CN115461441A - 用于改善基于i-e型crispr的基因沉默的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

基于CRISPR的干扰已在从基因电路到动态代谢控制的各种应用中变得普遍。在大肠杆菌中，天然的CRISPR Cascade系统可用于通过缺失cas3核酸酶以及表达向导RNA阵列来进行沉默，其中可以由单个转录本中沉默多个基因。

Description

用于改善基于I-E型CRISPR的基因沉默的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年3月16日提交的第62/990,172号美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国海军研究办公室(Office of Naval Research)授予的12043956项目以及DOE EERE授予的EE0007563项目的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

对序列表的引用

本申请包含序列表，该序列表已在2020年3月10日以ASCII格式的49186-45_ST25.txt电子提交为，该文件大小为28943字节，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

基因沉默是一种强大的工具，基于CRISPR的方法增加了这种方法的简单性(Adli,M.The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.Nat.

Commun.9,1911(2018))。在大肠杆菌(E.coli)中，天然多蛋白Cascade(I-E型CRISPR)系统能够进行工程改造以用于基因沉默，这涉及核酸酶组分的缺失(deletion)和负责加工CRISPR阵列与靶DNA结合的基因的过表达。使用经改造的Cascade系统的一个好处是通过表达包含多个前间隔序列(protospacer)的单个转录本，随后将所述单个转录本加工成单独的向导RNA(guide RNA)来靶向多个基因(Luo,M.L.,Mullis,A.S.,Leenay,R.T.&Beisel,C.L.Repurposing endogenous type I CRISPR-Cas systems for programmablegene repression.Nucleic Acids Research vol.43 674–681(2015))。

发明内容

基于CRISPR的干扰已在从基因电路(genetic circuit)到动态代谢控制的各种应用中变得普遍。已确定由Cas 1/2核酸内切酶介导的向导阵列(guide array)不稳定性在某些情况下会成为问题。在大肠杆菌中，天然的CRISPR Cascade系统可用于通过缺失cas3核酸酶以及表达向导RNA阵列来进行沉默，其中可以由单个转录本沉默多个基因。

附图说明

图1A-1G：图1A向导阵列示意图。图1B是向导阵列前间隔序列丢失的实例。图1C通过PCR定量的前间隔序列修饰。图1D向导阵列稳定性作为向导阵列和宿主菌株的函数。图1E用pFABI补充fabI沉默的示意图。图1F示出了菌落计数，图1G示出了用向导阵列和pFABI转化的菌株的向导阵列稳定性。

图2示出了本发明质粒的示例性集合。

图3示出了本发明的示例性菌株。

图4示出了对示例性sgRNA向导序列和用于它们的构建的引物的总结。间隔序列(spacer)为斜体。

图5示出了对本发明的示例性合成DNA的总结。

具体实施方式

一般定义

如在说明书和权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“表达载体”包括单个表达载体以及多个表达载体，或者相同(例如，相同操纵子)或者不同；提及“微生物”包括单一微生物以及多种微生物；等等。

本文所用的术语“异源DNA”、“异源核酸序列”等指其中至少以下一项为真的核酸序列：(a)核酸序列对于给定的宿主微生物而言是外源的(即不是天然存在的)；(b)序列可以天然存在于给定的宿主微生物中，但以非天然(例如，大于预期)的量存在；或者(c)核酸的序列包含两个以上的子序列，所述两个以上的子序列彼此之间的关系与它们在自然中彼此之间的关系不同。例如，关于实例(c)，重组产生的异源核酸序列将具有来自不相关的基因的两个以上序列，这些序列被排列以产生新的功能性核酸，例如驱动基因表达的非天然启动子。

物种和其他系统发育鉴定是根据微生物领域技术人员已知的分类进行的。

此处参考本领域技术人员熟知的UniProt识别号列出了酶。UniProt数据库可以在http://www.UniProt.org/访问。当本文(包括权利要求)提及基因产物(即酶)的遗传修饰时，应当理解，该遗传修饰是核酸序列的遗传修饰，所述核酸序列例如或包括正常编码所描述的基因产物(即酶)的基因。

在本文描述的方法和步骤指示以一定顺序发生某些事件的情况下，

本领域普通技术人员将认识到，可以修改某些步骤的顺序，并且这种修改符合本发明的变化形式。此外，如果可能，某些步骤可以在并行过程中同时进行，也可以按顺序进行。

缩写的含义如下：“C”意指摄氏温度或摄氏度，从其用法中可以清楚地看出，DCW意指干细胞重量，“s”意指秒，“min”意指分钟，“h”、“hr”或“hrs”意指小时，“psi”意指磅/平方英寸，“nm”意指纳米，“d”意指天，“μL”或“uL”或“ul”意指微升，“mL”意指毫升，“L”意指升，“mm”意指毫米，“nm”意指纳米，“mM”是指毫摩尔的，“μM”或“uM”意指微摩尔的，“M”意指摩尔的，“mmol”意指毫摩尔，“μmol”或“uMol”意指微摩尔，“g”意指克，“μg”或“ug”意指微克，“ng”意指纳克，“PCR”意指聚合酶链式反应，“OD”意指光密度，“OD600”意指在600nm光子波长下测得的光密度，“kDa”意指千道尔顿，“g”意指万有引力常数，“bp”意指碱基对，“kbp”意指千碱基对，“％w/v”意指重量/体积百分比，“％v/v”意指体积/体积百分比，“IPTG”意指异丙基-μ-D-硫代半乳糖苷，“aTc”意指无水四环素，“RBS”意指核糖体结合位点，“rpm”意指每分钟转数，“HPLC”意指高效液相色谱，并且“GC”

意指气相色谱。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

微生物

本文所描述和所要求保护的特征可以在选自本文所列的微生物或另一种合适的微生物中提供，所述微生物也包含一种或多种天然的、引入的或提高的产物生物生产途径。因此，在一些实施方案中，微生物包括内源的产物生产途径(在一些此类实施方案中，所述产物生物生产途径可以被增强)，而在其他实施方案中，微生物不包括内源的产物生产途径。

