KR20220154748A

KR20220154748A - 개선된 i-e형 crispr에 기반한 유전자 침묵화를 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20220154748A
Application number: KR1020227035523A
Authority: KR
Inventors: 미셸 디. 린츠; 지시아 예; 에이릭 모르에브; 줄리아나 레뷰
Original assignee: 듀크 유니버시티
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2022-11-22
Also published as: EP4103689A2; EP4103689A4; CA3175878A1; IL296416A; WO2021188554A3; WO2021188554A2; BR112022018344A2; AU2021239868A1; JP2023518028A; MX2022011418A; US20230193264A1; CN115461441A

Abstract

CRISPR 기반의 간섭은 유전자 회로에서부터 동적 대사 조절에 이르는 다양한 응용 분야들에서 일반화되었다. E. coli에서 천연적인 CRISPR 캐스케이드 시스템은 복수의 유전자들을 하나의 전사체로부터 침묵시킬 수 있는 가이드 RNA 어레이의 발현과 더불어 cas3 뉴클레아제의 결손에 의한 침묵화에 이용할 수 있다.

Description

개선된 I-E형 CRISPR에 기반한 유전자 침묵화를 위한 방법 및 조성물

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2020년 3월 16일자 미국 가출원 번호 62/990,172에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

연방 지원에 관한 진술

본 발명은 해군 연구소에 의해 부여된 12043956 및 DOE EERE에 의해 부여된 EE0007563 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부가 본 발명에 대해 일정 권리를 가진다.

서열목록에 대한 언급

본 출원은 2020년 3월 10일자에 생성된 28943 바이트 크기의 ASCII 형식의 49186-45_ST25.txt로서 전자 제출된 서열목록을 수록하고 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다.

유전자 침묵은 강력한 도구로서, CRISPR 기반의 방법이 이러한 접근 방법을 더욱 단순하게 만들었다 (Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat. Commun. 9, 1911 (2018)). E. coli에서 천연적인 다중-단백질 캐스케이드 (I-E형 CRISPR) 시스템은, 뉴클레아제 구성성분의 결손 및 CRISPR 어레이와 표적 DNA의 결합 과정을 담당하는 유전자들의 과다발현을 수반하는, 유전자 침묵에 이용하도록 조작할 수 있다. 변형된 캐스케이드 시스템을 이용하는 한가지 이점은 추후 각각의 가이드 RNA들로 진행되는 프로토스페이서를 여러개 함유한 단일 전사체의 발현을 통해 복수의 유전자들을 표적화하는 것이다 (Luo, M. L., Mullis, A. S., Leenay, R. T. & Beisel, C. L. Repurposing endogenous type I CRISPR-Cas systems for programmable gene repression. Nucleic Acids Research vol. 43 674-681 (2015)).

CRISPR 기반의 간섭은 유전자 회로에서부터 동적 대사 제어에 이르는 다양한 응용 분야들에서 일반화되었다. Cas 1/2 엔도뉴클레아제 매개 가이드 어레이의 불안정성이 일부 사례들에서 문제로 확인되었다. E. coli에서 천연적인 CRISPR 캐스케이드 시스템은 여러 유전자들을 하나의 전사체로부터 침묵시킬 수 있는 가이드 RNA 어레이 (guide RNA array)의 발현과 더불어 cas3 뉴클레아제의 결손에 의한 침묵화에 활용할 수 있다.

도 1(A)-1(G): 도 1(A) 가이드 어레이에 대한 개략도. 도 1(B) 가이드 어레이 프로토스페이서 소실에 대한 예. 도 1(C) PCR에 의해 정량 분석한 프로토스페이서 변형. 도 1(D) 가이드 어레이 및 숙주 균주에 따른 가이드 어레이의 안정성. 도 1(E) pFABI를 이용한 fabI 침묵화에 대한 보완 개략도. 도 1(F) 콜로니 개수를 나타낸 그래프, 및 도 1(G) 가이드 어레이 및 pFABI로 형질전환된 균주를 이용한 가이드 어레이의 안정성 입증.
도 2는 본 발명의 플라스미드 제품군 예를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 균주 예들을 나타낸 것이다.
도 4는 sgRNA 가이드 서열 및 이의 구축용 프라이머의 예들을 요약하여 나타낸 것이다. 스페이서는 이탤릭체로 표시한다.
도 5는 본 발명의 합성 DNA 예들을 요약하여 나타낸 것이다.

일반 정의

본 명세서 및 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 달리 명시되지 않은 한 복수의 언급을 포함한다. 즉, 예를 들어, "발현 벡터"에 대한 언급은 한가지 발현 벡터뿐 아니라, 동일 (예를 들어, 동일한 오페론)하거나 또는 상이한, 복수의 발현 벡터를 망라하며; "미생물"에 대한 언급은 한가지 미생물뿐 아니라 복수의 미생물을 망라하며, 그 외에도 이와 같다.

용어 "이종적인 DNA", "이종적인 핵산 서열" 등은 본원에서 다음 중 한가지 이상에 해당되는 핵산 서열을 지칭한다: (a) 핵산 서열이 주어진 숙주 미생물에 대해 외래의 것이거나 (즉, 자연적으로 발견되지 않음); (b) 서열이 주어진 숙주 미생물에서 자연적으로 발견될 순 있지만 비-천연적인 (예를 들어, 예상되는 수준보다 더 높은) 수준일 수 있거나; 또는 (c) 핵산 서열이 자연계에서와 동일한 관계로 확인되지 않는 2 이상의 부분 서열들을 포함한다. 예를 들어, (c) 경우와 관련하여, 재조합 방식에 의해 만들어진 이종적인 핵산 서열은 유전자 발현을 구동하는 비-천연적인 프로모터와 같은 새로운 기능성 핵산을 생성하기 위해 정렬된 비관련 유전자들로부터 유래한 2 이상의 서열을 가질 것이다.

종 및 기타 계통 식별은 미생물학 기술 분야의 당업자에게 공지된 분류에 따른다.

효소는 UniProt 식별 번호로 본원에 열거되며, 이는 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. UniProt 데이터베이스는 http://www.UniProt.org/에서 접근할 수 있다. 유전자 산물, 즉 효소의 유전자 변형이 청구항을 비롯한 본 명세서에 언급되는 경우, 유전자 변형이 통상적으로 언급된 유전자 산물, 즉 효소를 암호화하는 유전자 등과 같은 핵산 서열의 유전자 변형인 것으로 이해된다.

본원에 언급된 방법 및 단계가 특정 순서로 이루어지는 특별한 이벤트를 기술하는 경우, 당해 기술 분야의 당업자들은 특정 단계들의 순서가 변경될 수 있으며, 이러한 변경이 본 발명의 변이에 따른 것임을 알 것이다. 아울러, 일부 단계들은 가능한 경우 병렬 방식으로 동시에 이루어질 수 있으며, 아울러 순차적으로 수행될 수도 있다.

