CN113966390A - 岩藻糖基化低聚糖在芽孢杆菌属中的生产 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了用于生产岩藻糖基化低聚糖的非孢子形成的芽孢杆菌属细胞以及用于生产岩藻糖基化低聚糖的方法，其中所述芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以具有乳糖通透酶、GDP‑岩藻糖生物合成途径和岩藻糖基转移酶。
Description
本发明涉及遗传工程的技术领域，特别涉及用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞的遗传工程，并涉及使用所述经遗传工程化的芽孢杆菌属细胞的岩藻糖基化低聚糖的微生物生产。
背景技术
人母乳对婴儿具有最佳的营养特性。人母乳中存在的糖类代表人乳的主要成分，排在脂肪和蛋白质之前。除了作为能量来源的乳糖外，人母乳还含有约5至25克/升的复合糖分子，即低聚糖。这些低聚糖仅在人乳中以显著浓度存在，它们统称为人乳低聚糖(HMO)。
迄今为止已经鉴定出大约200个结构上不同的HMO。所述HMO是基于二糖乳糖(由葡萄糖(Glc)部分和半乳糖(Gal)部分组成)，并具有基于N-乙酰基-葡糖胺(GlcNAc)、岩藻糖(Fuc)、唾液酸(NeuNAc)和半乳糖(Gal)的额外的单糖残基。人乳中HMO的浓度和组成随个体而变化，并且在哺乳期间从初乳中的最多达20g/L至成熟乳汁中的5-10g/L。
属于所谓“分泌者表型”的妇女的乳含有较高含量的α-1,2-岩藻糖基化HMO。这些妇女表达编码所谓的“岩藻糖基转移酶2”的FUT2基因。在她们的乳中最丰富的HMO是2’-岩藻糖基-乳糖(2’-FL；Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc)和乳-N-岩藻戊糖-I(LNPF-I；Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)。
人乳低聚糖在其穿过婴儿肠道时不被消化。由于它们持续存在于婴儿肠道中，它们表现出有益的效果。更具体地说，HMO已被证明是益生元，因为它们是双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)和乳杆菌属(Lactobacillus)的共生微生物的碳源。因此，HMO支持这些微生物在婴儿肠道中的增殖。
人乳低聚糖还直接减少了病原体在婴儿肠道中的定殖，因为它们阻止了所述病原体粘附在肠粘膜表面的聚糖结构上。HMO由于其与上皮表面聚糖的结构相似性而发挥诱饵的功能并抑制病原体的入侵，从而降低感染的风险。
α-1,2-岩藻糖基化HMO已被证明具有针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(最常见的细菌性腹泻的病原体)感染的保护作用。α-1,2-岩藻糖基化HMO还与针对大肠杆菌(Escherichia coli)耐热毒素引起的腹泻的保护作用有关。此外，母乳中较高含量的α-1,2-岩藻糖基化HMO降低了介导腹泻的嵌杯样病毒(calicivirus)的感染风险。HMO，尤其是岩藻糖基化HMO乳-N-岩藻戊糖V(LNFP-V；Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)[Fucα1-3]Glc)，结合艰难梭菌(Clostridium difficile)(医院腹泻最常见病因)毒素A的碳水化合物结合位点。因此，HMO似乎阻止了艰难梭菌毒素A与细胞受体的相互作用。
此外，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)对上皮细胞的粘附受到2’-FL和3-岩藻糖基乳糖(3-FL；Gal(β1-4)[Fucα1-3]Glc)的显著抑制。α-1,2-岩藻糖基化HMO和α-1,3-岩藻糖基化HMO阻止了诺如病毒(诺瓦克样病毒，NLV)(急性胃肠炎主要病因)与组织血型抗原的结合。这表明这些HMO抑制诺如病毒衣壳结合宿主受体聚糖的潜力。
由于HMO的已知益处，特别是岩藻糖基化HMO的已知益处，人们需要有一种具有经济价值的HMO合成方法，以使得这些低聚糖或这些低聚糖中的至少一些可用作婴儿配方物的补充剂。
由于供应有限且难以获得单个人乳低聚糖的纯级分，开发了合成这些复杂分子中的一些的化学途径。然而，化学合成和生物催化方法都没有被证明是商业上可持续的。此外，特别是人乳低聚糖的化学合成涉及几种有害化学品的使用，这带来了污染最终产品的风险。
由于人乳低聚糖的化学合成所涉及的挑战，开发了用于生产HMO的发酵方法。如今，已经公开了主要使用经遗传工程化的大肠杆菌菌株进行的几种HMO(例如2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻戊糖I、乳-N-二岩藻己糖II、3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖)的微生物生产。
迄今为止，重组大肠杆菌细胞被用于工业规模的HMO的微生物生产。然而，大肠杆菌属包括致病成员和非致病成员。尽管非致病大肠杆菌菌株被用于HMO的微生物生产，但在许多司法管辖区(jurisdictions)，此类非致病大肠杆菌未被认为可安全用于生产意欲用于人食用的产品。因此，需要在此类司法管辖区内被认为是安全的属的微生物细胞，以用于生产意欲用于人食用的化合物，以获得所述产品在所述司法管辖区内用于其商业化的监管批准。
通过使用芽孢杆菌属的细菌细胞解决了该问题，所述芽孢杆菌属的细菌细胞被认为可安全用于人食用，并且能够产生岩藻糖基化低聚糖。
芽孢杆菌属细菌是需氧或兼性厌氧物种的革兰氏阳性、杆状、形成内生孢子的微生物细胞。芽孢杆菌属属于厚壁菌门(Firmicutes)。芽孢杆菌属成员的基因组在其密码子使用上偏向A-T碱基对。芽孢杆菌属种在自然界中几乎无处不在。例如，它们可以存在于土壤中(枯草芽孢杆菌(B.subtilis))，但也可以存在于极端环境中，如高pH(嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus))、高温(嗜热芽孢杆菌(B.thermophilus))或高盐(耐盐芽孢杆菌(B.halodurans))。
芽孢杆菌属包括266个已命名的种，其包括自由生活的种和寄生致病的种。两个芽孢杆菌的种被认为具有医学意义：引起炭疽的炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)和引起食物中毒的蜡样芽孢杆菌(B.cereus)。第三个种苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，是一种重要的昆虫病原体，能产生杀死昆虫的毒素。因此，它被用作杀虫剂来防治害虫。
由于其GRAS(公认安全的)状态，几种芽孢杆菌属种，如解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和枯草芽孢杆菌，被用于食品和制药工业中使用的多种蛋白质和化合物的生物技术生产。
解淀粉芽孢杆菌是限制性酶BamHI的来源，还合成天然抗生素蛋白barnase。此外，解淀粉芽孢杆菌产生植物唑菌素(plantazolicin)，一种对炭疽芽孢杆菌具有选择性活性的抗生素。解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶常用于淀粉水解。解淀粉芽孢杆菌也是枯草杆菌蛋白酶的来源，其催化蛋白质的分解。
解淀粉芽孢杆菌是一种根定殖细菌，其用于对抗农业、水产养殖和水培中的一些植物根病原体，因为它对细菌和真菌病原体起作用，并且可以通过竞争性排斥或在竞争中战胜不需要的病原体来防止感染。
地衣芽孢杆菌的高的分泌碱性丝氨酸蛋白酶的能力，使其成为工业酶生产中最重要的细菌之一。地衣芽孢杆菌分泌的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg被用作洗涤剂蛋白酶，并以商品名
出售。
枯草芽孢杆菌是一种过氧化氢酶阳性细菌，存在于土壤以及反刍动物和人的胃肠道中。不同的权威机构已经评估了枯草芽孢杆菌和来源于这种无内毒素细菌的物质在食品中的安全和有益使用。在美国，来自枯草芽孢杆菌的糖酶和蛋白酶被美国食品与安全监督管理局(FDA)认为是公认安全的(GRAS)。枯草芽孢杆菌也被欧洲食品安全局授予“安全资格认定(Qualified Presumption of Safety)”地位。
此外，枯草芽孢杆菌菌株的非产毒性和非致病性菌株通常用于食品中。例如，在日本通常食用的纳豆形式的发酵大豆每克含有多达108个活的枯草芽孢杆菌细胞。发酵豆类因其对健康肠道菌群和维生素K2摄入量的贡献而得到认可。纳豆产品和作为其主要成分的枯草芽孢杆菌纳豆变种(B.subtilis var.natto)，是日本厚生劳动省(Japanese Ministryof Health,Labor and Welfare)批准的FOSHU(特定保健用途食品)，可有效保持健康。
枯草芽孢杆菌易于处理，生长迅速，培养条件简单。重组枯草芽孢杆菌菌株被用于生产聚羟基链烷醇酯、透明质酸和多种酶，如淀粉酶和蛋白酶。
与经过诱变和选择的驯化过程的实验室菌株相比，枯草芽孢杆菌的野生型天然分离株很难使用。这些驯化的菌株通常具有提高的能力，以经历自然感受态发育(吸收和整合环境DNA)、生长和丧失“在野外”所需的能力。在枯草芽孢杆菌中，线性DNA和多聚体形式的质粒DNA被自然感受态细胞主动吸收。
在某些生理条件下，枯草芽孢杆菌细胞的一个小亚群变为感受态。在枯草芽孢杆菌中，自然感受态由复杂的调节网络调控。该网络中的关键调节子尤其是感受态ComK的主调节子和孢子形成Spo0A的转录主调节子。可通过遗传工程提高枯草芽孢杆菌细胞的转化效率，并可能提高将DNA整合到其基因组中的效率。这可以通过将表达盒异位整合到枯草芽孢杆菌的基因组中来实现，所述表达盒包含调节启动子(例如甘露醇诱导型PmtlA启动子)以及基因comK和comS。此外，该策略允许使用复合培养基(例如LB)通过自然感受态转化枯草芽孢杆菌。
为了生产岩藻糖基化糖，可以通过多种方法对枯草芽孢杆菌进行遗传修饰。
可以通过同源重组实现基因整合和/或(同时)通过破坏或缺失进行的基因失活。为了进行有效的同源重组，枯草芽孢杆菌中需要至少400-500bp的同源臂。
靶向基因组工程化的另一种方法是现代CRISPR-Cas9系统。这种快速、无标记的基因组编辑工具可用于大规模基因组缺失、小和大DNA插入、通过引入终止密码子以及引入点突变进行的基因沉默。通过CRISPR-Cas9进行的无痕基因组编辑，不需要先前的基因组修饰。
基因的随机染色体整合和插入诱变可以使用修饰的水手衍生转座子进行。该系统不偏好枯草芽孢杆菌中的热点(hotpot)，但在随机异位整合中表现出高效率。
尽管芽孢杆菌属种用于酶的工业规模生产，但迄今为止尚未将芽孢杆菌属细胞用于低聚糖(特别是岩藻糖基化低聚糖)的工业规模生产。
中国专利申请CN108410787A公开了合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌细胞。所述重组枯草芽孢杆菌细胞具有已整合到细胞基因组中的乳糖通透酶基因。此外，所述芽孢杆菌属细胞携带包含β-1,3-N-葡糖胺转移酶基因和β-1,4-半乳糖基转移酶基因的质粒。枯草芽孢杆菌细胞可在外源乳糖的存在下培养，并以最多达约1g/L的效价合成乳酰-N-新四糖，这对于经济上合理的工业规模生产来说太少了。
尽管许多专利申请提及芽孢杆菌属为适合于生产低聚糖如乳-N-新四糖的属，但尚未实现将芽孢杆菌属用于生产岩藻糖基化低聚糖(特别是岩藻糖基化人乳低聚糖)的商业应用，这大概是因为在芽孢杆菌属中实现用于HMO生产所必需的生物合成途径需要代谢工程上的大量努力。然而上述用于生产LNnT的枯草芽孢杆菌依赖于天然存在于枯草芽孢杆菌细胞中的供体底物，在芽孢杆菌属中生产岩藻糖基化低聚糖需要在细胞中实现异源代谢途径以提供所需的供体底物GDP-岩藻糖。
中国专利申请CN109735479A公开了一种用于合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌细胞，其中乳糖转运酶的表达被增强，并且该细胞表达岩藻糖激酶、磷酸鸟嘌呤转移酶和岩藻糖基转移酶。据报道，发酵培养基中2’-岩藻糖基乳糖的产量在0.424g/L至1.042g/L之间。
尽管如此，本发明的一个目的是提供用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属的细菌细胞。
通过提供一种芽孢杆菌细属胞实现了该目的，所述芽孢杆菌属细胞具有用于将外源乳糖输入细胞的乳糖通透酶、用于提供GDP-岩藻糖的从头(de novo)GDP-岩藻糖生物合成途径和用于将岩藻糖部分从GDP-岩藻糖转移至乳糖的岩藻糖基转移酶。可以在外源乳糖的存在下培养所述芽孢杆菌属细胞以产生岩藻糖基化低聚糖。
发明内容
根据第一方面，提供了用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属的非孢子形成细菌细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞具有乳糖通透酶、GDP-岩藻糖生物合成途径和岩藻糖基转移酶。
根据第二方面，提供了根据第一方面的芽孢杆菌属的非孢子形成细菌细胞用于生产岩藻糖基化低聚糖的用途。
根据第三方面，提供了一种用于生产岩藻糖基化低聚糖的方法，所述方法包括：
-提供芽孢杆菌属的非孢子形成细菌细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞具有乳糖通透酶、GDP-岩藻糖生物合成途径和接受乳糖的岩藻糖基转移酶；
-在含有乳糖的培养基中和在允许芽孢杆菌属细胞产生岩藻糖基化低聚糖的条件下培养所述芽孢杆菌属细胞，和
-任选地从培养基和/或芽孢杆菌属细胞中回收岩藻糖基化低聚糖。
根据第四方面，提供了由芽孢杆菌属细胞产生的岩藻糖基化低聚糖，所述芽孢杆菌属细胞具有乳糖通透酶、GDP-岩藻糖生物合成途径和岩藻糖基转移酶。
根据第五方面，提供了由芽孢杆菌属细胞产生的岩藻糖基化低聚糖用于制备营养组合物的用途，所述芽孢杆菌属细胞具有乳糖通透酶、GDP-岩藻糖生物合成途径和岩藻糖基转移酶。
根据第六方面，提供了含有至少一种已由芽孢杆菌属细胞产生的岩藻糖基化低聚糖的营养组合物，所述芽孢杆菌属细胞具有乳糖通透酶、GDP-岩藻糖生物合成途径和岩藻糖基转移酶。
具体实施方式
本发明涉及用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞、其用于生产岩藻糖基化低聚糖的用途以及方法，所述方法通过在含有乳糖的培养基中和在允许通过所述芽孢杆菌属细胞生产所述岩藻糖基化低聚糖的条件下培养所述芽孢杆菌属细胞来生产岩藻糖基化低聚糖。
为了能够产生岩藻糖基化低聚糖，芽孢杆菌属细胞必须向岩藻糖基转移酶提供包含岩藻糖部分的供体底物和作为二糖或低聚糖的受体底物，使得岩藻糖基转移酶可以将岩藻糖部分从供体底物转移到所述受体底物，从而产生岩藻糖基化低聚糖。
应当理解，所述芽孢杆菌属细胞旨在生产的岩藻糖基化低聚糖是所需的岩藻糖基化低聚糖，而在所需岩藻糖基化低聚糖的生产过程中由于岩藻糖基转移酶的混杂性而可能产生的其他岩藻糖基化低聚糖被认为是不需要的岩藻糖基化低聚糖或副产物。合适的供体底物是GDP-L-岩藻糖，用于产生岩藻糖基乳糖的合适的受体底物是二糖乳糖。所得到的所需岩藻糖基化低聚糖是2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖或2’,3-二岩藻糖基乳糖。
野生型芽孢杆菌属细胞既不在细胞内合成乳糖，也不内化和代谢外源乳糖。然而，在一些岩藻糖基化低聚糖的形成中，乳糖是接受乳糖的岩藻糖基转移酶的用于岩藻糖部分的受体底物。因此，为了能够产生岩藻糖基化低聚糖(如2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖或2’,3-二岩藻糖基乳糖)，芽孢杆菌属细胞必须具有通过在细胞内产生乳糖和/或通过内化外源乳糖而向接受乳糖的岩藻糖基转移酶提供乳糖的能力。
在一个实施方案中，用于产生岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞能够通过具有乳糖通透酶来内化外源乳糖。本文所用的用于乳糖的术语“外源的”是指不是来源于芽孢杆菌属细胞的乳糖，即不是由芽孢杆菌属细胞在细胞内合成的，而是来源于芽孢杆菌属细胞外部并被添加到芽孢杆菌属细胞在其中生长的培养基中以产生岩藻糖基化低聚糖的乳糖。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以能够内化外源乳糖，即具有乳糖通透酶。因此，用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞具有异源乳糖通透酶。合适的乳糖通透酶是大肠杆菌LacY或其功能性变体。
本文所用的用于蛋白质、多肽、酶和转运蛋白，以及用于核酸分子和/或核苷酸序列的术语“异源的”是指对含有所述分子的细胞的种来说是非天然的分子。术语“非天然的”表示所述分子不存在于芽孢杆菌属细胞的天然存在的或野生型的祖细胞中，即自然界中最常见的相同种的细胞。
本文所用的用于酶和/或转运分子的术语“功能性变体”是指与所提及的酶或转运蛋白具有相同活性(酶促、催化或易位)但与所提及的酶或转运分子具有不同氨基酸序列的蛋白质或多肽。因此，蛋白质/多肽的典型变体的氨基酸序列不同于参考蛋白质/多肽。变体和参考蛋白质/多肽的氨基酸序列可能相差任意组合的一个或多个取代、添加和/或缺失。因此，术语“功能性变体”包括具有与参考蛋白质/多肽相同活性的所提及的蛋白质/多肽的截短形式。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。蛋白质/多肽的变体可以是天然存在的，如等位基因变体，或者它可以为不是已知天然存在的变体。蛋白质/多肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术、通过直接合成和通过本领域技术人员已知的其他重组方法来制备。在本公开的范围内，术语“变体”还包括蛋白质和种间同源物，其的氨基酸序列/核酸序列与所提及的多肽具有大于约60％的氨基酸序列同一性，65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，98％或99％或更高的氨基酸序列同一性，优选在至少约25、50、100、200、500、1000或更多个氨基酸的区域上。
本文使用的术语“相同活性”是指仅以定性方式的蛋白质/多肽的酶促活性、催化活性或转运活性。因此，“功能性变体”还包括与所提及的蛋白质/多肽的活性相比具有增加或降低的活性的变体。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码乳糖通透酶的核苷酸序列，优选编码大肠杆菌乳糖通透酶LacY或其功能性变体的核苷酸序列。
大肠杆菌乳糖通透酶LacY由大肠杆菌lacY基因(Gen Bank登录号：NP_414877.1)的蛋白编码区(即开放阅读框)编码。因此，在一个实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码大肠杆菌乳糖通透酶LacY或其功能性变体的核苷酸序列。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，编码异源乳糖通透酶的核苷酸序列的密码子使用被改造以适于芽孢杆菌属的密码子使用。例如，枯草芽孢杆菌的密码子使用是特有的，其中总GC含量低于约45％，密码子第一个字母的GC含量高于约51％，密码子第二个字母的CG含量低于约36.1％，密码子第三个字母的CG含量低于约46％。
为了表达乳糖通透酶，芽孢杆菌属细胞含有重组乳糖通透酶基因，其中编码乳糖通透酶的核苷酸序列与介导乳糖通透酶开放阅读框表达的表达控制序列可操作地连接。
本文所用的术语“可操作地连接”应指核酸/基因表达控制序列(如启动子、信号序列或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列(通常称为“蛋白编码区”、“开放阅读框”，有时甚至称为“基因”)之间的功能性连接，其中表达控制序列影响对应于第二序列的核苷酸序列的转录和翻译。因此，术语“启动子”是指DNA聚合物中通常位于开放阅读框“前面”并提供起始向mRNA的转录的位点的DNA序列。“调节子”DNA序列，还通常是在给定的DNA聚合物中的开放阅读框的“上游”(即前面)，结合确定转录起始频率(或速率)的蛋白质。这些序列统称为“启动子/调节子”或“控制”DNA序列，它们在功能DNA聚合物中的一个选定开放阅读框(或一系列开放阅读框)前面，相互配合以确定开放阅读框的转录(和最终表达)是否发生。在DNA聚合物中“跟随”基因并提供用于终止向mRNA的转录的信号的DNA序列被称为转录“终止子”序列。
重组乳糖通透酶基因可以整合到芽孢杆菌属染色体中，或作为游离型存在于芽孢杆菌属细胞内的质粒上。
异源乳糖通透酶基因在芽孢杆菌属细胞中的表达使所得芽孢杆菌属细胞能够内化来自培养基的外源供应的乳糖。然后内化的乳糖可以作为岩藻糖基转移酶的受体底物(见下文)。
用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞必须能够提供用于将岩藻糖部分转移至受体底物的供体底物。岩藻糖部分的供体底物是GDP-岩藻糖。因此，芽孢杆菌属细胞必须能够在细胞内产生GDP-岩藻糖。为了GDP-岩藻糖的细胞内生物合成，芽孢杆菌属细胞具有GDP-岩藻糖生物合成途径。芽孢杆菌属已被遗传工程化以具有GDP-岩藻糖生物合成途径。GDP-岩藻糖生物合成途径可以是从头GDP-岩藻糖生物合成途径和/或GDP-岩藻糖补救途径。
在一个实施方案中，芽孢杆菌属细胞具有用于GDP-岩藻糖的细胞内生物合成的从头GDP-岩藻糖生物合成途径。芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以具有从头GDP-岩藻糖生物合成途径。
从头GDP-岩藻糖生物合成途径包括下列酶的活性：
1.果糖-6-磷酸异构酶；
2.磷酸甘露糖变位酶；
3.GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶；
4.GDP-甘露糖-4,6-脱水酶；和
5.GDP-岩藻糖合酶。
因此，用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞具有果糖-6-磷酸异构酶(通常也称为甘露糖-6-磷酸异构酶)、磷酸甘露糖变位酶、GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶和GDP-岩藻糖合酶。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以具有果糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶和GDP-岩藻糖合酶。
GDP-岩藻糖生物合成的从头途径始于果糖-6-磷酸异构化为甘露糖-6-磷酸，该反应由果糖-6-磷酸异构酶催化。在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码果糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列。合适的果糖-6-磷酸是大肠杆菌ManA或其功能性变体。示例性的核苷酸序列是编码大肠杆菌ManA的核苷酸序列。
大肠杆菌果糖-6-磷酸异构酶ManA由大肠杆菌manA基因(GenBank登录号：NP_416130.3)的蛋白编码区编码。因此，在一个额外的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码大肠杆菌ManA或其功能性变体的核苷酸序列。
大肠杆菌果糖-6-磷酸异构酶ManA由大肠杆菌manA基因(Gen Bank登录号：NP_416130.3)的开放阅读框编码。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞含有大肠杆菌manA基因或其功能性变体。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，编码果糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列的密码子使用被改造以适于芽孢杆菌属的密码子使用。
