JP2007518415A - 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ｉｂｄｖ）のキメラエンプティーキャプシド、取得方法および用途 - Google Patents
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Abstract
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のキメラエンプティーキャプシドは、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と、（ii）目的のポリペプチド、例えば、ワクチン接種、治療または診断において有用なポリペプチド、を含む異種ポリペプチドによって構成される領域Ｂと結合されている、ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質によって構成される領域Ａを含む融合タンパク質と、の組み立てによって構成される。
Description
発明の分野
本発明は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）（infectious bursal disease virus）のキメラエンプティー粒子の製造およびそれらの用途に関する。
本発明は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）（infectious bursal disease virus）のキメラエンプティー粒子の製造およびそれらの用途に関する。
背景技術
ウイルス粒子は、核酸およびタンパク質のビヒクルへのパッケージングおよび組込みに特化した構造である。ウイルス粒子の一般的な特徴は、宿主の免疫応答の誘導に関するそれらの優れた能力である。これらの性質は、ウイルス粒子を、両方の細胞内送達系の開発や粒子ワクチンの生成に関して非常に興味深い薬剤にする。異なる遺伝子発現系を使用することにより、異なる種類のウイルスのウイルス様粒子（viral-like particles）、すなわちエンプティーウイルスキャプシド（empty viral capsides）（ＶＬＰ）の製造が容易になった（米国特許第６，４５８，３６２号 Casal, et al. 2002. ＣＴＬまたはＴヘルパー細胞エピトープをコードする組換えＶＰ２パルボウイルス偽粒子(Recombinant VP2 parvoviral pseudo-particles encoding CTL or T-helper cell epitopes)；米国特許第５，９３２，４２６号 Baralle, et al. 1999. 分子提示系(Molecular presenting system)；米国特許第６，６０２，７０５号 Barnett, et al. 2003 ＨＩＶポリペプチドの発現およびウイルス様粒子の産生(Expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles)）。これらの発現系を遺伝子操作することで、次には、天然ウイルスキャプシドを形成しているタンパク質以外のタンパク質に由来する異種アミノ酸配列を含むＶＬＰの製造が可能になる。これらのＶＬＰは、異型組換えＶＬＰまたは異型キメラＶＬＰ（ＣＶＬＰ）（chimeric VLP）と総称されている。ＣＶＬＰは、主として２つの用途：（ｉ）免疫学的に関連した異種ペプチドを用いた多価ワクチンの生成(Kingsman, A. J., N. R. Burns, G. T. Layton, and S. E. Adams. 1995. Yeast retrotransposon particles as antigen delivery systems. Ann. N. Y. Acad. Sci. 754: 202-213; Lo-Man, R., P. Rueda, C. Sedlik, E. Deriaud, I. Casal, and C. Leclerc. 1998. A recombinant virus-like particle system derived from parvovirus as an efficient antigen carrier to elicit a polarized Th1 immune response without adjuvant. Eur. J. Immunol. 28: 1401-1407; Qiu, Z., D. Ou, H. Wu, T. C. Hobma, and S. Gillam. 1994. Expression and characterization of virus-like particles containing rubella virus structural proteins. J. Virol. 68: 4086-4091)；および（ii）受容体−リガンドとの相互作用に関与するアミノ酸配列の挿入による親和性の改変(Schmidt, U., Rudolf, R, and Bomh, G. 2001. Binding of external ligands onto an engineered virus capsid. Prot. Eng. 14: 769-774; Shin, Y. C., and Folk, W. R. 2003. Formation of polyoma virus-like particles with different VP1 molecules that bind the urokinase plasminogen activator receptor. J. Virol. 77: 11491-11498)に使用されてきた。
ウイルス粒子は、核酸およびタンパク質のビヒクルへのパッケージングおよび組込みに特化した構造である。ウイルス粒子の一般的な特徴は、宿主の免疫応答の誘導に関するそれらの優れた能力である。これらの性質は、ウイルス粒子を、両方の細胞内送達系の開発や粒子ワクチンの生成に関して非常に興味深い薬剤にする。異なる遺伝子発現系を使用することにより、異なる種類のウイルスのウイルス様粒子（viral-like particles）、すなわちエンプティーウイルスキャプシド（empty viral capsides）（ＶＬＰ）の製造が容易になった（米国特許第６，４５８，３６２号 Casal, et al. 2002. ＣＴＬまたはＴヘルパー細胞エピトープをコードする組換えＶＰ２パルボウイルス偽粒子(Recombinant VP2 parvoviral pseudo-particles encoding CTL or T-helper cell epitopes)；米国特許第５，９３２，４２６号 Baralle, et al. 1999. 分子提示系(Molecular presenting system)；米国特許第６，６０２，７０５号 Barnett, et al. 2003 ＨＩＶポリペプチドの発現およびウイルス様粒子の産生(Expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles)）。これらの発現系を遺伝子操作することで、次には、天然ウイルスキャプシドを形成しているタンパク質以外のタンパク質に由来する異種アミノ酸配列を含むＶＬＰの製造が可能になる。これらのＶＬＰは、異型組換えＶＬＰまたは異型キメラＶＬＰ（ＣＶＬＰ）（chimeric VLP）と総称されている。ＣＶＬＰは、主として２つの用途：（ｉ）免疫学的に関連した異種ペプチドを用いた多価ワクチンの生成(Kingsman, A. J., N. R. Burns, G. T. Layton, and S. E. Adams. 1995. Yeast retrotransposon particles as antigen delivery systems. Ann. N. Y. Acad. Sci. 754: 202-213; Lo-Man, R., P. Rueda, C. Sedlik, E. Deriaud, I. Casal, and C. Leclerc. 1998. A recombinant virus-like particle system derived from parvovirus as an efficient antigen carrier to elicit a polarized Th1 immune response without adjuvant. Eur. J. Immunol. 28: 1401-1407; Qiu, Z., D. Ou, H. Wu, T. C. Hobma, and S. Gillam. 1994. Expression and characterization of virus-like particles containing rubella virus structural proteins. J. Virol. 68: 4086-4091)；および（ii）受容体−リガンドとの相互作用に関与するアミノ酸配列の挿入による親和性の改変(Schmidt, U., Rudolf, R, and Bomh, G. 2001. Binding of external ligands onto an engineered virus capsid. Prot. Eng. 14: 769-774; Shin, Y. C., and Folk, W. R. 2003. Formation of polyoma virus-like particles with different VP1 molecules that bind the urokinase plasminogen activator receptor. J. Virol. 77: 11491-11498)に使用されてきた。
ＣＶＬＰは、一般に、目的のポリペプチドをコードする領域と融合される、ウイルスキャプシドの形成に関与するウイルスタンパク質の発現によって得られる。
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）は、ビルナウイルス科(Birnaviridae)ファミリーに属するウイルスであり、異なる鳥類種に感染し、世界的に養鶏業界に重大な経済的損失をもたらす重症免疫抑制疾患に直接関与する。
ＩＢＤＶ粒子は、二十面体（Ｔ＝１３対称）であり、それらにはエンベロープはなく、単一のタンパク質層で形成されている。今まで、ＩＢＤＶ粒子の原子モデルの獲得を目的としたアプローチは失敗に終わっている。結果として、利用できる構造情報は、精製したウイルスおよびそのＶＬＰの電子低温顕微鏡検査により得られた画像から作成された三次元モデルに基づいている。これらの研究に基づき、粒子の外面が、５つの異なる構造に構成されたＶＰ２タンパク質の三量体（３７ｋＤａ）２６０個の連続束によって形成されていることが検証された。粒子の内面にＶＰ３タンパク質（２９ｋＤａ）の三量体２００個を含み、このＶＰ３タンパク質三量体は、互いに独立して、ＶＰ２三量体の基底領域と結合している。第３のポリペプチド、ＶＰ４（２８ｋＤａ）は、二十面体構造の頂点を形成している五量体の基底部に位置する粒子の一部でもあり得ることが示唆されている。
ＶＰ２ポリペプチド、ＶＰ３ポリペプチドおよびＶＰ４ポリペプチドは、サイズ１０９ｋＤａのポリペプチド前駆体のタンパク質分解プロセシングにより生成される。この前駆体は、自己触媒的にプロセシングを受け、ｐＶＰ２ポリペプチド（４８ｋＤａ）、ＶＰ３ポリペプチドおよびＶＰ４ポリペプチドを放出する。ＶＰ４ドメインは、ポリタンパク質の中心領域に位置している。このＶＰ４ドメインはＬｏｎプロテアーゼファミリーに属し、タンパク質分解切断に関与する。ｐＶＰ２ポリペプチドおよびＶＰ３ポリペプチドは、キャプシドの組み立て（assembly）に直接関与する。ｐＶＰ２産物は、そのＣ末端において最後の切断を受けた後、（精製した粒子で見られるものである）成熟型タンパク質、ＶＰ２となる(Da Costa, B., Chevalier, C., Henry, C., Huet, J. C., Petit, S., Lepault, J., Boot, H. & Delmas, B. (2002). The capsid of infectious bursal disease virus contains several small peptides arising from the maturation process of pVP2. Journal of Virology 76: 2393-2402)。このｐＶＰ２プロセシングは、キャプシドの正確な形成に必要である。このプロセシングにはＶＰ３の存在を必要とするが、関与するプロテアーゼについてはまだ確認されていない(Maraver, A., Ona, A., Abaitua, F., Gonzalez, D., Clemente, R., Diaz-Ruiz, A., Caston, J. R., Pazos, F. & Rodriguez, J. F. (2003). The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology 77: 6438-49)。
一般論として、形態形成は、ポリペプチド前駆体改変に関連する連続的な段階を必要とするウイルスサイクルの重要なプロセスである。結果として、ウイルスは、それらの成分それぞれの間での連続的で正確な相互作用を可能にする方法を発達させた。二十面体ウイルスによって用いられることが多いこれらの方法の１つが、それらのウイルスの構造成分の基礎として、単一ポリタンパク質由来のポリペプチドを使用する方法である。これらの場合では、前記ポリタンパク質の適切なタンパク質分解プロセシングが組み立てプロセスにおいて極めて重要な役割を果たす。
ＩＢＤＶキャプシドの組み立てに関するこの概念は、初期の研究により証明されている(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。真核細胞におけるＩＢＤＶポリタンパク質をコードする遺伝子の発現は、形態学的にも生化学的にもＩＢＤＶビリオンと完全には区別できないＶＬＰの形成をもたらす。キャプシドの構築では、ウイルスポリタンパク質の合成と正確なプロセシングのみを必要とし、ウイルスゲノムの存在またはウイルスゲノムによってコードされる他のタンパク質（ＶＰ５およびＶＰ１など）の存在とは無関係であることも示されている。
異なる組換え系におけるＩＢＤＶ遺伝子発現によって今日までに得られた結果から、ｉ）構築プロセスはウイルスの遺伝物質の存在とは無関係であり、ii）構築にはポリタンパク質遺伝子によってコードされるポリペプチドだけが必要であり、そしてiii）構築には、ｐＶＰ２ポリペプチドとＶＰ３ポリペプチドとの協調的な相互作用が必要であるという結論を下し得た。
しかしながら、ポリタンパク質前駆体がまだ改変を受けていない場合に、ＶＰ２／ＶＰ３相互作用が、そのポリタンパク質前駆体のＶＰ２ドメインとＶＰ３ドメインとの間で確立されるかどうかは分からず、反対にこの相互作用が前駆体のプロセシング後に起こるかどうかは分からないことを示さねばならない。さらに、現行の情報では、ＶＰ４がウイルスキャプシドの形態形成において関連した役割を果たす可能性が除外されていない。実際に、ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質、ＶＰ３タンパク質およびＶＰ４タンパク質の組み立てによって生成されるＩＢＤＶ ＶＬＰについては、開示されている（米国特許第６，５２８，０６３号、同第５，７８８，９７０号および日本国特許第５１９４５９７号）。