약어의 의미는 다음과 같다: "C"는 이의 사용으로부터 명확한 바와 같이 섭씨 또는 섭씨 온도를 의미하고, DCW는 건조 세포 중량을 의미하고, "s"는 초(들)를 의미하고, "min"은 분(들)을 의미하고, "h," "hr," 또는 "hrs"는 시간(들)을 의미하고, "psi"는 제곱 인치 당 파운드 (pound per square inch)를 의미하고, "nm"는 나노미터를 의미하고, "d"는 일수(들)를 의미하고, "μL" 또는 "uL" 또는 "ul"은 마이크로리터(들)를 의미하고, "mL"은 밀리리터(들)를 의미하고, "L"은 리터(들)를 의미하고, "mm"는 밀리미터(들)를 의미하고, "nm"는 나노미터를 의미하고, "mM"는 밀리몰 농도를 의미하고, "μM" 또는 "uM"은 마이크로몰 농도를 의미하고, "M"는 몰 농도를 의미하고, "mmol"은 밀리몰(들)을 의미하고, "μmol" 또는 "uMol"은 마이크로몰(들)을 의미하고, "g"은 그람(들)을 의미하고, "㎍" 또는 "ug"은 마이크로그램(들)을 의미하고, "ng"은 나노그램(들)을 의미하고, "PCR"은 중합효소 연쇄 반응을 의미하고, "OD"는 광학 밀도를 의미하고, "OD600"은 광자 파장 600 nm에서 측정한 광학 밀도를 의미하고, "kDa"은 킬로달톤을 의미하고, "g"은 중력 상수를 의미하고, "bp"는 염기쌍(들)을 의미하고, "kbp"는 킬로 염기쌍(들)을 의미하고, "% w/v"는 중량/부피 퍼센트를 의미하고, "% v/v"는 부피/부피 퍼센트를 의미하고, "IPTG"는 이소프로필-μ-D-티오갈락토피라노시드를 의미하고, "aTc"는 무수 테트라사이클린을 의미하고, "RBS"는 리보솜 결합부를 의미하고, "rpm"은 분당 회전수를 의미하고, "HPLC"는 고 성능 액체 크로마토그래피를 의미하고, "GC"는 기체 크로마토그래피를 의미한다.

달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다.

미생물

본원에 기술되고 청구되는 특징들은, 또한 하나 이상의, 천연적인, 도입된 또는 강화된, 산물의 생물-생산 경로를 포함하는 본원에 열거된 목록 또는 다른 적절한 미생물로부터 선택되는 미생물에서 제공될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 미생물(들)은 (이러한 일부 구현예에서, 강화될 수 있는) 내인성 산물 생산 경로를 포함하며, 다른 구현예에서, 미생물은 내인성 산물 생산 경로를 포함하지 않는다.

보다 구체적으로, 본원에 기술된 다양한 기준에 기반하여, 화학적 산물을 생물-생산하기에 적합한 미생물 숙주는 일반적으로 방법 단락에 기술된 유기체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

본원에 언급된 임의의 유전자 또는 단백질에 대한 숙주 미생물 또는 기원 미생물은 다음과 같은 미생물 목록으로부터 선택할 수 있다: 시트로박터 (Citrobacter), 엔테로박터 (Enterobacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 클렙시엘라 (Klebsiella), 에어로박터 (Aerobacter), 락토바실러스 (Lactobacillus), 아스퍼질러스 (Aspergillus), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 지고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 피키아 Pichia), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 한세뉼라 (Hansenula), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 뮤코르 (Mucor), 토룰롭시스 (Torulopsis), 메틸로박터 (Methylobacter), 에셰리키아 (Escherichia), 살모넬라 (Salmonella), 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 슈도모나스 (Pseudomonas). 일부 측면들에서, 숙주 미생물은 E.coli 미생물이다.

본 발명의 측면들에 대한 개괄

일반적으로, 가이드 어레이의 불안정성은 내인성 cas3 뉴클레아제의 결손 또는 돌연변이를 특징으로 하는 유전자 변형된 미생물을 이용함으로써 없앨 수 있으며; 캐스케이드 오페론이 과다 발현될 수 있으며; 하나 이상의 CRISPR/캐스케이드 gRNA가 발현되어 하나 이상의 유전자의 발현 감소를 달성할 수 있다.

일부 측면에서, 미생물 및 미생물을 이용하는 임의 방법은 내인성 cas1 유전자가 결손 또는 돌연변이된 유전자 변형된 미생물의 이용을 포함할 수 있다.

일부 측면에서, 미생물 및 미생물을 이용하는 임의 방법은 PhoB 활성화된 유도성 프로모터의 통제 하에 배치된 캐스케이드 오페론을 추가로 특징으로 하는 유전자 변형된 미생물의 이용을 포함할 수 있다.

일부 측면에서, 미생물 및 미생물을 이용하는 임의 방법은 유전자 변형된 미생물로서 E. coli 미생물의 이용을 포함할 수 있다.

일부 측면에서, 미생물 및 미생물을 이용하는 임의 방법은 유전자, 즉 fabI, gltA1, gltA2, udhA, zwf 또는 이들의 조합의 발현을 감소시키도록 작용할 수 있다.

상세한 설명

가이드 어레이의 불안정성은 Cas1/2 엔도뉴클레아제 복합체의 발현이 원인일 수 있다. cas1 결손이 가이드 어레이의 불안정성을 감소시킨다. 기본적인 Cas1/2 엔도뉴클레아제 활성은 가이드 어레이로부터 프로토스페이서의 소실을 야기한다. 후속적으로, 가이드 어레이는 선택을 통해 증폭될 수 있는 침묵 효과가 무력화될 수 있다. 캐스케이드 복합체의 발현을 구동하는 구성적인 프로모터를 엄격하게 제어되는 유도성 프로모터로 치환하면, 가이드 어레이의 안정성이 개선된다.

가이드 어레이의 불안정성은, 내인성 cas3 뉴클레아제의 결손 또는 돌연변이; 캐스케이드 오페론; 및 하나 이상의 CRISPR/캐스케이드 gRNA를 특징으로 하는 유전자 변형된 미생물을 제공하는 것을 비롯하여, 유전자 변형된 미생물에서 유전자를 조건에 따라 침묵시키는 방법을 이용하는 경우에, 없어진다. 본 방법은 CRISPR/캐스케이드 gRNA의 발현이 유전자 변형된 미생물의 유전자 하나 이상의 발현 감소를 달성하는 조건 하에 유전자 변형된 미생물을 배양하는 것을 포함한다. 미생물 및 본 발명의 이러한 미생물을 이용하는 방법은 내인성 cas3 뉴클레아제 유전자의 결손 또는 선택적인 돌연변이, 또는 캐스케이드 오페론의 조건부 발현의 임의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 조건들 중 한가지 조건 또는 2가지 조건 모두 가이드 어레이의 안정성을 증가시킨다.

가이드 어레이는 어레이의 조건부 발현시 한가지 유전자의 전사 침묵을 높이는 한가지 gRNA를 포함할 수 있다. 대안적으로, 가이드 어레이는 유전자 2종 이상의 전사 침묵을 유발하는 gRNA를 하나보다 더 많이 포함할 수 있다. 단일한 가이드 어레이는 유전자 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 그보다 많은 수를 동시에 조절하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 대안적으로, 유전자 변형된 미생물은, 각각 조건부 발현될 수 있는 2 이상의 가이드 어레이들을 동시에 포함할 수 있으며, 유전자 하나 이상에 대한 전사 침묵이 달성될 것이다.