其他合适的果糖-6-磷酸异构酶是枯草芽孢杆菌ManA和旁系同源蛋白枯草芽孢杆菌GmuF(YdhS)和枯草芽孢杆菌Pmi(Yvyl)或其功能性变体。示例性的核苷酸序列是编码枯草芽孢杆菌ManA、枯草芽孢杆菌GmuF或枯草芽孢杆菌Pmi的核苷酸序列。枯草芽孢杆菌果糖-6-磷酸异构酶ManA由枯草芽孢杆菌manA基因(Gen Bank登录号：NP_389084.1)的开放阅读框编码。
枯草芽孢杆菌果糖-6-磷酸异构酶ManA由枯草芽孢杆菌manA基因(GenBank登录号：(NP_389084.1)的蛋白编码区编码。因此，在一个额外的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码枯草芽孢杆菌ManA或其功能性变体的核苷酸序列。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞含有枯草芽孢杆菌manA基因或其功能性变体。在另一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码枯草芽孢杆菌gmuF基因或其功能性变体的核苷酸序列和/或编码枯草芽孢杆菌pmi基因或其功能性变体的核苷酸序列。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，可以增加天然manA基因、天然gmuF基因和/或天然pmi基因的表达。可以增加天然manA基因、天然gmuF基因和/或天然pmi基因的表达，其中天然manA基因、天然gmuF基因和天然pmi基因中至少一个的内源启动子被更强的启动子替换，即分别与manA基因、gmuF基因和pmi基因的天然启动子相比介导增加的表达的启动子。在另一个额外的或替代的实施方案中，可以增强天然manA基因、天然gmuF基因和/或天然pmi基因的表达，其中在芽孢杆菌属细胞中增殖天然manA基因、天然gmuF基因和/或天然pmi基因的额外拷贝。
在另一个额外的或替代的实施方案中，可以通过编码甘露糖转运蛋白的manP基因的缺失或功能性失活来增强天然manA基因的表达，从而导致天然manA基因的组成型表达。
在另一个额外的或替代的实施方案中，天然gmuF基因的表达可以通过编码相应转录阻遏蛋白的gmuR基因的缺失或功能性失活来增强。
为了表达果糖-6-磷酸异构酶，芽孢杆菌属细胞含有重组果糖-6-磷酸异构酶基因，其中编码果糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列与表达控制序列可操作地连接。
重组果糖-6-磷酸异构酶基因可整合到芽孢杆菌属染色体中，或以游离型存在于芽孢杆菌属细胞内的质粒上。
在从头GDP-岩藻糖生物合成的第二步中，甘露糖-6-磷酸通过磷酸甘露糖变位酶的酶促活性转化为甘露糖-1-磷酸。在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码磷酸甘露糖变位酶的核苷酸序列。
合适的磷酸甘露糖变位酶是大肠杆菌磷酸甘露糖变位酶ManB。因此，在一个额外的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码大肠杆菌ManB或其功能性变体的核苷酸序列。
大肠杆菌磷酸甘露糖变位酶ManB由大肠杆菌manB基因(Gen Bank登录号：NP_416552.1)的蛋白编码区的核苷酸序列编码。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞含有大肠杆菌manB基因或其功能性变体。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，编码磷酸甘露糖变位酶的核苷酸序列的密码子使用被改造以适于芽孢杆菌属的密码子使用。
为了表达磷酸甘露糖变位酶，芽孢杆菌属细胞含有重组磷酸甘露糖变位酶基因，其中编码磷酸甘露糖变位酶的核苷酸序列与表达控制序列可操作地连接。
重组磷酸甘露糖变位酶基因可整合到芽孢杆菌属染色体中，或以游离型存在于芽孢杆菌属细胞中的质粒上。
GDP-岩藻糖从头生物合成途径的下一步是通过以下反应形成GDP-甘露糖：
α-D-甘露糖-1-磷酸+GTP+H+＝>二磷酸+GDP-α-D-甘露糖
甘露糖-1-磷酸到GDP-甘露糖的转化是由GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶介导。因此，用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞具有异源GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶。合适的GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶是大肠杆菌ManC或其功能性变体。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶的核苷酸序列。示例性的核苷酸序列是编码大肠杆菌ManC的核苷酸序列。因此，在一个额外的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码大肠杆菌ManC或其功能性变体的核苷酸序列。
大肠杆菌GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶ManC由大肠杆菌manC基因(GenBank登录号：NP_416553.1)的开放阅读框编码。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞含有大肠杆菌manC基因或其功能性变体。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，编码GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶的核苷酸序列的密码子使用被改造以适于芽孢杆菌属的密码子使用。
为了表达GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，芽孢杆菌属细胞含有重组GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶基因，其中编码GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶的核苷酸序列与表达控制序列可操作地连接。
重组GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶基因可整合到芽孢杆菌属染色体中，或以游离型存在于质粒上。
在由GDP-甘露糖-4,6-脱水酶催化的从头GDP-岩藻糖途径的后续步骤中，GDP-D-甘露糖被转化为GDP-4-脱氢-6-脱氧-D-甘露糖。
因此，用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞具有GDP-甘露糖-4,6-脱水酶。合适的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶是大肠杆菌Gmd。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的核苷酸序列。示例性的核苷酸序列是编码大肠杆菌Gmd的核苷酸序列。因此，在一个额外的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码大肠杆菌Gmd或其功能性变体的核苷酸序列。
大肠杆菌GDP-甘露糖-4,6-脱水酶Gmd由大肠杆菌gmd基因(Gen Bank登录号：NP_416557.1)的开放阅读框编码。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞含有大肠杆菌gmd基因或其功能性变体。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的核苷酸序列的密码子使用被改造以适于芽孢杆菌属的密码子使用。
为了表达GDP-甘露糖-4,6-脱水酶，芽孢杆菌属细胞含有重组GDP-甘露糖-4,6-脱水酶基因，其中编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的核苷酸序列与表达控制序列可操作地连接。
重组GDP-甘露糖-4,6-脱水酶基因可整合到芽孢杆菌属染色体中或以游离型存在于质粒上。
在从头GDP-岩藻糖生物合成途径的最终反应中，GDP-4-脱氢-6-脱氧-D-甘露糖通过两步NADPH依赖性反应转化为GDP-岩藻糖。该转化是由GDP-岩藻糖合酶介导，并涉及差向异构酶反应和还原酶反应。所述差向异构酶反应将GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖转化为GDP-4-酮-6-脱氧半乳糖，然后其被还原为GDP-岩藻糖。
因此，用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞具有GDP-岩藻糖合酶。合适的GDP-岩藻糖合酶是大肠杆菌WcaG或其功能性变体。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码GDP-岩藻糖合酶的核苷酸序列。示例性的核苷酸序列是编码大肠杆菌WcaG的核苷酸序列。因此，在一个额外的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码大肠杆菌WcaG或其功能性变体的核苷酸序列。
大肠杆菌GDP-岩藻糖合酶WcaG由大肠杆菌wcaG基因(Gen Bank登录号：NP_416556.1)的开放阅读框编码。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞含有大肠杆菌wcaG基因或其功能性变体。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，编码GDP-岩藻糖合酶的核苷酸序列的密码子使用被改造以适于芽孢杆菌属的密码子使用。
为了表达GDP-岩藻糖合酶，芽孢杆菌属细胞含有重组GDP-岩藻糖合酶基因，其中编码GDP-岩藻糖合酶的核苷酸序列与表达控制序列可操作地连接。
重组GDP-岩藻糖合酶基因可整合到芽孢杆菌属染色体中，或以游离型存在于质粒上。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞具有用于GDP-岩藻糖的细胞内生物合成的GDP-岩藻糖补救途径。在GDP-L-岩藻糖的补救途径中，游离的胞质岩藻糖被L-岩藻糖激酶磷酸化，形成L-岩藻糖-L-磷酸，然后其被进一步转化为GDP-L-岩藻糖。
用于GDP-岩藻糖的生物合成的补救途径包括以下酶：
I.岩藻糖激酶；和
II.L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶。
因此，具有GDP-岩藻糖补救途径的用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞具有岩藻糖激酶和L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以具有岩藻糖激酶和L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶。
岩藻糖激酶(fucose kinase)，又称为岩藻糖激酶(fucokinase)，ATP:6-脱氧-L-半乳糖1-磷酸转移酶，ATP:β-L-岩藻糖1-磷酸转移酶或L-岩藻糖激酶活性，L-岩藻糖激酶活性催化反应L-岩藻糖+ATP→β-L-岩藻糖-1-磷酸+ADP+2H+。
然后，L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶或GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶将所述β-L-岩藻糖-1-磷酸转化为GDP-L-岩藻糖。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码岩藻糖激酶或其功能性变体以及L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶或其功能性变体的核苷酸序列。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，岩藻糖激酶和L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶结合在单个多肽中。用于转化的编码岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶和/或双功能的L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶的合适基因，可从拟杆菌属(Bacteroides)、黏胶球形菌属(Lentisphaera)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、Solibacter、拟南芥属(Arabidopsis)、稻属(Oryza)、藓属(Physcomitrella)、葡萄属(Vitis)、鱼丹属(Danio)、牛属(Bos)、马属(Equus)、猕猴属(Macaca)、Pan、人属(Homo)、家鼠属(Rattus)、小鼠属(Mus)和爪蟾属(Xenopus)获得。双功能的岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶的一个实例存在于脆弱拟杆菌(Bacterioides fragilis)中。
在脆弱拟杆菌中，双功能的岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶Fkp由脆弱拟杆菌fkp基因(GenBank登录号AY849806)编码。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码脆弱拟杆菌Fkp或其功能性变体的核苷酸序列。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，编码岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶和/或双功能的岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶的核苷酸序列的密码子使用被改造以适于芽孢杆菌属的密码子使用。
为了表达岩藻糖激酶和岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，芽孢杆菌属细胞含有至少一个重组基因，其中编码岩藻糖激酶和L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶和/或双功能的岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶岩藻糖激酶的蛋白编码区与表达控制序列可操作地连接。
重组岩藻糖激酶基因、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶基因和/或双功能的岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶基因可以整合到芽孢杆菌属染色体中或以游离型存在于质粒上。
为了岩藻糖基乳糖的细胞内形成，芽孢杆菌属细胞具有岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶的酶促活性将岩藻糖部分从供体底物转移到受体底物。为了岩藻糖基乳糖的生物合成，所述受体底物是乳糖。因此，岩藻糖基转移酶是接受乳糖的岩藻糖基转移酶。
岩藻糖基转移酶选自用于2’-岩藻糖基乳糖的生物合成的α-1,2-岩藻糖基转移酶和用于3-岩藻糖基乳糖的生物合成的α-1,3-岩藻糖基转移酶。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以包含和表达至少一个编码岩藻糖基转移酶的核苷酸序列。
记载了用于生产2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的大肠杆菌O126的α-1,2-岩藻糖基转移酶WbgL和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的FucT2(EP2479263B1)、霍乱弧菌(Vibriocholera)O22的α-1,2-岩藻糖基转移酶WblA、胆型螺杆菌(H.bilis)ATCC 437879的FutD、朱奈德螺杆菌(H.cinaede)CCUG 18818的FutE、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)ATCC8482的FutN、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)ATCC 8483的FutO、大肠杆菌O55:H7的WbgN、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)NCTC 9343的Bft1和Bft3(WO2014/018596A2)，以及用于合成Lewis Y和Lewis B糖类的幽门螺杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶FucT2(US 6,670,160B2)，它们是合适的用于芽孢杆菌属细胞中的2’-FL生物合成的α-1,2-岩藻糖基转移酶。
记载了用于生产3-岩藻糖基乳糖的嗜粘性假单胞菌(Akkermansia muciniphila)的α-1,3-岩藻糖基转移酶Amuc和脆弱拟杆菌的FucT6和FucT7(EP2439264A1)、幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶FutA(US 2014/0120611 A1)，它们是合适的用于芽孢杆菌属细胞中的3-FL生物合成的α-1,3-岩藻糖基转移酶。另外，WO 2016/040531A1公开了用于合成3-岩藻糖基乳糖和乳二岩藻四糖的诺迪拟杆菌(B.nordii)CL02T12C05的α-1,3-岩藻糖基转移酶CafC和用于生产LNnFP-III的肝螺杆菌(H.hepaticus)ATCC51449的CafD。
WO 2019/0088133A1中公开了可在芽孢杆菌属细胞中表达用于产生岩藻糖基化糖类的额外岩藻糖基转移酶，其通过引用纳入本文。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，编码岩藻糖基转移酶的核苷酸序列的密码子使用被改造以适于芽孢杆菌属的密码子使用。
为了表达岩藻糖基转移酶，芽孢杆菌属细胞含有至少一个重组基因，其中编码岩藻糖基转移酶的蛋白编码区与表达控制序列可操作地连接。
重组岩藻糖基转移酶基因可整合到芽孢杆菌属染色体中或以游离型存在于质粒上。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，用于产生岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞能够内化L-岩藻糖。内化L-岩藻糖的能力对于具有GDP-岩藻糖补救途径的芽孢杆菌属细胞是有利的。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以使得允许或提高L-岩藻糖的内化。因此，芽孢杆菌属细胞具有异源L-岩藻糖通透酶。合适的L-岩藻糖通透酶是大肠杆菌FucP或其功能性变体。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码L-岩藻糖通透酶的核苷酸序列，优选编码大肠杆菌FucP或其功能性变体的核苷酸序列。
大肠杆菌L-岩藻糖通透酶由大肠杆菌fucP基因(Gen Bank登录号：NP_417281.1)的蛋白编码区编码。因此，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以含有并表达编码大肠杆菌FucP或其功能性变体的核苷酸序列。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，编码L-岩藻糖通透酶的核苷酸序列的密码子使用被改造以适于芽孢杆菌属的密码子使用。
为了表达L-岩藻糖通透酶，芽孢杆菌属细胞含有重组L-岩藻糖通透酶基因，其中编码L-岩藻糖通透酶的核苷酸序列与表达控制序列可操作地连接。
重组L-岩藻糖通透酶基因可整合到芽孢杆菌属染色体中，或以游离型存在于质粒上。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，与相同物种的野生型芽孢杆菌属细胞相比，用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞缺少任何β-半乳糖苷酶活性或具有降低的β-半乳糖苷酶活性。
岩藻糖基化低聚糖的细胞内生物合成需要输入乳糖作为接受乳糖的岩藻糖基转移酶的受体底物。水解内化乳糖的任何细胞内酶活性都将影响岩藻糖基乳糖形成的功效，因为细胞内乳糖池将减少。因此，与野生型芽孢杆菌属细胞相比，用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞缺少或至少具有降低的β-半乳糖苷酶活性，将是有利的。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以消除或至少降低细胞的β-半乳糖苷酶活性。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，已通过ganA基因的缺失或功能性失活而将芽孢杆菌属细胞遗传工程化。在另一个实施方案中，与野生型芽孢杆菌属细胞相比，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以降低ganA基因的表达水平。
芽孢杆菌属ganA基因也称为yvfN或lacA。它是GanR调节子的一个基因，所述GanR调节子包含编码参与半乳聚糖利用的酶的基因。ganA基因编码参与芽孢杆菌属的半乳聚糖利用的β-半乳糖苷酶。
ganA基因的缺失或功能性失活会消除芽孢杆菌属细胞中GanA介导的β-半乳糖苷酶活性，而ganA表达的减少会降低芽孢杆菌属细胞中的GanA的量，从而降低可干扰岩藻糖基化低聚糖的生物合成的β-半乳糖苷酶活性。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，已通过yesZ基因的缺失或功能性失活而将芽孢杆菌属细胞遗传工程化。芽孢杆菌属yesZ基因编码β-半乳糖苷酶YesZ，该酶在来源于植物细胞壁的鼠李糖半乳糖醛酸的降解中起作用。芽孢杆菌属yesZ基因的表达是由鼠李糖半乳糖醛酸I诱导的。在另一个实施方案中，与野生型芽孢杆菌属细胞相比，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化以降低yesZ基因的表达水平。
yesZ基因的缺失或功能性失活会消除芽孢杆菌属细胞中YesZ介导的β-半乳糖苷酶活性，而yesZ表达的减少会降低芽孢杆菌属细胞中的YesZ的量，从而降低可干扰岩藻糖基化低聚糖的生物合成的β-半乳糖苷酶活性。
当枯草芽孢杆菌进入指数后生长期(post-exponential growth phase)时，它们(开始)产生大量的细胞外蛋白酶。外源蛋白通常对蛋白酶敏感。因此，需要不含胞外蛋白酶的菌株来增加异源蛋白的稳定性并允许积累高水平的外源蛋白。芽孢杆菌属的基因组编码至少8种细胞外蛋白酶，即nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr和wprA。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化，其中至少一个编码细胞外蛋白酶的基因已被缺失或功能性失活，优选至少一个选自nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr和wprA的基因。优选地，选自nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr和wprA的基因中的2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个已被缺失或功能性失活。
