CN1910276A - 传染性法氏囊病病毒(ibdv)的嵌合空衣壳及其获得方法和应用 - Google Patents

传染性法氏囊病病毒(ibdv)的嵌合空衣壳及其获得方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空衣壳，其由(i)IBDVpVP2蛋白和(ii)包括连接到由包含目的多肽的异源多肽构成的区域B的由IBDV VP3蛋白构成的区域A的融合蛋白组装构成，该目的多肽例如是用于在疫苗、治疗或诊断中的多肽。

Description

传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空衣壳及其获得方法和应用
发明领域
本发明涉及传染性法氏囊病(bursal disease)病毒(IBDV)的嵌合空颗粒的生产及其应用。
发明背景
病毒颗粒是特化为包装和结合入核酸和蛋白质媒介物的结构。病毒颗粒的通常特征是它们的刺激宿主免疫反应的出色能力。这些特性使病毒颗粒成为开发细胞内递送系统和产生粒子疫苗的特别关注的工具。不同遗传表达系统的使用促进了不同类型病毒的病毒样颗粒或空病毒衣壳(VLP)的生产(美国专利6,458,362 Casal，et al.2002.Recombinant VP2 parvoviral pseudo-particles encoding CTL or T-helper cell epitopes(编码CTL或T辅助细胞抗原决定簇的重组VP2细小病毒假颗粒)；美国专利5,932,426 Baralle，et al.1999.Molecular presenting system(分子提呈系统)；美国专利6,602,705 Barnett，et al.2003 Expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles(HIV多肽的表达和病毒样颗粒的产生))。这些表达系统的遗传操作又使产生含有异源氨基酸序列的VLP成为可能，该异源氨基酸序列来自与形成天然病毒衣壳的那些蛋白质不同的蛋白质。这些VLP通常称为异型、重组或嵌合VLP(CVLP)。CVLP主要用于两个目的：(i)通过免疫相关异源多肽产生多价疫苗(Kingsman，A.J.，N.R.Burns，G.T.Layton，and S.E.Adams.1995.Yeastretrotransposon particles as antigen delivery systems(作为抗原递送系统的酵母反转座子颗粒).Ann.N.Y.Acad.Sci.754：202-213；Lo-Man，R.，P.Rueda，C.Sedlik，E.Deriaud，I.Casal，and C.Leclerc.1998.A recombinant virus-likeparticle system derived from parvovirus as an efficient antigen carrier to elicit apolarized Thl immune response without adjuvant(源自细小病毒的重组病毒样颗粒作为有效的抗原载体在无佐剂时引起极化的Thl免疫反应).Eur.J.Immunol.28：1401-1407；Qiu，Z.D.Ou，H.Wu，T.C.Hobma，and S.Gillam.1994.Expression and characterization of virus-like particles containing rubellavirus structural proteins(含有风疹病毒结构蛋白的病毒样颗粒的表达和表征).J.Virol.68：4086-4091)；以及(ii)通过插入与受体-配体相互作用有关的氨基酸序列修饰趋向性(Schmidt，U.，Rudolf，R，and Bmh，G.2001.Binding ofexternal ligand onto an engineered virus capsid(外部配体与工程化病毒衣壳的结合).Prot.Eng.14：769-774；Shin，Y.C.，and Folk，W.R.2003.Formation ofpolyoma virus-like particles with different molecules that bind the urokinaseplasminogen activator receptor(用结合尿激酶纤溶酶原活化受体的不同分子形成多瘤病毒样颗粒).J.Virol.77：11491-11498)。
CVLP一般通过表达融合到编码目的多肽的区域的负责形成病毒衣壳的病毒蛋白而获得。
属于双RNA病毒科(birnaviridae)的传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染不同的禽类，并直接造成严重的免疫抑制疾病，导致世界家禽业的重大经济损失。
IBDV颗粒为具有T＝13对称性的二十面体，它们缺少被膜，由单蛋白质层形成。迄今为止，旨在获得IBDV颗粒的原子模型的方法都没有成功。于是，得到的结构信息是基于通过纯化的病毒以及VLP的电子低温显微镜法得到的图像而产生的三维模型。基于这些研究，已证实颗粒的外表面由260个VP2蛋白(37kDa)三聚体的连续网格以5种不同的形式构成。颗粒的内表面含有200个VP3蛋白(29kDa)三聚体，后者之间相互独立，结合到VP2三聚体的基底区域。已表明第三种多肽VP4(28kDa)也可为颗粒的一部分，位于形成二十面体结构顶点的五聚体的基部。
VP2、VP3和VP4多肽由蛋白水解加工109kDa大小的多肽前体而产生。该前体经自催化加工，释放pVP2(48kDa)、VP3和VP4多肽。位于多聚蛋白中心区域的VP4结构域属于Lon蛋白酶家族，负责蛋白水解剪切。VP2和VP3多肽直接负责衣壳的组装。pVP2产物在形成成熟形式的在纯化的颗粒中存在的蛋白VP2之前在其C末端进行最后的剪切(Da Costa，B.，Chevalier，C.，Henry，C.，Huet，J.C.，Petit，S.，Lepault，J.，Boot，H.& Delmas，B.(2002).The capsid of infectious bursal disease virus contains several smallpeptides arising from the maturation process of pVP2(传染性法氏囊病病毒的衣壳含有几种由pVP2的成熟加工产生的小肽).Journal of Virology 76：2393-2402)。尽管还未鉴定出负责的蛋白酶，但该pVP2加工为正确形成衣壳所必需并需要VP3的存在(Maraver，A.，
Figure A20058000293700081
A.，Abaitua，F.，González，D.，Clemente，R.，Díaz-Ruíz，A.，Caston，J.，R.，Pazos，F.& Rodríguez，J.F.(2003).The oligomerization domain of VP3，the scaffolding protein of infectious bursaldisease virus，plays a critical role for capsid formation(作为传染性法氏囊病病毒的骨架蛋白的VP3寡聚结构域在衣壳形成中起关键作用).Journal ofVirology 77：6438-49)。
大体上，形态形成为病毒周期的必需过程，需要与多肽前体中的修饰有关的连续步骤。结果，病毒发展了使其各组分顺次和正确相互作用的策略。经常被二十面体病毒采用的这些策略之一是利用来自单一多聚蛋白的多肽作为它们结构组分的基础。这些情况下，所述多聚蛋白的合适的蛋白水解加工在组装过程中起关键作用。
这种IBDV衣壳组装的概念为早期的工作所证实(Fernández-Arias，A.，Risco，C.，Martínez，S.，Albar，J.P.& Rodríguez，J.F.(1998).Expression of ORFA1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-likeparticles(表达传染性法氏囊病病毒的ORF A1导致病毒样颗粒的形成).Journal of General Virology 79，1047-1054)。在真核细胞中编码IBDV多聚蛋白的基因的表达导致在形态和生化上完全不能与IBDV病毒粒子相区别的VLP的形成。也已显示病毒的衣壳的组装仅需合成和正确加工病毒多聚蛋白，而与病毒基因组或由病毒编码的诸如VP5和VP1的其它蛋白存在无关。
目前从IBDV基因在不同的重组系统中的表达得到的结果允许得出结论：i)该组装过程与病毒的遗传物质的存在无关，ii)仅仅由多聚蛋白基因编码的多肽为该组装所必需，以及iii)该组装需要pVP2和VP3多肽间协调地相互作用。
但是必需指出的是，还未知VP2/VP3间相互作用是在多聚蛋白前体还未经修饰时就在VP2和VP3结构域之间建立，或是相反，该相互作用出现在前体加工之后。此外，当前的信息不能排除VP4可能在病毒衣壳的形态形成中起相关的作用。实际上，已公开了由IBDV VP2、VP3和VP4蛋白组装的IBDV VLP(US 6,528,063，US 5,788,970和JP 5194597)。
由相同发明人进行的工作使得能用不同的真核表达载体构建用于获得IBDV VLP的系统。这些载体已用于在有或无病毒VP1 RNA聚合酶存在时的IBDV多聚蛋白的表达。纯化的VLP的生化特征证明，当仅表达病毒多聚蛋白时，它们含有pVP2、VP2和VP3蛋白，当同时进行多聚蛋白和病毒RNA聚合酶的表达时，它们含有pVP2、VP2、VP3和VP1蛋白(Fernández-Arias，A.，Risco，C.，Martínez，S.，Albar，J.P.& Rodriguez，J.F.(1998).Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in theformation ofvirus-like particles(传染性法氏囊病病毒的ORF A1的表达导致病毒样颗粒的形成).Journal of General Virology 79：1047-1054；Martínez-Torrecuadrada，J.L.，Castón，J.R.，Castro，M.，Carrascosa，J.L.，Rodríguez，J.F.& Casal，J.I.(2000).Different architectures in the assembly ofinfectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells(在昆虫细胞中表达的传染性法氏囊病病毒衣壳蛋白组装中的不同结构).Virology278：322-331；Maraver，A.，et al.，(2003)同前；Lombardo，E.，Maraver，A.，Castón，J.R.，Rivera，J.，Fernández-Arias，A.，Serrano，A.，Carrascosa，J.L.&Rodríguez，J.F.(1999).VP1，the putative RNA-dependent RNA polymerase ofinfectious bursal disease virus，forms complexes with the capsid protein VP3，leading to efficient encapsidation into virus-like particles(推测的传染性法氏囊病病毒RNA依赖的RNA聚合酶VP1与衣壳蛋白VP3形成复合物，导致有效地包装进病毒样颗粒中).Journal of Virology 73：6973-6983)。
另一方面，专利申请WO 02/088339公开了IBDV病毒样颗粒，其通过组装包括在其羧基端连接到多肽的IBDV多聚蛋白的嵌合蛋白而形成。
但是，仅基于IBDVpVP2和VP3的CVLP，其中后者VP3蛋白融合到目的多肽，或它们作为目的产物媒介物的可能性，在此之前没有公开。
发明概述
本发明是针对提供新的用于结合入诸如具有生物活性的分子的目的载体或媒介物产物的问题，该具有生物活性的分子，例如药物、多肽、蛋白质、核酸等等。
本发明提供的技术方案是基于可在同时表达IBDV pVP2和VP3的基础上产生IBDV嵌合空衣壳(CVLP)，其中VP3经遗传修饰以包括编码包含目的多肽的异源多肽的核酸序列。所获得的CVLP由(i)IBDV pVP2蛋白和(ii)包括连接到由包括目的多肽的异源多肽构成的区域B的由IBDV VP3蛋白构成的区域A的融合蛋白组装形成，其中所述区域B连接到所述IBDV VP3蛋白的氨基或羧基端。这些CVLP可用于治疗、预防或诊断目的等等，例如用于制备基因治疗载体或疫苗。
本发明人之前发现当IBDV VPX(pVP2)和VP3蛋白从独立的基因表达时，形成空IBDV颗粒(VLP)。这些VLP与那些通过表达对应于IBDV多聚蛋白的ORF而获得的VLP在结构上相同。作为开发新疫苗的策略的一部分，分析了采用该IBDV VLP生产策略获得含有异源氨基酸序列的CVLP的可能性，其中该异源氨基酸序列对应于目的肽，诸如组氨酸标签(实施例1)、GFP(实施例2)以及最终的参与免疫反应诱导的多肽(实施例3)。如所证实的，这些构建体中异源序列的融合不是CVLP形成的障碍。
作为参与免疫反应的转运肽的CVLP的研究模型，探讨了获得具有对应于疟疾CS蛋白(Plasmodium yoelii)CD8抗原决定簇(E-CD8)的序列的CVLP的可能性。该抗原决定簇负责针对这种病原体的CD8特异性的细胞免疫反应诱导。其可在来自BALB/c小鼠的脾细胞培养物中通过ELISPOT技术进行定量(实施例3)。
总之，得到的结果清楚地显示：(i)采用的表达系统使获得包含异源氨基酸序列的IBDV CVLP成为可能；以及(ii)用所述IBDV CVLP进行免疫诱导了针对CVLP内存在的异源氨基酸序列的特异性免疫反应。
因此，本发明的一方面涉及IBDV嵌合空衣壳，特征在于其由(i)IBDVpVP2蛋白和(ii)融合蛋白组装构成，该融合蛋白包括连接到由包括目的多肽的异源多肽构成的区域B的由IBDV VP3蛋白构成的区域A。
本发明的另一方面涉及基于所述IBDV pVP2和融合蛋白作为两独立基因的基因共表达而生产本发明提供的所述IBDV CVLP的方法。
开发的用于实施所述IBDV CVLP生产的所述方法的核酸、基因构建体、表达系统和宿主细胞，以及它们生产所述IBDV CVLP的用途，构成了本发明的其它方面。
所述IBDV CVLP能够结合入诸如为具有生物活性的分子的目的载体或媒介物产物，该具有生物活性的分子例如多肽、蛋白、核酸等等。在特定的实施方式中，所述IBDV CVLP可在内部结合入动物或人的媒介物抗原和免疫反应诱导物，所述IBDV CVLP提供给该动物或人，由此它们可用在制备针对由病毒、细菌、寄生虫或任何其它类型的微生物引起的人和动物疾病或针对肿瘤疾病的疫苗中。
在另一特定的实施方案中，所述IBDV CVLP用在制备基因治疗载体中。
因此，本发明的另一方面涉及所述IBDV CVLP在制备诸如疫苗和基因治疗载体的药物中的用途。所述疫苗和载体构成了本发明的另一方面。
附图简要说明
图1.(a)该图扼要表示了从多聚蛋白前体形成成熟VP2和VP3衣壳蛋白所需的蛋白水解加工步骤。(b)该图反映了衍生自到目前为止所描述的IBDV多聚蛋白的不同遗传构建体，以及通过其在不同的异源系统中表达所产生的结构。数字表示对应存在于每一构建体中的多聚蛋白的第一和最后氨基酸残基的位置。图的较下部分显示经表达不同构建体得到的结构通过透射电子显微镜法获得的图像。线条对应50nm。数据取自以下参考文献：Fernández-Arias et al.，(1998)，同上；Maraver et al.，(2003)，同上；Marínez-Torrecuadrada et al.，(2000)，同上；Castón et al.，2001.C terminal ofinfectious bursal disease Virus major capsid protein VP2 is involved in definitionof the tnumber for capsid assembly.Journal of Virology 75，10815-10828.