일 측면에서, 본 방법은 내인성 cas1 유전자가 결손 또는 돌연변이된 유전자 변형된 미생물의 이용을 포함할 수 있다. cas1 유전자의 결손 또는 돌연변이는 최적의 가이드 어레이 안정성을 제공하기 위해 2가지 조건과 조합될 수 있으며, 즉 내인성 cas3 뉴클레아제 유전자의 결손 또는 선택적인 돌연변이, 또는 캐스케이드 오페론의 조건부 발현과 조합된다. 그러나, 이들 3가지 인자들 (cas3 결손/돌연변이; cas1 결손/돌연변이; 또는 캐스케이드 오페론의 조건부 발현)의 임의 조합은 가이드 어레이의 안정성을 실제 높일 것으로 보인다.

cas3 및/또는 cas1 내인성 유전자의 결손 또는 돌연변이는 주로 이 내인성 유전자의 발현을 불가능하게 하는 내인성 유전자에 대한 임의 변형을 지칭한다. 이러한 결손 또는 돌연변이는 유전자 조절 서열에서 발생할 수 있거나, 또는 유전자 자체의 암호화 서열의 변형, 또는 유전자 변형된 미생물의 특이적인 내인성 유전자의 발현을 방지하는 기타 수단일 수 있다.

조건부 발현, 조건부 과다발현, 유도성 프로모터 또는 엄격하게 억제되는 유도성 프로모터라는 표현들은 유전자 발현에 대한 조절 방식을 지칭한다. 유전자 발현은 자극 물질의 도입 또는 대안적으로 필수 영양분 또는 기타 물질의 고갈에 의해 조건에 따라 조절할 수 있다. 엄격하게 억제되는 프로모터 서열은, 프로모터가 언급된 억제성 조건 하에 놓인 동안에는 유전자 발현의 제어가 엄밀하게 이루어지지 않는 것을 의미하며, 유도성은 프로모터가 외부에서 적용된 신호에 반응할 수 있는 것을 의미한다.

가이드 어레이는 표적에 대해 특이적인 gRNA의 발현을 허용하는 임의의 구성을 지칭한다. 이 경우, 표적은 특정 조건에서 전사적으로 침묵시키고자 하는 유전자이다.

본 발명의 다른 측면은 내인성 cas3 뉴클레아제 유전자의 결손 또는 선택적인 돌연변이, 또는 캐스케이드 오페론의 조건부 발현의 임의 조합을 겸비한 유전자 조작된 미생물에서의 가이드 어레이의 발현을, 이러한 특징이 결핍된 유전자 변형된 미생물과 비교하여, 기술된다. 이러한 특징은 가이드 어레이의 안정성을 강화해, 즉 표적 유전자에 대한 유전자 전사 침묵화를 강화하도록 작용한다.

일 측면에서, 본 방볍은 유도성 프로모터로서 활성화된 PhoB의 통제 하에 배치된 캐스케이드 오페론을 추가적으로 특징으로 하는 유전자 변형된 미생물의 이용을 포함할 수 있다. PhoB 이외의 다른 임의의 유도성 프로모터도 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다.

일 측면에서, 본 방법은 유전자 변형된 미생물로서 E. coli 미생물의 이용을 포함할 수 있다. 그러나, 조절, 결손 또는 돌연변이하고자 하는 대상 유전자뿐 아니라 발현할 오페론 및 가이드 어레이는 임의의 공지된 미생물에 적용가능한 것으로 이해된다.

일 측면에서, 본 방법은 유전자, 즉 fabI, gltA1, gltA2, udhA, zwf 또는 이들의 조합의 발현을 감소시키도록 기능할 수 있다. 이들 유전자들은 본원에 언급된 유전자 변형된 미생물에서 조절할 후보 유전자로 동정되었지만, 본 방법 및 미생물은 선택적인 제어가 요망되는 것으로 동정된 임의 유전자에도 널리 적용가능한 것으로 이해된다. 예를 들어,

실시예

본 발명의 원리에 대한 이해를 돕기 위한 목적으로, 이제 바람직한 구현예가 언급될 것이며, 구체적인 표현이 이를 설명하기 위해 사용될 것이다. 그러나, 이로 인한 본원의 범위에 대한 제한은 의도되지 않으며, 본 발명의 내용과 관련한 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이루어질 수 있는 바와 같이 본원에 예시된 내용에 대한 변형 및 추가적인 수정도 고려되는 것으로, 이해될 것이다.

재료 및 방법:

도 2는 본 발명의 예시적인 플라스미드들을 요약하여 나타낸 것이다. 도 3은 본 발명의 예시적인 미생물 균주들을 요약한 것이다. 도 4는 예시적인 sgRNA 가이드 서열 및 이를 구축하기 위해 사용되는 프라이머 목록을 요약한 것이다. 도 5는 본 발명의 예시적인 합성 DNA를 요약한 것이다. 스페이서는 이탤릭체로 표시된다.

시약 및 배지: 달리 언급되지 않은 한, 모든 재료와 시약은 가능한 최고 품질이며, Sigma (St. Louis, MO) 사에서 구입하였다. LB (Luria Broth), 저염 레녹스 제형을 일반적인 균주 및 플라스미드 증폭, 구축 및 콜로니 단리시 사용하였다. 클로람페니콜, 암피실린 및 테트라사이클린은 각각 최종 작용 농도 20 ㎍/mL, 100 ㎍/mL 및 5 ㎍/mL로 사용하였다. 푸로마이신 선별은 최종 작용 농도 200 ㎍/mL에서, 적절하게 선별되도록 pH를 유지하기 위해 50 mM 포타슘 포스페이트 완충제 (pH=8.0)가 첨가된 LH와 함께 사용해 수행하였다.

균주 및 플라스미드: 더 작은 어레이의 PCR 어셈블리를 이용한 기존에 발표된 바와 같이 pCASCADE 어레이 플라스미드를 구축하였다. 본 실험에서 구축한 pCASCADE 플라스미드의 서열 및 프라이머에 대한 구체적인 내용은 도 2-5를 참조한다. 플라스미드, pFABI는 강력한 합성 EM7 프로모터를 이용해 코돈 최적화된 fabI 유전자를 구성적으로 발현할 수 있도록 구축하였다. 이 프로모터 및 유전자를 함유한 플라스미드 DNA는 Twist Biosciences (San Francisco, CA)에서 구입하였다. 균주 E. cloni 10G는 Lucigen에서 구입하였다. 균주 DLF_Z0025, DLF_Z0045 및 DLF_Z0047은 기존에 발표된 바와 같이 준비하였다. 본 실험에서 준비한 모든 균주들은 표준적인 재조합 조작을 이용해 구축하였다. 재조합 조작 플라스미드 pSIM5 및 tet-sacB 선별/대항선택 마커 카세트는 Donald Court (NCI, https://redrecombineering.ncifcrf.gov/court-lab.html)로부터 친절하게 제공받았다. DLF_Z0047 ΔsbcD::ampR은 직접 통합 및 적절한 항생제 마커를 함유한 선형 도너 DNA와의 유전지 치환에 의해 구축하였다. 도너는 합성 암피실린 내성 카세트 (ampR2)를 프라이머 del_sbcD_p1 및 del_sbcD_p2를 이용해 PCR하여 준비하였다. DLF_Z0047, recA1::ampR도 유사한 방식으로 구축하였으며, 단 통합시 결손시키지 않고 recA 유전자에 G160D 돌연변이를 삽입하였다. 균주 DLF_Z0047 Δcas1::purR 및 DLF_Z0047 Δcas2::purR은 직접 통합 및 선형 도너 DNA와의 유전자 치환을 통해 구축하였다. 균주 DLF_S0047 및 DLF_S0025는, 재조합 조작 및 tet-sacB 기반의 선별 대항선별을 이용하여 각각 DLF_Z0047 및 DLF_Z0025로부터 구축함으로써, sspB 유전자 및 캐스케이드 오페론의 앞부분에 위치한 프로모터를 치환하였다. 모든 유전자 변형은 PCR 및 서열분석으로 검증하였다. 서열분석은 Genewiz (Morrisville, NC) 또는 Eurofins (Louisville, KY)에서 수행하였다. 플라스미드 형질전환은 표준 방법에 따라 수행하였다.