更具体地，基于本文所述的各种标准，用于生物生产化学产品的合适微生物宿主通常可以包括但不限于方法部分中描述的生物体。

此处描述的任何基因或蛋白质的宿主微生物或来源微生物可以选自下列微生物：柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、梭菌属(Clostridium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、气杆菌属(Aerobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、毛霉属(Mucor)、球拟酵母属(Torulopsis)、甲基杆菌属(Methylobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)。在一些方面，宿主微生物是大肠杆菌微生物。

发明方面概述

通常，不稳定的向导阵列可以通过使用以缺失或突变的内源cas3核酸酶为特征的经遗传修饰的微生物来消除；Cascade操纵子可以过表达；并且可以表达至少一种CRISPR/Cascade gRNA以导致至少一种基因的表达降低。

在一些方面，微生物和使用微生物的任何方法可以包括使用经遗传修饰的微生物，该经遗传修饰的微生物具有内源cas1基因的缺失或突变。

在一些方面，微生物和使用微生物的任何方法可以包括使用经遗传修饰的微生物，该经遗传修饰的微生物的特征进一步在于在被PhoB激活的诱导型启动子控制下的Cascade操纵子。

在一些方面，微生物和使用微生物的任何方法可以包括使用经遗传修饰的微生物，该经遗传修饰的微生物是大肠杆菌微生物。

在一些方面，微生物和使用微生物的任何方法可以起到降低基因表达的作用，该基因是：fabI、gltA1、gltA2、udhA、zwf或它们的组合。

具体实施方式

不稳定的向导阵列可能是由于Cas1/2核酸内切酶复合物的表达。cas1缺失降低了向导阵列的不稳定性。基础Cas1/2核酸内切酶活性导致前间隔序列从向导阵列中丢失。随后，向导阵列可能在沉默方面变得无效，可以通过选择进行扩增。用严格抑制的诱导型启动子替换驱动Cascade

复合物表达的组成型启动子可以提高向导阵列的稳定性。

当在经遗传修饰的微生物中条件性沉默基因的方法包括提供以内源cas3核酸酶的缺失或突变为特征的经遗传修饰的微生物；Cascade操纵子；和至少一个CRISPR/CascadegRNA时，也消除了不稳定的向导阵列。

该方法包括使所述经遗传修饰的微生物在其中所述CRISPR/Cascade gRNA的表达导致所述经遗传修饰的微生物的至少一个基因的表达降低的条件下生长的步骤。本发明的微生物和使用这些微生物的方法可以包括内源cas3核酸酶基因的缺失或选择性突变，或Cascade操纵子的条件性表达的任何组合。这些条件之一或两者导致向导阵列的稳定性增加。

向导阵列可以包括单个gRNA，该单个gRNA在阵列条件性表达时导致单个基因的转录沉默增加。或者，向导阵列可以包括不止一个gRNA，该不止一个的gRNA导致不止一个的基因的转录沉默。单个向导阵列可以包括同时调节一个、两个、三个、四个、五个或更多个基因的装置。或者，经遗传修饰的微生物可以同时包含两个以上的向导阵列，其中每个向导阵列可以有条件地表达并且将导致一个以上基因的转录沉默。

在一个方面，该方法可以包括使用具有内源cas1基因的缺失或突变的经遗传修饰的微生物。cas1基因的缺失或突变可与两种条件结合，以提供最佳的向导阵列稳定性——即与内源cas3核酸酶基因的缺失或选择性突变相结合，或与Cascade操纵子的条件性表达相结合。然而，应当理解，这三个因素的任意组合(cas3缺失/突变；cas1缺失/突变；或条件性Cascade操纵子表达式)，实际上都会增加向导阵列的稳定性。

cas3和/或cas1内源基因的缺失或突变仅指使得该内源基因无法表达的对该内源基因的任何修饰。缺失或突变可以发生在基因调控序列中，或基因本身的编码序列的修饰，或阻止经遗传修饰的微生物的特定内源基因表达的其他方式(means)。

术语条件性表达、条件性过表达、诱导型启动子或严格抑制的诱导型启动子(tightly repressed inducible promotor)指调节基因表达的方式。基因表达可以通过引入刺激物或替代地撤出所需的营养物或其他物质进行有条件地调节。严格抑制的启动子序列指当启动子处于所述的抑制条件下时严格地不发生基因表达的调节的事实，而诱导型指启动子可以对外部施加的信号作出响应的事实。

向导阵列指允许表达靶(target)特异性的gRNA的任何结构。在这种情况下，靶是在特定条件下被转录沉默的基因。

本发明的另一个方面通过比较在具有内源cas3核酸酶基因的缺失或选择性突变、或Cascade操纵子的条件性表达的任意组合的经遗传修饰微生物中的向导阵列表达与缺乏这些特征的经遗传修饰微生物中的向导阵列表达来描述。这些特性用于提高向导阵列的稳定性，从而提高靶基因的转录基因沉默。

在一个方面，所述方法可以包括使用特征进一步在于在被PhoB激活的诱导型启动子的控制下的Cascade操纵子的经遗传修饰的微生物。应当理解，除了PhoB之外的任何诱导型启动子都包括在本发明中。

在一个方面，所述方法可以包括使用经遗传修饰的微生物，该微生物是大肠杆菌微生物。然而，应当理解，待调节、缺失或突变的基因以及待表达的操纵子和向导阵列适用于任何已知的微生物。

在一个方面，所述方法可以起到降低基因表达的作用，所述基因是：

fabI、gltA1、gltA2、udhA、zwf或它们的组合。应当理解，虽然这些基因已被鉴定为本文所述的经遗传修饰的微生物中基因调节的候选物，但所述方法和微生物可广泛应用于被鉴定为期望选择性调节的任何基因。

