JP2007518415A - 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(ibdv)のキメラエンプティーキャプシド、取得方法および用途 - Google Patents
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Abstract
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のキメラエンプティーキャプシドは、(i)IBDV pVP2タンパク質と、(ii)目的のポリペプチド、例えば、ワクチン接種、治療または診断において有用なポリペプチド、を含む異種ポリペプチドによって構成される領域Bと結合されている、IBDV VP3タンパク質によって構成される領域Aを含む融合タンパク質と、の組み立てによって構成される。
Description
発明の分野
本発明は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)(infectious bursal disease virus)のキメラエンプティー粒子の製造およびそれらの用途に関する。
本発明は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)(infectious bursal disease virus)のキメラエンプティー粒子の製造およびそれらの用途に関する。
背景技術
ウイルス粒子は、核酸およびタンパク質のビヒクルへのパッケージングおよび組込みに特化した構造である。ウイルス粒子の一般的な特徴は、宿主の免疫応答の誘導に関するそれらの優れた能力である。これらの性質は、ウイルス粒子を、両方の細胞内送達系の開発や粒子ワクチンの生成に関して非常に興味深い薬剤にする。異なる遺伝子発現系を使用することにより、異なる種類のウイルスのウイルス様粒子(viral-like particles)、すなわちエンプティーウイルスキャプシド(empty viral capsides)(VLP)の製造が容易になった(米国特許第6,458,362号 Casal, et al. 2002. CTLまたはTヘルパー細胞エピトープをコードする組換えVP2パルボウイルス偽粒子(Recombinant VP2 parvoviral pseudo-particles encoding CTL or T-helper cell epitopes);米国特許第5,932,426号 Baralle, et al. 1999. 分子提示系(Molecular presenting system);米国特許第6,602,705号 Barnett, et al. 2003 HIVポリペプチドの発現およびウイルス様粒子の産生(Expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles))。これらの発現系を遺伝子操作することで、次には、天然ウイルスキャプシドを形成しているタンパク質以外のタンパク質に由来する異種アミノ酸配列を含むVLPの製造が可能になる。これらのVLPは、異型組換えVLPまたは異型キメラVLP(CVLP)(chimeric VLP)と総称されている。CVLPは、主として2つの用途:(i)免疫学的に関連した異種ペプチドを用いた多価ワクチンの生成(Kingsman, A. J., N. R. Burns, G. T. Layton, and S. E. Adams. 1995. Yeast retrotransposon particles as antigen delivery systems. Ann. N. Y. Acad. Sci. 754: 202-213; Lo-Man, R., P. Rueda, C. Sedlik, E. Deriaud, I. Casal, and C. Leclerc. 1998. A recombinant virus-like particle system derived from parvovirus as an efficient antigen carrier to elicit a polarized Th1 immune response without adjuvant. Eur. J. Immunol. 28: 1401-1407; Qiu, Z., D. Ou, H. Wu, T. C. Hobma, and S. Gillam. 1994. Expression and characterization of virus-like particles containing rubella virus structural proteins. J. Virol. 68: 4086-4091);および(ii)受容体−リガンドとの相互作用に関与するアミノ酸配列の挿入による親和性の改変(Schmidt, U., Rudolf, R, and Bomh, G. 2001. Binding of external ligands onto an engineered virus capsid. Prot. Eng. 14: 769-774; Shin, Y. C., and Folk, W. R. 2003. Formation of polyoma virus-like particles with different VP1 molecules that bind the urokinase plasminogen activator receptor. J. Virol. 77: 11491-11498)に使用されてきた。