가이드 안정성 검사: 플라스미드 DNA 미니프렙 및 서열분석은 표준 방법으로 수행하였다. 다음과 같은 프라이머 2종을 이용해 pCASCADE 플라스미드로부터 가이드 어레이를 증폭시켰다: gRNA-for: 5'-GGGAGACCACAACGG-3' (서열번호 60), gRNA-rev: 5'-CGCAGTCGAACGACCG-3' (서열번호 61). 콜로니 PCR은 다음과 같이 수행하였다: 2X EconoTaq 마스터 믹스 (Lucigen)는 2X EconoTaq 마스터 믹스 (Lucigen) 5 ㎕, 각 프라이머 (10 uM 농도) 1 ㎕, dH₂O 3 ㎕ 및 콜로니 소량으로 이루어진 PCR 반응물 10 ㎕로 사용하였다. PCR 매개변수는 초기 98℃에서 2분간 1차 변성한 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초로 이루어진 사이클 35회, 그리고 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 연장이다. 이후, PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다.

도 1A-B를 참조하여 살펴보면, 먼저 가이드 소실이 의심되는 가이드 어레이 플라스미드 수종을 서열분석하였다. 실시예 (도 1A)에서와 같이, gltAp1 (G1), gltAp2 (G2) 및 udhA (U) 프로모터를 침묵시키기 위한 프로토스페이서를 함유한 가이드 어레이 플라스미드를, FabI (에노일-ACP 리덕타제), GltA (사이트레이트 신타제) 및 UdhA (가용성 트랜스하이드로게나제)를 단백질 가수분해에 의해 분해할 수 있는 데그론 (degron) 태그를 가지도록 조작된 숙주 균주 (DLF_Z0047)에 형질전환하였다. 콜로니 하나를 선택하고 이를 5 mL 배지 (루리아 브로스)에 접종한 다음, 밤새 배양한 후 배양물을 도말하여 단일 콜로니들로 단리하였다. 콜로니 24개가 단리되었으며, 가이드 어레이 플라스미드를 미니프렙하여 서열분석하였다. 플라스미드 17종이 예상된 서열을 가지고 있으며 프로토스페이서 3종 모두 유지한 반면 (도 1B, 상위 서열), 다른 7종에는 돌연변이가 존재하였으며, 중간 프로토스페이서 G2의 양 쪽에 위치한 프로토스페이서 2종 (G1 및 U)이 소실되었다. 이들 변형 클론들 중 4종은 5' 및 3' 측면 반복 서열을 둘다 보유한 반면, 나머지 클론 3종은 G2 프로토스페이서 측면에 위치한 5' 또는 3' 반복 서열 중 어느 하나를 또한 상실하였다.

도 1C에 나타낸 바와 같이, 다음 단계로, 단일한 가이드 (G2)와 부가적인 가이드 어레이 3종: FG2, FG1G2 및 FG1G2U ("F"는 fabI 프로모터를 표적화하는 프로토스페이서임)의 안정성을 조사하였다. 재차, 균주 DLF_Z0047을 이용하였으며, 콜로니 하나를 취해 5 mL 배지 (루리아 브로스)에 접종하는 절차로 개시하였다. 밤새 배양한 후, 배양물을 도말하여 단일 콜로니로 단리하였다. 이 경우에, 4개의 배양물 각각에서 클론 4개가 단리되었으며, 서열분석보다는 콜로니 PCR을 통해 가이드 어레이의 안정성을 평가하였다. 그 결과는 도 1C에 나타낸다. 이 경우에 단일한 G2 가이드가 안정적인 것으로 입증되었으며, 프로토스페이서 2-4개로 구성된 더 큰 어레이들은 불안정성 정도가 다양하여, 프로토스페이서 1-3개의 소실에 해당하는 증폭산물들이 생성되었다.

이제 도 1D를 참조하여 살펴보면, 안정성을 평가하기 위한 도구로서 PCR의 성공으로, 여러가지 수종의 숙주 균주들에서 더 큰 가이드 어레이 군들에 대한 가이드 어레이의 안정성을 평가하는 다음 단계를 실시하였다. 이는 F, G1, G2 및 U 프로토스페이서뿐 아니라 zwf 프로모터를 표적화하는 프로토스페이서, 즉 Z를 포함한다. 조사 균주로는 상업적인 recA1 클로닝 균주 E. cloni 10G (Lucigen), 2-단계 동적 대사 조절에 이용되는, 임의의 대사 효소에 대한 단백질 가수분해성 데그론 태그가 결핍된, 대조군 숙주로서 DLF_Z0025, GltA 및 UdhA에 데그론 태그를 가진 DLF_Z0045, DLF_Z0047 (FGU, 상기에 기술됨), 뿐만 아니라 recA1 돌연변이 (recAG160D), sbcD 유전자 결손 (가이드 어레이에 존재하는 팔린드롬 서열 및 헤어핀을 인지하는 SbcCD 엔도뉴클레아제의 구성성분) 및 cas1 및 cas2의 결손이 존재하는 DLF_Z0047의 파생 균주를 포함하였다. 결과는 도 1D에 제시한다.