图2.H5昆虫细胞共表达pVP2和VP3的显微分析。通过共聚焦免疫显微镜分析pVP2和VP3蛋白的亚细胞分布。将采用FB/pVP2(a)、FB/VP3(b)或FBD/pVP2-VP3(c-e)rBV感染的细胞与兔抗-pVP2血清或鼠抗-VP3血清孵育。然后所述细胞与偶联到Alexa 488(红)的山羊抗兔IgG血清和偶联到Alexa 594(绿)的山羊抗大鼠IgG血清孵育。核心用To-Pro 3(蓝)染色。(e)为图(c)和(d)中显示的图像的叠加。对应采用衍生自IBDV多聚蛋白的不同遗传构建体感染的H5细胞切片的电子显微图像。(f)用亲本Fb病毒感染的H5细胞的低倍数图像。插图对应于由方框表示的区域的放大细节。(g)用FBD/pVPX-VP3病毒感染的H5细胞的低倍数图像。插图对应于由方框表示的区域的放大细节。(h)用FBD/pVPX-VP3病毒感染的H5细胞的高倍数图像，详细显示IBDV结构的形成。(i)用VTLacOI/POLY重组疫苗病毒感染的BSC1细胞的高倍数图像，显示了类似于插图(h)中检测的结构。线条对表示600nn(插图f和g)和200nm(插图h和i)。
图3.衍生自在FB/pVP2+FB/his-VP3重组杆状病毒(rBV)共感染的昆虫细胞中产生的IBDV的结构的生化和结构特征。用FB/pVP2和FB/his-VP3rBV共感染或用FBD/Poly-VP1或FB/pVP2病毒感染的细胞用于通过蔗糖梯度离心纯化IBDV衍生的结构。插图(a)，(b)和(c)分别显示对应于用FBD/Poly-VP1、FB/pVP2+FB/his-VP3和FB/pVP2感染而获得的梯度的级分4(fraction 4)的透射电子显微图像。插图(d)分别显示对应于用FBD/Poly-VP1和FB/pVP2+FB/his-VP3感染的培养物的蔗糖梯度的Western印迹分析结果。利用抗IBDV VP1、pVP2、VP3和VP4蛋白的特异血清通过Western印迹分别分析总提取物(进样)和蔗糖梯度的不同级分(级分F1对应于梯度的底部)。免疫活性多肽的分子质量以kDa表示。
图4.用质粒pESCURA/pVP2-VP3-GFP转化的S.cerevisiae中产生的IBDV VLP的生化和结构特征。质粒pESCURA/pVP2-VP3-GFP转化的S.cerevisiae培养物于30℃生长在含有半乳糖引子的培养基中。在18小时，收集并离心培养物。得到的沉淀物通过在25-50％线性蔗糖梯度中分级来进行处理。A)对应于分级前的沉淀物(T)及蔗糖梯度的不同级分的样品的生化分析。通过SDS-PAGE和采用针对VP3(抗-VP3)和pVP2(抗-pVP2)的特异抗体的Western印迹对样品进行分析。箭头分别表示对应于VP3-GFP(61kDa)和pVP2(48kDa)蛋白的免疫活性条带的位置。B)通过TEM对获得的样品进行结构分析。图像对应从与蔗糖梯度7、8和9级分的混合物对应的等份得到的显微照片。该样品用乙酸双氧铀染色并通过TEM进行观察。线条对应于65nm。C)采用VT3/Poly重组疫苗病毒(Fernández-Arias等人(1998)，同前)感染在哺乳动物中通过IBDV多聚蛋白的表达获得的VLP样品。线条对应于65nm。
图5.QVLPs-CD8的结构和生化特征。插图A显示采用乙酸双氧铀染色的样品的TEM图像，该图像对应于在共感染有FB/pVP2和PF/his-CD8-VP3 rBV的昆虫细胞提取物上进行结构纯化的蔗糖梯度的级分4。线条表示100nm。插图B显示对样品采用针对VP3蛋白的抗体进行的SDS-PAGE和Western印迹分析，该样品图像对应于在共感染有FB/pVP2和PF/his-CD8-VP3 rBV的昆虫细胞提取物上进行结构纯化的蔗糖梯度的级分4(QVLPs-CD8)(见插图A)。纯化的IBDV病毒(IBDV)样品用作对照。已标出分子量(MW)标记物以及估计的VP3和his-CD8-VP3蛋白的大小
图6.通过采用含有Plasmodium yoelii CD8抗原决定簇的IBDV CVLP免疫产生的特异性抗-疟疾CD8细胞免疫反应的增强效应。向BALB/c品系的4组小鼠中腹膜内接种50μg/小鼠的QVLP-CD8(组IV)或非嵌合VPL(组IIII)。接种表达全Plasmodium yoelii CHITOSAN蛋白的重组病毒VVpJRCS(107pfu/鼠)的组(组II)用作对照。15天后，所有组的小鼠采用VVpJRCS(107pfu/鼠)腹膜内免疫。其中一组此时接受单一剂量的病毒载体(组I)。第二次免疫15天后，宰杀小鼠，取出脾并针对疟疾CD8肽进行ELISPOT。插图A显示用不同浓度的脾细胞在有(+CD8)或无(-CD8)CD8肽存在时孵育后进行的ELISPOT孔的图像，其中该脾细胞得自属于各组之一的小鼠。插图B显示作为特异性IFN-γ/106脾细胞分泌细胞的数量得到的结果图。
发明详述
本发明在第一方面提供了 传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空衣壳，本发明以下记为CVLP，特征在于它由(i)IBDV pVP2蛋白和(ii)包括由IBDVVP3蛋白构成的区域A连接到由包括目的多肽的异源多肽构成的区域B的融合蛋白组装构成。
用在本发明中的术语“IBDV”指属于任何已知血清型(1或2)的不同IBDV株[作为说明，参见由van den Berg TP，Eterradassi N，Toquin D，Meulemans G.，en Rev Sci Tech 2000 19：509-43进行的综述]，术语“IBDVpVP2蛋白”和“IBDV VP3蛋白”指根据Sánchez和Rodríguez(1999)(SánchezAB，Rodríguez JF.Proteolytic processing in infectious bursal disease virus：identification of the polyprotein cleavage sites by site-directedmutagenesis.Virology(传染性法氏囊病病毒中的蛋白水解加工：通过位点特异的突变发生鉴定多聚蛋白剪切位点).1999 Sep 15；262(1)：190-199)给出的定义，代表提到的任何IBDV株的不同形式的pVP2和VP3蛋白[NCBI蛋白质数据库]，以及基本上同源于所述IBDV pVP2和VP3蛋白的蛋白，即其氨基酸序列与所述IBDV pVP2和VP3蛋白有至少60％、优选至少80％、更优选至少90％并且甚至更优选至少95％的同一性程度。
存在于本发明CVLP中的IBDV pVP2蛋白可以是代表任何IBDV株的任何pVP2蛋白，例如IBDV Soroa株的全长pVP2蛋白[NCBI登录号AAD30136]。
存在于本发明CVLP中的融合蛋白包括由IBDV VP3蛋白构成的区域A连接到由包括目的多肽的异源多肽构成的区域B。在特定的实施方案中，所述区域B连接到所述IBDV VP3蛋白的氨基端区域或羧基端区域。
构成所述融合蛋白区域A的IBDV VP3蛋白可以是代表任何IBDV株的任何VP3蛋白，例如IBDV Soroa株的全长VP3蛋白[NCBI登录号AAD30136]。
存在于所述融合蛋白中的区域B由包括目的多肽的异源多肽构成。用在本发明中的术语“异源多肽”指不属于天然IBDV衣壳的多肽。目的多肽的大小可在大的区间内变动，从几个氨基酸直至数百个氨基酸。所述目的多肽几乎可以是任何适于以重组方式表达的多肽，而不论其来源(真核的、原核的、病毒的等等)。但是，在特定的实施方案中，所述的目的多肽是用于在免疫接种、治疗或诊断中的多肽，诸如能够在动物和人体内诱导针对由病毒、细菌、寄生虫或任何其它类型的微生物引起的疾病或针对肿瘤疾病的抗原决定簇或决定抗原。
在特定的实施方案中，所述区域B包括单一的目的多肽。但是，在另一实施方案中，所述区域B包括能以前后方式排列的相同或不同的两个或多个目的多肽。
在特定的实施方案中，所述融合蛋白包括区域A连接到单一的区域B。这时，所述区域B可连接到存在于区域A中的VP3的氨基端区域或者VP3的氨基端区域。如前所述，区域B可含有一个或多个目的多肽。在特定的实施方案中，所述区域B含有单一的目的多肽，但在另一特定的实施方案中，所述区域B含有两个或多个不同的目的多肽。
在另一特定的实施方案中，所述融合蛋白包括区域A连接到两个区域B，其中一个连接到存在于区域A中的VP3的氨基端区域，另一个连接到存在于区域A中的VP3的羧基端区域。所述区域B可相同或不同，并且每一区域B可含有一个或多个目的多肽，这些目的多肽可相同或不同。在特定的实施方案中，融合蛋白包括区域A连接到含有第一目的多肽(B1)的第一区域B和含有第二目的多肽(B2)的第二区域B。所述目的多肽(B1)和(B2)可相同或不同。在特定的实施方案中，所述目的多肽(B1)和(B2)相互间不同。
通常，区域A(由IBDV VP3蛋白构成)不直接连接到所述区域B(由包含目的蛋白的异源多肽构成)，而是通过所述区域A和B之间的接头多肽连接。因此，如果需要，本发明的融合蛋白可进一步包含位于所述区域A和B之间的接头多肽。有利的是，所述接头多肽为具有结构柔性的肽，优选产生出能诱导或不能诱导免疫反应的非结构性结构域。作为例子，所述柔性肽可含有特别为Gly和Ser残基的氨基酸残基重复或任何合适的氨基酸残基重复。
本发明的CVLP可通过在合适的宿主细胞中同时表达所述IBDV pVP2蛋白和包括所述区域A和B的所述融合蛋白而获得。所述合适的宿主细胞为以单一基因构建体或以两基因构建体的形式含有包括区域A和B的所述融合蛋白的编码核苷酸序列和IBDV pVP2蛋白的编码核苷酸序列的细胞。在特定的实施方案中，所述合适的宿主细胞为用合适的表达系统转化、转染或感染的细胞，该表达系统例如为包含基因构建体的表达系统，其中所述基因构建体包括编码包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列和编码IBDV pVP2蛋白的核苷酸序列，或者所述表达系统包括第一基因构建体和第二基因构建体，其中第一基因构建体包括包含编码区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列，第二基因构建体包括编码IBDV pVP2蛋白的核苷酸序列。
因此，本发明在另一方面提供了核酸，该核苷酸序列包括编码所述融合蛋白的核苷酸序列，该融合蛋白形成本发明CVLP的一部分并且包括由IBDV VP3蛋白构成的区域A连接到由包括目的多肽的异源多肽构成的区域B，其中所述区域B连接到所述IBDV VP3蛋白的氨基端区域或羧基端区域。任选地，如果需要，本发明提供的核酸可含有编码IBDV pVP2的核苷酸序列。更具体地，在特定的实施方案中，本发明提供的核酸序列包括(i)包括对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，(ii)包括包含一个或多个目的多肽的一个或多个异源多肽的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，以及视情况而任选地(iii)包括对应于IBDV pVP2蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列。
在另一特定的实施方案中，本发明提供的核酸序列包括(i)包括对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，(ii)包括一个或多个异源多肽的开放阅读框或编码区域的第一核苷酸序列，所述异源多肽包含一个或多个目的多肽的开放阅读框或编码区域，(ii’)包括包含一个或多个目的多肽的一个或多个异源多肽的开放阅读框或编码区域的第二核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可各自与第一核苷酸序列相同或不同，以及视情况而任选地(iii)包括对应于IBDV pVP2蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列。这时，所述第一或第二核苷酸序列的一个可操作地连接到包括对应于IBDVVP3蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列的5’端，而另一个可操作地连接到包括对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列的3’端。
用在本说明书中的术语“对应于pVP2蛋白的开放阅读框”或“对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框”，除了所述开放阅读框的核苷酸序列以外，还包括类似于IBDV pVP2和VP3蛋白的相同编码框的其它开放阅读框。同样，术语“包含一个或多个多肽的一个或多个异源多肽的开放阅读框”包括包含一个或多个目的多肽的所述异源多肽的任何编码核苷酸序列。这里使用的术语“类似”意图包括任何核苷酸序列，该核苷酸序列可以是分离的或基于IBDV pVP2和VP3的编码核苷酸序列构建的，例如通过引入保守或非保守核苷酸置换，包括在分子的任意端插入一个或多个核苷酸，添加一个或多个核苷酸，或在任意端或序列内部删除一个或多个核苷酸。通常，类似于另一核苷酸序列的核苷酸序列基本上同源于所述核苷酸序列。表达“基本上同源”在本说明书中的意义为，在核苷酸水平，所讨论的核苷酸有至少60％、优选有至少80％、更优选有至少90％并甚至更优选有95的同一性程度。
在另一方面，本发明提供了包括本发明提供的核酸的 基因构建体，即其核苷酸序列包括编码包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列，以及任选地编码所述IBDV pVP2蛋白的核苷酸序列。更具体地，在特定的实施方案中，本发明提供的基因构建体包括核苷酸序列，该核苷酸序列包含(i)包括对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列和(ii)包括包含一个或多个目的多肽的一个或多个异源多肽的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，以及视情况而任选地(iii)包括对应于IBDV pVP2蛋白的开放阅读框或编码区的核苷酸序列。在另一特定的实施方案中，本发明提供的基因构建体包括核苷酸序列，该核苷酸序列包含(i)包括对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，(ii)包括包含一个或多个目的多肽的一个或多个异源多肽的开放阅读框或编码区域的第一核苷酸序列，(ii’)包括包含一个或多个目的多肽的一个或多个异源多肽的开放阅读框或编码区域的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列可各自与第一核苷酸序列相同或不同，以及视情况而任选地(iii)包括对应于IBDV pVP2蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列。这时，所述第一或第二核苷酸序列的一个可操作地连接到包括对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列的5’端，而另一个可操作地连接到包括对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列的3’端。
在另一方面，本发明提供 表达载体或系统，其选自：
a)包括可操作地连接到转录及任选的翻译控制元件的本发明提供的基因构建体酸表达系统，其中所述的基因构建体包括编码包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列以及编码IBDV pVP2蛋白的核苷酸序列；以及
b)包括可操作地连接到转录及任选的翻译控制元件的本发明提供的第一基因构建体和可操作地连接到转录及任选的翻译控制元件的第二基因构建体的表达系统，其中所述第一基因构建体包括编码包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列，所述第二基因构建体包括编码IBDV pVP2蛋白的核苷酸序列。
在特定的实施方案中，本发明提供的表达系统包括基因构建体，该基因构建体包含(i)包括对应于IBDV VP3的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，(ii)包括包含一个或多个目的多肽的一个或多个异源多肽的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，以及(iii)包括对应于IBDV pVP2蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，其中所述基因构建体可操作地连接到转录及任选的翻译控制元件。
