KR20130132416A - 열안정성 트리코데르마 셀룰라아제 - Google Patents

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KR20130132416A
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cellulase
thermostable
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KR1020137009740A
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안드레이 미아스니코프
마이클 쉘
마이클 워드
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다니스코 유에스 인크.
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Abstract

열안정성 진륜류 셀룰라아제 효소, EGV, 및 EGV 발현을 방지하는, 이 셀룰로오스의 발현을 위한 뉴클레오티드(들)의 파괴 또는 결실을 포함하거나 또는 상기 파괴 또는 결실로 본질적으로 이루어진 변형을 갖는 트리코데르마(Trichoderma) 숙주 세포에 관련된 조성물 및 방법이 개시된다.

Description

열안정성 트리코데르마 셀룰라아제 {THERMOSTABLE TRICHODERMA CELLULASE}
참고로 포함시킴
본 출원은 2010년 10월 20일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/394,946호 및 2010년 10월 20일자로 출원된 유럽 특허 출원 제10188285.0호에 대한 우선권을 주장한다.
전술한 출원, 및 그 안에 인용된 또는 그의 처리 중에 인용된 모든 문서("출원 인용된 문서") 및 출원 인용된 문서에서 인용되거나 또는 참고된 모든 문서와, 본 명세서에서 인용되거나 또는 참고된 모든 문서("본 명세서에서 인용된 문서"), 및 본 명세서에서 인용된 문서에서 인용되거나 또는 참고된 모든 문서는 본 명세서에서 또는 본 명세서에 참고로 포함된 임의의 문서에서 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조업자의 사용 설명서, 설명서, 제품 사양 및 제품 시트와 함께, 본 명세서에 참고로 포함되며, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.
본 발명은 열안정성 진균류 셀룰라아제 효소, 예를 들어 엔도글루카나아제 V(endoglucanase V; EGV)의 발현을 방지하거나 또는 감소시키는 파괴 또는 결실을 포함하거나 또는 상기 파괴 또는 결실로 본질적으로 이루어진 변형을 갖는 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이, 예를 들어 EGV의 발현에 연루된 뉴클레오티드의 하나 이상의 결실 또는 파괴, 예를 들어, 이 셀룰라아제를 코딩하는 유전자 또는 이 셀룰라아제의 코딩 영역 또는 이 셀룰라아제의 발현을 위한 프로모터 또는 조절 요소의 파괴 또는 결실을 포함하거나 또는 상기 결실 또는 파괴로 본질적으로 이루어진 변형을 갖는 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이에 관한 것이다. 그러한 숙주 세포는 원하지 않는 셀룰라아제 활성이 없는 열안정성 폴리펩티드를 발현하는 데 특히 유용하다. 유리하게는 본 발명은 관심대상의 단백질을 코딩하는 외인성 핵산 분자, 예를 들어 하이드로포빈(hydrophobin), 예를 들어 하이드로포빈 II를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 발현시키는, 그리고 EGV의 발현에 연루된 뉴클레오티드(들)의 하나 이상의 결실 또는 파괴를 포함하거나 또는 상기 결실 또는 파괴로 본질적으로 이루어진 변형을 갖는 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이에 관한 것으로서, 이에 의해 EGV 발현이 방지되거나 또는 감소되면서 관심대상의 단백질, 예를 들어 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II가 발현된다. 예를 들어, 트리코데르마 변형은 본질적으로 egl5의 결실 또는 파괴로 이루어질 수 있다.
셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스는 광합성에 의해 생성되는 가장 풍부한 식물 물질이다. 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스는 중합체성 기질을 단량체성 당으로 가수분해시킬 수 있는 세포외 효소를 생성하는 다수의 미생물 (예를 들어, 세균, 효모 및 진균류)에 의해 분해되어 에너지 공급원으로 사용될 수 있다 (문헌[Aro et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:24309-14]).
셀룰라아제는 셀룰로오스 (β-1,4-글루칸 또는 β-D-글루코시딕 결합)를 가수분해시켜 글루코스, 셀로바이오스, 셀로올리고당류 등을 형성하는 효소이다. 셀룰라아제는 전통적으로 하기 3가지의 주요 부류, 즉 엔도글루카나아제(EC 3.2.1.4)("EG"), 엑소글루카나아제 또는 셀로바이오하이드롤라아제(EC 3.2.1.91; "CBH") 및 β-글루코시다아제(β-D-글루코시드 글루코하이드롤라아제; EC 3.2.1.21; "BG")로 분류되었다 (문헌[Knowles et al. (1987) TIBTECH 5:255-61]; 및 문헌[Schulein (1988) Methods Enzymol. 160:234-43]). 엔도글루카나아제는 주로 비결정성 부분의 셀룰로오스 섬유에 작용하여 저 결정도 영역에서 내부 β-1,4-글루코시딕 결합을 가수분해시킨다. 셀로바이오하이드롤라아제류는 셀룰로오스의 환원 또는 비환원 말단으로부터 셀로바이오스를 가수분해시키며, 결정성 셀룰로오스를 분해시킬 수 있다 (문헌[Nevalainen and Penttila (1995) Mycota 303-319]). 셀룰라아제 시스템에서의 셀로바이오하이드롤라아제(CBH)의 존재는 결정성 셀룰로오스의 효율적인 가용화에 요구되는 것으로 믿어진다 (문헌[Suurnakki et al. (2000) Cellulose 7:189-209]). β-글루코시다아제는 셀로바이오스, 셀로올리고당류 및 다른 글루코시드로부터 D-글루코스 단위를 유리시키는 작용을 한다 (문헌[Freer (1993) J. Biol. Chem. 268:9337-42]). β-글루코시다아제는 또한 알킬 및/또는 아릴 베타-D-글루코시드, 예를 들어 메티 β-D-글루코시드 및 p-니트로페닐 글루코시드와, 단지 탄수화물 잔기를 함유하는 글리코시드, 예를 들어 셀로바이오스의 가수분해를 촉매하는 것으로 밝혀졌다.
셀룰라아제는 다수의 세균, 효모 및 진균류에 의해 생성되는 것으로 공지되어 있다. 소정의 진균류는 엑소-셀로바이오하이드롤라아제류 또는 CBH계 셀룰라아제, 엔도글루카나아제 또는 EG계 셀룰라아제 및 β-글루코시다아제 또는 BG계 셀룰라아제를 포함하는 전 셀룰라아제 시스템을 생성한다. 다른 진균류 및 세균은 CBH계 셀룰라아제를 거의 발현하지 않거나 또는 전혀 발현하지 않는다. 트리코데르마 레에세이(하이포크레아 제코리나(Hypocrea jecorina)로도 칭해짐)는 다수의 셀룰라아제를 발현하는데, 이는 2가지의 CBH, 즉 CBHI(Cel7a) 및 CBHII(Cel6a), 적어도 8가지의 EG, 즉 EGI(Cel7b), EGII(Cel5a), EGIII(Cel12a), EGIV(Cel61a), EGV(Cel45a), EGVI(Cel74a), EGVII(Cel61b), 및 EGVIII(Cel5b)과, 적어도 5가지의 BG, 즉 BG1(Cel3a), BG2(Cel1a), BG3(Cel3b), BG4(Cel3c) 및 BG5(Cel1b)를 포함한다. EGIV, EGVI, 및 EGVIII은 또한 자일로글루카나아제 활성을 갖는다.
일부의 경우에, 예를 들어 바이오매스(biomass) 전환, 직물 가공, 종이 및 펄프 처리 등을 위하여, 셀룰로오스의 공급원으로서 티. 레에세이로부터 수득되는 전 셀룰라아제 브로쓰(broth)를 사용하는 것이 바람직하다. 다른 경우에, 티. 레에세이는 엔지니어링된(engineered) 셀룰라아제, 다른 유기체 유래의 셀룰라아제, 또는 전적으로 상이한 효소 또는 다른 단백질 (예를 들어, 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 구조 단백질 등)의 발현을 위한 탁월한 숙주 유기체로서의 역할을 한다. 특히 이러한 후자의 경우에, 내인성 티. 레에세이 셀룰라아제의 부재 하에 관심대상의 단백질을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 내인성 티. 레에세이 셀룰라아제 유전자의 결실에 의해 성취될 수 있지만, 다수의 이들 유전자는 그러한 접근법이 시간이 많이 걸리게 하고 노동 집약적으로 되게 한다.
본 출원에서의 임의의 문서의 인용 또는 확인은 그러한 문서를 종래 기술로서 본 발명에서 이용가능함을 인정하는 것은 아니다.
본 발명은 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이에서 발견되는 열안정성 셀룰라아제 효소에 관련된 방법 및 조성물, 예를 들어 관심대상의 단백질, 예를 들어 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II를 발현하도록 엔지니어링된 그러한 세포를 포함하는 변형 세포를 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 열안정성 EGV 폴리펩티드의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하는 변형을 포함하거나 또는 상기 변형으로 본질적으로 이루어진 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이를 제공한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 열안정성 EGV 폴리펩티드의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하는 변형을 포함하거나 또는 상기 변형으로 본질적으로 이루어진 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이를 제공하며, 여기서 상기 변형은 EGV의 발현에 연루된 뉴클레오티드(들)의 하나 이상의 결실 또는 파괴, 예를 들어 이 셀룰라아제를 코딩하는 유전자 또는 이 셀룰라아제의 코딩 영역 또는 이 셀룰라아제의 발현을 위한 프로모터 또는 조절 요소의 파괴 또는 결실로 본질적으로 이루어진다.
실시 형태들 중 하나에서, 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 열안정성 EGV 폴리펩티드의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하는 변형을 포함하거나 또는 상기 변형으로 본질적으로 이루어지며, 여기서 상기 변형은 egl5의 결실 또는 파괴를 포함하거나 또는 상기 결실 또는 파괴로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 파괴된 egl5를 포함하거나 또는 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 결실된 egl5를 포함하거나 또는 본질적으로 이로 이루어진다.
특정 실시 형태에서, egl5는 상동 재조합에 의해 결실된다. 이것은 또한 상동 재조합에 의해 파괴될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 기능성 egl5를 포함하는 모(parental) 숙주 세포를 변형시킴으로써 생성된다.
일부 실시 형태에서, 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 열불안정성 효소가 발현되게 하는, 열불안정성 효소를 코딩하는 하나 이상의 내인성 기능성 유전자 또는 핵산 분자를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지며; 예를 들어, 열불안정성 효소는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 또는 프로테아제, 또는 이들 효소 중 임의의 2가지의 또는 모든 3가지의 효소일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 엑소-셀로바이오하이드롤라아제, 엔도글루카나아제, 또는 β-글루코시다아제, 또는 이들 단백질 중 임의의 2가지의 또는 모든 3가지의 단백질일 수 있는 하나 이상의 추가의 단백질을 발현할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 관심대상의 단백질을 코딩하여 이의 발현을 허용하는 뉴클레오티드 또는 관심대상의 기능성 유전자를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 관심대상의 유전자는 열안정성 폴리펩티드; 예를 들어 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II를 코딩하거나 또는 관심대상의 단백질은 열안정성 폴리펩티드; 예를 들어 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II이다.
다른 태양에서, 본 발명은 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이에서 관심대상의 열안정성 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 이는 관심대상의 열안정성 단백질을 코딩하는 핵산 분자를, 관심대상의 단백질을 생체 내에서 발현시키는 조건 하에 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이 내로 도입하는 단계를 포함하고, 예를 들어, 여기서 관심대상의 핵산 분자는 발현을 위하여 프로모터 또는 조절 요소에 작동가능하게 연결되며; 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 열안정성 EGV 폴리펩티드의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하는 변형을 포함하거나 또는 상기 변형으로 본질적으로 이루어지고, 여기서 상기 변형은 EGV의 발현에 연루된 뉴클레오티드(들)의 하나 이상의 결실 또는 파괴, 예를 들어 이 셀룰라아제를 코딩하는 유전자 또는 이 셀룰라아제의 코딩 영역 또는 이 셀룰라아제의 발현을 위한 프로모터 또는 조절 요소의 파괴 또는 결실로 본질적으로 이루어지며; 예를 들어, 상기 변형은 egl5의 결실 또는 파괴를 포함하거나 또는 상기 결실 또는 파괴로 본질적으로 이루어진다. 관심대상의 열안정성 단백질은 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II일 수 있다. 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 하나 이상의 추가의 기능성 단백질(들)을 생체 내에서 발현시키는 조건 하에 추가의 기능성 단백질(들)을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들), 또는 추가의 기능성 단백질(들)을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(들)를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 여기서 상기 하나 이상의 핵산 분자(들)는 발현을 위하여 프로모터(들) 및/또는 조절 요소(들)에 작동가능하게 연결된다. 본 방법은 관심대상의 단백질을 포함하는 세포의 발현 생성물과 발현 생성물 중의 임의의 발현된 추가의 기능성 단백질(들)에 상기 추가의 단백질을 사실상 불활성화시키기에 충분한 승온을 가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며; 여기서 상기 승온은 관심대상의 열안정성 단백질을 불활성화시키기에는 불충분하며 EGV 셀룰라아제를 불활성화시키기에 불충분할 것이고; 관심대상의 열안정성 단백질은 사실상 상기 추가의 단백질로부터의 활성의 부재 하에 활성 또는 기능성 형태로 생성된다.
다른 태양에서, 본 발명은 관심대상의 열안정성 단백질, 예를 들어 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II의 제조 방법을 제공하며, 이는 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이로부터 수득된 발현 생성물에 승온을 가하는 단계를 포함하고, 여기서 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 열안정성 EGV 폴리펩티드의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하는 변형을 포함하거나 또는 상기 변형으로 본질적으로 이루어지고, 여기서 상기 변형은 EGV의 발현에 연루된 뉴클레오티드(들)의 하나 이상의 결실 또는 파괴, 예를 들어 이 셀룰라아제를 코딩하는 유전자 또는 이 셀룰라아제의 코딩 영역 또는 이 셀룰라아제의 발현을 위한 프로모터 또는 조절 요소의 파괴 또는 결실로 본질적으로 이루어지며; 예를 들어, 상기 변형은 egl5의 결실 또는 파괴를 포함하거나 또는 상기 결실 또는 파괴로 본질적으로 이루어지고; 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이는 하나 이상의 추가의 기능성 단백질(들)을 생체 내에서 발현시키는 조건 하에 추가의 기능성 단백질(들)을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들), 또는 추가의 기능성 단백질(들)을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(들)를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 여기서 상기 하나 이상의 핵산 분자(들)는 발현을 위하여 프로모터(들) 및/또는 조절 요소(들)에 작동가능하게 연결되며; 상기 승온은, 존재할 경우, 상기 하나 이상의 추가의 기능성 단백질을 불활성화시키기에 충분하지만 관심대상의 열안정성 단백질 또는 EGV를 불활성화시키기에는 불충분하고; 이럼으로써 관심대상의 열안정성 단백질을 상기 추가의 기능성 단백질로부터의 활성의 부재 하에 활성 또는 기능성 형태로 생성하게 된다.
전술한 방법들은 관심대상의 단백질 및 존재할 경우 추가의 기능성 단백질(들)을 생성하기에 적합한 배지에서 숙주 세포인 변형 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
전술한 방법들은 또한 관심대상의 단백질 및 존재할 경우 추가의 기능성 단백질(들)에 승온을 가하는 단계 이전에 숙주 세포인 변형 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이로부터 발현 생성물 (또는 단백질 혼합물)을 단리하는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 본 방법의 경우, 일부 실시 형태에서, egl5는 숙주 세포에서 파괴되는데, 상기 숙주 세포는 달리 egl5를 자연적으로 포함할 것이다.
임의의 본 방법의 경우, 일부 실시 형태에서, egl5는 숙주 세포에서 결실되는데, 상기 숙주 세포는 달리 egl5를 자연적으로 포함한다.