가이드 어레이는 클로닝 균주에서 안정적이었다. 이러한 결과는 이들 구조체들이 본래 E. cloni 10G를 이용해 구축된 것이었므로 놀라운 사실은 아니며, 오리지널 플라스미드는 서열분석을 통해 임의의 프로토스페이서의 소실이 없는 것으로 검증되었다. 프로토스페이서 소실은 처음에 DLF_Z0025에서 작은 어레이 군에서 언급된 바 있다. DLF_Z0025는 캐스케이드 오페론을 구성적으로 발현하도록 변형된 것이다 (도 1A). 불안정성 증가는 숙주 균주 DLF_Z0045 및 DLF_Z0047에서 검출되었다. recA1 돌연변이 삽입도 sbcD 결손도 DLF_Z0047 백그라운드에서 프로토스페이서의 소실을 낮추지 못하였다. recA의 경우, 이는 E. coli에서 20 bp의 상동성만으로도 재조합을 수행할 수 있음에도 불구하고, 유의미한 재조합에는 50 bp 이상의 상동적인 서열이 필요한 것으로 입증된 이전의 실험 결과와 일치하였으며; 프로토스페이서의 길이는 30 bp이다. 이와는 대조적으로, cas1 또는 cas2의 결손은 어레이 안정성을 개선하였으며, cas1 결손은 프로토스페이서 소실을 최소화하였다.

cas1 결손의 결과는 프로토스페이서 소실의 원인이 되는 Cas1/2 엔도뉴클레아제와 일치하며, Cas1은 뉴클레아제 성분이다. 이러한 활성은 프로토스페이서 획득에 대한 기존에 발표된 활성과 일치한다. 매우 낮은 수준의 프로토스페이서 소실이 여전히 Cas1 돌연변이에서 관찰되는 점은, 프로토스페이서 소실에 대한 제2 대체 기전이 존재할 가능성 또는 대안적으로 본 PCR 분석의 오류를 의미한다. 그러나, 도 1D에서 알 수 있는 바와 같이, F 프로토스페이서를 함유한 가이드 어레이는 함유하지 않는 것보다 불안정성이 훨씬 현저하였다. 이러한 프로토스페이서 특이성은 일반적인 엔도뉴클레아제 활성과 일치하지 않으므로, F 함유 어레이가 프로토스페이서 소실 경향을 증가시키는 것인지에 대한 추가적인 조사가 필요하다.

FabI은 극히 필수적인 효소일 수 있으며, 가이드 어레이가 유도성 발현 하에 있음에도 불구하고 누출 발현 (leaky expression)이 증식 저해를 일으킬 수 있으며, F 프로토스페이서를 소실하는 가이드 어레이는 (cas1 및 cas2 포함) 캐스케이드 오페론이 과다 발현되는 균주에서 선택적인 이점을 가질 것이다. 이는 또한 F 프로토스페이서를 가진 가이드 어레이 플라스미드를 형질전환하였을 경우, 다른 어레이에 비해 콜로니 개수가 더 적게 생성된다는 일반적인 관찰 결과와 일치한다. 본 발명자들은 대안적인 구성적인 프로모터로부터 FabI를 발현할 수 있는 플라스미드 (pFABI, FIG IE)를 구축하였으며, 이중 하나는 F 프로토스페이서에 의해 침묵되지 않는다. 그 후, F 프로토스페이서를 함유한 가이드 어레이 플라스미드와 pFABI의 공동-형질전환이 콜로니 개수 및 어레이 안정성에 미치는 영향을 조사하였다. 도 1F-1G에서 알 수 있는 바와 같이, pFABI의 공동-형질전환은 콜로니 개수 및 어레이 안정성을 증가시켰다. 이들 데이터는 fabI의 누출 침묵으로 인한 증식 저해, 및 그로 인한 F 프로토스페이서가 소실되는 어레이의 선택적인 이점과 일치한다.

요컨대, 전술한 결과들은, 기본적인 Cas1/2 엔도뉴클레아제 활성시 가이드 어레이에서 프로토스페이서의 소실이 달성되는, 모델을 뒷받침해준다. 필수 유전자를 표적화하는 프로토스페이서를 함유한 침묵 어레이는, 심지어 캐스케이드 오페론의 과다 발현시 가이드의 누출 발현으로 인해 미묘하더라도 증식 저해로 이어질 수 있다. 독성 프로토스페이서가 생략된 어레이는 일반적인 배양 선별을 통해 증폭할 수 있다. 어레이 안정성을 개선하기 위한 옵션이 몇가지 있다. 먼저, 단순 cas1 결손은 안정성을 개선할 것이며, Cas1은 캐스케이드 오페론의 침묵 기능에 필수인 것은 아니며, 유전자 침묵에 영향을 미치지 않을 것이다. 이러한 접근 방식에는 향후 침묵 균주에 2가지 변형, cas3 및 cas1의 결손이 필요할 것이다 (도 1A). 그러나, 기본적인 fabI 침묵 사례에서 관찰되는 독성을 고려해, 제2 옵션을 조사하였으며, cas3를 결손시키고, 캐스케이드 오페론을 발현하기 위해 본래 발표된 바와 같은 구성적인 프로모터 (Biobrick J23100)가 아닌 엄격하게 조절되는 저 인산염 유도성 프로모터를 이용하였다. 이러한 접근 방식을 구현 및 검사하기 위해, FabI, GltA 및 UdhA에 데그론 태그를 함유한, DLF_Z0047과 동일한, DLF_S0047을 구축하였으며, 단 구성적인 J23100 프로모터 (도 1A)는 강력한 합성 전사 tZ 종결인자 앞에 놓인 저 인산염 유도성 변형된 yibD 유전자 프로모터로 치환하였다. 어레인 불안정성은 도 1D에서 알 수 있는 바와 같이 DLF_S0047을 이용하는 경우 없어졌다. 또한, 동적 대사 조절을 위해 향후 조작하기 위한 새로운 안정한 균주로서 DLF_S0025를 구축하였다.

CRISPR 간섭에서의 캐스케이드의 이용은, cas1/2 결손되지 않았을 경우의 캐스케이드 오페론 (cas1/2) 발현보다 더 엄격한 조절 또는 적어도 가이드 안정성 평가 측면에서 유익할 것이다.

개시된 구현예들은 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다양한 구현예들이 본원에서 도시 및 언급되지만, 이러한 구현예들은 단순 예로서 제공된다는 점을 강조한다. 본 발명의 다양한 구현들에서 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변이, 변화 및 치환이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 어떤 이유로, 명확하게 달리 언급되지 않은 한, 화합물, 핵산 서열, 기능성 효소, 대사 경로 효소 또는 중간산물 등의 특정 단백질을 비롯한 폴리펩타이드, 인자 또는 기타 조성물 또는 목록, 표 또는 기타 군별에서 본원에 언급되거나 또는 제시된 임의 농도 군들에 대해, 이러한 각각의 군이 다양한 하위 구현예들에 대한 토대를 제공하고 이를 식별하는 역할을 하는 것으로 의도되며, 하위 구현예들은 이의 가장 넓은 범위에서 각각 언급된 군의 하나 이상의 구성 요소 (또는 서브세트)를 제외한 이러한 군의 모든 서브세트를 포함한다. 아울러, 임의의 범위가 본원에 언급된 경우, 명확하게 달리 언급되지 않은 한, 그 범위는 이에 포함된 모든 수치와 모든 하위-범위를 포괄한다.