实施例

为了促进对本发明的原理的理解，现在将参照优选实施例，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解，并不由此意图限制本发明的范围，如本文所涉及的对本发明的此类改变和进一步修改是本发明所涉及的领域的技术人员通常想到的。

材料与方法：

图2总结了本发明的示例性质粒。图3总结了本发明的示例性微生物菌株。图4总结了示例性sgRNA向导序列和用于构建它们的引物的列表。图5总结了本发明的示例性合成DNA。间隔序列为斜体。

试剂和培养基：除非另有说明，否则所有材料和试剂均为可能的最高等级的并且均购自Sigma公司(密苏里州，圣路易斯)。Luria肉汤(Luria Broth,LB)，低盐lennox配方用于常规菌株和质粒繁殖、构建和菌落分离。

氯霉素、氨苄青霉素和四环素的最终使用浓度分别为20μg/mL、100μg/mL和5μg/mL。嘌呤霉素选择使用200μg/mL的最终工作浓度进行，

LB中补充50mM磷酸钾缓冲液(pH＝8.0)以维持pH值从而进行充分选择。

菌株和质粒：pCASCADE阵列质粒如先前报道的使用较小阵列的PCR组装构建。对于本研究中构建的pCASCADE质粒，参见图2-图5了解序列和引物详情。构建质粒pFABI，使能够使用强合成型EM7启动子从密码子优化的fabI基因进行组成型表达。含启动子和基因的质粒DNA获自Twist Biosciences公司(加利福尼亚州，圣地亚哥)。大肠杆菌10G菌株获自Lucigen公司。按先前报道的方法制备菌株DLF_Z0025、DLF_Z0045和DLF_Z0047。使用标准重组工程构建了本研究中制备的所有菌株。重组工程质粒pSIM5和tet-sacB选择/反选择标记盒为Donald Court(NCI,https://redrecombineering.ncifcrf.gov/court-lab.html)惠赠。DLF_Z0047ΔsbcD::ampR是通过对含有适当抗生素标记的线性供体DNA进行直接整合和基因置换而构建的。使用引物del_sbcD_p1和del_sbcD_p2对合成氨苄青霉素抗性盒(ampR2)进行PCR制备供体。DLF_Z0047，recA1::ampR的构建与此相似，但整合过程在recA基因中掺入了G160D突变，而非缺失。菌株DLF_Z0047Δcas1::purR和DLF_Z0047Δcas2::purR是通过对线性供体DNA进行直接整合和基因置换构建的。使用重组工程和基于tet-sacB的选择反选择来替换Cascade操纵子前面的sspB基因和启动子，分别由DLF_Z0047和DLF_Z0025构建DLF_S0047和DLF_S0025菌株。所有遗传修饰均经PCR和测序确认。

测序由Genewiz公司(北卡罗来纳州，莫里斯维尔)或Eurofins集团(肯塔基州，路易斯维尔)进行。使用标准方法完成质粒转化。

向导序列稳定性(guide stability)测试：使用标准方法进行质粒DNA的微量制备和测序。以下两种引物用于从pCASCADE质粒扩增向导阵列，gRNA-正向：5’-GGGAGACCACAACGG-3’(SEQ ID NO：60)，gRNA-反向：5’-CGCAGTCGAACGACCG-3’(SEQ ID NO：61)。菌落PCR如下进行：在10μL PCR反应中使用2X EconoTaq Master mix(Lucigen)，该PCR反应由5μL 2X EconoTaq Master mix(Lucigen)、每种引物1μL(10uM浓度)、3μL dH₂O和一小部分菌落组成。PCR参数为：初始98℃，2分钟初始变性；随后94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；最终72℃，5分钟的最后延伸。然后通过琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析。

现在参照图1A-图1B，首先对怀疑有向导序列(guide)丢失的几个向导阵列质粒进行测序。作为一个实例(图1A)，我们将一个含有前间隔序列的向导阵列质粒转化到宿主菌株(DLF_Z0047)中，以沉默gltAp1(G1)、gltAp2(G2)和udhA(U)启动子，该宿主菌株用能够蛋白水解降解FabI(烯酰-ACP还原酶)、GltA(柠檬酸合成酶)和UdhA(可溶性转氢酶)的降解决定子(degron)标签进行工程改造。选择单个菌落并用其接种5mL培养物(Luria肉汤)，过夜生长后，将培养物铺板以分离单个菌落，分离了24个克隆，并对向导阵列质粒进行微量制备和测序。虽然17个质粒具有预期序列并保留了所有3个前间隔序列(图1B，顶部序列)，但其他7个存在突变，中间的前间隔序列G2侧翼的2个前间隔序列(G1和U)丢失。这些经修饰的克隆中有四个保留了5’和3’侧翼重复序列(flanking repeat sequences)，而其他三个也丢失了G2前间隔序列侧翼的5’或3’重复序列。

如图1C所示，作为下一步，评估了单个向导阵列(G2)和三个附加向导阵列(FG2、FG1G2和FG1G2U，其中“F”是靶向fabI启动子的前间隔序列)的稳定性。再次使用菌株DLF_Z0047，并再次从用于接种5mL培养物(Luria肉汤)的单个菌落开始。过夜生长后，将培养物铺板以分离单个菌落。在这种情况下，从四种培养物的每一种中分离出四个克隆，并使用菌落PCR而不是测序来评估向导阵列的稳定性。结果见图1C。