在另一特定的实施方案中，本发明提供的表达系统包括可操作地连接到转录及任选的翻译控制元件的第一基因构建体以及可操作地连接到转录以及任选的翻译控制元件第二基因构建体，其中所述第一基因构建体包含(i)包括对应于IBDV VP3的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，和(ii)包括包含一个或多个目的多肽的一个或多个异源多肽的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列；其中第二基因构建体包括包含对应于IBDV pVP2蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列。
存在于本发明提供的表达系统中的转录及任选的翻译控制元件包括指导可操作地与其连接的目的核苷酸序列(pVP2、VP3和异源多肽)的转录的启动子，以及转录和其在时间和位置上合适的调节所必需或适合的其它序列，例如起始和终止密码子、剪切位点、多聚腺甘酸信号、复制起点、转录激活子(增强子)、转录沉默子(沉默子)等等。
实际上任何合适的表达系统或载体可用于产生本发明提供的表达系统。举例来说，根据每一特定情况的条件和需要，所述合适的表达或载体系统可选自质粒、杆粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、基于噬菌体P1的人工染色体(PAC)、粘粒、病毒，它们可进一步具有例如细菌或酵母的异源复制起点，以便能在细菌或酵母中扩增，以及用于选择不同于一个或多个目的基因的转染细胞的标记物。这些表达系统或载体可通过本领域技术人员所知的常用方法获得[Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.(1989).Molecular cloning：a laboratory manual，2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory]，并构成了本发明的一部分。在特定的实施方案中，所述表达或载体系统诸如为适于转化酵母的质粒，例如称为pESCURA/pVP2-VP3-GFP(实施例2)的质粒，或诸如重组杆状病毒(rBV)的病毒，例如称为FBD/pVP2-his-VP3的在昆虫细胞内在复制周期中同时表达两种蛋白(pVP2和VP3)的rBV(实施例1.2)，或称为FB/pVP2和FB/his-VP3的rBV(实施例1.1)，当它们共转染昆虫细胞，分别表达IBDV pVP2和his-VP3蛋白，得到具有6个组氨酸(6his)异源多肽的IBDV CVLP，或称为FB/pVP2和FB/his-CD8-VP3的rBV(实施例3)，当它们共转染昆虫细胞，分别表达IBDV pVP2蛋白和his-CD8-VP3，形成称为CD8-CVLP的衣壳。
在另一方面，本发明提供了 宿主细胞，其以单一构建体或两不同的基因构建体形式含有包含区域A和B的所述融合蛋白的编码核苷酸序列和IBDVpVP2的编码核苷酸序列。在特定的实施方案中，所述宿主细胞为用表达系统转化、转染或感染的宿主细胞，该表达系统为(i)本发明提供的包括任一基因构建体表达系统，其中所述基因构建体包括编码所述IBDV pVP2蛋白的核苷酸序列和编码包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列，以及IBDV pVP2蛋白的编码核苷酸序列，或可选择地为(ii)包括第一构建体和第二构建体的表达系统，该第一构建体包括编码包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列，该第二构建体包括编码所述IBDV pVP2蛋白的核苷酸序列。
在特定的实施方案中，所述宿主细胞为用包括基因构建体的表达系统转化、转染或感染的宿主细胞，该基因构建体包括(i)包括对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，(ii)包括包含目的多肽的异源多肽的开放阅读框或编码区域的第一核苷酸序列，以及(iii)包括对应于IBDVpVP2蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，其中所述基因构建体可操作地连接到转录以及任选的翻译控制元件。
在另一特定实施方案中，本发明提供的宿主细胞为用(a)可操作地连接到转录及任选的翻译控制元件的第一基因构建体和(b)可操作地连接到转录及任选的翻译控制元件的第二基因构建体转化、转染或感染的宿主细胞，其中所述第一基因构建体包括(i)包括对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，和(ii)包括开放阅读框或编码区域的核苷酸序列，所述开放阅读框或编码区域包含目的多肽的异源多肽，所述第二基因构建体包括对应于IBDV pVP2蛋白的开放阅读框或编码区域的核苷酸序列。
实际上可以采用任何适于由本发明提供的表达系统转化、转染或感染的的宿主细胞，例如哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞、酵母等等；但是，在特定的实施方案中，所述宿主细胞选自酵母和昆虫细胞。由于简单和生产成本的原因，酵母是适合的。当表达系统包括一种或两种重组杆状病毒(rBV)时，昆虫细胞是合适的。由于涉及杆状病毒的宿主范围的生物安全因素，不能在非昆虫细胞的其它细胞中复制，rBV的使用是有利的。
在特定的实施方案中，本发明提供了诸如酵母的宿主细胞，例如Saccharomyces cerevisiae，Saccharomyces pombe等等，它们经诸如质粒或表达载体的表达系统转化，该表达系统包括本发明提供的基因构建体，该基因构建体包括编码包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸系列和编码IBDVpVP2蛋白的核苷酸序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供了诸如昆虫的细胞的宿主细胞，其经诸如重组杆状病毒的表达系统感染，该表达系统包括本发明提供的基因构建体，该基因构建体包括编码包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列和编码IBDV pVP2蛋白的核苷酸序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供了诸如昆虫的细胞的宿主细胞，其经包括第一重组杆状病毒和第二重组杆状病毒的表达系统共感染，该第一重组杆状病毒包括本发明提供的包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列基因构建体，该第二重组杆状病毒包括本发明提供的包含编码IBDV pVP2蛋白的核苷酸序列的基因构建体。
在另一方面，本发明提供了 产生本发明CVLP的方法，包括培养本发明提供的宿主细胞，该宿主细胞以单一构建体或两不同的基因构建体形式含有包含区域A和B的所述融合蛋白的编码核苷酸序列和IBDV pVP2的编码核苷酸序列，并且同时表达所述IBDV pVP2蛋白和包含区域A和B的融合蛋白，以及如果需要的话，回收本发明的所述CVLP。在特定的实施方案中，本发明提供的所述宿主细胞为用诸如包括基因构建体的合适的表达系统转化、转染或感染的宿主细胞，其中所述基因构建体包括编码包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列和编码IBDV pVP2的核苷酸序列，或者本发明提供的所述宿主细胞为用包括第一基因构建体和第二基因构建体的表达系统转化、转染或感染的宿主细胞，该第一基因构建体包括编码包含区域A和B的所述融合蛋白的核苷酸序列，该第二基因构建体包括编码IBDV pVP2的核苷酸序列。
因此，所述方法包括IBDV pVP2蛋白和包含区域A和B的融合蛋白作为两个独立基因的基因共表达。在所述细胞内同时表达所述蛋白(IBDV pVP2蛋白和包含区域A和B的融合蛋白)后，表达的蛋白组装并形成本发明的CVLP，如果需要，可将其从培养基分离或取出并纯化。分离和纯化本发明的所述CVLP可通过常用方法进行，例如通过蔗糖梯度分级。
在特定的实施方案中，通过采用允许在昆虫细胞中由两独立的嵌合基因同时表达IBDV pVP2蛋白和包含区域A和B的融合蛋白的rBV，同时进行所述蛋白的基因共表达。这时，本发明提供的产生本发明CVLP的方法包括，首选获得由包含同时编码IBDV蛋白和包含区域A和B的融合蛋白的基因构建体的rBV构成的基因表达系统，该表达系统例如为称为FBD/pVP2-his-VP3的rBV(实施例1.2)，或者分别获得含有编码IBDV pVP2的基因构建体的rBV和获得含有编码包含区域A和B的所述融合蛋白的基因构建体的另一rBV，例如称为FB/pVP2和FB/his-VP3的rBV(实施例1.1)或称为FB/pVP2和FB/his-CD8-VP3的rBV(实施例3)，然后用基于所述重组杆状病毒的所述表达系统感染昆虫细胞，表达重组蛋白，以及如果需要的话，分离通过组装所述IBDV pVP2蛋白和包含区域A和B的融合蛋白形成的本发明的CVLP，以及任选地随后纯化本发明的所述CVLP。
使得独立表达IBDV pVP2蛋白和包含区域A和B的融合蛋白的重组杆状病毒的构建可由本领域的任何技术人员基于本文的描述和与此技术有关的现有技术(Cold Spring Harbor，N.Y.；Leusch MS，Lee SC，Olins PO.1995.Anovel host-vector system for direct selection of recombinant baculoviruses(bacmids)in Escherichia coli(用于在大肠杆菌中直接选择重组杆状病毒(杆粒)的新宿主载体系统).Gene 160：191-4；Luckow VA，Lee SC，Barry GF，Olins PO.1993.Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses bysite-specific transposon-medited insertion of foreign genes into a baculovirusgenome propagated in Escherichia coli(通过位点特异的转座子介导将外源基因插入在大肠杆菌中繁殖的杆状病毒基因组中有效地产生传染性重组杆状病毒).J Virol 67：4566-79)而完成。
在另一特定的实施方案中，通过采用允许在酵母细胞中表达所述蛋白的载体进行IBDV pVP2蛋白和先前定义的包含区域A和B的融合蛋白的基因共表达。这时，本发明提供的产生本发明的CVLP的方法包括，首先，获得由含有同时编码IBDV pVP2蛋白和包含区域A和B的所述融合蛋白的基因构建体的质粒构建的基因表达系统，然后用所述表达系统转化酵母，表达重组蛋白，以及如果需要的话，分离通过组装所述IBDV pVP2蛋白和包含区域A和B的融合蛋白形成的本发明的CVLP，以及任选地随后纯化本发明的所述CVLP。在特定的实施方案中，转化酵母的合适表达系统为基于pESCYeast(Stratagene)的表达系统，例如含有编码IBDV pVP2蛋白和VP3-GFP蛋白的基因构建体的质粒pESCURA/pVP2/VP3-GFP(实施例2)。
本领域的任何技术人员基于本文的描述和与此技术有关的现有技术(pESC epitope tagging vectors Instructions manual(pESC抗原决定簇标签载体指导手册).Stratagene www.Stratagene.com；Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，andManiatis，T.(1989).Molecular cloning：a laboratory manual，2nd ed.Cold SpringHarbor Laboratory)可获得允许同时表达IBDV pVP2蛋白和包含区域A和B的融合蛋白的基因构建体、或合适表达系统或载体转化的酵母。
本发明在另一方面涉及本发明提供的 基因表达系统在产生和获得本发明的CVLP中 的用途。
本发明的CVLP可用作目标产物的载体或媒介物，该目标产物为诸如具有生物活性的分子，例如药物、多肽、蛋白、核酸等等，由此它们可用于治疗或诊断或研究目的。在特定的实施方案中，所述生物目的分子包括目的多肽，例如在它们所给予的动物或人体内的抗原或免疫反应诱导物，或希望引入合适细胞内部的在基因治疗中有用的核酸序列。
因此，本发明在另一方面涉及 本发明的CVLP在制备药物中的用途，这些药物例如为疫苗、基因治疗载体(递送系统)等等。在特定的实施方案中，所述药物为意欲赋予保护作用的疫苗，该保护作用针对由病毒、细菌、寄生虫、或任何其它类型的微生物引起的人类或动物疾病，或针对肿瘤疾病。在另一特定的实施方案中，所述药物为基因治疗载体。
本发明在另一方面提供疫苗，其包括治疗有效量的本发明CVLP，任选地连同一种或多种药物可接受的佐剂和/或赋形剂。所述疫苗用于使人类和动物免于由微生物(病毒、细菌、寄生虫等等)引起的疾病或肿瘤疾病。在特定的实施方案中，所述疫苗特别用在同时使动物或人类免于由两种或多种感染性致病物引起的感染。举例来说，本发明提供的疫苗可用于使例如鸡、火鸡、鹅、雉鸡、鹌鹑、鸵鸟等等的禽类免于传染性法氏囊病病毒(IBDV)和一种或多种引起禽类疾病的感染物(禽类病原体)。
用在本说明书中的表达“治疗有效量”指计算的用于产生希望的效果的本发明CVLP的量，通常由但不限于通过CVLP的特性和达到的免疫效果而确定。
所述疫苗中可采用的药物可接受的佐剂和赋形剂为本领域技术人员所知并且为疫苗制备上通常使用的佐剂和赋形剂。
在特定的实施方案中，所述疫苗为在药物可接受的稀释液中以水溶液形式或悬浮液形式制备的，该稀释液例如为盐溶液、磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)或任何其它药物可接受的稀释液。
本发明提供的疫苗可通过任何合适的给药途径给药，其引起针对采用的异源序列或抗原决定簇的保护性免疫反应，为此所述疫苗将配制为适于所选择的给药途径的剂型。在特定的实施方案中，本发明提供的疫苗的给药在肠道外进行，例如腹膜内、皮下等等。
以下的实施例阐述了本发明，但不用理解为限制其范围。
实施例1
在昆虫细胞中获得IBDV CVLP
1.1通过两独立的rBV，在昆虫细胞中得到IBDV CVLP，VP2-his-VP3
本实施例描述了设计为分析从两独立嵌合基因共表达IBDV pVP2和VP3蛋白以及异源多肽而获得IBDV CVLP的可能性的一系列试验的结果。为此，采用了上述的两重组杆状病毒(rBV)FB/his-VP3(Kochan，G.，González，D.& Rodríguez，J.F.(2003)Characterization of the RNA binding activity of VP3，a major structural protein of IBDV(IBDV主要结构蛋白VP3的RNA结合活性特征).Archiyes of Virology 148，723-744)和这里引述为FB/pVP2的FB/VPX(Martínez-Torrecuadrada，J.L.，Castón，J.R.，Castro，M.，Carrascosa，J.L.，Rodríguez，J.F.& Casal，J.I.(2000).Different architectures in the assembly ofinfectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells(在昆虫细胞中表达的传染性法氏囊病病毒衣壳蛋白组装中的不同结构).Virology278，322-331)。这些rBV通过将IBDV pVP2和pVP3蛋白的互补DNA(cDNA)编码链克隆进合适的载体而产生。所述cDNA通过RT-PCT从I血清型IBDVSoroa株基因组的A片段获得(NCBI登录号AAD30136)。rBV FB/his-VP3表达在VP3蛋白N末端含有一串融合到VP3序列(多聚蛋白的Met754-Glu1012)的六个组氨酸的嵌合VP3蛋白，称为his-VP3。rBV FB/pVP2表达pVP2蛋白的编码区(Mel1-Ala512)。