同じ発明者らが進めた研究によって、異なる真核生物発現ベクターを使用してＩＢＤＶ ＶＬＰを獲得するための系を確立することが可能になった。これらのベクターは、ウイルスＶＰ１ ＲＮＡ ポリメラーゼの不在下または存在下でのＩＢＤＶポリタンパク質発現に使用されてきた。精製したＶＬＰの生化学的特性から、それらが、ウイルスポリタンパク質だけが発現される場合には、ｐＶＰ２タンパク質、ＶＰ２タンパク質およびＶＰ３タンパク質を含み、ポリタンパク質とウイルスＲＮＡポリメラーゼの同時発現が行われる場合には、ｐＶＰ２タンパク質、ＶＰ２タンパク質、ＶＰ３タンパク質およびＶＰ１タンパク質を含むことが立証されている(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054; Martinez-Torrecuadrada, J. L., Caston, J. R., Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodriguez, J. P. & Casal, J. I. (2000). Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells. Virology 278: 322-331; Maraver, A., et al., (2003) 前掲； Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R. , Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。
その一方で、特許出願ＷＯ０２／０８８３３９では、そのカルボキシル末端でポリペプチドと結合したＩＢＤＶポリタンパク質を含んでなるキメラタンパク質の組み立てによって生成されるＩＢＤＶウイルス様粒子について開示されている。
しかしながら、ＣＶＬＰ（このＣＶＬＰはＩＢＤＶ ｐＶＰ２およびＩＢＤＶ ＶＰ３に基づくのみであり、後者のＶＰ３タンパク質は目的のポリペプチドと融合されているか、または目的の産物のビヒクルとして有望である）については、まだ開示されていない。
本発明は、ベクターまたはビヒクルに、目的の産物（例えば、生物活性を有する分子（例えば、薬物、ポリペプチド、タンパク質、核酸など））を組み込むための新規ツールを提供する課題に向けられる。
本発明により提供される解決法は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質とＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質の同時発現に基づいて（後者のＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質は、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むように遺伝子を操作される）、ＩＢＤＶキメラエンプティーキャプシド（ＣＶＬＰ）を産生することが可能であることに基づく。結果として生じるＣＶＬＰは、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と、（ii）目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Ｂと結合されている、ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質によって構成される領域Ａを含む融合タンパク質との組み立てによって生成される（ここで、前記領域Ｂは前記ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端と結合されている）。これらのＣＶＬＰは、治療目的、予防目的または診断目的などに、例えば、遺伝子治療ベクターまたはワクチンの製造において使用することができる。
本発明者らは、ＩＢＤＶ ＶＰＸ（ｐＶＰ２）タンパク質とＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質が独立した遺伝子から生じる場合には、エンプティーＩＢＤＶ粒子（ＶＬＰ）が生成されることをこれまでに発見した。これらのＶＬＰは、ＩＢＤＶポリタンパク質に対応するＯＲＦの発現によって得られるものと構造的に同一である。新規ワクチン接種戦略の開発の一環として、目的のペプチドに対応する異種アミノ酸配列（ヒスチジンタグ（実施例１）、ＧＦＰ（実施例２）、最終的には免疫応答誘導に関与するペプチド（実施例３）など）を含むＣＶＬＰを得るために、このＩＢＤＶ ＶＬＰ製造戦略が使用される可能性を解析した。示されるように、これらの構築物における異種配列の融合は、ＣＶＬＰ形成の障害にはならない。
免疫応答に関与するペプチド輸送ＣＶＬＰの研究モデルとして、マラリアＣＳタンパク質（マウスマラリア原虫(Plasmodium yoelii)）のＣＤ８エピトープ（ＥＣＤ８）に対応する配列を有するＣＶＬＰを獲得する可能性に取り組んだ。このエピトープは、この病原体に対するＣＤ８特異的細胞性免疫応答の誘導に関与し、これはＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞培養物においてＥＬＩＳＰＯＴ技術を用いて定量することができる（実施例３）。
要約すれば、得られた結果は、（ｉ）使用する発現系が異種アミノ酸配列を含むＩＢＤＶ ＣＶＬＰの獲得を可能にすること、そして（ii）前記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰを用いた免疫により、ＣＶＬＰに存在する異種アミノ酸配列に対して特異的な免疫応答が誘導されることを明白に示している。
従って、本発明の一態様は、ＩＢＤＶキメラエンプティーキャプシドに関する。このＩＢＤＶキメラエンプティーキャプシドは、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と、（ii）目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Ｂと結合されている、ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質によって構成される領域Ａを含む融合タンパク質の組み立てによって構成されることを特徴とする。
本発明のさらなる態様は、本発明によって提供される前記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰを製造するための方法に関する。この方法は、前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と融合タンパク質の、２つの独立した遺伝子としての遺伝子同時発現に基づく。
前記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰを製造する前記方法を実行するために開発された核酸、遺伝子構築物、発現系および宿主細胞、ならびに前記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰの製造のためのそれらの使用も、本発明のさらなる態様である。
前記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰは、ベクターまたはビヒクルに、目的の産物（例えば、生物活性を有する分子（例えば、ポリペプチド、タンパク質、核酸など））を組み込む能力を有する。特定の態様では、前記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰは、ビヒクル内部に、（供給される）動物またはヒトにおける抗原および免疫応答誘導物質を組み込むことができ、それによって、それらをウイルス、細菌、寄生生物または他の種類の微生物によって引き起こされるヒト疾患および動物疾患に対するワクチン、あるいは腫瘍疾患に対するワクチンの製造において使用することができる。もう１つの特定の態様では、前記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰは、遺伝子治療ベクターの製造において使用される。
従って、さらなる態様では、本発明は、医薬（ワクチンおよび遺伝子治療ベクターなど）の製造における前記ＩＢＤＶ ＣＶＬＰの使用に関する。前記ワクチンも前記ベクターも、本発明のさらなる態様である。
第１の態様では、本発明は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のキメラエンプティーキャプシド（以下、本発明のＣＶＬＰ）を提供する。この伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のキメラエンプティーキャプシドは、（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と、（ii）目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Ｂと結合されている、ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質によって構成される領域Ａを含む融合タンパク質の組み立てによって構成されることを特徴とする。
本発明において使用される、「ＩＢＤＶ」とは、既知血清型（１型または２型）のいずれかに属する異なるＩＢＤＶ株を指し［例として、van den Berg TP, Eterradossi N, Toquin D, Meulemans G., en Rev Sci Tech 2000 19: 509-43によって行われた検討を参照］、「ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質」および「ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質」とは、Sanchez and Rodriguez (1999) (Sanchez AB, Rodriguez JF. Proteolytic processing in infectious bursal disease virus: identification of the polyprotein cleavage sites by site-directed mutagenesis. Virology. 1999 Sep 15; 262 (1): 190-199)によってなされた定義に従う、記載されたＩＢＤＶ株総てのものを代表する異なる形態のｐＶＰ２タンパク質およびＶＰ３タンパク質［ＮＣＢＩ タンパク質データバンク］、ならびに前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質および前記ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質と実質的に相同であるタンパク質、すなわち、そのタンパク質のアミノ酸配列が前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質および前記ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に関し、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を指す。
本発明のＣＶＬＰに存在するＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質は、任意のＩＢＤＶ株を代表するいずれのｐＶＰ２タンパク質（例えば、ＩＢＤＶ Ｓｏｒｏａ株の全長ｐＶＰ２タンパク質［ＮＣＢＩ、受託番号ＡＡＤ３０１３６］）であってもよい。
本発明のＣＶＬＰに存在する融合タンパク質は、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Ｂと結合されている、ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質によって構成される領域Ａを含む。特定の態様では、前記領域Ｂは前記ＩＢＤＶ ＶＰ３のアミノ末端領域と結合されているか、あるいはＩＢＤＶ ＶＰ３のカルボキシ末端領域と結合されている。
前記融合タンパク質の領域Ａを構成しているＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質は、任意のＩＢＤＶ株を代表するいずれのＶＰ３タンパク質（例えば、ＩＢＤＶ Ｓｏｒｏａ株の全長ＶＰ３タンパク質［ＮＣＢＩ、受託番号ＡＡＤ３０１３６］）であってもよい。
前記融合タンパク質に存在する領域Ｂは、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成されている。本発明において使用される、「異種ポリペプチド」とは、天然ＩＢＤＶキャプシドには属していないポリペプチドを指す。目的のポリペプチドのサイズは、数個のアミノ酸から数百個のアミノ酸までの広い範囲で変動し得る。前記目的のポリペプチドは、その起源（真核生物起源、原核生物起源、ウイルス起源など）には関係なく、実質的には組換えによる発現を受け入れやすいいずれのポリペプチドでもあってもよい。しかしながら、特定の態様では、前記目的のポリペプチドは、ワクチン接種、治療または診断において有用なポリペプチド（動物およびヒトにおいて、ウイルス、細菌、寄生生物または他の種類の微生物によって引き起こされる疾患に対する免疫応答、あるいは腫瘍疾患に対する免疫応答を誘導し得るエピトープまたは決定抗原など）である。
特定の態様では、前記領域Ｂは単一の目的のポリペプチドを含んでなる。しかしながら、もう１つの特定の態様では、前記領域Ｂは２個以上の目的のポリペプチドを含んでなり、それらの目的のポリペプチドは同一であるかまたは異なっており、それらはタンデムを形成している場合がある。
特定の態様では、前記融合タンパク質は単一の領域Ｂと結合された領域Ａを含んでなる。この場合、前記領域Ｂは、領域Ａに存在するＶＰ３のアミノ末端領域と結合されているか、あるいは領域Ａに存在するＶＰ３のカルボキシ末端領域と結合されている。先に述べたように、領域Ｂは１個以上の目的のポリペプチドを含み得る。特定の態様では、前記領域Ｂは単一の目的のポリペプチドを含み、一方、もう１つの特定の態様では、前記領域Ｂは異なる２個以上の目的のポリペプチドを含んでなる。
もう１つの特定の態様では、前記融合タンパク質は２個の領域Ｂと結合された領域Ａを含んでなり、その２個の領域Ｂの一方のものは領域Ａに存在するＶＰ３のアミノ末端領域と結合されており、もう一方のものは領域Ａに存在するＶＰ３のカルボキシ末端領域と結合されている。前記領域Ｂは同一であるかまたは異なっており、それらはそれぞれ、同一であるかまたは相互に異なっている１個以上の目的のポリペプチドを含み得る。特定の態様では、融合タンパク質は、第１の目的のポリペプチド（Ｂ１）を含む第１の領域Ｂおよび第２の目的のポリペプチド（Ｂ２）を含む第２の領域Ｂと結合された領域Ａを含んでなる。前記目的のポリペプチド（Ｂ１）および（Ｂ２）は同一であるかまたは異なっている。特定の態様では、前記目的のポリペプチド（Ｂ１）および（Ｂ２）は相互に異なっている。
一般に、領域Ａ（ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質によって構成される）は、前記領域Ｂ（目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される）と、直接ではなく、むしろ前記領域Ａおよび前記領域Ｂ間のリンカーポリペプチドを通じて結合される。従って、必要に応じて、本発明の融合タンパク質は、前記領域Ａと前記領域Ｂとの間に位置づけられたリンカーポリペプチドをさらに含み得る。有利には、前記リンカーポリペプチドは、構造的柔軟性を有するペプチド、好ましくは免疫応答を誘導し得るまたはし得ない非構造化ドメインをもたらすポリペプチドである。例として、前記フレキシブルペプチドは、アミノ酸残基（特に、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基）の繰り返しまたはアミノ酸残基の他の好適な繰り返しを含み得る。