虽然在这种情况下，单个G2向导序列被证明是稳定的，但2-4个前间隔序列的较大阵列具有不同程度的不稳定性，产生的扩增子符合丢失1-3个前间隔序列。

现在参照图1D，随着PCR作为评估稳定性的工具的成功，下一步研究了在几个不同的宿主菌株中评估更大组的向导阵列的向导阵列稳定性。这些包括F、G1、G2和U前间隔序列以及靶向zwf启动子的前间隔序列，Z。所评估的菌株包括大肠杆菌10G，一种市售recA1克隆菌株(Lucigen)，以及DLF_Z0025，一种用于两阶段动态代谢控制的对照宿主，其在任何代谢酶上没有蛋白水解降解决定子标签；DLF_Z0045，其在GltA和UdhA上带有降解决定子标签；DLF_Z0047(FGU，如上所述)以及DLF_Z0047的衍生物，其包括recA1突变体(recAG160D)、sbcD基因缺失(识别向导阵列中存在的发夹序列和回文序列的SbcCD核酸内切酶的一个组成部分)以及cas1和cas2中的缺失。结果见图1D。

向导阵列在克隆菌株中是稳定的。这一结果并不令人惊讶，因为这些构建体最初是使用大肠杆菌10G构建的，并且原始质粒经测序证实没有任何前间隔序列丢失。最初在DLF_Z0025中针对一小组阵列发现了前间隔序列的丢失。对DLF_Z0025进行了修饰以用于Cascade操纵子的组成型表达(图1A)。在宿主菌株DLF_Z0045和DLF_Z0047中检测到不稳定性增加。在DLF_Z0047背景下，recA1突变的掺入以及sbcD的缺失都不能减少前间隔序列的丢失。就recA而言，这与先前的研究一致，先前的研究表明尽管仅20bp的同源性就能在大肠杆菌中重组，但要进行显著的重组，需要大于50bp的同源序列；前间隔序列长30bp。相比之下，cas1或cas2的缺失均提高了阵列稳定性，cas1缺失时，前间隔序列丢失最小。

cas1缺失结果与负责前间隔序列丢失的Cas1/2内切酶一致，Cas1是核酸酶组分。这种活性与先前报道的它们在前间隔序列获得(protospacer acquisition)中的活性相符。Cas1突变时仍观察到极低水平的前间隔序列丢失，这一事实表明可能存在第二种前间隔序列丢失机制，或者在我们的PCR分析中存在不准确性。然而，从图1D中可以看出，包含F前间隔序列的向导阵列比没有F前间隔序列的向导阵列明显更不稳定。这种前间隔序列特异性与广义核酸内切酶活性不相符，促使我们进一步研究含F阵列是否有增加的前间隔序列丢失倾向。

FabI可能是一种严格必需的酶，尽管事实上向导阵列处于可诱导表达状态，但渗漏表达(leaky expression)可能导致生长抑制，并且失去F前间隔序列的向导阵列在Cascade操纵子(包括cas1和cas2)过表达的菌株中具有选择性优势。这也与一般观察结果一致，即带有F前间隔序列的向导阵列质粒的转化导致低于其他阵列的菌落数。我们构建了一个质粒(pFABI，图IE)，其使得FabI能够从另一种组成型启动子表达，该启动子不被F前间隔序列沉默。然后，我们评估了pFABI与含F前间隔序列的向导阵列质粒共转化对菌落数和阵列稳定性的影响。如图1F-图1G所示，pFABI的共转化增加了菌落数和阵列稳定性。这些数据与由于fabI的渗漏沉默导致的生长抑制一致，因此是F前间隔序列丢失的阵列的选择性优势。

总之，以上讨论的结果支持了一个模型，其中基础Cas1/2内切酶活性导致向导阵列中前间隔序列的丢失。当Cascade操纵子过表达时，由于向导序列的渗漏表达，带有靶向必需基因的前间隔序列的沉默阵列(silencing array)可能会导致生长抑制，尽管不易察觉。可以通过常规培养中的选择来扩增缺失毒性前间隔序列的阵列。有几种方法可以提高阵列的稳定性。首先，简单地删除cas1应该可以提高稳定性，因为Cas1对于Cascade操纵子的沉默功能不是必需的，所以基因沉默应该不受影响。这种方法需要对未来的沉默菌株进行两次修饰，即缺失cas3和cas1(图1A)。然而，鉴于在基础fabI沉默情况下观察到的毒性，我们还评估了第二个方案，其中我们缺失了cas3，并使用严格控制的低磷酸盐诱导型启动子来表达Cascade操纵子，而不是最初报道的组成型启动子(Biobrick J23100)。为了实施和测试这种方法，我们构建了DLF_S0047，与DLF_Z0047相同，其在FabI、GltA和UdhA上含有降解决定子标签，但其中组成型J23100启动子(图1A)被严格控制的低磷酸盐诱导型的、修饰的yibD基因启动子取代，前面有强合成转录tZ终止子。如图1D所示，使用DLF_S0047消除了阵列不稳定性。还构建了DLF_S0025，作为未来动态代谢控制工程用的新的稳定菌株。

如果cas1/2没有缺失，使用Cascade进行CRISPR干扰将受益于对Cascade操纵子(cas1/2)表达的更严格的控制，或者至少受益于对向导序列稳定性的评估。

公开的实施方案是非限制性的

虽然本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但是要强调的是，这些实施方案仅作为实例提供。在不脱离本发明的各种实施方案的情况下，可以进行多种变化、改变和替换。具体而言，无论出于何种原因，对于化合物、核酸序列、多肽(包括特定蛋白质，特定蛋白质包括功能性酶、代谢途径酶或中间体)、元件或其它组合物的任何分组，或者在本文中以列表、表格或其它分组的形式陈述或以其它方式呈现的浓度，除非另有明确说明，否则每个此类分组旨在为各种子实施方案提供基础并用于识别各种子实施方案，子实施方案在其最广泛的范围内通过排除各自规定的分组的一个或多个成员(或子集)包括此类分组的每一个子集。

此外，当本文描述任何范围时，除非另有明确说明，否则该范围包括其中的所有值和其中的所有子范围。

此外，并且更一般地，根据本文的公开、讨论、实施例和实施方案，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、细胞生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Sambrook和Russell，《分子克隆：实验室手册》，2001年第三版(第1-3卷)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；《动物细胞培养》，R.I.Freshney编著，1986。这些公开的资源通过引用并入本文。