ウイルス粒子は、核酸およびタンパク質のビヒクルへのパッケージングおよび組込みに特化した構造である。ウイルス粒子の一般的な特徴は、宿主の免疫応答の誘導に関するそれらの優れた能力である。これらの性質は、ウイルス粒子を、両方の細胞内送達系の開発や粒子ワクチンの生成に関して非常に興味深い薬剤にする。異なる遺伝子発現系を使用することにより、異なる種類のウイルスのウイルス様粒子(viral-like particles)、すなわちエンプティーウイルスキャプシド(empty viral capsides)(VLP)の製造が容易になった(米国特許第6,458,362号 Casal, et al. 2002. CTLまたはTヘルパー細胞エピトープをコードする組換えVP2パルボウイルス偽粒子(Recombinant VP2 parvoviral pseudo-particles encoding CTL or T-helper cell epitopes);米国特許第5,932,426号 Baralle, et al. 1999. 分子提示系(Molecular presenting system);米国特許第6,602,705号 Barnett, et al. 2003 HIVポリペプチドの発現およびウイルス様粒子の産生(Expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles))。これらの発現系を遺伝子操作することで、次には、天然ウイルスキャプシドを形成しているタンパク質以外のタンパク質に由来する異種アミノ酸配列を含むVLPの製造が可能になる。これらのVLPは、異型組換えVLPまたは異型キメラVLP(CVLP)(chimeric VLP)と総称されている。CVLPは、主として2つの用途:(i)免疫学的に関連した異種ペプチドを用いた多価ワクチンの生成(Kingsman, A. J., N. R. Burns, G. T. Layton, and S. E. Adams. 1995. Yeast retrotransposon particles as antigen delivery systems. Ann. N. Y. Acad. Sci. 754: 202-213; Lo-Man, R., P. Rueda, C. Sedlik, E. Deriaud, I. Casal, and C. Leclerc. 1998. A recombinant virus-like particle system derived from parvovirus as an efficient antigen carrier to elicit a polarized Th1 immune response without adjuvant. Eur. J. Immunol. 28: 1401-1407; Qiu, Z., D. Ou, H. Wu, T. C. Hobma, and S. Gillam. 1994. Expression and characterization of virus-like particles containing rubella virus structural proteins. J. Virol. 68: 4086-4091);および(ii)受容体−リガンドとの相互作用に関与するアミノ酸配列の挿入による親和性の改変(Schmidt, U., Rudolf, R, and Bomh, G. 2001. Binding of external ligands onto an engineered virus capsid. Prot. Eng. 14: 769-774; Shin, Y. C., and Folk, W. R. 2003. Formation of polyoma virus-like particles with different VP1 molecules that bind the urokinase plasminogen activator receptor. J. Virol. 77: 11491-11498)に使用されてきた。
CVLPは、一般に、目的のポリペプチドをコードする領域と融合される、ウイルスキャプシドの形成に関与するウイルスタンパク質の発現によって得られる。
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)は、ビルナウイルス科(Birnaviridae)ファミリーに属するウイルスであり、異なる鳥類種に感染し、世界的に養鶏業界に重大な経済的損失をもたらす重症免疫抑制疾患に直接関与する。
IBDV粒子は、二十面体(T=13対称)であり、それらにはエンベロープはなく、単一のタンパク質層で形成されている。今まで、IBDV粒子の原子モデルの獲得を目的としたアプローチは失敗に終わっている。結果として、利用できる構造情報は、精製したウイルスおよびそのVLPの電子低温顕微鏡検査により得られた画像から作成された三次元モデルに基づいている。これらの研究に基づき、粒子の外面が、5つの異なる構造に構成されたVP2タンパク質の三量体(37kDa)260個の連続束によって形成されていることが検証された。粒子の内面にVP3タンパク質(29kDa)の三量体200個を含み、このVP3タンパク質三量体は、互いに独立して、VP2三量体の基底領域と結合している。第3のポリペプチド、VP4(28kDa)は、二十面体構造の頂点を形成している五量体の基底部に位置する粒子の一部でもあり得ることが示唆されている。