本発明のＣＶＬＰは、前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と、前記領域Ａおよび前記領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質を好適な宿主細胞において同時発現させることによって得ることができる。前記好適な宿主細胞は、単一の遺伝子構築物または２個の遺伝子構築物のいずれかとして、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質のコーディングヌクレオチド配列とＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のコーディングヌクレオチド配列を含む細胞である。特定の態様では、前記好適な宿主細胞は、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含んでなる発現系などの好適な発現系、あるいは領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の遺伝子構築物とＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の遺伝子構築物を含んでなる発現系で形質転換される、トランスフェクトされる、または感染される細胞である。
従って、もう１つの態様では、本発明は核酸を提供する。この核酸のヌクレオチド配列は、本発明のＣＶＬＰの一部を形成する、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Ｂと結合されている、ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質によって構成される領域Ａを含む前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる（ここで、前記領域Ｂは前記ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質のアミノ末端領域と結合されているか、または前記ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質のカルボキシ末端領域と結合されている）。場合によっては、本発明によって提供される核酸は、必要に応じて、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２をコードするヌクレオチド配列を含み得る。さらに詳しく言えば、特定の態様では、本発明によって提供される核酸配列は、（ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含むヌクレオチド配列と、（ii）１個以上の目的のポリペプチドを含んでなる１個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含むヌクレオチド配列、さらに場合によっては、必要に応じて、（iii）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる。
もう１つの特定の態様では、本発明によって提供される核酸配列は、（ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含むヌクレオチド配列と、（ii）１個以上の目的のポリペプチドを含んでなる１個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含む第１のヌクレオチド配列と、（ii'）１個以上の目的のポリペプチドを含んでなる１個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む第２のヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、各第１のヌクレオチド配列と同一であるかまたは異なっている）、さらに場合によっては、必要に応じて、（iii）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる。この場合、前記第１のヌクレオチド配列または前記第２のヌクレオチド配列のうちの一方がＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列の５’末端に作動可能なように連結され、もう一方がＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列の３’末端に作動可能なように連結されている。
本説明において「ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレーム」または「ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレーム」とは、前記オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列のほかに、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質およびＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質のそのコードフレームに類似した他のオープンリーディングフレームも含む。同様に、「１個以上のポリペプチドを含んでなる１個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレーム」とは、１個以上の目的のポリペプチドを含んでなる前記異種ポリペプチドのいずれのコードヌクレオチド配列も含む。本明細書において「類似した」とは、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２およびＩＢＤＶ ＶＰ３のコードヌクレオチド配列に基づいて、単離され得るか、または、例えば、保存的または非保存的ヌクレオチド置換（１個以上のヌクレオチドの挿入、分子の末端への１個以上のヌクレオチドの付加または配列末端もしくは配列内での１個以上のヌクレオチドの欠失を含む）を導入することによって構築され得るいずれのヌクレオチド配列も含むことを意図している。一般に、別のヌクレオチド配列と類似したあるヌクレオチド配列は、前記別のヌクレオチド配列と実質的に相同である。本説明において使用される意味では、「実質的に相同の」とは、ヌクレオチドレベルにおいて、当該ヌクレオチド配列が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そしてさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有することを意味する。
もう１つの態様では、本発明は、遺伝子構築物を提供する。この遺伝子構築物は、本発明によって提供される核酸、すなわち、そのヌクレオチド配列が領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、場合によっては、前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含んでなる。さらに詳しく言えば、特定の態様では、本発明によって提供される遺伝子構築物は、（ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、（ii）１個以上の目的のポリペプチドを含んでなる１個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列、さらに場合によっては、必要に応じて、（iii）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列を含む。もう１つの特定の態様では、本発明によって提供される遺伝子構築物は、（ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、（ii）１個以上の目的のポリペプチドを含んでなる１個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む第１のヌクレオチド配列と、（ii'）１個以上の目的のポリペプチドを含んでなる１個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む第２のヌクレオチド配列（ここで、前記第２のヌクレオチド配列は、前記第１のヌクレオチド配列と同一であるかまたは異なっている）、さらに場合によっては、必要に応じて、（iii）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列を含む。この場合、前記第１のヌクレオチド配列または前記第２のヌクレオチド配列のうちの一方がＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列の５’末端に作動可能なように連結され、もう一方がＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列の３’末端に作動可能なように連結されている。
もう１つの態様では、本発明は、発現ベクターまたは系を提供する。この発現ベクターまたは系は、
ａ）転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む発現系（ここで、前記遺伝子構築物は領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる）、および
ｂ）転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、本発明によって提供される第１の遺伝子構築物（ここで、前記第１の構築物は、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる）と、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる第２の遺伝子構築物を含む発現系
から選択される。
ａ）転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む発現系（ここで、前記遺伝子構築物は領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる）、および
ｂ）転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、本発明によって提供される第１の遺伝子構築物（ここで、前記第１の構築物は、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる）と、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる第２の遺伝子構築物を含む発現系
から選択される。
特定の態様では、本発明によって提供される発現系は、（ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ３に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、（ii）１個以上の目的のポリペプチドを含んでなる１個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、（iii）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子構築物（ここで、前記遺伝子構築物は、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい）を含む。
もう１つの特定の態様では、本発明によって提供される発現系は、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい第１の遺伝子構築物（前記第１の遺伝子構築物は、（ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、（ii）１個以上の目的のポリペプチドを含んでなる１個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる）と、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい第２の遺伝子構築物（前記第２の遺伝子構築物はＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる）を含む。
本発明によって提供される発現系に存在する転写制御エレメント、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントとしては、目的のヌクレオチド配列（ｐＶＰ２、ＶＰ３および異種ポリペプチド）に作動可能なように連結され、その目的のヌクレオチド配列の転写を命令するプロモーター、ならびに転写およびその転写の時間と場所の適切な調節に必要であるか、または好適である他の配列（例えば、開始シグナルおよび終止シグナル、切断部位、ポリアデニル化シグナル、複製起点、転写アクチベーター（エンハンサー）、転写サイレンサー（サイレンサー）など）が挙げられる。
実質的には、いかなる好適な発現系またはベクターも、本発明によって提供される発現系の作製に使用することができる。例として、前記好適な発現系またはベクター系は、それぞれの具体的なケースについての条件および必要性に従って、プラスミド、バクミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、コスミドまたはウイルス（異種複製起点（例えば、細菌または酵母において増幅し得るように、細菌または酵母の複製起点）、ならびに目的の遺伝子または遺伝子群とは異なるトランスフェクト細胞を選択するのに使用することができるマーカーをさらに有し得る）から選択することができる。これらの発現系またはベクターは、当業者に公知の従来の方法によって得ることができ[Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory]、本発明に含まれる。特定の態様では、前記発現系またはベクター系は、プラスミド（酵母の形質転換に好適なプラスミド（例えば、ｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−ＶＰ３−ＧＦＰと呼ばれるプラスミド（実施例２））など）またはウイルス（組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）（例えば、複製サイクル中に昆虫細胞において両方のタンパク質（ＩＢＤＶ ｐＶＰ２およびｈｉｓ−ＶＰ３）を同時に発現するＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３と呼ばれるｒＢＶ（実施例１．２）、もしくは昆虫細胞を同時感染させたときにＩＢＤＶ ｐＶＰ２およびｈｉｓ−ＶＰ３タンパク質それぞれを発現し、６ヒスチジン（６ｈｉｓ）異種ポリペプチドを有するＩＢＤＶ ＣＶＬＰを得るＦＢ／ｐＶＰ２およびＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３と呼ばれるｒＢＶ（実施例１．１）、もしくは昆虫細胞を同時感染させたときにＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質およびｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３それぞれを発現し、ＣＤ８−ＣＶＬＰと呼ばれるキャプシドを形成するＦＢ／ｐＶＰ２およびＦＢ／ｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３と呼ばれるｒＢＶ（実施例３））など）である。