따라서, 임의의 본 방법의 경우, 일부 실시 형태에서, 파괴되거나 또는 결실된 egl5는 내인성이다.
따라서, 본 방법은 열안정성 EGV 폴리펩티드의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하기 위하여 egl5를 결실시키거나 또는 파괴하는 단계 또는 달리 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이를 변형시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 변형은 EGV의 발현에 연루된 뉴클레오티드(들)의 하나 이상의 결실 또는 파괴, 예를 들어 이 셀룰라아제를 코딩하는 유전자 또는 이 셀룰라아제의 코딩 영역 또는 이 셀룰라아제의 발현을 위한 프로모터 또는 조절 요소의 파괴 또는 결실로 본질적으로 이루어진다.
임의의 본 방법의 경우, 일부 실시 형태에서, egl5는 상동 재조합에 의해 결실된다. 이것은 또한 상동 재조합에 의해 파괴될 수 있다.
임의의 본 방법의 경우, 일부 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 추가의 단백질은 열불안정성 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 추가의 단백질은 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 또는 프로테아제, 또는 이들 효소 중 임의의 2가지의 또는 모든 3가지의 효소일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 추가의 단백질은 엑소-셀로바이오하이드롤라아제, 엔도글루카나아제 또는 β-글루코시다아제, 또는 이들 단백질 중 임의의 2가지의 또는 모든 3가지의 단백질일 수 있다.
임의의 본 방법의 경우, 일부 실시 형태에서, 관심대상의 단백질은 가역적으로 열변성가능하기 때문에 안정성이다.
임의의 본 방법의 경우, 특정 실시 형태에서, 관심대상의 단백질은 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II이다.
임의의 본 방법의 경우, 일부 실시 형태에서, 승온은 90℃ 이상의 온도이다. 유리한 실시 형태에서, 승온은 약 100℃ 미만일 수 있다.
임의의 본 방법의 경우, 일부 실시 형태에서, 승온에의 노출은 5분 이상의 시간 동안이다.
임의의 본 방법의 경우, 일부 실시 형태에서, 승온에의 노출은 60분 이상의 시간 동안이다.
다른 추가의 태양에서, 이들 방법 중 임의의 방법에 의해 생성된 열안정성 또는 가역적 열변성가능 단백질이 제공된다.
관련 태양에서, 본 발명은 사상균 숙주 세포, 예를 들어 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이로부터 수득된, 그리고 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II를 포함하는 발효 브로쓰 조성물을 제공하며, 여기서 발효 브로쓰에는 셀룰라아제 및/또는 만난아제 활성이 사실상 없다. 예를 들어, 셀룰라아제 및/또는 만난아제 활성이 사실상 없는 발효 브로쓰는 전술한 방법들 중 임의의 방법으로부터 수득되거나 또는 수득가능하다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II는 열불안정성 셀룰라아제 및/또는 만난아제의 존재 하에 생성되며, 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 불활성화시키기 위하여 승온이 가해진다.
일부 실시 형태에서, 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II는 셀룰라아제 및/또는 만난아제의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하는 변형을 포함하거나 또는 상기 변형으로 본질적으로 이루어진 숙주 세포, 예를 들어 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이에서 생성되며, 여기서 상기 변형은 셀룰라아제 및/또는 만난아제의 발현에 연루된 뉴클레오티드(들)의 하나 이상의 결실 또는 파괴, 예를 들어 셀룰라아제 및/또는 만난아제를 코딩하는 유전자 또는 셀룰라아제 및/또는 만난아제의 코딩 영역 또는 셀룰라아제 및/또는 만난아제의 발현을 위한 프로모터 또는 조절 요소의 파괴 또는 결실로 본질적으로 이루어지며, 이에 의해 하이드로포빈을 생성하는(그리고 함유하는) 것으로부터의 발효 브로쓰에는 셀룰라아제 및/또는 만난아제 활성이 사실상 없게 된다.
일부 실시 형태에서, 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II는 숙주 세포에 셀룰라아제 및/또는 만난아제를 코딩하는 유전자(들) 또는 핵산 분자(들)가 결여된 변형을 포함하거나 또는 상기 변형으로 본질적으로 이루어진 숙주 세포, 예를 들어 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이에서 생성되며, 이에 의해 하이드로포빈을 생성하는(그리고 함유하는) 것으로부터의 발효 브로쓰에는 셀룰라아제 및/또는 만난아제 활성이 사실상 없게 된다.
발효 브로쓰에 대한 실시 형태에서, 발효 브로쓰는 농축될 수 있으며, 셀룰라아제 및/또는 만난아제 이외의 많은 숙주 세포 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 관심대상의 폴리펩티드는 열안정성, 열민감성 또는 열불안정성일 수 있다.
또한 본 발명의 방법은 본 발명의 변형 트리코데르마 숙주 세포에 의해 발현되는 관심대상의 폴리펩티드의 활성의 제어에 관련되며, 여기서 관심대상의 폴리펩티드는 열민감성 또는 열불안정성이고, 상기 방법은 관심대상의 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드 및 내인성 폴리펩티드에 승온을 가하는 단계를 포함할 수 있으며, 승온은 내인성 폴리펩티드 및 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드를 불활성화시키기에 충분할 수 있다. 유리한 실시 형태에서, 내인성 폴리펩티드는 셀룰로오스일 수 있다. 본 방법은 관심대상의 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드에 승온을 가하기 이전에 관심대상의 폴리펩티드를 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 관심대상의 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드에 승온을 가하기 이전에 관심대상의 폴리펩티드를 셀룰로오스 및 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 하나 이상의 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 방법은 본 발명의 발효 브로쓰 중 관심대상의 폴리펩티드의 활성의 제어 방법에 관련되며, 여기서 관심대상의 폴리펩티드는 열민감성 또는 열불안정성일 수 있고, 본 방법은 발효 브로쓰에 내인성 폴리펩티드 및 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드를 불활성화시키기에 충분한 승온을 가하는 단계를 포함할 수 있다. 유리한 실시 형태에서, 내인성 폴리펩티드는 셀룰로오스일 수 있다. 본 방법은 발효 브로쓰에 승온을 가하기 이전에 발효 브로쓰를 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 관심대상의 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 발효 브로쓰에 승온을 가하기 이전에 발효 브로쓰를 셀룰라아제 및 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 하나 이상의 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 변형 트리코데르마 숙주 세포로부터 수득되는 조성물에 존재하는 셀룰라아제의 활성을 제어하는 방법에 관한 것이며, 여기서 조성물은 EGV 이외의 적어도 하나의 셀룰라아제 효소를 포함할 수 있으며, 상기 방법은 관심대상의 폴리펩티드를 불활성화시키기에 충분한 승온을 조성물에 가하는 단계를 포함할 수 있고, 조성물에 승온을 가한 후 조성물에는 셀룰라아제 활성이 사실상 없다. 관심대상의 폴리펩티드는 열민감성이거나 또는 열불안정성일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 폴리펩티드는 내열성 또는 열안정성일 수 있다. 조성물에 승온을 가하는 것은 식료품 또는 음료에서 수행될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 승온은 약 100℃ 미만일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 변형 트리코데르마 숙주 세포로부터 수득된 조성물은 하이드로포빈-함유 발효 브로쓰일 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, 본 출원인이 권리를 유보하도록 본 발명 내에 임의의 이전에 공지된 생성물, 그 생성물의 제조 방법, 또는 그 생성물의 사용 방법을 포함시키는 것을 하지 않고 이로써 임의의 이전에 공지된 생성물, 공정 또는 방법에 대한 권리 포기를 밝히고자 하는 것이다. 본 발명은, 본 출원인이 권리를 유보하도록 본 발명의 범주 내에 USPTO (35 USC § 112, 제1 단락) 또는 EPO (EPC의 제83조)의, 서면으로 된 기재 및 구현가능성 요건을 충족시키지 않는 임의의 생성물, 그 생성물의 제조 방법, 또는 그 생성물의 사용 방법을 포함시키고자 하는 것이 아니며 이로써 임의의 이전에 기재된 생성물, 그 생성물의 제조 방법, 또는 그 생성물의 사용 방법에 대한 권리 포기를 밝히고자 하는 것임이 추가로 주목된다.
본 명세서에서, 그리고 특히 특허청구범위 및/또는 단락들에서, "포함하다", "포함하였다", "포함하고 있는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 기인한 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어 상기 용어들은 "함유하다", "함유하였다", "함유하고 있는" 등을 의미할 수 있고; "본질적으로 이루어진" 및 "본질적으로 이루어지다"와 같은 용어는 미국 특허법에서 이들에 기인한 의미를 가지며, 예를 들어 상기 용어들은 명백하게 기술되지 않은 요소들은 고려하지만 종래 기술에서 발견되거나 또는 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 주는 요소들은 배제함이 주목된다.
"본질적으로 이루어지다" 및 "본질적으로 이루어진"이라는 용어는 특히 특허청구범위가 단독으로 또는 임의의 조합으로 종래 기술에 의해 개시되거나 또는 제안된 실시 형태들에 대하여 해석되지 않도록 하기 위한 것이며, 그 이유는 EGV의 발현에 연루된 뉴클레오티드의 결실 또는 파괴, 예를 들어 이 셀룰로오스를 코딩하는 유전자 또는 이 셀룰로오스의 코딩 영역의 파괴 또는 결실, 예를 들어 egl5에 대한 결실 또는 파괴가 열안정성 외인성 폴리펩티드, 예를 들어 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II의 발현 및/또는 수득을 돕는다는 것이 예기치 않게 발견되었기 때문이다.
이들 실시 형태 및 다른 실시 형태는 첨부된 도면을 비롯하여 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 의해 개시되거나 또는 이로부터 자명해지며 이에 포함된다.
예로서 주어진 것으로서 본 발명을 단지 기재된 특정 실시 형태에 한정하고자 하는 것이 아닌 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
<도 1>
도 1은 pFl(EG5RPyr)의 플라스미드 지도이다.
<도 2>
도 2는 egl5의 파괴 후의 티. 레에세이 염색체의 일부분의 지도이다.
<도 3>
도 3은 열처리를 한, 그리고 열처리를 하지 않은, 대조군 및 egl5-결실 티. 레에세이 배양물의 상청액에 존재하는 셀룰라아제 활성의 양을 나타내는 그래프이다.
<도 4>
도 4는 글루코스 표준 곡선을 나타내는 그래프이다.
<도 5>
도 5는 대조 주(strain)와 비교하여 ΔEG5 주 유래의 상청액 중 열안정성 셀룰라아제 활성의 손실을 나타내는 그래프이다.
<도 6>
도 6은 egl5의 파괴 및 pyr2 마커의 절제 후 티. 레에세이 염색체의 일부분의 지도이다.
<도 7>
도 7은 헥소키나아제 프로모터와 융합된 sucA 유전자의 단편을 지닌 3.5 kb DNA 단편의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1)이다.
<도 8>
도 8은 pUC19 유래의 암피실린 내성 유전자 및 복제 기점과, 박테리오파지 f1 복제 기점을 포함하는 작은 플라스미드인 pF1X,의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 2)이다.
<도 9>
도 9는 도 9a 및 도 9b로 이루어지며, egl5 및 pyr2 유전자의 공지된 염색체 DNA 서열을 바탕으로 한, 파괴된 유전자(즉, "파괴 카세트")의 추정 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 3)이다.
<도 10>
도 10은 egl5의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 32)이다.
<도 11>
도 11은 EGV의 아미노산 서열 (서열 번호 33)이다.
<도 12>
도 12는 벡터 pTrex3gM(Hfb2) 및 pTrex8R(Hfb2)의 기능적 및 부분적 제한효소 지도이다.
<도 13a>
도 13a는 pTrex3gM(Hfb2)의 뉴클레오티드 서열이다.
<도 13b>
도 13b는 pTrex8R(Hfb2)의 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 조성물 및 방법을 상세하게 기재하기 이전에, 하기 용어가 명확함을 위하여 정의된다. 정의되지 않은 용어는 관련 분야에서 사용되는 그의 일상적인 의미에 따라야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "셀룰라아제"는 β-1,4-글루칸 또는 β-D-글루코시딕 결합을 가수분해시켜 예를 들어 셀룰로오스로부터 글루코스, 셀로바이오스, 셀로올리고당류 등을 형성하는 효소이다. 셀룰라아제는 예를 들어 엔도글루카나아제, 엑소글루카나아제, β-글루코시다아제 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "엔도글루카나아제(EG)"는 셀룰로오스 섬유의 비결정성 부분에 주로 작용하여 저 결정도 영역에서 내부 β-1,4-글루코시딕 결합을 가수분해시키는 셀룰라아제이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "헤미셀룰라아제" 및 "자일라나아제"는 일반적으로 오탄당을 포함하는 다당류에서 글리코시딕 결합을 가수분해시킬 수 있는 효소를 말하기 위하여 상호교환가능하게 사용된다. 그러한 효소는 예를 들어 만난아제, 아라비난아제, 글루큐로니다아제, 아세틸자일란 에스테라아제, 아라비노푸라노시다아제, 자일로시다아제 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "트리코데르마 레에세이" (또는 티. 레에세이)는 자낭균문(phylum Ascomycota)의 사상균을 말한다. 이 유기체는 이전에 하이포크레아 제코리나로 공지되어 있었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "티. 레에세이 EGV 셀룰라아제"는 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 관련 폴리펩티드를 말한다. 관련 폴리펩티드는 서열 번호 33의 서열과의 아미노산 서열 동일성이 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 심지어 적어도 약 99%이거나 또는 그보다 더 크며, 셀룰로오스 기질에 대하여 엔도글루카나아제 활성을 가지며, 본 명세서에 기재된 분석법을 이용하면 열안정성이다. "EGV"는 본 명세서에서 "EG5"로 칭해질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "티. 레에세이 egl5 유전자" 또는 "egl5"는 EGV 셀룰라아제 또는 관련 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 말하며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다. 예시적인 egl5의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 32로 나타낸다. EGV의 아미노산 서열은 서열 번호 33에 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드와 관련하여 용어 "열안정성"은 소정의 승온을 소정의 시간 동안 가한 후 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩티드의 능력을 말한다. 생물학적 활성은 폴리펩티드에 특징적인 효소 활성, 결합 활성, 표면 활성 특성, 또는 임의의 다른 활성 또는 특성일 수 있다. 폴리펩티드는 이것이 소정의 승온에 소정의 시간 동안 노출된 이후 그의 원래 활성의 적어도 절반을 유지할 경우 열안정성으로 간주된다. 대체로, 소정의 온도 및 시간은 EGV 이외의 티. 레에세이 셀룰라아제를 사실상 불활성화시키는 데 요구되는 것이다. 이들 조건은 egl5 결실을 포함하거나 또는 상기 결실로 본질적으로 이루어진 티. 레에세이 숙주 세포에서 셀룰라아제 활성에 대하여 분석함으로써 쉽게 확립될 수 있다.