当枯草芽孢杆菌在含有碳水化合物(如葡萄糖或乳糖)的培养基中生长时，其合成美好菌素酸。当铁存在于生长培养基中时，分泌出的美好菌素酸形成红色素普切明，即美好菌素酸的盐(一种铁螯合物)。在发酵过程中这种不需要的副产物的形成可以通过基因yvmC和/或cypX的缺失或破坏来避免/消除。基因yvmC编码环二肽合酶，基因cypX编码细胞色素P450环-l-亮氨酰-l-亮氨酰二肽氧化酶。
因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞已被遗传工程化，其中基因yvmC和cypX中的至少一个已被缺失或功能性失活。
根圈细菌枯草芽孢杆菌具有用于合成20多种抗生素的基因。其中包括肽抗生素如枯草芽孢杆菌硫醚抗生素(lantibiotic)和硫醚抗生素样肽(枯草杆菌素、ericin S、美杀菌素(mersacidin)、sublancin 168、subtilosin A)和非核糖体合成的(肽)抗生素(表面活性素、伊枯草菌素、芽孢菌霉素、抗霉枯草菌素、corynebactin/嗜铁素(bacillibactin)、丰原素(fengycin)、制磷脂菌素(plipastatin)、分枝杆菌素、TL-119、芽孢菌溶素(bacilysin)、bacilysocin、amicoumacin、3,3’-新海藻糖二胺、杀艰菌素(difficidin)、rhizocticin)。
为了生产岩藻糖基化低聚糖，优选使用不产生抗生素的芽孢杆菌属细胞。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，芽孢杆菌属细胞不合成选自以下的一种或多种抗生素：硫醚抗生素和硫醚抗生素样肽，例如枯草杆菌素、ericin S、美杀菌素、sublancin 168、subtilosin A；非核糖体合成的(肽)抗生素，例如表面活性素、伊枯草菌素、芽孢菌霉素、抗霉枯草菌素、corynebactin/嗜铁素、丰原素(fengycin)、制磷脂菌素(plipastatin)、分枝杆菌素、TL-119、芽孢菌溶素(bacilysin)、bacilysocin、amicoumacin、3,3’-新海藻糖二胺、杀艰菌素(difficidin)和rhizocticin。芽孢杆菌属细胞可已被遗传工程化以获得不合成一种或多种所述抗生素的芽孢杆菌属细胞。
野生型芽孢杆菌属细胞能够形成孢子。细菌中的孢子形成，即形成孢子的过程，被认为是细菌细胞的一种反应，它启动了导致形成具有不同形态和命运的子细胞的发育程序。芽孢杆菌属的孢子形成被研究作为细胞分化的基础模型。在孢子形成过程中，杆状芽孢杆菌属细胞不对称分裂，从而产生两个具有不同形态和命运的遗传上相同的细胞。
然而，在工业生产中，不需要细菌生产菌株在发酵过程中形成孢子。因此，优选使用不能形成孢子的芽孢杆菌属细胞来生产岩藻糖基化低聚糖。这种芽孢杆菌属细胞被称为“非孢子形成”。
优选地，能够产生岩藻糖基化低聚糖的非孢子形成芽孢杆菌属细胞源自表1中所列的枯草芽孢杆菌菌株之一。
表1：枯草芽孢杆菌菌株的非限制性列表
在一个额外的和/或替代的实施方案中，已通过Spo0A的缺失或功能性失活而将芽孢杆菌属细胞遗传工程化。Spo0A的适合的功能性失活包括磷酸化位点的缺失，其中Spo0F和Spo0B磷酸转移酶磷酸化Spo0A。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，已通过编码σ因子SigE(sigE)和/或σ因子SigF(sigF)的基因的缺失或功能性失活而将芽孢杆菌属细胞遗传工程化。
当在存在乳糖的培养基中和在允许芽孢杆菌属细胞产生岩藻糖基化低聚糖的条件下培养本发明的芽孢杆菌属细胞时，其能够产生岩藻糖基化低聚糖。
根据第二方面，提供了如前所述的芽孢杆菌属细胞用于生产岩藻糖基化低聚糖的用途，优选岩藻糖基化人乳低聚糖如2’-FL、3-FL或2’,3-DiFL。
由于芽孢杆菌属是公认安全的，利用公认安全的生产生物体生产用于人食用的岩藻糖基化低聚糖也应被认为是安全的，前提是对用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞的修改不影响生产菌株在人类健康和环境方面的安全性。因此，预期影响用于人食用的岩藻糖基化低聚糖，特别是用于人食用的岩藻糖基化人乳低聚糖，更具体地是婴儿配方物的监管批准的顾虑将减少，所述婴儿配方物由通过使用本文所述的芽孢杆菌属细胞产生的岩藻糖基化低聚糖组成或含有所述岩藻糖基化低聚糖。因此，监管机构和消费者对婴儿配方物和营养组合物中微生物生产的岩藻糖基化低聚糖的接受度应该更高。
根据第三方面，提供了一种用于生产岩藻糖基化低聚糖的方法，所述方法包括：
-提供非孢子形成芽孢杆菌属细胞，其已被遗传工程化以具有乳糖通透酶、GDP-岩藻糖生物合成途径和岩藻糖基转移酶；
-在含有乳糖的培养基中和在允许生产岩藻糖基化低聚糖的条件下培养芽孢杆菌属细胞，和
-任选地从培养基和/或从芽孢杆菌属细胞中回收岩藻糖基化低聚糖。
所提供的非孢子形成芽孢杆菌属细胞是本文所述的芽孢杆菌属细胞。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，岩藻糖基化低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、2’,3-二岩藻糖基乳糖(DiFL)、乳-N-岩藻戊糖I(LNFPI)、乳-N-新岩藻戊糖I(LNnFP I)、乳-N-岩藻戊糖II(LNFP II)、乳-N-岩藻戊糖III(LNFPIII)、乳-N-岩藻戊糖V(LNFP V)、乳-N-新岩藻戊糖V(LNnFP V)、乳-N-二岩藻己糖I(LNDHI)和乳-N-二岩藻己糖II(LND)。
在一个额外的和/或替代的实施方案中，培养基含有L-岩藻糖，特别是用于培养用于生产岩藻糖基化低聚糖的芽孢杆菌属细胞，所述芽孢杆菌属细胞具有GDP-岩藻糖补救途径以提供GDP-岩藻糖作为岩藻糖基转移酶的供体底物。
本发明还扩展至通过本文所述的芽孢杆菌属细胞和/或方法生产的岩藻糖基化低聚糖，至所述岩藻糖基化低聚糖用于制备营养组合物，优选婴儿配方物、膳食补充剂或药用食物的用途。此外，本发明还扩展至含有岩藻糖基化低聚糖的营养组合物，所述岩藻糖基化低聚糖是通过本文所述的芽孢杆菌属细胞和/或方法产生。
将用特定实施方案和附图来描述本发明，但本发明不仅限于此，而仅通过权利要求来限定。此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二等用于区分相似的要素，而并不必然用于在时间、空间、排序或以任何其他方式描述顺序。应该理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或举例说明的其他顺序操作。
应当注意的是，权利要求中使用的术语“包括”不应被解释为仅限于其后列出的方法；它不排除其他要素或步骤。因此，它被解释为指明所述特征、整数、步骤或成分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤或成分或其群组。因此，表述“包括装置A和B的设备”的范围不应限于仅由组件A和B组成的设备。这意味着，就本发明而言，该装置仅有的相关组件是A和B。
在本说明书通篇中提及“一个(one)实施方案”或“一个(an)实施方案”是指在本发明的至少一个实施方案中包括描述的与实施方案相关特定的特性、结构或特征。因此，在本说明书通篇中多处出现的短语“在一个(one)实施方案中”或“在一个(an)实施方案中”并不必然都是指同一实施方案，而是可能。此外，在一个或多个实施方案中，可以以任何适当的方式来组合特定的特性、结构或特征，这对于本公开内容所属领域中的普通技术人员来说是显而易见的。
类似地，应当意识到，在本发明的示例性实施方案的描述中，为了简化本公开内容并有助于理解本发明多个方面中的一个或多个，本发明的多种特征有时在单个实施方案、其图或描述中被分组在一起。然而，这种公开方法不应被解释为反映了所要求保护的发明需要比在每个权利要求中明确记载的特征的更多的特征的意图。相反，正如下面的权利要求所反映的，本发明的方面少于单个前述公开实施方案的所有特征。因此，在具体实施方式之后的权利要求被明确地纳入本具体实施方式中，每一项权利要求本身作为本发明的一个单独的实施方案。
此外，虽然本文描述的一些实施方案包括其他实施方案中包括的一些特征但不包括其他特征，但不同实施方案的特征组合意欲在本发明的范围内，并形成不同的实施方案，正如本领域技术人员所理解的那样。例如，在以下权利要求中，任何要求保护的实施方案都可以以任何组合使用。
此外，本文将一些实施方案描述为可以由计算机系统的处理器或通过执行该功能的其他手段来实现的方法或方法要素的组合。因此，具有执行这种方法或方法要素的必要指令的处理器构成用于执行所述方法或方法要素的手段。此外，本文描述的装置实施方案的元件是用于执行由元件行使的功能以实施本发明的装置的实例。
在本文提供的说明书和附图中，列出了许多具体的细节。然而，据了解，本发明的实施方案可以在没有这些具体细节的情况下实施。在其他情况下，众所周知的方法、结构和技术还没有被详细地展示出来，以避免混淆理解。现在将通过对本发明的几个实施方案的具体说明来描述本发明。显然，在不偏离本发明的真正主旨或技术教导的情况下，可以根据本领域技术人员的知识来配置本发明的其他实施方案，本发明仅受所附权利要求的术语限制。
实施例
实施例1：枯草芽孢杆菌的转化
可以通过多种技术对枯草芽孢杆菌进行遗传操作。为了转化枯草芽孢杆菌，通过两步法的修改方案制备感受态细胞(Anagnostopoulos,C.and Spizizen,J.(1961)JBacteriol 81(5):741-746)。将过夜培养物接种在MG1培养基中，并在37℃下振荡。MG1培养基是Spizizen的基本培养基，其补充有0.5％葡萄糖、5mM MgSO4和0.02％酪蛋白氨基酸(任选地额外补充有生物素和/或L-色氨酸)。第二天早上，将该培养物在新鲜的MG1培养基中以1:20稀释，并在37℃孵育约6h。
将1ml培养物稀释在8ml MG2培养基中，该培养基与MG1培养基的不同之处在于酪蛋白氨基酸的浓度(0.01％而不是0.02％)。在缩短的方案中，将过夜培养物直接在MG2培养基中稀释。再孵育90min后，将1-ml份的培养物与1-3μg多聚体质粒DNA或线性DNA混合，并在37℃下振荡孵育30-60min。通过使用大肠杆菌菌株NM538增殖质粒DNA或通过用单切割限制性酶消化使质粒线性化(所述酶在骨架内切割)，然后用T4 DNA连接酶再连接，获得多聚体质粒DNA。
然后，将细胞涂在含有适当抗生素的2x YT琼脂平板上。抗生素以以下浓度添加：5μg·mL-1红霉素、5μg·mL-1氯霉素、10μg·mL-1卡那霉素、100μg·mL-1大观霉素。
或者，为了原生质体转化(Romero,D.et al.(2006)Journal of MicrobiologicalMethods 66:556-559)，将细胞在20ml Penassay肉汤(PAB)中于37℃下生长，直至生长的稳定期开始(OD600＝1.7-2)。然后将细胞沉淀并重悬于10ml的SMPP培养基(0.3％牛血清白蛋白、5％2M蔗糖、25％4x PAB、50％2x SMM)中，2x SMM的组成为1M蔗糖、0.04M马来酸二钠盐水合物和0.04M MgCl2(pH 6.5)。加入溶菌酶(10mg ml-1)和变溶菌素(75U ml-1)后，将混合物在37℃振荡孵育以产生原生质体。显微镜下检查原生质体形成。然后通过在5200x g和4℃下离心5min小心收集原生质体，用冰冷的洗涤电转化缓冲液(1x SMM)洗涤两次，最后悬浮于该溶液中。将质粒DNA(1-3μg)添加到120μl的原生质体悬浮液中，并将混合物在冰上保持至少5min。将转化混合物转移到0.2-cm比色皿中，在25μF、400Ω和0.7kV下施加单个电穿孔脉冲。电穿孔电击后，立即向比色皿中加入1ml回收培养基(等体积的4x PAB和2x SMM，使用前新鲜制备)。然后将转化反应转移到2ml试管中，并在37℃下振荡孵育12h。为了再生，将细胞悬浮液涂在DM3琼脂平板上(Chang,S.and Cohen,S.(1979)MGG 168(1):111-115)，并在37℃下孵育48h。DM3再生培养基每升含有下列无菌溶液：200ml 4％琼脂、100ml 5％酪蛋白氨基酸、50ml 10％酵母提取物、100ml 3.5％K2HPO4和1.5％KH2PO4、25ml 20％葡萄糖、20ml 1M MgCl2、500ml 0.5M山梨糖醇和5ml过滤灭菌的2％牛血清白蛋白(当温度低于55℃时添加到混合物中)，并补充适当的抗生素。
枯草芽孢杆菌的电穿孔是根据MoBiTec GmbH提供的Zhang et al.(2011)(Zhang,G.,Bao,P.,Zhang,Y.,Deng,A.,Chen,N.and Wen,T.(2011)Anal.Biochem.,409:130-137)的改进方案进行的。将2x YT过夜培养物用新鲜的2x YT培养基稀释100倍，并使培养物在旋转摇床上于37℃下生长至OD600为0.2。然后向培养物中补充1％DL-苏氨酸、2％甘氨酸、0.1％色氨酸和0.03％Tween 80。再培养60min后，将细胞悬浮液在冰上冷却20min，在4℃下以5000x g离心10min，并用电穿孔缓冲液(0.5M海藻糖、0.5M山梨糖醇、0.5M甘露醇、0.5mMMgCl2、0.5mM K2HPO4、0.5mM KH2PO4，pH 7.4，过滤灭菌并冷冻储存)洗涤两次。最后，将细胞以原始培养体积的1/100重悬于电穿孔缓冲液中，并将100μl细胞悬浮液与DNA混合。将转化混合物转移至0.1-cm比色皿中，并在1.8kV下用MicroPulserTM装置(Bio-Rad)输送的单个脉冲进行电穿孔。脉冲输送后，立即向比色皿中添加1ml 2x YT肉汤(含0.5M山梨糖醇和0.38M甘露醇)。将转化悬浮液转移至2ml试管中，并在旋转摇床上于37℃下培养3h。将细胞涂在选择性2x YT琼脂平板上，并在37℃下孵育过夜。
使用替代的电穿孔方案(Xue,G.P.,J.S.Johnson,and B.P.Dalrymple:1999；Journal of Microbiological Methods 34:183-191)，用枯草芽孢杆菌接种5ml含0.5M山梨醇(glucitol)的LB，并在37℃下孵育过夜。随后，将过夜培养物用75ml含0.5M山梨醇(glucitol)的LB稀释(1:16)，并孵育至获得0.85-0.95的OD600。然后通过在4℃、5.000x g下离心10min沉淀细胞，并用冰冷却的电穿孔缓冲液(10％甘油、0.5M山梨醇(glucitol)、0.5M甘露醇)洗涤4次。最后，将细胞重悬于1-2ml电穿孔缓冲液中。在冷却的电穿孔比色皿(1-mm电极间隙)中，使用60μl含有DNA的感受态细胞进行电穿孔。对细胞-DNA混合物进行25μF、200Ω和21kV/cm的单个电脉冲处理。最后，将1ml回收肉汤(含有0.5M山梨醇(glucitol)和0.38甘露醇的LB)添加到电通透细胞中，并将细菌培养物在37℃孵育3h，然后铺在补充抗生素的LB琼脂上。
使用了两种不同的丰富培养基，即Luria肉汤(LB)和2x YT。
Luria肉汤(LB)培养基由1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％NaCl(pH 7.2)组成。
2x YT培养基由1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％NaCl(pH 7.5)组成。
为了制备丰富培养基琼脂平板，添加了15g L-1琼脂。
对于摇瓶实验，使用Spizizen的基本培养基(Spizizen,J.1958Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.44(10):1072-1078)。
Spizizen的基本培养基含有以下盐类：2g/L(NH4)2SO4、14g/L K2HPO4、6g/LKH2PO4、1g/L柠檬酸三钠x 2·H2O和0.2g/L MgSO4 x 7·H2O。
预培养基由Spizizen的基本盐类(其补充了2％D-葡萄糖、0.05％酪蛋白氨基酸和MgSO4至最终浓度为2mM)组成(任选地额外补充生物素和/或L-色氨酸)。
主培养基由Spizizen的基本盐类(其补充了2％D-葡萄糖、0.05％酪蛋白氨基酸、MgSO4至最终浓度为2mM)和0.5mL·L-1 1000x微量元素溶液组成(任选地额外补充生物素和/或L-色氨酸)。
微量元素溶液(1000x)由100.6g L-1C6H9NO6、56.4g·L-1柠檬酸铁铵、9.8g·L- 1MnCl2×4·H2O、1.6g·L-1CoCl2×6·H2O、1g·L-1CuCl2×2·H2O、1.9g·L-1H3BO3、9g·L- 1ZnSO4×7·H2O、1.1g·L-1Na2MoO4×2·H2O、1.5g·L-1Na2SeO3、1.5g·L-1NiSO4×6·H2O组成。
如有必要，向培养基中添加适当的抗生素以使其具有选择性。
将枯草芽孢杆菌菌株最初在丰富培养基琼脂平板上生长以获得单个菌落。这些平板在30-37℃下生长1天。对于摇瓶实验，用单个菌落接种20-ml预培养物(preculture)，并在30-37℃下在旋转摇床上过夜生长。随后用该预培养物接种20-ml主培养物至起始OD600为约0.1，并在30-37℃下在旋转摇床上培养。如果需要诱导，在诱导时间点处将40-60ml的主培养物分成20-ml的部分(proportion)。培养体积不超过摇瓶容量的20％。
实施例2：用于2’-岩藻糖基乳糖的枯草芽孢杆菌生产菌株的构建
通过整合异源基因大肠杆菌manC、大肠杆菌manB和大肠杆菌manA，并通过同源重组同时缺失内源基因lacA，实现了对孢子形成缺陷型枯草芽孢杆菌菌株(表1)的代谢工程化。位于半乳聚糖操纵子内的枯草芽孢杆菌基因ganA(yvfN，lacA)编码β-半乳糖苷酶。
为了合成GDP-甘露糖，manC、manB和manA的开放阅读框作为操纵子与枯草芽孢杆菌组成型启动子P43(iGem部分储存库(iGem part repository)：序列ID：BBa_K143013)可操作地连接。基因manC(Gen Bank登录号：NP_416553.1)编码来自大肠杆菌的GDP:甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶。基因manB(Gen Bank登录号：NP_416552.1)编码大肠杆菌磷酸甘露糖变位酶，基因manA(Gen Bank登录号：NP_389084.1)编码枯草芽孢杆菌果糖-6-磷酸异构酶。将上述每个基因与枯草芽孢杆菌RBS序列进行计算机模拟融合。将本文所述的表达盒<P43-manCBA>针对在枯草芽孢杆菌中的表达进行了密码子优化，并由GenScript公司以合成方法制备。随后，组装完整的整合盒并克隆到pBR322(New England Biolabs GmbH，Frankfurt，Germany)中，以产生自杀质粒<pBR322侧翼ganA上-lox71-erm-lox66-P43-manCBA-侧翼ganA下>(SEQ ID NO:1)。然后，用该质粒通过其自然感受态转化枯草芽孢杆菌。将细胞涂在含有适当抗生素(5μg mL-1红霉素)的2x YT琼脂平板上。通过菌落PCR验证表达盒<P43-manCBA>整合到枯草芽孢杆菌基因组的ganA基因座，产生菌株A。通过靶向蛋白质组学和/或通过实时荧光定量PCR确认基因表达。
为了在所得的<P43-manCBA>整合菌株中从乳糖和GDP-甘露糖生产2’-岩藻糖基乳糖，构建了表达质粒(SEQ ID NO:2)，其包含在诱导型启动子Pgrac100控制下的所有必需基因。因此，使用枯草芽孢杆菌表达载体pHT253(MoBiTec GmbH，
Germany)作为骨架。通过PCR从染色体DNA中扩增了大肠杆菌lacY基因(基因库登录号：NP_414877.1)的开放阅读框。编码大肠杆菌O126α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因wbgL的开放阅读框针对在枯草芽孢杆菌中的表达进行了密码子优化，并由GenScript公司以合成方法制备。此外，大肠杆菌基因gmd(Gen Bank登录号：NP_416557.1；编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶)和wcaG(GenBank登录号：NP_416556.1；编码GDP-岩藻糖合酶)的开放阅读框针对在枯草芽孢杆菌中的表达进行了密码子优化，并由GenScript公司以合成方法制备。包含在诱导型表达盒中的每个基因与枯草芽孢杆菌RBS序列连接。此外，在最终表达质粒<pHT253 Pgrac100-wbgL-gmd-wcaG-lacY-终止子>(SEQ ID NO:2)中引入了来自iGem部分储存库的合适的枯草芽孢杆菌终止子序列(序列ID：BBa_B0015)。用该表达质粒(SEQ ID NO:2)通过其自然感受态转化<P43-manCBA>整合菌株。通过靶向蛋白质组学和/或通过实时荧光定量PCR确认基因表达。在允许枯草芽孢杆菌在外源乳糖存在下产生2’-岩藻糖基乳糖的条件下培养转化体。
实施例3：用于2’-岩藻糖基乳糖的枯草芽孢杆菌生产菌株的构建
使用实施例2中所述的菌株A作为亲本菌株。此外，为了从乳糖和GDP-甘露糖生产2’-岩藻糖基乳糖，将大肠杆菌基因lacY、gmd、wcaG和wbgL整合到菌株A的内源amyE(amyA)基因座(编码α-淀粉酶)中。
基因wbgL(编码α-1,2-岩藻糖基转移酶)的开放阅读框针对在枯草芽孢杆菌中的表达进行了密码子优化，并由GenScript公司以合成方法制备。此外，基因gmd(Gen Bank登录号：NP_416557.1；编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶)和wcaG(Gen Bank登录号：NP_416556.1；编码GDP-岩藻糖合酶)的开放阅读框针对在枯草芽孢杆菌中的表达进行了密码子优化(由GenScript公司进行)，其作为双基因操纵子被置于强组成型枯草芽孢杆菌启动子PlepA的控制之下，并由GenScript公司以合成方法制备。通过PCR从染色体DNA中扩增了编码乳糖通透酶的大肠杆菌lacY基因(Gen Bank登录号：NP_414877.1)的开放阅读框。
将从乳糖和GDP-甘露糖生产2’-岩藻糖基乳糖的所有必需基因组装到组成型表达盒<P43-wbgL-lacY-PlePA-gmd-wcaG>中，其中每个基因均与枯草芽孢杆菌RBS序列连接。此外，将iGem部分储存库中合适的枯草芽孢杆菌终止子序列(序列ID：BBa_B0015)置于该表达盒的下游。将上述构建体克隆到pBR322(New England Biolabs GmbH,Frankfurt,Germany)中，生成<pBR322侧翼amyE上-lox71-aad9-lox66-P43-wbgL-lacY-PlePA-gmd wcaG-终止子-侧翼amyE下>(SEQ ID NO:3)。
使用所得的amyE整合载体(SEQ ID NO:3)通过其自然感受态转化枯草芽孢杆菌。通过大观霉素(100μg ml-1)选择转化体。通过菌落PCR验证表达盒<P43-wbgL-lacY-PlePA-gmd wcaG-终止子>整合到枯草芽孢杆菌基因组的amyE基因座。通过靶向蛋白质组学和/或通过实时荧光定量PCR确认基因表达。
实施例4：2’-岩藻糖基乳糖的枯草芽孢杆菌生产菌株的构建