もう１つの態様では、本発明は、宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、単一の遺伝子構築物または２個の異なる遺伝子構築物のいずれかとして、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質のコードヌクレオチド配列とＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のコードヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、前記宿主細胞は、（ｉ）前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質のコードヌクレオチド配列を含んでなる単独の遺伝子構築物を含む、本発明によって提供される発現系で、あるいは、（ii）領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる第１の構築物と、前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる第２の遺伝子構築物とを含む発現系で形質転換される、トランスフェクトされる、または感染される宿主細胞である。
特定の態様では、本発明によって提供される宿主細胞は、（ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、（ii）目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、（iii）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子構築物を含む発現系（ここで、前記遺伝子構築物は転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい）で形質転換される、トランスフェクトされる、または感染される宿主細胞である。
もう１つの特定の態様では、本発明によって提供される宿主細胞は、（ａ）転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい第１の遺伝子構築物（前記第１の遺伝子構築物は、（ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、（ii）目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる）で、および（ｂ）転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい第２の遺伝子構築物（前記第２の遺伝子構築物は、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる）で形質転換される、トランスフェクトされる、または感染される宿主細胞である。
実質的には、本発明によって提供される発現系での形質転換、トランスフェクションまたは感染を受け入れやすいいかなる宿主細胞も使用することができる（例えば、哺乳類細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母など）。しかしながら、特定の態様では、前記宿主細胞は酵母および昆虫細胞から選択される。容易さと製造コストから酵母が好適である。発現系が１種または２種の組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を含む場合には、昆虫細胞が好適である。バキュロウイルスの宿主域に関する生物学的研究における安全性の問題から、昆虫細胞以外の細胞種では複製することができないｒＢＶを使用することが好都合である。
特定の態様では、本発明は宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む発現系（プラスミドまたは発現ベクターなど）で形質転換された宿主細胞（例えば、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)など））である。
もう１つの特定の態様では、本発明は宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む発現系（組換えバキュロウイルスなど）に感染された宿主細胞（例えば、昆虫細胞）である。
もう１つの特定の態様では、本発明は宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む第１の組換えバキュロウイルスを含む発現系と、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む第２の組換えバキュロウイルスに同時感染された宿主細胞（例えば、昆虫細胞）である。
もう１つの態様では、本発明は、本発明のＣＶＬＰの製造のための方法を提供する。この方法は、単一の遺伝子構築物または２個の異なる遺伝子構築物のいずれかとして、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質のコードヌクレオチド配列とＩＢＤＶ ｐＶＰ２のコードヌクレオチド配列を含む、本発明によって提供される宿主細胞を培養することおよび前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と領域ＡおよびＢを含んでなる融合タンパク質を同時発現させること、さらに、必要に応じて、前記本発明のＣＶＬＰを回収することを含む。特定の態様では、本発明によって提供される前記宿主細胞は、好適な発現系（領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とＩＢＤＶ ｐＶＰ２をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含んでなる発現系など）で、あるいは、領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の遺伝子構築物とＩＢＤＶ ｐＶＰ２をコードするヌクレオチド配列を含む第２の遺伝子構築物を含んでなる発現系で形質転換される、トランスフェクトされる、または感染される細胞である。
前記方法は、従って、前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質を、２つの独立した遺伝子として、遺伝子を同時発現させることを含む。前記タンパク質（ＩＢＤＶ ｐＶＰ２と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる融合タンパク質）の前記細胞における同時発現後、発現タンパク質が構成され、本発明のＣＶＬＰを生成する。このＣＶＬＰは培地から単離するか、または回収することができ、さらに必要に応じて精製することができる。前記本発明のＣＶＬＰの単離および精製は、従来の方法により（例えば、スクロース勾配による分画により）行うことができる。
特定の態様では、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる融合タンパク質の同時に起こる遺伝子同時発現は、昆虫細胞における２つの独立したキメラ遺伝子からの前記タンパク質の同時発現を可能にするｒＢＶを使用することによって行われる。この場合、本発明によって提供される本発明のＣＶＬＰの製造のための方法は、第一に、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質を同時にコードする遺伝子構築物を含むｒＢＶ（ＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３と呼ばれるｒＢＶ（実施例１．２）など）によって構成される遺伝子発現系の獲得、あるいは、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む１つのｒＢＶの獲得と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を含むもう１つのｒＢＶの獲得（ＦＢ／ｐＶＰ２およびＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３と呼ばれるｒＢＶ（実施例１．１）またはＦＢ／ｐＰＶ２およびＦＢ／ｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３と呼ばれるｒＢＶ（実施例３）など）それぞれの獲得に続いて、前記組換えバキュロウイルスに基づく前記発現系での昆虫細胞の感染、組換えタンパク質の発現、さらに必要に応じて、前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質の組み立てによって生成された本発明のＣＶＬＰの単離、さらに場合によっては、前記本発明のＣＶＬＰのその後の精製を含む。
ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる融合タンパク質の独立した発現を可能にする組換えバキュロウイルスの構築は、当業者ならば本明細書において記載されているようなことやこのテクノロジーに関する技術水準に基づいて行うことができる(Cold Spring Harbor, N. Y.; Leusch MS, Lee SC, Olins PO. 1995. A novel host-vector system for direct selection of recombinant baculoviruses (bacmids) in Escherichia coli. Gene 160: 191-4; Luckow VA, Lee SC, Barry GF, Olins PO. 1993. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol 67: 4566-79)。
もう１つの特定の態様では、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質の遺伝子同時発現は、酵母細胞における前記タンパク質の発現を可能にするベクターを使用することによって行われる。この場合、本発明によって提供される本発明のＣＶＬＰの製造のための方法は、第一に、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質を同時にコードする遺伝子構築物を含むプラスミドによって構成される遺伝子発現系の獲得、その獲得に続いて、前記発現系での酵母の形質転換、組換えタンパク質の発現、さらに必要に応じて、前記ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる前記融合タンパク質の組み立てによって生成された本発明のＣＶＬＰの単離、さらに場合によっては、前記本発明のＣＶＬＰのその後の精製を含む。特定の態様では、酵母の形質転換に好適な発現系は、例えば、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２およびＶＰ３−ＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子構築物を含むプラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２／ＶＰ３−ＧＦＰ（実施例２）のようなｐＥＳＣ酵母(Stratagene)発現系に基づくものである。
遺伝子構築物またはＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と領域Ａおよび領域Ｂを含んでなる融合タンパク質の同時発現を可能にする好適な発現系もしくはベクターで形質転換された酵母の獲得は、当業者ならば本明細書において記載されているようなことやこのテクノロジーに関する技術水準に基づいて行うことができる(pESC epitope tagging vectors Instructions manual. Stratagene www.stratasene.com; Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory)。
もう１つの態様では、本発明は、本発明のＣＶＬＰを製造し、獲得するための、本発明によって提供される遺伝子発現系の使用に関する。
本発明のＣＶＬＰは、目的の産物（例えば、生物活性を有する分子（例えば、薬物、ポリペプチド、タンパク質、核酸など））のベクターまたはビヒクルとして使用することができるため、ＣＶＬＰは治療目的もしくは診断目的または研究目的に使用することができる。特定の態様では、生物学的に関心の高い前記分子としては、目的のポリペプチド、例えば、（供給される）動物またはヒトにおける抗原もしくは免疫応答誘導物質、または遺伝子療法において有用な、好適な細胞内に導入することを目的とする核酸配列を包含する。
従って、もう１つの態様では、本発明は、医薬（例えば、ワクチン、遺伝子治療ベクター（送達系）など）の製造における本発明のＣＶＬＰの使用に関する。特定の態様では、前記医薬は、ウイルス、細菌、寄生生物または他の種類の微生物によって引き起こされるヒト疾患または動物疾患に対する防御、あるいは腫瘍疾患に対する防御を与えることを目的とするワクチンである。もう１つの特定の態様では、前記医薬は遺伝子治療ベクターである。
もう１つの態様では、本発明は、本発明のＣＶＬＰの治療上有効な量と、場合によっては、１種以上の医薬上許容されるアジュバントおよび／またはビヒクルを含んでなるワクチンを提供する。前記ワクチンは、動物およびヒトを、微生物（ウイルス、細菌、寄生生物など）によって引き起こされる疾患、あるいは腫瘍疾患から防御するのに有用である。特定の態様では、前記ワクチンは、動物またはヒトを、２種類以上の感染性病原体によって引き起こされる感染から同時に防御するのに特に有用である。例として、本発明によって提供されるワクチンは、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、キジ、ウズラ、ダチョウなど）を、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）や鳥類疾患に関与する１種類以上の感染性病原体（鳥類病原体）から防御するために使用することができる。
本説明において使用される意味では、「治療上有効な量」とは、所望の効果をもたらすための算出された本発明のＣＶＬＰの量を指し、この量は、一般に、とりわけ、ＣＶＬＰの性質と達成すべき免疫効果によって決定される。
前記ワクチンに使用することができる医薬上許容されるアジュバントおよびビヒクルは、当業者には公知であり、ワクチンの製造において通常使用されるアジュバントおよびビヒクルである。
特定の態様では、前記ワクチンは、医薬上許容される希釈液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または他の任意の医薬上許容される希釈液）中水溶液または懸濁液の形態で調製される。