또한, 보다 일반적으로, 본원의 개시내용, 논의, 예 및 구현예에 따라, 통례적인 분자 생물학, 세포 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법들이 당해 기술 분야의 기술 범위 내에서 채택될 수 있다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook and Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Third Edition 2001 (volumes 1 - 3), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1986을 참조한다. 이러한 공개된 자료들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

아래 공개 자료들은 본원에 기술된 발명과 함께 이용가능한 기술, 예를 들어 당 공급원으로부터 화학적 산물(들)의 공업적인 생물-생산 방법, 및 또한 이러한 변환을 달성하기 위해 이용할 수 있는 공업적인 시스템에 대해, 원용에 의해 본 명세서에 포함된다 (Biochemical Engineering Fundamentals, 2^nd Ed. J. E. Bailey and D. F. Ollis, McGraw Hill, New York, 1986, 예를 들어, 생물학적 반응조 설계에 대해 제9장 533-657쪽; Unit Operations of Chemical Engineering, 5^th Ed., W. L. McCabe et al., McGraw Hill, New York 1993, 예를 들어, 가공 및 분리 기술 분석에 대해; Equilibrium Staged Separations, P. C. Wankat, Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ USA, 1988, 예를 들어, 분리 기술 교시에 대해).

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Duke University <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVED TYPE I-E CRISPR BASED GENE SILENCING <130> 49186-45 <150> 62/990,172 <151> 2020-03-16 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic guide array assembly <400> 1 aagttatgaa gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc 60 ggacagttat tagttcgagt tccccgcgcc agcggggata aaccgttaca tt 112 <210> 2 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic guide array assembly <400> 2 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gtattgacca attcattcgg acagttatta 60 gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 93 <210> 3 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic guide array assembly <400> 3 agttccccgc gccagcgggg ataaaccgta ttgaccaatt cattcggaca gttattagtt 60 cgagttcccc gcgccagcgg ggataaaccg 90 <210> 4 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic guide array assembly <400> 4 gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtat 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tcggcgccca gtgctgttgt 300 tgtcattaat aggcgcatcg ctggattact tattgctggc tttttcaagt gcgctttgga 360 tgctgtattt aggccgtttg ctttcaggga tcacaggagc tactggggct gtcgcggcat 420 cggtcattgc cgataccacc tcagcttctc aacgcgtgaa gtggttcggt tggttagggg 480 caagttttgg gcttggttta atagcggggc ctattattgg tggttttgca ggagagattt 540 caccgcatag tccctttttt atcgctgcgt tgctaaatat tgtcactttc cttgtggtta 600 tgttttggtt ccgtgaaacc aaaaatacac gtgataatac agataccgaa gtaggggttg 660 agacgcaatc gaattcggta tacatcactt tatttaaaac gatgcccatt ttgttgatta 720 tttatttttc agcgcaattg ataggccaaa ttcccgcaac ggtgtgggtg ctatttaccg 780 aaaatcgttt tggatggaat agcatgatgg ttggcttttc attagcgggt cttggtcttt 840 tacactcagt attccaagcc tttgtggcag gaagaatagc cactaaatgg ggcgaaaaaa 900 cggcagtact gctcggattt attgcagata gtagtgcatt tgccttttta gcgtttatat 960 ctgaaggttg gttagttttc cctgttttaa ttttattggc tggtggtggg atcgctttac 1020 ctgcattaca gggagtgatg tctatccaaa caaagagtca tcagcaaggt gctttacagg 1080 gattattggt gagccttacc aatgcaaccg gtgttattgg cccattactg tttgctgtta 1140 tttataatca ttcactacca atttgggatg gctggatttg gattattggt ttagcgtttt 1200 actgtattat tatcctgcta tcgatgacct tcatgttaac ccctcaagct caggggagta 1260 aacaggagac aagtgcttag ttatttcgtc accaaatgat gttattccgc gaaatataat 1320 gaccctcttg ataacccaag agcatcacat atacctgccg ttcactatta tttagtgaaa 1380 tgagatatta tgatattttc tgaattgtga ttaaaaaggc aactttatgc ccatgcaaca 1440 gaaactataa aaaatacaga gaatgaaaag aaacagatag attttttagt tctttaggcc 1500 cgtagtctgc aaatcctttt atgattttct atcaaacaaa agaggaaaat agaccagttg 1560 caatccaaac gagagtctaa tagaatgagg tcgaaaagta aatcgcgcgg gtttgttact 1620 gataaagcag gcaagaccta aaatgtgtaa agggcaaagt gtatactttg gcgtcacccc 1680 ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact tgccatcttc aaacaggagg 1740 gctggaagaa gcagaccgct aacacagtac ataaaaaagg agacatgaac gatgaacatc 1800 aaaaagtttg caaaacaagc aacagtatta acctttacta ccgcactgct ggcaggaggc 1860 gcaactcaag cgtttgcgaa agaaacgaac caaaagccat ataaggaaac atacggcatt 1920 tcccatatta cacgccatga tatgctgcaa atccctgaac agcaaaaaaa tgaaaaatat 1980 caagttcctg agttcgattc gtccacaatt aaaaatatct cttctgcaaa aggcctggac 2040 gtttgggaca gctggccatt acaaaacgct gacggcactg tcgcaaacta tcacggctac 2100 cacatcgtct ttgcattagc cggagatcct aaaaatgcgg atgacacatc gatttacatg 2160 ttctatcaaa aagtcggcga aacttctatt gacagctgga aaaacgctgg ccgcgtcttt 2220 aaagacagcg acaaattcga tgcaaatgat tctatcctaa aagaccaaac acaagaatgg 2280 tcaggttcag ccacatttac atctgacgga aaaatccgtt tattctacac tgatttctcc 2340 ggtaaacatt acggcaaaca aacactgaca actgcacaag ttaacgtatc agcatcagac 2400 agctctttga acatcaacgg tgtagaggat tataaatcaa tctttgacgg tgacggaaaa 2460 acgtatcaaa atgtacagca gttcatcgat gaaggcaact acagctcagg cgacaaccat 2520 acgctgagag atcctcacta cgtagaagat aaaggccaca aatacttagt atttgaagca 2580 aacactggaa ctgaagatgg ctaccaaggc gaagaatctt tatttaacaa agcatactat 2640 ggcaaaagca catcattctt ccgtcaagaa agtcaaaaac ttctgcaaag cgataaaaaa 2700 cgcacggctg agttagcaaa cggcgctctc ggtatgattg agctaaacga tgattacaca 2760 ctgaaaaaag tgatgaaacc gctgattgca tctaacacag taacagatga aattgaacgc 2820 gcgaacgtct ttaaaatgaa cggcaaatgg tacctgttca ctgactcccg cggatcaaaa 2880 atgacgattg acggcattac gtctaacgat atttacatgc ttggttatgt ttctaattct 2940 ttaactggcc catacaagcc gctgaacaaa actggccttg tgttaaaaat ggatcttgat 3000 cctaacgatg taacctttac ttactcacac ttcgctgtac ctcaagcgaa aggaaacaat 3060 gtcgtgatta caagctatat gacaaacaga ggattctacg cagacaaaca atcaacgttt 3120 gcgccaagct tcctgctgaa catcaaaggc aagaaaacat ctgttgtcaa agacagcatc 3180 cttgaacaag gacaattaac agttaacaaa taaaaacgca aaagaaaatg ccgatattga 3240 ctaccggaag cagtgtgacc gtgtgcttct caaatgcctg attcaggctg tctatgtgtg 3300 actgttgagc tgtaacaagt tgtctcaggt gttcaatttc atgttctagt tgctttgttt 3360 tactggtttc acctgttcta ttaggtgtta catgctgttc atctgttaca ttgtcgatct 3420 gttcatggtg aacagcttta aatgcaccaa aaactcgtaa aagctctgat gtatctatct 3480 tttttacacc gttttcatct gtgcatatgg acagttttcc ctttgat 3527 <210> 53 <211> 2250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic plasmid <400> 53 ccatctctac cggttcgctt tcactggata tcgcgcttgg ggcaggtggt ctgccgatgg 60 gccgtatcgt cgaaatctac ggaccggaat cttccggtaa aaccacgctg acgctgcagg 120 tgatcgccgc agcgcagcgt gaaggtaaaa cctgtgcgtt tatcgatgct gaacacgcgc 180 tggacccaat ctacgcacgt aaactgggcg tcgatatcga caacctgctg tgctcccagc 240 cggacaccgg cgagcaggca ctggaaatct gtgacgccct ggcgcgttct ggcgcagtag 300 acgttatcgt cgttgactcc gtggcggcac tgacgccgaa agcggaaatc gaaggcgaaa 360 tcgatgactc tcacatgggc cttgcggcac gtatgatgag ccaggcgatg cgtaagctgg 420 cgggtaacct gaagcagtcc aacacgctgc tgatcttcat caaccagatc cgtatgaaaa 480 ttggtgtgat gttcggtaac ccggaaacca ctaccggtgg taacgcgctg aaattctacg 540 cctctgttcg tctcgacatc cgtcgtatcg gcgcggtgaa agagggcgaa aacgtggtgg 600 gtagcgaaac ccgcgtgaaa gtggtgaaga acaaaatcgc tgcgccgttt aaacaggctg 660 aattccagat cctctacggc gaaggtatca acttctacgg cgaactggtt gacctgggcg 720 taaaagagaa gctgatcgag aaagcaggcg cgtggtacag ctacaaaggt gagaagatcg 780 gtcagggtaa agcgaatgcg actgcctggc tgaaagataa cccggaaacc gcgaaagaga 840 tcgagaagaa agtacgtgag ttgctgctga gcaacccgaa ctcaacgccg gatttctctg 900 tagatgatag cgaaggcgta gcagaaacta acgaagattt ttaatgattg cagtccagtt 960 acgctggagt ctgaggctcg tcctgaatga tatcaagctt gaattcgttg gttcatcccg 1020 tgggcattgc atagggataa cagggtaatc taaatacatt caaatatcta tccgctcatg 1080 agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagaatat gagtattcaa 1140 catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 1200 ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgcc gaagatcagt tgggtgcacg tgtgggttac 1260 atcgaactgg