。如果盒的两端都含有侧翼同源性，则线性或环形形式的盒可通过与周围侧翼的双重重组来整合。可通过基因工程来构建构建盒，其中例如编码序列由非天然启动子表达，或其可使用天然相关的启动子。盒可以构建到质粒中，所述质粒可为环状的，或所述质粒可为通过聚合酶链式反应(PCR)、引物延伸PCR，或通过DNA片段末端之间的体内或体外同源重组产生的线性DNA，其中每一个都是期望的最终盒的一个子集，其中每个子集片段在任一端或两端具有重叠同源性，设计为在体外或在体内通过同源重组导致相邻片段的连接。可将盒设计为包括选择性标记基因或DNA序列，其在整合后被约30个或更多个碱基对的同向重复序列围绕(相同的序列，以相同的方向存在于整合的选择性基因的两端)，使得在将含有选择性标记的初始盒整合到染色体或质粒中之后，选择性标记可以通过同向重复之间的同源重组(也称为“环出”)而缺失。有用的选择标记基因包括，但不限于，抗生素G418抗性(kan或kanR)、潮霉素抗性(hyg或hygR)、博来霉素抗性(zeo或zeoR)、自然毒素(naturicin)抗性(nat或natR)和生物合成基因，比如URA3、TRP1、TRP5、LEU2和HIS3。对于用作选择性标记的生物合成基因，宿主菌株当然必须在相应基因中含有突变，优选非回复无效突变。例如，如果使用URA3作为选择性标记基因，那么待转化的菌株必须是表型ura3-。对于抗生素抗性基因，该抗性基因通常需要在宿主微生物菌株中起到足够好的作用以使得能够进行选择的启动子。尽管可将期望被表达的基因以盒的形式引入在宿主菌株中，但是可将例如从起始密码子到终止密码子的编码序列的基因整合到宿主染色体或质粒中，而没有启动子或终止子，使得进入的编码序列精确地或大致地替代宿主菌株的天然基因的编码序列，从而在整合后，进入的编码区从被进入的编码序列替换的宿主编码序列的其余启动子开始表达。

在本文描述的一些示例中，通过用大致等摩尔浓度的两个或更多个线性DNA片段的混合物转化酵母菌株而在体内组装表达盒，这些片段在细胞内通过使用“重叠同源性”的同源重组连接在一起，其中在子集片段的每一端的相对短的DNA序列(约20至50个碱基对)与最终组装盒中相邻子集片段的序列完全相同，或与最终组装盒的5’和3’端的染色体靶序列完全相同。许多酵母菌株(包括马克斯克鲁斯酵母和酿酒酵母)具有将多个子集片段装配到最终盒中并且将装配好的盒整合进染色体靶标中的能力，所有这些都是通过“重叠同源性”之间的同源重组实现的。

“D-乳酸脱氢酶”意指催化由丙酮酸形成D-乳酸的任何酶。“L-乳酸脱氢酶”意指催化由丙酮酸形成L-乳酸的任何酶。用于这些反应中任一种的必需的还原当量可由NADH、NADPH或任何其他还原当量供体来提供。

“吉布森方法(Gibson method)”意指用于将在其末端具有短(约15-40个碱基对)重叠同源性的两个或更多个线性DNA片段体外连接在一起的方法。该方法可用于从合成的线性DNA片段、PCR片段或由限制酶产生的片段来构建质粒。可购买试剂盒来，例如NEBuilder HiFi DNA套件克隆试剂盒(New England BioLabs，Ipswitch，马萨诸塞州，美国)，并且根据制造商的指示使用来进行吉布森方法。

“转化体”意指通过将期望的DNA序列(线性或环形，并且自主复制或不自主复制)引入到宿主或亲本菌株中而产生的细胞或菌株。

“滴度”意指化合物在发酵液中的浓度，通常表示为克/升(g/L)或表示为％重量/体积(％)。通过任何适合的分析方法，如定量分析色谱法，例如高压液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC)，用由外标物制成的标准曲线，以及任选地用内标物来确定滴度。

“产率”意指在发酵过程中使用每克碳源产生的产物的克数。这通常基于滴度、最终液体体积和供应的碳源的量来计算，其中最终体积针对取样、进料和/或蒸发的体积进行校正。其通常表示为克/克(g/g)或表示为％重量/重量(％)。

“时间”意指在发酵中从接种到取样或收获所耗费的时间，通常以小时测量。

“比生产率”意指在给定时间段内在给定体积的发酵液中产生的产物(以克计的产物)形成速率，通常以克每升-小时(g/L-hr)表示。“平均比生产率”意指其中的时间段是从接种到取样或收获的整个发酵的比生产率。平均比生产率低于发酵中间的比生产率，因为早期生长期和后续阶段比生产率低于平均值。能够通过最终滴度除以收获时的小时数来计算平均比生产率。应注意，尽管未明确给出测量时间段，但是一些公开的比生产率明显示不是平均的比生产率(见表1的一些实施例)。

“pKa”意指溶液中的酸一半为共轭碱状态(其通常为离子或盐形式)时的pH。L-LAC和D-LAC的pKa公开为3.78至3.86，但准确的pKa可随温度、浓度和其他溶质的浓度稍有变化。对于乳酸，共轭碱状态是乳酸根离子，所以pKa是其中乳酸根离子的浓度等于质子化或“游离酸”状态的浓度的pH。可通过进行酸碱滴定并且取滴定曲线的中点的公知方法来测量pKa。本领域技术人员将知道，在水溶液中，D-乳酸和L-乳酸在某种程度上都以两种形式存在，即质子化酸形式和离子化盐(即，共轭碱)形式。因此，根据上下文，术语“D-乳酸盐”、“D-乳酸”和“D-LAC”可指两种形式的任一种形式或混合物。尤其，当讨论滴度和产率时，意在包括两种形式的总和，但它以游离酸表示，换言之，滴度和产率表示为存在的任何盐形式转化为游离酸形式。

“异源”意指不是自然或天然存在于生物体中，但是可通过基因工程(比如通过转化、交配或转导)而引入生物体中的基因或蛋白质。异源基因可被整合(即，插入或引入)到染色体中，或包含在质粒上。术语“外源的”意指为了增加、减少或消除活性，通过基因工程(如通过转化、交配、转导或诱变)已经被引入生物体中或在生物体中发生改变的基因或蛋白。外源基因或蛋白可为异源的，或其可为宿主生物体中天然存在但是通过一种或多种方法改变的基因或蛋白，例如，突变、缺失、启动子改变、终止子改变、复制或在染色体中或在质粒中插入一个或多个另外的拷贝。因此，例如，如果DNA序列的第二拷贝插入到染色体中不同于天然位点的位点处，则该第二拷贝就是外源的。

“质粒”意指总体上小于染色体的，与微生物的一个或多个染色体分离的，并且与一个或多个染色体分开复制的环状或线性DNA分子。质粒可以以约一个拷贝/细胞或以多于一个拷贝/细胞存在。将质粒维持在微生物细胞内通常需要培养基中生长，该培养基例如利用抗生素抗性基因或染色体营养缺陷型的互补来选择质粒的存在。然而，一些质粒不需要用于稳定维持的选择压力，例如在许多酵母菌属菌株中的2微米环状质粒。

“染色体”或“染色体DNA”意指总体上大于质粒并且通常不需要任何抗生素或营养选择的线性或环状DNA分子。在本发明中，酵母人工染色体(YAC)可用作用于引入异源和/或外源基因的载体，但是其需要选择压力以用于维持。

“过表达”意指使得由基因或编码区编码的酶或蛋白在宿主微生物中在相同或相似的生长条件下以比在宿主微生物的野生型版本中发现的水平更高的水平产生。这可通过例如以下方法中的一种或多种来实现：引入更强的启动子，引入更强的核糖体结合位点，引入终止子或更强的终止子，改善编码区中一个或多个位点处的密码子选择，通过在染色体中引入多个拷贝或将盒置于多拷贝质粒上来提高mRNA稳定性，或增加基因的拷贝数。由过表达的基因产生的酶或蛋白被称为“过量产生的”。过表达的基因或过量产生的蛋白可为宿主微生物天然的基因，或可为通过基因工程方法从不同的生物体移植到宿主微生物中的微生物，在这种情况下，该酶或蛋白以及编码该酶或蛋白的基因或编码区被称为“外源的”或“异源的”。外源或异源基因和蛋白根据定义是过表达和过量产生的，因为它们不存在于未经过基因改造的宿主生物体中。

“同源物”意指通过序列同源性与不同的第一基因、DNA序列或蛋白质相关的第二基因、DNA序列或蛋白质序列，其中当比对蛋白质序列或比对源自基因序列的蛋白质序列时，所述第二序列具有至少25％的序列同一性，或当将DNA序列与所述第一基因、DNA序列或蛋白质序列进行比对时，具有至少50％的同一性，如通过用于序列比对的基本局部比对算法的搜索工具(BLAST)计算机程序(Altschul，1990#332；Altschul，1997#334)确定的，并且允许缺失和插入。马克斯克鲁维酵母PDC1基因的同源物的示例将是来自酿酒酵母的PDC1基因。“功能同源物”是第二DNA或蛋白质序列，其是所述第一DNA或蛋白质序列的同源物并且已经或能够显示出具有与所述第一DNA或蛋白质序列相同或相似的功能。

“类似物”意指执行与另一个基因、DNA序列或蛋白质的生物功能类似的生物功能的基因、DNA序列或蛋白质，但其中与所述另一基因、DNA序列或蛋白质具有小于25％的序列同一性(当比对蛋白质序列或比对源自基因序列的蛋白质序列时)，如用于序列比对的BLAST计算机程序测定的(Altschul，1990#26；Altschul，1997#17)，并且允许缺失和插入。马克斯克鲁维酵母Gpd1蛋白的类似物的一个示例是马克斯克鲁维酵母Gut2蛋白，因为这两种蛋白都是催化相同反应的酶，但是在两种酶或它们各自的基因之间不存在显著的序列同源性。本领域普通技术人员知道，许多具有特定生物学功能的酶和蛋白质(在上文刚刚提到的示例中，甘油-3-磷酸脱氢酶)可以在许多不同的生物体中找到，作为同源物或类似物，并且因为这种酶或蛋白质家族的成员共享相同的功能，尽管它们可以在结构上略微或实质上不同。在许多情况下，使用目前的基因工程方法，相同家族的不同成员可用于执行相同的生物功能。因此，例如，编码D-乳酸脱氢酶的基因可以从许多不同生物体的任一种获得。

“突变”意指来自天然或亲本DNA序列的任何改变，例如倒置、重复、一个或多个碱基对的插入、一个或多个碱基对的缺失、导致产生提前终止密码子的碱基变化的点突变或在编码的氨基酸的位置处发生改变的错义突变。“无效突变”意指有效消除基因功能的突变。编码区的完全缺失将是无效突变，但是单个碱基改变也可导致无效突变。“突变体”、“突变的菌株”、“突变的酵母菌株”或“已经发生突变的菌株”意指当与天然、野生型、亲本或前体菌株相比时包含一个或多个突变的菌株。

短语“消除或降低功能的突变”意指当测量基因、蛋白质或酶的任何可测定参数或输出并与未突变的亲本菌株相比时，降低所述基因、蛋白质或酶的任何可测定参数或输出(比如，菌株的mRNA水平、蛋白质浓度或特异性酶活性)的任何突变。这种突变优选是缺失突变，但是其可为实现功能期望的消除或减少的任何类型的突变。

“强组成型启动子”意指典型地位于由RNA聚合酶转录的DNA序列或基因上游的DNA序列(当以常规的5’至3’方向描绘时，位于基因的5’侧)，并且使得所述DNA序列或基因通过由RNA聚合酶以易于直接或间接通过任何合适的测定程序检测的水平转录来表达。适当的测定程序的示例包括定量逆转录酶加PCR、编码酶的酶测定、考马斯蓝染色的蛋白质凝胶或作为所述转录的结果间接产生的代谢物的可测量的产生，并且无论特异性调节转录水平的蛋白、代谢物或诱导剂化学品的存在与否，这种可测量的转录都会发生。通过使用公知的方法，可使用强组成型启动子来替换天然启动子(在DNA序列或基因的上游天然存在的启动子)，得到表达盒，该表达盒可以位于质粒或染色体中，并且以高于来自天然启动子的水平提供期望DNA序列或基因的表达水平。强组成型启动子可为种或属特异性的，但是来自酵母的强组成型启动子通常在远缘酵母中能够很好地发挥作用。例如，来自棉囊阿舒氏酵母(Ashbyagossypii)的TEF1(翻译延伸因子1)启动子在许多其他酵母属(包括马克斯克鲁维酵母)中良好发挥作用。

“微需氧的”或“微需氧发酵条件”意指向发酵罐供应空气小于0.1体积空气/体积液体培养液/分钟(vvm)。

“化学成分明确的培养基”、“基本培养基”或“矿物质培养基”意指包括提供必需元素如氮、硫、镁、磷(并且有时包含钙和氯化物)的纯化学物质如矿物盐(例如，钠、钾、铵、镁、钙、磷酸盐、硫酸盐、氯化物等)，维生素(当微生物生长需要或刺激时)，一种或多种纯碳源比如纯糖、甘油、乙醇等，微生物生长所需的或刺激性的痕量金属(比如，铁、锰、铜、锌、钼、镍、硼和钴)，和任选的渗透保护剂比如甘氨酸甜菜碱(也称为甜菜碱)的任何发酵培养基。除了任选的渗透保护剂和维生素之外，这种培养基不含有对于正在发酵的微生物的生长并非必需的大量任何营养物质或多于一种营养物质的混合物。这种培养基不含任何大量丰富或复杂的营养混合物，比如酵母提取物、蛋白胨、蛋白质水解产物、糖蜜、肉汤、植物提取物、动物提取物、微生物提取物、乳清、菊芋粉等。对于通过发酵生产商品化的化学品，通过简单蒸馏纯化期望的化学品并不是经济上有吸引力的选择，基本培养基优于丰富培养基，因为基本培养基通常较便宜，并且发酵结束时的发酵液通常含有较低浓度的需要从期望的化学品中纯化出来的不需要的污染化学物质。

“发酵生产培养基”意指在使微生物生长以产生期望的产物(例如D-LAC或L-LAC)的过程中，在包括一个或多个罐、容器或发酵罐的一系列中的最后一个罐、容器或发酵罐中使用的培养基。对于通过发酵生产比如D-LAC或L-LAC的商品化化学品，在需要或期望充分纯化的情况下，作为基本培养基的发酵生产培养基优于丰富培养基，因为基本培养基通常比较便宜，而且发酵结束时的发酵液通常含有较低浓度的需要从期望的化学物质中纯化出来的不需要的污染化学物质。尽管通常优选使这种发酵中的富营养物质的浓度最小化，但是在一些情况下，使接种体培养物在不同于发酵生产培养基的培养基中生长的总体方法是有利的，例如，生长相对少量(通常为发酵生产培养基体积的10％或更少)的在包含一种或多种富集成分的培养基中生长的接种物培养物。如果接种体培养物的体积相对于生产培养物要小，则可以将接种体培养物的富集组分稀释到发酵生产培养基中至它们基本上不干扰期望的产物的纯化的程度。发酵生产培养基必须含有碳源，其通常是糖、甘油、脂肪、脂肪酸、二氧化碳、甲烷、醇或有机酸。在一些地方，例如在美国中西部，D-葡萄糖(右旋糖)相对便宜，并且因此用作碳源。关于通过酵母生产乳酸的现有技术出版物大多数使用右旋糖作为碳源。然而，在一些地方(比如，巴西和大多数东南亚地区)，蔗糖比右旋糖更便宜，所以在那些地区蔗糖是优选的碳源。

“最终pH”意指当发酵视为完成、发酵停止和收获发酵液时，在发酵结束时发酵液的pH。虽然优选乳酸发酵的最终pH低于乳酸的pKa，但是还优选的是在发酵过程中通过加入“碱”(碱性物质)来控制pH，以防止pH过快地下降或发酵结束时pH过低。该“碱”可为溶液、悬液、浆料或固体形式。该“碱”可为钠、铵、钾、镁或钙的氢氧化物、氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐。对于乳酸的生产，优选的碱是氢氧化钙的浆料或粉末状氢氧化钙，这使得在发酵液中形成与质子化酸形式混合的一些乳酸钙。可以用硫酸处理发酵结束时得到的发酵液，引起硫酸钙(石膏)的沉淀，这有助于去除钙，从而增加以质子化形式存在的乳酸的比例。为了控制pH而加入碱可以手动地加料或通过自动控制的泵或螺旋输送器进加料，如通过pH测量所要求的，其可以手动地或通过经由浸入发酵容器中的pH探针的连续监测来获得。