在细胞培养物中进行这些pVP2和his-pVP3蛋白的表达分析，无论是独立还是一起表达。为了进行这些试验，采用了来自昆虫Trichloplusia ni(H5，Invitrogen)的单层细胞培养物，其生长在盖玻片上。所述培养物单独感染FB/pVP2、FB/his-VP3或共感染两rBV。感染复制数为5pfu/细胞。细胞在感染后48小时固定(h.p.i)，并与兔抗-VP2多克隆血清和大鼠抗-VP3多克隆血清孵育(Fernández-Arias，A.，Risco，C.，Martínez，S.，Albar，J.P.& Rodríguez，J.F.(1998).Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results inthe formation of virus-like particles(表达传染性法氏囊病病毒的ORF A1导致病毒样颗粒的形成).Journal of General Virology 79，1047-1054)。在相继的清洗之后，所述盖玻片与偶联有Alexa 594山羊抗-大鼠血清和偶联有Alexa 488的山羊抗-兔血清(Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc)孵育。细胞核心用特异的To-Pro-3标记物(Molecular Probes，Inc.)染色。最后采用配备有BioRad Radiance 2100共聚焦系统的Zeiss Axiovert 200显微镜通过表面荧光显微观察样品。采用Laser Sharp Package(Bio Rad)软件设备存储得到的图像。如图2a所示，在感染FB/pVP2的培养物中，抗-VP2血清显示与管状结构混合的小颗粒信号，二者分布在整个细胞质中。在用rBV FB/his-VP3感染的细胞中检测的抗-VP3信号特征在于球形和明显中空的围绕核心的堆积物。在用两rBV共感染的培养物中，检测到两种蛋白的分布模式的明显改变。在这些细胞中，pVP2和VP3的特异信号共存于球形和密集堆积物中，表明它们的共表达使得形成pVP2/his-VP3复合物(图2c-2e)。
为了更详细的表征这些结构，通过透射电子显微镜(TEM)分析了对应于FB/pVP2+FB/hisVP3感染的细胞的类似提取物。作为对照，并且平行地，用FBD(FastBacDual，Invitrogen)病毒野生株感染的H5细胞培养物采用同样技术进行分析。在感染后，在48小时后收集细胞，并以前述的方式(Fernández-Arias，A.，Risco，C.，Martínez，S.，Albar，J.P.& Rodríguez，J.F.(1998).Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in theformation of virus-like particles(表达传染性法氏囊病病毒的ORF A1导致病毒样颗粒的形成).Journal of General Virology 79，1047-1054)进行处理，以便在超薄切片中通过透射电子显微镜进行分析。如图2所示，共感染细胞的细胞质含有由小管和类似于衣壳的结构形成的聚集物(图2g、2h和2i)。在所有情况下都没有在对应于用野生型FBD病毒感染的细胞的样品中观察到这些聚集物(图2f)。所述小管以及类似于衣壳的结构的外观和大小类似于前述的用VT7/Poly感染的细胞培养物中的那些，其中VT7/Poly为表达IBDV多聚蛋白基因的牛痘病毒的重组体(Fernández-Arias，A.，Risco，C.，Martínez，S.，Albar，J.P.& Rodríguez，J.F.(1998).Expression of ORF A1 of infectious bursaldisease virus results in the formation of virus-like particles(表达传染性法氏囊病病毒的ORF A1导致病毒样颗粒的形成).Journal of General Virology 79，1047-1054)。
为了正确无误地确定pVP2和his-VP3的共表达使组装成为可能并由此获得CVLP，决定纯化形成的颗粒。为此，用FB/pVP2+FB/his-VP3感染H5细胞培养物。在60h.p.i时，匀浆细胞，如以前所述在蔗糖梯度上分离提取物(Lombardo E.，Maraver A.，Castón J.R.，Rivera J.，Fernández-Arias A.，SerranoA.，Carrascosa，J.L.& Rodríguez，J.F.(1999).VP1，the putativeRNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus，formscomplexes with the capsid protein VP3，leading to efficient encapsidation intovirus-like particles(推测的传染性法氏囊病病毒RNA依赖的RNA聚合酶VP1与衣壳蛋白VP3形成复合物，导致有效地包封进病毒样颗粒中).Journal ofVirology 73：6973-6983)。离心后，分出各梯度，如以前所述采用TEM分析不同的级分(Lombardo E.，Maraver A.，Castón J.R.，Rivera J.，Fernández-AriasA.，Serrano A.，Carrascosa，J.L.& Rodríguez，J.F.(1999).VP1，the putativeRNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus，formscomplexes with the capsid protein VP3，leading to efficient encapsidation intovirus-like particles(推测的传染性法氏囊病病毒RNA依赖的RNA聚合酶VP1与衣壳蛋白VP3形成复合物，导致有效地包装进病毒样颗粒中).Journal ofVirology 73：6973-6983)。作为对照并按照相同的方法，分出对应于用rBVFB/VPX或用rBV FBD/Poly-VP1感染的细胞提取物的梯度。重组病毒FBD/Poly-VP1同时表达VP1多肽和多聚蛋白。可以预料的，用FBD/Poly-VP1感染具有有效产生VLP的结果(Maraver A.， A.，Abaitua F.，González D.，Clemente R.，Diaz-Ruiz A.，Caston J.R.，Pazos F.& Rodríguez J.F.(2003).Theoligomerization domain of VP3，the scaffolding protein of infectious bursaldisease virus，plays a critical role for capsid formation(作为传染性法氏囊病病毒的骨架蛋白的VP3寡聚结构域在衣壳形成中起关键作用).Journal ofVirology 77：6438-49)。在另一方面，对应于用FB/VPX感染的细胞的级分只含有扭转外观的小管。对应于rBV FB/pVP2+FB/his-VP3共感染的细胞的梯度在接近梯度底部的级分中含有刚性的I型小管，在中部和顶部级分中含有CVLP(图3b)。从rBV FB/pVP2+FB/his-VP3共感染的细胞中分离的CVLP有65-70nm的直径以及典型的多边形轮廓，完全不能与用FBD/Poly-VP1(Maraver A.，
Figure A20058000293700261
A.，Abaitua F.，González D.，Clemente R.，Diaz-Ruiz A.，Caston J.R.，Pazos F.& Rodríguez J.F.(2003).The oligomerizationdomain of VP3，the scaffolding protein of infectious bursal disease virus，plays acritical role for capsid formation(作为传染性法氏囊病病毒的骨架蛋白的VP3寡聚结构域在衣壳形成中起关键作用).Journal of Virology 77：6438-49)感染或用VT7/Poly(Fernández-Arias，A.，Risco，C.，Martínez，S.，Albar，J.P.&Rodríguez，J.F.(1998).Expression or ORF A1 ofinfectious bursal disease virusresults in the formation of virus-like particles(表达传染性法氏囊病病毒的ORFA1导致病毒样颗粒的形成).Journal of General Virology 79，1047-1054)感染的培养物的纯化VLP相区别。
为了得到获得的材料的生化特征，进行了Western印迹实验，其中采用抗VP1、pVP2、VP3和VP4蛋白的特异血清(Fernández-Arias等人1998，同前；Lombardo et al.，2000)比较了不同的级分。用IBDV感染的细胞提取物用作对照。得到的结果显示于图3d中。如所预料的，仅在对应FBD/Poly-VP1感染的细胞的样品中检测到对应VP1和VP4多肽的带。在对应于用FBD/Poly-VP1感染或用FB/VPX+FB/his-VP3共感染的细胞的样品中对应于pVP2/VP3的模式是相似的，检测到分别对应于pVP2和VP3的两条带。
1.2通过单一rBV，在昆虫细胞中得到IBDV CVLP，pVP2-his-VP3
此外，进行了质粒pFBD/pVP2-his-VP3的构建。该构建的第一步通过将pVP2蛋白的编码区克隆进pFBDual载体(Invitrogen)而完成。对应于pVP2的DNA片段采用称为Oligo I(SEQ ID NO：1)和Oligo II(SEQ ID NO：2)的寡核苷酸通过利用质粒pVOTE.2/Poly作为模板进行PCR而得到(Fernández-Arias，A.，Risco，C.，Martínez，S.，Albar，J.P.& Rodríguez，J.F.(1998).Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in theformation of virus-like particles(表达传染性法氏囊病病毒的ORF A1导致病毒样颗粒的形成).Journal of General Virology 79，1047-1054)。纯化该片段，经BglII和HindIII酶消化并克隆进之前用BamHI和Hindi酶消化的pFBDual载体(Invitrogen)中。得到的质粒称为pFBD/pVP2。然后，通过用RsrII酶消化质粒pFB/his-VP3(Kochan et al.，同前)、用Klenow进行处理并随后用KpnI限制性酶切而得到含有对应于VP3蛋白的开放阅读框的DNA片段。纯化该DNA片段并克隆进之前用SmaI和KpnI酶消化的质粒pFBD/pVP2中。得到的质粒称为pFBD/pVP2-his-VP3(SEQ ID NO：3)，包括pVP2蛋白和含有异源组氨酸6序列的his-pVP3融合蛋白的编码核苷酸序列(后者由SEQ IDNO：3的6734-7585核苷酸的互补链编码)。由包含在所述质粒pFBD/pVP2-his-VP3中的核苷酸序列编码的pVP2蛋白和his-VP3融合蛋白(pVP2-his-VP3)的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。
质粒pFBD/pVP2-his-VP3使获得称为FBD/pVP2-his-VP3的rBV成为可能，该rBV在其复制周期中同时表达两种蛋白[http://invitrogen.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf]。
采用FBD/pVP2-his-VP3在昆虫细胞中得到的结果与那些通过出VFB/pVP2和FD/his-VP3共感染得到的结果相同，得到具有六个组氨酸(6his)的IBDV CVLP。
实施例2
在酵母细胞中获得IBDV CVLP，pVP2-VP3-GFP
为了研究在酵母培养物(Saccharomyces cerevisiae)中获得IBDV CVLP的可能性，制备了载体pESCURA/pVP2-VP3-GFP，其中异源GFP基因连接到VP3的N端。构建该载体的第一步通过将pVP2蛋白的编码区域克隆进载体pESCURAinv而完成。质粒pESCURAinv通过用PvuII酶消化载体pRS426(Stratagene)并重新连接而产生。得到的载体pESCURAinv在相对于亲本载体pRS426的反转位置含有多克隆区域。采用称为Oligo III(SEQ IDNO：5)和Oligo IV(SEQ ID NO：6)的寡核苷酸通过利用质粒pVOTE.2/Poly作为模板进行PCR得到对应于pVP2蛋白的DNA片段(Fernández-Arias，A.，Risco，C.，Martínez，S.，Albar，J.P.& Rodríguez，J.F.(1998).Expression of ORFA1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-likeparticles(表达传染性法氏囊病病毒的ORF A1导致病毒样颗粒的形成).Journal of General Virology 79，1047-1054)。纯化该片段，用BglII和HindIII酶将其消化并克隆进之前用BamHI和HindIII酶消化的载体pESCURA.inv中。得到的质粒称为pESCURA/pVP2。
质粒pFB/VP3-GFP以两阶段构建。第一阶段由克隆通过PCR产生的含有缺少终止密码子的VP3蛋白的ORF的DNA片段构成。该PCR采用称为Oligo V(SEQ ID NO：9)和Oligo VI(SEQ ID NO：10)的寡核苷酸和采用质粒pVOTE.2/Poly作为模板(Fernández-Arias，A.，Risco，C.，Martínez，S.，Albar，J.P.& Rodríguez，J.F.(1998).Expression of ORF A1 of infectious bursal diseasevirus results in the formation of virus-like particles(表达传染性法氏囊病病毒的ORF A1导致病毒样颗粒的形成).Journal of General Virology 79，1047-1054)进行。用EcoRI和BamHI酶消化得到的DNA，并克隆进也用相同酶消化的载体pEGFP-N3(Clontech)中。得到的质粒称为pVP3-GFP。然后，用EcoRI和NotI酶消化质粒pEGFP-N3并克隆进载体pFastBacl(Invitrogen)中。得到的质粒称为pFB/VP3-GFP。
接着，通过用EcoRI和NotI酶消化质粒pFB/VP3-GFP，得到融合到EGFP蛋白的编码区域的含有对应于VP3蛋白的开放阅读框的DNA片段。纯化该DNA片段并克隆进之前用EcoRI和NotI酶消化的质粒pESCURA/pVP2中。得到的质粒称为pESCURA/pVP2-VP3-GFP(SEQ ID NO：7)，含有pVP2和VP3-GFP蛋白的ORF，它们置于两独立的启动子GAL 1和GAL 10转录控制下，均可由半乳糖诱导(pVP2蛋白由互补于SEQ ID NO：7的核苷酸5862-7343的核苷酸链编码)。由包含在所述质粒pESCURA/pVP2-VP3-GFP中的核苷酸序列编码的pVP2蛋白和VP3-GFP融合蛋白(pVP2-VP3-GFP)的氨基酸序列示于SEQ ID NO：8。
然后，根据前述的方法(Gietz，R.D.and R.A.Woods.(2002)，Transformationof yeast by the Liac/SS carrier DNA/PEG method(通过Liac/SS载体DNA/PEG方法转化酵母).Methods in Enzymology 350：87-96)将pESCURA/pVP2-VP3-GFP用于转化S.cerevisiae酵母单倍体菌株499。通过在含有氨基酸色氨酸、亮氨酸和组氨酸并缺乏尿嘧啶(-Ura)的SC培养板(CSM+YNB，2％葡萄糖和bacto琼脂)上生长来筛选用该质粒转化的酵母。在30℃孵育48小时后，选择用于进行以下蛋白表达和CVLP形成分析的菌落。