本発明によって提供されるワクチンは、使用される異種配列またはエピトープに対する防御免疫応答を引き起こす任意の好適な投与経路により投与することができ、そのため、前記ワクチンは、選択される投与経路に適した投与形に製剤される。特定の態様では、本発明によって提供されるワクチンの投与は、非経口的（例えば、腹膜内、皮下など）に行われる。
以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
昆虫細胞におけるＩＢＤＶ ＣＶＬＰの獲得
１．１ 昆虫細胞における、２つの独立したｒＢＶを用いたＩＢＤＶ ＣＶＬＰ、ＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３の獲得
２つの独立したキメラ遺伝子からのＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質およびＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質と異種ポリペプチドの同時発現によりＩＢＤＶ ＣＶＬＰを獲得する可能性を解析するように設計された一連の試験の結果を、本実施例において記載する。そこで、上述の２つの組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）、ＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３(Kochan, G., Gonzalez, D. & Rodriguez, J. F. (2003). Characterization of the RNA binding activity of VP3, a major structural protein of IBDV. Archives of Virology 148, 723-744)とＦＢ／ＶＰＸ（本明細書ではＦＢ／ｐＶＰ２として記載）(Martinez-Torrecuadrada, J. L., Caston, J. R., Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodriguez, J. F. & Casal, J. I. (2000). Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells. Virology 278: 322-331)を使用した。これらのｒＢＶは、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質およびＩＢＤＶ ｐＶＰ３タンパク質の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）エンコーダーを好適なベクターにクローニングすることによって作製した。前記ｃＤＮＡは、血清型Ｉ型ＩＢＤＶ Ｓｏｒｏａ株ゲノムａ（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＤ３０１３６）のＡセグメントからＲＴ−ＰＣＲによって得た。ｒＢＶ ＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３は、そのＮ末端においてｈｉｓ−ＶＰ３と呼ばれる、ＶＰ３配列（ポリタンパク質のＭｅｔ７５４−Ｇｌｕ１０１２）と融合されたタンデム型６ヒスチジンを含むキメラＶＰ３タンパク質を発現する。ｒＢＶ ＦＢ／ｐＶＰ２は、ｐＶＰ２タンパク質（Ｍｅｔ１−Ａｌａ５１２）のコード領域を発現する。
昆虫細胞におけるＩＢＤＶ ＣＶＬＰの獲得
１．１ 昆虫細胞における、２つの独立したｒＢＶを用いたＩＢＤＶ ＣＶＬＰ、ＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３の獲得
２つの独立したキメラ遺伝子からのＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質およびＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質と異種ポリペプチドの同時発現によりＩＢＤＶ ＣＶＬＰを獲得する可能性を解析するように設計された一連の試験の結果を、本実施例において記載する。そこで、上述の２つの組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）、ＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３(Kochan, G., Gonzalez, D. & Rodriguez, J. F. (2003). Characterization of the RNA binding activity of VP3, a major structural protein of IBDV. Archives of Virology 148, 723-744)とＦＢ／ＶＰＸ（本明細書ではＦＢ／ｐＶＰ２として記載）(Martinez-Torrecuadrada, J. L., Caston, J. R., Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodriguez, J. F. & Casal, J. I. (2000). Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells. Virology 278: 322-331)を使用した。これらのｒＢＶは、ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質およびＩＢＤＶ ｐＶＰ３タンパク質の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）エンコーダーを好適なベクターにクローニングすることによって作製した。前記ｃＤＮＡは、血清型Ｉ型ＩＢＤＶ Ｓｏｒｏａ株ゲノムａ（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＤ３０１３６）のＡセグメントからＲＴ−ＰＣＲによって得た。ｒＢＶ ＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３は、そのＮ末端においてｈｉｓ−ＶＰ３と呼ばれる、ＶＰ３配列（ポリタンパク質のＭｅｔ７５４−Ｇｌｕ１０１２）と融合されたタンデム型６ヒスチジンを含むキメラＶＰ３タンパク質を発現する。ｒＢＶ ＦＢ／ｐＶＰ２は、ｐＶＰ２タンパク質（Ｍｅｔ１−Ａｌａ５１２）のコード領域を発現する。
これらのｐＶＰ２タンパク質およびｈｉｓ−ｐＶＰ３タンパク質の発現の解析は、独立試験、同時試験に関係なく、細胞培養物において実施した。これらの試験を実施するために、昆虫Trichloplusia ni（Ｈ５、Invitrogen）の単層細胞培養物を使用し、それをカバーガラス上で増殖させた。前記培養物を独立にＦＢ／ｐＶＰ２に感染させ、ＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３に感染させるか、または両方のｒＢＶに同時感染させた。その多重感染度は５ｐｆｕ／細胞であった。感染後の経過時間（h.p.i.）４８時間の時点でそれらの細胞を固定し、ウサギ抗ＶＰ２ポリクローナル血清とともにインキュベートし、ラット抗ＶＰ３ポリクローナル血清とともにインキュベートした(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。連続洗浄後、カバーガラスをＡｌｅｘａ ５９４と結合したヤギ抗ラット血清およびＡｌｅｘａ ４８８と結合したヤギ抗ウサギ血清とともにインキュベートした(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.)。細胞核を特定のＴｏ−Ｐｒｏ−３マーカー(Molecular Probes, Inc.)で染色した。最後にそれらのサンプルを、Bio Rad Radiance 2100共焦点系を装備したZeiss Axiovert 200顕微鏡を使用してエピ蛍光により観察した。Laser Sharp Package (Bio Rad)ソフトウェア装置を使用して得られた画像を保存した。図２ａに示されるように、ＦＢ／ｐＶＰ２に感染させた培養物では、抗ＶＰ２血清が、管状構造物の混じった細粒シグナルを示し、その両方が細胞質全体に分布した。ｒＢＶ ＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３に感染させた細胞で検出される抗ＶＰ３シグナルは、核周囲の球状で明らかに中空の蓄積物の存在によって確認された。両方のｒＢＶに同時感染させた培養物では、両方のタンパク質の分布パターンからの著しい変化が検出された。これらの細胞では、ｐＶＰ２およびＶＰ３特有のシグナルが球形で高密度の蓄積物として一所に存在していた。このことはそれらの同時発現がｐＶＰ２／ｈｉｓ−ＶＰ３複合体の形成を可能にしたことを示唆する（図２ｃ〜２ｅ）。
これらの構造をさらに詳細に特性決定するために、ＦＢ／ｐＶＰ２＋ＦＢ／ｈｉｓＶＰ３に感染させた細胞に対応する同様の抽出物を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により解析した。対照として、並行して、野生株のＦＢＤ(FastBacDual, Invitrogen)ウイルスに感染させたＨ５細胞培養物を同じ方法により解析した。感染させた後、４８時間後に細胞を回収し、透過型電子顕微鏡による超薄切片でのそれらの解析についてこれまでに記載されているように処理した(Fernandez-Arias, A, Risco, C, Martinez, S, Albar, JP & Rodriguez JF. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。図２に示されるように、同時感染細胞の細胞質は、管状構造物とキャプシドに類似した構造物の混合物によって形成された組み立て物を含む（図２ｇ、図２ｈおよび図２ｉ）。野生株ＦＢＤウイルスに感染させた細胞に相当するサンプルでは、いずれの場合においてもこれらの会合体は観察されなかった（図２ｆ）。管状構造物ならびにキャプシドに類似した構造物の概観およびサイズは、ＶＴ７／Ｐｏｌｙ（ＩＢＤＶポリタンパク質の遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体）に感染させた細胞培養物においてこれまでに記載されているものと同様であった(Fernandez-Arias, A, Risco C, Martinez, S, Albar JP & Rodriguez JF. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。
ｐＶＰ２およびｈｉｓ−ＶＰ３の同時発現が会合を可能にし、その結果として、ＣＶＬＰの獲得を可能にすることを明白に確立するために、生成された粒子を精製することを決定した。そこで、Ｈ５細胞培養物をＦＢ／ｐＶＰ２＋ＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３に感染させた。これまでに記載されているように、ｈ．ｐ．ｉ．６０時間の時点で、細胞をホモジナイズし、抽出物をスクロース勾配により分離した(Lombardo E, Maraver, A, Caston, JR, Rivera J, Fernandez-Arias A, Serrano A, Carrascosa JL & Rodriguez JF. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。これまでに記載されているように、それらを遠心分離した後、勾配を分画し、異なる画分をＴＥＭにより解析した(Lombardo, E, Maraver A, Caston JR, Rivera J, Fernandez-Arias A, Serrano A, Carrascosa JL & Rodriguez JF. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。対照として、同じ方法に従った、ｒＢＶ ＦＢ／ＶＰＸに感染させた細胞抽出物またはｒＢＶ ＦＢＤ／Ｐｏｌｙ−ＶＰ１に感染させた細胞抽出物に相当する勾配を分画した。組換えウイルスＦＢＤ／Ｐｏｌｙ−ＶＰ１はＶＰ１ポリペプチドおよびポリタンパク質を同時に発現する。予測されるように、ＦＢＤ／Ｐｏｌｙ−ＶＰ１での感染では、ＶＬＰの効率的な製造がもたらされた(Maraver A, Ona A, Abaitua F, Gonzalez D, Clemente R, Diaz-Ruiz A, Caston JR, Pazos F & Rodriguez JF. (2003). The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology 77: 6438-49)。もう一方で、ＦＢ／ＶＰＸ単独に感染させた細胞に相当する画分はねじれた外観の管状構造物を含む。ＦＢ／ｐＶＰ２＋ＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３ ｒＢＶに同時感染させた細胞に相当する勾配は、勾配の最下層に近い画分に硬質のＩ型管状構造物、中間画分と上部画分にＣＶＬＰを含む（図３ｂ）。ＲＢＶ ＦＢ／ｐＶＰ２＋ＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３に同時感染させた細胞から単離されたＣＶＬＰは、直径６５〜７０ｎｍを有し、ＦＢＤ／Ｐｏｌｙ−ＶＰ１に感染させた培養物の精製ＶＬＰと完全には区別できない典型的な多角形の輪郭を有していた(Maraver, A., Ona, A., Abaitua, F., Gonzalez, D., Clemente, R., Diaz-Ruiz, A., Caston, J. R., Pazos, F. & Rodriguez, J. F. (2003). The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology 77: 6438-49)またはＶＴ７／Ｐｏｌｙに感染させた培養物の精製ＶＬＰ(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。
得られた材料の生化学的特性を決定するために、ウエスタンブロット試験を実施した。この試験では、ＶＰ１タンパク質、ｐＶＰ２タンパク質、ＶＰ３タンパク質およびＶＰ４タンパク質に対して特異的な血清を用いて、異なる画分を比較した(Fernandez-Arias et al. 1998, 前掲; Lombardo et al., 2000)。ＩＢＤＶに感染させた細胞抽出物を対照として使用した。得られた結果を図３ｄに示す。予測されるように、ＶＰ１ポリペプチドおよびＶＰ４ポリペプチドに相当するバンドは、ＦＢＤ／Ｐｏｌｙ−ＶＰ１に感染させた細胞に相当するサンプルにおいてのみ検出された。ＦＢＤ／Ｐｏｌｙ−ＶＰ１に感染させた細胞に相当するサンプルまたはＦＢ／ＶＰＸ＋ＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３に同時感染させた細胞に相当するサンプルにおけるｐＶＰ２／ＶＰ３に相当するパターンは類似しており、ｐＶＰ２およびＶＰ３それぞれに相当する２つのバンドが検出された。
１．２ 昆虫細胞における、単一のｒＢＶを用いたＩＢＤＶ ＣＶＬＰ、ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３の獲得