为了便于理解本发明，在表1中列出了多种基因。

一般方法和材料。除非另有说明，否则重组DNA和基因工程用本领域熟知的方法和材料进行。利用“吉普森方法(Gibson method)”使用NEBuilder HiFi DNA套装克隆试剂盒(New England Biolabs)根据制造商的方案，或通过如上所述的体内同源重组来组装质粒和线性DNA盒。对于盒的体内组装，以大致等摩尔的混合物提供子集DNA片段，理想地含有总共至少500ng的DNA。因此，例如，来自两个长度为1000bp(碱基对)和2000bp的子集片段的盒的体内组装应当分别使用至少166ng和333ng的两种片段。体内待组装的片段数目越大，就需要越多的DNA以增加获得成功组装的概率。在一种极端情况下(见实施例5)，在一次转化中体内组装和整合了六个片段。六个片段的DNA的总量为约5μg，获得了约40个转化体，并且这40个转化体中的约10个具有期望的整合结构。用于组装线性盒或质粒的所有组分或“子集”DNA片段(在适当情况下包括质粒骨架)视情况通过以下三种方法之一产生：1)通过根据供应商的说明书从前体DNA序列进行限制酶切割，2)根据制造商的方案，通过PCR(聚合酶链式反应)使用Phusion高保真PCR反应混合物(New England Biolabs)或3)由IntegratedDNA Technologies，Inc.进行的gBlock的商业合成。

通过诊断性限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳(例如,在由Qiagen MiniprepKits产生的质粒的情况下)；或通过适当的诊断型PCR，例如其中PCR产物与两个或更多个相邻前体片段的连接点杂交以确认正确连接；以及琼脂糖凝胶电泳，根据供应商的方案使用Phusion高保真PCR反应混合物(New England Biolabs)或Phire Plant PCR反应混合物试剂盒(ThermoScientific)来鉴定和/或确认正确的构建体。通过适当的诊断型PCR鉴定整合到酵母染色体中的盒的正确结构，例如其中第一PCR引物从待整合的盒内向外读取，而第二引物从位于靶向的整合位点侧翼但不包含在待整合的盒中的相邻染色体序列朝向整合连接点和第一PCR引物阅读。可以在全细胞(例如，大肠杆菌或含有质粒或整合的线性DNA盒的酵母转化体)上进行鉴定正确DNA结构的诊断型PCR。用牙签或微量移液器尖端从培养皿上的菌落中挑取大约一至两微升的细胞体积，并且将这些细胞悬浮在来自Phire Plant PCR反应混合物试剂盒(ThermoScientific)的20微升无菌水或“稀释缓冲液”中。然后在20或25微升(总体积)PCR反应中使用一微升这种细胞悬液作为模板DNA持续25至40个循环。可选地，通过在微量离心机中沉淀大约100微升饱和液体培养物，弃上清，并将细胞沉淀重悬于20微升无菌水或稀释缓冲液中，可以获得大约相等数量的细胞用作模板DNA。

在一些情况下，例如其中诊断型PCR指示正确的结构，但其他证据指示缺乏预期功能的情况下，对盒的全部或部分，或从质粒携带的或染色体整合的盒扩增的PCR产物进行测序以确认或否认期望的或预期的DNA序列。许多商业公司能够提供DNA测序服务，例如GeneWiz，Cambridge，MA，USA。

为了缺失DNA序列或整合表达盒，我们通常使用的方法是将该盒组装在可以在大肠杆菌中复制的质粒上，或通过共转化该盒的两个或更多个子区段(subsection)从而在靶标酵母菌株中在体内组装该盒，其中相邻的子区段被设计成在待连接的末端处重叠40至60个碱基对，以及在组装的盒的末端与染色体靶序列同源的40至60个碱基对。将在此所述的用于整合在马克斯克鲁维酵母染色体中的所有盒设计为表达酵母URA3基因(通常为ScURA3基因或天然KmURA3基因)，并且该受体宿主生物具有非回复(non-reverting)ura3-表型，通常是由于在天然KmURA3基因座处的缺失。为了能够在随后的工程化步骤中重新使用URA3+选择，在每个盒中，用同向重复DNA序列围绕URA3基因，该同向重复DNA序列允许在URA3基因已经被整合之后从该盒中缺失该URA3基因，通过在所述同向重复的DNA序列之间的同源重组，在第二步中通过在含有5’-氟乳清酸的基本培养基上针对URA3基因进行选择(详见美国专利申请62/631，541)。因此，整合盒被设计为在染色体靶位点处插入两个特定碱基对之间，当在质粒中组装或直接组装到酵母染色体中时，其按顺序具有以下子区段或前体DNA片段的一般结构：1)与恰好在期望的整合靶位点上游的靶染色体序列同源的40个或更多个碱基对的序列，在图中标记为“上”，2)期望整合的DNA序列，例如启动子-ORF-终止子组合，3)与恰好在期望的整合靶位点下游的靶染色体序列不同源的40个或更多个碱基对的序列“DR”(用于同向重复)，4)选择性基因，比如URA3基因，5)片段3的DR序列的第二拷贝，和6)与恰好在期望的整合靶位点下游的靶染色体序列同源的40个或更多个碱基对的序列，在图中标记为“下”。在这种情况下，该盒通过“上”与“下”之间的双重同源重组整合。在对选择性基因进行反选择时，“DR”的两个拷贝之间的同源重组导致选择性基因的环出，从而在染色体靶标处的两个特异性碱基对之间精确插入的期望的序列。

在可选的盒设计中，其中期望缺失染色体靶位点处的DNA序列，当组装时，该盒将按顺序具有以下子区段或前体DNA片段：1)与恰好在期望的整合靶位点上游的靶染色体序列同源的40个或更多个碱基对的序列，在图中标记为“上”，2)期望整合的DNA序列，例如启动子-ORF-终止子组合，3)与恰好在期望的缺失端点下游的靶染色体序列同源的40个或更多个碱基对的序列“下”，4)选择性基因，比如URA3基因，5)与期望缺失的染色体靶序列的至少一部分同源的至少40个碱基对的DNA序列“中间”。在需要纯缺失(clean deletion)而不需要插入DNA的情况下，则省略该设计的第二片段。在转化和选择时，组装的盒通过“上”序列与“中间”序列之间的同源双重重组整合到染色体靶位点中。通过诊断型PCR验证整个装配盒的正确整合。在第二步骤中，通过在盒内部的“下”序列与染色体中与“下”同源的序列(在逻辑上存在于整合盒的下游)之间的反选择和同源重组，将可选择基因“环出”。

提供以下示例以进一步解释本发明，但并不是旨在限制本发明的范围。

实施例1.马克斯克鲁维酵母菌株SD98及其衍生物的DNA转化方法。

以下基于化学的DNA转化方法由Abdel-Banat等人公开的实验方案(Abdel-Banat，2010#56)改编而来，以针对菌株SD98(美国专利申请62/631，541)及其衍生物进行改进，其中的许多被命名并且用于本文描述的实施例中。

将待转化菌株的新鲜单个菌落接种到5ml TG(转化生长培养基)中，该5ml TG每升由10g酵母提取物、20g蛋白胨、3g葡萄糖、200mg氨苄青霉素(钠盐)组成，并且用浓NH₄OH用调节至pH 6.2的终浓度200mM的MES(Sigma-Aldrich)进行缓冲。将该“起始培养物”在50mL锥形瓶中在250rpm下在摇床培养箱中在30℃下生长至饱和过夜(16至24小时)。重要的是，这些条件防止培养物的pH降至低于4.5。

在16至24小时期间内，菌株通常生长至OD₆₀₀为约10。将饱和的起始培养物稀释以得到在500mL锥形瓶中的50ml相同TG培养基中的OD₆₀₀为1.0(通常约1：10)。通过在250rpm和30℃下振荡培养再次生长这种培养物，直至其达到对数生长晚期，OD₆₀₀为约6.0至6.5。这通常花费约5至6小时，但时间因菌株而不同。一些更广泛工程化的菌株比其祖先生长更慢。少数广泛工程化的菌株在OD₆₀₀仅为5至6时就达到饱和，在这种情况下，为了在对数生长晚期时收获细胞，在3.0至3.5的OD₆₀₀下收获细胞。

在培养物生长期间，制备成制剂以确保在收获后转化快速进行。通过在热循环仪中加热至100℃持续5分钟来制备10mg/mL单链鲑鱼精DNA(ssDNA)的溶液，并且然后在冰水浴中快速冷却这些管。准备1.5mL Eppendorf管用于每次单独的转化并且在冰上冷却。将10μL的ssDNA溶液添加到每个管中，随后是理想地5μL的旨在用于转化进菌株的实验DNA(线性或环状)。有时，尤其是当一起引入多个片段时，难以将所有DNA拟合到5μL中，在这种情况下，可使用高达10μL的实验DNA。理想地，实验DNA的浓度应该是至少200ng/μL，使得每个转化管添加至少1μg的总可转化DNA。

制备无菌转化混合物(TM)以化学方式制备用于转化的细胞，其包含最终浓度为的40％聚乙二醇(分子量约3,000-3350，还称作PEG 3350，来自Sigma-Aldrich)、0.2M乙酸锂、0.1M二硫苏糖醇、0.2X YPD培养基(1X YPD培养基是每升10g酵母提取物、20g蛋白胨和20g葡萄糖)。在实践中，该TM通过在转化当天组合三种储备溶液来制备。2M乙酸锂在1X YPD培养基而不是蒸馏水中制备。在使用之前，将其无菌过滤并且在-20℃下以1mL等分试样储存。同样在1X YPD培养基而不是水中制备1M二硫苏糖醇，并且在使用之前，也将其无菌过滤并且在-20℃下以1mL等分试样储存。最后，在蒸馏水中制备50％PEG 3350的溶液，无菌过滤，并在室温下储存在气密容器中。PEG 3350显然在空气中缓慢氧化，在此期间溶液的pH下降。通常，用于转化的PEG 3350的所有储备溶液在2个月内制备，并且pH不低于5.0。在转化当天，通过将1mL的YPD中的无菌乙酸锂、1mL的YPD中的无菌二硫苏糖醇和8mL的无菌PEG 3350溶液混合在一起新鲜制备10mL的“TM”制剂。将粘性TM充分起涡旋混合以确保适当混合。然后在用于转化之前将其储存在冰上。

一旦待转化的培养物达到对数生长晚期，在温和制冷(12℃)的条件下将细胞在6500rpm下离心5分钟。从这一时间点开始，尽可能快地处理培养物，尽可能减少使菌株达到其热休克步骤所花费的时间。倒出上清液，将细胞沉淀重悬于1mL的TM中，并在相同条件下再离心一次。用微量移液器除去上清液。最后，将漂洗的细胞沉淀重悬于700μL的TM中，产生总体积为约900μL至1mL的粘性细胞悬液。该悬液足以用于约10次单独的转化。为了所有的随后续步骤，将这些管保持在冰上。尽可能快且仔细地将85μL部分的细胞悬液等分至每个冷却的转化管中并充分混合。与已经存在于每个管中的15μL的混合DNA一起，这产生每次转化100μL的总混合物。通过将管置于42℃水浴或加热块中45分钟使得每一转化物发生热休克。

在45分钟热休克之后，立即将这些管放回到冰上，并且然后如果该选择培养基是排除培养基(drop out medium)(缺少特定营养物如尿嘧啶的培养基)，用1mL的待用于选择的基于琼脂的培养基的液体培养基形式在微量离心机中以全速沉淀和冲洗细胞。大多数我们的转化利用URA3或TRP5作为选择标记物，所以使用分别缺乏(“排除”)尿嘧啶或色氨酸的完全培养基(具有2％葡萄糖)来重悬浮和冲洗细胞。降速离心(spin down)每次转化的细胞并移去上清。将每个沉淀重悬于300μL新鲜选择培养基中，并且将每个悬液铺展在含有具有2％琼脂的选择性培养基的平板上。通常的做法是将1/10的悬液铺展在一个Petri板上，并将9/10的悬液铺展在第二板上。在干燥之后，将这些板在30℃下温育直到菌落出现，通常为2至4天。如果利用抗生素如G418进行选择，则将细胞重悬于1ml液体1X YPD培养基中，添加到含有4ml液体1XYPD的15ml管中，并且在30℃下滚动或摇晃3小时。3小时后，将细胞以5,000rpm沉淀，重悬于0.5ml 1X YPD中并且在含有1X YPD加抗生素的选择性平板上铺平板。合适的抗生素浓度，即为消除亲本菌株的任何背景生长所必需的最小浓度，应该由每个菌株的中间试验确定。典型的适当浓度是200mg/L G418、300mg/L潮霉素或200mg/L吉欧霉素。

当使用线性DNA或线性DNA片段的混合物通过重叠端的同源重组在体内组装时，当受体菌株是Δnej1，并且当选择性基因是URA3时，典型地使用以上方法获得约10至200个转化体菌落。为了用期望整合到特定染色体靶标中的线性DNA进行转化，根据供应商指示，使用Phire Plant PCR试剂盒(Thermo Fisher)通过菌落PCR测试单个菌落的正确的期望整合结构。PCR引物对应当在整合的DNA和邻近的染色体DNA之间构成连接之一，以避免由盒本身内部的位点引发PCR，所述位点可以作为转化混合物的剩余物存在，或通过非同源末端连接在随机的染色体位置整合。最好使用两组不同的PCR引物对，一组用于整合盒和周围染色体DNA之间的两个连接中的每一个，因为我们已经发现盒一端的一个连接看起来是正确的但另一端不正确的情况。

实施例2.构建可转化的低丙酮酸产D-乳酸的酵母。

SD1566是马克斯克鲁维酵母的Crabtree阳性菌株的工程化衍生物，其含有设计为表达大肠杆菌ldhA(EcldhA)基因的三个整合拷贝的盒。SD1566的构建和生成已经在美国专利申请62/631，541中进行了描述，该专利申请的全部内容通过引用并入本文。在SD1566中，在KmPDC1、KmGPP1和KmNDE1基因座处插入三个EcldhA盒。在所有三种情况下，EcldhA基因由KmPDC1启动子驱动，但没有染色体序列缺失。SD1555(SD1566的前体)包含在KmPCK1基因座处插入的EcldhA的第四拷贝，但是在针对β-氯乳酸的抗性的选择(产生SD1566)期间，发生整个KmPCK1基因座和周围DNA的自发缺失，留下具有pck1-表型的SD1566，其缺乏进行糖异生的能力。在SD1566中自发发生的另一表型是DNA转化感受态的丧失。尽管如此，SD1566的高D-乳酸生产率和低丙酮酸生产率迫使我们发现如何进一步开发含有SD1566的期望特征的菌株。

SD1566的前体菌株是SD1524，其包含与SD1566相同的三个拷贝的EcLdhA，但是SD1524包含完整的和有功能的PCK1基因，因此它可在具有不可发酵的碳源(比如，甘油、D-乳酸盐、L-乳酸盐或琥珀酸盐)作为唯一碳源的基本培养基上生长。由于SD1524缺失KmURA3基因，因此其具有ura3-表型。这样，SD1566为URA3+、pck1-，而SD1524为ura3-、PCK1+。

由于我们的所有马克斯克鲁维酵母菌株都被假定包含两种接合型的单倍体的混合物，我们认为SD1566(URA3+，pck1-)能够与SD1524(ura3-PCK1+)接合，并且可以通过在包含2％L-乳酸钾pH 5.0作为唯一碳源(CM，-ura，+L-Lac)的尿嘧啶排除基本培养基(SigmaAldrich)上生长来选择二倍体。通过在由2％琼脂和2％右旋糖组成的“接合培养基”上的膜片(patch)上将菌株混合在一起并且在30℃下温育过夜来接合SD1566和SD1524。然后将接合的膜片复制铺平板到CM、-ura、+L-Lac平板上并且在37℃下孵育。2天后，很可能出现了二倍体菌株，将其划线以产生单菌落，进而将其贴在由2％琼脂、1％乙酸钾、0.1％酵母提取物和0.05％右旋糖组成的“产孢培养基”上。将产孢培养基平板在30℃下温育4-7天。通过显微镜观察确认孢子形成，并且当看到约70％或更多的孢子形成效率时进行随机孢子分析。对于随机孢子分析，用牙签刮取约20微升的细胞团，并且将其重悬于含有200单位/ml酵母裂解酶(Zymo Research)的0.25ml缓冲液(10mM TrisHCl，pH 6，1mM Na2EDTA)中，在37℃下温育45分钟以杀死营养细胞并且富集孢子。接着，将该悬液在57℃下热处理15-25分钟以通过杀死营养细胞进一步富集孢子。然后将孢子连续稀释并铺板在YPD琼脂(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)上，并且通过在具有2％葡萄糖作为碳源的含有尿嘧啶(Sigma-Aldrich)完全基本培养基、具有2％葡萄糖作为碳源的完全最小尿嘧啶排除培养基(Sigma-Aldrich)或包含尿嘧啶(Sigma-Aldrich)且2％L-乳酸钾作为唯一碳源的完全最小尿嘧啶排除培养基上铺板来检查所得单菌落的URA3和PCK1表型。

针对保留产生高滴度的D-乳酸(大于100g/L)、低滴度的丙酮酸(小于1g/L)(如实施例2中所述)、ura3+和PCK1+的能力筛选所得单倍体衍生的菌株。选择一个这样的菌株(命名为MYR2755)用于进一步开发，因为它还恢复了用DNA转化的能力。为了促进MYR2755的进一步工程化，利用图1中所示的盒缺失其NEJ1基因，该DNA序列在SEQ ID NO.1中给出。在尿嘧啶排除培养基上将MYR2755的初始转化体选择为URA3+，并且将其命名为MYR2785。由于MYR2785能够在不含尿嘧啶的基本培养基上生长，所以其在以下给出的几个实施例中用作对照亲本菌株。通过在5-FOA上选择使URA3基因环出之后，Δnej1衍生物，MYR2787(其为ura3-)，然后变成用于FFZ1表达盒的首次和后续引入的亲本，如以下给出的实施例中所述。