일부의 경우에, 단백질은 약 70℃ 이상, 약 75℃ 이상, 약 80℃ 이상, 약 85℃ 이상, 약 90℃ 이상, 또는 심지어 약 95℃ 이상의 온도에, 약 3분 이상, 약 5분 이상, 약 10분 이상, 약 15분 이상, 약 20분 이상, 약 30분 이상, 약 45분 이상, 또는 심지어 약 60분 이상의 시간 동안 노출시킨 후 그의 생물학적 활성의 적어도 절반(즉, 적어도 50%)을 이것이 유지할 경우 열안정성인 것으로 간주된다. 일 실시예에서, 소정의 온도는 약 90℃ 이상이며, 소정의 시간은 약 5분 이상이다. 다른 실시예에서, 소정의 시간은 약 90℃ 이상이며, 소정의 시간은 약 60분 이상이다. 열안정성 폴리펩티드는, 그의 생물학적 활성의 적어도 절반(즉, 적어도 50%)이 기재된 바와 같이 노출 후에 복구되도록, 승온에서 가역적으로 변성되는 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드와 관련하여 용어 "가열-불안정성", "비-열안정성" 및 "열불안정성"은 소정의 승온을 소정의 시간 동안 가한 후 생물학적 활성을 유지하는 것에 대한 폴리펩티드의 무능력을 말하기 위하여 상호교환가능하게 사용된다. 생물학적 활성은 폴리펩티드에 특징적인 효소 활성, 결합 활성, 표면 활성 특성, 또는 임의의 다른 활성 또는 특성일 수 있다. 폴리펩티드는 소정의 승온에 소정의 시간 동안 노출된 후 이것이 그의 원래 활성의 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 심지어 본질적으로 100%를 상실할 경우 가열-불안정성으로 간주된다. 그러한 온도 및 시간은 바로 위에, 그리고 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용의 다른 곳에 기재되어 있다. 가열-불안정성 폴리펩티드의 수 또는 유형에 대한 제한은 두어지지 않는다. 예에는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 프로테아제, 리파아제, 아밀라아제, 에스테라아제, 퍼하이드롤라아제, 파이타아제, 락카아제, 및 다른 상업적으로 관련있는 효소, 결합 단백질 및 구조 단백질이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "관심대상의 단백질"은 티. 레에세이에서 발현시키기를 원하는, EGV 이외의 폴리펩티드를 말한다. 그러한 단백질은 효소, 결합 단백질, 표면 활성 단백질, 구조 단백질 등일 수 있다. 관심대상의 단백질은 열안정성 또는 열불안정성일 수 있다. 명시될 경우, 이것은 열안정성이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "활성이 사실상 없는" (또는 유사한 어구)은 명시된 활성이 폴리펩티드들의 혼합물에서 검출가능하지 않거나, 또는 상기 혼합물의 의도된 목적을 간섭하지 않는 양으로 존재함을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 연결되는 아미노산 잔기들을 포함하는 임의의 길이의 중합체를 말하기 위하여 상호교환가능하게 사용된다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 또는 3문자 암호가 본 명세서에서 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이것은 변형 아미노산을 포함할 수 있으며, 이것은 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 변형되었거나 또는 개재에 의해; 예를 들어 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들어 표지화 성분과의 콘쥬게이션(conjugation)에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)와, 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 상기 정의 내에 또한 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 단백질은 "관련 단백질"인 것으로 간주된다. 그러한 단백질은 상이한 속 및/또는 종의 유기체, 또는 심지어 상이한 강의 유기체 (예를 들어, 세균 및 진균류)로부터 유래될 수 있다. 또한 관련 단백질은 일차 서열 분석에 의해 결정되거나, 이차 또는 삼차 구조 분석에 의해 결정되거나, 또는 면역학적 교차 반응성에 의해 결정되는 동족체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유도체형 폴리펩티드/단백질"은 N- 및 C-말단 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두에의 하나 이상의 아미노산의 부가, 아미노산 서열 내의 하나의 또는 다수의 상이한 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환, 단백질의 어느 한 말단 또는 양 말단에서의 또는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실 및/또는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의해 단백질로부터 유도된 단백질을 말한다. 단백질 유도체의 제조는 천연 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 변형시키고, 상기 DNA 서열로 적합한 숙주를 형질전환시키고, 변형 DNA 서열을 발현시켜 유도체형 단백질을 형성함으로써 성취될 수 있다.
관련 단백질 (및 유도체형 단백질)은 "변이 단백질"을 포함한다. 변이 단백질은 소수의 아미노산 잔기에서 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 기준/모 단백질, 예를 들어 야생형 단백질과 상이해진다. 상이한 아미노산 잔기의 수는 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50개의 아미노산 잔기 또는 그보다 많은 아미노산 잔기일 수 있다. 변이 단백질은 기준 단백질과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 심지어 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성, 또는 그보다 큰 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 또한 변이 단백질은 선택된 모티프, 도메인, 에피토프, 보존 영역 등에서 기준 단백질과 상이할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유사 서열"은 관심대상의 단백질(즉, 전형적으로 관심대상의 원래 단백질)과 유사한 기능, 삼차 구조 및/또는 보존 잔기를 제공하는 단백질 내의 서열을 말한다. 예를 들어, 알파-나선 또는 베타-시트 구조를 함유하는 에피토프 영역에서, 유사 서열 내의 대체 아미노산은 바람직하게는 동일한 특정 구조를 유지한다. 상기 용어는 또한 아미노산 서열뿐만 아니라 뉴클레오티드 서열도 말한다. 일부 실시 형태에서, 유사 서열은 대체 아미노산이 유사한 기능 또는 개선된 기능을 나타내는 변이 효소를 생성하도록 개발된다. 일부 실시 형태에서, 관심대상의 단백질에 있어서 아미노산의 삼차 구조 및/또는 보존 잔기는 관심대상의 절편 또는 단편에 또는 그 근처에 위치한다. 따라서, 관심대상의 절편 또는 단편이 예를 들어 알파-나선 또는 베타-시트 구조를 함유할 경우, 대체 아미노산은 바람직하게는 그 특정 구조를 유지한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "상동 단백질"은 기준 단백질과 유사한 활성 및/또는 구조를 갖는 단백질을 말한다. 상동체는 반드시 진화론적으로 관련된 것으로 의도되는 것은 아니다. 따라서, 상기 용어는 상이한 유기체들로부터 수득되는 동일하거나, 유사하거나 또는 상응하는 효소(들)(즉, 구조 및 기능 면에서)를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시 형태에서, 기준 단백질과 유사한 사차, 삼차 및/또는 일차 구조를 갖는 상동체를 확인하는 것이 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 상동 단백질은 기준 단백질과 유사한 면역 반응(들)을 유도한다. 일부 실시 형태에서, 상동 단백질들은 원하는 활성(들)을 갖는 효소를 생성하도록 엔지니어링된다.
서열들 사이의 상동성의 정도는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443]; 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]; 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package; 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 문헌[Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res . 12:387-395] 참조).
예를 들어, PILEUP는 서열 상동성 수준을 결정하는 데 유용한 프로그램이다. PILEUP는 진행식 쌍별 정렬을 이용하여 관련 서열들의 군으로부터 다수의 서열 정렬을 생성한다. 또한 이것은 정렬 생성에 사용되는 클러스터링(clustering) 관계를 나타내는 트리(tree)를 플로팅할 수 있다. PILEUP는 펭(Feng) 및 두리틀(Dooittle)의 진행식 정렬법을 단순화시킨 것을 이용한다 (문헌Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360]). 상기 방법은 히긴스(Higgins) 및 샤프(Sharp)에 의해 기재된 것과 유사하다 (문헌[Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153]). 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 가중치, 0.10의 디폴트 갭 길이 가중치 및 가중 말단 갭을 포함한다. 유용한 알고리즘의 다른 예로는 BLAST 알고리즘이 있으며, 이는 알트슐(Altschul) 등의 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; 및 문헌[Karlin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787]에 기재되어 있다. 하나의 특히 유용한 BLAST 프로그램으로는 WU-BLAST-2 프로그램이 있다 (문헌[Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460-480] 참조). 파라미터 "W" "T" 및 "X"는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci . USA 89:10915] 참조) 정렬치(B), 10의 기대치(E), M'5, N'-4, 및 양 가닥의 비교를 이용한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 적어도 2가지의 핵산 또는 폴리펩티드의 맥락에서 "사실상 유사한" 및 "사실상 동일한"이라는 어구는 전형적으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 기준 서열(즉, 야생형 서열)과 비교하여 적어도 약 70%의 동일성, 적어도 약 75%의 동일성, 적어도 약 80%의 동일성, 적어도 약 85%의 동일성, 적어도 약 90%의 동일성, 적어도 약 91%의 동일성, 적어도 약 92%의 동일성, 적어도 약 93%의 동일성, 적어도 약 94%의 동일성, 적어도 약 95%의 동일성, 적어도 약 96%의 동일성, 적어도 약 97%의 동일성, 적어도 약 98%의 동일성, 또는 심지어 적어도 약 99%의 동일성, 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 서열 동일성은 표준 파라미터를 사용하여 BLAST, ALIGN, 및 CLUSTAL과 같은 공지된 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; 문헌[Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915]; 문헌[Karin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873]; 및 문헌[Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244] 참조). BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통하여 공개적으로 입수가능하다. 또한, 데이터베이스는 FASTA를 이용하여 검색될 수 있다 (문헌[Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448]). 두 폴리펩티드가 사실상 동일하다는 하나의 표시는 제1 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 면역적 교차 반응성을 갖는다는 것이다. 전형적으로, 보존적 아미노산 치환에 의해 상이해진 폴리펩티드들은 면역적 교차 반응성을 갖는다. 따라서, 소정 폴리펩티드는, 예를 들어 두 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이해질 경우, 제2 폴리펩티드와 사실상 동일하다. 두 핵산 서열이 사실상 동일하다는 다른 표시는, 상기 두 분자가 엄격한 조건 하에서 (예를 들어, 중간 엄격도 내지 높은 엄격도의 범위 내에서) 서로와 혼성화된다는 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "야생형" 및 "천연" 유전자 또는 단백질은 자연에서 발견되는 것이다. 용어 "야생형 서열" 및 "야생형 유전자/단백질"은 숙주 세포에 있어서 자연 발생되거나 또는 천연인 서열을 말하기 위하여 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자의 결실"은 숙주 세포의 게놈으로부터의 그의 제거를 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자의 파괴"는 대체적으로 숙주 세포에서 기능성 유전자 생성물, 예를 들어 단백질의 발현을 사실상 방지하는 임의의 유전자 조작 또는 화학적 조작을 말한다. 예시적인 파괴 방법에는 기능성 유전자 생성물의 발현을 사실상 방지하기 위하여 유전자 (폴리펩티드 코딩 서열, 프로모터, 인핸서 또는 다른 조절 요소를 포함함)의 임의의 부분의 전 결실 또는 부분 결실, 또는 이의 돌연변이 유발 (치환, 삽입, 결실 및 그 조합을 포함함)이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기능성 유전자"는 활성 유전자 생성물, 전형적으로 단백질을 생성하기 위하여 세포 성분에 의해 사용될 수 있는 유전자이다. "기능성" 유전자는 활성 유전자 생성물을 생성하도록 세포 성분에 의해 사용될 수 없도록 변형된 "파괴된" 유전자의 반대이다. 예시적인 기능성 유전자에는 EGV 이외의 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제, 퍼하이드롤라아제, 에스테라아제, 펙테이트 라이아제, 펙티나아제, 락카아제, 옥시다아제, 리덕타아제, 아미다아제, 및 다른 효소, 구조 단백질, 표면 활성 단백질, 결합 단백질 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 티. 레에세이 숙주 세포는 예를 들어 본 명세서에 기재된 분석법을 사용하여 결정할 때 열안정성 셀룰라아제 활성을 나타내는 EGV 폴리펩티드의 생성을 방지하도록 이것이 유전자 변경되거나 또는 화학적으로 변경되었을 경우, "열안정성 EGV 셀룰라아제의 생성을 방지하도록 변형"되었다. 그러한 변형은 egl5의 결실, egl5의 파괴, 코딩된 EGV 폴리펩티드가 더 이상 열안정성이 아니도록 하는 egl5의 변형, 코딩된 EGV 폴리펩티드가 더 이상 셀룰라아제 활성을 나타내지 않도록 하는 egl5에 대한 변형, 코딩된 EGV 폴리펩티드가 더 이상 분비되지 않도록 하는 egl5의 변형, EGV가 발현되지 않도록 하는 프로모터 또는 조절 요소의 변형 및 그 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기능성 폴리펩티드/단백질"은 활성, 예를 들어 효소 활성, 결합 활성, 표면 활성 특성 등을 보유하며, 돌연변이되거나, 절단되거나 또는 달리 변형되어 활성이 완전 파괴된 것이 아닌 (또는 본질적으로 제거된 것이 아닌) 단백질이다. 기능성 폴리펩티드는 열안정성 또는 열불안정성일 수 있으며, 이는 명시된 바와 같다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원하지 않는 활성"은 티. 레에세이 숙주 세포로부터 생성되는 단백질 제제에서 요망되지 않는 활성 (예를 들어, 효소 활성, 결합 활성, 표면 활성 특성 등)이다. 전형적으로, 원하지 않는 활성은 요망되는 또는 바람직한 활성을 갖는 관심대상의 단백질을 추가로 포함하는 단백질 제제에서 나타난다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "발효 브로쓰 조성물"은 관심대상의 단백질, 예를 들어 하이드로포빈을 함유하는 세포 성장 배지를 말한다. 세포 성장 배지는 세포 및/또는 세포 잔사를 포함할 수 있으며, 농축될 수 있다. 예시적인 발효 브로쓰 조성물은 하이드로포빈-함유, 한외여과-농축 발효 브로쓰이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "만난아제 만노스 단위(mannanase mannose unit; MMU)"는 0.24%의 로커스트 빈 검(locust bean gum; LBG)의 존재 하에 pH 7.0 및 50℃에서 분당 1 μmol의 환원 말단 등가물 (D-만노스를 포함하지만, 이에 한정되지 않음)을 생성하는 데 요구되는, 하이드로포빈 1 mg당 만난아제의 양이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "엔도글루카나아제 단위(endoglucanase unit; EGU)"는 분당 1 μmol의 환원당을 생성하는 데 요구되는, 하이드로포빈 1 mg당 엔도글루코나아제의 양이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프로테아제 단위(protease unit; PU)"는 pH 6.2 및 25℃에서 분당 1 μmol의 N-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르(BAEE)를 가수분해시키는 데 요구되는, 하이드로포빈 1 mg당 시스테인 프로테아제의 양에 상응한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 식품 또는 다른 물질을 "처리"하여 그 물질의 변화에 영향을 준다는 것은 식품 또는 다른 물질을 티. 레에세이 숙주 세포로부터 생성되는 단백질 제제와 접촉시킴을 의미하며, 여기서 단백질 제제에 존재하는 하나 이상의 단백질은 식품 또는 다른 물질의 성분에 작용하여 예를 들어 효소 활성, 결합 활성, 표면 활성 특성 등의 결과로서 화학적 변화를 야기한다. 처리의 예에는 구운 식품 제품을 아밀라아제와 접촉시켜 아밀로펙틴을 가수분해시키는 것, 식품 제품을 리파아제와 접촉시켜 유화제를 생성하는 것, 및 식품 제품을 하이드로포빈과 접촉시켜 질감을 변경시키는 것이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형(the singular article, "a", "an" 및 "the")은 그 문맥이 달리 명백하게 기술하지 않으면 복수형 지시 대상을 포함한다. 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
하기 약어/두문자어는 달리 명시되지 않으면 하기 의미를 갖는다:
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본 발명의 조성물 및 방법은 부분적으로는 트리코데르마 레에세이 egl5 유전자가 열안정성 셀룰라아제 효소, 즉 EGV를 코딩한다는 발견을 기반으로 한다. 이와는 대조적으로, 티. 레에세이에 의해 발현되는 다른 공지된 셀룰라아제는 가열 불안정성이다. egl5의 생성물이 열안정성이라는 발견은 셀룰라아제 활성을 포함하는 원하지 않는 효소 활성의 부재 하에서의 티. 레에세이에서의 내인성 폴리펩티드 및 외인성 폴리펩티드 둘 모두의 생성에 대하여 원대한 영향을 준다.