为了从GDP-岩藻糖和外源乳糖生产2’-岩藻糖基乳糖，最初将大肠杆菌基因lacY整合到内源amyE(amyA)基因座(编码α-淀粉酶)。通过PCR从染色体DNA中扩增了编码乳糖通透酶的大肠杆菌lacY基因(Gen Bank登录号：NP_414877.1)的开放阅读框。构建了整合盒<侧翼amyE上-lox71-aad9-lox66-P43-lacY-侧翼amyE下>(SEQ ID NO:4)，并将其克隆到pBR322(New England Biolabs GmbH,Frankfurt,Germany)中。用所得的质粒通过其自然感受态转化枯草芽孢杆菌。通过菌落PCR验证了表达盒<P43-lacY>整合到枯草芽孢杆菌基因组的amyE基因座，产生菌株B。通过靶向蛋白质组学和/或通过实时荧光定量PCR确认基因表达。
为了从外源L-岩藻糖合成GDP-岩藻糖，构建了枯草芽孢杆菌表达质粒，其包含所有必需基因。使用质粒pDW1作为骨架。该质粒由GenScript公司以合成方法制备，含有分别用于在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的选择的基因bla和erm。此外，它还含有用于在大肠杆菌中增殖的pMB1复制子以及用于在枯草芽孢杆菌中增殖的pUB110复制子。
脆弱拟杆菌基因fkp(GenBank登录号AY849806)编码双功能的岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，大肠杆菌基因wbgL编码α-1,2-岩藻糖基转移酶，大肠杆菌基因fucP(Gen Bank登录号:NP_417281.1)编码L-岩藻糖通透酶。这些基因的开放阅读框均针对在枯草芽孢杆菌中的表达进行了密码子优化，并由GenScript公司以合成方法制备。构建了一个表达盒，该表达盒包含在强组成型枯草芽孢杆菌启动子P43的控制下的基因fkp、wbgL和fucP。
包含在表达盒中的每个基因都与枯草芽孢杆菌RBS序列连接。此外，将来自iGem部分储存库的合适的枯草芽孢杆菌终止子序列(序列ID:BBa_B0015)引入最终表达质粒<pDW1-P43-fkp-wbgL-fucP-终止子>(SEQ ID NO:5)。用该表达质粒(SEQ ID NO:5)通过其自然感受态转化菌株B。通过靶向蛋白质组学和/或通过实时荧光定量PCR确认基因表达。在允许枯草芽孢杆菌在外源乳糖和L-岩藻糖存在下产生2’-岩藻糖基乳糖的条件下培养转化体。
实施例5：使用经代谢工程化的枯草芽孢杆菌菌株生产2’-岩藻糖基乳糖
用适合于2’-岩藻糖基乳糖的生物合成的经代谢工程化的枯草芽孢杆菌菌株接种预培养物(分别如实施例2、3和4所述)。
将预培养物在30-37℃下培养过夜，然后在新鲜的主培养基中稀释至起始OD600为约0.1。当主培养物OD600达到约0.5时，向生长培养基中添加2mM乳糖。当使用诱导型启动子Pgrac100进行基因表达时，使用乳糖(2mM)或同时使用乳糖(2mM)和IPTG(1mM)进行诱导。此外，为了GDP-岩藻糖的补救生物合成，添加了2mM L-岩藻糖。24h/48h后停止(discontinue)培养，通过薄层色谱法和/或HPLC和/或质谱法(如WO 2017/042382A或WO 2019/008133A中所述)分析细胞内和细胞外2’-岩藻糖基乳糖。检测到大量2’-岩藻糖基乳糖的生物合成。
序列表
<110> Jennewein Biotechnologie GmbH
<120> 岩藻糖基化低聚糖在芽孢杆菌属中的生产
<130> P 1903 WO
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 自杀质粒
<400> 1
ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60
ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120
caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180
gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240
tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300
ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360
cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac 420
aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca 480
cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg 540
actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct 600
caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat 660
gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt 720
cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct 780
ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct 840
tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa 900
acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt 960
cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc 1020
cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca 1080
tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc 1140
gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat 1200
tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg 1260
ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga 1320
attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac 1380
atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg 1440
tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg 1500
ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc 1560
tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg 1620
taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca 1680
ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga 1740
ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa 1800
cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt 1860
ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc 1920
aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt 1980
ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac 2040
gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 2100
ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 2160
agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 2220
cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 2280
tactgagagt gcaccagcgg gcaaggaaag ccttcaatat gtgcagtggt atgtcaactc 2340
tatgaagatc agcctgttta caatggcagg gtctttgctc tgtgtgacgt ttacggccta 2400
tgcgttttcg cgctttcggt ttaaagggag gaaatacgct ttaacgctct ttttattgct 2460
gcagatgatt cctcagtttt cagctttaat tgccttgttt gtgctggcgc aaatcttggg 2520
aatgatcaat agccactggc tgctaatctt gctttatatc ggcggcctga tcccgatgaa 2580
tacgtatttg atgaaagggt acatggattc cattccgatg gatttagacg aaagcgccaa 2640
gattgacgga gccagcagca ccagaatctt cttccagatc attctgccat tatcaaaacc 2700
gatggcggca gtcgtggcca tgaacggctt taccggtccg ctcggagatt ttgtgctgtc 2760
ctcaaccata ttgagaacgc ctgaatcata tacattgccc gtcggtctat tcaatttagt 2820
gaatgatgtc atgggggcca gctatacgac atttgcggcc ggagccctgc ttatcagcat 2880
accggttgcc gtcatcttta ttatgctgca aaagaatttt gtgtccggat taaccgcagg 2940
cggaacgaag ggctaagaga acaaggagga gaatgtgatg tcaaagcttg aaaaaacgca 3000
cgtaacaaaa gcaaaattta tgctccatgg gggagactac aaccccgatc agtggctgga 3060
tcggcccgat attttagctg acgatatcaa actgatgaag ctttctcata cgaatacgtt 3120
ttctgtcggc accagtgaat tcgagctcgg tacctaccgt tcgtataatg tatgctatac 3180
gaagttatta cgcgttaacc cgggcccgcg gatgcatatg atcagatcct ttaactctgg 3240
caaccctcaa aattgaatga gacatgctac acctccggat aataaatata tataaacgta 3300
tatagatttc ataaagtcta acacactaga cttatttact tcgtaattaa gtcgttaaac 3360
cgtgtgctct acgaccaaaa ctataaaacc tttaagaact ttcttttttt acaagaaaaa 3420
agaaattaga taaatctctc atatctttta ttcaataatc gcatccgatt gcagtataaa 3480
tttaacgatc actcatcatg ttcatattta tcagagctcg tgctataatt atactaattt 3540
tataaggagg aaaaaatatg ggcattttta gtatttttgt aatcagcaca gttcattatc 3600
aaccaaacaa aaaataagtg gttataatga atcgttaata agcaaaattc atataaccaa 3660
attaaagagg gttataatga acgagaaaaa tataaaacac agtcaaaact ttattacttc 3720
aaaacataat atagataaaa taatgacaaa tataagatta aatgaacatg ataatatctt 3780
tgaaatcggc tcaggaaaag gccattttac ccttgaatta gtaaagaggt gtaatttcgt 3840
aactgccatt gaaatagacc ataaattatg caaaactaca gaaaataaac ttgttgatca 3900
cgataatttc caagttttaa acaaggatat attgcagttt aaatttccta aaaaccaatc 3960
ctataaaata tatggtaata taccttataa cataagtacg gatataatac gcaaaattgt 4020
ttttgatagt atagctaatg agatttattt aatcgtggaa tacgggtttg ctaaaagatt 4080
attaaataca aaacgctcat tggcattact tttaatggca gaagttgata tttctatatt 4140
aagtatggtt ccaagagaat attttcatcc taaacctaaa gtgaatagct cacttatcag 4200
attaagtaga aaaaaatcaa gaatatcaca caaagataaa caaaagtata attatttcgt 4260
tatgaaatgg gttaacaaag aatacaagaa aatatttaca aaaaatcaat ttaacaattc 4320
cttaaaacat gcaggaattg acgatttaaa caatattagc tttgaacaat tcttatctct 4380
tttcaatagc tataaattat ttaataagta agttaaggga tgcataaact gcatccctta 4440
acttgttttt cgtgtgccta ttttttgtga atcgattata acttcgtata atgtatgcta 4500
tacgaacggt aggatcctct agagtcgacc tgcaggcatt ttacattttt agaaatgggc 4560
gtgaaaaaaa gcgcgcgatt atgtaaaata taaagattaa ctaataagga ggacaaacat 4620
ggcacaatct aaactgtatc cggttgtgat ggcgggcgga tctggatcaa gactgtggcc 4680
gctttcacgc gttctttacc cgaaacaatt tctgtgtctg aaaggagatt taacaatgct 4740
gcagacaaca atttgcagat taaatggcgt ggaatgtgaa tctccggtcg ttatttgcaa 4800
cgaacagcat agatttatcg tcgctgaaca acttcgccag ctgaacaaac tgacagaaaa 4860
catcatcctg gaaccggccg gcagaaatac agcaccggcg attgctcttg cagcgttagc 4920
tgccaaacgc cattcaccgg aaagcgatcc gcttatgtta gtgctggcag cggatcatgt 4980
cattgcggat gaagatgctt ttagagctgc cgttcgcaac gctatgccgt atgccgaagc 5040
aggcaaactt gtgacatttg gaattgtccc ggatttaccg gaaacaggct atggatatat 5100
cagacgcggc gaagtgtcag cgggagaaca agatatggtt gcctttgaag tggcacagtt 5160
tgtcgaaaaa ccgaatctgg aaacagcgca agcgtatgtt gcttcaggcg aatattattg 5220
gaacagcgga atgtttcttt ttagagccgg ccgctatctg gaagaactta aaaaatacag 5280
accggatatt ttagatgcat gtgaaaaagc gatgtcagct gtcgatccgg atttaaactt 5340
tatcagagtt gatgaagaag cctttctggc atgcccggaa gaaagcgttg attatgcagt 5400
gatggaacgc acagccgatg cagtggtcgt tccgatggat gcgggctggt ctgatgttgg 5460
atcatggtca agcctttggg aaattagcgc gcatacagct gaaggcaatg tttgtcatgg 5520
agatgtgatc aaccataaaa cagaaaacag ctatgtttac gcggaatctg gcctggtgac 5580
aacagtcgga gttaaagatt tagtggtcgt tcagacaaaa gatgcggtgt taattgctga 5640
tagaaacgcc gtgcaagatg ttaagaaagt tgtcgaacag atcaaagcag atggaagaca 5700
tgaacataga gtccatcgcg aagtttatcg cccgtgggga aaatatgata gcattgatgc 5760
gggcgatcgc tatcaagtca aacgcatcac agttaaaccg ggcgaaggac tgtctgttca 5820
gatgcatcat catcgcgcag aacattgggt tgtggtcgcc ggcacagcaa aagtgacaat 5880
tgatggcgat attaaactgc ttggagaaaa cgaatctatt tatatcccgt taggagctac 5940
acattgcctg gaaaacccgg gcaaaattcc gcttgattta atcgaagtca gaagcggatc 6000
ttatcttgaa gaagatgatg ttgtgcgctt tgccgataga tatggccgcg tttaagctct 6060
taaggaggat tttagaatga aaaaacttac atgctttaaa gcgtatgata ttcgcggcaa 6120
acttggagaa gaattaaacg aagatattgc ttggagaatc ggccgcgcct atggagaatt 6180
tctgaaaccg aaaacaatcg tgctgggcgg agatgtcaga cttacatcag aaacacttaa 6240
actggctctg gccaaaggcc tgcaagatgc tggagttgat gtgcttgata ttggcatgag 6300
cggaacagaa gaaatctatt ttgccacatt tcatttagga gtcgatggcg gaatcgaagt 6360
tacagcaagc cataatccga tggattataa cggaatgaaa ctggttagag aaggcgcaag 6420
accgatttct ggcgatacag gattaagaga tgtgcagcgc ctggcagaag cgaacgattt 6480
tccgccggtc gatgaaacaa aaagaggacg ctatcaacag attaatttac gcgatgcgta 6540
tgttgatcat ctttttggct acatcaacgt taaaaacctg acaccgctta aactggtgat 6600
caattctggc aacggagcag cgggaccggt tgtggatgct attgaagcca gatttaaagc 6660
acttggcgca ccggttgaat taatcaaagt gcataataca ccggatggca attttccgaa 6720
cggcattccg aacccgctgc ttccggaatg cagagatgat acacgcaatg cggttattaa 6780
acatggcgct gatatgggaa tcgcctttga tggagatttt gatcgctgtt ttctttttga 6840
tgaaaaaggc caatttatcg aaggatacta catcgtgggc ttactggctg aagcatttct 6900
ggagaaaaat ccgggagcga aaattatcca tgatccgaga ctttcttgga atacagtcga 6960
tgtcgttaca gctgccggcg gaacaccggt tatgtcaaaa acaggccatg cttttatcaa 7020
agaaagaatg cgcaaagaag atgcaatcta tggcggagaa atgagcgcgc atcattactt 7080
tagagatttt gcttactgcg attctggcat gatcccgtgg cttttagtcg cggaactggt 7140
ttgtcttaaa gataaaacac tgggagaact ggtcagagat cgcatggcag cgtttccggc 7200
ttcaggcgaa attaatagca aactggcaca accggtggaa gcgatcaaca gagtcgaaca 7260
gcatttttca cgcgaagcac tggcggttga tagaacagat ggaattagca tgacatttgc 7320
cgattggaga tttaatcttc gcacatctaa cacagaaccg gtggtcagac ttaacgttga 7380
atcacgcggc gatgtgccgt taatggaagc aagaacacgc acactgctta cattactgaa 7440
tgaataaaaa ggaggaacta ctatgacaac agaaccgctg tttttcaaac cggtctttaa 7500
agaaagaatt tggggcggaa cagctctggc cgattttggc tatacaatcc cgtctcaacg 7560
cacaggagaa tgctgggctt ttgcagcgca tcaaaatggc cagagcgttg tgcagaacgg 7620
catgtacaaa ggatttacac tgtctgaact gtgggaacat catagacatc tttttggcca 7680
attagaagga gatcgctttc cgctgcttac aaaaatttta gatgctgatc aggatctgtc 7740
agttcaggtt catccgaatg atgaatatgc caatatccat gaaaacggcg aacttggaaa 7800
aacagaatgc tggtatatta tcgattgtca gaaagatgct gaaattatct atggccataa 7860
cgccacaaca aaagaagaat taacaacaat gatcgaaaga ggagaatggg atgaattact 7920
gagacgcgtg aaagtcaaac cgggcgattt cttttatgtc ccgtcaggaa cagttcatgc 7980
aattggcaaa ggaatccttg cgttagaaac acaacagaat agcgatacaa catacagact 8040