采用前述的在其它表达系统中表征IBDV VLP的方案(Fernández-Arias，A.，Risco，C.，Martínez，S.，Albar，J.P.& Rodríguez，J.F.(1998).Expression ofORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-likeparticles(表达传染性法氏囊病病毒的ORF A1导致病毒样颗粒的形成).Journal of General Virology 79，1047-1054；Lombardo E.，Maraver A.，CastónJ.R.，Rivera J.，Fernández-Arias A.，Serrano A.，Carrascosa，J.L.& Rodríguez，J.F.(1999).VP1，the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectiousbursal disease virus，forms complexes with the capsid protein VP3，leading toefficient encapsidation into virus-like particles(推测的传染性法氏囊病病毒RNA依赖的RNA聚合酶VP1与衣壳蛋白VP3形成复合物，导致有效地包装进病毒样颗粒中).Journal of Virology 73：6973-6983)进行pVP2和VP3的蛋白表达和CVLP形成分析。所选择的菌落在含有2％棉籽糖的液体CSM(-Ura)+YNB培养基中培养。该培养物在30℃孵育24小时。该培养物用于在光密度(O.D.)为0.2时接种在含有200ml补加有2％的半乳糖诱导物的CSM(-Ura)+YNB培养基的烧瓶中。该培养物在30℃维持18小时(直到O.D.为1.0-2.0)。将酵母在3,000辐射功率测量时(radiant power measurement)时，在4℃下离心5分钟，用蒸馏水清洗一次，并用溶解缓冲液(TEN：Tris 10mM，pH8.0；NaCl 150mM；EDTA 1mM)+2X蛋白酶抑制剂(Compl Roche)重悬浮沉淀。添加一定体积的具有约425-600微米大小的玻璃珠，用于溶解。该混合物在4℃下以30秒的间隔剧烈涡旋搅拌4次，每次30秒。之后，通过将溶解的混合物在13,000rpm离心15分钟回收可溶性级分。按照前述的方式(Lombardo E.，Maraver A.，Castón J.R.，Rivera J.，Fernández-Arias A.，SerranoA.，Carrascosa，J.L.& Rodríguez，J.F.(1999).VP1，the putativeRNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus，formscomplexes with the capsid protein VP3，leading to efficient encapsidation intovirus-like particles(推测的传染性法氏囊病病毒RNA依赖的RNA聚合酶VP1与衣壳蛋白VP3形成复合物，导致有效地包装进病毒样颗粒中).Journal ofVirology 73：6973-6983)将该样品在蔗糖梯度上分级。分级后得到的样品以及起始材料的样品通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)[Current Protocol in Molecular Biology(现代分子生物学技术)]以及采用抗-pVP2和抗-VP3的血清通过Western印迹(图4A)的免疫检测[Current Protocol in Molecular Biology]进行分析。如图4A所示，Western印迹显示存在有的对应pVP2(48kDa)和VP3-GFP(61kDa)蛋白的预测分子质量的条带以及其它较小大小的免疫活性带，这可能由于在起始样品和梯度的不同级分中的蛋白水解降解产生。这些结果可靠地显示在用质粒pESCURA/pVP2-VP3转化的S.cerevisiae培养物中两种多肽的正确表达。接着，如前所述(Lombardo E.，Maraver A.，Castón J.R.，Rivera J.，Fernández-AriasA.，Serrano A.，Carrascosa，J.L.& Rodríguez，J.F.(1999).VP1，the putativeRNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus，formscomplexes with the capsid protein VP3，leading to efficient encapsidation intovirus-like particles(推测的传染性法氏囊病病毒RNA依赖的RNA聚合酶VP1与衣壳蛋白VP3形成复合物，导致有效地包装进病毒样颗粒中).Journal ofVirology 73：6973-6983)，通过TEM进行梯度的不同级分的分析。如图4B所示，梯度的级分的TEM分析显示IBDV CVLP存在于梯度的顶部级分中。这些CVLP具有65-70nm的直径和不能区别于从其它表达系统中得到的IBDV CVLP的多边形轮廓(图4C)。
实施例3
获得和表征IBDV CVLP的免疫原性
作为开发新的免疫接种疫苗策略的一部分，分析了采用产生嵌合IBDVVLP(CVLP)的策略的可能性，其中该嵌合IBDV VLP含有对应于其它参与诱导免疫反应的蛋白或肽的异源氨基酸序列。作为研究模型，探讨了获得作为包含目的多肽的异源多肽而含有对应于疟疾CS蛋白(Plasmodium yoelii)的CD8抗原决定簇(E-CD8)的氨基酸序列。(Quanfification of antigen specificCD8+T cells using an ELISPOT assay(采用ELISPOT试验定量抗原特异的CD8+T细胞).J Immunol Methods 181：45-54；Zavala，F.，Rodrigues，M.，Rodriguez，D.，Rodriguez，J.R.，Nussenzweig，R.S.and Esteban，M.(2001).Astriking property of recombinant poxviruses：efficient inducers  of in vivoexpansion of primed CD8(+)T cells(重组痘病毒的惊人特性：体内扩展初生CD8(+)T细胞的有效诱导物).Virology 280：155-159)。该抗原决定簇引起CD8特异的针对该病原体的细胞免疫反应(Oliveira-Ferreira J，Miyahira Y，Layton GT，Savage N，Esteban M，Rodriguez D，Rodriguez JR，Nussenzweig RS，Zavala F，Myahira Y.(2000).Immunogenicity of Ty-VLP bearing a CD8(+)Tcell epitope of the CS protein of P.yoelii：enhanced memory response byboosting with recombinant vaccinia virus(携带有P.yoelii CS蛋白的CD8(+)T细胞抗原决定簇的Ty-VLP的免疫原性：通过用重组牛痘病毒强化而增强的记忆应答).Vaccine 18：1863-1869)。可通过ELISPOT技术(Miyahira Y，MurataK，Rodriguez D，Rodriguez JR，Esteban M，Rodrigues MM，Zavala F.(1995)Quantification of antigen specific CD8+T cells using an ELISPOT assay(采用ELISPOT试验定量抗原特异的CD8+T细胞).J Immunol Methods 181：45-54)在来自BALB/c小鼠的脾细胞培养物中对该反应定量。
为此，按照稍后描述的克隆策略进行质粒pFB/his-CD8-VP3(SEQ IDNO：13)的构建。通过向整合在pFB/his-VP3载体中的his-VP3蛋白的编码ORF中插入36携带部分DNA片段构建该载体，其中该部分DNA片段通过杂交合成的称为CD8A(SEQ ID NO：11)和CD8B(SEQ ID NO：12)的寡核苷酸产生，其含有疟疾CS蛋白CD8抗原决定簇的编码序列(SYVPSAEQI，参见SEQ ID NO：13和14的残基29-37)。通过将合成的寡核苷酸CD8A和B(SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)杂交产生的DNA片段连接到用EheI限制酶消化的pFB/his-VP3，进行该克隆。该质粒pFB/his-CD8-VP3(SEQ IDNO：13)含有编码称为his-CD8-VP3的融合蛋白的ORF，该蛋白在对应于his-VP3蛋白ORF的N末端序列的末端含有CD8抗原决定簇。由包含在所述质粒pFB/his-CD8-VP3中的核苷酸序列编码的his-CD8-VP3融合蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：14。
纯化质粒pFB/his-CD8-VP3并按照制造商(Invitrogen BV，Groningen，The Netherlands)描述的方法根据Bac-to-Bac技术用于产生相应的称为FB/his-CD8-VP3的重组杆状病毒(rBV)。
3.1产生CVLP
同时用重组杆状病毒FB/his-CD8-VP3和FB/pVP2感染H5细胞培养物。FB/pVP2 rBV(见实施例1.1)表达对应于IBDV多聚蛋白的pVP2蛋白(Met1-Ala 512)的区域。在感染后(pi)48小时收集细胞，并且相应的提取物通过在线性蔗糖梯度上分级进行的IBDV VLP纯化(Lombardo E.，Maraver A.，Castón J.R.，Rivera J.，Fernández-Arias A.，Serrano A.，Carrascosa，J.L.&Rodríguez，J.F.(1999).VP1，the putative RNA-dependent RNA polymerase ofinfectious bursal disease virus，forms complexes with the capsid protein VP3，leading to efficient encapsidation into virus-like particles(推测的传染性法氏囊病病毒RNA依赖的RNA聚合酶VP1与衣壳蛋白VP3形成复合物，导致有效地包装进病毒样颗粒中).Journal of Virology 73：6973-6983)。每一获得的级分通过透射电子显微镜(TEM)观察并通过SDS-PAGE和采用VP3特异的抗体的免疫印迹进行分析。如图5A所示，梯度的级分4含有大量的组装体，该组装体具有与通过表达病毒多聚蛋白得到的IBDV VLP相同的结构(多边形外周和65-70nm的直径)。通过SDS-PAGE和Western印迹(图5B)，生化特征显示这些CVLP含有针对抗-VP3血清的免疫活性的蛋白，其分子量(33.5kDa)与以前提到的his-CD8-VP3融合蛋白的分子量(33.591kDa)相同。从这些结果能得出结论，pVP2和his-CD8-VP3基因在昆虫细胞中的共表达导致形成含有his-CD8-VP3融合蛋白的嵌合VLP(CVLP)。这些CVLP称为CD8-CVLP。
3.2CD8-CVLP的免疫原性分析
为了确定CD8-CVLP的免疫原性能力，采用两批独立产生和纯化的CD8-CVLP进行了两个相同的试验。采用了4组(I、II、III和IV)8周大的雌性BalbC大鼠，每组3只。各组为随机形成。免疫方案与以前描述的用于其它免疫原的表征的方案相似。该方案基于使用研究中的抗原作为初次剂量，随后为增强初次应答的第二强化剂量，该强化剂量使用表达疟疾CS蛋白的重组牛痘病毒VVpJRCS。通过抗原特异的CD8+T细胞的检测确定诱导的免疫反应，其中该检测根据CD8+T细胞产生IFN-γ的能力通过ELISPOT试验(Miyahira Y，Murata K，Rodriguez D，Rodriguez JR，Esteban M，Rodrigues MM，Zavala F.(1995)Quantification of antigen specific CD8+T cells using anELISPOT assay(采用ELISPOT试验定量抗原特异的CD8+T细胞).J ImmunolMethods 181：45-54)进行。概括的说，用含有6μg/ml重悬浮在PBS中的大鼠抗鼠IFN-γ单克隆抗体(R4-6A2，Pharmingen，San Diego，CA)的溶液以75μl/孔包被具有硝酸纤维素底部的96孔板(Millipore)。该板在室温下孵育过夜。这些孔随后用RPMI培养基洗涤3次，最后用含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基在37℃和5％CO2气氛下孵育1小时。另一方面，将维持在含有10％FCS RPMI培养基中的经免疫大鼠的脾放置在60可移动元件板上的无菌网格上并匀浆，提取物通过其穿过不同规格的针头(21G-＞25G)而分散。由此分散的细胞在4℃下以1,500rpm离心5分钟，并用RPMI+10％FCS培养基洗涤两次。为了溶解样品中的红细胞，添加无菌的0.1M NH4Cl(2ml/脾)，并在4℃下保持3-5分钟，添加RPMI+10％FCS并离心。然后，将它们洗涤两次并最终悬浮在1-2ml RPMI+10％FCS。通过锥虫蓝染色(水中4％，Sigma)进行脾细胞的存活计数。
该试验中采用的专业抗原提出细胞(APC)为P815。这些细胞调整为106细胞/ml的浓度并与合成肽SYVPSAEQI(对应疟疾CS蛋白的CD8区域)10-6M孵育。用该肽处理后，洗涤细胞并用丝裂霉素C(30μg/ml)(Sigma)在37℃和CO2气氛下处理15分钟。在随后的洗涤之后，向抗原提呈细胞中以105/孔的浓度添加30U/ml鼠白介素2(IL-2)。并以100μl/孔以及1/4和1/6的稀释度添加106脾细胞/ml。该板在37℃和CO2气氛下孵育18小时，将它们用PBST洗涤5次并与稀释在PBST中的2μg/ml的生物素化大鼠抗-IFN-γXMG1.2单克隆抗体(Pharmingen)在室温下孵育2小时。然后将板用PBST洗涤5次并添加1/800稀释的亲和素-过氧化物酶(0.5mg/ml)(Sigma)。在1小时室温孵育之后，用PBST清洗3次，用PBS清洗2次，最后添加具有1μg/ml的DAB底物(Sigma)的显影剂混合物，重悬浮在含有0.015％H2O2的Tris-HCl，pH7.5，50mM中。通过用大量的水清洗该板而终止反应，一旦干燥，在Leica MZ122 APO立体显微镜和QWIN成像系统软件(Leica，Cambrige，United kingdom)的协助下对点计数。
按以下表中说明的免疫方案进行免疫。
  组   1st免疫第0天  2nd免疫第14天
  I   未免疫  VVpJRPyCS
  II   VVpJRPyCS  VVpJRPyCS
  III   IBDVVLP  VVpJRPyCS
  IV   CD8-CVLP  VVpJRPyCS
利用VVpJRCS的免疫采用每只动物107空斑形成单位(pfu)腹腔注射进行。利用VLP、非嵌合IBDV VLP和CD8-CVLP的免疫采用每只动物50μg抗原的剂量腹腔注射进行。所有情况下，抗原制剂都稀释在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中。
在第一次免疫28天之后，杀死动物取出它们的脾进行ELISPOT试验。这些试验遵循以上所述的方案进行。两次试验中得到几乎相同的结果。图6显示对应于第一次试验的结果。得到的结果证实，当CD8-CVLP用作初次剂量，随后为VVpJRCS病毒的强化剂量时，出现了针对疟疾CD8抗原决定簇的特异细胞免疫反应的强烈刺激。该刺激比用一(组I)或二(组II)剂量的VVpJRCS免疫后得到的刺激强得多(约高20倍)。相对于接受单一剂量的VVpJRCS的组I，针对E-CD8的反应的明显刺激没有在用非嵌合IBDVVLP(组III)免疫的动物中出现的事实证实，组IV中获得的反应由E-CD8特异地诱导，该E-CD8存在于形成CD8-CVLP完整部分的his-CD8-VP3融合蛋白中。
                         序列表
<110>CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS
<110>BIONOSTRA，S.L.