以下公开的资源通过引用并入本文，用于与本文所述的发明结合进行有用的描述，例如，从糖源工业生物生产化学产品的方法，以及可用于实现这种转化的工业系统(《生物化学工程基础》，第二版。J.E.Bailey和D.F.Ollis，McGraw Hill，New York，1986，例如第9章，第533-657页，关于生物反应器设计；《化学工程单元操作》，第5版，W.L.McCabe等人，McGraw Hill，New York 1993，例如，用于过程和分离技术分析；平衡分级分离，P.C.Wankat，Prentice Hall，Englewood Cliffs，NJ USA，1988，例如，用于分离技术教学)。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全部并入本文。

序列表

<110> 杜克大学

<120> 用于改善基于I-E型CRISPR的基因沉默的方法和组合物

<130> KHP222111442.9

<150> 62/990,172

<151> 2020-03-16

<160> 61

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成向导阵列组件

<400> 1

aagttatgaa gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc 60

ggacagttat tagttcgagt tccccgcgcc agcggggata aaccgttaca tt 112

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<223> 合成向导阵列组件

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<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 10

gtttatctgt tcgtatcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgaaaa aaaaacccc 59

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 11

ggttattata atcaacggtt tatccccgct ggcgcgggga actcgaggtg gtaccagatc 60

<210> 12

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成sgRNA向导序列

<400> 12

tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60

atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120

agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accg 154

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 13

gcgccagcgg ggataaaccg aaaagcatat aatgcg 36

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 14

cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 15

ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 16

cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59

<210> 17

<211> 155

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成sgRNA向导序列

<400> 17

tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60

atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgtattgacc aattcattcg ggacagttat 120

tagttcgagt tccccgcgcc agcggggata aaccg 155

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 18

gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 19

cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 20

ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28

<210> 21

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 21

cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59

<210> 22

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成sgRNA向导序列

<400> 22

tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60

atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgttaccatt ctgttgcttt tatgtataag 120

aatcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 153

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 23

gcgccagcgg ggataaaccg ttaccattct gttg 34

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 24

cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 25

ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 26

cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59

<210> 27

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成sgRNA向导序列

<400> 27

tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60

atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgctcgtaaa agcagtacag tgcaccgtaa 120

gatcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 153

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 28

gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 29

cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 30

ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 31

cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59

<210> 32

<211> 217

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成sgRNA向导序列

<400> 32

tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60

atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120

agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180

attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccg 217

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 33

gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 34

cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 35

ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28

<210> 36

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 36

cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47

<210> 37

<211> 278

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成sgRNA向导序列

<400> 37

tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60

atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120

agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180

attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtta ccattctgtt gcttttatgt 240

ataagaatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278

<210> 38

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 38

gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 39

cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 40

ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28

<210> 41

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 41

cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47

<210> 42

<211> 278

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成sgRNA向导序列

<400> 42

tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60

atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120

agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180

attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgctc gtaaaagcag tacagtgcac 240

cgtaagatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278

<210> 43

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 43

gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 44

cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 45

ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28

<210> 46

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 46

cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47

<210> 47

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成sgRNA向导序列

<400> 47

tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60

atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120

agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180

attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtta ccattctgtt gcttttatgt 240

ataagaatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccgct cgtaaaagca gtacagtgca 300