gtacgattac gatcgcaaag atgcagaagg caaacttaga gaactgcatc ttaaaaaatc 8100
aatcgaagtt atcgaagtgc cgagcattcc ggaacgccat acagttcatc atgaacaaat 8160
cgaagattta ctgacaacaa cactgatcga atgcgcatat tttagcgtgg gcaaatggaa 8220
cctttcagga agcgcgtctt taaaacaaca gaaaccgttt ctgcttattt ctgtgatcga 8280
aggcgaagga cgcatgattt caggcgaata tgtctatccg tttaagaaag gcgatcacat 8340
gttactgccg tatggcctgg gagaatttaa acttgaagga tatgcggaat gtatcgtttc 8400
tcatctttaa gcgaggcagg atcaggacaa tgattatatt tttgtcatga atttcacgga 8460
agaaaaacag ctggtcacgt ttgatcagag tgtgaaggac ataatgacag gagacatatt 8520
gtcaggcgac ctgacgatgg aaaagtatga agtgagaatt gtcgtaaaca cacattaggc 8580
tgatgctccg ctcgatatgg gcggattctt ttttctatag aatgaaaacg cttgctaagt 8640
cttgggggga tgaaatcatg aaaagcaaag tgaaaatgtt ctttgcggct gccatcgtgt 8700
ggagtgcatg tagttcaaca ggatatgccg ctgccattga gaaggagaag cacgtgtcag 8760
agcttcgggc agaggatctt tttgttaaaa aagtagaggg gatgaacaag gattttatca 8820
aaggggcaga tgtatccagc gttattgctt tggaaaacag cggtgtcacc ttttacaata 8880
caaacggaaa acgccaggat atctttacaa ctttaaaaca ggctggggtc aactatgttc 8940
gcgtccgcat ctggaatcac ccgtatgatt caaatggcaa cgggtatggc gggggaaaca 9000
atgatgttca aaaagccatc gaaatcggaa aaagagcgac agcgaacgga atgaaggtgc 9060
tggccgactt tcactactct gatttctggg ccgatccagc gaaacaaaag gtgcccaaag 9120
cctgggcgaa tctcagcttt gaagcaaaaa aagcaaagct ctatgagtat acgaaacaaa 9180
gcctgcaaaa gatgatcaag gaaggcgtgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 9240
gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 9300
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 9360
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 9420
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 9480
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 9540
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 9600
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 9660
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 9720
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 9780
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 9840
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 9900
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 9960
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 10020
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 10080
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 10140
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 10200
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 10260
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 10320
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 10380
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 10440
agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 10500
acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 10560
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 10620
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 10680
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 10740
ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 10800
gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 10860
tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 10920
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 10980
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 11040
cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 11100
gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 11160
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 11220
cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa 11270
<210> 2
<211> 12427
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达质粒
<400> 2
ttaagttatt ggtatgactg gttttaagcg caaaaaaagt tgctttttcg tacctattaa 60
tgtatcgttt tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120
gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180
aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240
tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300
ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360
gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420
ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480
tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540
cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600
aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660
tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720
cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780
tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840
ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900
ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 960
aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 1020
tatcttgata ataagggtaa ctattgccga tcgtccattc cgacagcatc gccagtcact 1080
atggcgtgct gctagcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg 1140
gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta 1200
agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc 1260
gagctcaggc cttaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 1320
aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 1380
attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt 1440
caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg 1500
aaaatcctgt ttgatggtgg ttgacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc 1560
gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat 1620
tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt 1680
cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc 1740
tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc 1800
cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag 1860
atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt 1920
ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat 1980
ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag 2040
attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac 2100
gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg 2160
cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg 2220
tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt 2280
tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc 2340
ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcatc aaaatcgtct ccctccgttt 2400
gaatatttga ttgatcgtaa ccagatgaag cactctttcc actatcccta cagtgttatg 2460
gcttgaacaa tcacgaaaca ataattggta cgtacgatct ttcagccgac tcaaacatca 2520
aatcttacaa atgtagtctt tgaaagtatt acatatgtaa gatttaaatg caaccgtttt 2580
ttcggaagga aatgatgacc tcgtttccac cggaattagc ttggtaccaa aggaggtaag 2640
gatcactaga aaatttttta aaaaatctct tgacattgga agggagatat gttattataa 2700
gaattgcgga attgtgagcg gataacaatt cccatataga ttaactaata aggaggacaa 2760
acatgggttc tatcatcaga cttcagggtg gtttaggcaa tcaactgttt caatttagct 2820
ttggttatgc tctttcaaaa atcaatggca caccgctgta ctttgatatt tcacattacg 2880
cagaaaacga tgatcatggc ggatatagac tgaataacct tcaaatcccg gaagaatatc 2940
ttcagtacta cacaccgaaa atcaacaaca tctacaaact gcttgtcaga ggcagccgct 3000
tatatccgga tatttttctg tttcttggct tttgcaacga atttcatgcg tatggctatg 3060
attttgaata catcgcgcaa aaatggaaaa gcaaaaaata catcggatac tggcagtctg 3120
aacatttctt tcataaacat attctggatc tgaaagaatt tttcatcccg aaaaacgtta 3180
gcgaacaagc taacttactg gcagcgaaaa tcttagaatc tcagtcaagc ctgtcaattc 3240
atatcagacg cggcgattac atcaaaaaca aaacagccac actgacacat ggagtttgct 3300
ctcttgaata ctacaagaaa gcactgaaca aaatcagaga tttagccatg attcgcgatg 3360
tgtttatctt ttctgatgat attttctggt gtaaagaaaa catcgaaaca cttctgagca 3420
aaaaatacaa catctactac tcagaagatt taagccaaga agaagattta tggctgatgt 3480
ctctggctaa tcatcatatt atcgccaact cttcattttc atggtggggc gcatatcttg 3540
gaagctctgc gagccagatt gttatctatc cgacaccgtg gtatgatatt acaccgaaaa 3600
acacatacat tcctatcgtg aaccattgga tcaacgtgga caaacattcc tcctgctaag 3660
gagaaaagct agcgattaac taataaggag gaactgaaat gtcaaaagtg gcgcttatta 3720
caggcgtcac aggacaagat ggcagctatt tagctgaatt tctgcttgaa aaaggatatg 3780
aagtgcatgg cattaaaaga cgcgcatcat catttaacac agaaagagtc gatcatatct 3840
atcaagatcc gcatacatgc aacccgaaat ttcatctgca ttatggcgat ctgagcgata 3900
catctaacct gacaagaatt ttacgcgaag tccagccgga tgaagtttat aacctgggcg 3960
cgatgtctca tgtcgctgtt tcatttgaaa gcccggaata tacagccgat gtcgatgcaa 4020
tgggaacact tagattactg gaagccattc gctttttagg cctggaaaag aaaacacgct 4080
tttatcaggc atctacatca gaactgtatg gacttgttca agaaatcccg cagaaagaaa 4140
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cagttaatta tcgcgaatct tatggaatgt atgcttgcaa tggcatctta tttaaccatg 4260
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tcgcccaagg actggaaagc tgtctttatt taggcaacat ggattctctt agagattggg 4380
gccatgcaaa agattacgtt aaaatgcaat ggatgatgtt acaacaggaa cagccggaag 4440
attttgtgat cgccacagga gtgcaatatt cagtcagaca gtttgttgaa atggcagcgg 4500
ctcagcttgg cattaaactg cgctttgaag gcacaggagt ggaagaaaaa ggaatcgttg 4560
tgagcgttac aggccatgat gcgccgggag tgaaaccggg cgatgtgatt atcgccgtcg 4620
atccgagata ttttcgcccg gcagaagtcg aaacactttt aggagatccg acaaaagcgc 4680
atgaaaaact gggctggaaa ccggaaatta cactgagaga aatggttagc gaaatggtgg 4740
ctaacgattt agaagccgcg aaaaaacatt ctctgcttaa atcacatggc tatgatgtgg 4800
cgatcgctct ggaatcttaa aaaggaggaa ctactatgag caaacaaaga gtttttatcg 4860
ctggccatcg cggaatggtg ggctctgcca ttagacgcca attagaacag agaggagatg 4920
tggaacttgt cttaagaaca cgcgatgaac tgaatctgct tgattcaaga gctgtccatg 4980
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ttgtggcaaa taacacatat ccggcggatt ttatctacca aaacatgatg atcgaatcta 5100
acattatcca tgccgcacat cagaatgatg ttaacaaact gctgtttctg ggatcaagct 5160
gcatctatcc gaaacttgca aaacaaccga tggcggaatc agaactttta cagggcacac 5220
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cttacaacag acaatacggc agagattatc gctcagtgat gccgacaaac ttatatggac 5340
cgcatgataa ttttcatccg tctaactcac atgtcattcc ggcactgctt agacgctttc 5400
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gcgaatttct gcatgttgat gatatggcgg ctgccagcat ccatgtgatg gaacttgctc 5520
atgaagtctg gttagaaaat acacaaccga tgcttagcca tattaacgtc ggcacaggag 5580
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gcctgcatca acttggatgg tatcatgaaa ttagcttaga agcaggcctg gcgtctacat 5760
accaatggtt tttagaaaac caggatagat ttcgcggcgg atcataaagt gatagcggta 5820
ccattatagg taagagagga atgtacacat gtactattta aaaaacacaa acttttggat 5880
gttcggttta ttctttttct tttacttttt tatcatggga gcctacttcc cgtttttccc 5940
gatttggcta catgacatca accatatcag caaaagtgat acgggtatta tttttgccgc 6000
tatttctctg ttctcgctat tattccaacc gctgtttggt ctgctttctg acaaactcgg 6060
gctgcgcaaa tacctgctgt ggattattac cggcatgtta gtgatgtttg cgccgttctt 6120
tatttttatc ttcgggccac tgttacaata caacatttta gtaggatcga ttgttggtgg 6180
tatttatcta ggcttttgtt ttaacgccgg tgcgccagca gtagaggcat ttattgagaa 6240
agtcagccgt cgcagtaatt tcgaatttgg tcgcgcgcgg atgtttggct gtgttggctg 6300
ggcgctgtgt gcctcgattg tcggcatcat gttcaccatc aataatcagt ttgttttctg 6360