<120>传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空衣壳及其获得方法和应用
<130>P1391PC
<150>ES P200400120
<151>2004-01-21(January 21，2004)
<160>14
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>Oligo I引物
<400>1
gcgcagatct atgacaaacc tgtcagatca aaccc                 35
<210>2
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>Oligo II引物
<400>2
gcgcaagctt aggcgagagt cagctgcctt atgc                  34
<210>3
<211>7595
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pFBD/pVP2-his-VP3
<220>
<221>启动子
<222>(157)..(285)
<223>启动子ppolh
<220>
<221>CDS
<222>(291)..(1289)
<223>pVP2 ORF
<220>
<221>启动子
<222>(7443)..(7503)
<223>启动子p10
<400>3
gggtgatcaa gtcttcgtcg agtgattgta aataaaatgt aatttacagt atagtatttt    60
aattaatata caaatgattt gataataatt cttatttaac tataatatat tgtgttgggt    120
tgaattaaag gtccgtatac tccggaatat taatagatca tggagataat taaaatgata    180
accatctcgc aaataaataa gtattttact gttttcgtaa cagttttgta ataaaaaaac    240
ctataaatat tccggattat tcataccgtc ccaccatcgg gcgcggatct atg aca       296
                                                       Met Thr
                                                       1
aac ctg tca gat caa acc cag cag att gtt ccg ttc ata cgg agc ctt      344
Asn Leu Ser Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser Leu
        5                   10                  15
ctg atg cca aca acc gga ccg gcg tcc att ccg gac gac acc ctg gag      392
Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr Leu Glu
    20                  25                  30
aag cac act ctc agg tca gag acc tcg acc tac aat ttg act gtg ggg      440
Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr Val Gly
35                  40                  45                  50
gac aca ggg tca ggg cta att gtc ttt ttc cct gga ttc cct ggc tca      488
Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ser
                55                  60                  65
att gtg ggt gct cac tac aca ctg cag ggc aat ggg aac tac aag ttc      536
Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Gly Asn Gly Asn Tyr Lys Phe
            70                  75                  80
gat cag atg ctc ctg act gcc cag aac cta ccg gcc agt tac aac tac      584
Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr Asn Tyr
        85                  90                  95
tgc agg cta gtg agt cgg agt ctc aca gtg agg tca agc aca ctt cct      632
Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr Leu Pro
    100                 105                 110
ggt ggc gtt tat gca cta aac ggc acc ata aac gcc gtg acc ttc caa      680
Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr Phe Gln
115                 120                 125                 130
gga agc ctg agt gaa ctg aca gat gtt agc tac aat ggg ttg atg tct      728
Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu Met Ser
                135                 140                 145
gca aca gcc aac atc aac gac aaa att ggg aac gtc cta gta ggg gaa      776
Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val Gly Glu
            150                 155                 160
ggg gtc acc gtc ctc agc tta ccc aca tca tat gat ctt ggg tat gtg     824
Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly Tyr Val
        165                 170                 175
agg ctt ggt gac ccc att ccc gca ata ggg ctt gac cca aaa atg gta     872
Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys Met Val
    180                 185                 190
gcc aca tgt gac agc agt gac agg ccc aga gtc tac acc ata act gca     920
Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr Ala
195                 200                 205                 210
gcc gat gat tac caa ttc tca tca cag tac caa cca ggt ggg gta aca     968
Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly Val Thr
                215                 220                 225
atc aca ctg ttc tca gcc aac att gat gcc atc aca agc ctc agc gtt     1016
Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu Ser Val
            230                 235                 240
ggg gga gag ctc gtg ttt cga aca agc gtc cac ggc ctt gta ctg ggc     1064
Gly Gly Glu Leu Val Phe Arg Thr Ser Val His Gly Leu Val Leu Gly
        245                 250                 255
gcc acc atc tac ctc ata ggc ttt gat ggg aca acg gta atc acc agg     1112
Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Thr Val Ile Thr Arg
    260                 265                 270
gct gtg gcc gca aac aat ggg ctg acg acc ggc acc gac aac ctt atg     1160
Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Thr Gly Thr Asp Ash Leu Met
275                 280                 285                 290
cca ttc aat ctt gtg att cca aca aac gag ata acc cag cca atc aca     1208
Pro Phe Asn Leu Val Ils Pro Thr Asn Glu Ile Thr Gln Pro Ile Thr
                295                 300                 305
tcc atc aaa ctg gag ata gtg acc tcc aaa agt ggt ggt cag gca ggg     1256
Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln Ala Gly
            310                 315                 320
gat cag atg tca tgg tcg gca aga ggg agc cta gcagtgacga tccatggtgg   1309
Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu
        325                 330
caactatcca ggggccctcc gtcccgtcac gctagtggcc tacgaaagag tggcaacagg   1369
atccgtcgtt acggtcgctg gggtgagcaa cttcgagctg atcccaaatc ctgaactagc   1429
aaagaacctg gttacagaat acggccgatt tgacccagga gccatgaact acacaaaatt   1489
gatactgagt gagagggacc gtcttggcat caagaccgtc tggccaacaa gggagtacac   1549
tgactttcgt gaatacttca tggaggtggc cgacctcaac tctcccctga agattgcagg   1609
agcattcggc ttcaaagaca taatccgggc cataaggagg atagctgtgc cggtggtctc   1669
cacattgttc ccacctgccg ctcccctagc ccatgcaatt ggggaaggtg tagactacct   1729
gctgggcgat gaggcccagg ccgcttcagg aactgctcga gccgcgtcag gaaaagcaag   1789
agctgcctca ggccgcataa ggcagctgac tctcgcctaa gcttgtcgag aagtactaga   1849
ggatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac   1909
acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg   1969
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt   2029
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga   2089
tctgatcact gcttgagcct aggagatccg aaccagataa gtgaaatcta gttccaaact   2149
attttgtcat ttttaatttt cgtattagct tacgacgcta cacccagttc ccatctattt   2209
tgtcactctt ccctaaataa tccttaaaaa ctccatttcc acccctccca gttcccaact   2269
attttgtccg cccacagcgg ggcatttttc ttcctgttat gtttttaatc aaacatcctg   2329
ccaactccat gtgacaaacc gtcatcttcg gctacttttt ctctgtcaca gaatgaaaat   2389
ttttctgtca tctcttcgtt attaatgttt gtaattgact gaatatcaac gcttatttgc   2449
agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg   2509
gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc   2569
ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc   2629
cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt   2689
gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag   2749
tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg   2809
gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag   2869
ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aatttcaggt   2929
ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca   2989
aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg   3049
aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc   3109
cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg   3169
ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt   3229
cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta   3289
ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat   3349
gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga   3409
gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca   3469
acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact   3529
cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc   3589
acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact   3649
ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt   3709
ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt   3769
gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt   3829
atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata   3889
ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag   3949
attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat   4009
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa   4069
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca   4129
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt   4189
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg   4249
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc   4309
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga   4369
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc   4429
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagca ttgagaaagc   4489
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca   4549
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg   4609
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta   4669
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct   4729
cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag   4789
tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa   4849
gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc   4909
agaccagccg cgtaacctgg caaaatcggt tacggttgag taataaatgg atgccctgcg   4969
taagcgggtg tgggcggaca ataaagtctt aaactgaaca aaatagatct aaactatgac   5029
aataaagtct taaactagac agaatagttg taaactgaaa tcagtccagt tatgctgtga   5089
aaaagcatac tggacttttg ttatggctaa agcaaactct tcattttctg aagtgcaaat   5149
tgcccgtcgt attaaagagg ggcgtggcca agggcatggt aaagactata ttcgcggcgt   5209
tgtgacaatt taccgaacaa ctccgcggcc gggaagccga tctcggcttg aacgaattgt   5269
taggtggcgg tacttgggtc gatatcaaag tgcatcactt cttcccgtat gcccaacttt   5329
gtatagagag ccactgcggg atcgtcaccg taatctgctt gcacgtagat cacataagca   5389
ccaagcgcgt tggcctcatg cttgaggaga ttgatgagcg cggtggcaat gccctgcctc   5449
cggtgctcgc cggagactgc gagatcatag atatagatct cactacgcgg ctgctcaaac   5509
ctgggcagaa cgtaagccgc gagagcgcca acaaccgctt cttggtcgaa ggcagcaagc   5569
gcgatgaatg tcttactacg gagcaagttc ccgaggtaat cggagtccgg ctgatgttgg   5629
gagtaggtgg ctacgtctcc gaactcacga ccgaaaagat caagagcagc ccgcatggat   5689
ttgacttggt cagggccgag cctacatgtg cgaatgatgc ccatacttga gccacctaac   5749
tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta acatcgttgc tgctgcgtaa catcgttgct   5809
gctccataac atcaaacatc gacccacggc gtaacgcgct tgctgcttgg atgcccgagg   5869
catagactgt acaaaaaaac agtcataaca agccatgaaa accgccactg cgccgttacc   5929
accgctgcgt tcggtcaagg ttctggacca gttgcgtgag cgcatacgct acttgcatta   5989
cagtttacga accgaacagg cttatgtcaa ctgggttcgt gccttcatcc gtttccacgg   6049
tgtgcgtcac ccggcaacct tgggcagcag cgaagtcgag gcatttctgt cctggctggc   6109
gaacgagcgc aaggtttcgg tctccacgca tcgtcaggca ttggcggcct tgctgttctt   6169
ctacggcaag gtgctgtgca cggatctgcc ctggcttcag gagatcggta gacctcggcc   6229
gtcgcggcgc ttgccggtgg tgctgacccc ggatgaagtg gttcgcatcc tcggttttct   6289
ggaaggcgag catcgtttgt tcgcccagga ctctagctat agttctagtg gttggcctac   6349
gtacccgtag tggctatggc agggcttgcc gccccgacgt tggctgcgag ccctgggcct   6409
tcacccgaac ttgggggttg gggtggggaa aaggaagaaa cgcgggcgta ttggtcccaa   6469
tggggtctcg gtggggtatc gacagagtgc cagccctggg accgaacccc gcgtttatga   6529
acaaacgacc caacacccgt gcgttttatt ctgtcttttt attgccgtca tagcgcgggt   6589
tccttccggt attgtctcct tccgtgtttc agttagcctc ccccatctcc cggtaccgca   6649
tgcctcgaga ctgcaggctc tagattcgaa agcggccgcg actagtgagc tcgtcgacgt   6709
aggcctttga attccggatc ctcactcaag gtcctcatca gagacggtcc tgatccagcg   6769
gcccagccga ccagggggtc tctgtgttgg agcattgggt tttggcttgg gctttggtag   6829
agcccgcctg ggattgcgat gcttcatctc catcgcagtc aagagcagat ctttcatctg   6889
ttcttggttt gggccacgtc catggttgat ttcatagact ttggcaactt cgtctatgaa   6949
agcttggggt ggctctgcct gtcctggagc cccgtagatc gacgtagctg cccttaggat   7009
ttgttcttct gatgccaacc ggctcttctc tgcatgcacg tagtctagat agtcctcgtt   7069
tgggtccggt atttctcgtt tgttctgcca gtactttacc tggcctgggc ttggccctcg   7129
gtgcccattg agtgctaccc attctggtgt tgcaaagtag atgcccatgg tctccatctt   7189
ctttgagatc cgtgtgtctt tttccctctg tgcttcctct ggtgtggggc cccgagcctc   7249
cactccgtag cctgctgtcc cgtacttggc cctttgcgac ttgctgcctg cttgtggtgc   7309
gtttgcaaga aaatttcgca tccgatgggc gttcgggtcg ctgagtgcga agttggccat   7369
gtcagtcaca atcccattct cttccagcca catgaacaca ctgagtgcag attggaatag   7429
tgggtccacg ttggctgctg cttccattgc tctgacggca ctctcgagtt cgggggtctc   7489
tttgaactct gatgcagcca tggcgccctg aaaatacagg ttttcggtcg ttgggatatc   7549
gtaatcgtga tggtgatggt gatggtagta cgacatggtt tcggac                  7595
<210>4
<211>333
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pVP2-his-VP3蛋白
<400>4
Met Thr Asn Leu Ser Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr
            20                  25                  30
Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr
        35                  40                  45
Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro
    50                  55                  60
Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Gly Asn Gly Asn Tyr
65                  70                  75                  80
Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr
                85                  90                  95
Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr
            100                 105                 110
Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr
        115                 120                 125
Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu
    130                 135                 140
Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val
145                 150                 155                 160
Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly
                165                 170                 175
Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys
            180                 185                 190
Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile
        195                 200                 205
Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly
    210                 215                 220
Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu
225                 230                 235                 240
Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Arg Thr Ser Val His Gly Leu Val
                245                 250                 255
Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Thr Val Ile
            260                 265                 270
Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Thr Gly Thr Asp Asn
        275                 280                 285
Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu Ile Thr Gln Pro
    290                 295                 300
Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln
305                 310                 315                 320
Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu
                325                 330
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>Oligo III引物
<400>5
gcgcagatct atgacaaacc tgtcagatca aaccc                 35
<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>Oligo IV引物
<400>6
gcgcaagctt aggcgagagt cagctgcctt atgc                  34
<210>7
<211>9600
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pESCURA/pVP2-VP3-GFP
<220>
<221>启动子
<222>(5649)..(5859)
<223>启动子1(pVP2)
<220>
<221>启动子
<222>(7402)..(8080)
<223>启动子2(VP3-GFP)
<220>
<221>CDS
<222>(8086)..(9597)
<223>VP3-GFP ORF
<400>7
ggccgcacta gtatcgatgg attacaagga tgacgacgat aagatctgag ctcttaatta    60
acaattcttc gccagaggtt tggtcaagtc tccaatcaag gttgtcggct tgtctacctt    120
gccagaaatt tacgaaaaga tggaaaaggg tcaaatcgtt ggtagatacg ttgttgacac    180
ttctaaataa gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa    240
aataagtgta tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt    300
gagtaactct ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctccaat    360
tcagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc    420
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc    480
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa    540