국제특허 공개 WO 2005/093073호("073 PCT")에 언급이 되어 있다. 073 PCT는 외인성 융합 단백질을 발현하는 티. 레에세이에 관계된다. 또한 국제특허 공개 WO 2005/001036호("036 PCT")에 언급이 되어 있다. 036 PCT는 티. 레에세이에서의 소정의 유전자의 확인 및 단리에 관한 것이다. 추가로 국제특허 공개 WO 98/15619호("619 PCT")에 언급이 되어 있다. 619 PCT는 트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum)에 의한 EGVI의 발현에 관한 것이다. 073 PCT, 036 PCT 및 619 PCT 중 어떠한 것도, 개별적으로 또는 임의로 조합되어, EGV와 같은 내인성 열안정성 셀룰라아제의, 티. 레에세이와 같은 트리코데르마에서의 발현의 방지 또는 감소를 교시하고 있지 않거나 제안하고 있지 않으며, 특히 EGV와 같은 내인성 열안정성 셀룰라아제의, 티. 레에세이와 같은 트리코데르마에서의 발현 및 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II와 같은 외인성 열안정성 폴리펩티드의 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이에 의한 발현의 방지 또는 감소를 교시하지 않거나 또는 제안하지 않는다.
일 태양에서, 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이에서 열안정성 폴리펩티드를 발현시키는 방법이 제공되며, 이는 티. 레에세이 숙주 세포에서 egl5를 파괴하는 단계, 트리코데르마 숙주 세포에서 열안정성 폴리펩티드를 발현시키는 단계, 및 생성된 전 세포 용해물, 세포 브로쓰, 또는 부분적으로 정제된 단백질 제제를 승온에 노출시키고, 이럼으로써 사실상 모든 가열-불안정성 효소 활성을 단백질 제제로부터 제거하는 단계를 포함하거나 또는 상기 단계들로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 가열-불안정성 효소 활성은 셀룰라아제 활성이다. 이 방법의 한 가지 상당한 이점은 egl5가 관심대상의 열안정성 단백질 발현에 사용되는 트리코데르마 숙주 세포에서 파괴될 수 있는 반면, 가열-불안정성 효소를 코딩하는 다른 유전자는 온전하게 남아 있어서 트리코데르마 숙주 세포에서 다수의 결실을 만들 필요를 회피할 수 있다는 것이다. 예시적인 가열-불안정성 효소로는 프로테아제, 셀룰라아제 및 자일라나아제가 있다.
관련 태양에서, 파괴된 egl5를 갖거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이가 제공되는데, 숙주 세포는 원하지 않는 효소 활성이 없는 가열 안정성 폴리펩티드의 발현에 적합하다. 상기와 같이, 가열-불안정성 효소를 코딩하는 트리코데르마 유전자는 숙주 세포에서 온전하게 남아 있을 수 있으며, 그 이유는 이들 유전자의 발현 생성물이 가열에 의해 불활성화될 수 있기 때문이다. 이러한 방식으로, 트리코데르마 숙주 세포는 egl5가 파괴되기만 한다면, 가열 불안정성 셀룰라아제를 코딩하는 다수의 온전한 유전자를 포함할 수 있다.
추가의 관련 태양에서, 파괴된 egl5를 갖거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이가 제공되는데, 숙주 세포는 가열-불안정성 폴리펩티드의 발현에 적합하며, 여기서 본질적으로 모든 효소 활성은 발현 후 소정의 시점에 가열에 의해 불활성화될 수 있다. 이전과 같이, 트리코데르마 숙주 세포는 egl5가 파괴되기만 한다면 가열 불안정성 효소를 코딩하는 다수의 온전한 유전자를 포함할 수 있다.
다른 태양에서, 열안정성 엔도글루카나아제 V(EGV) 폴리펩티드의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하도록 변형된 트리코데르마 숙주 세포가 제공되며, 여기서 상기 변형은 EGV를 코딩하는 유전자를 트리코데르마 숙주 세포로부터 파괴하거나 또는 결실시키는 것을 포함하거나 또는 상기 파괴 또는 결실로 본질적으로 이루어지며, EGV를 코딩하는 유전자는 egl5이다.
관련 태양에서, 셀룰라아제 및/또는 만난아제 활성의 감소된 양의 존재 하에, 또는 사실상 상기 활성의 부재 하에, 하이드로포빈 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 실시 형태에서, 하이드로포빈 폴리펩티드는 사상균 숙주 세포로부터 수득된다. 그러한 하이드로포빈 조성물은 셀룰로오스 및 만노스가 존재하고 이들 복합 당의 효소적 가수분해가 바람직하지 못한 응용에서 사용하기에 적절하다. 일부의 경우, 하이드로포빈 폴리펩티드는 열불안정성 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드의 존재 하에 생성되며, 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 불활성화시키기 위하여 승온이 가해진다.
일부의 경우, 하이드로포빈 폴리펩티드는 활성 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드가 숙주 세포에서 생성되지 않도록, 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴되거나 또는 상기 파괴된 유전자로 본질적으로 이루어진 숙주 세포에서 생성된다.
또 다른 경우, 하이드로포빈 폴리펩티드는 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자(들) 또는 핵산 분자(들)가 결여된 숙주 세포에서 생성된다.
본 명세서에서 언급되는 egl5 유전자는 젠뱅크(Genbank) 등록 번호 Z33381에 상응한다 (문헌[Saloheimo, A. et al . (1994) Mol . Microbiol. 13:219-28]). egl5의 뉴클레오티드 서열은 도 10에 개시되며, 서열 번호 32로 표기된다.
EGV 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열은 도 10에 개시되며, 서열 번호 33으로 표기된다.
EGV는 탄수화물 활성 효소(Carbohydrate Active Enzymes; CAZy) 패밀리 45 글리코실 하이드롤라아제에 속하는 엔도-1,4-베타-글루카나아제이며, 이는 효소 분류(Enzyme Classification; EC) 번호 (EC 3.2.1.4)를 갖는다. 이들 효소는 패밀리 K 셀룰라아제/자일라나아제로서 이전에 공지되었었다. EGV의 중요한 특징 - 이는 상기 효소를 다른 공지된 티. 레에세이 셀룰라아제와 구별함 - 은 EGV가 열안정성이라는 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법에 따른 EGV 폴리펩티드는 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 EGV 셀룰라아제와 비교하여 유사한 구조 및 기능을 갖는 셀룰라아제이다. 유사한 구조라는 것은 서열 번호 33의 서열과의 일차 아미노산 서열 동일성이 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 심지어 적어도 약 99%이거나 또는 그보다 더 크다는 것을 의미한다. 유사한 기능은 열안정성 엔도-1,4-베타-글루카나아제 활성을 의미한다. 이 문맥에서, 열안정성은 약 90℃ 이상의 온도에 약 5분 이상의 시간 동안 노출시킨 후 셀룰라아제가 그의 원래 활성의 1/2 이상(즉, 50% 이상)을 유지하는 능력을 말한다.
본 조성물 및 방법의 일 태양은 egl5의 결실 또는 파괴를 포함하는 숙주 세포인데, 이는 기능성 효소의 발현을 저지한다.
본 조성물 및 방법의 다른 태양은 egl5의 결실 또는 파괴를 포함하거나 또는 상기 결실 또는 파괴로 본질적으로 이루어진 숙주 세포인데, 이는 기능성 효소의 발현을 저지한다. 결실은 숙주 세포의 게놈으로부터의 egl5의 제거를 말하며, 이는 예를 들어 상동 재조합 또는 화학적 돌연변이 유발에 의해 달성될 수 있다. 상동 재조합이 일반적으로 바람직하며, 그 이유는 이것이 표적화된 방법이기 때문이다. 대체적으로 egl5의 파괴는 효소 활성 EGV 셀룰라아제의 발현을 사실상 방지하는, 티. 레에세이 숙주 세포의 임의의 유전자 조작 또는 화학적 조작을 말한다. 예시적인 파괴 방법에는 egl5의 전 결실, egl5를 포함하는 게놈의 일부분의 결실, egl5의 부분 결실(절단을 포함함), egl5 프로모터, 인핸서 또는 다른 유전자 제어 요소의 전 결실 또는 부분 결실, egl5 코딩 서열, 프로모터, 인핸서 또는 다른 유전자 제어 요소의 돌연변이 유발, 또는 기능성 egl5 유전자 생성물(즉 EGV)의 발현을 저지하는 다른 임의의 유전자 변형이 포함된다. 그러한 파괴는 또한 예를 들어 상동 재조합 또는 화학적 돌연변이 유발에 의해 성취될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법의 목적상, egl5 유전자의 파괴는 EGV 폴리펩티드의 열안정성을 완전 파괴하거나 또는 감소시키는 유전자 변형을 또한 포함한다.
egl5의 결실 또는 파괴 공정에서, 다수의 선발가능 마커를 숙주 세포 내로 도입하여 고체 또는 액체 배지 상에서의 돌연변이 숙주 세포의 선발을 가능하게 하거나, 세포 분류 (예를 들어, FACS 분석)에 의해 선발을 허용하거나, 또는 PCR 또는 서던(Southern) 블롯 분석에 의한 스크리닝을 용이하게 할 수 있다. 추가의 숙주 세포 유전자가 또한 결실되거나 또는 파괴될 수 있다. 일부의 경우, egl5의 결실 또는 파괴 부위에 관심대상의 유전자를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 조성물 및 방법에서는 열안정성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 티. 레에세이 숙주 세포 내로 도입함에 있어서 상동 재조합을 위한 부위로서 egl을 사용하는 것이 고려된다.
관심대상의 유전자는 관심대상의 단백질을 코딩하며, 이는 셀룰라아제 활성의 부재 하에서의 트리코데르마에서의 발현에 바람직하다. 일부의 경우, 관심대상의 유전자는 열안정성 폴리펩티드를 코딩한다. 그러한 열안정성 폴리펩티드는 egl5가 결실되거나 또는 파괴된 숙주 세포에서 이를 발현시키고, 숙주 세포 용해물 또는 이 숙주 세포로부터의 배지에 열 스트레스를 가하여 숙주 세포에 의해 발현되는 셀룰라아제를 가열 불활성화시키고, 셀룰라아제 활성이 사실상 없는 열안정성 폴리펩티드를 회수함으로써 셀룰라아제 활성의 부재 하에 발현될 수 있다.
열안정성 폴리펩티드는 효소, 구조 단백질, 핵산 결합 단백질, 수용체 등을 포함한다. 그러한 단백질은 호열성 유기체 유래의 것일 수 있으며, 상기 유기체는 파이로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 써무스 플라부스(Thermus flavus), 써모언에어로박테리움 써모설퍼리게네스(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes), 바실루스 써모프로테오라이티쿠스(Bacillus thermoproteolyticus), 써모토가 마리티메(Thermotoga maritime), 써모마이세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus), 바실루스 써모프로테오라이티쿠스(Bacillus thermoproteolyticus), 및 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 호열성 단백질에는 파이로코쿠스 푸리오수스 유래의 시트레이트 신타아제, 루브레독신, 글루타메이트 데하이드로게나아제 및 메티오닌 아미노펩티다아제, 써무스 아쿠아티쿠스 및 테미우스 써모필루스(Themius thermophilus)유래의 EF-TU 및 EF-TU-TS, 써무스 써모필루스 유래의 무기 파이로포스파타아제 및 망간 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 바실루스 스테아로써모필루스 유래의 락테이트 데하이드로게나아제, 3-포스포글리세레이트 키나아제, 아데닐레이트 키나아제 및 포스포프룩토키나아제, 써무스 플라부스 유래의 말레이트 데하이드로게나아제, 써모언에어로박테리움 써모설퍼리게네스 유래의 사이클로덱스트린, 바실루스 써모프로테오라이티쿠스 유래의 써모라이신, 중성프로테아제 및 페레독신, 써모토가 마리티메 유래의 cheY, 및 써모마이세스 라누기노수스 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나아제가 포함된다.
추가의 열안정성 폴리펩티드는 아밀라아제, 풀룰라나아제, 자일라나아제, 키티나아제, 프로테아제, 리파아제, 폴리머라아제 및 심지어 셀룰라아제를 포함한다. 호열성 셀룰라아제가 당업계에 공지되어 있지만, 지금까지는 EGV가 적어도 티. 레에세이 유래의 전 세포 용해물, 브로쓰, 또는 부분 정제된 세포 단백질 제제에 있어서 상당한 양의 셀룰라아제 활성을 생성하도록 하는 그러한 양으로 티. 레에세이에서 발현되는 유일한 열안정성 셀룰라아제라는 것은 공지되지 않았음을 주목하라. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 티. 레에세이 숙주 세포에서 외인성 열안정성 셀룰라아제를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 상기 외인성 열안정성 셀룰라아제에는 원하지 않는 티. 레에세이 셀룰라아제 활성이 사실상 없다.
다른 추가의 열안정성 폴리펩티드는, 단지 몇 가지를 들자면, 구조 폴리펩티드, 전사 인자, 샤페로닌(chaperonin) 및 폴리펩티드 저해자를 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생성될 수 있는 예시적인 단백질 군으로는 사상균에 의해 발현되는 시스테인-풍부 폴리펩티드 부류인 하이드로포빈이 있다. 하이드로포빈은 자가-조립하여 양쪽친매성 단백질을 형성하는 능력으로 유명한 작은 (~100개의 아미노산) 폴리펩티드이다. 이는 세포 및 인공 물질을 포함하여 대상의 표면 상에 소수성 코팅을 형성할 수 있다. 1991년에 쉬조필룸 코뮨(Schizophyllum commune)에서 처음에 발견된 하이드로포빈은 현재 다수의 사상균에서 인식되었다. 소수도(hydropathy) 및 다른 생물물리학적 특성의 차이를 기반으로 하여, 하이드로포빈은 클래스 I 또는 클래스 II로 분류된다.