さらに、プラスミドｐＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３の構築を行った。構築の第１の段階を、ｐＶＰ２タンパク質コード領域をｐＦＢＤｕａｌベクター(Invitrogen)にクローニングすることによって行った。ｐＶＰ２に対応するＤＮＡ断片を、プラスミドｐＶＯＴＥ．２／Ｐｏｌｙを鋳型に、オリゴＩ（配列番号１）およびオリゴII（配列番号２）と同定されたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって得た(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。その断片を精製し、ＢｇｌII酵素およびＨｉｎｄIII酵素で消化を行い、予めＢａｍＨＩ酵素およびＨｉｎｄｉ酵素で消化しておいたｐＦＢＤｕａｌベクター(Invitrogen)にクローニングした。得られたプラスミドをｐＦＢＤ／ｐＶＰ２と呼んだ。次いで、ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３(Kochan et al., 2003, 前掲)をＲｓｒII酵素での消化し、クレノウにより処理し、その後、ＫｐｎＩで制限処理することによって得た。このＤＮＡ断片を精製し、予めＳｍａＩ酵素およびＫｐｎＩ酵素で消化しておいたプラスミドｐＦＢＤ／ｐＶＰ２にクローニングした。得られたプラスミドをｐＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３（配列番号３）と呼んだ。このプラスミドは、ｐＶＰ２タンパク質のコードヌクレオチド配列と、異種ｈｉｓ６配列を含むｈｉｓ−ｐＶＰ３融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を含む（後者は、配列番号３のヌクレオチド６７３４〜７５８５の相補鎖によってコードされる）。前記プラスミドｐＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３に含まれるヌクレオチド配列によってコードされる、ｐＶＰ２タンパク質とｈｉｓ−ＶＰ３融合タンパク質（ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
さらに、プラスミドｐＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３の構築を行った。構築の第１の段階を、ｐＶＰ２タンパク質コード領域をｐＦＢＤｕａｌベクター(Invitrogen)にクローニングすることによって行った。ｐＶＰ２に対応するＤＮＡ断片を、プラスミドｐＶＯＴＥ．２／Ｐｏｌｙを鋳型に、オリゴＩ（配列番号１）およびオリゴII（配列番号２）と同定されたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって得た(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。その断片を精製し、ＢｇｌII酵素およびＨｉｎｄIII酵素で消化を行い、予めＢａｍＨＩ酵素およびＨｉｎｄｉ酵素で消化しておいたｐＦＢＤｕａｌベクター(Invitrogen)にクローニングした。得られたプラスミドをｐＦＢＤ／ｐＶＰ２と呼んだ。次いで、ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３(Kochan et al., 2003, 前掲)をＲｓｒII酵素での消化し、クレノウにより処理し、その後、ＫｐｎＩで制限処理することによって得た。このＤＮＡ断片を精製し、予めＳｍａＩ酵素およびＫｐｎＩ酵素で消化しておいたプラスミドｐＦＢＤ／ｐＶＰ２にクローニングした。得られたプラスミドをｐＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３（配列番号３）と呼んだ。このプラスミドは、ｐＶＰ２タンパク質のコードヌクレオチド配列と、異種ｈｉｓ６配列を含むｈｉｓ−ｐＶＰ３融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を含む（後者は、配列番号３のヌクレオチド６７３４〜７５８５の相補鎖によってコードされる）。前記プラスミドｐＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３に含まれるヌクレオチド配列によってコードされる、ｐＶＰ２タンパク質とｈｉｓ−ＶＰ３融合タンパク質（ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
プラスミドｐＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３は、その複製サイクル中に両方のタンパク質を同時に発現するＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３と呼ばれるｒＢＶの獲得を可能にする[http://invitrogen.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf]。
昆虫細胞においてＦＢＤ／ｐＶＰ２−ｈｉｓ−ＶＰ３を用いて得られた結果は、ＦＢ／ｐＶＰ２ ｒＢＶおよびＦＤ／ｈｉｓ−ＶＰ３ ｒＢＶでの同時感染によって得られた結果と同一であり、異種６ヒスチジン（６ｈｉｓ）ポリペプチドを有するＩＢＤＶ ＣＶＬＰが得られる。
実施例２
酵母におけるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ、ｐＶＰ２−ＶＰ３−ＧＦＰの獲得
酵母培養物（サッカロミセス・セレビシエ）においてＩＢＤＶ ＣＶＬＰを獲得する可能性を研究するために、ベクターｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−ＶＰ３−ＧＦＰを、ＶＰ３Ｎ末端と結合された異種ＧＦＰ遺伝子を用いて作製した。ベクター構築の第１の段階を、ｐＶＰ２タンパク質コード領域をベクターｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖにクローニングすることによって行った。プラスミドｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖを、ベクターｐＲＳ４２６(Stratagene)をＰｖｕII酵素で消化し、消化混合物を再連結することによって作製した。得られたベクター、ｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖは、親ベクターｐＲＳ４２６とは逆位置に多重クローニング領域を含む。ｐＶＰ２タンパク質に対応するＤＮＡ断片を、プラスミドｐＶＯＴＥ．２／Ｐｏｌｙを鋳型に、オリゴIII（配列番号５）およびオリゴＩＶ（配列番号６）と呼ばれるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって得た(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。その断片を精製し、ＢｇｌII酵素およびＨｉｎｄIII酵素で消化を行い、予めＢａｍＨＩ酵素およびＨｉｎｄIII酵素で消化しておいたベクターｐＥＳＣＵＲＡ．ｉｎｖにクローニングした。得られたプラスミドをｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２と呼んだ。
酵母におけるＩＢＤＶ ＣＶＬＰ、ｐＶＰ２−ＶＰ３−ＧＦＰの獲得
酵母培養物（サッカロミセス・セレビシエ）においてＩＢＤＶ ＣＶＬＰを獲得する可能性を研究するために、ベクターｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−ＶＰ３−ＧＦＰを、ＶＰ３Ｎ末端と結合された異種ＧＦＰ遺伝子を用いて作製した。ベクター構築の第１の段階を、ｐＶＰ２タンパク質コード領域をベクターｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖにクローニングすることによって行った。プラスミドｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖを、ベクターｐＲＳ４２６(Stratagene)をＰｖｕII酵素で消化し、消化混合物を再連結することによって作製した。得られたベクター、ｐＥＳＣＵＲＡｉｎｖは、親ベクターｐＲＳ４２６とは逆位置に多重クローニング領域を含む。ｐＶＰ２タンパク質に対応するＤＮＡ断片を、プラスミドｐＶＯＴＥ．２／Ｐｏｌｙを鋳型に、オリゴIII（配列番号５）およびオリゴＩＶ（配列番号６）と呼ばれるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって得た(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。その断片を精製し、ＢｇｌII酵素およびＨｉｎｄIII酵素で消化を行い、予めＢａｍＨＩ酵素およびＨｉｎｄIII酵素で消化しておいたベクターｐＥＳＣＵＲＡ．ｉｎｖにクローニングした。得られたプラスミドをｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２と呼んだ。
プラスミドｐＦＢ／ＶＰ３−ＧＦＰを２段階で構築した。第１の段階は、ＰＣＲによって作製された、終止コドンのないＶＰ３タンパク質のＯＲＦを含む、ＤＮＡ断片のクローニングであった。このＰＣＲは、プラスミドｐＶＯＴＥ．２／Ｐｏｌｙを鋳型に、オリゴＶ（配列番号９）およびオリゴＶＩ（配列番号１０）と呼ばれるオリゴヌクレオチドを用いて実施した(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。得られたＤＮＡをＥｃｏＲＩ酵素およびＢａｍＨＩ酵素で消化し、同様に同じ酵素で消化しておいたベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ３(Clontech)にクローニングした。得られたプラスミドをｐＶＰ３−ＧＦＰと呼んだ。次いで、そのプラスミドｐＥＧＦＰ−ＧＦＰをＥｃｏＲＩ酵素およびＮｏｔＩ酵素で消化し、ベクターｐＦａｓｔＢａｃｌ(Invitrogen)にクローニングした。得られたプラスミドをｐＦＢ／ＶＰ３−ＧＦＰと呼んだ。
次に、ＥＧＦＰタンパク質コード領域と融合されたＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＦＢ／ＶＰ３−ＧＦＰをＥｃｏＲＩ酵素およびＮｏｔＩ酵素で消化することによって得た。このＤＮＡ断片を精製し、予めＥｃｏＲＩ酵素およびＮｏｔＩ酵素で消化しておいたプラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２にクローニングした。得られたプラスミドをｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−ＶＰ３−ＧＦＰ（配列番号７）と呼んだ。このプラスミドは、２つの独立したプロモーター、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０（いずれもガラクトースによって誘導される）の転写制御下でｐＶＰ２タンパク質のＯＲＦおよびＶＰ３−ＧＦＰタンパク質のＯＲＦを含む（ｐＶＰ２タンパク質は、配列番号７のヌクレオチド５８６２〜７３４３と相補的であるヌクレオチド鎖によってコードされる）。前記プラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−ＶＰ３−ＧＦＰに含まれるヌクレオチド配列によってコードされる、ｐＶＰ２タンパク質とＶＰ３−ＧＦＰ融合タンパク質（ｐＶＰ２−ＶＰ３−ＧＦＰ）のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
続いて、ｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２−ＶＰ３−ＧＦＰを使用して、これまでに記載されているプロトコールに従って、Ｓ．セレビシエ酵母ハプロイド株４９９の培養物を形質転換した(Gietz, R. D. and R. A. Woods. (2002), Transformation of yeast by the Liac/SS carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96)。プラスミドで形質転換した酵母を、アミノ酸、トリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを添加した、ウラシルを含まない（−Ｕｒａ）ＳＣ培地プレート（ＣＳＭ＋ＹＮＢ、２％グルコースおよびバクトアガー(bacto agar)）で増殖させることによって選抜した。３０℃にて４８時間インキュベートした後、コロニーを選抜した。このコロニーを使用して、以下のタンパク質発現およびＣＶＬＰ形成についての解析を行った。
ｐＶＰ２タンパク質およびＶＰ３タンパク質発現、ならびにＣＶＬＰ形成についての解析を、他の発現系におけるＩＢＤＶ ＶＬＰの特性決定についてこれまでに記載されているプロトコールに従って行った(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054; Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R., Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。選抜したコロニーを２％ラフィノースを添加した液体ＣＳＭ（−Ｕｒａ）＋ＹＮＢ培地で培養した。この培養物を３０℃にて２４時間インキュベートした。この培養物を用いて、２％誘導物質（ガラクトース）を添加したＣＳＭ（−Ｕｒａ）＋ＹＮＢ培地２００ｍｌのフラスコに光学濃度（Ｏ．Ｄ．）０．２にて接種した。培養物を３０℃にて１８時間維持した（Ｏ．Ｄ．１．０〜２．０間まで）。酵母を３，０００放射力にて４℃にて５分遠心分離し、蒸留水で１回洗浄し、ペレットを溶解バッファー（ＴＥＮ：Ｔｒｉｓ １０ｍＭ、ｐＨ８．０；ＮａＣｌ １５０ｍＭ；ＥＤＴＡ １ｍＭ）＋２×プロテアーゼ阻害剤(Compl Roche)に再懸濁した。溶解用に、サイズ約４２５〜６００ミクロンの多量のガラスビーズ(Sigma)を加えた。この混合物を、４℃にて３０秒間、３０秒間隔で４回、強いボルテックス攪拌を行った。この後、溶解混合物を１３，０００ｒｐｍにて４℃にて１５分間遠心分離することによって、可溶性画分を回収した。このサンプルを、これまでに記載されているプロトコールに従ってスクロース勾配による分画を行った(Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R., Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。分画後に得られたサンプル、ならびに出発物質サンプルを、抗ｐＶＰ２血清および抗ＶＰ３血清を使用したドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［Current Protocols in Molecular Biology］およびウエスタンブロットによる免疫検出（図４Ａ）[Current Protocols in Molecular Biology]によって解析した。図４Ａに示されるように、ウエスタンブロットでは、ｐＶＰ２タンパク質（４８ｋＤａ）およびＶＰ３−ＧＦＰ（６１ｋＤａ）タンパク質に対応する推定分子量を有するバンドの存在だけでなく、最初のサンプルにおいても勾配の異なる画分においても、タンパク質分解によっておそらく生じるであろう、より小さいサイズの他の免疫反応性バンドも示した。これらの結果は、プラスミドｐＥＳＣＵＲＡ／ｐＶＰ２ＶＰ３で形質転換したＳ．セレビシエ培養物における両方のポリペプチドの正確な発現を正確に示した。次いで、これまでに記載されているように、勾配の異なる画分をＴＥＭによって解析した(Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R., Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。図４Ｂに示されるように、勾配の画分のＴＥＭ解析では、勾配の上部画分においてＩＢＤＶ ＣＶＬＰの存在を示した。これらのＣＶＬＰは直径６５〜７０ｎｍを有し、他の発現系において得られるＩＢＤＶ ＣＶＬＰと区別できない多角形の輪郭を有する（図４Ｃ）。