实施例3.在产D-乳酸的酵母中构建第一代FFZ1表达盒。

来自拜耳接合酵母或鲁氏接合酵母的FFZ1基因通过在染色体4上的基因座处的同源整合进行表达，使得该基因位处的天然KmADH2基因被破坏。整合盒包括：1)“ADH2上”，对应于天然ADH2 ORF的编码序列的1至501位的501bp DNA，2)TAA终止密码子，其应当起到翻译终止密码子的作用，以终止部分ADH2 ORF的翻译，3)含有KmPDC1启动子的1000bp序列，4)分别来自拜耳接合酵母或鲁氏接合酵母的ZbFFZ1 ORF(开放阅读框)或ZrFFZ1 ORF，5)ScURA3盒，其包含位于酿酒酵母URA3启动子和ORF的的上游和下游修饰的酿酒酵母URA3基因终止子序列，6)“D+”，22bp的合成DNA序列(AACTTAGACTAAGGAGGTTTGG)；和7)“ADH2下”，对应于天然ADH2基因的编码序列bp编号502至1001的500bp序列。图2给出了示出ZbFFZ1和ZrFFZ1整合盒的结构的图，并且ZrFFZ1形式的DNA序列以SEQ ID NO.2给出。

使用体内组装DNA片段来进行盒的同源整合，这些DNA片段在其末端具有重叠同源性，通过PCR产生，全部以大致等摩尔浓度一起转化到接收菌株MYR2787(一种产生D-乳酸的菌株)中(见实施例2)。在不含尿嘧啶(不含尿嘧啶的最小2％葡萄糖平板(CM，Sigma-Aldrich)上选择整合子，在相同培养基上再划线(substreak)用于纯化，并且通过菌落PCR测试期望的整合事件。然后，ScURA3基因终止子重复使得能够在含有5’-FOA的培养基上同源“环出”ScURA3盒(见美国临时申请62/631,541)，使得FFZ1表达盒保持整合并且菌株变成ura3-表型，从而促进重复使用URA3标记用于进一步工程化。

将获得的这种URA3+转化体(例如，针对ZbFFZ1的SD1748和针对ZrFFZ1盒的SD1751和SD1755)进行序列确认，并且还在BioLector发酵中测试其对糖，蔗糖、葡萄糖和果糖的利用。

在图3A和图3B中给出了来自这样的BioLector实验的结果，这些结果显示，ZbFFZ1不具有显著效果，而ZrFFZ1具有可测量的效果。

BioLector实验显示，在引入ZrFFZ1盒的情况下，相对于葡萄糖的利用改善了果糖的利用。例如，如果在两个不同的时间点计算利用的果糖与利用的葡萄糖的比率并且与缺乏FFZ1的亲本菌株(MYR2785)相比较，该比率从约0.32增加至约0.44(12％蔗糖培养基，48小时数据)。当在起始培养基中使用6％葡萄糖和6％果糖的混合物而不是在起始培养基中使用12％蔗糖进行实验时，这种改善更大(从约0.3至约1.3(16小时数据))。总之，这些结果表明，就果糖利用而言，菌株SD1755(具有ZrFFZ1)是该批次的最佳菌株，因此将其用于进一步工程化。在控制pH的7升发酵罐中将SD1755与MYR2785进行比较，并且果糖再次被SD1755更早地消耗(见实施例6)。

通过在5-FOA上进行选择使从SD1755中的ScURA3基因缺失，并且将所得ura3-衍生物命名为SD1774，其能够进一步工程化。在实施例4中，其从D-乳酸生产者转化为L-乳酸生产者。

实施例4.KMS1017(L-乳酸生产者)和适合于进一步工程化的KMS1019(KMS1019的ura3-衍生物)的构造

利用NEBuilder HiFi Assembler克隆试剂盒构建质粒pMS155，其被设计成含有用于在任何D-乳酸生产菌株中的任何整合盒处将PaldhL开放阅读框交换为EcldhA开放阅读框的盒(见图4和SEQ ID NO.5)。通过PCR从pMS155扩增PaldhL交换盒，并且将其转化到SD1774中，选择URA3+转化体。然后通过菌落PCR测试URA3+菌落以确定EcldhA基因的三个拷贝中的哪一个已经被替换。菌株KMS977显示GPP1基因座处的拷贝被替换。然后通过同源重组和在含有产生KMS984的5’-FOA的培养基上进行选择来缺失KMS977中的URA3基因。KMS984随后用相同的交换盒进行转化，这次在NDE1基因座处替换EcldhA得到KMS1001。然后通过在含有5’-FOA的培养基上进行选择来缺失KMS1001中的URA3基因，产生菌株KMS1004。用交换盒转化KMS1004，交换PDC1基因座处的最后剩余EcldhA基因以产生仅生产L-乳酸的KMS1017。URA3盒如上所述从KMS1017中缺失，产生KMS1019。KMS1017仅包含PaldhL盒，因此它仅生产L-乳酸。KMS1019是ura3-，因此其被设置用于进一步的基因工程，如在实施例5中。

实施例5.鲁氏接合酵母FFZ1基因的重新设计的整合和改善的功能。

鉴于相对于葡萄糖利用，适度但可测量的增加果糖利用是由于将一个拷贝的ZrFFZ1表达盒基因插入染色体4上的KmADH2的中间，期望通过向我们现有的D-乳酸生产菌株SD1755和MYR2785添加ZrFFZ1表达盒的另外拷贝来进一步改善果糖的利用。存在当在异源宿主中表达时，ZrFFZ1根本不能复制其果糖渗透性的正常的强大功能的可能性。为了测试该理论，以两种新的方式重新设计ZrFFZ1表达盒，以试图找到会增加其在马克斯克鲁维酵母中的有效性的整合方法。

设计了两个新的整合盒以在马克斯克鲁维酵母中表达ZrFFZ1。一个命名为JSS89，被设计成缺失并且替换KmADH6的整个ORF。另一个命名为JSS90，被设计为插入KmADH6 ORF的中间。两个盒JSS89和JSS90的结构分别示于图5和图6中。这两个盒的DNA序列分别在SEQID NO.3和SEQ ID NO.4中给出。已经用于实施例2的盒设计中的相同的1,000个碱基对KmPDC1启动子(PPDC1-1,000bp)(其前面是TAA终止密码子)再次用于驱动来自这两个新盒的ZrFFZ1表达。然而，两个新盒都与实施例2中用于产生SD1755的早期设计不同，因为JSS89和JSS90都利用来自鲁氏接合酵母的ZrFFZ1基因的天然终止子序列。在两种情况下酿酒酵母URA3被用作选择标记，但是它被不同地引入在两个盒中以促进整合到我们的乳酸生产菌株中。pJSS89盒在FFZ1基因的相反方向上表达ScURA3，使得该盒将不能整合在我们的菌株谱系中的较早整合事件处留下的DNA“疤痕”内。pJSS90盒通过在ZrFFZ1 ORF的拷贝和天然ZrFFZ1终止子的207个碱基对之后直接在线表达略缩短的缺乏其天然终止子的ScURA3基因而避免了相同的问题。ScURA3启动子和ORF之后是整个900bp Zr FFZ1终止子，在此用于终止ScURA3转录本，并且提供207个碱基对的同向重复序列，该同向重复序列将允许通过5-FOA选择去除标记基因。

在盒JSS89中，整个ZrFFZ1-900bp终止子之后是对应于KmADH6的天然终止子的220bp序列。这之后是完整的、反向的ScURA3标记，并且然后是对应于KmADH6序列的中心的500bp的DNA片段。从KmADH6的ATG下游天然出现270bp的这个片段用作该盒的“下游”整合侧翼。在该盒前面的TAA-PPDC1-1,000bp启动子构建体之前是对应于KmADH6的上游调节区(ATG5’-510bp至-10bp)的500bpDNA片段。其用作整个盒的“上游”整合侧翼。

通过PCR产生构建JSS89和JDSS90整合盒所需的DNA片段(具有与每个相邻片段具有重叠DNA同源性的60bp区域)，并且以等摩尔量混合。然后将该混合物通过上述方法转化到SD1755(称为SD1774)和MYR2785(称为MYR2787)的Δura3衍生物中，并且将重叠片段连接在一起并通过同源重组整合。通过菌落PCR筛选URA3⁺转化体克隆以鉴定来自图5和图6的盒在每个菌株中的正确整合。在BioLector Basic(由m2p Labs销售)中，使用包含12％蔗糖和150mM磷酸铵缓冲液(pH 6.3)的SDM2基本培养基进行在多个分离物中的针对每个克隆的发酵。培养菌株直到由于低pH而停止生长，75小时。通过HPLC分析样品的D-乳酸(图7)。

如由早期结果所预期的，添加ZrFFZ1的另外拷贝进一步增加了所有菌株中的果糖利用速率。pJSS90盒的表现与已经以KmADH2整合在SD1755中的先前插入盒大致相当。与亲本菌株相比，各自将利用的果糖与利用的葡萄糖之比增加了约0.1至0.2(图7)。来自这两个整合的盒的贡献大致是累加的，因为相对于利用的果糖与利用的葡萄糖之比，pJSS90盒到SD1774中的整合体比制成MYR2787中的类似整合体的相应地更高。

然而，出乎意料的是，在设计用于将ZrFFZ1基因引入到ADH6中的两个盒之间存在显著的性能差异。然而，将JSS90整合到MYR2787中将使用的果糖与使用的葡萄糖之比从0.35增加到0.55，添加一个拷贝的JSS89盒将其一直增加到1.65，与之前的插入盒中的任一者相比，效率增加了大约6倍(图7)。这种单一的、显著的增加本身就足以将菌株的代谢从嗜葡萄糖性完全改变成嗜果糖性。有趣的是，这种作用也与初始ZrFFZ1盒在ADH2处的作用相加，但初始盒的作用似乎仍然小得多，因为存在两种盒的[使用的果糖]/[使用的葡萄糖]仅从1.65增加到1.85。

在每种情况下，向马克斯克鲁维酵母的这些工程化菌株添加ZrFFZ1的另外拷贝增强了最初嗜葡萄糖的菌株在生长过程中吸收并且代谢果糖的能力。然而，该作用显著不仅仅是根据Km中的该特定异源等位基因，而且也是由于其表达的情况。整合ZrFFZ1代替KmADH6，同时在基因(900bp)之后使用天然Zr DNA的延伸终止子序列，使得能够在果糖利用方面实现大幅度且非预期的增强。在不同规模和时长的发酵中均一致地看到了这种加强，如新的Km D-乳酸生产菌株(列于表2中)甚至在进行至完成的控制碱的7L发酵中保留了它们的嗜果糖特征(见实施例6)。

当其引入L-乳酸生产菌株KMS1017衍生物KMS1019中时，用于ZrFFZ1表达基于JSS89的“替换”盒的改变特征的能力类似地起作用(见，实施例4)。当添加至KMS1019时，KMS1017的Δura3衍生物获得了果糖利用类似的改善。获得通过将JSS89盒转化至KMS1019中获得的5中分离物的总结提供在表3中。所有新的菌株在含有碳酸钙，以将pH稳定保持在用于早期发酵的6附近的摇瓶发酵中显示增加的嗜果糖特征(图8)。注意，观察到的改善的果糖利用的程度在摇瓶中比在上述BioLector发酵中更低。在7-升发酵中评估含有JSS89盒的KMS1019的最佳衍生物，其中通过进料氢氧化钙控制pH。在7-升发酵中，最佳表现分离物为JSS1397(见，实施例6)。

实施例6.在控制pH的7升发酵罐中通过含有ZrFFZ1盒的菌株生产L-乳酸或D-乳酸。

酵母菌株JSS1397的接种物在37℃下在500ml挡板摇瓶中在150ml的YPS-MES培养基(见表4)中生长至OD 600nm为3.0至4.0。将150ml接种至4升的AM1S培养基(见表4)中。叶轮速度为750rpm并且通气为300ml/分钟，等于起始体积的0.075vvm。起始pH为约6.8。通过3摩尔氢氧化钙浆料的自动控制的蠕动泵送来控制pH，该浆料保持悬浮在搅拌贮器中。pH设定点以线性方式从时间零(接种时间)至25小时自动斜降(即降低)至pH 4.25。在25小时，将设定点改变至pH 3.5。这允许pH随着产生更多的L-乳酸而自然下降。在45小时发酵结束时，终pH为3.5。pH缓慢降低防止乳酸钙沉淀。在图16中，乳酸钙的溶解度显示为pH的函数。

在45小时，L-LAC滴度126g/L和计算的产率为0.85g/g蔗糖(两次发酵的平均值，在图12至图16中命名为YL487和YL488)。L-LAC的最大比生产率为3.75g/L-hr，并且累积生产率为3.4g/L-hr。虽然JSS1397的终L-乳酸滴度类似于对照菌株KMS1017(在图13至图16中命名为发酵YL492)的终L-乳酸滴度，但是JSS1397的生产速率快得多(图13)。通过测量蔗糖水解后的游离果糖，可以看出果糖利用的速率增加(图14)。甚至更显著的是，图15中所示的葡萄糖与果糖利用的比率。对于大部分发酵，JSS1397的葡萄糖与果糖利用速率的比率大致相同，而对照菌株KMS1017在发酵早期以果糖速率的两倍利用葡萄糖，并且仅当剩余的果糖与葡萄糖的比率为4:1时，在27小时EFT(流逝的发酵时间)下以相同速率利用葡萄糖和果糖。

在类似的7升发酵中，比较生产D-乳酸的菌株SD1755(含有一个ZrFFZ1盒)、MYR2879(含有两个ZrFFZ1盒)或MYR2785(没有ZrFFZ1盒)。在这种情况下，起始蔗糖浓度稍低，为在180g/L。如图17中所示，MYR2879和SD1755两者的果糖消耗速率相比MYR2785增加了。此外，MYR2879显示出比SD1755更早的果糖消耗。表5中给出了针对这种比较获得的最终发酵参数。

实施例7.针对L-乳酸解决甘蔗汁发酵中的果糖问题

在气候为热带或温带的许多地区，甘蔗是可发酵糖的优选来源。在收获后，将甘蔗机械破碎并研磨以提取汁液，并且然后在几个步骤中纯化甘蔗汁以制备糖。果汁中的主要糖是蔗糖。在商业生产中，优选将甘蔗汁用作生产几种生物基化学品的低成本原料。马克斯克鲁维酵母分泌在细胞膜外将蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶，然后葡萄糖和果糖被输入细胞，在细胞中它们进入糖酵解途径。当马克斯克鲁维酵母在含有高浓度的蔗糖的甘蔗汁中生长时，通过转化酶产生胞外葡萄糖和果糖超过细胞输入葡萄糖和果糖的能力，因此葡萄糖和果糖在细胞外积聚。随着发酵的进行，葡萄糖比果糖更快地被利用，因此发酵时间必须延长以便消耗所有果糖。这种现象被称为‘果糖问题’，其在L-乳酸生产的情况下通过如下实验清楚地说明。

为了避免发生该现象，构建了没有ZrFFZ1盒的新的生产L-乳酸的菌株。选择来自凝结芽孢杆菌BC060的乳酸脱氢酶基因以在马克斯克鲁维酵母中表达。使用NEBuilderHiFi Assembler克隆试剂盒构建质粒pBe-ldhL-OP2-int，其被设计为包含用于在任何D-乳酸生产菌株中的任何整合盒处将BcldhL开放阅读框交换为EcldhA开放阅读框的盒(见图18和SEQ ID NO.7)。通过PCR从pL-BCldh扩增BcldhL交换盒，并且将其转化进MYR2787中，选择URA3+转化体。然后通过菌落PCR测试URA3+菌落以确定EcldhA基因的三个拷贝中的哪一个已经被替换。菌株MYR2891显示GPP1基因座处的拷贝被替换。然后通过同源重组和在含有5’-FOA的培养基上选择来缺失MYR2891中的URA3基因，产生MYR2891-ura-。随后用相同的交换盒转化MYR2891-ura-，这次替换NDE1基因座处的EcldhA以给出MYR2892。然后通过在含有5’-FOA的培养基上进行选择来缺失MYR2892中的URA3基因，产生菌株MYR2892-ura-。用交换盒转化MYR2892-ura-，交换PDC1基因座处最后剩余的EcldhA基因以产生仅生产L-乳酸的MYR2893。MYR2893仅包含BcldhL盒，因此它仅生产L-乳酸，而没有ZrFFZ1盒。

JSS1397(具有ZrFFZ1盒)和MYR2893(没有ZrFFZ1)的L-乳酸发酵在控制pH的5升发酵罐中进行。酵母菌株JSS1397和MYR2893的接种物在37℃下在500ml挡板摇瓶中在150ml的YPS-MES培养基(见表4)中生长至OD600nm为3.0至4.0。将150ml接种到3升的AM1CJ培养基(见表4)中。叶轮速度为750rpm并且通气为195ml/分钟，等于起始体积的0.065vvm。起始pH为约6.8。通过3摩尔氢氧化钙浆料的自动控制的蠕动泵送来控制pH，该浆料保持悬浮在搅拌贮器中。pH设定点以线性方式从时间零(接种时间)至25小时自动斜降(即降低)至pH4.1。在25小时，将设定点改变至pH 3.5。这允许pH随着产生更多的L-乳酸而自然下降。每种菌株的发酵实验是双份平行的发酵，并且在表6中总结了平均结果。