gctgggctct ggctgtgcac tcatcctcgc cgttttactc tttttcgcca aaacggatgc 6420
gccctcttct gccacggttg ccaatgcggt aggtgccaac cattcggcat ttagccttaa 6480
gctggcactg gaactgttca gacagccaaa actgtggttt ttgtcactgt atgttattgg 6540
cgtttcctgc acctacgatg tttttgacca acagtttgct aatttcttta cttcgttctt 6600
tgctaccggt gaacagggta cgcgggtatt tggctacgta acgacaatgg gcgaattact 6660
taacgcctcg attatgttct ttgcgccact gatcattaat cgcatcggtg ggaaaaacgc 6720
cctgctgctg gctggcacta ttatgtctgt acgtattatt ggctcatcgt tcgccacctc 6780
agcgctggaa gtggttattc tgaaaacgct gcatatgttt gaagtaccgt tcctgctggt 6840
gggctgcttt aaatatatta ccagccagtt tgaagtgcgt ttttcagcga cgatttatct 6900
ggtctgtttc tgcttcttta agcaactggc gatgattttt atgtctgtac tggcgggcaa 6960
tatgtatgaa agcatcggtt tccagggcgc ttatctggtg ctgggtctgg tggcgctggg 7020
cttcacctta atttccgtgt tcacgcttag cggccccggc ccgctttccc tgctgcgtcg 7080
tcaggtgaat gaagtcgctt aaggatccat gtctagagtc gacgtccccg gggcagcccg 7140
cctaatgagc gggctttttt cacgtcccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa 7200
agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact agagtcacac 7260
tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatacccgg ggcagcccgc ctaatgagcg 7320
ggcttttttc acgtcacgcg tccatggaga tctttgtctg caactgaaaa gtttatacct 7380
tacctggaac aaatggttga aacatacgag gctaatatcg gcttattagg aatagtccct 7440
gtactaataa aatcaggtgg atcagttgat cagtatattt tggacgaagc tcggaaagaa 7500
tttggagatg acttgcttaa ttccacaatt aaattaaggg aaagaataaa gcgatttgat 7560
gttcaaggaa tcacggaaga agatactcat gataaagaag ctctaaaact attcaataac 7620
cttacaatgg aattgatcga aagggtggaa ggttaatggt acgaaaatta ggggatctac 7680
ctagaaagcc acaaggcgat aggtcaagct taaagaaccc ttacatggat cttacagatt 7740
ctgaaagtaa agaaacaaca gaggttaaac aaacagaacc aaaaagaaaa aaagcattgt 7800
tgaaaacaat gaaagttgat gtttcaatcc ataataagat taaatcgctg cacgaaattc 7860
tggcagcatc cgaagggaat tcatattact tagaggatac tattgagaga gctattgata 7920
agatggttga gacattacct gagagccaaa aaacttttta tgaatatgaa ttaaaaaaaa 7980
gaaccaacaa aggctgagac agactccaaa cgagtctgtt tttttaaaaa aaatattagg 8040
agcattgaat atatattaga gaattaagaa agacatggga ataaaaatat tttaaatcca 8100
gtaaaaatat gataagatta tttcagaata tgaagaactc tgtttgtttt tgatgaaaaa 8160
acaaacaaaa aaaatccacc taacggaatc tcaatttaac taacagcggc caaactgaga 8220
agttaaattt gagaagggga aaaggcggat ttatacttgt atttaactat ctccatttta 8280
acattttatt aaaccccata caagtgaaaa tcctctttta cactgttcct ttaggtgatc 8340
gcggagggac attatgagtg aagtaaacct aaaaggaaat acagatgaat tagtgtatta 8400
tcgacagcaa accactggaa ataaaatcgc caggaagaga atcaaaaaag ggaaagaaga 8460
agtttattat gttgctgaaa cggaagagaa gatatggaca gaagagcaaa taaaaaactt 8520
ttctttagac aaatttggta cgcatatacc ttacatagaa ggtcattata caatcttaaa 8580
taattacttc tttgattttt ggggctattt tttaggtgct gaaggaattg cgctctatgc 8640
tcacctaact cgttatgcat acggcagcaa agacttttgc tttcctagtc tacaaacaat 8700
cgctaaaaaa atggacaaga ctcctgttac agttagaggc tacttgaaac tgcttgaaag 8760
gtacggtttt atttggaagg taaacgtccg taataaaacc aaggataaca cagaggaatc 8820
cccgattttt aagattagac gtaaggttcc tttgctttca gaagaacttt taaatggaaa 8880
ccctaatatt gaaattccag atgacgagga agcacatgta aagaaggctt taaaaaagga 8940
aaaagagggt cttccaaagg ttttgaaaaa agagcacgat gaatttgtta aaaaaatgat 9000
ggatgagtca gaaacaatta atattccaga ggccttacaa tatgacacaa tgtatgaaga 9060
tatactcagt aaaggagaaa ttcgaaaaga aatcaaaaaa caaataccta atcctacaac 9120
atcttttgag agtatatcaa tgacaactga agaggaaaaa gtcgacagta ctttaaaaag 9180
cgaaatgcaa aatcgtgtct ctaagccttc ttttgatacc tggtttaaaa acactaagat 9240
caaaattgaa aataaaaatt gtttattact tgtaccgagt gaatttgcat ttgaatggat 9300
taagaaaaga tatttagaaa caattaaaac agtccttgaa gaagctggat atgttttcga 9360
aaaaatcgaa ctaagaaaag tgcaataaac tgctgaagta tttcagcagt tttttttatt 9420
tagaaatagt gaaaaaaata taatcaggga ggtatcaata tttaatgagt actgatttaa 9480
atttatttag actggaatta ataattaaca cgtagactaa ttaaaattta atgagggata 9540
aagaggatac aaaaatatta atttcaatcc ctattaaatt ttaacaaggg ggggattaaa 9600
atttaattag aggtttatcc acaagaaaag accctaataa aatttttact agggttataa 9660
cactgattaa tttcttaatg ggggagggat taaaatttaa tgacaaagaa aacaatcttt 9720
taagaaaagc ttttaaaaga taataataaa aagagctttg cgattaagca aaactcttta 9780
ctttttcatt gacattatca aattcatcga tttcaaattg ttgttgtatc ataaagttaa 9840
ttctgttttg cacaaccttt tcaggaatat aaaacacatc tgaggcttgt tttataaact 9900
cagggtcgct aaagtcaatg taacgtagca tatgatatgg tatagcttcc acccaagtta 9960
gcctttctgc ttcttctgaa tgtttttcat atacttccat gggtatctct aaatgatttt 10020
cctcatgtag caaggtatga gcaaaaagtt tatggaattg atagttcctc tctttttctt 10080
caactttttt atctaaaaca aacactttaa catctgagtc aatgtaagca taagatgttt 10140
ttccagtcat aatttcaatc ccaaatcttt tagacagaaa ttctggacgt aaatcttttg 10200
gtgaaagaat ttttttatgt agcaatatat ccgatacagc accttctaaa agcgttggtg 10260
aatagggcat tttacctatc tcctctcatt ttgtggaata aaaatagtca tattcgtcca 10320
tctacctatc ctattatcga acagttgaac tttttaatca aggatcagtc ctttttttca 10380
ttattcttaa actgtgctct taactttaac aactcgattt gtttttccag atctcgaggg 10440
taactagcct cgccgatccc gcaagaggcc cggcagtcag gtggcacttt tcggggaaat 10500
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 10560
agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 10620
catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 10680
ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 10740
atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 10800
ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 10860
gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 10920
ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 10980
ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 11040
gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 11100
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 11160
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 11220
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 11280
gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 11340
gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 11400
caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 11460
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 11520
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 11580
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 11640
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 11700
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 11760
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 11820
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 11880
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 11940
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 12000
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 12060
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 12120
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 12180
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 12240
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 12300
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 12360
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 12420
cgcatgc 12427
<210> 3
<211> 12330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 整合载体
<400> 3
ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60
ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120
caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180
gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240
tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300
ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360
cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac 420
aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca 480
cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg 540
actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct 600
caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat 660
gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt 720
cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct 780
ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct 840
tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa 900
acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt 960
cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc 1020
cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca 1080
tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc 1140
gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat 1200
tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg 1260
ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga 1320
attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac 1380
atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg 1440
tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg 1500
ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc 1560
tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg 1620
taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca 1680
ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga 1740
ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa 1800
cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt 1860
ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc 1920
aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt 1980
ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac 2040
gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 2100
ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 2160
agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 2220
cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 2280
tactgagagt gcaccatatg acccgacatc cggcgttctc atggcggtgc ttgccgccag 2340
cggtattccg tatgtcaagt ggctgcggtt tatggtgccg cttgctctga tttggttctt 2400
gatcgggctt gtctttatcg tgatcggagt catgatcaat tgggggccgt tttaacgatt 2460
gctgcccgcc ggcttgtacg gcgggctttt gagttattca ttgcagaagc gcaggctgtt 2520
attgtaacat gtaagccata agccattcgt aaaagtgcgg gaggaaggtc atgaataatc 2580
tgcgtaatag actttcaggc gtgaatggga aaaataagag agtaaaagaa aaagaacaaa 2640
aaatctggtc ggagattggg atgatagcgg gagcatttgc gctgcttgat gtgatcatcc 2700
gcggcattat gtttgaattt ccgtttaaag aatgggctgc aagccttgtg tttttgttca 2760
tcattatctt atattactgc atcagggctg cggcatccgg aatgctcatg ccgagaatag 2820
acaccaaaga agaactgcaa aaacgggtga agcagcagcg aatagaatca attgcggtcg 2880
cctttgcggt agtggtgctt acgatgtacg acagggggat tccccataca ttcttcgctt 2940
ggctgaaaat gattcttctt tttatcgtct gcggcggcgt tctgtttctg cttcggtatg 3000
tgattgtgaa gctggcttac agaagagcgg taaaagaaga aataaaaaag aaatcatctt 3060
ttttgtttgg aaagcgaggg aagcgttcac agtttcgggc agcttttttt ataggaacat 3120
tgatttgtat tcactctgcc aagttgtttt gatagagtga ttgtgataat tttaaatgta 3180
agcgttaaca aaattctcca gtcttcacat cggtttgaaa ggaggaagcg gaagaatgaa 3240
gtaagaggga tttttgactc cgaagtaagt cttcaaaaaa tcaaataagg agtgtcaaga 3300
ccagtgaatt cgagctcggt acctaccgtt cgtataatgt atgctatacg aagttatgat 3360