VP2ポリペプチド、VP3ポリペプチドおよびVP4ポリペプチドは、サイズ109kDaのポリペプチド前駆体のタンパク質分解プロセシングにより生成される。この前駆体は、自己触媒的にプロセシングを受け、pVP2ポリペプチド(48kDa)、VP3ポリペプチドおよびVP4ポリペプチドを放出する。VP4ドメインは、ポリタンパク質の中心領域に位置している。このVP4ドメインはLonプロテアーゼファミリーに属し、タンパク質分解切断に関与する。pVP2ポリペプチドおよびVP3ポリペプチドは、キャプシドの組み立て(assembly)に直接関与する。pVP2産物は、そのC末端において最後の切断を受けた後、(精製した粒子で見られるものである)成熟型タンパク質、VP2となる(Da Costa, B., Chevalier, C., Henry, C., Huet, J. C., Petit, S., Lepault, J., Boot, H. & Delmas, B. (2002). The capsid of infectious bursal disease virus contains several small peptides arising from the maturation process of pVP2. Journal of Virology 76: 2393-2402)。このpVP2プロセシングは、キャプシドの正確な形成に必要である。このプロセシングにはVP3の存在を必要とするが、関与するプロテアーゼについてはまだ確認されていない(Maraver, A., Ona, A., Abaitua, F., Gonzalez, D., Clemente, R., Diaz-Ruiz, A., Caston, J. R., Pazos, F. & Rodriguez, J. F. (2003). The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology 77: 6438-49)。
一般論として、形態形成は、ポリペプチド前駆体改変に関連する連続的な段階を必要とするウイルスサイクルの重要なプロセスである。結果として、ウイルスは、それらの成分それぞれの間での連続的で正確な相互作用を可能にする方法を発達させた。二十面体ウイルスによって用いられることが多いこれらの方法の1つが、それらのウイルスの構造成分の基礎として、単一ポリタンパク質由来のポリペプチドを使用する方法である。これらの場合では、前記ポリタンパク質の適切なタンパク質分解プロセシングが組み立てプロセスにおいて極めて重要な役割を果たす。
IBDVキャプシドの組み立てに関するこの概念は、初期の研究により証明されている(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。真核細胞におけるIBDVポリタンパク質をコードする遺伝子の発現は、形態学的にも生化学的にもIBDVビリオンと完全には区別できないVLPの形成をもたらす。キャプシドの構築では、ウイルスポリタンパク質の合成と正確なプロセシングのみを必要とし、ウイルスゲノムの存在またはウイルスゲノムによってコードされる他のタンパク質(VP5およびVP1など)の存在とは無関係であることも示されている。
異なる組換え系におけるIBDV遺伝子発現によって今日までに得られた結果から、i)構築プロセスはウイルスの遺伝物質の存在とは無関係であり、ii)構築にはポリタンパク質遺伝子によってコードされるポリペプチドだけが必要であり、そしてiii)構築には、pVP2ポリペプチドとVP3ポリペプチドとの協調的な相互作用が必要であるという結論を下し得た。
しかしながら、ポリタンパク質前駆体がまだ改変を受けていない場合に、VP2/VP3相互作用が、そのポリタンパク質前駆体のVP2ドメインとVP3ドメインとの間で確立されるかどうかは分からず、反対にこの相互作用が前駆体のプロセシング後に起こるかどうかは分からないことを示さねばならない。さらに、現行の情報では、VP4がウイルスキャプシドの形態形成において関連した役割を果たす可能性が除外されていない。実際に、IBDV VP2タンパク質、VP3タンパク質およびVP4タンパク質の組み立てによって生成されるIBDV VLPについては、開示されている(米国特許第6,528,063号、同第5,788,970号および日本国特許第5194597号)。
同じ発明者らが進めた研究によって、異なる真核生物発現ベクターを使用してIBDV VLPを獲得するための系を確立することが可能になった。これらのベクターは、ウイルスVP1 RNA ポリメラーゼの不在下または存在下でのIBDVポリタンパク質発現に使用されてきた。精製したVLPの生化学的特性から、それらが、ウイルスポリタンパク質だけが発現される場合には、pVP2タンパク質、VP2タンパク質およびVP3タンパク質を含み、ポリタンパク質とウイルスRNAポリメラーゼの同時発現が行われる場合には、pVP2タンパク質、VP2タンパク質、VP3タンパク質およびVP1タンパク質を含むことが立証されている(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054; Martinez-Torrecuadrada, J. L., Caston, J. R., Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodriguez, J. P. & Casal, J. I. (2000). Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells. Virology 278: 322-331; Maraver, A., et al., (2003) 前掲; Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R. , Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。