如图19中所示，在发酵过程中JSS1397培养物中的游离果糖显著低于MYR2893的游离果糖。此外，JSS1397培养物中的果糖在27小时内被完全消耗，果糖消耗速率为3.66g/L/hr。这要早于MYR2893，MYR2893在30小时时果糖被完全消耗，果糖消耗速率为3.28g/L/hr。该实验清楚地证明了具有ZrFFZ1盒的细胞可以解决在甘蔗汁发酵中的L-乳酸生产的果糖问题。

实施例8.解决酿酒酵母乙醇发酵中的果糖问题。

通过酿酒酵母菌株将源自甘蔗汁的糖发酵成用于燃料和饮料用途的乙醇已经大规模实施。像马克斯克鲁维酵母一样，酿酒酵母分泌在细胞膜外将蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶，并且然后葡萄糖和果糖被输入细胞中，在细胞中它们进入糖酵解途径。在酿酒酵母的情况下，所分泌的酶被命名为转化酶或蔗糖酶或蔗糖水解酶，或其他名称。当酿酒酵母在含有高浓度蔗糖的培养基中生长时，由转化酶产生的胞外葡萄糖和果糖超过了细胞输入葡萄糖和果糖的能力，因此葡萄糖和果糖会在细胞外积聚。随着发酵的进行，葡萄糖比果糖更快地被利用，因此发酵时间必须延长以便消耗所有果糖。该现象在以下实验中示出。

使可商购的酿酒菌株Ethanol Red(LaSaffre Advanced Fermentations)在34℃下在包括2X酵母氮源(Sigma-Aldrich)和12％w/v蔗糖的培养基中在微需氧摇瓶(100ml在250ml Erlenmeyer中，80rpm，无晃动)中生长。通过HPLC测量蔗糖、葡萄糖和果糖浓度作为时间的函数(图9)。在发酵结束时，剩余的葡萄糖实质上比果糖更多，因此Ethanol Red显然具有“果糖问题”。

通常，甘蔗汁中的蔗糖在处理和/或储存过程中会发生水解。例如，在高测试糖蜜的生产中，加热甘蔗汁并且蒸发水以形成浓缩的混合物。由于暴露于热、微酸性pH，并且可能由于酶的存在，大部分蔗糖被水解成葡萄糖加果糖。为了模拟由这样的混合物制成的培养基，重复以上实验，只是培养基是2X酵母氮源加6％w/v葡萄糖和6％w/v果糖。结果示于图10中。发酵结束时，仍然残留比葡萄糖更多的果糖，所以不仅是培养基包含蔗糖时存在“果糖问题”，而且当起始培养基包含葡萄糖和果糖的混合物时也存在“果糖问题”。

接下来的实验显示，酿酒酵母中的果糖问题可通过将ZrFFZ1基因引入在表达盒中得到解决。为了在酿酒酵母中表达ZrFFZ1，构建了表达来自强组成型ScADH1启动子的ZrFFZ1开放阅读框的盒，其具有来自酿酒酵母MEL5基因的转录终止子。通过引入与HO基因座同源的约1kb的侧翼DNA序列，将盒设计为在HO基因座处整合。根据制造商的方案，利用Phusion高保真PCR反应混合物(New England Biolabs))通过PCR产生上述所有组分DNA序列。根据制造商的方案，利用NEBuilder HiFi DNA套装克隆试剂盒(New EnglandBiolabs))，将组分DNA序列组装到在命名为pRY789的大肠杆菌中复制的质粒中。pRY789的结构如图11所示，并且完整的pRY789的DNA序列如SEQ ID NO.6所示。将表达盒通过本领域熟知的用于酿酒酵母的方法整合在Ethanol Red的HO基因座处，以制备转化感受态细胞和用提供抗生素G418抗性的复制质粒共转化线性盒DNA的组合(Gietz，2014#63；Rudolph，1985#80；US 6,214,577)。根据供应商的方案，使用Phire Plant PCR反应混合物(ThermoScientific)通过诊断型PCR在单独的菌落上鉴定正确的整合体。

在如上所述的微需氧摇瓶中将所得菌株(命名为ER+ZrFFZ1)与亲本菌株EthanolRed(ER)进行比较，使用包含2X酵母氮源和6％葡萄糖和6％果糖的培养基，只是在该实验中，将温度降低到26℃以便能够在糖完全消耗之前的中间时间方便地收集更多的数据。如图12中所示，工程化菌株ER+ZrFFZ1比亲本菌株更快速地使用果糖，并且更慢地使用葡萄糖。ER+ZrFFZ1对果糖利用的改善是适度的但显著的。所示数据是Ethanol Red的双份平行实验烧瓶的平均值以及ER+ZrFFZ1的三份平行实验烧瓶的平均值。净结果是果糖和葡萄糖以类似的速率被工程化的菌株使用，使得两种糖在大约相同的时间被完全消耗。此处看到的模式类似于我们针对以上描述的D-乳酸或L-乳酸生产工程化的马克斯克鲁维酵母菌株的模式。

实施例9.提高果糖的磷酸化速率。

已经解决了将果糖输入细胞的瓶颈，下一个潜在的限速步骤是通过酶(比如，果糖激酶(EC 2.7.1.4)或己糖激酶(EC 2.7.1.1))磷酸化果糖以产生果糖-6-磷酸。马克斯克鲁维酵母具有两种天然己糖激酶基因GLK1和RAG5。编码的酶磷酸化葡萄糖和果糖。植物，比如拟南芥(Arabidopsis thaliana)(塔勒水芹)和番茄(Solanum lycopersicum)(西红柿)具有良好表征的基因，例如编码专用果糖激酶的AtFRK1-7和SlFRK1-4(Stein，2018#88)。来自任何这些基因的无内含子开放阅读框可通过PCR获得(KmGLK1和KmRAG5来自马克斯克鲁维酵母基因组，或cDNA克隆来自植物基因)，或开放阅读框(减去任何细胞器靶向序列)可从gBlocks合成(Integrated DNA Technologies)并且从酵母中的强组成型启动子表达，如马克斯克鲁维酵母中的KmPDC1启动子，以提高果糖进入糖酵解途径的通量。将表达盒整合到生产L-乳酸的酵母中，其中靶向的染色体整合位点处的基因的非必需开放阅读框被精确地缺失。利用生产L-乳酸的酵母KMS1019(KMS1017 ura-)、JSS1398(JSS1397 ura-)和JSS1408(JSS1407 ura-)作为亲本菌株。结果，如表7中所列构建了35种重组酵母。以与上文实施例7中所述相同的实验方法(有两处修改)，测定了每个重组体在控制pH的5升发酵罐中的L-LAC发酵的性能以及糖消耗。首先，在这个实验中使用具有150g/L蔗糖的AM1S培养基。第二，在发酵开始时将pH设置为3.5。这使得pH能够随着产生更多的L-乳酸而自然下降。

在实验期间，发明人发现，含有衍生自JSS1408的KmRAG5的细胞(所谓的MYR3058和MYR3059)的出乎意料的行为。与亲本菌株相比，两种重组酵母的培养物中的游离果糖显著降低。为了证实该行为，选择MYR 3059以确定与具有与JSS1407(JSS1408 URA+)类似的遗传背景的JSS1397相当的发酵性能，并且用于证明本发明的性能。发酵性能在控制pH的5升发酵罐中进行，与本实施例中上述相同的实验方法一样。结果说明，具有果糖激酶基因(RAG5)的酵母细胞具有如图20中所示的果糖消耗的改善，并且这些细胞的L-LAC生产的性能如图21中所示也得到了改善。

实施例10.增加果糖-6-磷酸的磷酸化速率以产生果糖-1,6-二磷酸

果糖代谢中果糖激酶之后的下一步骤是通过磷酸果糖激酶1(EC 2.7.1.11)酶第二磷酸化以得到果糖-1,6-二磷酸。在马克斯克鲁维酵母中，野生型磷酸果糖激酶1是八聚体，并且包括四个拷贝，两个不同亚基的每个拷贝由KmPFK1和KmPFK2基因编码。该酶由ATP变构抑制。已知在具有类似酶的酿酒酵母中如何产生过度活化且对ATP的抑制具有抗性突变体形式(Lobo，1982#98；(odicio，2000#113))。能够通过直接的基因工程将这种突变体形式移植到马克斯克鲁维酵母菌株中以增加通过糖酵解的通量，以实现增加期望化学物质如L-乳酸或D-乳酸的生产的目的。此外，在马克斯克鲁维酵母PFK基因或其同源物中可以引入类似的突变。这种突变，尤其在具有增加的果糖输入能力和/或果糖激酶活性的菌株中，对于增加产生衍生自糖酵解途径的期望产物的通量是有用的，所述期望产物包括来自三羧酸循环的产物。

根据上述所有实施例的结果反映了具有至少一个异源DNA盒的基因工程酵母细胞，该异源DNA盒用作果糖输入子，如在发明内容中所提及的，在本发明中发现该异源DNA盒改善了果糖利用。

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[12]Rodicio，R.，Strauss，A.，and Heinisch，J.J.(2000)Single pointmutations in either gene encoding the subunits of the heterooctameric yeastphosphofructokinase abolish allosteric inhibition by ATP，J Biol Chem275，40952-40960.

[13]Rudolph，H.，Koenig-Rauseo，I.，and Hinnen，A.(1985)One-step genereplacement in yeast by cotransformation，Gene36，87-95.

[14]Stein，O.，and Granot，D.(2018)Plant Fructokinases：Evolutionary，Developmental，and Metabolic Aspects in Sink Tissues，Front Plant Sci9，339.

[15]Zhou，Y.，Zhu，Y.，Men，Y.，Dong，C.，Sun，Y.，and Zhang，J.(2017)Construction of engineered Saccharomyces cerevisiae strain to improve thatwhole-cellbiocatalytic production of melibiose from raffinose，J Ind MicrobiolBiotechnol44，489-501.

序列表

<110> PTT全球化学股份有限公司

<120> 用于改善糖果利用的工程微生物菌株

<130> IP40-210470

<160> 7

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 2660

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于缺失马克斯克鲁维酵母的NEJ1基因的表达盒。

<400> 1

gtacttgctg gcgtatatgt gatacacaaa ctaaacctat ggggtccttt ataccaattc 60

gctaatcaag caacgggaca agcaactatg actttgaaac agactgtccg taatttggtg 120

cttgatgaag accctaagcc tgtatccaca gagaaatact ctggagattt gaaggccagg 180

aaagaagatc cttctaaaga gagtacccat ttataaggag caaatataaa acaacaaaat 240

agcaatcgca accacatatt agataggtct gtagactata tccaatgcac caaaatatgg 300

catcctattt cctgtgcctt atcactacat gatcattcgt ttagatcttt taactaatat 360

tgtatataac cattttttaa ggctgtagtt cttacaaact taaccttaaa aaacttagca 420

tgggaacctt acaaagacta ctacgctgaa agaaatagta acctaagcgc tagattcgga 480

tttccttgca aaaaggatat gtatttctaa ccttttcttc tagctctccg atcaagctgg 540

acctaattca gagcaccttt gtagccaagt gtgaaagaac ttcgaagaag cctcagaatc 600

cacatctgca tcttccttac aaagcgcttg cacaatcttc gaccagaagg ttacaaatgc 660

cttcaattgg tgtacactaa ccggtacttc caccaattca ttaggcagtt gtttccaatc 720

attgtggcta ataccagaat ttctgaagaa atcagagaac accgcaatat aatgcttgta 780

aattaccctt gcgactgctt tgaagtctgt catttcttta cggctgtacg aagtgaacat 840

taactcgtca ccgtatatgc gtatcatagt acgatcaatg gcctccacaa tgacgttgaa 900

aaattcgtcg caggcgctaa cggcaagggc gtggaaatcc gaactggata cgccattgta 960

tgtaggctcg cgttcaattg gtttagggac ctggatattt tcaattcatc attttttttt 1020

tattcttttt tttgatttcg gtttctttga aatttttttg attcggtaat ctccgaacag 1080

aaggaagaac gaaggaagga gcacagactt agattggtat atatacgcat atgtagtgtt 1140

gaagaaacat gaaattgccc agtattctta acccaactgc acagaacaaa aacctgcagg 1200

aaacgaagat aaatcatgtc gaaagctaca tataaggaac gtgctgctac tcatcctagt 1260

cctgttgctg ccaagctatt taatatcatg cacgaaaagc aaacaaactt gtgtgcttca 1320

ttggatgttc gtaccaccaa ggaattactg gagttagttg aagcattagg tcccaaaatt 1380

tgtttactaa aaacacatgt ggatatcttg actgattttt ccatggaggg cacagttaag 1440

ccgctaaagg cattatccgc caagtacaat tttttactct tcgaagacag aaaatttgct 1500

gacattggta atacagtcaa attgcagtac tctgcgggtg tatacagaat agcagaatgg 1560

gcagacatta cgaatgcaca cggtgtggtg ggcccaggta ttgttagcgg tttgaagcag 1620

gcggcagaag aagtaacaaa ggaacctaga ggccttttga tgttagcaga attgtcatgc 1680

aagggctccc tatctactgg agaatatact aagggtactg ttgacattgc gaagagcgac 1740

aaagattttg ttatcggctt tattgctcaa agagacatgg gtggaagaga tgaaggttac 1800

gattggttga ttatgacacc cggtgtgggt ttagatgaca agggagacgc attgggtcaa 1860

cagtatagaa ccgtggatga tgtggtctct acaggatctg acattattat tgttggaaga 1920

ggactatttg caaagggaag ggatgctaag gtagagggtg aacgttacag aaaagcaggc 1980

tgggaagcat atttgagaag atgcggccag caaaactaaa aaactgtatt ataagtaaat 2040

gcatgtatac taaactcaca aattagagct tcaatttaat tatatcagtt attacccggg 2100

aatctcggtc gtaatgattt ttataatgac gaaaaaaaaa aaattggaaa gaaaaagctt 2160

tctaaagagc ttctgaaagc ctcaacgaaa gaagaaggac taatagatac actgcaggac 2220

atatacacaa tattatcaga agaatccaat tctaagtttg agtcattggg aagcaagatg 2280

tttctatcca tccaaagaaa agattcgtct gagattgtct tagaagtgga aacctccagt 2340

gttgatgaga gtcgagaaca aacgctacta catgagtgta ctggatattt gatgaaaaat 2400

gcggtggttg gaaatcatat tcgaacatat atttcccacc tcgcattaga aaaagatagg 2460

gcgatcgaat ttttagggaa tactgccaaa gattacggag ctagcaatac aatacttaaa 2520

tgggctcctg taaactctcc aaactacaaa tcattgatga aatttgatcc aagtttggca 2580

tgggcggaga gttttccaaa tggaagcgtc aatctagaca taatagatct taatgaatta 2640

aatgaaatta cacacaagag 2660

<210> 2

<211> 5363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于在KmADH2基因座处整合并表达ZrFFZ1的表达盒。