実施例３
ＩＢＤＶ ＣＶＬＰの免疫原性の獲得および特性決定
新規ワクチン接種戦略開発の一環として、免疫応答の誘導に関与する他のタンパク質またはペプチドに対応する異種アミノ酸配列を含むキメラＩＢＤＶ ＶＬＰ（ＣＶＬＰ）を製造する戦略が使用される可能性を解析した。研究モデルとして、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドとして、マラリアＣＳタンパク質（マウスマラリア原虫）のＣＤ８エピトープ（Ｅ−ＣＤ８）に対応するアミノ酸配列を含むＣＶＬＰを獲得する可能性に取り組んだ。Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54; Zavala, F., Rodrigues, M., Rodriguez, D., Rodriguez, J. R., Nussenzweig, R. S. and Esteban, M. (2001). A striking property of recombinant poxviruses: efficient inducers of in vivo expansion of primed CD8(+) T cells. Virology 280: 155-159)。このエピトープは、この病原体に対するＣＤ８特異的細胞性免疫応答の誘導に関与する(Oliveira-Ferreira J, Miyahira Y, Layton GT, Savage N, Esteban M, Rodriguez D, Rodriguez, JR, Nussenzweig RS, Zavala F, Miyahira Y. (2000).Immunogenicity of Ty-VLP bearing a CD8(+) T cell epitope of the CS protein of P. yoelii: enhanced memory response by boosting with recombinant vaccinia virus. Vaccine 18: 1863-1869)。この応答はＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞培養物においてＥＬＩＳＰＯＴ技術を用いて定量することができる(Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M, Rodrigues MM, Zavala F. (1995) Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54)。
ＩＢＤＶ ＣＶＬＰの免疫原性の獲得および特性決定
新規ワクチン接種戦略開発の一環として、免疫応答の誘導に関与する他のタンパク質またはペプチドに対応する異種アミノ酸配列を含むキメラＩＢＤＶ ＶＬＰ（ＣＶＬＰ）を製造する戦略が使用される可能性を解析した。研究モデルとして、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドとして、マラリアＣＳタンパク質（マウスマラリア原虫）のＣＤ８エピトープ（Ｅ−ＣＤ８）に対応するアミノ酸配列を含むＣＶＬＰを獲得する可能性に取り組んだ。Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54; Zavala, F., Rodrigues, M., Rodriguez, D., Rodriguez, J. R., Nussenzweig, R. S. and Esteban, M. (2001). A striking property of recombinant poxviruses: efficient inducers of in vivo expansion of primed CD8(+) T cells. Virology 280: 155-159)。このエピトープは、この病原体に対するＣＤ８特異的細胞性免疫応答の誘導に関与する(Oliveira-Ferreira J, Miyahira Y, Layton GT, Savage N, Esteban M, Rodriguez D, Rodriguez, JR, Nussenzweig RS, Zavala F, Miyahira Y. (2000).Immunogenicity of Ty-VLP bearing a CD8(+) T cell epitope of the CS protein of P. yoelii: enhanced memory response by boosting with recombinant vaccinia virus. Vaccine 18: 1863-1869)。この応答はＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞培養物においてＥＬＩＳＰＯＴ技術を用いて定量することができる(Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M, Rodrigues MM, Zavala F. (1995) Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54)。
このために、プラスミドｐＦＢ／ｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３（配列番号１３）の構築を後述のクローニング戦略に従って行った。マラリアＣＳタンパク質のＣＤ８エピトープのコード配列（ＳＹＶＰＳＡＥＱＩ、配列番号１３および配列番号１４の残基２９〜３７参照）を含む、ＣＤ８ Ａ（配列番号１１）およびＣＤ８ Ｂ（配列番号１２）として同定された合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって作製した３６含有部分のＤＮＡ断片を、ｐＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３ベクターに組み込まれるｈｉｓ−ＶＰ３タンパク質をコードするＯＲＦに挿入することによって、このベクターを構築した。合成オリゴヌクレオチドＣＤ８ ＡおよびＣＤ８ Ｂ（配列番号１１および配列番号１２）を、ＥｈｅＩ制限酵素で消化したプラスミドｐＦＢ／ｈｉｓ−ＶＰ３とハイブリダイズすることによって作製したＤＮＡ断片を連結することによって、クローニングを行った。このプラスミドｐＦＢ／ｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３（配列番号１３）は、ｈｉｓ−ＶＰ３タンパク質ＯＲＦのＮ末端配列に対応する末端に挿入されるＣＤ８エピトープを含む、ｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３と呼ばれる融合タンパク質をコードするＯＲＦを含む。前記プラスミドｐＦＢ／ｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
プラスミドｐＦＢ／ｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３を精製し、製造業者(Invitrogen BV,Groningen, The Netherlands)によって記載されているプロトコールに従い、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ技術によって、それを使用して、ＦＢ／ｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３と呼ばれる対応する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を作製した。
３．１ ＣＶＬＰの製造
Ｈ５細胞培養物を、組換えバキュロウイルスＦＢ／Ｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３およびＦＢ／ｐＶＰ２に同時に感染させた。ＦＢ／ｐＶＰ２ ｒＢＶ（実施例１．１参照）は、ＩＢＤＶポリタンパク質のｐＶＰ２タンパク質（Ｍｅｔ１−Ａｌａ５１２）に相当する領域を発現する。感染後（ｐｉ）４８時間の時点で細胞を回収し、該当する抽出物を、直線スクロース勾配による分画を用いるＩＢＤＶ ＶＬＰ精製プロトコールを行った(Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R., Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。得られた画分をそれぞれ、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して観察し、ＶＰ３特異的抗体を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットにより解析した。図５Ａに見られるように、勾配の画分４には、ウイルスポリタンパク質の発現によって得られるＩＢＤＶ ＶＬＰと同じ構造（多角形の輪郭、直径６５〜７０ｎｍ）を有する会合体が豊富に含まれていた。生化学的特性については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより（図５Ｂ）、これらのＣＶＬＰが抗ＶＰ３血清に対して免疫反応性を有するタンパク質を含有し、そのタンパク質の分子量（３３．５ｋＤａ）がｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３融合タンパク質（３３．５９１ｋＤａ）の分子量と同じであることが示された。これらの結果から、昆虫細胞におけるｐＶＰ２遺伝子およびｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３遺伝子の同時発現がｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３融合タンパク質を含むキメラＶＬＰ（ＣＶＬＰ）の形成をもたらすという結論を下すことができる。これらのＣＶＬＰはＣＤ８−ＣＶＬＰと呼ばれる。
Ｈ５細胞培養物を、組換えバキュロウイルスＦＢ／Ｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３およびＦＢ／ｐＶＰ２に同時に感染させた。ＦＢ／ｐＶＰ２ ｒＢＶ（実施例１．１参照）は、ＩＢＤＶポリタンパク質のｐＶＰ２タンパク質（Ｍｅｔ１−Ａｌａ５１２）に相当する領域を発現する。感染後（ｐｉ）４８時間の時点で細胞を回収し、該当する抽出物を、直線スクロース勾配による分画を用いるＩＢＤＶ ＶＬＰ精製プロトコールを行った(Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R., Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。得られた画分をそれぞれ、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して観察し、ＶＰ３特異的抗体を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットにより解析した。図５Ａに見られるように、勾配の画分４には、ウイルスポリタンパク質の発現によって得られるＩＢＤＶ ＶＬＰと同じ構造（多角形の輪郭、直径６５〜７０ｎｍ）を有する会合体が豊富に含まれていた。生化学的特性については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより（図５Ｂ）、これらのＣＶＬＰが抗ＶＰ３血清に対して免疫反応性を有するタンパク質を含有し、そのタンパク質の分子量（３３．５ｋＤａ）がｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３融合タンパク質（３３．５９１ｋＤａ）の分子量と同じであることが示された。これらの結果から、昆虫細胞におけるｐＶＰ２遺伝子およびｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３遺伝子の同時発現がｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３融合タンパク質を含むキメラＶＬＰ（ＣＶＬＰ）の形成をもたらすという結論を下すことができる。これらのＣＶＬＰはＣＤ８−ＣＶＬＰと呼ばれる。
３．２ ＣＤ８−ＣＶＬＰの免疫原性解析
ＣＤ８−ＣＶＬＰの免疫原性を決定するために、独立に製造し、精製した２バッチのＣＤ８−ＣＶＬＰを使用して、２つの同一アッセイを行った。雌８週齢ＢａｌｂＣラット３匹からなる４群（Ｉ、II、IIIおよびＩＶ）を使用した。ランダムに群にした。免疫戦略は、他の免疫原の特性決定においてこれまでに使用されたものと同様であった。この戦略は、研究対象の抗原の初回抗原投与量の使用、その後の、一次応答を増幅する、マラリアＣＳタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスＶＶｐＪＲＣＳの２回目の追加免疫投与量の使用に基づく。誘導された免疫応答を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いた、ＩＦＮ−γを産生するそれらの能力による抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出によって決定した(Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M, Rodrigues MM, Zavala F. (1995). Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54)。要するに、ニトロセルロース(Millipore)ボトムを有する９６ウェルプレートを、ＰＢＳに再懸濁した、６μｇ／ｍｌのラット抗ネズミＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｒ４−６Ａ２、Pharmingen, San Diego, CA）を含有する溶液、７５μｌ／ウェルでコーティングした。このプレートを室温にて一晩インキュベートした。続いて、ウェルをＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、最後に１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ培地とともに３７℃にて５％ＣＯ２雰囲気にて１時間インキュベートした。一方、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地で維持した免疫ラットの脾臓を６０可動メンバープレートの滅菌グリッド上に準備し、ホモジナイズし、異なるゲージ（２１Ｇ→２５Ｇ）のニードルをそれに通すことによって抽出物を破壊した。このようにして破壊した細胞を４℃にて１，５００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ培地で２回洗浄した。サンプルの赤血球を溶解するために、滅菌済みの、０．１Ｍ ＮＨ４Ｃｌ（２ｍｌ／脾臓）を加え、それを４℃にて３〜５分間維持し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳを加え、それを遠心分離した。次いで、それらを２回行い(They were twice)、それを最後に１〜２ｍｌ ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳに再懸濁した。脾細胞生存率の測定をトリパンブルー染色（水中４％、Sigma）により行った。