적합한 하이드로포빈은 당업계에 공지된 임의의 클래스 I 또는 클래스 II 하이드로포빈, 예를 들어 아가리쿠스(Agaricus) spp. (예를 들어 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus)), 아그로사이베(Agrocybe) spp. (예를 들어 아그로사이베 아에게리타(Agrocybe aegerita)), 아젤로마이세스(Ajellomyces) spp. (예를 들어, 아젤로마이세스 캅술라투스(Ajellomyces capsulatus), 아젤로마이세스 더마티티디스(Ajellomyces dermatitidis)), 아스페르길루스(Aspergillus) spp. (예를 들어 아스페르길루스 아르비이(Aspergillus arvii), 아스페르길루스 브레비페스(Aspergillus brevipes), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 두리카울리스(Aspergillus duricaulis), 아스페르길루스 엘립티쿠스(Aspergillus ellipticus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 푸미신네마투스(Aspergillus fumisynnematus), 아스페르길루스 렌툴루스(Aspergillus lentulus), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 유니라테랄리스(Aspergillus unilateralis), 아스페르길루스 비리디누탄스(Aspergillus viridinutans)), 뷰베리아(Beauveria) spp. (예를 들어 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana)), 클라비셉스(Claviceps) spp. (예를 들어 클라비셉스 푸시포르미스(Claviceps fusiformis)), 콕시디오이데스(Coccidioides) spp. (예를 들어 콕시디오이데스 포사다시이(Coccidioides posadasii)), 코흐리오볼루스(Cochliobolus) spp. (예를 들어 코흐리오볼루스 헤테로스트로푸스(Cochliobolus heterostrophus)), 크리니펠리스(Crinipellis) spp. (예를 들어 크리니펠리스 페르니시오사(Crinipellis perniciosa)), 크라이포넥트리아(Cryphonectria) spp. (예를 들어 크라이포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)), 다비디엘라(Davidiella) spp. (예를 들어 다비디엘라 타시아나(Davidiella tassiana)), 딕시오네마(Dicxyonema) spp. (예를 들어 딕티오네마 글라브라툼(Dictyonema glabratum)), 에메리셀라(Emericella) spp. 예를 들어 에메리셀라 니둘란스(Emericella nidulans)), 플람물리나(Flammulina) spp. (예를 들어 플람물리나 벨루티페스(Flammulina velutipes)), 푸사륨(Fusarium) spp. (예를 들어 푸사륨 쿨모룸(Fusarium culmorum)), 지베렐라(Gibberella) spp. (예를 들어 지베렐라 모닐리포르미스(Gibberella moniliformis)), 글로메렐라(Glomerella) spp. (예를 들어 글로메렐라 그라미니콜라(Glomerella graminicola)), 그리폴라(Grifola) spp. (예를 들어 그리폴라 프론도사(Grifola frondosa)), 헤테로바시디온(Heterobasidion) spp. (예를 들어 헤테로바시디온 안노숨(Heterobasidion annosum)), 하이포크레아(Hypocrea) spp. (예를 들어 하이포크레아 제코리나, 하이포크레아 릭시이(Hypocrea lixii), 하이포크레아 비렌스(Hypocrea virens)), 락카리아(Laccaria) spp. (예를 들어 락카리아 비콜로르(Laccaria bicolor)), 렌티눌라(Lentinula) spp. (예를 들어 렌티눌라 에도데스(Lentinula edodes)), 마그나포르테(Magnaporthe) spp. (예를 들어 마그나포르테 오리자에( Magnaporthe oryzae)), 마라스미우스(Marasmius) spp. (예를 들어 마라스미우스 클라도필루스(Marasmius cladophyllus)), 모닐리오프토라(Moniliophthora) spp. (예를 들어 모닐리오프토라 페르니시오사( Moniliophthora perniciosa)), 네오사르토리아(Neosartorya) spp. (예를 들어 네오사르토리아 아우레올라(Neosartorya aureola), 네오사르토리아 펜넬리아에(Neosartorya fennelliae), 네오사르토리아 피세리(Neosartorya fischeri), 네오사르토리아 글라브라(Neosartorya glabra), 네오사르토리아 히라추카에(Neosartorya hiratsukae), 네오사르토리아 니시무라에(Neosartorya nishimurae), 네오사르토리아 오타니이(Neosartorya otanii), 네오사르토리아 슈도피세리(Neosartorya pseudofischeri), 네오사르토리아 쿠아드리신크타(Neosartorya quadricincta), 네오사르토리아 스파툴라타(Neosartorya spathulata), 네오사르토리아 스피노사(Neosartotya spinosa), 네오사르토리아 스트라메니아(Neosartorya stramenia), 네오사르토리아 우다가와에(Neosartorya udagawae)), 뉴로스포라(Neurospora) spp. (예를 들어 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 뉴로스포라 디스크레타(Neurospora discreta), 뉴로스포라 인터메디아(Neurospora intermedia), 뉴로스포라 시토필라(Neurospora sitophila), 뉴로스포라 테트라스페르마(Neurospora tetrasperma)), 오피오스토마(Ophiostoma) spp. (예를 들어 오피오스토마 노보-울미(Ophiostoma novo-ulmi), 오피오스토마 쿠에르쿠스(Ophiostoma quercus)), 파라콕시디오이데스(Paracoccidioides) spp. (예를 들어, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis)), 파살로라(Passalora) spp. (예를 들어 파살로라 풀바( Passalora fulva), 팍실루스 필라멘토수스(Paxillus filamentosus), 팍실루스 인볼루투스(Paxillus involutus)), 페니실륨(Penicillium) spp. (예를 들어 페니실륨 카멤베르티(Penicillium camemberti), 페니실륨 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실륨 마르네페이(Penicillium marneffei)), 플레비옵시스(Phlebiopsis) spp. (예를 들어 플레비옵시스 기간테아( Phlebiopsis gigantea)), 피솔리투스(Pisolithus) (예를 들어 피솔리투스 틴크토리우스(Pisolithus tinctorius)), 플레우로투스(Pleurotus) spp. (예를 들어 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus)), 포도스포라(Podospora) spp. (예를 들어 포도스포라 안세리나(Podospora anserina)), 포스티아(Postia) spp. (예를 들어 포스티아 플라센타(Postia placenta)), 파이레노포라(Pyrenophora) spp. (예를 들어 파이레노포라 트리티시-레펜티스(Pyrenophora tritici-repentis)), 쉬조필룸(Schizophyllum) spp. (예를 들어 쉬조필룸 코뮨), 탈라로마이세스(Talaromyces) spp. (예를 들어 탈라로마이세스 스티피타투스(Talaromyces stipitatus)), 트리코데르마 spp. (예를 들어, 트리코데르마 아스페렐룸(Trichoderma asperellum), 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 트리코데르마 레에세이 [이전에는 하이포크레아 제코리나]), 트리콜로마(Tricholoma) spp. (예를 들어 트리콜로마 테레움(Tricholoma terreum)), 운시노카르푸스(Uncinocarpus) spp. (예를 들어 운시노카르푸스 레에세이(Uncinocarpus reesii)), 베르티실리움(Verticillium) spp. (예를 들어 베르티실리움 달리아에(Verticillium dahliae)), 잔토닥틸론(Xanthodactylon) spp. (예를 들어 잔토닥틸론 플람메움(Xanthodactylon flammeum)), 잔토리아(Xanthoria) spp. (예를 들어 잔토리아 칼시콜라(Xanthoria calcicola), 잔토리아 카펜시스(Xanthoria capensis), 잔토리아 엑타네오이데스(Xanthoria ectaneoides), 잔토리아 플람메아(Xanthoria flammea), 잔토리아 카로오엔시스(Xanthoria karrooensis), 잔토리아 리굴라타(Xanthoria ligulata), 잔토리아 파리에티나(Xanthoria parietina), 잔토리아 투르비나타(Xanthoria turbinata)) 등으로부터의 하이드로포빈이다. 하이드로포빈은 예를 들어 문헌[Sunde, M. et al. (2008) Micron 39:773-84]; 문헌[Linder, M. et al. (2005) FEMS Microbiol Rev. 29:877-96]; 및 문헌[
Figure pct00002
, H. et al . (2001) Ann . Rev . Microbiol . 55:625-46]에 개관되어 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 관심대상의 단백질은 EGV 이외의 셀룰라아제를 불활성화시키는 데 요구되는 온도에서 최소로 변성되는 중온 단백질(mesophilic protein)일 수 있다. 관심대상의 단백질은 또한 그의 열안정성에 대하여 선발된 엔지니어링된 단백질일 수 있다. 또한 관심대상의 단백질은, 활성 단백질 또는 구조적으로 온전한 단백질이 승온에의 노출 후 회수되도록, EGV 이외의 셀룰라아제를 불활성화시키는 데 요구되는 온도에서 가역적으로 변성되는 것일 수 있다.
관심대상의 폴리펩티드, 특히 관심대상의 열안정성 폴리펩티드는 국제특허 공개 WO/2011/019686호에 논의된 바와 같이, 유리하게는 그 발명에 따라, 예를 들어 그의 실시예 1의 기술에 따라 회수될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 사실상 셀룰라아제, 만난아제 및/또는 프로테아제 활성을 포함하는 탐지가능한 효소 활성의 부재 하에 관심대상의 단백질이 생성되게 한다. 다른 실시 형태에서, 관심대상의 단백질은 소량이지만 검출가능한 양의 탐지가능한 셀룰라아제, 만난아제 및/또는 프로테아제 활성의 존재 하에 생성된다. 예를 들어, 특정 실시 형태에서, 관심대상의 단백질은 약 0.1 EGU 미만, 또는 심지어 약 0.05 EGU 미만, 약 0.10 MMU 미만, 약 0.05 MMU 미만, 약 0.025 MMU 미만, 약 0.02 MMU 미만, 약 0.015 MMU 미만, 또는 심지어 약 0.01 MMU 미만의 엔도글루카나아제 활성, 및/또는 약 1.3 PU 미만, 또는 심지어 약 0.5 PU 미만의 탐지가능한 시스테인 프로테아제 활성의 존재 하에 생성된다. 관심대상의 단백질이 예를 들어 식품 응용용으로 의도된 하이드로포빈일 경우, 그러한 양의 오염 활성은 일반적으로 해롭지 않다.
일반적으로, 관심대상의 단백질은, 단백질이 열적 스트레스에 응답하여 가역적으로 변성되는 능력을 유지하거나 또는 열안정성을 유지하기만 한다면, 다수의 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 결실, 또는 화학적 변형을 포함할 수 있다. 바람직한 관심대상의 단백질은 약 70℃ 이상, 약 75℃ 이상, 약 80℃ 이상, 약 85℃ 이상, 약 90℃ 이상 또는 심지어 약 95℃ 이상의 온도에, 약 3분 이상, 약 5분 이상, 약 10분 이상, 약 15분 이상, 약 20분 이상, 또는 심지어 약 30분 이상의 시간 동안 노출시킨 후 그의 활성, 결합 능력 또는 천연 구조 (단백질의 유형에 따름)의 대략적으로 절반(즉, 적어도 50%)을 유지한다. 특정한 경우, 관심대상의 단백질은 약 90℃ 이상의 온도에 약 5분 이상의 시간 동안 노출시킨 후 그의 활성, 결합 능력 또는 천연 구조의 약 50% 이상을 유지한다.
관심대상의 유전자 또는 관심대상의 핵산 분자는 상동 재조합, 일시적 발현 벡터를 이용한 형질감염, 안정한 통합성의 발현 벡터, 또는 인공 염색체, 바이러스를 이용한 감염/형질도입 등을 포함하는 임의의 공지된 방법을 사용하여 트리코데르마 세포 내로 도입될 수 있다. 일부의 경우, 관심대상의 유전자를 파괴시킬 egl5 부위에 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 일부의 경우, 관심대상의 하나 초과의 유전자 또는 핵산 분자가 있을 수 있다.
일 태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 egl5와 관련하여 결실되거나 또는 파괴된 그러나 선택적으로 다른 셀룰라아제 유전자를 코딩하는 숙주 세포인 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이를 사용하여 하이드로포빈과 같은 열안정성 단백질의 발현을 허용한다. 열안정성 단백질의 발현 후, 트리코데르마 유래의 전 세포 용해물, 브로쓰, 또는 부분적으로 정제된 세포 단백질 제제는 가열-불안정성 효소를 불활성화시키기에 충분한 온도에서 인큐베이션하여 원하지 않는 셀룰라아제 [엔도글루카나아제(EGV 이외의 것), 엑소글루카나아제, 셀로바이오하이드롤라아제, β-글루코시다아제, 카르복시메틸 셀룰라아제 등을 포함함], 헤미셀룰라아제 (자일라나아제, 만난아제, 아라비난아제, 글루큐로니다아제, 아세틸자일란 에스테라아제, 아라비노푸라노시다아제, 자일로시다아제 등을 포함함), 프로테아제, 리파아제, 아밀라아제, 에스테라아제, 퍼하이드롤라아제, 파이타아제, 락카아제 및 다른 상업적으로 관련된 효소의 활성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 원하지 않는 효소 활성의 부재 하에 관심대상의 단백질을 생성하는데, 이는 전부 숙주 세포에서 다수의 상이한 가열-불안정성 효소 코딩 유전자를 파괴할 필요를 회피하면서 그러하다. 이는 트리코데르마에서 관심대상의 유전자 또는 핵산 분자의 발현을 크게 단순화한다.
다른 태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 본질적으로 egl5와 관련하여 결실되거나 또는 파괴된 그러나 선택적으로 다른 셀룰라아제 유전자를 발현하거나 또는 다른 셀룰라아제 유전자를 코딩하는 트리코데르마 숙주 세포를 사용하여 열안정성 단백질, 예를 들어 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II의 발현을 허용한다. 열안정성 단백질의 발현 후, 트리코데르마 유래의 전 세포 용해물, 브로쓰, 또는 부분적으로 정제된 세포 단백질 제제는 가열-불안정성 효소를 불활성화시키기에 충분한 온도에서 인큐베이션하여 원하지 않는 셀룰라아제 [엔도글루카나아제(EGV 이외의 것), 엑소글루카나아제, 셀로바이오하이드롤라아제, β-글루코시다아제, 카르복시메틸 셀룰라아제 등을 포함함], 헤미셀룰라아제 (자일라나아제, 만난아제, 아라비난아제, 글루큐로니다아제, 아세틸자일란 에스테라아제, 아라비노푸라노시다아제, 자일로시다아제 등을 포함함), 프로테아제, 리파아제, 아밀라아제, 에스테라아제, 퍼하이드롤라아제, 파이타아제, 락카아제 및 다른 상업적으로 관련된 효소의 활성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 원하지 않는 효소 활성의 부재 하에 관심대상의 단백질을 생성하는데, 이는 전부 숙주 세포에서 다수의 상이한 가열-불안정성 효소 코딩 유전자를 파괴할 필요를 회피하면서 그러하다.
다른 태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 열안정성 엔도글루카나아제 V(EGV)의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하도록 변형된 트리코데르마 숙주 세포를 사용하여 하이드로포빈과 같은 열안정성 단백질의 발현을 허용하며, 여기서 상기 변형은 트리코데르마 숙주 세포 유래의 EGV를 코딩하거나 또는 상기 EGV의 발현을 제공하는 핵산 분자를 본질적으로 결실시키는 것을 포함하거나 또는 상기 결실로 본질적으로 이루어지며, EGV를 코딩하는 핵산 분자는 egl5인 것이 제공된다.
다른 태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II가 존재하는, 숙주 세포로부터 수득되는 조성물을 제공하며, 이때 셀룰라아제 및/또는 만난아제 활성은 부재한다. 그러한 조성물은 열불안정성 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 또한 생성하는 숙주 세포, 예를 들어 사상균 세포, 예를 들어 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이에서 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II를 생성하고, 그 후 숙주 세포에 의해 생성된 단백질에 승온을 가하여 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 불활성화시킴으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 코딩하는 또는 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드의 발현에 책임이 있는 핵산 분자가 결실되고/되거나 파괴된, 또는 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자(들)가 결여된 숙주 세포, 예를 들어 트리코데르마, 예를 들어 티. 레에세이에서 하이드로포빈이 생성될 수 있다. 그러한 조성물은 하이드로포빈, 예를 들어 하이드로포빈 II를 요구하는 응용에서 유용하며, 여기서 셀룰라아제 및/또는 만난아제 활성의 존재는 바람직하지 못하다.
본 발명의 조성물 및 방법의 이들 태양 및 다른 태양과 실시 형태는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 고려하면 당업자에게 명백해질 것이다.
실제, 당업자라면 본 발명을, 2011년 3월 29일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/469,067호 및 2011년 4월 15일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/475,933호 각각의 또는 이들 둘 모두의 발명과 조합하여 실시할 수 있다는 언급이 되어 있는데, 상기 미국 특허 출원 둘 모두는 본 명세서에 참고로 포함된다. 구체적으로, 당업자라면, 열처리 전 또는 후를 포함하는, 본 발명의 실시에서 하이드로포빈 II를 발현시킨 후 임의의 시점에서, 2011년 4월 15일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/475,933호의 하이드로포빈 II의 정제 방법을 본 발명과 함께 이용할 수 있으며; 상기 정제 방법은 C1-C3 알코올, 예를 들어 아이소프로판올을 하이드로포빈 용액에 첨가하여 제1 침전물을 생성하고, C1-C3 알코올/하이드로포빈 용액으로부터 상청액을 가만히 따라내고, C1-C3 알코올을 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 제2 침전물은 정제된 하이드로포빈 II일 수 있다. 그리고, 본 발명을 실시할 때 하이드로포빈 II의 발현 동안 2011년 3월 29일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/469,067호의 침전제 기술을 이용할 수 있다.