<400> 2

atgtctattc caactactca aaagggtgtt atcttctacg aaaacggtgg tcaattgtac 60

tacaaggaca tcccagtccc aaagccaaag tctaacgaac ttttgatcaa cgttaagtac 120

tccggtgtct gccacaccga tttgcacgcc tggaagggtg actggccatt ggacaccaag 180

ttgccattgg tcggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgtcg tcgccatggg tgacaacgtc 240

aagggctgga agatcggtga ccttgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatgaac 300

tgtgaagaat gtgaattgtc caacgaatcc aactgtccag acgctgactt gtccggttac 360

acccacgacg gttctttcca acaatacgct accgctgacg ctgtccaagc cgctcacatc 420

ccagctggta ccgacttggc tcaagtcgcc ccaatcttgt gtgccggtgt taccgtctac 480

aaggctttga agaccgctga ataaagcgtg aataatgaat ggccttgtat tcgttttttt 540

ccgagagaaa attaacaaga gcgaaaaaaa aaacgggctt cggtgaaaat cgggtgaata 600

tgcaactagc gggacgaatg ctctggaaat gcatatccta tgcaactagc gggatgaaca 660

aatctcaccc cagaattcgc aggaaaaaac aggaaaaaaa aaaagaaggc caccacggcc 720

acaaagacca caaagaccac aaaaaaaaac aaaaaacaac cgtcccagct tccagtgttt 780

ggaatactgg aacacaggaa gccgcataag agtgggcgtt gcacaggaag ccaggcccag 840

aagccccaga gttacttttt tttttttgtt ttttccttct gttcgctgtg cccgcatcag 900

atgatgcgcc tttatttacg atgccaatgc gaatagcacc agtgagagca ccagtaaaag 960

catacgcata cacatacaca catagagcaa gcaagcaggc tagcaaccag gaaaggctgc 1020

cagtgactgc tactgggtgt ctaagaaccg tagggcggat tattgttgcg gtggttggtt 1080

gcgggtggtt atgcgatggt acggtgcaga atcgtacggt gttgggttat ggaattagta 1140

tgggtatgtg atatgtggta atatgtgata ttgggttatt gtgatttgga atactgaata 1200

tcgaatatgg gatatggaat atggctatgg catggtatgg tatgggatgg gagtattcta 1260

ttttatttta ttctggttcc tgcgtttagg gtagggtagg aagaaggtga gtgcttttgt 1320

atataagtgg agtgtctgga tcagttttgt ggattgtgaa tgttagtttc ccctttaatg 1380

tatatttgta ttatttgctt ttgagtactc aataaccaag cacaactact agttttaaag 1440

gatccatcct cttaaacagt acaaatcgca aagaaaagct ccacacccaa accaaataat 1500

tgcaatggtc aaaatagacg ccagtgcaga tttggactgg aataatttgc ctccccaaca 1560

gaggttgggt agaatcgttg gtggaaaata tattgaaacc gtgcacatgg atgagtcatc 1620

accagaagcc atggagcgtc caatgacaaa agtcgagtgt gatatcccat taacttatac 1680

tgaatctgtg gaaaaggacg gcaaagaatg ggtaatgtta acttttgcac caggtgatcc 1740

agaaaaccca tttaattgga gtcttagatt gaaatggttt ctaacgactt tactgtgcct 1800

aatgacactt ttcatcggtc tagccaccac ggcttatagt tctggtatag acagaatggc 1860

aaaacacttt aacagttctt cggaagttgg tcagttgggt cttttcacct tcaatgaaac 1920

atgttccatt gcacctttgt ttctagcgcc attctgtgaa ttggttggta gaaaggtgat 1980

ttacaccggt ggttatcttt gcttctgtct ttgtttcatc ggtcttgcat taggtaaaaa 2040

tatggccact atcatttgtt tgcgtgcttg tttaggtttg tttggttgca ttggtaccat 2100

tcttgttggt ggtactttcg acgatatgtt tgttgcagat gaaagagcta ttcctatggc 2160

tctgtttgca tatgttgcta tcctgggtac cgtgggtgct ccaatctatg caggttttat 2220

tgatcaagcc attggctggc gttggattga aggtatccaa gggttatcta atgttccatt 2280

gttgattatc atctttttat ttttcaaaga aactcgtggt ggtgtcacct tgcaaaagag 2340

ggccaagtct ctacgtaaag ataccggtga tgagagatgg gtgtccaagg aagaattgga 2400

ggctcctggt cttaaggatg ctctttacaa ctcctctgtt aaggctatta agatgttaat 2460

ctccgagccc gtggtgtttt tctttggtct ttggatcagt ttcgcatggt tcctaacctt 2520

tttgtttttg tctgttatcg gtattacttt ctcacacttt aagcactgga gtgaaggtgt 2580

tgcaggttta ccttatatct cccttgttat tggtgttacc attggattct taaccaactt 2640

tttgcaaatt cgcaaatacg aaaatatgag aaagaagtca aagtatcctt taccacctga 2700

aaaccgttta tatggtgcta tgactggtgc cgtgttttta cctattggtc ttatgatcta 2760

ctctttcact caataccact ggttgcactg gatcggtcct aacatcggtt tggcatgcat 2820

ctctctcggt atcttcttca tcttcgaatc ctgttattcc tacacttcgg attgttatgg 2880

tcctgatgct tcttccgcca ttgcaggtca aggtttcatg cgtaatactt taggtgccgt 2940

ttcaccattg tttggtaagt acatgttctt aaacatgcac agtcaatggg ccggcctgtt 3000

gtgtagtctc gtggctttcg gtttgacatt gttgcccttc gtcctttaca aatttggtcc 3060

tgcaatccgt gccagatcta agcgtgctat tgtgtaccat ggtgaagaag acgatgaaga 3120

tgacgaaatt gctgaacagc aaagtagctc aagtactgga ggaggcagat ctttgcaaga 3180

tgatgctcac gttgaaaatg ctaacaacaa ccagttattc gaaaagaacg aaggttctcg 3240

tgaatctgat tctccagaga ctgctagaga gactgattcc ctatcacctt ccgaaaaggt 3300

agataaccat gctggagtat ctcgtagcgt ggaagaacac tcagataccg tttctgaaag 3360

tgaattacat ggccatactg gtcgtgcatg aaatatctat atcacaagat gaaaactgta 3420

ttataagtaa atgcatgtat actaaactca caaattagag cttcaattta attatatcag 3480

ttattacccg ggaatctcgg tcgtaatgat ttttataatg acgaaaaaaa aaaaattgga 3540

aagaaaaagc ttggatccac aggacgggtg tggtcgccat gatcgcgtag tcgatagtgg 3600

ctccgtccgg cgtagaggat cctcaattca tcattttttt tttattcttt tttttgattt 3660

cggtttcttt gaaatttttt tgattcggta atctccgaac agaaggaaga acgaaggaag 3720

gagcacagac ttagattggt atatatacgc atatgtagtg ttgaagaaac atgaaattgc 3780

ccagtattct taacccaact gcacagaaca aaaacctgca ggaaacgaag ataaatcatg 3840

tcgaaagcta catataagga acgtgctgct actcatccta gtcctgttgc tgccaagcta 3900

tttaatatca tgcacgaaaa gcaaacaaac ttgtgtgctt cattggatgt tcgtaccacc 3960

aaggaattac tggagttagt tgaagcatta ggtcccaaaa tttgtttact aaaaacacat 4020

gtggatatct tgactgattt ttccatggag ggcacagtta agccgctaaa ggcattatcc 4080

gccaagtaca attttttact cttcgaagac agaaaatttg ctgacattgg taatacagtc 4140

aaattgcagt actctgcggg tgtatacaga atagcagaat gggcagacat tacgaatgca 4200

cacggtgtgg tgggcccagg tattgttagc ggtttgaagc aggcggcaga agaagtaaca 4260

aaggaaccta gaggcctttt gatgttagca gaattgtcat gcaagggctc cctatctact 4320

ggagaatata ctaagggtac tgttgacatt gcgaagagcg acaaagattt tgttatcggc 4380

tttattgctc aaagagacat gggtggaaga gatgaaggtt acgattggtt gattatgaca 4440

cccggtgtgg gtttagatga caagggagac gcattgggtc aacagtatag aaccgtggat 4500

gatgtggtct ctacaggatc tgacattatt attgttggaa gaggactatt tgcaaaggga 4560

agggatgcta aggtagaggg tgaacgttac agaaaagcag gctgggaagc atatttgaga 4620

agatgcggcc agcaaaacta aaaaactgta ttataagtaa atgcatgtat actaaactca 4680

caaattagag cttcaattta attatatcag ttattacccg ggaatctcgg tcgtaatgat 4740

ttttataatg acgaaaaaaa aaaaattgga aagaaaaagc ttggatccac aggacgggtg 4800

tggtcgccat gatcgcgtag tcgatagtgg ctcaacttag actaaggagg tttggggcgc 4860

gccatgaagg ctggtgactg ggtcgccatc tccggtgctg ctggtggtct aggttccttg 4920

gccgtccaat acgccaaggc catgggtttc agagtcctag gtatcgatgg tggtgaaggt 4980

aaggaagaat tgttcaagag cttgggtggt gaagtcttca ttgatttcac caagtctaag 5040

gacattgtcg gtgaagtcat caaggctacc aacggtggtg ctcacggtgt catcaacgtc 5100

tccgtctccg aaaaggccat cgaatcctcc atcgaatact gtagatccaa cggtaccgtc 5160

gttctagtcg gtttgccaaa ggacgccaag tgtaagtccg atgtcttcaa ccaagtcgtc 5220

aagtccatcc acattgttgg ttcttacgtc ggtaacagag ctgacaccag agaagctctt 5280

gacttcttct gcagaggtct agtccacgcc ccaatcaagg ttgtcggttt gtccaccttg 5340

ccagaaattt acgaaaagat gga 5363

<210> 3

<211> 6228

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过在KmADH6中部插入ORF来整合并表达ZrFFZ1的来自pJSS89的表达盒。

<400> 3

cccggggatc ctctagagtc gagcggccgc cgaaagcatt gcgcttgtac ggtacactac 60

tgcatattcg gacgtggaaa cggcaagaaa aaaaagccag gaatgcaagt gcgggaataa 120

gctacgtacc gcacgctgta tacttgtgca ctagatgttt cttgtgcgct tcctatttgt 180

gcgtgaagac gtagagaaga ttatacaata caggtctcga gcgtgcgccg cgaatccagt 240

agattatgtc agaagagcaa atgggaagaa gcaaaagttg gtagggtaga gattatagat 300

gaggacgggt tttgatatga gagattagta attagtaatc acagagagag agagatggaa 360

tagaatgtct tagagacaca catgcacgtt tcacaatgtg taaaagtata aaaagaaggg 420

agcattgaat cttttcttgt caattgttta agctaatgta gttagtatga atttaaagag 480

cgtactacag taagctgata gatagaaggt atatccatac tttagccaaa taaagcgtga 540

ataatgaatg gccttgtatt cgtttttttc cgagagaaaa ttaacaagag cgaaaaaaaa 600

aacgggcttc ggtgaaaatc gggtgaatat gcaactagcg ggacgaatgc tctggaaatg 660

catatcctat gcaactagcg ggatgaacaa atctcacccc agaattcgca ggaaaaaaca 720

ggaaaaaaaa aaagaaggcc accacggcca caaagaccac aaagaccaca aaaaaaaaca 780

aaaaacaacc gtcccagctt ccagtgtttg gaatactgga acacaggaag ccgcataaga 840

gtgggcgttg cacaggaagc caggcccaga agccccagag ttactttttt ttttttgttt 900

tttccttctg ttcgctgtgc ccgcatcaga tgatgcgcct ttatttacga tgccaatgcg 960

aatagcacca gtgagagcac cagtaaaagc atacgcatac acatacacac atagagcaag 1020

caagcaggct agcaaccagg aaaggctgcc agtgactgct actgggtgtc taagaaccgt 1080

agggcggatt attgttgcgg tggttggttg cgggtggtta tgcgatggta cggtgcagaa 1140

tcgtacggtg ttgggttatg gaattagtat gggtatgtga tatgtggtaa tatgtgatat 1200

tgggttattg tgatttggaa tactgaatat cgaatatgga tatggaatat ggctatggca 1260

tggtatggta tgggatggga gtattctatt ttattttatt ctggttcctg cgtttagggt 1320

agggtaggaa gaaggtgagt gcttttgtat ataagtggag tgtctggatc agttttgtgg 1380

attgtgaatg ttagtttccc ctttaatgta tatttgtatt atttgctttt gagtactcaa 1440

taaccaagca caactactag ttttaaagga tccatcctct taaacagtac aaatcgcaaa 1500

gaaaagctcc acacccaaac caaataattg caatggtcaa aatagacgcc agtgcagatt 1560

tggactggaa taatttgcct ccccaacaga ggttgggtag aatcgttggt ggaaaatata 1620

ttgaaaccgt gcacatggat gagtcatcac cagaagccat ggagcgtcca atgacaaaag 1680

tcgagtgtga tatcccatta acttatactg aatctgtgga aaaggacggc aaagaatggg 1740

taatgttaac ttttgcacca ggtgatccag aaaacccatt taattggagt cttagattga 1800

aatggtttct aacgacttta ctgtgcctaa tgacactttt catcggtcta gccaccacgg 1860

cttatattct ggtatagaca gaatggcaaa acactttaac agttcttcgg aagttggtca 1920

gttgggtctt ttcaccttca atgaaacatg ttccattgca cctttgtttc tagcgccatt 1980

ctgtgaattg gttggtagaa aggtgattta caccggtggt tatctttgct tctgtctttg 2040

tttcatcggt cttgcattag gtaaaaatat ggccactatc atttgtttgc gtgcttgttt 2100

aggtttgttt ggttgcattg gtaccattct tgttggtggt actttcgacg atatgtttgt 2160

tgcagatgaa agagctattc ctatggctct gtttgcatat gttgctatcc tgggtaccgt 2220

gggtgctcca atctatgcag gttttattga tcaagccatt ggctggcgtt ggattgaagg 2280

tatccaaggg ttatctaatg ttccattgtt gattatcatc tttttatttt tcaaagaaac 2340

tcgtggtggt gtcaccttgc aaaagagggc caagtctcta cgtaaagata ccggtgatga 2400

gagatgggtg tccaaggaag aattggaggc tcctggtctt aaggatgctc tttacaactc 2460

ctctgttaag gctattaaga tgttaatctc cgagcccgtg gtgtttttct ttggtctttg 2520

gatcagtttc gcatggttcc taaccttttt gtttttgtct gttatcggta ttactttctc 2580

acactttaag cactggagtg aaggtgttgc aggtttacct tatatctccc ttgttattgg 2640

tgttaccatt ggattcttaa ccaacttttt gcaaattcgc aaatacgaaa atatgagaaa 2700

gaagtcaaag tatcctttac cacctgaaaa ccgtttatat ggtgctatga ctggtgccgt 2760

gtttttacct attggtctta tgatctactc tttcactcaa taccactggt tgcactggat 2820

cggtcctaac atcggtttgg catgcatctc tctcggtatc ttcttcatct tcgaatcctg 2880

ttattcctac acttcggatt gttatggtcc tgatgcttct tccgccattg caggtcaagg 2940

tttcatgcgt aatactttag gtgccgtttc accattgttt ggtaagtaca tgttcttaaa 3000

catgcacagt caatgggccg gcctgttgtg tagtctcgtg gctttcggtt tgacattgtt 3060

gcccttcgtc ctttacaaat ttggtcctgc aatccgtgcc agatctaagc gtgctattgt 3120

gtaccatggt gaagaagacg atgaagatga cgaaattgct gaacagcaaa gtagctcaag 3180

tactggagga ggcagatctt tgcaagatga tgctcacgtt gaaaatgcta acaacaacca 3240

gttattcgaa aagaacgaag gttctcgtga atctgattct ccagagactg ctagagagac 3300

tgattcccta tcaccttccg aaaaggtaga taaccatgct ggagtatctc gtagcgtgga 3360

agaacactca gataccgttt ctgaaagtga attacatggc catactggtc gtgcatgaac 3420

gttgtcattt tcatttcatt tcatttcata acatttctgt tttcatttgt ctttttttct 3480

gttattataa ttaacaaacg agaatggatc ttataaattc gtaacgatgg ccttcatacc 3540

acaattccat ctgaattact aacactatta actttatatt tttctttctg tctaacgaac 3600

ggtgtaaagc atatgataat aaattaacta tataggtttt aaaaaaagta tagaacgaac 3660

ttaaatgata tcaggataat tgaagatgtt tttttttact ttttgtttgc ttatatatta 3720

caaatataat gggaggggta cggagataaa actgtaagcg ggaacaatgg ttgtaaacgt 3780

caaacttcat gactccaaca agttagactt ttgcgtagcg tctgcacctg aaaatccggg 3840

gccgatacca acaagctaac actaacaaat actgtagaga cacggtacct agcaagttcc 3900

tagacacata aacagacaat ctagtacaca cggaagccag acaaccgcta caggcactac 3960

ttacgttatc tgcatttatc ctaatgaggc aaaaatctag aaaccatgga gactaccccg 4020

cgattaaagg cgattaaaag aaagtaccac aacgtagaac agagccgaac ttaaagtgga 4080

acaggtgtct acgagctgta cttcccgagc tggtttctcc aaacagccaa tgatcatacc 4140

aagatctgat gtatggcaac gttgttcacg tttgacatac gcagtatggt tgacaagaat 4200

cagggctctc aagctcagtt gagcggtttc cgggtcaaat tgctatgaat tcagtgatga 4260

gaattaatgc aactcccttc tttgtgacta gttcctacac tcaattgaaa cacggcatga 4320

gaattataaa actctaaagc aggtctaaac ttatactttg catgtcgttg catttccccc 4380

gtcttctaaa aaacataacc ctttcaatta tacttatata taatataata tgaattcgtc 4440

attctatgca gcattattat acagatccag atacaaatac gaagccattt tacaaaaaaa 4500

aaaaagatta tactacaaaa gttttgaagt agaatcgtaa gctttttctt tccaattttt 4560

tttttttcgt cattataaaa atcattacga ccgagattcc cgggtaataa ctgatataat 4620

taaattgaag ctctaatttg tgagtttagt atacatgcat ttacttataa tacagttttt 4680

tagttttgct ggccgcatct tctcaaatat gcttcccagc ctgcttttct gtaacgttca 4740

ccctctacct tagcatccct tccctttgca aatagtcctc ttccaacaat aataatgtca 4800

gatcctgtag agaccacatc atccacggtt ctatactgtt gacccaatgc gtctcccttg 4860

tcatctaaac ccacaccggg tgtcataatc aaccaatcgt aaccttcatc tcttccaccc 4920

atgtctcttt gagcaataaa gccgataaca aaatctttgt cgctcttcgc aatgtcaaca 4980

gtacccttag tatattctcc agtagatagg gagcccttgc atgacaattc tgctaacatc 5040

aaaaggcctc taggttcctt tgttacttct tctgccgcct gcttcaaacc gctaacaata 5100

cctgggccca ccacaccgtg tgcattcgta atgtctgccc attctgctat tctgtataca 5160

cccgcagagt actgcaattt gactgtatta ccaatgtcag caaattttct gtcttcgaag 5220

agtaaaaaat tgtacttggc ggataatgcc tttagcggct taactgtgcc ctccatggaa 5280

aaatcagtca agatatccac atgtgttttt agtaaacaaa ttttgggacc taatgcttca 5340

actaactcca gtaattcctt ggtggtacga acatccaatg aagcacacaa gtttgtttgc 5400

ttttcgtgca tgatattaaa tagcttggca gcaacaggac taggatgagt agcagcacgt 5460

tccttatatg tagctttcga catgatttat cttcgtttcc tgcaggtttt tgttctgtgc 5520

agttgggtta agaatactgg gcaatttcat gtttcttcaa cactacatat gcgtatatat 5580

accaatctaa gtctgtgctc cttccttcgt tcttccttct gttcggagat taccgaatca 5640

aaaaaatttc aaagaaaccg aaatcaaaaa aaagaataaa aaaaaaatga tgaattgacg 5700

tgttggtgtt ggtgcgcaag tcagatcctg tttggaatgt agacgttgta aggaggacaa 5760

cgaaccatac tgtccaaagt tcgtcactac ttactcgcaa ccatacccag aagatggtta 5820

cgtttcccaa ggtggttacg cctctcatat cagattgcat gagcactttg ccattccaat 5880

cccagaatct ctagaagccg cttacactgc tcctctactt tgcggtggtg gtactgtcta 5940

ctctccattg aagagatacg gctgtggtcc aggtaagaag gttggtatcg tcggtatcgg 6000

tggtattggt cacatgggta tccttttggc caaggctatg ggtgctgaag tttacgccat 6060

ctccagatct cacgctaaag aagaagctgc caagaaattg ggtgctgacc actacattgc 6120

taccaaggat gaaggctggg aattggaaaa ctttgacaaa ttggacttga tcgttctatg 6180

tgccagctcc ttgaccgagc ggccgcgccg ggtcacccgg ccagcgac 6228

<210> 4

<211> 6094

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于整合并表达ZrFFZ1以及同时缺失KmADH6 ORF的来自pJSS90的表达盒。