ccgtaagatc gagttccccg cgccagcggg gataaaccg 339

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 48

gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30

<210> 49

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 49

cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28

<210> 50

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 50

ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28

<210> 51

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 51

cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48

<210> 52

<211> 3527

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成质粒

<400> 52

tcctaatttt tgttgacact ctatcattga tagagttatt ttaccactcc ctatcagtga 60

tagagaaaag tgaaatgaat agttcgacaa agatcgcatt ggtaattacg ttactcgatg 120

ccatggggat tggccttatc atgccagtct tgccaacgtt attacgtgaa tttattgctt 180

cggaagatat cgctaaccac tttggcgtat tgcttgcact ttatgcgtta atgcaggtta 240

tctttgctcc ttggcttgga aaaatgtctg accgatttgg tcggcgccca gtgctgttgt 300

tgtcattaat aggcgcatcg ctggattact tattgctggc tttttcaagt gcgctttgga 360

tgctgtattt aggccgtttg ctttcaggga tcacaggagc tactggggct gtcgcggcat 420

cggtcattgc cgataccacc tcagcttctc aacgcgtgaa gtggttcggt tggttagggg 480

caagttttgg gcttggttta atagcggggc ctattattgg tggttttgca ggagagattt 540

caccgcatag tccctttttt atcgctgcgt tgctaaatat tgtcactttc cttgtggtta 600

tgttttggtt ccgtgaaacc aaaaatacac gtgataatac agataccgaa gtaggggttg 660

agacgcaatc gaattcggta tacatcactt tatttaaaac gatgcccatt ttgttgatta 720

tttatttttc agcgcaattg ataggccaaa ttcccgcaac ggtgtgggtg ctatttaccg 780

aaaatcgttt tggatggaat agcatgatgg ttggcttttc attagcgggt cttggtcttt 840

tacactcagt attccaagcc tttgtggcag gaagaatagc cactaaatgg ggcgaaaaaa 900

cggcagtact gctcggattt attgcagata gtagtgcatt tgccttttta gcgtttatat 960

ctgaaggttg gttagttttc cctgttttaa ttttattggc tggtggtggg atcgctttac 1020

ctgcattaca gggagtgatg tctatccaaa caaagagtca tcagcaaggt gctttacagg 1080

gattattggt gagccttacc aatgcaaccg gtgttattgg cccattactg tttgctgtta 1140

tttataatca ttcactacca atttgggatg gctggatttg gattattggt ttagcgtttt 1200

actgtattat tatcctgcta tcgatgacct tcatgttaac ccctcaagct caggggagta 1260

aacaggagac aagtgcttag ttatttcgtc accaaatgat gttattccgc gaaatataat 1320

gaccctcttg ataacccaag agcatcacat atacctgccg ttcactatta tttagtgaaa 1380

tgagatatta tgatattttc tgaattgtga ttaaaaaggc aactttatgc ccatgcaaca 1440

gaaactataa aaaatacaga gaatgaaaag aaacagatag attttttagt tctttaggcc 1500

cgtagtctgc aaatcctttt atgattttct atcaaacaaa agaggaaaat agaccagttg 1560

caatccaaac gagagtctaa tagaatgagg tcgaaaagta aatcgcgcgg gtttgttact 1620

gataaagcag gcaagaccta aaatgtgtaa agggcaaagt gtatactttg gcgtcacccc 1680

ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact tgccatcttc aaacaggagg 1740

gctggaagaa gcagaccgct aacacagtac ataaaaaagg agacatgaac gatgaacatc 1800

aaaaagtttg caaaacaagc aacagtatta acctttacta ccgcactgct ggcaggaggc 1860

gcaactcaag cgtttgcgaa agaaacgaac caaaagccat ataaggaaac atacggcatt 1920

tcccatatta cacgccatga tatgctgcaa atccctgaac agcaaaaaaa tgaaaaatat 1980

caagttcctg agttcgattc gtccacaatt aaaaatatct cttctgcaaa aggcctggac 2040

gtttgggaca gctggccatt acaaaacgct gacggcactg tcgcaaacta tcacggctac 2100

cacatcgtct ttgcattagc cggagatcct aaaaatgcgg atgacacatc gatttacatg 2160

ttctatcaaa aagtcggcga aacttctatt gacagctgga aaaacgctgg ccgcgtcttt 2220

aaagacagcg acaaattcga tgcaaatgat tctatcctaa aagaccaaac acaagaatgg 2280

tcaggttcag ccacatttac atctgacgga aaaatccgtt tattctacac tgatttctcc 2340

ggtaaacatt acggcaaaca aacactgaca actgcacaag ttaacgtatc agcatcagac 2400

agctctttga acatcaacgg tgtagaggat tataaatcaa tctttgacgg tgacggaaaa 2460

acgtatcaaa atgtacagca gttcatcgat gaaggcaact acagctcagg cgacaaccat 2520

acgctgagag atcctcacta cgtagaagat aaaggccaca aatacttagt atttgaagca 2580

aacactggaa ctgaagatgg ctaccaaggc gaagaatctt tatttaacaa agcatactat 2640

ggcaaaagca catcattctt ccgtcaagaa agtcaaaaac ttctgcaaag cgataaaaaa 2700

cgcacggctg agttagcaaa cggcgctctc ggtatgattg agctaaacga tgattacaca 2760

ctgaaaaaag tgatgaaacc gctgattgca tctaacacag taacagatga aattgaacgc 2820

gcgaacgtct ttaaaatgaa cggcaaatgg tacctgttca ctgactcccg cggatcaaaa 2880

atgacgattg acggcattac gtctaacgat atttacatgc ttggttatgt ttctaattct 2940

ttaactggcc catacaagcc gctgaacaaa actggccttg tgttaaaaat ggatcttgat 3000

cctaacgatg taacctttac ttactcacac ttcgctgtac ctcaagcgaa aggaaacaat 3060

gtcgtgatta caagctatat gacaaacaga ggattctacg cagacaaaca atcaacgttt 3120

gcgccaagct tcctgctgaa catcaaaggc aagaaaacat ctgttgtcaa agacagcatc 3180

cttgaacaag gacaattaac agttaacaaa taaaaacgca aaagaaaatg ccgatattga 3240

ctaccggaag cagtgtgacc gtgtgcttct caaatgcctg attcaggctg tctatgtgtg 3300

actgttgagc tgtaacaagt tgtctcaggt gttcaatttc atgttctagt tgctttgttt 3360

tactggtttc acctgttcta ttaggtgtta catgctgttc atctgttaca ttgtcgatct 3420

gttcatggtg aacagcttta aatgcaccaa aaactcgtaa aagctctgat gtatctatct 3480

tttttacacc gttttcatct gtgcatatgg acagttttcc ctttgat 3527

<210> 53

<211> 2250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成质粒

<400> 53

ccatctctac cggttcgctt tcactggata tcgcgcttgg ggcaggtggt ctgccgatgg 60

gccgtatcgt cgaaatctac ggaccggaat cttccggtaa aaccacgctg acgctgcagg 120

tgatcgccgc agcgcagcgt gaaggtaaaa cctgtgcgtt tatcgatgct gaacacgcgc 180

tggacccaat ctacgcacgt aaactgggcg tcgatatcga caacctgctg tgctcccagc 240

cggacaccgg cgagcaggca ctggaaatct gtgacgccct ggcgcgttct ggcgcagtag 300

acgttatcgt cgttgactcc gtggcggcac tgacgccgaa agcggaaatc gaaggcgaaa 360

tcgatgactc tcacatgggc cttgcggcac gtatgatgag ccaggcgatg cgtaagctgg 420

cgggtaacct gaagcagtcc aacacgctgc tgatcttcat caaccagatc cgtatgaaaa 480

ttggtgtgat gttcggtaac ccggaaacca ctaccggtgg taacgcgctg aaattctacg 540

cctctgttcg tctcgacatc cgtcgtatcg gcgcggtgaa agagggcgaa aacgtggtgg 600

gtagcgaaac ccgcgtgaaa gtggtgaaga acaaaatcgc tgcgccgttt aaacaggctg 660

aattccagat cctctacggc gaaggtatca acttctacgg cgaactggtt gacctgggcg 720

taaaagagaa gctgatcgag aaagcaggcg cgtggtacag ctacaaaggt gagaagatcg 780

gtcagggtaa agcgaatgcg actgcctggc tgaaagataa cccggaaacc gcgaaagaga 840

tcgagaagaa agtacgtgag ttgctgctga gcaacccgaa ctcaacgccg gatttctctg 900

tagatgatag cgaaggcgta gcagaaacta acgaagattt ttaatgattg cagtccagtt 960

acgctggagt ctgaggctcg tcctgaatga tatcaagctt gaattcgttg gttcatcccg 1020

tgggcattgc atagggataa cagggtaatc taaatacatt caaatatcta tccgctcatg 1080

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagaatat gagtattcaa 1140

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 1200

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgcc gaagatcagt tgggtgcacg tgtgggttac 1260