또한 본 발명의 방법은 본 발명의 변형 트리코데르마 숙주 세포에 의해 발현되는 관심대상의 폴리펩티드의 활성의 제어에 관련되며, 여기서 관심대상의 폴리펩티드는 열민감성 또는 열불안정성이고, 상기 방법은 관심대상의 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드 및 내인성 폴리펩티드에 승온을 가하는 단계를 포함할 수 있으며, 승온은 내인성 폴리펩티드 및 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드를 불활성화시키기에 충분할 수 있다. 유리한 실시 형태에서, 내인성 폴리펩티드는 셀룰로오스일 수 있다. 본 방법은 관심대상의 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드에 승온을 가하기 이전에 관심대상의 폴리펩티드를 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 관심대상의 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드에 승온을 가하기 이전에 관심대상의 폴리펩티드를 셀룰로오스 및 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 하나 이상의 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 방법은 본 발명의 발효 브로쓰 중 관심대상의 폴리펩티드의 활성의 제어 방법에 관련되며, 여기서 관심대상의 폴리펩티드는 열민감성 또는 열불안정성일 수 있고, 본 방법은 발효 브로쓰에 내인성 폴리펩티드 및 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드를 불활성화시키기에 충분한 승온을 가하는 단계를 포함할 수 있다. 유리한 실시 형태에서, 내인성 폴리펩티드는 셀룰로오스일 수 있다. 본 방법은 발효 브로쓰에 승온을 가하기 이전에 발효 브로쓰를 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 관심대상의 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 발효 브로쓰에 승온을 가하기 이전에 발효 브로쓰를 셀룰라아제 및 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 하나 이상의 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
관심대상의 폴리펩티드 및/또는 셀룰라아제가 작용하는 화합물은 관심대상의 폴리펩티드 및/또는 셀룰라아제와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 임의의 화합물일 수 있다. 관심대상의 화합물은 관심대상의 폴리펩티드 및/또는 셀룰라아제에 직접적으로 결합하는 화합물, 즉, 시스(cis)-작용 화합물일 수 있다. 일 실시 형태에서, 관심대상의 화합물은 관심대상의 폴리펩티드 및/또는 셀룰라아제의 기질, 예를 들어 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌, 펙틴 또는 그 유도체일 수 있다. 예에는 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 트라이아세테이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 아세테이트 프로피오네이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 니트로셀룰로오스 (셀룰로오스 니트레이트), 셀룰로오스 설페이트, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 에틸 메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC), 하이드록시에틸 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스(HPMC), 에틸 하이드록시에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 실시 형태에서, 관심대상의 화합물은 관심대상의 폴리펩티드 및/또는 셀룰라아제와 간접적으로 상호작용하는 화합물, 즉 트랜스(trans)-작용 화합물일 수 있다.
또한 본 발명은 변형 트리코데르마 숙주 세포로부터 수득되는 조성물에 존재하는 셀룰라아제의 활성을 제어하는 방법에 관한 것이며, 여기서 조성물은 EGV 이외의 적어도 하나의 셀룰라아제 효소를 포함할 수 있으며, 상기 방법은 관심대상의 폴리펩티드를 불활성화시키기에 충분한 승온을 조성물에 가하는 단계를 포함할 수 있고, 조성물에 승온을 가한 후 조성물에는 셀룰라아제 활성이 사실상 없다. 관심대상의 폴리펩티드는 열민감성이거나 또는 열불안정성일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 폴리펩티드는 내열성 또는 열안정성일 수 있다. 조성물에 승온을 가하는 것은 식료품 또는 음료에서 수행될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 승온은 약 100℃ 미만일 수 있다. 본 발명의 승온은 열안정성 셀룰라아제를 파괴하는 굽기, 튀기기, 파스퇴르화, 또는 다른 열처리를 포함함을 의미하는 것은 아니다. 다른 실시 형태에서, 변형 트리코데르마 숙주 세포로부터 수득된 조성물은 하이드로포빈-함유 발효 브로쓰일 수 있다.
하기 실시예는 본 조성물 및 방법을 추가로 예시하고자 하는 것으로서, 이를 한정하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. pyr2 유전자가 파괴된 티. 레에세이 주의 제작
아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 유래의 sucA의 단편을 프라이머 oANSUCA5 및 oANSUCA3을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이와 유사하게, 헥소키나아제 유전자 프로모터를 프라이머 oHXK5 및 oHXK3을 사용하여 티. 레에세이의 염색체로부터 증폭시켰다. 증폭시킨 sucA DNA 단편을 EcoRI 및 AscI로 제한효소 처리하였다. 헥소키나아제 프로모터를 지닌 증폭 DNA 단편을 HindIII 및 EcoRI으로 절단하였다. 절단한 두 단편을, HindIII 및 AscI로 절단한 플라스미드 pTrex3(AGL51M) (본 명세서에 참고로 포함된 국제특허 공개 WO 08/118382호 참조)과 함께 라이게이션 반응물에서 함께 인큐베이션하였다. 생성된 벡터, pTHXK(SUCA)를 HindIII 및 BamHI로 절단하고, 헥소키나아제 프로모터와 융합된 sucA 유전자의 단편을 지닌 3.5 kb DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 단리하였다. 이 단편의 뉴클레오티드 서열이 도 7에 제공되어 있으며, 이는 본 명세서에서 서열 번호 1로 표기된다.
pF1X는 pUC19 유래의 암피실린 내성 유전자 및 복제 기점과, 박테리오파지 f1 복제 기점을 포함하는 작은 플라스미드이다. 이의 전 뉴클레오티드 서열이 도 8에 제공되어 있으며, 이는 본 명세서에서 서열 번호 2로 표기된다.
티. 레에세이의 pyr2 유전자를 프라이머 oPYR2 51 및 oPYR2 31을 사용하여 증폭시켰다. 생성된 단편을 SfiI 및 NotI로 절단하고, 동일 효소로 절단한 pF1X와 함께 라이게이션 반응물에서 인큐베이션하였다. 생성된 플라스미드를 pF1X(pyr2hxksuc)로 표기하였다. 이. 콜라이(E. coli) 주 XL1-Blue MRF'를 pF1X(pyr2hxksuc)로 형질전환시키고, 헬퍼 파지 M13K07 (인비트로겐(Invitrogen))로 형질감염시켰다. 파지미드 형태의 pF1X(pyr2hxksuc) 유래의 DNA를 표준 방법을 이용하여 단리하였다 (예를 들어, 인비트로겐으로부터의 사용 설명서를 참조).
상기 파지미드 DNA를 약 1 mg/ml의 농도로 H-제한 효소 완충액에 용해시키고, 상기 용액을 75℃로 가열하고 이를 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 두 올리고뉴클레오티드 oPYR2F_3M 및 oPYR2_5P에 어닐링시켰는데, 상기 올리고뉴클레오티드 둘 모두는 5 μM의 농도로 존재하였다. 생성된, 부분 이중 가닥 DNA를 BamHI로 절단하고, 이 절단에 의한 생성된 두 DNA 단편 중 더 큰 것을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하였다.
상기 더욱 큰 BamHI DNA 단편은, 포자 전기천공에 의한 티. 레에세이의 사중-결실(Δcbhl, Δcbh2, Δegl 및 Δeg2) 주(즉 "Quad"; 미국 특허 제5,650,322호)의 형질전환에 사용하였다 (예를 들어, 문헌[Miasnikov, A. and Kim, S. (2009) Abstracts of the 25th Fungal Genetics conference at Asilomar. p.232] 참조). 형질전환체를 수크로스 최소 배지(수크로스, 5 g/ℓ; KH2PO4, 5 g/ℓ; (NH4)2SO4, 6.6 g/ℓ; MgC12, 1 g/ℓ; MgSO4, 0.1 g/ℓ; CaC12, 0.25 g/ℓ; FeSO4, 5.0 mg/ℓ; MnSO4, 1.6 mg/ℓ; ZnSO4, 1.4 mg/ℓ; 우리딘, 100 mg/ℓ) 상에서 성장하는 그의 능력에 대하여 선발하였다. 수크로스 상에서 성장하는 형질전환체를 1 g/ℓ의 플루오로오로트산(FOA)을 포함하는 동일 배지를 함유하는 플레이트 상에서 계대 배양하였다. FOA의 존재 하에 최상의 성장을 나타내는 형질전환체 (DURA로 암호화함)로부터 염색체 DNA를 단리하였다. 이 DNA를 프라이머 쌍 (i) oPYR2FD_R1 및 oSUC2_D1과, (ii) oPYR2FU_D1 및 oSUC2_R1을 사용하여 PCR로 분석하였다. 둘 모두의 경우, 기대되는 크기(각각 2.4 및 1.8 kb)의 PCR 생성물이 관찰되었다. 주 DURA는 우리딘이 결여된 수크로스 최소 배지 상에서는 성장하지 않았으며, 이는 pyr2 유전자가 이 주에서 파괴됨을 확인해 주는 것이었다.
이 실시예에서 언급된 프라이머들의 서열이 표 1에 기재되어 있다.
[표 1]
Figure pct00003
실시예 2 egl5 유전자의 파괴
티. 레에세이 egl5 유전자는 주형으로서의 티. 레에세이 염색체 DNA 및 프라이머 oEG5_5 및 oEG5_3을 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 증폭시킨 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 SfiI 및 NotI로 절단하고, 동일 효소로 절단한 pF1X 내로 클로닝하여 플라스미드 pF1X(EG5)를 생성하였다. egl5 코딩 영역의 더욱 상류에 위치하는, 티. 레에세이 염색체 DNA의 다른 단편(후에 이를 "반복 영역"으로 칭함)을 프라이머 oEG5R_5 및 oEG5R_3을 사용하여 유사하게 증폭시켰다. 증폭시킨 단편을 SpeI 및 SalI로 절단하고, AvaII 및 XhoI로 절단한 pF1X(EG5) 내로 클로닝하여 플라스미드 pF1X(EG5R)를 생성하였다.
egl5 파괴 카세트의 제작의 마지막 단계는 프라이머 oPYR2_55 및 oPYR2_35와, 주형으로서 사중-결실 티. 레에세이 주(상기)의 염색체 DNA를 사용하여 PCR에 의해 티. 레에세이 pyr2 유전자를 증폭시키고, 증폭시킨 DNA 단편을 XhoI 및 SpeI로 절단하고, 상기 절단한 단편을 XhoI 및 XbaI-절단 pFl(EG5R)과 함께 라이게이션 반응물에서 인큐베이션하는 것이었다. pFIX(EG5RPyr2)로 표기되는 최종 플라스미드는 둘 모두의 pyr2 유전자의 기능성 카피(copy) 및 egl5 5'-반복 영역에 의해 파괴된 티. 레에세이 egl5 유전자를 지녔다 (도 1). 파괴된 유전자(즉, "파괴 카세트")의 DNA 서열을 egl5 및 pyr2 유전자의 공지된 염색체 DNA 서열, 전술한 제작 방법, 및 다수의 제한 엔도뉴클레아제 분석을 기반으로 하여 추정하였다. 이 서열은 도 9(이는 도 9a 및 9b로 이루어짐)에 제공되어 있으며, 본 명세서에서 3으로 표기된다.
상기 파괴 카세트를 주형으로서의 pF1X(EG5RPyr2) 및 프라이머 oEG5f 및 oEG5r를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. PCR 생성물을 이용하여 티. 레에세이 주 DURA (실시예 1에 기재됨)를 형질전환시켜 우리딘 원영양성(prototrophy)을 부여하였다. 염색체 DNA를 다수의 형질전환체로부터 단리하고, 하기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 분석하였다: oEG5R_D1 및 oEG5D_R1, oEG5R_D2 및 oEG5DR2, oEG5R_D2 및 oPYR2U_R2와, oPYR2D_D2 및 oEG5D_R2. 3가지의 형질전환체(즉 DURA ΔEG5 18, DURA ΔEG5 22, 및 DURA ΔEG5 23)는 모든 4가지의 프라이머 쌍을 포함하는 기대되는 크기의 PCR 생성물(즉, 각각 1.2 kb, 1.15 kb, 1.4 kb, 및 1.5 kb; 도 2)을 생성하였다. 이들 3가지의 주를 그의 셀룰라아제 활성의 생화학적 특성에 대하여 선발하였다.
이 실시예에서 언급된 프라이머들의 서열이 표 2에 기재되어 있다.
[표 2]
Figure pct00004
실시예 3. 환원당의 검출을 기반으로 한 티. 레에세이 대조군 및 egl5 결실 주에서의 셀룰로오스 활성
티. 레에세이 주 Quad (대조군으로서), 및 독립적으로 단리한 형질전환체 DURA ΔEG5 18, DURA ΔEG5 22, 및 DURA ΔEG5 23을 탄소 및 에너지 공급원으로서 1.6% 글루코스-소포로스 혼합물을 포함하는 최소 배지를 이용하여 진탕 플라스크에서 28℃에서 6일 동안 성장시켰다. 균사체를 0.22 γm 막을 통한 여과에 의해 분리하고, 배양 상청액을 10 kDa-컷오프(cutoff) 막을 사용하여 한외여과에 의해 약 100배 농축시켰다.
농축시킨 배양 상청액 (100 ㎕)을 물 (100 ㎕)로 희석시키고, 에펜도르프 써모믹서(Eppendorf Thermomixer) R PCR기에서 60℃ 또는 90℃로 60분 동안 가열하였다. 그 후, 가열 처리한 상청액 (10 ㎕)을 96웰 플레이트에서 195 ㎕의 다당류 기질 (0.5% 카르복시메틸 셀룰로오스, 50 mM 시트르산나트륨, pH 5.45)과 혼합하였다. 플레이트를 알루미늄 밀봉 필름으로 덮고, 400 rpm에서 진탕하면서 40℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 셀룰라아제 반응 혼합물의 일부분 (75 ㎕)을 96웰 PCR 플레이트에서 75 ㎕의 DNS 시약(1% 3,5-다이니트로살리실산, 1% NaOH, 0.2% 페놀, 0.05% 메타중아황산나트륨 및 10% 소듐 포타슘 타르트레이트)과 혼합하고, 에펜도르프 써모믹서 R PCR기에서 99℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. DNS를 사용하여 환원당의 양을 측정한다. 생성된 DNS 반응물 (100 ㎕)의 540 nm에서의 흡광도를 투명 바닥 96웰 플레이트에서 측정하였다 (몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices) 스펙트라맥스(SpectraMax) M2 UV 플레이트 판독기). 활성을 방출되는 글루코스 (Glc) 등가물의 농도로 기록하였다 (도 3). A540 판독치를 배경에 대하여 보정하고, 글루코스 표준 곡선으로부터의 글루코스 당량과 상관시켰다 (도 4).
셀룰라아제 활성은 egl5 유전자가 결실된 3가지 티. 레에세이 주 중 어떠한 것에서도 검출되지 않았다. 대조 Quad 주는 90℃에서 가열 처리를 가한 후 그의 원래 셀룰라아제 활성의 대략 1/2을 유지하였다. 3가지의 이중 샘플을 기반으로 한 결과를 표 3에 나타낸다.
다른 기능성 셀룰라아제 유전자(즉 egl5 이외의 것)를 포함하는 티. 레에세이 주로부터의 egl5 유전자의 결실은 세포 물질 중 모든 셀룰라아제 활성이 승온에의 노출에 의해 완전 파괴되는 것을 가능케 함을 당해 실험이 입증한다. 모든 셀룰라아제 활성을 완전 파괴하기 위한 승온의 사용은 티. 레에세이 주로부터의 것이 기능성 egl5 유전자를 포함할 때에는 가능하지 않으며, 그 이유는 EGV 셀룰라아제 유전자 생성물이 열안정성이기 때문이다.