<400> 4

cccggggatc ctctagagtc gagcggccgc tttgatatga gagattagta attagtaatc 60

acagagagag agagatggaa tagaatgtct tagagacaca catgcacgtt tcacaatgtg 120

taaaagtata aaaagaaggg agcattgaat cttttcttgt caattgttta agctaatgta 180

gttagtatga atttaaagag cgtactacag taagctgata gatagaaggt atatccatac 240

tttagccaaa tagtcaaata atgtcctacc cagatagttt ccaaggtttc gctgtcgtta 300

atgaccacaa gaactggttg aacccagaaa agatcgttta cccagccaag aagttcggtc 360

ctcaagacgt tgatgtcgag atcgaagctt gcggtgtttg tggtagtgat gtccattgtg 420

ccaacggtaa ctggggtaat caaaagttgc cattagttgt tggtcacgaa gtcatcggta 480

aggttatcag agttggtgaa gaatgtacca ctggtatcaa ggttggtgac taaagcgtga 540

ataatgaatg gccttgtatt cgtttttttc cgagagaaaa ttaacaagag cgaaaaaaaa 600

aacgggcttc ggtgaaaatc gggtgaatat gcaactagcg ggacgaatgc tctggaaatg 660

catatcctat gcaactagcg ggatgaacaa atctcacccc agaattcgca ggaaaaaaca 720

ggaaaaaaaa aaagaaggcc accacggcca caaagaccac aaagaccaca aaaaaaaaca 780

aaaaacaacc gtcccagctt ccagtgtttg gaatactgga acacaggaag ccgcataaga 840

gtgggcgttg cacaggaagc caggcccaga agccccagag ttactttttt ttttttgttt 900

tttccttctg ttcgctgtgc ccgcatcaga tgatgcgcct ttatttacga tgccaatgcg 960

aatagcacca gtgagagcac cagtaaaagc atacgcatac acatacacac atagagcaag 1020

caagcaggct agcaaccagg aaaggctgcc agtgactgct actgggtgtc taagaaccgt 1080

agggcggatt attgttgcgg tggttggttg cgggtggtta tgcgatggta cggtgcagaa 1140

tcgtacggtg ttgggttatg gaattagtat gggtatgtga tatgtggtaa tatgtgatat 1200

tgggttattg tgatttggaa tactgaatat cgaatatggg atatggaata tggctatggc 1260

atggtatggt atgggatggg agtattctat tttattttat tcggttcctg cgtttagggt 1320

agggtaggaa gaaggtgagt gcttttgtat ataagtggag tgtctggatc agttttgtgg 1380

attgtgaatg ttagtttccc ctttaatgta tatttgtatt atttgctttt gagtactcaa 1440

taaccaagca caactactag ttttaaagga tccatcctct taaacagtac aaatcgcaaa 1500

gaaaagctcc acacccaaac caaataattg caatggtcaa aatagacgcc agtgcagatt 1560

tggactggaa taatttgcct ccccaacaga ggttgggtag aatcgttggt ggaaaatata 1620

ttgaaaccgt gcacatggat gagtcatcac cagaagccat ggagcgtcca atgacaaaag 1680

tcgagtgtga tatcccatta acttatactg aatctgtgga aaaggacggc aaagaatggg 1740

taatgttaac ttttgcacca ggtgatccag aaaacccatt taattggagt cttagattga 1800

aatggtttct aacgacttta ctgtgcctaa tgacactttt catcggtcta gccaccacgg 1860

cttatagttc tggtatagac agaatggcaa aacactttaa cagttcttcg gaagttggtc 1920

agttgggtct tttcaccttc aatgaaacat gttccattgc acctttgttt ctagcgccat 1980

tctgtgaatt ggttggtaga aaggtgattt acaccggtgg ttatctttgc ttctgtcttt 2040

gtttcatcgg tcttgcatta ggtaaaaata tggccactat catttgtttg cgtgcttgtt 2100

taggtttgtt tggttgcatt ggtaccattc ttgttggtgg tactttcgac gatatgtttg 2160

ttgcagatga aagagctatt cctatggctc tgtttgcata tgttgctatc ctgggtaccg 2220

tgggtgctcc aatctatgca ggttttattg atcaagccat tggctggcgt tggattgaag 2280

gtatccaagg gttatctaat gttccattgt tgattatcat ctttttattt ttcaaagaaa 2340

ctcgtggtgg tgtcaccttg caaaagaggg ccaagtctct acgtaaagat accggtgatg 2400

agagatgggt gtccaaggaa gaattggagg ctcctggtct taaggatgct ctttacaact 2460

cctctgttaa ggctattaag atgttaatct ccgagcccgt ggtgtttttc tttggtcttt 2520

ggatcagttt cgcatggttc ctaacctttt tgtttttgtc tgttatcggt attactttct 2580

cacactttaa gcactggagt gaaggtgttg caggtttacc ttatatctcc cttgttattg 2640

gtgttaccat tggattctta accaactttt tgcaaattcg caaatacgaa aatatgagaa 2700

agaagtcaaa gtatccttta ccacctgaaa accgtttata tggtgctatg actggtgccg 2760

tgtttttacc tattggtctt atgatctact ctttcactca ataccactgg ttgcactgga 2820

tcggtcctaa catcggtttg gcatgcatct ctctcggtat cttcttcatc ttcgaatcct 2880

gttattccta cacttcggat tgttatggtc ctgatgcttc ttccgccatt gcaggtcaag 2940

gtttcatgcg taatacttta ggtgccgttt caccattgtt tggtaagtac atgttcttaa 3000

acatgcacag tcaatgggcc ggcctgttgt gtagtctcgt ggctttcggt ttgacattgt 3060

tgcccttcgt cctttacaaa tttggtcctg caatccgtgc cagatctaag cgtgctattg 3120

tgtaccatgg tgaagaagac gatgaagatg acgaaattgc tgaacagcaa agtagctcaa 3180

gtactggagg aggcagatct ttgcaagatg atgctcacgt tgaaaatgct aacaacaacc 3240

agttattcga aaagaacgaa ggttctcgtg aatctgattc tccagagact gctagagaga 3300

ctgattccct atcaccttcc gaaaaggtag ataaccatgc tggagtatct cgtagcgtgg 3360

aagaacactc agataccgtt tctgaaagtg aattacatgg ccatactggt cgtgcatgaa 3420

cgttgtcatt ttcatttcat ttcatttcat aacatttctg ttttcatttg tctttttttc 3480

tgttattata attaacaaac gagaatggat cttataaatt cgtaacgatg gccttcatac 3540

cacaattcca tctgaattac taacactatt aactttatat ttttctttct gtctaacgaa 3600

cggtgtaaag catatgataa taaattcgtc cggcgtagag gatcctcaat tcatcatttt 3660

ttttttattc ttttttttga tttcggtttc tttgaaattt ttttgattcg gtaatctccg 3720

aacagaagga agaacgaagg aaggagcaca gacttagatt ggtatatata cgcatatgta 3780

gtgttgaaga aacatgaaat tgcccagtat tcttaaccca actgcacaga acaaaaacct 3840

gcaggaaacg aagataaatc atgtcgaaag ctacatataa ggaacgtgct gctactcatc 3900

ctagtcctgt tgctgccaag ctatttaata tcatgcacga aaagcaaaca aacttgtgtg 3960

cttcattgga tgttcgtacc accaaggaat tactggagtt agttgaagca ttaggtccca 4020

aaatttgttt actaaaaaca catgtggata tcttgactga tttttccatg gagggcacag 4080

ttaagccgct aaaggcatta tccgccaagt acaatttttt actcttcgaa gacagaaaat 4140

ttgctgacat tggtaataca gtcaaattgc agtactctgc gggtgtatac agaatagcag 4200

aatgggcaga cattacgaat gcacacggtg tggtgggccc aggtattgtt agcggtttga 4260

agcaggcggc agaagaagta acaaaggaac ctagaggcct tttgatgtta gcagaattgt 4320

catgcaaggg ctccctatct actggagaat atactaaggg tactgttgac attgcgaaga 4380

gcgacaaaga ttttgttatc ggctttattg ctcaaagaga catgggtgga agagatgaag 4440

gttacgattg gttgattatg acacccggtg tgggtttaga tgacaaggga gacgcattgg 4500

gtcaacagta tagaaccgtg gatgatgtgg tctctacagg atctgacatt attattgttg 4560

gaagaggact atttgcaaag ggaagggatg ctaaggtaga gggtgaacgt tacagaaaag 4620

caggctggga agcatatttg agaagatgcg gccagcaaaa ctaaacgttg tcattttcat 4680

ttcatttcat ttcataacat ttctgttttc atttgtcttt ttttctgtta ttataattaa 4740

caaacgagaa tggatcttat aaattcgtaa cgatggcctt cataccacaa ttccatctga 4800

attactaaca ctattaactt tatatttttc tttctgtcta acgaacggtg taaagcatat 4860

gataataaat taactatata ggttttaaaa aaagtataga acgaacttaa atgatatcag 4920

gataattgaa gatgtttttt tttacttttt gtttgcttat atattacaaa tataatggga 4980

ggggtacgga gataaaactg taagcgggaa caatggttgt aaacgtcaaa cttcatgact 5040

ccaacaagtt agacttttgc gtagcgtctg cacctgaaaa tccggggccg ataccaacaa 5100

gctaacacta acaaatactg tagagacacg gtacctagca agttcctaga cacataaaca 5160

gacaatctag tacacacgga agccagacaa ccgctacagg cactacttac gttatctgca 5220

tttatcctaa tgaggcaaaa atctagaaac catggagact accccgcgat taaaggcgat 5280

taaaagaaag taccacaacg tagaacagag ccgaacttaa agtggaacag gtgtctacga 5340

gctgtacttc ccgagctggt ttctccaaac agccaatgat cataccaaga tctgatgtat 5400

ggcaacgttg ttcacgtttg acatacgcag tatggttgac aagaatcagg gctctcaagc 5460

tcagttgagc ggtttccggg tcaaattgct atgaattcag tgatgagaat taatgcaact 5520

cccttctttg tgactagttc ctacactcaa ttgaaacacg gcatcgtgtt ggtgttggtg 5580

cgcaagtcag atcctgtttg gaatgtagac gttgtaagga ggacaacgaa ccatactgtc 5640

caaagttcgt cactacttac tcgcaaccat acccagaaga tggttacgtt tcccaaggtg 5700

gttacgcctc tcatatcaga ttgcatgagc actttgccat tccaatccca gaatctctag 5760

aagccgctta cactgctcct ctactttgcg gtggtggtac tgtctactct ccattgaaga 5820

gatacggctg tggtccaggt aagaaggttg gtatcgtcgg tatcggtggt attggtcaca 5880

tgggtatcct tttggccaag gctatgggtg ctgaagttta cgccatctcc agatctcacg 5940

ctaaagaaga agctgccaag aaattgggtg ctgaccacta cattgctacc aaggatgaag 6000

gctgggaatt ggaaaacttt gacaaattgg acttgatcgt tctatgtgcc agctccttga 6060

ccgagcggcc gcgccgggtc acccggccag cgac 6094

<210> 5

<211> 6398

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有用于在三个基因座的任何一个处将EcldhA表达盒替换为PaldhL表达盒的整合表达盒的质粒pMS155。

<400> 5

agcatacgca tacacataca cacatagagc aagcaagcag gctagcaacc aggaaaggct 60

gccagtgact gctactgggt gtctaagaac cgtagggcgg attattgttg cggtggttgg 120

ttgcgggtgg ttatgcgatg gtacggtgca gaatcgtacg gtgttgggtt atggaattag 180

tatgggtatg tgatatgtgg taatatgtga tattgggtta ttgtgatttg gaatactgaa 240

tatcgaatat gggatatgga atatggctat ggcatggtat ggtatgggat gggagtattc 300

tattttattt tattctggtt cctgcgttta gggtagggta ggaagaaggt gagtgctttt 360

gtatataagt ggagtgtctg gatcagtttt gtggattgtg aatgttagtt tcccctttaa 420

tgtatatttg tattatttgc ttttgagtac tcaataccaa gcacaactac tagttttaaa 480

ggatccatcc tcttaaacag tacaaatcgc aaagaaaagc tccacaccca aaccaaataa 540

ttgcaatgtc taatattcaa aatcatcaaa aagttgtcct cgtcggtgac ggtgccgtag 600

gttctagtta cgcattcgcg atggcactac aaggaatcgc tgaagaattc gtcattgtcg 660

acgttgttaa ggatcgtaca gttggggacg cattggacct tgaagatgct actccattca 720

cagctccaaa gaacatctac tctggtgaat actcagactg caaggatgct gacttagttg 780

ttatcacagc tggcgcacca caaaagccag gtgaaacacg tcttgacctt gttaacaaga 840

acttaaacat cctttcaacg attgttaaac cagttgttga ttctggtttt gatggtatct 900

tccttgttgc tgctaaccca gttgatatcc ttacttacgc aacatggaaa ttctctggct 960

tccctaagga aaaagttatc ggttcaggta tctcacttga cacagctcgt ttgcgcgtag 1020

ctcttggtaa gaaattcaac gttagcccag aatctgtaga tgcttacatc ttaggtgaac 1080

atggtgacag tgaatttgct gcttactcat cagctacaat cggtacaaag ccattgcttg 1140

aaatcgctaa agaagaaggc gtttcaactg acgaattggc tgaaatcgaa gacagcgtac 1200

gtaacgcagc ttacgaaatc atcaacaaga agggtgctac attctacggt gttggtactg 1260

cattgatgcg catttctaaa gcaattcttc gcgacgaaaa cgccgtattg cctgttggtg 1320

catacatgga tggcgaatat ggtttgaacg acatttacat tggtactcct gcagttatca 1380

atggtcaagg tctaaaccgc gttatcgaag caccacttag cgatgacgaa aagaagaaga 1440

tgactgactc agcaactact ttgaagaagg ttcttactga cggtctaaac gctcttgctg 1500

aaaaacaaga caaataaggc gcgggagatt gataagactt ttctagttgc atatctttta 1560

tatttaaatc ttatctatta gttaattttt tgtaatttat ccttatatat agtctggtta 1620

ttctaaaata tcatttcagt atctaaaaat tcccctcttt tttcagttat atcttaacag 1680

gcgacagtcc aaatgttgat ttatcccagt ccgattcatc agggttgtga agccaatact 1740

gccatttcaa agaatacgta aataattaat agtagtgatt ttcctaactt tatttagtca 1800

aaaaattagc cttttaattc tgctgtaacc cgtacatgcc caaaataggg ggcgggttac 1860

acagaatata taacatcgta ggtgtctggg tgaacagttt attcctggca tccactaaat 1920

ataatggagc ccgcttttta agctggcatc cagaaaaaaa aagaatccca gcaccaaaat 1980

attgttttct tcaccaacca tcagttcata ggtccattct cttagcgcaa ctacagagaa 2040

caggggcaca aacaggcaaa aaacgggcac aacctcaatg gagtgatgca acctgcctgg 2100

agtaaatgat gacacaaggc aattgaccca cgcatgtatc tatctcattt tcttacacct 2160

tctattacct tctgctctct ctgatttgga aaaagctgaa aaaaaaggtt gaaaccagtt 2220

ccctgaaatt attcccctac ttgactaata agtatataaa gacggtaggt attgattgta 2280

attctgtaaa tctatttctt aaacttctta aattctactt ttatagttag tctttttttt 2340

agttttaaaa caccaagaac ttagtttcga ataaacacac ataaacaaac aaaatgtcga 2400

ctaagagtta ctcggaaaga gcagctgctc atagaagtcc agttgctgcc aagcttttaa 2460

acttgatgga agagaagaag tcaaacttat gtgcttctct tgatgttcgt aaaacagcag 2520

agttgttaaa attagtcgag gttttgggtc catatatctg tctattgaag acacatgtag 2580

atatcttgga ggatttcagc tttgagaata ccattgtgcc gttgaagcaa ttagcagaga 2640

aacacaagtt tttgatattt gaagacagga agtttgccga cattgggaac actgttaaat 2700

tacaatacac gtctggtgta taccgtatcg ccgaatggtc tgatatcacc aatgcacacg 2760

gtgtgactgg tgcgggcatt gttgctggtt tgaagcaagg tgccgaggaa gttacgaaag 2820

aacctagagg gttgttaatg cttgccgagt tatcgtccaa ggggtctcta gcgcacggtg 2880

aatacactcg tgggaccgtg gaaattgcta agagtgataa ggactttgtt attggattta 2940

ttgctcaaaa cgatatgggt ggaagagaag agggctacga ttggttgatc atgacgccag 3000

gtgttggtct tgatgacaaa ggtgatgctt tgggacaaca atacagaact gtggatgaag 3060

ttgttgccgg tggatcagac atcattattg ttggtagagg tcttttcgca aagggaagag 3120

atcctgtagt ggaaggtgag agatacagaa aggcgggatg ggacgcttac ttgaagagag 3180

taggcagatc cgcttaatca tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac gccctccccc 3240