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt    600
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg    660
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg    720
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag    780
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc    840
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa    900
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg    960
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc    1020
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac    1080
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg    1140
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt    1200
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt    1260
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa   1320
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga   1380
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt   1440
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg   1500
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga   1560
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga   1620
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg   1680
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc   1740
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc   1800
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca   1860
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac   1920
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg   1980
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc   2040
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg   2100
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac   2160
aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat   2220
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata   2280
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa   2340
agtgccacct gaacgaagca tctgtgcttc attttgtaga acaaaaatgc aacgcgagag   2400
cgctaatttt tcaaacaaag aatctgagct gcatttttac agaacagaaa tgcaacgcga   2460
aagcgctatt ttaccaacga agaatctgtg cttcattttt gtaaaacaaa aatgcaacgc   2520
gagagcgcta atttttcaaa caaagaatct gagctgcatt tttacagaac agaaatgcaa   2580
cgcgagagcg ctattttacc aacaaagaat ctatacttct tttttgttct acaaaaatgc   2640
atcccgagag cgctattttt ctaacaaagc atcttagatt actttttttc tcctttgtgc   2700
gctctataat gcagtctctt gataactttt tgcactgtag gtccgttaag gttagaagaa   2760
ggctactttg gtgtctattt tctcttccat aaaaaaagcc tgactccact tcccgcgttt   2820
actgattact agcgaagctg cgggtgcatt ttttcaagat aaaggcatcc ccgattatat   2880
tctataccga tgtggattgc gcatactttg tgaacagaaa gtgatagcgt tgatgattct   2940
tcattggtca gaaaattatg aacggtttct tctattttgt ctctatatac tacgtatagg   3000
aaatgtttac attttcgtat tgttttcgat tcactctatg aatagttctt actacaattt   3060
ttttgtctaa agagtaatac tagagataaa cataaaaaat gtagaggtcg agtttagatg   3120
caagttcaag gagcgaaagg tggatgggta ggttatatag ggatatagca cagagatata   3180
tagcaaagag atacttttga gcaatgtttg tggaagcggt attcgcaata ttttagtagc   3240
tcgttacagt ccggtgcgtt tttggttttt tgaaagtgcg tcttcagagc gcttttggtt   3300
ttcaaaagcg ctctgaagtt cctatacttt ctagagaata ggaacttcgg aataggaact   3360
tcaaagcgtt tccgaaaacg agcgcttccg aaaatgcaac gcgagctgcg cacatacagc   3420
tcactgttca cgtcgcacct atatctgcgt gttgcctgta tatatatata catgagaaga   3480
acggcatagt gcgtgtttat gcttaaatgc gtacttatat gcgtctattt atgtaggatg   3540
aaaggtagtc tagtacctcc tgtgatatta tcccattcca tgcggggtat cgtatgcttc   3600
cttcagcact accctttagc tgttctatat gctgccactc ctcaattgga ttagtctcat   3660
ccttcaatgc tatcatttcc tttgatattg gatcatacta agaaaccatt attatcatga   3720
cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg   3780
acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg   3840
atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct   3900
ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatacc acagcttttc   3960
aattcaattc atcatttttt ttttattctt ttttttgatt tcggtttctt tgaaattttt   4020
ttgattcggt aatctccgaa cagaaggaag aacgaaggaa ggagcacaga cttagattgg   4080
tatatatacg catatgtagt gttgaagaaa catgaaattg cccagtattc ttaacccaac   4140
tgcacagaac aaaaacctgc aggaaacgaa gataaatcat gtcgaaagct acatataagg   4200
aacgtgctgc tactcatcct agtcctgttg ctgccaagct atttaatatc atgcacgaaa   4260
agcaaacaaacttgtgtgct tcattggatg ttcgtaccac caaggaatta ctggagttag    4320
ttgaagcatt aggtcccaaa atttgtttac taaaaacaca tgtggatatc ttgactgatt   4380
tttccatgga gggcacagtt aagccgctaa aggcattatc cgccaagtac aattttttac   4440
tcttcgaaga cagaaaattt gctgacattg gtaatacagt caaattgcag tactctgcgg   4500
gtgtatacag aatagcagaa tgggcagaca ttacgaatgc acacggtgtg gtgggcccag   4560
gtattgttag cggtttgaag caggcggcag aagaagtaac aaaggaacct agaggccttt   4620
tgatgttagc agaattgtca tgcaagggct ccctatctac tggagaatat actaagggta   4680
ctgttgacat tgcgaagagc gacaaagatt ttgttatcgg ctttattgct caaagagaca   4740
tgggtggaag agatgaaggt tacgattggt tgattatgac acccggtgtg ggtttagatg   4800
acaagggaga cgcattgggt caacagtata gaaccgtgga tgatgtggtc tctacaggat   4860
ctgacattat tattgttgga agaggactat ttgcaaaggg aagggatgct aaggtagagg   4920
gtgaacgtta cagaaaagca ggctgggaag catatttgag aagatgcggc cagcaaaact   4980
aaaaaactgt attataagta aatgcatgta tactaaactc acaaattaga gcttcaattt   5040
aattatatca gttattaccc tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa   5100
taccgcatca ggaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt   5160
aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag   5220
aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga   5280
acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg   5340
aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc   5400
ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg   5460
aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc   5520
gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcg cgccattcgc   5580
cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc   5640
agctggatct tcgagcgtcc caaaaccttc tcaagcaagg ttttcagtat aatgttacat   5700
gcgtacacgc gtctgtacag aaaaaaaaga aaaatttgaa atataaataa cgttcttaat   5760
actaacataa ctataaaaaa ataaataggg acctagactt caggttgtct aactccttcc   5820
ttttcggtta gagcggatct tagctagccg cggtaccaag cttaggcgag agtcagctgc   5880
cttatgcggc ctgaggcagc tcttgctttt cctgacgcgg ctcgagcagt tcctgaagcg   5940
gcctgggcct catcgcccag caggtagtct acaccttccc caattgcatg ggctagggga   6000
gcggcaggtg ggaacaatgt ggagaccacc ggcacagcta tcctccttat ggcccggatt   6060
atgtctttga agccgaatgc tcctgcaatc ttcaggggag agttgaggtc ggccacctcc   6120
atgaagtatt cacgaaagtc agtgtactcc cttgttggcc agacggtctt gatgccaaga   6180
cggtccctct cactcagtat caattttgtg tagttcatgg ctcctgggtc aaatcggccg   6240
tattctgtaa ccaggttctt tgctagttca ggatttggga tcagctcgaa gttgctcacc   6300
ccagcgaccg taacgacgga tcctgttgcc actctttcgt aggccactag cgtgacggga   6360
cggagggccc ctggatagtt gccaccatgg atcgtcactg ctaggctccc tcttgccgac   6420
catgacatct gatcccctgc ctgaccacca cttttggagg tcactatctc cagtttgatg   6480
gatgtgattg gctgggttat ctcgtttgtt ggaatcacaa gattgaatgg cataaggttg   6540
tcggtgccgg tcgtcagccc attgtttgcg gccacagccc tggtgattac cgttgtccca   6600
tcaaagccta tgaggtagat ggtggcgccc agtacaaggc cgtggacgct tgttcgaaac   6660
acgagctctc ccccaacgct gaggcttgtg atggcatcaa tgttggctga gaacagtgtg   6720
attgttaccc cacctggttg gtactgtgat gagaattggt aatcatcggc tgcagttatg   6780
gtgtagactc tgggcctgtc actgctgtca catgtggcta ccatttttgg gtcaagccct   6840
attgcgggaa tggggtcacc aagcctcaca tacccaagat catatgatgt gggtaagctg   6900
aggacggtga ccccttcccc tactaggacg ttcccaattt tgtcgttgat gttggctgtt   6960
gcagacatca acccattgta gctaacatct gtcagttcac tcaggcttcc ttggaaggtc   7020
acggcgttta tggtgccgtt tagtgcataa acgccaccag gaagtgtgct tgacctcact   7080
gtgagactcc gactcactag cctgcagtag ttgtaactgg ccggtaggtt ctgggcagtc   7140
aggagcatct gatcgaactt gtagttccca ttgccctgca gtgtgtagtg agcacccaca   7200
attgagccag ggaatccagg gaaaaagaca attagccctg accctgtgtc ccccacagtc   7260
aaattgtagg tcgaggtctc tgacctgaga gtgtgcttct ccagggtgtc gtccggaatg   7320
gacgccggtc cggttgttgg catcagaagg ctccgtatga acggaacaat ctgctgggtt   7380
tgatctgaca ggtttgtcat agatccgggg ttttttctcc ttgacgttaa agtatagagg   7440
tatattaaca attttttgtt gatactttta ttacatttga ataagaagta atacaaaccg   7500
aaaatgttga aagtattagt taaagtggtt atgcagtttt tgcatttata tatctgttaa   7560
tagatcaaaa atcatcgctt cgctgattaa ttaccccaga aataaggcta aaaaactaat   7620
cgcattatca tcctatggtt gttaatttga ttcgttcatt tgaaggtttg tggggccagg   7680
ttactgccaa tttttcctct tcataaccat aaaagctagt attgtagaat ctttattgtt   7740
cggagcagtg cggcgcgagg cacatctgcg tttcaggaac gcgaccggtg aagacgagga   7800
cgcacggagg agagtcttcc ttcggagggc tgtcacccgc tcggcggctt ctaatccgta   7860
cttcaatata gcaatgagca gttaagcgta ttactgaaag ttccaaagag aaggtttttt   7920
taggctaaga taatggggct ctttacattt ccacaacata taagtaagat tagatatgga   7980
tatgtatatg gatatgtata tggtggtaat gccatgtaat atgattatta aacttctttg   8040
cgtccatcca aaaaaaaagt aagaattttt gaaaattcga attcg atg gct gca tca   8097
                                                  Met Ala Ala Ser
                                                  1
gag ttc aaa gag acc ccc gaa ctc gag agt gcc gtc aga gca atg gaa     8145
Glu Phe Lys Glu Thr Pro Glu Leu Glu Ser Ala Val Arg Ala Met Glu
5                   10                  15                  20
gca gca gcc aac gtg gac cca cta ttc caa tct gca ctc agt gtg ttc     8193
Ala Ala Ala Asn Val Asp Pro Leu Phe Gln Ser Ala Leu Ser Val Phe
                25                  30                  35
atg tgg ctg gaa gag aat ggg att gtg act gac atg gcc aac ttc gca     8241
Met Trp Leu Glu Glu Asn Gly Ile Val Thr Asp Met Ala Asn Phe Ala
            40                  45                  50
ctc agc gac ccg aac gcc cat cgg atg cga aat ttt ctt gca aac gca     8289
Leu Ser Asp Pro Asn Ala His Arg Met Arg Asn Phe Leu Ala Asn Ala
        55                  60                  65
cca caa gca ggc agc aag tcg caa agg gcc aag tac ggg aca gca ggc     8337
Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala Lys Tyr Gly Thr Ala Gly
    70                  75                  80
tac gga gtg gag gct cgg ggc ccc aca cca gag gaa gca cag agg gaa     8385
Tyr Gly Val Glu Ala Arg Gly Pro Thr Pro Glu Glu Ala Gln Arg Glu
85                  90                  95                  100
aaa gac aca cgg atc tca aag aag atg gag acc atg ggc atc tac ttt     8433
Lys Asp Thr Arg Ile Ser Lys Lys Met Glu Thr Met Gly Ile Tyr Phe
                105                 110                 115
gca aca cca gaa tgg gta gca ctc aat ggg cac cga ggg cca agc cca     8481
Ala Thr Pro Glu Trp Val Ala Leu Asn Gly His Arg Gly Pro Ser Pro
            120                 125                 130
ggc cag gta aag tac tgg cag aac aaa cga gaa ata ccg gac cca aac     8529
Gly Gln Val Lys Tyr Trp Gln Asn Lys Arg Glu Ile Pro Asp Pro Asn
        135                 140                 145
gag gac tat cta gac tac gtg cat gca gag aag agc cgg ttg gca tca     8577
Glu Asp Tyr Leu Asp Tyr Val His Ala Glu Lys Ser Arg Leu Ala Ser
    150                 155                 160
gaa gaa caa atc cta agg gca gct acg tcg atc tac ggg gct cca gga     8625
Glu Glu Gln Ile Leu Arg Ala Ala Thr Ser Ile Tyr Gly Ala Pro Gly
165                 170                 175                 180
cag gca gag cca ccc caa gct ttc ata gac gaa gtt gcc aaa gtc tat     8673
Gln Ala Glu Pro Pro Gln Ala Phe Ile Asp Glu Val Ala Lys Val Tyr
                185                 190                 195
gaa atc aac cat gga cgt ggc cca aac caa gaa cag atg aaa gat ctg     8721
Glu Ile Asn His Gly Arg Gly Pro Asn Gln Glu Gln Met Lys Asp Leu
            200                 205                 210
ctc ttg act gcg atg gag atg aag cat cgc aat ccc agg cgg gct cta     8769
Leu Leu Thr Ala Met Glu Met Lys His Arg Asn Pro Arg Arg Ala Leu
        215                 220                 225
cca aag ccc aag cca aaa ccc aat gct cca aca cag aga ccc cct ggt     8817
Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Ala Pro Thr Gln Arg Pro Pro Gly
    230                 235                 240
cgg ctg ggc cgc tgg atc agg acc gtc tct gat gag gac ctt gag gga     8865
Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Thr Val Ser Asp Glu Asp Leu Glu Gly
245                 250                 255                 260
tcc atc gcc acc atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg     8913
Ser Ile Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val
                265                 270                 275
gtg ccc atc ctg gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc     8961
Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe
            280                 285                 290
agc gtg tcc ggc gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc     9009
Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr
        295                 300                 305
ctg aag ttc atc tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc     9057
Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr
    310                 315                 320
ctc gtg acc acc ctg acc tac ggc gtg cag tgc ttc agc cgc tac ccc     9105
Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro
325                 330                 335                 340
gac cac atg aag cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc     9153
Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly
                345                 350                 355
tac gtc cag gag cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag     9201
Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys
            360                 365                 370
acc cgc gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc     9249
Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile
        375                 380                 385
gag ctg aag ggc atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac     9297
Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His
    390                 395                 400
aag ctg gag tac aac tac aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac     9345
Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp
405                 410                 415                 420
aag cag aag aac ggc atc aag gtg aac ttc aag atc cgc cac aac atc     9393
Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile
                425                 430                 435
gag gac ggc agc gtg cag ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc     9441
Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro
            440                 445                 450
atc ggc gac ggc ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc acc     9489
Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr
        455                 460                 465
cag tcc gcc ctg agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc     9537
Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val
    470                 475                 480
ctg ctg gag ttc gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag     9585
Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu
485                 490                 495                 500
ctg tac aag taa agc                                                 9600
Leu Tyr Lys
<210>8
<211>503
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>pVP2-VP3-GFP蛋白
<400>8
Met Ala Ala Ser Glu Phe Lys Glu Thr Pro Glu Leu Glu Ser Ala Val
1               5                   10                  15
Arg Ala Met Glu Ala Ala Ala Asn Val Asp Pro Leu Phe Gln Ser Ala
            20                  25                  30
Leu Ser Val Phe Met Trp Leu Glu Glu Asn Gly Ile Val Thr Asp Met
        35                  40                  45
Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn Ala His Arg Met Arg Asn Phe
    50                  55                  60
Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala Lys Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Thr Ala Gly Tyr Gly Val Glu Ala Arg Gly Pro Thr Pro Glu Glu
                85                  90                  95
Ala Gln Arg Glu Lys Asp Thr Arg Ile Ser Lys Lys Met Glu Thr Met
            100                 105                 110