[표 3]
Figure pct00005
실시예 4. 점도 변화를 기반으로 한 셀룰라아제 활성 분석
다당류 기질 [300 mL, 1.0% 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC), 50 mM 시트르산나트륨 (pH 5.45)]을 400 mL 유리 비커에 첨가하고, 초기 점도를 측정하였다 (브룩필드(Brookfield) 점도계 DV-II 프로(Pro), 스핀들(spindle) 62, 10 rpm). 이들 CMC 용액/현탁액에 첨가하기 위한 준비에 있어서, 티. 레에세이 대조군 또는 egl5 결실 주 유래의 농축 배양 상청액 (220 ㎕)을 에펜도르프 써모믹서 R PCR기에서 4℃ 또는 90℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 가열 처리한 상청액들의 일부분들 (100 ㎕)을 CMC 용액/현탁액에 첨가하고, 150 rpm에서 22℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응물들의 최종 점도를 상기와 같이 측정하였다. 그 결과를 표 4 및 도 5에 나타낸다. 활성을 10 rpm에서의, %토크 단위의 로그 변화 배수로서 기록하였다.
상기 CMC 용액/현탁액을 Quad (대조) 주 유래의 배양 상청액과 함께 인큐베이션하면 가열 처리와 관계 없이 점도가 유의하게 감소하였다. 또한 DURA ΔEG5 18 주 유래의 배양 상청액이 CMC 용액/현탁액의 점도의 유의한 감소를 생성하였지만, 90℃에서의 가열 처리 후는 아니었다. 이들 결과는 EGV가 티. 레에세이 세포에 존재하는 유일한 가열-안정성 셀룰라아제이며, 티. 레에세이에서의 egl5 유전자의 결실은 티. 레에세이 배양 상청액에 존재하는 모든 셀룰라아제 효소의 가열 불활성화를 허용함을 시사하였다.
[표 4]
Figure pct00006
실시예 5 egl5 파괴 주로부터의 pyr2 마커의 절제
주 DURA ΔEG5 18, DURA ΔEG5 22, 및 DURA ΔEG5 23을 포자 형성시키고, 포자 현탁액을 우리딘 및 FOA를 보충한 수크로스 최소 배지 상에 도말하였다. 몇 개의 FOA 내성 클론을 상기 3가지 주 각각의 자손으로부터 선발하고, 그의 염색체 DNA를 단리하고, 프라이머 쌍 (i) oEG5FU_D1 및 oEG5D_R1과 (ii) oEG5FU_D2 및 oEG5D_R2 (표 2에 기재된 바와 같음)를 사용하여 PCR로 분석하였다. 대다수의 분석 클론으로부터 수득된 염색체 DNA는 DURA ΔEG5 18, DURA ΔEG5 22, 및 DURA ΔEGS 23의 염색체에서 두 "반복 영역들" 사이의 상동 재조합 후 기대되는 크기(즉, 약 1.6-1.7 kb)의 PCR 생성물을 생성하였다 (도 6).
실시예 6. 셀룰라아제 및 만난아제 활성 분석
하기 분석을 이용하여 하이드로포빈 제제에서의 셀룰라아제 활성 및 만난아제 활성을 측정하였다:
셀룰라아제 분석
셀룰라아제 활성은 100 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.5)에서 기질로서 4-메틸움벨리페리 β-D-셀로바이오사이드(4MUC, 시그마알드리치(SigmaAldrich), M6018)를 사용하여 측정하였다. 표준 셀룰라아제 조성물(즉 EG3 셀룰라아제, 제넨코르(Genencor))을 기준 물질로 사용하였다. 샘플 조성물 (예를 들어, 하이드로포빈-함유 발효 브로쓰) 및 표준 셀룰라아제 조성물의 연속 희석물을 제조하고, 4MUC 시약과 함께, 400 rpm에서 진탕시키면서 플레이트 인큐베이터에서 40℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
형광을 하기 파라미터를 사용하여 스펙트라맥스 형광 플레이트 판독기에서 판독하였다: 여기 = 360 nm, 방출 = 460 nm, 자동 컷오프 = 455 nm. 실험 샘플에 의해 생성된 형광 시그널의 양을 표준 셀룰라아제 조성물에 의해 생성된 형광 시그널의 양과 상관시켰으며, 이를 NPC/mL= 방출된 o-니트로페놀의 μmole/min/mL (셀룰라아제 활성의 표준 척도)로 기록하였다.
만난아제 분석
만난아제 활성은 100 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.5)에서 기질로서 4-메틸움벨리페리릴 β-D-만노피라노사이드(4MUM, 시그마알드리치, M0905)를 사용하여 측정하였다. 표준 만난아제 조성물(제넨코르)을 기준 물질로 사용하였다. 샘플 조성물 (예를 들어, 하이드로포빈-함유 발효 브로쓰) 및 표준 만난아제 조성물의 연속 희석물을 제조하고, 4MUM 시약과 함께, 400 rpm에서 진탕시키면서 플레이트 인큐베이터에서 40℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
형광을 하기 파라미터를 사용하여 스펙트라맥스 형광 플레이트 판독기에서 판독하였다: 여기 = 360 nm, 방출 = 460 nm, 자동 컷오프 = 455 nm. 실험 샘플에 의해 생성된 형광 시그널의 양을 표준 만난아제 조성물에 의해 생성된 형광 시그널의 양과 상관시켰으며, 이를 MU/L = 방출된 o-니트로페놀의 μmole/min/mL로 기록하였다.
기재한 바와 같이 생성한 하이드로포빈의 분석
기재된 바와 같이 생성한 하이드로포빈-함유 발효 브로쓰 조성물에서의 잔존 셀룰라아제 및 만난아제 활성은, 기재된 바와 같이 샘플을 4- 메틸움벨리페릴 β-D-셀로바이오사이드 (셀룰라아제) 또는 4-메틸움벨리페릴 β-D-만노피라노사이드 (만난아제)와 함께 인큐베이션하고, 이들 값을 EG3 셀룰라아제 표준물 또는 만난아제 표준물 (제넨코르)을 사용하여 수득한 것과 비교함으로써 시험하였다. 데이터 (표 5에 나타냄)는 용액 1 mL (또는 L)당 활성 또는 하이드로포빈 1 g당 활성으로 표현한다. 이 발효 브로쓰 조성물에서, 세포를 미세여과에 의해 제거하고, 단백질을 한외여과에 의해 농축시켰지만; 정제 단계를 수행하여 잔존 만난아제 및 셀룰라아제와 같은 다른 단백질에 대한 하이드로포빈의 비를 변경시키는 것은 하지 않았다.
[표 5]
Figure pct00007
상기 표에 나타낸 바와 같이, 잔존 만난아제 활성, 그리고 특히 셀룰라아제의 수준은 가열 처리 후 유의하게 감소하였다.
실시예 7. egl5 -결실된 주에서의 HFB2 의 발현
pTrex8R(Hfb2) 및 pTrex3gM(Hfb2)의 제작
두 벡터는 둘 모두 강력한 cbhI 프로모터의 제어 하에 그의 천연 코딩 서열로부터의 HFB2의 발현을 구동하도록 디자인하였다. 상기 두 벡터의 발현 카세트는 동일하며, 이들 두 분자 사이의 유일한 차이는 pTrex3gM(Hfb2)이 선발가능 마커로서 amdS 유전자를 갖는 반면 pTrex8R(Hfb2)는 pyr2를 갖는다는 것이다. 둘 모두의 벡터는 데스티네이션 벡터(destination vector) pTrex3gM 및 pTrex8R와, pENTR TOPO/D 벡터에 클로닝된 hfb2 유전자의 염색체 카피를 사용하여 LR-게이트웨이(Gateway)(등록상표) 클로닝 절차에 의해 제작하였다. 표 6은 플라스미드 pTrex8R(hfb2) 및 pTrex3gM(hfb2)에서의 기능성 요소의 전 목록을 제공한다. 표 6에 열거되지 않은 임의의 서열은 LR-게이트웨이(등록상표) 반응에 의해 생성된 서열 또는 제한효소 부위와 같이 유전자 엔지니어링 목적에 사용되는 DNA의 짧은 단편이다. 플라스미드 pTrex8R(Hfb2) 및 pTrex3gM(Hfb2)의 기능성 제한효소 지도 및 부분적 제한효소 지도가 도 12에 제공되어 있다. 이들의 전 뉴클레오티드 서열이 도 13에 열거되어 있다.
[표 3]
Figure pct00008
HFB2 발현 카세트를 이용한 티. 레에세이 DUD5 의 형질전환
형질전환을 연속적인 두 단계로 행하였다. 첫째, 주 DUD5는 표준 원형질체(protoplast) 형질전환 기술을 이용하여 우리딘 원영양성이 되도록 플라스미드 pTrex8R(hfb2)의 단리된 큰 SfiI 단편으로 형질전환시켰다. HFB2의 고수준의 발현에 대하여 랜덤 세트의 형질전환체의 배양 배지를 스크리닝한 후 3개의 클론(DUD5 HFB#176, #194 및 #228)을 선발하였다. 이들 단리체를 아세트아미드 동화 표현형이 되도록 플라스미드 pTrex3gM(hfb2)의 큰 SfiI 단편으로 추가로 형질전환시켰다. (또한, cbhI 프로모터를 유도하는 조건 하에 액체 배양으로 개개의 형질전환체를 성장시키고 배양 배지를 SDS PAGE에 의해 분석함으로써) 두 번째 라운드의 스크리닝을 한 후, 클론 DUD5 HFB2 B, DUD5 HFB2 D, DUD5 HFB2 K 및 DUD5 HFB2 N을 최상의 HFB2 생산자로서 선발하였다.
본 발명을 하기의 넘버링된 단락에 의해 추가로 설명한다:
1. 열안정성 EGV 폴리펩티드의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하도록 변형된 트리코데르마 숙주 세포.
2. 파괴된 egl5 유전자를 포함하는, 단락 1의 트리코데르마 숙주 세포.
3. 결실된 egl5 유전자를 포함하는, 단락 1 또는 2의 트리코데르마 숙주 세포.
4. egl5 유전자가 상동 재조합에 의해 결실된, 전술한 단락들 중 임의의 것의 트리코데르마 숙주 세포.
5. 기능성 egl5 유전자를 포함하는 모 숙주 세포의 변형에 의해 생성된, 전술한 단락들 중 임의의 것의 트리코데르마 숙주 세포.
6. 열불안정성 효소를 코딩하는 하나 이상의 내인성 기능성 유전자를 추가로 포함하는, 전술한 단락들 중 임의의 것의 트리코데르마 숙주 세포.
7. 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 열불안정성 효소를 코딩하는 하나 이상의 기능성 유전자를 추가로 포함하는, 전술한 단락들 중 임의의 것의 트리코데르마 숙주 세포.
8. 열불안정성 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제를 코딩하는 기능성 유전자를 추가로 포함하는, 전술한 단락들 중 임의의 것의 트리코데르마 숙주 세포.
9. 관심대상의 기능성 유전자를 추가로 포함하는, 전술한 단락들 중 임의의 것의 트리코데르마 숙주 세포.
10. 관심대상의 유전자는 열안정성 폴리펩티드를 코딩하는, 단락 9의 트리코데르마 숙주 세포.
11. 열안정성 폴리펩티드는 하이드로포빈인, 단락 10의 트리코데르마 숙주 세포.
12. 트리코데르마 숙주 세포에서 관심대상의 열안정성 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
파괴된 egl5 유전자와, 추가의 기능성 단백질을 코딩하는 하나 이상의 내인성 유전자를 갖는 트리코데르마 숙주 세포 내로 관심대상의 열안정성 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하는 단계;
관심대상의 단백질 및 추가의 기능성 단백질을 생성하기에 적합한 배지에서 상기 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
관심대상의 단백질 및 추가의 기능성 단백질에, 상기 추가의 단백질을 사실상 불활성화시키기에 충분한 승온을 가하는 단계를 포함하고;
여기서 상기 승온은 관심대상의 열안정성 단백질을 불활성화시키기에는 불충분하며 기능성 egl5 유전자에 의해 생성된 EGV 셀룰라아제를 불활성화시키기에 불충분할 것이고;
관심대상의 열안정성 단백질은 사실상 상기 추가의 단백질로부터의 활성의 부재 하에 활성 또는 기능성 형태로 생성되는, 방법.
13. 트리코데르마 숙주 세포에서 관심대상의 열안정성 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자, 파괴된 egl5 유전자, 및 하나 이상의 추가의 기능성 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자들을 포함하는 트리코데르마 숙주 세포에서 관심대상의 열안정성 단백질 및 하나 이상의 추가의 기능성 단백질을 생성하는 단계;
상기 하나 이상의 추가의 기능성 단백질을 사실상 불활성화시키기에는 충분하지만 열안정성의 관심대상의 단백질 및 기능성 egl5 유전자에 의해 생성되는 EGV 셀룰라아제를 불활성화시키기에는 불충분한 승온을 상기 숙주 세포로부터 수득된 단백질 혼합물에 가하는 단계를 포함하며;
여기서 관심대상의 열안정성 단백질은 사실상 상기 추가의 기능성 단백질로부터의 활성의 부재 하에 활성 또는 기능성 형태로 생성되는, 방법.
14. 트리코데르마 숙주 세포에서 관심대상의 열안정성 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 관심대상의 열안정성 단백질을 코딩하는 유전자, 파괴된 egl5 유전자, 및 추가의 기능성 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 트리코데르마 숙주 세포로부터 수득된 단백질 혼합물에 승온을 가하여 상기 하나 이상의 추가의 기능성 단백질을 불활성화시키고, 이럼으로써 관심대상의 열안정성 단백질을 상기 추가의 기능성 단백질로부터의 활성의 부재 하에 활성 또는 기능성 형태로 생성하게 되는 단계를 포함하는, 방법.
15. egl5 유전자는 egl5 유전자를 자연적으로 포함하는 숙주 세포에서 파괴된, 단락 12 내지 14 중 임의의 것의 방법.
16. egl5 유전자는 egl5 유전자를 자연적으로 포함하는 숙주 세포에서 결실된, 단락 12 내지 15 중 임의의 것의 방법.
17. egl5 유전자는 상동 재조합에 의해 결실된, 단락 12 내지 16 중 임의의 것의 방법.
18. 상기 하나 이상의 추가의 단백질은 열불안정성 단백질인, 단락 12 내지 17 중 임의의 것의 방법.
19. 상기 하나 이상의 추가의 단백질은 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단락 12 내지 18 중 임의의 것의 방법.
20. 상기 하나 이상의 추가의 단백질은 엑소-셀로바이오하이드롤라아제, 엔도글루카나아제 및 β- 글루코시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단락 12 내지 18 중 임의의 것의 방법.
21. 관심대상의 단백질은 가역적으로 열변성가능하기 때문에 열안정성인, 단락 12 내지 20 중 임의의 것의 방법.
22. 관심대상의 단백질은 하이드로포빈인, 단락 12 내지 20 중 임의의 것의 방법.
23. 승온은 90℃ 이상의 온도인, 단락 12 내지 22 중 임의의 것의 방법.
24. 승온에의 노출은 약 5분 이상의 시간 동안인, 단락 12 내지 23 중 임의의 것의 방법.
25. 승온에의 노출은 약 60분 이상의 시간 동안인, 단락 12 내지 23 중 임의의 것의 방법.
26. 단락 12 내지 25 중 임의의 것의 방법에 의해 생성된 열안정성 또는 가역적 열변성가능 단백질.
27. 사상균 숙주 세포로부터 수득되며 하이드로포빈 폴리펩티드를 포함하는 발효 브로쓰 조성물로서, 상기 발효 브로쓰에는 셀룰라아제 및/또는 만난아제 활성이 사실상 없는, 발효 브로쓰 조성물.