cacatccgct ctaaccgaaa aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg tccctattta 3300

tttttttata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt ttcttttttt 3360

tctgtacaga cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg agaaggtttt 3420

gggacgctcg aaggctttaa tttgcgtgat gctaacttct ctctggaagg tctgaccggc 3480

tttactatgt atggcaaaac ggcaggcgtt atcggtaccg gtaaaatcgg tgtggcgatg 3540

ctgcgcattc tgaaaggttt tggtatgcgt ctgctggcgt tcgatccgta tccaagtgca 3600

gcggcgctgg aactcggtgt ggagtatgtc gatctgccaa ccctgttctc tgaatcagac 3660

gttatctctc tgcactgccc gctgacaccg gaaaactatc atctgttgaa cgaagccgcc 3720

ttcgaacaga tgaaaaatgg cgtgatgatc gtcaatacca gtcgcggtgc attgattgat 3780

tctcaggcag caattgaagc gctgaaaaat cagaaaattg gttcgttggg tatggacgtg 3840

tatgagaacg aacgcgatct attctttgaa gataaatcca acgacgtgat ccaggatgac 3900

gtattccgtc gcctgtctgc ctgccacaac gtgctgttta ccgggcacca ggcattcctg 3960

acagcagaag ctctgaccag tatttctcag actacgctgc aaaacttaag caatctggaa 4020

aaaggcgaaa cctgcccgaa gaactggtct accctgtgga acacctacat ctgtattaac 4080

gaagcgctaa ccgtttttat caggctctgg gaggcagaat aaatgatcat atcgtcaatt 4140

attacctcca cggggagagc ctgagcaaac tggcctcagg catttgagaa gcacacggtc 4200

acactgcttc cggtagtcaa taaaccggta aaccagcaat agacataagc ggctatttaa 4260

cgaccctgcc ctgaaccgac gaccgggtcg aatttgcttt cgaatttctg ccattcatcc 4320

gcttattatc acttattcag gcgtagcacc aggcgtttaa gggcaccaat aactgcctta 4380

aaaaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 4440

gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 4500

cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 4560

attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 4620

catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 4680

ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 4740

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 4800

cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag 4860

aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 4920

cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 4980

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 5040

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 5100

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 5160

tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg acaccaggat ttatttattc 5220

tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc 5280

caacttactg atttagtgta tgatggtgtt tttgaggtgc tccagtggct tctgtttcta 5340

tcagctgtcc ctcctgttca gctactgacg gggtggtgcg taacggcaaa agcaccgccg 5400

gacatcagcg ctagcggagt gtatactggc ttactatgtt ggcactgatg agggtgtcag 5460

tgaagtgctt catgtggcag gagaaaaaag gctgcaccgg tgcgtcagca gaatatgtga 5520

tacaggatat attccgcttc ctcgctcact gactcgctac gctcggtcgt tcgactgcgg 5580

cgagcggaaa tggcttacga acggggcgga gatttcctgg aagatgccag gaagatactt 5640

aacagggaag tgagagggcc gcggcaaagc cgtttttcca taggctccgc ccccctgaca 5700

agcatcacga aatctgacgc tcaaatcagt ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 5760

accaggcgtt tccccctggc ggctccctcg tgcgctctcc tgttcctgcc tttcggttta 5820

ccggtgtcat tccgctgtta tggccgcgtt tgtctcattc cacgcctgac actcagttcc 5880

gggtaggcag ttcgctccaa gctggactgt atgcacgaac cccccgttca gtccgaccgc 5940

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccacccgga aagacatgca aaagcaccac 6000

tggcagcagc cactggtaat tgatttagag gagttagtct tgaagtcatg cgccggttaa 6060

ggctaaactg aaaggacaag ttttggtgac tgcgctcctc caagccagtt acctcggttc 6120

aaagagttgg tagctcagag aaccttcgaa aaaccgccct gcaaggcggt tttttcgttt 6180

tcagagcaag agattacgcg cagaccaaaa cgatctcaag aagatcatct tattaatcag 6240

ataaaatatt tctagatttc agtgcaattt atctcttcaa atgtagcacc tgaagtcagc 6300

cccatacgat ataagttgta attctcatgt ttgacagctt atcatcgata agctttaatg 6360

cggtagttta tcacagttaa attgctaacg cagtcagg 6398

<210> 6

<211> 8515

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于在酿酒酵母HO基因座处整合的含有ZrFFZ1表达盒的质粒pRY789。

<400> 6

tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 60

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 120

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa 180

ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat 240

ggccgcggac agcatcaaac tgtaagattc cgccacattt tatacactct ggtcctttaa 300

ctggcaaacc ttcgggcgta atgcccaatt tttcgccttt gtcttttgcc tttttcactt 360

cacgtgcttc tggtacatac ttgcaattta tacagtgatg accgctgaat ttgtatcttc 420

catagcatct agcacatact cgatttttac cactccaatc tttataaaaa tacttgattc 480

cctttctggg acaagcaaca cagtgtttta gattcttttt ttgtgatatt ttaagctgtt 540

ctcccacaca gcagcctcga catgatttca cttctatttt gttgccaagc aagaaatttt 600

tatggccttc tatcgtaagc ccatatacag tactctcacc ctggaaatca tccgtgaagc 660

tgaaatatac gggttccctt tttataattg gcggaacttc tcttgttttg tgaccacttc 720

gacaatatga caaaacattc tgtgaagttg ttcccccagc aacattacag tcgtatgtaa 780

attgacattg gacttttctt ccttcaatga tttcctccct agctgacctg gtcgtcacag 840

tagctgacat accaagagat cttgaaatat ggacaattcc gtccataatg gatgaataaa 900

cagtttgaat tgctatttta taagattcag ggccttcgcc ctttttcaca acgtacccat 960

ctgagtcgat caagccggct aagaatgctt cacgaacttc tatatgctcg ccgtacataa 1020

attcagggat ttgcttctct ccatcaagat cccttttaaa ctttaaaatt gtgacagctt 1080

tccagaatgg attatttttc ctcaaattcc ttgtcttcct gttttcatct ggaccatctc 1140

cataatgaag ccttacatgt ttggcacgta gcggaacgtg atcgtcacaa accgtaaggt 1200

agagacccca gattttcgca ttttctctta aactctccat tagcttagga tccaagctat 1260

ctactgagat ttctggctct tttgttgtac tgtcacctaa ccacagaccc agcgtgaata 1320

atgaatggcc ttgtattcgt ttttttccga gagaaaatta acaagagcga aaaaaaaaac 1380

gggcttcggt gaaaatcggg tgaatatgca actagcggga cgaatgctct ggaaatgcat 1440

atcctatgca actagcggga tgaacaaatc tcaccccaga attcgcagga aaaaacagga 1500

aaaaaaaaaa gaaggccacc acggccacaa agaccacaaa gaccacaaaa aaaaacaaaa 1560

aacaaccgtc ccagcttcca gtgtttggaa tactggaaca caggaagccg cataagagtg 1620

ggcgttgcac aggaagccag gcccagaagc cccagagtta cttttttttt tttgtttttt 1680

ccttctgttc gctgtgcccg catcagatga tgcgccttta tttacgatgc caatgcgaat 1740

agcaccagtg agagcaccag taaaagcata cgcatacaca tacacacata gagcaagcaa 1800

gcaggctagc aaccaggaaa ggctgccagt gactgctact gggtgtctaa gaaccgtagg 1860

gcggattatt gttgcggtgg ttggttgcgg gtggttatgc gatggtacgg tgcagaatcg 1920

tacggtgttg ggttatggaa ttagtatggg tatgtgatat gtggtaatat gtgatattgg 1980

gttattgtga tttggaatac tgaatatcga atatgggata tggaatatgg ctatggcatg 2040

gtatggtatg ggatgggagt attctatttt attttattct ggttcctgcg tttagggtag 2100

ggtaggaaga aggtgagtgc ttttgtatat aagtggagtg tctggatcag ttttgtggat 2160

tgtgaatgtt agtttcccct ttaatgtata tttgtattat ttgcttttga gtactcaata 2220

accaagcaca actactagtt ttaaaggatc catcctctta aacagtacaa atcgcaaaga 2280

aaagctccac acccaaacca aataattgca atggtcaaaa tagacgccag tgcagatttg 2340

gactggaata atttgcctcc ccaacagagg ttgggtagaa tcgttggtgg aaaatatatt 2400

gaaaccgtgc acatggatga gtcatcacca gaagccatgg agcgtccaat gacaaaagtc 2460

gagtgtgata tcccattaac ttatactgaa tctgtggaaa aggacggcaa agaatgggta 2520

atgttaactt ttgcaccagg tgatccagaa aacccattta attggagtct tagattgaaa 2580

tggtttctaa cgactttact gtgcctaatg acacttttca tcggtctagc caccacggct 2640

tatagttctg gtatagacag aatggcaaaa cactttaaca gttcttcgga agttggtcag 2700

ttgggtcttt tcaccttcaa tgaaacatgt tccattgcac ctttgtttct agcgccattc 2760

tgtgaattgg ttggtagaaa ggtgatttac accggtggtt atctttgctt ctgtctttgt 2820

ttcatcggtc ttgcattagg taaaaatatg gccactatca tttgtttgcg tgcttgttta 2880

ggtttgtttg gttgcattgg taccattctt gttggtggta ctttcgacga tatgtttgtt 2940

gcagatgaaa gagctattcc tatggctctg tttgcatatg ttgctatcct gggtaccgtg 3000

ggtgctccaa tctatgcagg ttttattgat caagccattg gctggcgttg gattgaaggt 3060

atccaagggt tatctaatgt tccattgttg attatcatct ttttattttt caaagaaact 3120

cgtggtggtg tcaccttgca aaagagggcc aagtctctac gtaaagatac cggtgatgag 3180

agatgggtgt ccaaggaaga attggaggct cctggtctta aggatgctct ttacaactcc 3240

tctgttaagg ctattaagat gttaatctcc gagcccgtgg tgtttttctt tggtctttgg 3300

atcagtttcg catggttcct aacctttttg tttttgtctg ttatcggtat tactttctca 3360

cactttaagc actggagtga aggtgttgca ggtttacctt atatctccct tgttattggt 3420

gttaccattg gattcttaac caactttttg caaattcgca aatacgaaaa tatgagaaag 3480

aagtcaaagt atcctttacc acctgaaaac cgtttatatg gtgctatgac tggtgccgtg 3540

tttttaccta ttggtcttat gatctactct ttcactcaat accactggtt gcactggatc 3600

ggtcctaaca tcggtttggc atgcatctct ctcggtatct tcttcatctt cgaatcctgt 3660

tattcctaca cttcggattg ttatggtcct gatgcttctt ccgccattgc aggtcaaggt 3720

ttcatgcgta atactttagg tgccgtttca ccattgtttg gtaagtacat gttcttaaac 3780

atgcacagtc aatgggccgg cctgttgtgt agtctcgtgg ctttcggttt gacattgttg 3840

cccttcgtcc tttacaaatt tggtcctgca atccgtgcca gatctaagcg tgctattgtg 3900

taccatggtg aagaagacga tgaagatgac gaaattgctg aacagcaaag tagctcaagt 3960

actggaggag gcagatcttt gcaagatgat gctcacgttg aaaatgctaa caacaaccag 4020

ttattcgaaa agaacgaagg ttctcgtgaa tctgattctc cagagactgc tagagagact 4080

gattccctat caccttccga aaaggtagat aaccatgctg gagtatctcg tagcgtggaa 4140

gaacactcag ataccgtttc tgaaagtgaa ttacatggcc atactggtcg tgcatgaaat 4200

atctatatca caagatggac tcaatgttga gcaaagcagg acgagaaaaa aaaaaataat 4260

gattgttaag aagttcatga aaaaaaaaag aaaaaatact caaatactta taacagagtg 4320

attaaataat aaacgacagt ataccctatc aggtattcag atagttttat ttttgtaggt 4380

atataatctg aagcctttga actattttct cgtatatatc atggagtata cattgcatta 4440

gcaacattac atactagtga cttttgagaa gtggcttttg gtttctcaat tttttgaagg 4500

aaacatcctt ggacctgtgg caactcctcc aataattctt cgaagttatg ttgaactttt 4560

cgtggtttca cacctaataa cgcccagcgg tagtacaatt caaagtagta ggtaccaatg 4620

gtagtactag tgggtgatag tagcaaattt ctctatgaaa atgaattgtt gctctgcaat 4680

gatgttaatg tggacatgac atgaattttc gcgatatgtt gatgtaaata ataacatgat 4740

tttcgtggat catttcgtaa accataggtt tatttcgtga attactaaga gaaaggcata 4800

gaaacaggac ttgcgaaccc tttctgtaat atgtcataat atttcaatac acgcacaaaa 4860

aaggtacgtt aatttccatg gtaatcgtgt atttagttac atcacttttc gtgacacaca 4920

tgaatacatt tgcccttaag ccctgtgtag gattgatttc ttttttcgtg acgcacatgt 4980

cttcaactgc atcaatttcc atgagacaca cacgtctacc atgttgtcag atctcatgaa 5040

tctttcatgt attcattcac atcattttcg tggatcctct aattgtatcg agatcacttt 5100

tcgtgatccg ctaatcagcg acggtcacat taggtttgcc aagtcagggt atgaaccata 5160

cgatcagttt tcgtgaacct ggtacgtata ttgtggcgtt tgtgtatatt ttcattcttt 5220

gacaacaatc aataccaacc tcaaatagga aaagtaataa gtttggcgtt acaccccaaa 5280

agacgccaaa cggatcgaac ttactcaata gcaattagcg agacaaaacc tacgttaaga 5340

cctgtaaccg atttatcaaa gcactctgcg gttctttctt gggaatatta cctggacatt 5400

ttgtgccctc aagaaacgag gctctacgag cctgttggag cccctcagac attagccgcc 5460

acgaatcaaa ctttttacgc gattcggccc aaatcagttt ctcacagatc attcgtagag 5520

tgaaaaagca catcgattat ttgatacccc tttgggttaa ttactgttga ggtcttttct 5580

atttctgatt gaaatttttg ctccagcatt atagcatgct ggtttttttt ttaaattgat 5640

gtatctcatc gcaggcacgg gcagtacagt gccctgagcg tagggaaaaa tgaaaaaaag 5700

gatgtaactt ttaacataat tccagcacgc agcgattggg tataatgaag attgttaagt 5760

tcaacaacat gtgaaattct tagctccgca acttgcttga attatgagct cccaacgcgt 5820

tggatgcata gcttgagtat tctatagtgt cacctaaata gcttggcgta atcatggtca 5880

tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 5940

agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 6000

cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 6060

caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 6120

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 6180

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 6240

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 6300

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 6360

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 6420

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 6480

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 6540

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 6600

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 6660

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga 6720

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 6780

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 6840

attacgcgca gaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 6900

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 6960

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 7020

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 7080

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 7140

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 7200

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 7260

tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 7320

ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 7380

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 7440

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 7500

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 7560

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 7620

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 7680

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 7740

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 7800

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 7860

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 7920

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 7980

ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgat gcggtgtgaa 8040

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcagga aattgtaagc gttaatattt 8100

tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa 8160

tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag 8220

tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg 8280

tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga 8340

ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg 8400

gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg 8460

cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaa 8515

<210> 7

<211> 8458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有用于在三个基因座的任何一个处将EcldhA表达盒替换为BcldhL表达盒的整合表达盒的质粒pBc-ldhL-int。