acctcaacag cggtaagatt cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttc 1320 ccaatgatga gcacttttaa agttctgctc tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 1380 gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 1440 ccagtcacag aaaagcatct tacggacggc atgacagtac gcgaattatg cagcgctgcc 1500 ataaccatga gtgataacac ggcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1560 gagcttaccg cttttttgca caacatgggt gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1620 ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagctatg 1680 gcaacaacgt tgcgcaaact cttaactggc gaacttctta ctctcgcttc ccggcaacaa 1740 ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1800 gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtcccg cggtattatt 1860 gcagccctgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagc 1920 caggcaacta tggacgaacg taatcgccag atcgctgaga taggtgcctc cctgattaag 1980 cattggtaat aaccaggcat ctcgtcttgt ttgatacaca agggtcgcat ctgcggccct 2040 tttgcttttt taagttgtaa ggatatgcca tgacagaatc aacatcccgt cgcccggcat 2100 atgctcgcct gttggatcgt gcggtacgca ttctggcggt gcgcgatcac agtgagcaag 2160 aactgcgacg taaactcgcg gcaccgatta tgggcaaaaa tggcccagaa gagattgatg 2220 ctacggcaga agattacgag cgcgttattg 2250 <210> 54 <211> 1056 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic plasmid <400> 54 tgattgcagt ccagttacgc tggagtctga ggctcgtcct gaatgatatc aagcttgaat 60 tcgttggttc atcccgtggg cattgcatag ggataacagg gtaatctaaa tacattcaaa 120 tatctatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa 180 gaatatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 240 tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgccgaag atcagttggg 300 tgcacgtgtg ggttacatcg aactggacct caacagcggt aagattcttg agagttttcg 360 ccccgaagaa cgtttcccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctctgtg gcgcggtatt 420 atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga 480 cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gacggcatga cagtacgcga 540 attatgcagc gctgccataa ccatgagtga taacacggcg gccaacttac ttctgacaac 600 gatcggagga ccgaaggagc ttaccgcttt tttgcacaac atgggtgatc atgtaactcg 660 ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac 720 gatgcctgta gctatggcaa caacgttgcg caaactctta actggcgaac ttcttactct 780 cgcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 840 gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 900 gtcccgcggt attattgcag ccctggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 960 ctacacgacg gggagccagg caactatgga cgaacgtaat cgccagatcg ctgagatagg 1020 tgcctccctg attaagcatt ggtaataacc aggcat 1056 <210> 55 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 55 gatttccgtg gcgcagaaaa aagcaaatgg cacatctgtt tgggtataat cgcgcccatg 60 ctttttcgcc atgattgcag tccagttacg 90 <210> 56 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 56 gggtgaaatc aatcttccat tcgcctttta atgagttcag gtttttcagg cgcaggctga 60 gaattatgcc tggttattac caatgcttaa 90 <210> 57 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic plasmid <400> 57 gatcatttca cgaatttttg cggatacatc acctacatat acccctgcac gtacctccaa 60 caaccagatg gctaatctgc ctcgtaagcg cggaggtaca ttttcagtga ccacgaccaa 120 catactcatt tcctgacgga tggccttttt gcgtttctac aaactctttt tgtttatttt 180 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 240 aatattgaaa aaggaagagt atgactgaat acaagcccac ggtacgcttg gcgacgcgcg 300 acgatgttcc ccgcgctgtt cgtacattag ctgcggcctt tgcagattac ccagcgacgc 360 gccatacggt cgatccggac cgccatatcg agcgtgtcac agaattgcag gaacttttct 420 taactcgcgt gggccttgac atcggaaagg tctgggtggc tgacgatggc gctgcagtgg 480 ctgtttggac cactccggag agtgtagagg ctggtgcagt gttcgccgaa attggtcctc 540 gtatggccga attaagtgga agtcgtctgg cagcccaaca acaaatggaa gggttgcttg 600 cgccccaccg tccgaaagaa cccgcgtggt tccttgccac cgttggagta agcccagatc 660 accaggggaa gggtttagga tctgccgtag ttttaccagg tgtggaggca gcagaacgtg 720 cgggagttcc ggccttcctt gagacgtcgg cgccgcgcaa tttaccgttt tacgaacgtc 780 ttggattcac cgttacggcg gacgtggagg tgccggaggg accccgtact tggtgtatga 840 ctcgtaaacc gggagcctga taatttatta cacctcaatc acagtggagc caaagatagc 900 aagccacatc ccatcgattt agctggccca ataccttgct gtacaagatc tattaacgct 960 ggcgcgtcgt tgatggtgag cacaccttca aagcaaaccg 1000 <210> 58 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic plasmid <400> 58 gcggtttatc cccgctggcg cggggaactc tctaaaagta tacatttgtt cttaaagcat 60 tttttcccat aaaaacaacc caccaacctt aatgtaacat ttccttatta ttaaagatca 120 gctaattctt tgttttcctg acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt 180 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 240 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgac tgaatacaag cccacggtac gcttggcgac 300 gcgcgacgat gttccccgcg ctgttcgtac attagctgcg gcctttgcag attacccagc 360 gacgcgccat acggtcgatc cggaccgcca tatcgagcgt gtcacagaat tgcaggaact 420 tttcttaact cgcgtgggcc ttgacatcgg aaaggtctgg gtggctgacg atggcgctgc 480 agtggctgtt tggaccactc cggagagtgt agaggctggt gcagtgttcg ccgaaattgg 540 tcctcgtatg gccgaattaa gtggaagtcg tctggcagcc caacaacaaa tggaagggtt 600 gcttgcgccc caccgtccga aagaacccgc gtggttcctt gccaccgttg gagtaagccc 660 agatcaccag gggaagggtt taggatctgc cgtagtttta ccaggtgtgg aggcagcaga 720 acgtgcggga gttccggcct tccttgagac gtcggcgccg cgcaatttac cgttttacga 780 acgtcttgga ttcaccgtta cggcggacgt ggaggtgccg gagggacccc gtacttggtg 840 tatgactcgt aaaccgggag cctgataatt cagctactcc gatggcctgc atctcccagt 900 gaaacaggaa gcggaatggc aacaggctgt gcatcttcag gtggggccgg cggttgtatt 960 tctccagcgg caagcacgtc ctctataagc ggaatcaatt 1000 <210> 59 <211> 1496 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic plasmid <400> 59 tatgagcagc atcgaaaaat agcccgctga tatcatcgat aatactaaaa aaacagggag 60 gctattacca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 120 atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctctac tagagtcaca ctggctcacc ttcgggtggg 180 cctttctgcg tttatatctt tctgacacct tactatctta caaatgtaac aaaaaagtta 240 tttttctgta attcgagcat gtcatgttac cccgcgagca taaaacgcgt gtgtaggagg 300 ataatctatg gatttgtcac agctaacacc acgtcgtccc tatctgctgc gtgcattcta 360 tgagtggttg ctggataacc agctcacgcc gcacctggtg gtggatgtga cgctccctgg 420 cgtgcaggtt cctatggaat atgcgcgtga cgggcaaatc gtactcaaca ttgcgccgcg 480 tgctgtcggc aatctggaac tggcgaatga tgaggtgcgc tttaacgcgc gctttggtgg 540 cattccgcgt caggtttctg tgccgctggc tgccgtgctg gctatctacg cccgtgaaaa 600 tggcgcaggc acgatgtttg agcctgaagc tgcctacgat gaagatacca gcatcatgaa 660 tgatgaagag gcatcggcag acaacgaaac cgttatgtcg gttattgatg gcgacaagcc 720 agatcacgat gatgacactc atcctgacga tgaacctccg cagccaccac gcggtggtcg 780 accggcatta cgcgttgtga agtaatcgac ctagcataac cccgcggggc ctcttcgggg 840 gtctcgcggg gttttttgct gaaagaagct tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga 900 ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc gctgcggccg ggtcaggtat gatttaaatg 960 gtcagtaacg ggtcttgagg ggttttttgc cacagctaac accacgtcgt ccctatctgc 1020 tgccctaggt ctatgagtgg ttgctggata acgtgcgtaa ttgtgctgat ctcttatata 1080 gctgctctca ttatctctct accctgaagt gactctctca cctgtaaaaa taatatctca 1140 caggcttaat agtttcttaa tacaaagcct gtaaaacgtc aggataactt ctatattcag 1200 ggagaccaca acggtttccc tctacaaata attttgttta acttttgaag gagaacaaat 1260 gaatttgctt attgataact ggatccctgt acgcccgcga aacgggggga aagtccaaat 1320 cataaatctg caatcgctat actgcagtag agatcagtgg cgattaagtt tgccccgtga 1380 cgatatggaa ctggccgctt tagcactgct ggtttgcatt gggcaaatta tcgccccggc 1440 aaaagatgac gttgaatttc gacatcgcat aatgaatccg ctcactgaag atgagt 1496 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 gggagaccac aacgg 15 <210> 61 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 cgcagtcgaa cgaccg 16