aaaaaattta gaagccaatg aaatctataa ataaactaaa ttaagtttat ttaattaaca 3420
actatggata taaaataggt actaatcaaa atagtgagga ggatatattt gaatacatac 3480
gaacaaatta ataaagtgaa aaaaatactt cggaaacatt taaaaaataa ccttattggt 3540
acttacatgt ttggatcagg agttgagagt ggactaaaac caaatagtga tcttgacttt 3600
ttagtcgtcg tatctgaacc attgacagat caaagtaaag aaatacttat acaaaaaatt 3660
agacctattt caaaaaaaat aggagataaa agcaacttac gatatattga attaacaatt 3720
attattcagc aagaaatggt accgtggaat catcctccca aacaagaatt tatttatgga 3780
gaatggttac aagagcttta tgaacaagga tacattcctc agaaggaatt aaattcagat 3840
ttaaccataa tgctttacca agcaaaacga aaaaataaaa gaatatacgg aaattatgac 3900
ttagaggaat tactacctga tattccattt tctgatgtga gaagagccat tatggattcg 3960
tcagaggaat taatagataa ttatcaggat gatgaaacca actctatatt aactttatgc 4020
cgtatgattt taactatgga cacgggtaaa atcataccaa aagatattgc gggaaatgca 4080
gtggctgaat cttctccatt agaacatagg gagagaattt tgttagcagt tcgtagttat 4140
cttggagaga atattgaatg gactaatgaa aatgtaaatt taactataaa ctatttaaat 4200
aacagattaa aaaaattata aaaaaattga aaaaatggtg gaaacacttt tttcaatttt 4260
tttgttttat tatttaatat ttgggaaata ttcattctaa tataacttcg tataatgtat 4320
gctatacgaa cggtaggatc ctctagagtc gacctgcagg cattttacat ttttagaaat 4380
gggcgtgaaa aaaagcgcgc gattatgtaa aatataaaga ttaactaata aggaggacaa 4440
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cagaaaacga tgatcatggc ggatatagac tgaataacct tcaaatcccg gaagaatatc 4620
ttcagtacta cacaccgaaa atcaacaaca tctacaaact gcttgtcaga ggcagccgct 4680
tatatccgga tatttttctg tttcttggct tttgcaacga atttcatgcg tatggctatg 4740
attttgaata catcgcgcaa aaatggaaaa gcaaaaaata catcggatac tggcagtctg 4800
aacatttctt tcataaacat attctggatc tgaaagaatt tttcatcccg aaaaacgtta 4860
gcgaacaagc taacttactg gcagcgaaaa tcttagaatc tcagtcaagc ctgtcaattc 4920
atatcagacg cggcgattac atcaaaaaca aaacagccac actgacacat ggagtttgct 4980
ctcttgaata ctacaagaaa gcactgaaca aaatcagaga tttagccatg attcgcgatg 5040
tgtttatctt ttctgatgat attttctggt gtaaagaaaa catcgaaaca cttctgagca 5100
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ctctggctaa tcatcatatt atcgccaact cttcattttc atggtggggc gcatatcttg 5220
gaagctctgc gagccagatt gttatctatc cgacaccgtg gtatgatatt acaccgaaaa 5280
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gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac atgtactatt taaaaaacac 5400
aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt tttatcatgg gagcctactt 5460
cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc agcaaaagtg atacgggtat 5520
tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa ccgctgtttg gtctgctttc 5580
tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt accggcatgt tagtgatgtt 5640
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gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc ggtgcgccag cagtagaggc 5760
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gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc gccgttttac tctttttcgc 5940
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gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac caacagtttg ctaatttctt 6120
tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta tttggctacg taacgacaat 6180
gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca ctgatcatta atcgcatcgg 6240
tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct gtacgtatta ttggctcatc 6300
gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg ctgcatatgt ttgaagtacc 6360
gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag tttgaagtgc gtttttcagc 6420
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actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc gcttatctgg tgctgggtct 6540
ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt agcggccccg gcccgctttc 6600
cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaaagtcaa tgtatgaatg gatacgggat 6660
atgaatcaat aagtacgtga aagagaaaag caacccagat atgataggga acttttctct 6720
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cgtttaatag tggagaaaag ctagcgatta actaataagg aggaactgaa atgtcaaaag 6840
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tcgatcatat ctatcaagat ccgcatacat gcaacccgaa atttcatctg cattatggcg 7020
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ataacctggg cgcgatgtct catgtcgctg tttcatttga aagcccggaa tatacagccg 7140
atgtcgatgc aatgggaaca cttagattac tggaagccat tcgcttttta ggcctggaaa 7200
agaaaacacg cttttatcag gcatctacat cagaactgta tggacttgtt caagaaatcc 7260
cgcagaaaga aacaacaccg ttttatccga gaagcccgta tgcggtcgct aaactttacg 7320
cgtactggat cacagttaat tatcgcgaat cttatggaat gtatgcttgc aatggcatct 7380
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ccattgcaaa tatcgcccaa ggactggaaa gctgtcttta tttaggcaac atggattctc 7500
ttagagattg gggccatgca aaagattacg ttaaaatgca atggatgatg ttacaacagg 7560
aacagccgga agattttgtg atcgccacag gagtgcaata ttcagtcaga cagtttgttg 7620
aaatggcagc ggctcagctt ggcattaaac tgcgctttga aggcacagga gtggaagaaa 7680
aaggaatcgt tgtgagcgtt acaggccatg atgcgccggg agtgaaaccg ggcgatgtga 7740
ttatcgccgt cgatccgaga tattttcgcc cggcagaagt cgaaacactt ttaggagatc 7800
cgacaaaagc gcatgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat tacactgaga gaaatggtta 7860
gcgaaatggt ggctaacgat ttagaagccg cgaaaaaaca ttctctgctt aaatcacatg 7920
gctatgatgt ggcgatcgct ctggaatctt aaaaaggagg aactactatg agcaaacaaa 7980
gagtttttat cgctggccat cgcggaatgg tgggctctgc cattagacgc caattagaac 8040
agagaggaga tgtggaactt gtcttaagaa cacgcgatga actgaatctg cttgattcaa 8100
gagctgtcca tgatttcttt gccagcgaac gcatcgatca ggtttatctt gcagcggcta 8160
aagttggcgg aattgtggca aataacacat atccggcgga ttttatctac caaaacatga 8220
tgatcgaatc taacattatc catgccgcac atcagaatga tgttaacaaa ctgctgtttc 8280
tgggatcaag ctgcatctat ccgaaacttg caaaacaacc gatggcggaa tcagaacttt 8340
tacagggcac actggaaccg acaaatgaac cgtatgcaat tgcgaaaatc gcgggaatca 8400
aactttgtga atcttacaac agacaatacg gcagagatta tcgctcagtg atgccgacaa 8460
acttatatgg accgcatgat aattttcatc cgtctaactc acatgtcatt ccggcactgc 8520
ttagacgctt tcatgaagct acagcccaga acgcgccgga tgttgtggtc tggggctcag 8580
gaacaccgat gcgcgaattt ctgcatgttg atgatatggc ggctgccagc atccatgtga 8640
tggaacttgc tcatgaagtc tggttagaaa atacacaacc gatgcttagc catattaacg 8700
tcggcacagg agttgattgc acaatcagag aattagctca gacaattgcc aaagttgtgg 8760
gatataaagg ccgcgtcgtt tttgatgcct ctaaaccgga tggcacaccg agaaaattac 8820
tggatgtgac acgcctgcat caacttggat ggtatcatga aattagctta gaagcaggcc 8880
tggcgtctac ataccaatgg tttttagaaa accaggatag atttcgcggc ggatcataag 8940
gatccatgtc tagagtcgac gtccccgggg cagcccgcct aatgagcggg cttttttcac 9000
gtcccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct 9060
gttgtttgtc ggtgaacgct ctctactaga gtcacactgg ctcaccttcg ggtgggcctt 9120
tctgcgttta tagaattcat attacttaga ggatactatt gagagagcta ttgataagat 9180
ggttgagaca ttacctgaga gccaaaaaac tttttatgaa tatgaattaa aaaaaagaac 9240
caacaaaggc tgagacagac tccgggcaag gctagacggg acttaccgaa agaaaccatc 9300
aatgatggtt tcttttttgt tcataaatca gacaaaactt ttctcttgca aaagtttgtg 9360
aagtgttgca caatataaat gtgaaatact tcacaaacaa aaagacatca aagagaaaca 9420
taccctggaa ggatgattaa tgatgaacaa acatgtaaat aaagtagctt taatcggagc 9480
gggttttgtt ggaagcagtt atgcatttgc gttaattaac caaggaatca cagatgagct 9540
tgtggtcatt gatgtaaata aagaaaaagc aatgggcgat gtgatggatt taaaccacgg 9600
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tgctgatatt gtctgcattt gcgccggagc aaaccaaaaa cctggtgaga cacgccttga 9720
attagtagaa aagaacttga agattttcaa aggcatcgtt agtgaagtca tggcgagcgg 9780
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gagattccgt ttcatgctga gcgaatactt tggcgcagcg cctcaaaacg tacacgcgca 9960
tattatcgga gagcacggcg acacagagct tcctgtttgg agccacgcga atgtcggcgg 10020
tgtgccggtc agtgaactcg ttgagaaaaa cgatgcgtac aaacaagagg agctggacca 10080
aattgtagat gatgtgaaaa acgcagctta ccatatcatt gagaaaaaag gcgcgactta 10140
ttatggggtt gcgatgagtc ttgctcgcat tacaaaagcc attcttcata atgaaaacag 10200
catattaact gtcagcacat atttggacgg gcaatacggt gcagatgacg tgtacatcgg 10260
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tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 10440
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 10500
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 10560
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 10620
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 10680
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 10740
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 10800
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 10860
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 10920
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 10980
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 11040
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 11100
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gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 11220
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 11280
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 11340
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 11400
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 11460
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 11520
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca 11580
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 11640
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 11700
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 11760
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 11820
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca 11880
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 11940
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cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 12060
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 12120
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 12180
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 12240
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 12300
cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa 12330
<210> 4
<211> 4254
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 整合盒
<400> 4
gcaggctgtt attgtaacat gtaagccata agccattcgt aaaagtgcgg gaggaaggtc 60
atgaataatc tgcgtaatag actttcaggc gtgaatggga aaaataagag agtaaaagaa 120
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tttttgttca tcattatctt atattactgc atcagggctg cggcatccgg aatgctcatg 300
ccgagaatag acaccaaaga agaactgcaa aaacgggtga agcagcagcg aatagaatca 360
attgcggtcg cctttgcggt agtggtgctt acgatgtacg acagggggat tccccataca 420
ttcttcgctt ggctgaaaat gattcttctt tttatcgtct gcggcggcgt tctgtttctg 480
cttcggtatg tgattgtgaa gctggcttac agaagagcgg taaaagaaga aataaaaaag 540
aaatcatctt ttttgtttgg aaagcgaggg aagcgttcac agtttcgggc agcttttttt 600
ataggaacat tgatttgtat tcactctgcc aagttgtttt gatagagtga ttgtgataat 660