<400> 7

atgtctgaat tagttgtttt caaagcaaat gaactagcga ttagtcgcta tgacttaacg 60

gagcatgaaa ccaagctaat tttatgctgt gtggcactac tcaaccccac gattgaaaac 120

cctacaagga aagaacggac ggtatcgttc acttataacc aatacgctca gatgatgaac 180

atcagtaggg aaaatgctta tggtgtatta gctaaagcaa ccagagagct gatgacgaga 240

actgtggaaa tcaggaatcc tttggttaaa ggctttgaga ttttccagtg gacaaactat 300

gccaagttct caagcgaaaa attagaatta gtttttagtg aagagatatt gccttatctt 360

ttccagttaa aaaaattcat aaaatataat ctggaacatg ttaagtcttt tgaaaacaaa 420

tactctatga ggatttatga gtggttatta aaagaactaa cacaaaagaa aactcacaag 480

gcaaatatag agattagcct tgatgaattt aagttcatgt taatgcttga aaataactac 540

catgagttta aaaggcttaa ccaatgggtt ttgaaaccaa taagtaaaga tttaaacact 600

tacagcaata tgaaattggt ggttgataag cgaggccgcc cgactgatac gttgattttc 660

caagttgaac tagatagaca aatggatctc gtaaccgaac ttgagaacaa ccagataaaa 720

atgaatggtg acaaaatacc aacaaccatt acatcagatt cctacctacg taacggacta 780

agaaaaacac tacacgatgc tttaactgca aaaattcagc tcaccagttt tgaggcaaaa 840

tttttgagtg acatgcaaag taagcatgat ctcaatggtt cgttctcatg gctcacgcaa 900

aaacaacgaa ccacactaga gaacatactg gctaaatacg gaaggatctg aggttcttat 960

ggcagcgtga ataatgaatg gccttgtatt cgtttttttc cgagagaaaa ttaacaagag 1020

cgaaaaaaaa aacgggcttc ggtgaaaatc gggtgaatat gcaactagcg ggacgaatgc 1080

tctggaaatg catatcctat gcaactagcg ggatgaacaa atctcacccc agaattcgca 1140

ggaaaaaaca ggaaaaaaaa aaagaaggcc accacggcca caaagaccac aaagaccaca 1200

aaaaaaaaca aaaaacaacc gtcccagctt ccagtgtttg gaatactgga acacaggaag 1260

ccgcataaga gtgggcgttg cacaggaagc caggcccaga agccccagag ttactttttt 1320

ttttttgttt tttccttctg ttcgctgtgc ccgcatcaga tgatgcgcct ttatttacga 1380

tgccaatgcg aatagcacca gtgagagcac cagtaaaagc atacgcatac acatacacac 1440

atagagcaag caagcaggct agcaaccagg aaaggctgcc agtgactgct actgggtgtc 1500

taagaaccgt agggcggatt attgttgcgg tggttggttg cgggtggtta tgcgatggta 1560

cggtgcagaa tcgtacggtg ttgggttatg gaattagtat gggtatgtga tatgtggtaa 1620

tatgtgatat tgggttattg tgatttggaa tactgaatat cgaatatggg atatggaata 1680

tggctatggc atggtatggt atgggatggg agtattctat tttattttat tctggttcct 1740

gcgtttaggg tagggtagga agaaggtgag tgcttttgta tataagtgga gtgtctggat 1800

cagttttgtg gattgtgaat gttagtttcc cctttaatgt atatttgtat tatttgcttt 1860

tgagtactca ataaccaagc acaactacta gttttaaagg atccatcctc ttaaacagta 1920

caaatcgcaa agaaaagctc cacacccaaa ccaaataatt gcaatgaaga aggtgaatcg 1980

tattgccgtg gtcggcactg gcgcagttgg tacgagttac tgctacgcta tgataaatca 2040

gggggttgcc gaggagttgg tgttgataga tattaatgag gctaaggccg aaggggaagc 2100

aatggatttg aatcacggtc ttccatttgc tccgactccc accagagttt ggaagggcga 2160

ctacagtgac tgtggtaccg cagacctagt agtaatcacc gccgggtccc cccagaagcc 2220

cggagaaacc cgtcttgact tggtttctaa gaacgcaaaa atctttaaag gcatgattaa 2280

atcaataatg gacagtggtt tcaacggcat tttcttggta gcatcaaacc ccgttgatat 2340

tcttacatac gttacgtgga aagaatcagg gttgccgaag gagcacgtga taggttcagg 2400

aacagttctt gactcagccc gtctaagaaa ctcactttcc gcccagtttg gaattgaccc 2460

aagaaatgtc cacgctgcca ttataggtga acacggggac acggagttac ccgtctggtc 2520

tcatactaac attggctacg acacgattga gtcgtactta caaaaaggta tcatagacga 2580

aaagacgctt gatgatatct ttgtcaatac tagagacgct gcataccaca tcatcgaaag 2640

gaagggagcc acattctatg gaataggcat gtcgttgact aggatcacca gggccatttt 2700

gaacaatgag aatagtgttt taacggttag tgccttctta gagggacaat atggtaattc 2760

cgacgtatat gtcggagtac cggcaattat taataggcaa ggtatacgtg aagtcgtaga 2820

gataaaactt aatgagaagg agcaagaaca gtttaatcac agtgttaagg ttttaaagga 2880

gaccatggcc cccattttgt aagagattga taagactttt ctagttgcat atcttttata 2940

tttaaatctt atctattagt taattttttg taatttatcc ttatatatag tctggttatt 3000

ctaaaatatc atttcagtat ctaaaaattc ccctcttttt tcagttatat cttaacaggc 3060

gacagtccaa atgttgattt atcccagtcc gattcatcag ggttgtgaag cattttgtca 3120

atggtcgaaa tcacatcagt aatagtgcct cttacttgcc tcatagaatt tctttctctt 3180

aacgtcaccg tttggtcttt tatagtttcg aaatctatgg tgataccaaa tggtgttccc 3240

aattcatcgt tacgggcgta ttttttacca attgaagtat tggaatcgtc aattttaaag 3300

tatatctctc ttttacgtaa agcctgcgag atcctcttaa gtatagcggg gaagccatcg 3360

ttattcgata ttgtcgtaac aaatactttg atcggcgcta tctgtaatgg aaaccaatac 3420

tgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat tttcctaact ttatttagtc 3480

aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc ccaaaatagg gggcgggtta 3540

cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt tattcctggc atccactaaa 3600

tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa aaagaatccc agcaccaaaa 3660

tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc tcttagcgca actacagaga 3720

acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat ggagtgatgc aacctgcctg 3780

gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat ctatctcatt ttcttacacc 3840

ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga aaaaaaaggt tgaaaccagt 3900

tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa agacggtagg tattgattgt 3960

aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact tttatagtta gtcttttttt 4020

tagttttaaa acaccaagaa cttagtttcg aataaacaca cataaacaaa caaaatgtcg 4080

actaagagtt actcggaaag agcagctgct catagaagtc cagttgctgc caagctttta 4140

aacttgatgg aagagaagaa gtcaaactta tgtgcttctc ttgatgttcg taaaacagca 4200

gagttgttaa aattagtcga ggttttgggt ccatatatct gtctattgaa gacacatgta 4260

gatatcttgg aggatttcag ctttgagaat accattgtgc cgttgaagca attagcagag 4320

aaacacaagt ttttgatatt tgaagacagg aagtttgccg acattgggaa cactgttaaa 4380

ttacaataca cgtctggtgt ataccgtatc gccgaatggt ctgatatcac caatgcacac 4440

ggtgtgactg gtgcgggcat tgttgctggt ttgaagcaag gtgccgagga agttacgaaa 4500

gaacctagag ggttgttaat gcttgccgag ttatcgtcca aggggtctct agcgcacggt 4560

gaatacactc gtgggaccgt ggaaattgct aagagtgata aggactttgt tattggattt 4620

attgctcaaa acgatatggg tggaagagaa gagggctacg attggttgat catgacgcca 4680

ggtgttggtc ttgatgacaa aggtgatgct ttgggacaac aatacagaac tgtggatgaa 4740

gttgttgccg gtggatcaga catcattatt gttggtagag gtcttttcgc aaagggaaga 4800

gatcctgtag tggaaggtga gagatacaga aaggcgggat gggacgctta cttgaagaga 4860

gtaggcagat ccgcttaatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc 4920

ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt 4980

atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt tttctttttt 5040

ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt 5100

tgggacgctc gaaggcttta atttgcgtga tgctaacttc tctctggaag gtctgaccgg 5160

ctttactatg tatggcaaaa cggcaggcgt tatcggtacc ggtaaaatcg gtgtggcgat 5220

gctgcgcatt ctgaaaggtt ttggtatgcg tctgctggcg ttcgatccgt atccaagtgc 5280

agcggcgctg gaactcggtg tggagtatgt cgatctgcca accctgttct ctgaatcaga 5340

cgttatctct ctgcactgcc cgctgacacc ggaaaactat catctgttga acgaagccgc 5400

cttcgaacag atgaaaaatg gcgtgatgat cgtcaatacc agtcgcggtg cattgattga 5460

ttctcaggca gcaattgaag cgctgaaaaa tcagaaaatt ggttcgttgg gtatggacgt 5520

gtatgagaac gaacgcgatc tattctttga agataaatcc aacgacgtga tccaggatga 5580

cgtattccgt cgcctgtctg cctgccacaa cgtgctgttt accgggcacc aggcattcct 5640

gacagcagaa gctctgacca gtatttctca gactacgctg caaaacttaa gcaatctgga 5700

aaaaggcgaa acctgcccga acgaactggt tggacataag cctgttcggt tcgtaagctg 5760

taatgcaagt agcgtatgcg ctcacgcaac tggtccagaa ccttgaccga acgcagcggt 5820

ggtaacggcg cagtggcggt tttcatggct tgttatgact gtttttttgg ggtacagtct 5880

atgcctcggg catccaagca gcaagcgcgt tacgccgtgg gtcgatgttt gatgttatgg 5940

agcagcaacg atgttacgca gcagggcagt cgccctaaaa caaagttaaa catcatgagg 6000

gaagcggtga tcgccgaagt atcgactcaa ctatcagagg tagttggcgt catcgagcgc 6060

catctcgaac cgacgttgct ggccgtacat ttgtacggct ccgcagtgga tggcggcctg 6120

aagccacaca gtgatattga tttgctggtt acggtgaccg taaggcttga tgaaacaacg 6180

cggcgagctt tgatcaacga ccttttggaa acttcggctt cccctggaga gagcgagatt 6240

ctccgcgctg tagaagtcac cattgttgtg cacgacgaca tcattccgtg gcgttatcca 6300

gctaagcgcg aactgcaatt tggagaatgg cagcgcaatg acattcttgc aggtatcttc 6360

gagccagcca cgatcgacat tgatctggct atcttgctga caaaagcaag agaacatagc 6420

gttgccttgg taggtccagc ggcggaggaa ctctttgatc cggttcctga acaggatcta 6480

tttgaggcgc taaatgaaac cttaacgcta tggaactcgc cgcccgactg ggctggcgat 6540

gagcgaaatg tagtgcttac gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac cggcaaaatc 6600

gcgccgaagg atgtcgctgc cgactgggca atggagcgcc tgccggccca gtatcagccc 6660

gtcatacttg aagctagaca ggcttatctt ggacaagaag aagatcgctt ggcctcgcgc 6720

gcagatcagt tggaagaatt tgtccactac gtgaaaggcg agatcaccaa ggtagtcggc 6780

aaataatgtc taacaattcg ttcaagccga cgccgcttcg cggcgcggct taactcaagc 6840

gttagatgca ctaagcacat aattgctcac agccaaacta tcaggtcaag tctgctttta 6900

ttatttttaa gcgtgcataa taagccctac acaaattggg agatatatca tgaaaggctg 6960

gctttttctt gttatcgcaa tagttggcga agtaatcgca acatccgcat taaaatctag 7020

cgagggcttt actaagctga tccggtggat gaccttttga atgaccttta atagattata 7080

ttactaatta attggggacc ctagaggtcc ccttttttat tttaaaaatt ttttcacaaa 7140

acggtttaca agcatacgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 7200

ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 7260

ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 7320

atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga 7380

ctctagagga tccccgggta ccgagctcga attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 7440

actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 7500

gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 7560

atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 7620

gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 7680

acccgccaac acccgctgac gaattcgttg acagtaagac gggtaagcct gttgatgata 7740

ccgctgcctt actgggtgca ttagccagtc tgaatgacct gtcacgggat aatccgaagt 7800

ggtcagactg gaaaatcaga gggcaggaac tgctgaacag caaaaagtca gatagcacca 7860

catagcagac ccgccataaa acgccctgag aagcccgtga cgggcttttc ttgtattatg 7920

ggtagtttcc ttgcatgaat ccataaaagg cgcctgtagt gccatttacc cccattcact 7980

gccagagccg tgagcgcagc gaactgaatg tcacgaaaaa gacagcgact caggtgcctg 8040

atggtcggag acaaaaggaa tattcagcga tttgcccgag cttgcgaggg tgctacttaa 8100

gcctttaggg ttttaaggtc tgttttgtag aggagcaaac agcgtttgcg acatcctttt 8160

gtaatactgc ggaactgact aaagtagtga gttatacaca gggctgggat ctattctttt 8220

tatctttttt tattctttct ttattctata aattataacc acttgaatat aaacaaaaaa 8280

aacacacaaa ggtctagcgg aatttacaga gggtctagca gaatttacaa gttttccagc 8340

aaaggtctag cagaatttac agatacccac aactcaaagg aaaaggacta gtaattatca 8400

ttgactagcc catctcaatt ggtatagtga ttaaaatcac ctagaccaat tgagatgt 8458

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其能够由选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源产生乳酸，其中所述基因工程酵母包括至少一个异源DNA盒，所述至少一个异源DNA盒使得产生用作果糖输入子的蛋白。

2.根据权利要求1所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述果糖输入子通过促进扩散起作用。

3.根据权利要求1或2所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述果糖输入子由外源FFZ1基因或其功能同源物编码。

4.根据前述权利要求中任一项所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述基因工程酵母菌株与亲本相比具有改善的果糖利用。

5.根据前述权利要求中任一项所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述基因工程酵母菌株能够消耗所有可测量的葡萄糖和果糖，果糖消耗速率为至少1.25g/L/小时。

6.根据前述权利要求中任一项所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述基因工程酵母菌株进一步包括盒，所述盒使得表达编码果糖激酶或己糖激酶的基因。

7.根据前述权利要求中任一项所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中克鲁维酵母属酵母菌株选自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、海泥克鲁维酵母(Kluyveromyces aestuarii)、非洲克鲁维酵母(Kluyveromyces africanus)、杆孢克鲁维酵母(Kluyveromyces bacillisporus)、布拉塔克鲁维酵母(Kluyveromycesblattae)、多布克鲁维酵母(Kluyveromyces dobzhanskii)、湖北克鲁维酵母(Kluyveromyces hubeiensis)、劳得利克鲁维酵母(Kluyveromyces lodderae)、非发酵克鲁维酵母(Kluyveromyces nonfermentans)、毕赤克鲁维酵母(Kluyveromyces piceae)、西尼克鲁维酵母(Kluyveromyces sinensis)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、沃尔特克鲁维酵母(Kluyveromyces waltii)、威克海姆克鲁维酵母(Kluyveromyces wickerhamii)或亚罗克鲁维酵母(Kluyveromyces yarrowii)。

8.一种用于生产乳酸的方法，包括使根据前述权利要求中任一项所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株在液体培养基中生长。

9.一种使用根据前述权利要求中任一项所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株生产乳酸的发酵方法。

Claims (9)

1.一种基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其能够由选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源生产乳酸，其中所述基因工程酵母包括至少一个异源DNA盒，所述至少一个异源DNA盒使得产生用作果糖输入子的蛋白。

2.根据权利要求1所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述果糖输入子通过促进扩散起作用。

3.根据权利要求1或2所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述果糖输入子由外源FFZ1基因或其功能同源物编码。

4.根据前述权利要求所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述基因工程酵母菌株与亲本相比具有改善的果糖利用。

5.根据前述权利要求所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述基因工程酵母菌株能够消耗所有可测量的葡萄糖和果糖，果糖消耗速率为至少1.25g/L/小时。

6.根据前述权利要求所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述基因工程酵母菌株进一步包括盒，所述盒使得表达编码果糖激酶或己糖激酶的基因。

7.根据前述权利要求所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中克鲁维酵母属酵母菌株选自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、海泥克鲁维酵母(Kluyveromyces aestuarii)、非洲克鲁维酵母(Kluyveromyces africanus)、杆孢克鲁维酵母(Kluyveromyces bacillisporus)、布拉塔克鲁维酵母(Kluyveromyces blattae)、多布克鲁维酵母(Kluyveromyces dobzhanskii)、湖北克鲁维酵母(Kluyveromyceshubeiensis)、劳得利克鲁维酵母(Kluyveromyces lodderae)、非发酵克鲁维酵母(Kluyveromyces nonfermentans)、毕赤克鲁维酵母(Kluyveromyces piceae)、西尼克鲁维酵母(Kluyveromyces sinensis)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、沃尔特克鲁维酵母(Kluyveromyces waltii)、威克海姆克鲁维酵母(Kluyveromyces wickerhamii)或亚罗克鲁维酵母(Kluyveromyces yarrowii)。

8.一种用于生产乳酸的方法，包括使根据前述权利要求所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株在液体培养基中生长。

9.一种使用根据前述权利要求所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株生产乳酸的发酵方法。

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