ＣＤ８−ＣＶＬＰの免疫原性を決定するために、独立に製造し、精製した２バッチのＣＤ８−ＣＶＬＰを使用して、２つの同一アッセイを行った。雌８週齢ＢａｌｂＣラット３匹からなる４群（Ｉ、II、IIIおよびＩＶ）を使用した。ランダムに群にした。免疫戦略は、他の免疫原の特性決定においてこれまでに使用されたものと同様であった。この戦略は、研究対象の抗原の初回抗原投与量の使用、その後の、一次応答を増幅する、マラリアＣＳタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスＶＶｐＪＲＣＳの２回目の追加免疫投与量の使用に基づく。誘導された免疫応答を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いた、ＩＦＮ−γを産生するそれらの能力による抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出によって決定した(Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M, Rodrigues MM, Zavala F. (1995). Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54)。要するに、ニトロセルロース(Millipore)ボトムを有する９６ウェルプレートを、ＰＢＳに再懸濁した、６μｇ／ｍｌのラット抗ネズミＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｒ４−６Ａ２、Pharmingen, San Diego, CA）を含有する溶液、７５μｌ／ウェルでコーティングした。このプレートを室温にて一晩インキュベートした。続いて、ウェルをＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、最後に１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ培地とともに３７℃にて５％ＣＯ２雰囲気にて１時間インキュベートした。一方、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地で維持した免疫ラットの脾臓を６０可動メンバープレートの滅菌グリッド上に準備し、ホモジナイズし、異なるゲージ（２１Ｇ→２５Ｇ）のニードルをそれに通すことによって抽出物を破壊した。このようにして破壊した細胞を４℃にて１，５００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ培地で２回洗浄した。サンプルの赤血球を溶解するために、滅菌済みの、０．１Ｍ ＮＨ４Ｃｌ（２ｍｌ／脾臓）を加え、それを４℃にて３〜５分間維持し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳを加え、それを遠心分離した。次いで、それらを２回行い(They were twice)、それを最後に１〜２ｍｌ ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳに再懸濁した。脾細胞生存率の測定をトリパンブルー染色（水中４％、Sigma）により行った。
このアッセイに使用されたプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＰ８１５であった。これらの細胞を濃度１０６細胞／ｍｌに調整し、合成ペプチドＳＹＶＰＳＡＥＱＩ（マラリアＣＳタンパク質のＣＤ８領域に相当する）１０−６Ｍとともにインキュベートした。ペプチドでの処置後、細胞を洗浄し、マイトマイシンＣ（３０μｇ／ｍｌ）(Sigma)で３７℃にて、ＣＯ２雰囲気中１５分間処理した。その後洗浄した後、３０Ｕ／ｍｌのネズミインターロイキン２（ＩＬ−２）を加えた抗原提示細胞を濃度１０５細胞／ウェルに加えた。１００μｌ／ウェルの１０６脾細胞／ｍｌならびに１／４および１／１６希釈物も加えた。プレートを３７℃にて、ＣＯ２雰囲気中１８時間インキュベートし、それらをＰＢＳＴで５回洗浄し、２μｇ／ｍｌの、ＰＢＳＴで希釈したビオチン化ラット抗ＩＦＮ−γＸＭＧ１．２モノクローナル抗体(Pharmingen)とともに室温にて２時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、１／８００アビジン−ペルオキシダーゼ希釈物を加えた（０．５ｍｇ／ｍｌ）(Sigma)。室温にて１時間インキュベートした後、それをＰＢＳＴで３回、ＰＢＳで２回洗浄し、最後に１μｇ／ｍｌのＤＡＢ基質(Sigma)を含む顕色剤混合物を加え、０．０１５％Ｈ２Ｏ２を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭに再懸濁した。プレートを多量の水で洗浄することによって、反応を終了させ、一度乾燥させ、Leica MZ122 APO 立体顕微鏡とQWIN Imaging System ソフトウェア(Leica, Cambridge, United kingdom)を用いてスポットを数えた。
以下の表に記載されている免疫プログラムに従って免疫を行った：
以下の表に記載されている免疫プログラムに従って免疫を行った：
ＶＶｐＪＲＣＳでの免疫を、腹膜内に、動物当たり(per anima)１０７プラーク形成単位（ｐｆｕ）を用いて行った。ＶＬＰ、非キメラＩＢＤＶ ＶＬＰおよびＣＤＳ−ＣＶＬＰの両方での免疫を、腹膜内に、投与量、動物当たり抗原５０μｇを用いて行った。総ての場合において、抗原調製物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。
初回免疫の２８日後、動物を犠牲にし、そこで脾臓を使用して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。これらのアッセイを上述のプロトコールに従って実施した。両方のアッセイにおいて実質的に同じ結果が得られた。図６は、第１のアッセイの結果を示す。得られた結果は、ＣＤ８−ＣＶＬＰを初回抗原投与に使用し、その後、ＶＶｐＪＲＣＳウイルスを用いて追加免疫投与を行った場合（群ＩＶ）に、マラリアＣＤ８エピトープに対して特異的な細胞性免疫応答の強い誘導が起こることを示している。この誘導は、ＶＶｐＪＲＣＳを１回投与（群Ｉ）または２回投与（群II）することによって免疫した後に得られた誘導よりもずっと強い（約２０倍強い）。ＶＶｐＪＲＣＳの単回投与を受けた群Ｉに対し、非キメラＩＢＤＶ ＶＬＰで免疫した動物（群III）では、Ｅ−ＣＤ８に対する応答の有意な誘導が起こらないという事実は、群ＩＶにおいて得られた応答が、ＣＤ８−ＣＶＬＰの不可欠な部分を形成しているｈｉｓ−ＣＤ８−ＶＰ３融合タンパク質に存在するＥ−ＣＤ８によって特異的に誘導されることを示している。
Claims (29)
- 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のキメラエンプティーキャプシドであって、
（ｉ）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質と、
（ii）目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Ｂと結合されている、ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質によって構成される領域Ａを含む融合タンパク質と
の組み立て（assembly）によって構成されることを特徴とする、キメラエンプティーキャプシド。 - 領域Ｂが、ＩＢＤＶ ＶＰ３のアミノ末端領域と結合されているか、あるいはＩＢＤＶ ＶＰ３のカルボキシ末端領域と結合されている、請求項１に記載のキャプシド。
- 目的のポリペプチドが、ワクチン接種、治療または診断において有用なポリペプチドである、請求項１に記載のキャプシド。
- 領域Ｂが、単一の目的のポリペプチドを含んでなる、請求項１に記載のキャプシド。
- 領域Ｂが、２個以上の目的のポリペプチドを含んでなる、請求項１に記載のキャプシド。
- 融合タンパク質が、単一の領域Ｂと結合された領域Ａを含んでなる、請求項１に記載のキャプシド。
- 融合タンパク質が、２個の領域Ｂと結合された領域Ａを含んでなり、その２個の領域Ｂは同一であるかまたは異なっており、それらのうちの一方のものが領域Ａに存在するＶＰ３のアミノ末端領域と結合されており、もう一方のものが領域Ａに存在するＶＰ３のカルボキシ末端領域と結合されている、請求項１に記載のキャプシド。
- 領域Ｂが、同一であるかまたは相互に異なっている２個以上の目的のポリペプチドを含む、請求項７に記載のキャプシド。
- 融合タンパク質が、領域Ａと領域Ｂとの間に位置づけられたリンカーポリペプチドをさらに含んでなる、請求項１に記載のキャプシド。
- 請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列を有する、核酸。
- （ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ３タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列と、
（ii）１個以上の目的のポリペプチドを含んでなる１個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列と
を含んでなるヌクレオチド配列を有する、核酸。 - （iii）ＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１１に記載の核酸。
- 請求項１０または１１に記載の核酸を含んでなる、遺伝子構築物。
- 請求項１２に記載の核酸を含んでなる、遺伝子構築物。
- ａ）転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに必要に応じて、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、請求項１３に記載の第１の遺伝子構築物と、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに必要に応じて、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、第２の遺伝子構築物と、を含む発現系であって、
ここで、前記第２の遺伝子構築物はＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を含んでなる、発現系、および
ｂ）転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに必要に応じて、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、請求項１４に記載の遺伝子構築物を含む発現系
から選択される、発現系。 - 必要に応じて、異種複製起点を含んでいてもよい、プラスミド、バクミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、コスミドｍまたはウイルスから選択される、請求項１５に記載の発現系。
- 請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１３もしくは１４に記載の遺伝子構築物、または請求項１５もしくは１６に記載の発現系を含む、宿主細胞。
- 請求項１５または１６に記載の発現系で、形質転換された、トランスフェクトされた、または感染された、宿主細胞。
- 哺乳類細胞、鳥類細胞、昆虫細胞および酵母から選択される、請求項１７または１８に記載の宿主細胞。
- 請求項１〜９のいずれか一項に記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のキメラエンプティーキャプシドの製造方法であって、
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、必要に応じて、前記キメラエンプティーＩＢＤＶキャプシドを回収することを含んでなる、方法。 - 前記宿主細胞が昆虫細胞であり、
ａ）発現系（Ｉ）および（II）から選択される発現系を調製する段階、
ここで、
発現系（Ｉ）は請求項１４に記載の遺伝子構築物を含む組換えバキュロウイルスによって構成され、かつ
発現系（II）はＩＢＤＶ ｐＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む第１の組換えバキュロウイルスと、請求項１３に記載の遺伝子構築物を含む第２の組換えバキュロウイルスによって構成されおり、
ｂ）段階ａ）で調製された前記発現系に、昆虫細胞を感染させる段階、
ｃ）段階ｂ）で得られた感染昆虫細胞を、組換えタンパク質およびそれらの組み立て物の発現を可能にする条件下で培養して、キメラエンプティーＩＢＤＶキャプシドを生成する段階、および
ｄ）必要に応じて、キメラエンプティーＩＢＤＶキャプシドを単離し、さらに必要に応じて、精製する段階
を含んでなる、請求項２０に記載の方法。 - 前記宿主細胞が酵母であり、
ａ）請求項１４に記載の遺伝子構築物を含むプラスミドによって構成される発現系を調製する段階、
ｂ）段階ａ）で調製された前記発現系により酵母細胞を形質転換する段階、
ｃ）段階ｂ）で得られた形質転換酵母を、組換えタンパク質およびそれらの組み立て物の発現を可能にする条件下で培養して、キメラエンプティーＩＢＤＶキャプシドを生成する段階、および
ｄ）必要に応じて、キメラエンプティーＩＢＤＶキャプシドを単離し、さらに必要に応じて、精製する段階
を含んでなる、請求項２０に記載の方法。 - 請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラエンプティーＩＢＤＶキャプシドを製造するための、請求項１５または１６に記載の遺伝子発現系の使用。
- 医薬の製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のキメラエンプティーキャプシドの使用。
- 前記医薬がワクチンである、請求項２４に記載の使用。
- 前記医薬が遺伝子治療ベクターである、請求項２４に記載の使用。
- 請求項１〜９のいずれか一項に記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のキメラエンプティーキャプシドの治療上有効な量と、必要に応じて、１種以上の医薬上許容されるアジュバントおよび／またはビヒクルとを含んでなる、ワクチン。
- 動物またはヒトを、２種類以上の感染性病原体によって引き起こされる感染から同時に防御するのに有用な、請求項２７に記載のワクチン。
- 請求項１〜９のいずれか一項に記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のキメラエンプティーキャプシドを含んでなる、遺伝子治療ベクター。
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