tttaaatgta agcgttaaca aaattctcca gtcttcacat cggtttgaaa ggaggaagcg 720
gaagaatgaa gtaagaggga tttttgactc cgaagtaagt cttcaaaaaa tcaaataagg 780
agtgtcaaga atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt 840
tttattgctg tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgctg aaacggcgaa 900
caaatcgaat gagcttacag caccgtcgat caaaagcgga accattcttc atgcatggcc 960
agtgaattcg agctcggtac ctaccgttcg tataatgtat gctatacgaa gttatgataa 1020
aaaatttaga agccaatgaa atctataaat aaactaaatt aagtttattt aattaacaac 1080
tatggatata aaataggtac taatcaaaat agtgaggagg atatatttga atacatacga 1140
acaaattaat aaagtgaaaa aaatacttcg gaaacattta aaaaataacc ttattggtac 1200
ttacatgttt ggatcaggag ttgagagtgg actaaaacca aatagtgatc ttgacttttt 1260
agtcgtcgta tctgaaccat tgacagatca aagtaaagaa atacttatac aaaaaattag 1320
acctatttca aaaaaaatag gagataaaag caacttacga tatattgaat taacaattat 1380
tattcagcaa gaaatggtac cgtggaatca tcctcccaaa caagaattta tttatggaga 1440
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tatgatttta actatggaca cgggtaaaat cataccaaaa gatattgcgg gaaatgcagt 1740
ggctgaatct tctccattag aacataggga gagaattttg ttagcagttc gtagttatct 1800
tggagagaat attgaatgga ctaatgaaaa tgtaaattta actataaact atttaaataa 1860
cagattaaaa aaattataaa aaaattgaaa aaatggtgga aacacttttt tcaatttttt 1920
tgttttatta tttaatattt gggaaatatt cattctaata taacttcgta taatgtatgc 1980
tatacgaacg gtaggatcct ctagagtcga cctgcaggca ttttacattt ttagaaatgg 2040
gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc attataggta 2100
agagaggaat gtacacatgt actatttaaa aaacacaaac ttttggatgt tcggtttatt 2160
ctttttcttt tactttttta tcatgggagc ctacttcccg tttttcccga tttggctaca 2220
tgacatcaac catatcagca aaagtgatac gggtattatt tttgccgcta tttctctgtt 2280
ctcgctatta ttccaaccgc tgtttggtct gctttctgac aaactcgggc tgcgcaaata 2340
cctgctgtgg attattaccg gcatgttagt gatgtttgcg ccgttcttta tttttatctt 2400
cgggccactg ttacaataca acattttagt aggatcgatt gttggtggta tttatctagg 2460
cttttgtttt aacgccggtg cgccagcagt agaggcattt attgagaaag tcagccgtcg 2520
cagtaatttc gaatttggtc gcgcgcggat gtttggctgt gttggctggg cgctgtgtgc 2580
ctcgattgtc ggcatcatgt tcaccatcaa taatcagttt gttttctggc tgggctctgg 2640
ctgtgcactc atcctcgccg ttttactctt tttcgccaaa acggatgcgc cctcttctgc 2700
cacggttgcc aatgcggtag gtgccaacca ttcggcattt agccttaagc tggcactgga 2760
actgttcaga cagccaaaac tgtggttttt gtcactgtat gttattggcg tttcctgcac 2820
ctacgatgtt tttgaccaac agtttgctaa tttctttact tcgttctttg ctaccggtga 2880
acagggtacg cgggtatttg gctacgtaac gacaatgggc gaattactta acgcctcgat 2940
tatgttcttt gcgccactga tcattaatcg catcggtggg aaaaacgccc tgctgctggc 3000
tggcactatt atgtctgtac gtattattgg ctcatcgttc gccacctcag cgctggaagt 3060
ggttattctg aaaacgctgc atatgtttga agtaccgttc ctgctggtgg gctgctttaa 3120
atatattacc agccagtttg aagtgcgttt ttcagcgacg atttatctgg tctgtttctg 3180
cttctttaag caactggcga tgatttttat gtctgtactg gcgggcaata tgtatgaaag 3240
catcggtttc cagggcgctt atctggtgct gggtctggtg gcgctgggct tcaccttaat 3300
ttccgtgttc acgcttagcg gccccggccc gctttccctg ctgcgtcgtc aggtgaatga 3360
agtcgcttaa gcaatcaatg tcggatgcca gcctggcttt gattacgtgc taaatggttt 3420
atataatgac tcgggcttaa gcggttctct tccccattga gggcaaggct agacgggact 3480
taccgaaaga aaccatcaat gatggtttct tttttgttca taaatcagac aaaacttttc 3540
tcttgcaaaa gtttgtgaag tgttgcacaa tataaatgtg aaatacttca caaacaaaaa 3600
gacatcaaag agaaacatac cctggaagga tgattaatga tgaacaaaca tgtaaataaa 3660
gtagctttaa tcggagcggg ttttgttgga agcagttatg catttgcgtt aattaaccaa 3720
ggaatcacag atgagcttgt ggtcattgat gtaaataaag aaaaagcaat gggcgatgtg 3780
atggatttaa accacggaaa ggcgtttgcg ccacaaccgg tcaaaacatc ttacggaaca 3840
tatgaagact gcaaggatgc tgatattgtc tgcatttgcg ccggagcaaa ccaaaaacct 3900
ggtgagacac gccttgaatt agtagaaaag aacttgaaga ttttcaaagg catcgttagt 3960
gaagtcatgg cgagcggatt tgacggcatt ttcttagtcg cgacaaatcc ggttgatatc 4020
ctgacttacg caacatggaa attcagcggc ctgccaaaag agcgggtgat tggaagcggc 4080
acaacacttg attctgcgag attccgtttc atgctgagcg aatactttgg cgcagcgcct 4140
caaaacgtac acgcgcatat tatcggagag cacggcgaca cagagcttcc tgtttggagc 4200
cacgcgaatg tcggcggtgt gccggtcagt gaactcgttg agaaaaacga tgcg 4254
<210> 5
<211> 10340
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达质粒
<400> 5
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcc ttcaatcctt ttaataacaa ttatagcatc taatcttcaa caaactggcc 240
cgtttgttga actactcttt aataaaataa tttttccgtt cccaattcca cattgcaata 300
atagaaaatc catcttcatc ggctttttcg tcatcatctg tatgaatcaa atcgccttct 360
tctgtgtcat caaggtttaa ttttttatgt atttctttta acaaaccacc ataggagatt 420
aaccttttac ggtgtaaacc ttcctccaaa tcagacaaac gtttcaaatt cttttcttca 480
tcatcggtca taaaatccgt atcctttaca ggatattttg cagtttcgtc aattgccgat 540
tgtatatccg atttatattt atttttcggt cgaatcattt gaacttttac atttggatca 600
tagtctaatt tcattgcctt tttccaaaat tgaatccatt gtttttgatt cacgtagttt 660
tctgtattct taaaataagt tggttccaca cataccaata catgcatgtg ctgattataa 720
gaattatctt tattatttat tgtcacttcc gttgcacgca taaaaccaac aagattttta 780
ttaatttttt tatattgcat cattcggcga aatccttgag ccatatctga caaactctta 840
tttaattctt cgccatcata aacattttta actgttaatg tgagaaacaa ccaacgaact 900
gttggctttt gtttaataac ttcagcaaca accttttgtg actgaatgcc atgtttcatt 960
gctctcctcc agttgcacat tggacaaagc ctggatttac aaaaccacac tcgatacaac 1020
tttctttcgc ctgtttcacg attttgttta tactctaata tttcagcaca atcttttact 1080
ctttcagcct ttttaaattc aagaatatgc agaagttcaa agtaatcaac attagcgatt 1140
ttcttttctc tccatggtct cacttttcca ctttttgtct tgtccactaa aacccttgat 1200
ttttcatctg aataaatgct actattagga cacataatat taaaagaaac ccccatctat 1260
ttagttattt gtttagtcac ttataacttt aacagatggg gtttttctgt gcaaccaatt 1320
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tcgacttcgt tcttttttta cctctcggtt atgagttagt tcaaattcgt tctttttagg 1560
ttctaaatcg tgtttttctt ggaattgtgc tgttttatcc tttaccttgt ctacaaaccc 1620
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cttgaaagag ttaaccgcac agattggttt tgcacatcag atccggttgg caaaaaactg 1860
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tatatccgca gcgaaaaacc gcttcagtct atcccggaag ctgatgttgt gtgctatgga 2220
ttatgggtcg atccgtctct ggcaacacat catggcgttt ttgcgtcaga tagaaaacat 2280
ccggaacaac tggattttat gctgcagaaa ccgtcacttg cagaattaga aagcctgtct 2340
aaaacacatt tatttctgat ggatattggc atctggttac tgtcagatag agcggtcgaa 2400
attctgatga aacgcagcca taaagaatca agcgaagaac ttaaatacta cgatctgtac 2460
tcagattttg gacttgcttt aggcacacat ccgcgcattg aagatgaaga agtgaataca 2520
cttagcgtcg caatcctgcc tcttccggga ggcgaatttt accattacgg aacatcaaaa 2580
gaactgattt cttcaacact tagcgttcaa aacaaagtgt atgatcagag acgcatcatg 2640
catagaaaag tgaaaccgaa tccggcaatg tttgtccaaa acgcggtcgt tcgcattccg 2700
ctttgcgctg aaaatgccga tttatggatt gaaaacagcc atatcggacc gaaatggaaa 2760
atcgcatcaa gacatattat cacaggcgtg ccggaaaatg attggtcact tgcagtcccg 2820
gcgggagtgt gtgtcgatgt ggtcccgatg ggagataaag gctttgttgc gagaccgtat 2880
ggattagatg atgtgtttaa aggcgatctg cgcgatagca aaacaacact tacaggcatt 2940
ccgtttggcg aatggatgtc taaaagagga ttatcataca cagatttaaa aggccgcaca 3000
gatgatctgc aggctgtttc agtgtttccg atggtgaaca gcgtcgaaga attaggcctg 3060
gtccttagat ggatgctttc tgaaccggaa ttagaagaag gaaaaaatat ttggctgcgc 3120
tctgaacatt tttcagcaga tgaaatctca gctggcgcca accttaaaag actgtacgcg 3180
caaagagaag aatttcgcaa aggaaattgg aaagcacttg cggttaacca tgaaaaatca 3240
gtgttttatc agctggatct ggcagatgca gcggaagatt ttgttcgcct tggcttagat 3300
atgccggaac ttttaccgga agatgctctg caaatgtcac gcattcataa tcgcatgctt 3360
agagcccgca tcctgaaact tgatggaaaa gattatagac cggaagaaca ggctgccttt 3420
gatctgctta gagatggatt actggatggc attagcaacc gcaaatctac accgaaactg 3480
gatgtctatt ctgatcaaat tgtttggggc agatcaccgg tgcgcatcga tatggcaggc 3540
ggctggacag atacaccgcc gtatagcctt tattctggag gcaatgttgt gaaccttgcg 3600
attgaattaa atggccaacc gccgcttcag gtctacgtta aaccgtgcaa agattttcat 3660
atcgttctga gatcaatcga tatgggagct atggaaatcg tgagcacatt tgatgaactg 3720
caagattaca agaaaattgg ctcaccgttt agcatcccga aagcagcgtt aagcctggcc 3780
ggatttgctc cggccttttc tgctgtcagc tatgcatcac tggaagaaca gcttaaagat 3840
tttggcgcag gaattgaagt tacactttta gctgccatcc cggcgggctc tggattaggc 3900
acaagctcta ttctggcttc aacagtgctt ggagccatca atgatttttg cggcctggca 3960
tgggataaaa acgaaatttg tcaaagaaca cttgtcttag aacagctgct tacaacaggc 4020
ggcggctggc aagatcagta tggcggagtc ctgcaaggag ttaaactgct gcagacagaa 4080
gctggctttg cccagtcacc gttagttcgc tggctgccgg atcatctttt tacacatccg 4140
gaatacaaag attgtcatct tttatactac acaggaatta caagaacagc aaaaggcatt 4200
ttagcggaaa tcgtgtcaag catgtttctg aatagctcac tgcatcttaa cctgcttagc 4260
gaaatgaaag cacatgcgct tgatatgaat gaagctattc aaagaggctc ttttgtcgaa 4320
tttggacgct tagttggcaa aacatgggaa cagaataaag ccctggatag cggaacaaac 4380
ccgccggcag tggaagcgat catcgatctg atcaaagatt acacactggg atacaaactg 4440
cctggagcag gcggcggcgg ctatctgtat atggttgcga aagatccgca agcagctgtg 4500
agaattagaa aaatcctgac agaaaatgct ccgaacccga gagcccgctt tgtggaaatg 4560
acactttcag ataaaggatt tcaggtctca agaagctaag ctcttaagga ggattttaga 4620
atgggttcta tcatcagact tcagggtggt ttaggcaatc aactgtttca atttagcttt 4680
ggttatgctc tttcaaaaat caatggcaca ccgctgtact ttgatatttc acattacgca 4740
gaaaacgatg atcatggcgg atatagactg aataaccttc aaatcccgga agaatatctt 4800
cagtactaca caccgaaaat caacaacatc tacaaactgc ttgtcagagg cagccgctta 4860
tatccggata tttttctgtt tcttggcttt tgcaacgaat ttcatgcgta tggctatgat 4920
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catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 10260
agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 10320
tatcacgagg ccctttcgtc 10340
Claims (15)
1.一种用于生产岩藻糖基化低聚糖的非孢子形成芽孢杆菌属细胞，其中所述细胞已被遗传工程化以具有乳糖通透酶、GDP-岩藻糖生物合成途径和岩藻糖基转移酶。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述孢子形成已通过编码Spo0A、σE和σf的基因中的一个或多个的缺失或功能性失活而受损。
3.根据权利要求1或2所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述乳糖通透酶是大肠杆菌LacY或其功能性变体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述GDP-岩藻糖生物合成途径是从头GDP-岩藻糖生物合成途径和/或补救途径。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述岩藻糖基转移酶是接受乳糖的岩藻糖基转移酶，优选地选自α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶的岩藻糖基转移酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中与相同种的野生型芽孢杆菌属祖细胞相比，所述芽孢杆菌属细胞缺少任何β-半乳糖苷酶活性或具有降低的β-半乳糖苷酶活性。
7.根据权利要求6所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞已通过至少一个选自yesZ和ganA的基因的缺失或功能性失活而被遗传工程化。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的芽孢杆菌属细胞用于生产岩藻糖基化低聚糖的用途。
10.一种用于生产岩藻糖基化低聚糖的方法，
-提供权利要求1至8中任一项所限定的非孢子形成芽孢杆菌属细胞；
-在允许生产岩藻糖基化低聚糖的培养基中和条件下培养所述芽孢杆菌属细胞；和任选地
-从所述培养基和/或芽孢杆菌属细胞中回收岩藻糖基化低聚糖。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述培养基含有乳糖。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述培养基含有L-岩藻糖。
13.通过根据权利要求10至12中任一项所述的方法生产的岩藻糖基化低聚糖。
14.根据权利要求13所述的岩藻糖基化低聚糖用于制备营养组合物的用途，优选用于婴儿配方物的用途。
15.含有根据权利要求13所述的岩藻糖基化低聚糖的营养组合物。
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