28. 하이드로포빈 폴리펩티드는 열불안정성 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드의 존재 하에 생성되며, 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 불활성화시키기 위하여 승온이 가해지는, 단락 27의 발효 브로쓰 조성물.
29. 하이드로포빈 폴리펩티드는 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 숙주 세포에서 생성되는, 단락 27의 발효 브로쓰 조성물.
30. 하이드로포빈 폴리펩티드는 셀룰라아제 및/또는 만난아제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 결여된 숙주 세포에서 생성되는, 단락 27의 발효 브로쓰 조성물.
* * *
이와 같이 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 상세하게 설명하였지만, 상기 단락들에 의해 정의된 본 발명은 상기 설명에 개시된 특정한 상술에 한정되지 않으며 그 이유는 그의 많은 분명한 변화가 본 발명의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고서 가능하기 때문임을 이해하여야 한다.
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Miasnikov, Andrei Schelle, Michael Ward, Michael <120> Thermostable Trichoderma Cellulase <130> 43064.99.2053 <140> PCT/US2011/056810 <141> 2011-10-19 <150> US 61/394,946 <151> 2010-10-20 <150> EP 10188285.0 <151> 2010-10-20 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3551 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 1 agcttggggt ggtggccaat cagcggccgc agcgggggcg ggagctggtg gcggcgatat 60 gaatttccgg gcgttgctac aacaggtacc actttgacca cccatggctg ccgtcgccct 120 gcttggagct ttcaggtcgc ttccgggcgt tggcgaggca agttggacgg tggggaaatg 180 acgaaaaatg gtgcatcgcc tttgtaggtg tgtgtgagta gtagttctac tatgaggtac 240 gtatgtagca gaaggatcga gctagaatct gccggcattg caaaggttat ctggaaagag 300 gaaaagggcc tgaaccggca tatggatgca ttcttcgtac gaactactat ctgataacag 360 ttaggtactg ttatccatac aaagagtctt atagaaacac tgcatcgtaa taaaatactc 420 ggtagctgct tgaatatagt aataagatca acatcctttc acctctagtc tccgtggatt 480 ccagtaaaag cgctcaattc tgacttccga ctctgttgat gccccgtgtc tgcccatcgg 540 ggtggtctag 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1380 gttgctgtaa acctgaagcg ttgaccctgg caatagcctg ttgctataaa cctgaggcgt 1440 tgaccctggc aatagcctgt tgttcatttg cccctggcgt tgcaagccgc gtacaactgc 1500 ccttttacct agtctcgagt ttataagtga caacatgctc tcaaagcgct catggctggc 1560 acaagcctgg aaagaaccaa cacaaagcat actgcagcaa atcagctgaa ttcgtcacca 1620 attaagtgaa catcaacctg aaggcagagt atgaggccag aagcacatct ggatcgcaga 1680 tcatggattg cccctcttgt tgaagatgag aatctagaaa gatggcgggg tatgagataa 1740 gagcgatggg ggggcacatc atcttccaag acaaacaacc tttgcagagt caggcaattt 1800 ttcgtataag agcaggagga gggagtccag tcatttcatc agcggtaaaa tcactctaga 1860 caatcttcaa gatgagttct gccttgggtg acttatagcc atcatcatac ctagacagaa 1920 gcttgtggga tactaagacc aacgtacaag ctcgcactgt acgctttgac ttccatgtga 1980 aaactcgata cggcgcgcct ctaaatttta tagctcaacc actccaatcc aacctctgca 2040 tccctctcac tcgtcctgat ctactgttca aatcagagaa taaggacact atccaaatcc 2100 aacagaatgg ctaccacctc ccagctgcct gcctacaagc aggacttcct caaatccgcc 2160 atcgacggcg gcgtcctcaa gtttggcagc ttcgagctca agtccaagcg gatatccccc 2220 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ttccggcgtc agtctgatct gcctatttaa tcaggtcagt caatatgtat ccagagataa 1020 taaattatgt atattatagc agtactgtat cattgctgct gtctgcctga cttcaatgct 1080 gcttccccta ttctcgttgc agtagcgttg gcgatatggg gcag 1124 <210> 33 <211> 242 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 33 Met Lys Ala Thr Leu Val Leu Gly Ser Leu Ile Val Gly Ala Val Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Lys Ala Thr Thr Thr Arg Tyr Tyr Asp Gly Gln Glu Gly Ala 20 25 30 Cys Gly Cys Gly Ser Ser Ser Gly Ala Phe Pro Trp Gln Leu Gly Ile 35 40 45 Gly Asn Gly Val Tyr Thr Ala Ala Gly Ser Gln Ala Leu Phe Asp Thr 50 55 60 Ala Gly Ala Ser Trp Cys Gly Ala Gly Cys Gly Lys Cys Tyr Gln Leu 65 70 75 80 Thr Ser Thr Gly Gln Ala Pro Cys Ser Ser Cys Gly Thr Gly Gly Ala 85 90 95 Ala Gly Gln Ser Ile Ile Val Met Val Thr Asn Leu Cys Pro Asn Asn 100 105 110 Gly Asn Ala Gln Trp Cys Pro Val Val Gly Gly Thr Asn Gln Tyr Gly 115 120 125 Tyr Ser Tyr His Phe Asp Ile Met Ala Gln Asn Glu Ile Phe Gly Asp 130 135 140 Asn Val Val Val Asp Phe Glu Pro Ile Ala Cys Pro Gly Gln Ala Ala 145 150 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tgggtgtaca tgtttgtgct ccgggcaaat gcaaagtgtg gtaggatcga acacactgct 2940 gcctttacca agcagctgag ggtatgtgat aggcaaatgt tcaggggcca ctgcatggtt 3000 tcgaatagaa agagaagctt agccaagaac aatagccgat aaagatagcc tcattaaacg 3060 gaatgagcta gtaggcaaag tcagcgaatg tgtatatata aaggttcgag gtccgtgcct 3120 ccctcatgct ctccccatct actcatcaac tcagatcctc caggagactt gtacaccatc 3180 ttttgaggca cagaaaccca atagtcaacc atcacaagtt tgtacaaaaa agcaggctcc 3240 gcggccgccc ccttcaccaa gatgcagttc ttcgccgtcg ccctcttcgc caccagcgcc 3300 ctggctgctg tctgccctac cggcctcttc tccaaccctc tgtgctgtgc caccaacgtc 3360 ctcgacctca ttggcgttga ctgcaagacc cgtatgttga attccaatct ctgggcatcc 3420 tgacattgga cgatacagtt gacttacacg atgctttaca gctaccatcg ccgtcgacac 3480 tggcgccatc ttccaggctc actgtgccag caagggctcc aagcctcttt gctgcgttgc 3540 tcccgtggta agtagtgctc gcaatggcaa agaagtaaaa agacatttgg gcctgggatc 3600 gctaactctt gatatcaagg ccgaccaggc tctcctgtgc cagaaggcca tcggcacctt 3660 ctaaagcaat ggcttgcttt actgccggca gtctttgaga actaagggtg ggcgcgccga 3720 cccagctttc ttgtacaaag tggtgatcgc gccagctccg tgcgaaagcc tgacgcaccg 3780 gtagattctt ggtgagcccg tatcatgacg gcggcgggag ctacatggcc ccgggtgatt 3840 tatttttttt gtatctactt ctgacccttt tcaaatatac ggtcaactca tctttcactg 3900 gagatgcggc ctgcttggta ttgcgatgtt gtcagcttgg caaattgtgg ctttcgaaaa 3960 cacaaaacga ttccttagta gccatgcatt ttaagataac ggaatagaag aaagaggaaa 4020 ttaaaaaaaa aaaaaaaaca aacatcccgt tcataacccg tagaatcgcc gctcttcggc 4080 tagctagtta cgcttgttta tttacgacaa gatctagaag attcgagata gaataataat 4140 aataacaaca atttgcctct tctttccacc ttttcagtct tactctccct tctgacattg 4200 aacgcctcaa tcagtcagtc gccttgtact tggcacggta atcctccgtg ttcttgatat 4260 cctcaggggt agcaaagccc ttcatgccat cgataatgtc atccagagtg aggatggcaa 4320 agatggggat gccgtactcc ttcctcagct cgccaatggc actcggtcca ggcttggagt 4380 cgtcgccatc cgcagcgggg agcttctcca tgcggtccag ggccacgacg atgccggcga 4440 cgatgccgcc ctccttggtg atcttctcaa tggcgtccct cttggcggtg ccggcggtga 4500 tgacgtcgtc gacaatcagg accctcttgc ccttgagcga agcgccgacg atgttgccgc 4560 cctcgccgtg gtccttggcc tccttgcggt caaacgagta 4600

Claims (37)

  1. 트리코데르마(Trichoderma) 숙주 세포에 의한 열안정성 엔도글루카나아제 V (endoglucananse V; EGV)의 생성을 사실상 감소시키거나 또는 방지하는 변형, 및
    프로모터에 작동가능하게 연결되고 이에 의해 적어도 하나의 내인성 폴리펩티드 및 관심대상의 폴리펩티드를 트리코데르마 숙주 세포에 의해 생체 내에서 각각 발현시키는, 관심대상의 폴리펩티드를 코딩하는 관심대상의 외인성 핵산 분자를 포함하는 트리코데르마 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변형은 EGV의 발현에 연루된 뉴클레오티드의 하나 이상의 결실 또는 파괴를 포함하는 트리코데르마 숙주 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 파괴 또는 결실은 EGV를 코딩하는 유전자 또는 EGV의 코딩 영역 또는 EGV의 발현을 위한 프로모터 또는 조절 요소의 결실 또는 파괴를 포함하는 트리코데르마 숙주 세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 결실 또는 파괴는 egl5의 결실 또는 파괴를 포함하는 트리코데르마 숙주 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 결실 또는 파괴는 egl5 파괴를 포함하는 트리코데르마 숙주 세포.
  6. 제4항에 있어서, 상기 결실 또는 파괴는 egl5 결실을 포함하는 트리코데르마 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, egl5는 상동 재조합에 의해 결실되는 트리코데르마 숙주 세포.
  8. 제1항에 있어서, 내인성 폴리펩티드는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 프로테아제 또는 그 조합을 포함하는 트리코데르마 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 열불안정성 효소는 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제를 포함하는 트리코데르마 숙주 세포.
  10. 제1항에 있어서, 티. 레에세이(T. reesei)인 트리코데르마 숙주 세포.
  11. 제1항에 있어서, 관심대상의 폴리펩티드는 하이드로포빈 II인 트리코데르마 숙주 세포.
  12. 제10항에 있어서, 관심대상의 폴리펩티드는 하이드로포빈 II인 트리코데르마 숙주 세포.
  13. 제1항에 있어서, 관심대상의 폴리펩티드는 열안정성인 트리코데르마 숙주 세포.
  14. 제1항에 있어서, 관심대상의 폴리펩티드는 열민감성 또는 열불안정성인 트리코데르마 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 변형 트리코데르마 숙주 세포에서 관심대상의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,
    상기 관심대상의 폴리펩티드는 열안정성이며,
    상기 방법은
    변형 숙주 세포가 관심대상의 열안정성 폴리펩티드 및 내인성 폴리펩티드를 생성하기에 적합한 배지에서 변형 숙주 세포를 인큐베이션하고, 이에 의해 각각의 내인성 폴리펩티드 및 관심대상의 열안정성 폴리펩티드를 각각 변형 숙주 세포에 의해 발현시키는 단계; 및
    관심대상의 열안정성 폴리펩티드 및 내인성 폴리펩티드에 승온을 가하는 단계를 포함하고,
    상기 승온은 내인성 폴리펩티드를 사실상 불활성화시키기에 충분하지만 관심대상의 열안정성 폴리펩티드 및 존재할 경우 EGV를 불활성화시키기에는 불충분하며;
    이에 의해 관심대상의 열안정성 폴리펩티드를 사실상 내인성 폴리펩티드로부터의 활성의 부재 하에 활성 또는 기능성 형태로 생성하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 관심대상의 폴리펩티드 및 내인성 폴리펩티드에 승온을 가하는 단계 이전에 변형 트리코데르마 숙주 세포로부터 단백질 혼합물을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 변형 숙주 세포는 엑소-셀로바이오하이드롤라아제, 엔도글루카나아제, β-글루코시다아제 또는 그 조합을 발현하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 관심대상의 열안정성 폴리펩티드는 가역적으로 열변성가능한 방법.
  19. 제15항에 있어서, 승온은 약 90℃ 이상의 온도인 방법.
  20. 제15항에 있어서, 승온에의 노출은 약 5분 이상의 시간 동안인 방법.
  21. 제15항에 있어서, 승온에의 노출은 약 60분 이상의 시간 동안인 방법.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 변형 트리코데르마 숙주 세포에 의해 발현되는 관심대상의 폴리펩티드의 활성을 제어하는 방법으로서, 상기 관심대상의 폴리펩티드는 열민감성 또는 열불안정성이며, 상기 방법은 관심대상의 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드 및 내인성 폴리펩티드에 승온을 가하는 단계를 포함하고,
    상기 승온은 내인성 폴리펩티드 및 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드를 불활성화시키기에 충분한 방법.
  23. 제22항에 있어서, 내인성 폴리펩티드는 셀룰라아제인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 관심대상의 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드에 승온을 가하기 이전에 관심대상의 폴리펩티드를 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 관심대상의 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드에 승온을 가하기 이전에 관심대상의 폴리펩티드를 셀룰로오스 및 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 하나 이상의 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 사상균 숙주 세포로부터 수득되거나 또는 수득가능하고 하이드로포빈 II를 포함하는 발효 브로쓰(broth) 조성물로서, 상기 발효 브로쓰에는 셀룰라아제 및/또는 만난아제 활성이 사실상 없으며, 하이드로포빈 II는 제11항 또는 제12항에 따른 변형 트리코데르마 숙주 세포에서 생성되는 발효 브로쓰 조성물.
  27. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 변형 트리코데르마로부터 수득되거나 또는 수득가능한 발효 브로쓰 조성물.
  28. 제27항의 발효 브로쓰에서 관심대상의 폴리펩티드의 활성을 제어하는 방법으로서, 상기 관심대상의 폴리펩티드는 열민감성 또는 열불안정성이며, 상기 방법은 내인성 폴리펩티드 및 열민감성 또는 열불안정성 폴리펩티드를 불활성화시키기에 충분한 승온을 발효 브로쓰에 가하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 내인성 폴리펩티드는 셀룰라아제인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 발효 브로쓰에 승온을 가하기 이전에 발효 브로쓰를 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 관심대상의 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 발효 브로쓰에 승온을 가하기 이전에 발효 브로쓰를 셀룰라아제 및 관심대상의 폴리펩티드가 작용하는 하나 이상의 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 변형 트리코데르마 숙주 세포로부터 수득되는 조성물에 존재하는 셀룰라아제의 활성을 제어하는 방법으로서, 조성물은 EGV 이외의 적어도 하나의 셀룰라아제 효소를 포함하며, 상기 방법은 관심대상의 폴리펩티드를 불활성화시키기에 충분한 승온을 조성물에 가하는 단계를 포함하고, 조성물에 승온을 가한 후 조성물에는 셀룰라아제 활성이 사실상 없는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 관심대상의 폴리펩티드는 열민감성 또는 열불안정성인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 관심대상의 폴리펩티드는 내열성 또는 열안정성인 방법.
  35. 제32항에 있어서, 조성물에 승온을 가하는 것을 식료품 또는 음료에서 수행하는 방법.
  36. 제32항에 있어서, 승온은 약 100℃ 미만인 방법.
  37. 제32항에 있어서, 변형 트리코데르마 숙주 세포로부터 수득되는 조성물은 하이드로포빈-함유 발효 브로쓰인 방법.
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