atcgaactgg acctcaacag cggtaagatt cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttc 1320

ccaatgatga gcacttttaa agttctgctc tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 1380

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 1440

ccagtcacag aaaagcatct tacggacggc atgacagtac gcgaattatg cagcgctgcc 1500

ataaccatga gtgataacac ggcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1560

gagcttaccg cttttttgca caacatgggt gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1620

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagctatg 1680

gcaacaacgt tgcgcaaact cttaactggc gaacttctta ctctcgcttc ccggcaacaa 1740

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1800

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtcccg cggtattatt 1860

gcagccctgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagc 1920

caggcaacta tggacgaacg taatcgccag atcgctgaga taggtgcctc cctgattaag 1980

cattggtaat aaccaggcat ctcgtcttgt ttgatacaca agggtcgcat ctgcggccct 2040

tttgcttttt taagttgtaa ggatatgcca tgacagaatc aacatcccgt cgcccggcat 2100

atgctcgcct gttggatcgt gcggtacgca ttctggcggt gcgcgatcac agtgagcaag 2160

aactgcgacg taaactcgcg gcaccgatta tgggcaaaaa tggcccagaa gagattgatg 2220

ctacggcaga agattacgag cgcgttattg 2250

<210> 54

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成质粒

<400> 54

tgattgcagt ccagttacgc tggagtctga ggctcgtcct gaatgatatc aagcttgaat 60

tcgttggttc atcccgtggg cattgcatag ggataacagg gtaatctaaa tacattcaaa 120

tatctatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa 180

gaatatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 240

tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgccgaag atcagttggg 300

tgcacgtgtg ggttacatcg aactggacct caacagcggt aagattcttg agagttttcg 360

ccccgaagaa cgtttcccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctctgtg gcgcggtatt 420

atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga 480

cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gacggcatga cagtacgcga 540

attatgcagc gctgccataa ccatgagtga taacacggcg gccaacttac ttctgacaac 600

gatcggagga ccgaaggagc ttaccgcttt tttgcacaac atgggtgatc atgtaactcg 660

ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac 720

gatgcctgta gctatggcaa caacgttgcg caaactctta actggcgaac ttcttactct 780

cgcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 840

gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 900

gtcccgcggt attattgcag ccctggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 960

ctacacgacg gggagccagg caactatgga cgaacgtaat cgccagatcg ctgagatagg 1020

tgcctccctg attaagcatt ggtaataacc aggcat 1056

<210> 55

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 55

gatttccgtg gcgcagaaaa aagcaaatgg cacatctgtt tgggtataat cgcgcccatg 60

ctttttcgcc atgattgcag tccagttacg 90

<210> 56

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 56

gggtgaaatc aatcttccat tcgcctttta atgagttcag gtttttcagg cgcaggctga 60

gaattatgcc tggttattac caatgcttaa 90

<210> 57

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成质粒

<400> 57

gatcatttca cgaatttttg cggatacatc acctacatat acccctgcac gtacctccaa 60

caaccagatg gctaatctgc ctcgtaagcg cggaggtaca ttttcagtga ccacgaccaa 120

catactcatt tcctgacgga tggccttttt gcgtttctac aaactctttt tgtttatttt 180

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 240

aatattgaaa aaggaagagt atgactgaat acaagcccac ggtacgcttg gcgacgcgcg 300

acgatgttcc ccgcgctgtt cgtacattag ctgcggcctt tgcagattac ccagcgacgc 360

gccatacggt cgatccggac cgccatatcg agcgtgtcac agaattgcag gaacttttct 420

taactcgcgt gggccttgac atcggaaagg tctgggtggc tgacgatggc gctgcagtgg 480

ctgtttggac cactccggag agtgtagagg ctggtgcagt gttcgccgaa attggtcctc 540

gtatggccga attaagtgga agtcgtctgg cagcccaaca acaaatggaa gggttgcttg 600

cgccccaccg tccgaaagaa cccgcgtggt tccttgccac cgttggagta agcccagatc 660

accaggggaa gggtttagga tctgccgtag ttttaccagg tgtggaggca gcagaacgtg 720

cgggagttcc ggccttcctt gagacgtcgg cgccgcgcaa tttaccgttt tacgaacgtc 780

ttggattcac cgttacggcg gacgtggagg tgccggaggg accccgtact tggtgtatga 840

ctcgtaaacc gggagcctga taatttatta cacctcaatc acagtggagc caaagatagc 900

aagccacatc ccatcgattt agctggccca ataccttgct gtacaagatc tattaacgct 960

ggcgcgtcgt tgatggtgag cacaccttca aagcaaaccg 1000

<210> 58

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成质粒

<400> 58

gcggtttatc cccgctggcg cggggaactc tctaaaagta tacatttgtt cttaaagcat 60

tttttcccat aaaaacaacc caccaacctt aatgtaacat ttccttatta ttaaagatca 120

gctaattctt tgttttcctg acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt 180