Claims

유전자 변형된 미생물로서,
내인성 cas3 뉴클레아제가 결손되거나 또는 돌연변이되고;
캐스케이드 오페론이 오페론의 조건부 과다발현을 허용하는 프로모터에 작동가능하게 연결되고; 및
하나 이상의 CRISPR/캐스케이드 gRNA가 조건에 따라 발현될 수 있는 가이드 어레이를 포함하며, 가이드 어레이의 발현으로 하나 이상의 유전자의 발현이 감소되며,
상기 유전자 변형된 미생물은, 내인성 cas3 뉴클레아제 결손 또는 돌연변이 또는 캐스케이드 오페론의 조건부 발현이 결핍된 유전자 변형된 미생물과 비교해, 가이드 어레이의 안정성 증가를 특징으로 하는, 유전자 변형된 미생물.
제1항에 있어서,
내인성 cas1 유전자가 결손되거나 또는 돌연변이된, 유전자 변형된 미생물.
제1항에 있어서,
상기 캐스케이드 오페론이 엄격하게 억제되는 유도성 프로모터의 통제 하에 과다 발현되는, 유전자 변형된 미생물.
제3항에 있어서,
상기 엄격하게 억제되는 유도성 프로모터가 활성화된 PhoB인, 유전자 변형된 미생물.
제1항에 있어서,
상기 유전자 변형된 미생물이 E. coli 미생물인, 유전자 변형된 미생물.
제1항에 있어서,
발현이 감소되는 유전자가 fabI, gltA1, gltA2, udhA 및 zwf로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 변형된 미생물.
유전자 변형된 미생물에서 유전자를 조건부 침묵화하는 방법으로서,
유전자 변형된 미생물을 제공하는 단계;
상기 유전자 조작된 미생물을 조건 하에 배양하는 단계로서, CRISPR/캐스케이드 gRNA의 발현으로 유전자 변형된 미생물의 하나 이상의 유전자의 발현 감소가 달성되는 단계를 포함하고,
상기 유전자 변형된 미생물이
내인성 cas3 뉴클레아제의 결손 또는 돌연변이;
캐스케이드 오페론; 및
하나 이상의 CRISPR/캐스케이드 gRNA를 포함하는 하나 이상의 가이드 어레이를 특징으로 하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 유전자 변형된 미생물이 내인성 cas1 유전자의 결손 또는 돌연변이를 추가로 포함하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 유전자 변형된 미생물은 상기 캐스케이드 오페론이 유도성 프로모터로서 활성화된 PhoB의 통제 하에 배치된 것을 추가로 특징으로 하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 유전자 변형된 미생물이 E. coli 미생물인, 방법.
제7항에 있어서,
발현이 감소되는 유전자가 fabI, gltA1, gltA2, udhA 및 zwf로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.