その一方で、特許出願WO02/088339では、そのカルボキシル末端でポリペプチドと結合したIBDVポリタンパク質を含んでなるキメラタンパク質の組み立てによって生成されるIBDVウイルス様粒子について開示されている。
しかしながら、CVLP(このCVLPはIBDV pVP2およびIBDV VP3に基づくのみであり、後者のVP3タンパク質は目的のポリペプチドと融合されているか、または目的の産物のビヒクルとして有望である)については、まだ開示されていない。
本発明は、ベクターまたはビヒクルに、目的の産物(例えば、生物活性を有する分子(例えば、薬物、ポリペプチド、タンパク質、核酸など))を組み込むための新規ツールを提供する課題に向けられる。
本発明により提供される解決法は、IBDV pVP2タンパク質とIBDV VP3タンパク質の同時発現に基づいて(後者のIBDV VP3タンパク質は、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むように遺伝子を操作される)、IBDVキメラエンプティーキャプシド(CVLP)を産生することが可能であることに基づく。結果として生じるCVLPは、(i)IBDV pVP2タンパク質と、(ii)目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Bと結合されている、IBDV VP3タンパク質によって構成される領域Aを含む融合タンパク質との組み立てによって生成される(ここで、前記領域Bは前記IBDV VP3タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端と結合されている)。これらのCVLPは、治療目的、予防目的または診断目的などに、例えば、遺伝子治療ベクターまたはワクチンの製造において使用することができる。
本発明者らは、IBDV VPX(pVP2)タンパク質とIBDV VP3タンパク質が独立した遺伝子から生じる場合には、エンプティーIBDV粒子(VLP)が生成されることをこれまでに発見した。これらのVLPは、IBDVポリタンパク質に対応するORFの発現によって得られるものと構造的に同一である。新規ワクチン接種戦略の開発の一環として、目的のペプチドに対応する異種アミノ酸配列(ヒスチジンタグ(実施例1)、GFP(実施例2)、最終的には免疫応答誘導に関与するペプチド(実施例3)など)を含むCVLPを得るために、このIBDV VLP製造戦略が使用される可能性を解析した。示されるように、これらの構築物における異種配列の融合は、CVLP形成の障害にはならない。
免疫応答に関与するペプチド輸送CVLPの研究モデルとして、マラリアCSタンパク質(マウスマラリア原虫(Plasmodium yoelii))のCD8エピトープ(ECD8)に対応する配列を有するCVLPを獲得する可能性に取り組んだ。このエピトープは、この病原体に対するCD8特異的細胞性免疫応答の誘導に関与し、これはBALB/cマウス由来の脾細胞培養物においてELISPOT技術を用いて定量することができる(実施例3)。
要約すれば、得られた結果は、(i)使用する発現系が異種アミノ酸配列を含むIBDV CVLPの獲得を可能にすること、そして(ii)前記IBDV CVLPを用いた免疫により、CVLPに存在する異種アミノ酸配列に対して特異的な免疫応答が誘導されることを明白に示している。
従って、本発明の一態様は、IBDVキメラエンプティーキャプシドに関する。このIBDVキメラエンプティーキャプシドは、(i)IBDV pVP2タンパク質と、(ii)目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Bと結合されている、IBDV VP3タンパク質によって構成される領域Aを含む融合タンパク質の組み立てによって構成されることを特徴とする。
本発明のさらなる態様は、本発明によって提供される前記IBDV CVLPを製造するための方法に関する。この方法は、前記IBDV pVP2タンパク質と融合タンパク質の、2つの独立した遺伝子としての遺伝子同時発現に基づく。
前記IBDV CVLPを製造する前記方法を実行するために開発された核酸、遺伝子構築物、発現系および宿主細胞、ならびに前記IBDV CVLPの製造のためのそれらの使用も、本発明のさらなる態様である。
前記IBDV CVLPは、ベクターまたはビヒクルに、目的の産物(例えば、生物活性を有する分子(例えば、ポリペプチド、タンパク質、核酸など))を組み込む能力を有する。特定の態様では、前記IBDV CVLPは、ビヒクル内部に、(供給される)動物またはヒトにおける抗原および免疫応答誘導物質を組み込むことができ、それによって、それらをウイルス、細菌、寄生生物または他の種類の微生物によって引き起こされるヒト疾患および動物疾患に対するワクチン、あるいは腫瘍疾患に対するワクチンの製造において使用することができる。もう1つの特定の態様では、前記IBDV CVLPは、遺伝子治療ベクターの製造において使用される。