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 240

tcaataatat tgaaaaagga agagtatgac tgaatacaag cccacggtac gcttggcgac 300

gcgcgacgat gttccccgcg ctgttcgtac attagctgcg gcctttgcag attacccagc 360

gacgcgccat acggtcgatc cggaccgcca tatcgagcgt gtcacagaat tgcaggaact 420

tttcttaact cgcgtgggcc ttgacatcgg aaaggtctgg gtggctgacg atggcgctgc 480

agtggctgtt tggaccactc cggagagtgt agaggctggt gcagtgttcg ccgaaattgg 540

tcctcgtatg gccgaattaa gtggaagtcg tctggcagcc caacaacaaa tggaagggtt 600

gcttgcgccc caccgtccga aagaacccgc gtggttcctt gccaccgttg gagtaagccc 660

agatcaccag gggaagggtt taggatctgc cgtagtttta ccaggtgtgg aggcagcaga 720

acgtgcggga gttccggcct tccttgagac gtcggcgccg cgcaatttac cgttttacga 780

acgtcttgga ttcaccgtta cggcggacgt ggaggtgccg gagggacccc gtacttggtg 840

tatgactcgt aaaccgggag cctgataatt cagctactcc gatggcctgc atctcccagt 900

gaaacaggaa gcggaatggc aacaggctgt gcatcttcag gtggggccgg cggttgtatt 960

tctccagcgg caagcacgtc ctctataagc ggaatcaatt 1000

<210> 59

<211> 1496

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成质粒

<400> 59

tatgagcagc atcgaaaaat agcccgctga tatcatcgat aatactaaaa aaacagggag 60

gctattacca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 120

atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctctac tagagtcaca ctggctcacc ttcgggtggg 180

cctttctgcg tttatatctt tctgacacct tactatctta caaatgtaac aaaaaagtta 240

tttttctgta attcgagcat gtcatgttac cccgcgagca taaaacgcgt gtgtaggagg 300

ataatctatg gatttgtcac agctaacacc acgtcgtccc tatctgctgc gtgcattcta 360

tgagtggttg ctggataacc agctcacgcc gcacctggtg gtggatgtga cgctccctgg 420

cgtgcaggtt cctatggaat atgcgcgtga cgggcaaatc gtactcaaca ttgcgccgcg 480

tgctgtcggc aatctggaac tggcgaatga tgaggtgcgc tttaacgcgc gctttggtgg 540

cattccgcgt caggtttctg tgccgctggc tgccgtgctg gctatctacg cccgtgaaaa 600

tggcgcaggc acgatgtttg agcctgaagc tgcctacgat gaagatacca gcatcatgaa 660

tgatgaagag gcatcggcag acaacgaaac cgttatgtcg gttattgatg gcgacaagcc 720

agatcacgat gatgacactc atcctgacga tgaacctccg cagccaccac gcggtggtcg 780

accggcatta cgcgttgtga agtaatcgac ctagcataac cccgcggggc ctcttcgggg 840

gtctcgcggg gttttttgct gaaagaagct tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga 900

ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc gctgcggccg ggtcaggtat gatttaaatg 960

gtcagtaacg ggtcttgagg ggttttttgc cacagctaac accacgtcgt ccctatctgc 1020

tgccctaggt ctatgagtgg ttgctggata acgtgcgtaa ttgtgctgat ctcttatata 1080

gctgctctca ttatctctct accctgaagt gactctctca cctgtaaaaa taatatctca 1140

caggcttaat agtttcttaa tacaaagcct gtaaaacgtc aggataactt ctatattcag 1200

ggagaccaca acggtttccc tctacaaata attttgttta acttttgaag gagaacaaat 1260

gaatttgctt attgataact ggatccctgt acgcccgcga aacgggggga aagtccaaat 1320

cataaatctg caatcgctat actgcagtag agatcagtgg cgattaagtt tgccccgtga 1380

cgatatggaa ctggccgctt tagcactgct ggtttgcatt gggcaaatta tcgccccggc 1440

aaaagatgac gttgaatttc gacatcgcat aatgaatccg ctcactgaag atgagt 1496

<210> 60

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 60

gggagaccac aacgg 15

<210> 61

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 61

cgcagtcgaa cgaccg 16

Claims (11)

1.一种经遗传修饰的微生物，其中：

内源cas3核酸酶缺失或突变；

Cascade操纵子可操作地连接至启动子，所述启动子允许所述操纵子的条件性过表达；和

向导阵列，其中至少一种CRISPR/Cascade gRNA可以被条件性表达，其中所述向导阵列的表达导致至少一种基因的表达降低，

其中所述经遗传修饰的微生物的特征在于，与缺乏内源cas3核酸酶缺失或突变或Cascade操纵子的条件性表达的经遗传修饰的微生物相比，所述向导阵列的稳定性增加。

2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中内源cas1基因缺失或突变。

3.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述Cascade操纵子在严格抑制的诱导型启动子的控制下过表达。

4.根据权利要求3所述的经遗传修饰的微生物，其中所述严格抑制的诱导型启动子是PhoB激活的。

5.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述经遗传修饰的微生物是大肠杆菌微生物。

6.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述表达降低的基因选自：fabI、gltA1、gltA2、udhA和zwf。

7.一种在经遗传修饰的微生物中条件性沉默基因的方法，其包括

提供经遗传修饰的微生物，其特征在于：

内源cas3核酸酶的缺失或突变；

Cascade操纵子；和

包括至少一个CRISPR/Cascade gRNA的至少一个向导阵列，

使所述经遗传修饰的微生物在其中所述CRISPR/Cascade gRNA的表达导致所述经遗传修饰的微生物的至少一个基因的表达降低的条件下生长。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述经遗传修饰的微生物还包括内源cas1基因的缺失或突变。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述经遗传修饰的微生物的特征还在于在被PhoB激活的诱导型启动子控制下的Cascade操纵子。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述经遗传修饰的微生物是大肠杆菌微生物。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述表达降低的基因选自：fabI、gltA1、gltA2、udhA和zwf。

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