Gly Ile Tyr Phe Ala Thr Pro Glu Trp Val Ala Leu Asn Gly His Arg
        115                 120                 125
Gly Pro Ser Pro Gly Gln Val Lys Tyr Trp Gln Asn Lys Arg Glu Ile
    130                 135                 140
Pro Asp Pro Asn Glu Asp Tyr Leu Asp Tyr Val His Ala Glu Lys Ser
145                 150                 155                 160
Arg Leu Ala Ser Glu Glu Gln Ile Leu Arg Ala Ala Thr Ser Ile Tyr
                165                 170                 175
Gly Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Gln Ala Phe Ile Asp Glu Val
            180                 185                 190
Ala Lys Val Tyr Glu Ile Asn His Gly Arg Gly Pro Asn Gln Glu Gln
        195                 200                 205
Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met Glu Met Lys His Arg Asn Pro
    210                 215                 220
Arg Arg Ala Leu Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Ala Pro Thr Gln
225                 230                 235                 240
Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Thr Val Ser Asp Glu
                245                 250                 255
Asp Leu Glu Gly Ser Ile Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu
            260                 265                 270
Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn
        275                 280                 285
Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr
    290                 295                 300
Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val
305                 310                 315                 320
Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe
                325                 330                 335
Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala
            340                 345                 350
Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp
        355                 360                 365
Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu
    370                 375                 380
Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn
385                 390                 395                 400
Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr
                405                 410                 415
Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile
            420                 425                 430
Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln
        435                 440                 445
Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His
    450                 455                 460
Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg
465                 470                 475                 480
Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu
                485                 490                 495
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
            500
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>Oligo V引物
<400>9
gcgcgaattc gatggcatca gagttcaaag aga                   33
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>Oligo VI引物
<400>10
cgcggatccc tcaaggtcct catcagagac gg                    32
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Oligo CD8 A引物
<400>11
aacgaggaca gttatgtccc aagcgcagaa caaata                36
<210>12
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Oligo CD8 B引物
<400>12
tatttgttct gcgcttggga cataactgtc ctcgtt                36
<210>13
<211>5676
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pFB/his-CD8-VP3
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(129)
<223>Polyhedrin启动子
<220>
<221>CDS
<222>(147)..(1043)
<223>His-CD8-VP3 ORF
<220>
<221>CDS
<222>(222)..(257)
<223>His-CD8 ORF
<400>13
atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc   60
gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca   120
tcgggcgcgg atctcggtcc gaaacc atg tcg tac tac cat cac cat cac cat    173
                             Met Ser Tyr Tyr His His His His His
                             1               5
cac gat tac gat atc cca acg acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcg     221
His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala
10                  15                  20                  25
aac gag gac agt tat gtc cca agc gca gaa caa ata gcc gcc atg gct     269
Asn Glu Asp Ser Tyr Val Pro Ser Ala Glu Gln Ile Ala Ala Met Ala
                30                  35                  40
gca tca gag ttc aaa gag acc ccc gaa ctc gag agt gcc gtc aga gca     317
Ala Ser Glu Phe Lys Glu Thr Pro Glu Leu Glu Ser Ala Val Arg Ala
            45                  50                  55
atg gaa gca gca gcc aac gtg gac cca cta ttc caa tct gca ctc agt     365
Met Glu Ala Ala Ala Asn Val Asp Pro Leu Phe Gln Ser Ala Leu Ser
        60                  65                  70
gtg ttc atg tgg ctg gaa gag aat ggg att gtg act gac atg gcc aac     413
Val Phe Met Trp Leu Glu Glu Asn Gly Ile Val Thr Asp Met Ala Asn
    75                  80                  85
ttc gca ctc agc gac ccg aac gcc cat cgg atg cga aat ttt ctt gca     461
Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn Ala His Arg Met Arg Asn Phe Leu Ala
90                  95                  100                 105
aac gca cca caa gca ggc agc aag tcg caa agg gcc aag tac ggg aca     509
Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala Lys Tyr Gly Thr
                110                 115                 120
gca ggc tac gga gtg gag gct cgg ggc ccc aca cca gag gaa gca cag     557
Ala Gly Tyr Gly Val Glu Ala Arg Gly Pro Thr Pro Glu Glu Ala Gln
            125                 130                 135
agg gaa aaa gac aca cgg atc tca aag aag atg gag acc atg ggc atc     605
Arg Glu Lys Asp Thr Arg Ile Ser Lys Lys Met Glu Thr Met Gly Ile
        140                 145                 150
tac ttt gca aca cca gaa tgg gta gca ctc aat ggg cac cga ggg cca     653
Tyr Phe Ala Thr Pro Glu Trp Val Ala Leu Asn Gly His Arg Gly Pro
    155                 160                 165
agc cca ggc cag gta aag tac tgg cag aac aaa cga gaa ata ccg gac     701
Ser Pro Gly Gln Val Lys Tyr Trp Gln Asn Lys Arg Glu Ile Pro Asp
170                 175                 180                 185
cca aac gag gac tat cta gac tac gtg cat gca gag aag agc cgg ttg     749
Pro Asn Glu Asp Tyr Leu Asp Tyr Val His Ala Glu Lys Ser Arg Leu
                190                 195                 200
gca tca gaa gaa caa atc cta agg gca gct acg tcg atc tac ggg gct     797
Ala Ser Glu Glu Gln Ile Leu Arg Ala Ala Thr Ser Ile Tyr Gly Ala
            205                 210                 215
cca gga cag gca gag cca ccc caa gct ttc ata gac gaa gtt gcc aaa     845
Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Gln Ala Phe Ile Asp Glu Val Ala Lys
        220                 225                 230
gtc tat gaa atc aac cat gga cgt ggc cca aac caa gaa cag atg aaa     893
Val Tyr Glu Ile Asn His Gly Arg Gly Pro Asn Gln Glu Gln Met Lys
    235                 240                 245
gat ctg ctc ttg act gcg atg gag atg aag cat cgc aat ccc agg cgg     941
Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met Glu Met Lys His Arg Asn Pro Arg Arg
250                 255                 260                 265
gct cta cca aag ccc aag cca aaa ccc aat gct cca aca cag aga ccc     989
Ala Leu Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Ala Pro Thr Gln Arg Pro
                270                 275                 280
cct ggt cgg ctg ggc cgc tgg atc agg acc gtc tct gat gag gac ctt     1037
Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Thr Val Ser Asp Glu Asp Leu
            285                 290                 295
gag tga ggatccggaa ttcaaaggcc tacgtcgacg agctcactag tcgcggccgc      1093
Glu
tttcgaatct agagcctgca gtctcgaggc atgcggtacc aagcttgtcg agaagtacta   1153
gaggatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc   1213
acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat   1273
tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt   1333
tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg   1393
gatctgatca ctagatctgc ctaggagatc cgaaccagat aagtgaaatc tagttccaaa   1453
ctattttgtc atttttaatt ttcgtattag cttacgacgc tacacccagt tcccatctat   1513
tttgtcactc ttccctaaat aatccttaaa aactccattt ccacccctcc cagttcccaa   1573
ctattttgtc cgcccacagc ggggcatttt tcttcctgtt atgtttttaa tcaaacatcc   1633
tgccaactcc atgtgacaaa ccgtcatctt cggctacttt ttctctgtca cagaatgaaa   1693
atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga ctgaatatca acgcttattt   1753
gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg   1813
tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt   1873
tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc   1933
tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg   1993
gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg   2053
agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct   2113
cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg   2173
agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag   2233
gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt   2293
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa   2353
ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt   2413
gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt   2473
tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt   2533
ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg   2593
tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga   2653
atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa   2713
gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga   2773
caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa   2833
ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca   2893
ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta   2953
ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac   3013
ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc   3073
gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag   3133
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caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt   3493
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gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa   3853
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ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc   3973
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gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc gatctcggct tgaacgaatt   4573
gttaggtggc ggtacttggg tcgatatcaa agtgcatcac ttcttcccgt atgcccaact   4633
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ggcatagact gtacaaaaaa acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta   5233
ccaccgctgc gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat   5293
tacagtttac gaaccgaaca ggcttatgtc aactgggttc gtgccttcat ccgtttccac   5353
ggtgtgcgtc acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg   5413
gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc   5473
ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc aggagatcgg aagacctcgg   5533
ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag tggttcgcat cctcggtttt   5593
ctggaaggcg agcatcgttt gttcgcccag gactctagct atagttctag tggttggcta   5653
cgtatactcc ggaatattaa tag                                           5676
<210>14
<211>298
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>his-CD8-VP3蛋白
<400>14
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Asn Glu Asp Ser Tyr Val Pro
            20                  25                  30
Ser Ala Glu Gln Ile Ala Ala Met Ala Ala Ser Glu Phe Lys Glu Thr
        35                  40                  45
Pro Glu Leu Glu Ser Ala Val Arg Ala Met Glu Ala Ala Ala Asn Val
    50                  55                  60
Asp Pro Leu Phe Gln Ser Ala Leu Ser Val Phe Met Trp Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ile Val Thr Asp Met Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn
                85                  90                  95
Ala His Arg Met Arg Asn Phe Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser
            100                 105                 110
Lys Ser Gln Arg Ala Lys Tyr Gly Thr Ala Gly Tyr Gly Val Glu Ala
        115                 120                 125
Arg Gly Pro Thr Pro Glu Glu Ala Gln Arg Glu Lys Asp Thr Arg Ile
    130                 135                 140
Ser Lys Lys Met Glu Thr Met Gly Ile Tyr Phe Ala Thr Pro Glu Trp
145                 150                 155                 160
Val Ala Leu Asn Gly His Arg Gly Pro Ser Pro Gly Gln Val Lys Tyr
                165                 170                 175
Trp Gln Asn Lys Arg Glu Ile Pro Asp Pro Asn Glu Asp Tyr Leu Asp
            180                 185                 190
Tyr Val His Ala Glu Lys Ser Arg Leu Ala Ser Glu Glu Gln Ile Leu
        195                 200                 205
Arg Ala Ala Thr Ser Ile Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro
    210                 215                 220
Gln Ala Phe Ile Asp Glu Val Ala Lys Val Tyr Glu Ile Asn His Gly
225                 230                 235                 240
Arg Gly Pro Asn Gln Glu Gln Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met
                245                 250                 255
Glu Met Lys His Arg Asn Pro Arg Arg Ala Leu Pro Lys Pro Lys Pro
            260                 265                 270
Lys Pro Asn Ala Pro Thr Gln Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp
        275                 280                 285
Ile Arg Thr Val Ser Asp Glu Asp Leu Glu
    290                 295

Claims (29)

1.传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空衣壳，其特征在于它由(i)IBDVpVP2蛋白和(ii)融合蛋白组装构成，所述融合蛋白包括连接到区域B的由IBDV VP3蛋白构成的区域A，所述区域B由包含目的多肽的异源多肽构成。
2.如权利要求1所述的衣壳，其中所述的区域B连接到IBDV VP3的氨基端区域或连接到IBDV VP3的羧基端区域。
3.如权利要求1所述的衣壳，其中所述的目的多肽为用在疫苗接种、治疗或诊断中的多肽。
4.如权利要求1所述的衣壳，其中所述的区域B包括单一目的多肽。
5.如权利要求1所述的衣壳，其中所述的区域B包括两个或多个目的多肽。
6.如权利要求1所述的衣壳，其中所述的融合蛋白包括连接到单一区域B的区域A。
7.如权利要求1所述的衣壳，其中所述的融合蛋白包括连接到两相同或不同的区域B的区域A，所述两区域B中的一个连接到存在于区域A中的VP3的氨基端区域，另一个连接到存在于区域A中的VP3的羧基端区域。
8.如权利要求7所述的衣壳，其中所述的区域B含有一个以上相互间相同或不同的目的多肽。
9.如权利要求1所述的衣壳，其中所述的融合蛋白还包括位于所述区域A和B之间的接头多肽。
10.核酸，所述核酸具有核苷酸序列，所述核苷酸序列包括编码权利要求1-9任一项定义的融合蛋白的核苷酸序列。
11、核酸，所述核酸具有核苷酸序列，所述核苷酸序列包括(i)包括对应于IBDV VP3蛋白的开放阅读框的核苷酸序列和(ii)包括一个或多个异源多肽的开放阅读框的核苷酸序列，所述一个或多个异源多肽包含一个或多个目的多肽。
12.如权利要求11所述的核酸，还包括(iii)包括对应于IBDV pVP2蛋白的开放阅读框的核苷酸序列。
13.包括权利要求10或11所述的核酸的基因构建体。
14.包括权利要求12所述的核酸的基因构建体。
15.表达系统，其选自：
a)包括可操作地连接到转录及任选的翻译控制元件的权利要求13所述的第一基因构建体，及可操作地连接到转录及任选的翻译控制元件的第二基因构建体的表达系统；所述第二基因构建体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包含IBDV pVP2蛋白的开放阅读框；以及
b)包括可操作地连接到转录及任选的翻译控制元件的权利要求14所述的基因构建体的表达系统。
16.如权利要求15所述的表达系统，所述的表达系统选自质粒、杆粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、基于噬菌体P1的人工染色体(PAC)、粘粒或病毒，上述任选地含有异源复制起点。
17.宿主细胞，其含有权利要求10-12任一项所述的核酸、或权利要求13或14任一项所述的基因构建体，或权利要求15或16任一项所述的表达系统。
18.宿主细胞，所述细胞经权利要求15或16任一项所述的表达系统转化、转染或感染。
19.如权利要求17或18所述的宿主细胞，所述细胞选自哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞和酵母。
20.产生权利要求1-9任一项所述的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空衣壳的方法，包括培养权利要求17-19任一项所述的宿主细胞，以及如果需要的话，回收所述嵌合空IBDV衣壳。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述的宿主细胞为昆虫细胞，包括步骤：
a)制备选自(I)和(II)的表达系统，其中：
-表达系统(I)由含有权利要求14所述的基因构建体的重组杆状病毒构成；以及
-表达系统(II)由含有编码IBDV pVP2蛋白的基因构建体的第一重组杆状病毒和含有权利要求13所述的基因构建体的第二重组杆状病毒构成；
b)用步骤a)制备的所述表达系统感染昆虫细胞；
c)在允许重组蛋白表达和它们组装以形成嵌合空IBDV衣壳的条件下培养步骤b)中获得的经感染昆虫细胞；以及
d)如果需要的话，分离和任选地纯化所述嵌合空IBDV衣壳。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述的宿主细胞为酵母，包括步骤：
a)制备由含有权利要求14所述的基因构建体的质粒构成的表达系统；
b)用步骤a)制备的所述表达系统转化酵母细胞；
c)在允许重组蛋白表达和它们组装以形成嵌合空IBDV衣壳的条件下培养步骤b)中获得的经转化酵母；以及
d)如果需要的话，分离和任选地纯化所述嵌合空IBDV衣壳。
23.权利要求15或16任一项所述的基因表达系统在产生权利要求1-9任一项所述的嵌合空IBDV衣壳中的用途。
24.权利要求1-9任一项所述的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空衣壳在制备药物中的用途。
25.如权利要求24所述的用途，其中所述的药物为疫苗。
26.如权利要求24所述的用途，其中所述的药物为基因治疗载体。
27.疫苗，包括治疗有效量的权利要求1-9任一项所述的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空衣壳，任选地连同一种或多种药物可接受的佐剂和/或赋形物。
28.如权利要求27所述的疫苗，用于同时使动物或人免于两种或多种致病感染物的感染。
29.基因治疗载体，包括权利要求1-9任一项所述的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的嵌合空衣壳。
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