従って、さらなる態様では、本発明は、医薬(ワクチンおよび遺伝子治療ベクターなど)の製造における前記IBDV CVLPの使用に関する。前記ワクチンも前記ベクターも、本発明のさらなる態様である。
第1の態様では、本発明は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のキメラエンプティーキャプシド(以下、本発明のCVLP)を提供する。この伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のキメラエンプティーキャプシドは、(i)IBDV pVP2タンパク質と、(ii)目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Bと結合されている、IBDV VP3タンパク質によって構成される領域Aを含む融合タンパク質の組み立てによって構成されることを特徴とする。
本発明において使用される、「IBDV」とは、既知血清型(1型または2型)のいずれかに属する異なるIBDV株を指し[例として、van den Berg TP, Eterradossi N, Toquin D, Meulemans G., en Rev Sci Tech 2000 19: 509-43によって行われた検討を参照]、「IBDV pVP2タンパク質」および「IBDV VP3タンパク質」とは、Sanchez and Rodriguez (1999) (Sanchez AB, Rodriguez JF. Proteolytic processing in infectious bursal disease virus: identification of the polyprotein cleavage sites by site-directed mutagenesis. Virology. 1999 Sep 15; 262 (1): 190-199)によってなされた定義に従う、記載されたIBDV株総てのものを代表する異なる形態のpVP2タンパク質およびVP3タンパク質[NCBI タンパク質データバンク]、ならびに前記IBDV pVP2タンパク質および前記IBDV VP3タンパク質と実質的に相同であるタンパク質、すなわち、そのタンパク質のアミノ酸配列が前記IBDV pVP2タンパク質および前記IBDV VP3タンパク質に関し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有するタンパク質を指す。
本発明のCVLPに存在するIBDV pVP2タンパク質は、任意のIBDV株を代表するいずれのpVP2タンパク質(例えば、IBDV Soroa株の全長pVP2タンパク質[NCBI、受託番号AAD30136])であってもよい。
本発明のCVLPに存在する融合タンパク質は、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Bと結合されている、IBDV VP3タンパク質によって構成される領域Aを含む。特定の態様では、前記領域Bは前記IBDV VP3のアミノ末端領域と結合されているか、あるいはIBDV VP3のカルボキシ末端領域と結合されている。
前記融合タンパク質の領域Aを構成しているIBDV VP3タンパク質は、任意のIBDV株を代表するいずれのVP3タンパク質(例えば、IBDV Soroa株の全長VP3タンパク質[NCBI、受託番号AAD30136])であってもよい。
前記融合タンパク質に存在する領域Bは、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成されている。本発明において使用される、「異種ポリペプチド」とは、天然IBDVキャプシドには属していないポリペプチドを指す。目的のポリペプチドのサイズは、数個のアミノ酸から数百個のアミノ酸までの広い範囲で変動し得る。前記目的のポリペプチドは、その起源(真核生物起源、原核生物起源、ウイルス起源など)には関係なく、実質的には組換えによる発現を受け入れやすいいずれのポリペプチドでもあってもよい。しかしながら、特定の態様では、前記目的のポリペプチドは、ワクチン接種、治療または診断において有用なポリペプチド(動物およびヒトにおいて、ウイルス、細菌、寄生生物または他の種類の微生物によって引き起こされる疾患に対する免疫応答、あるいは腫瘍疾患に対する免疫応答を誘導し得るエピトープまたは決定抗原など)である。
特定の態様では、前記領域Bは単一の目的のポリペプチドを含んでなる。しかしながら、もう1つの特定の態様では、前記領域Bは2個以上の目的のポリペプチドを含んでなり、それらの目的のポリペプチドは同一であるかまたは異なっており、それらはタンデムを形成している場合がある。
特定の態様では、前記融合タンパク質は単一の領域Bと結合された領域Aを含んでなる。この場合、前記領域Bは、領域Aに存在するVP3のアミノ末端領域と結合されているか、あるいは領域Aに存在するVP3のカルボキシ末端領域と結合されている。先に述べたように、領域Bは1個以上の目的のポリペプチドを含み得る。特定の態様では、前記領域Bは単一の目的のポリペプチドを含み、一方、もう1つの特定の態様では、前記領域Bは異なる2個以上の目的のポリペプチドを含んでなる。
もう1つの特定の態様では、前記融合タンパク質は2個の領域Bと結合された領域Aを含んでなり、その2個の領域Bの一方のものは領域Aに存在するVP3のアミノ末端領域と結合されており、もう一方のものは領域Aに存在するVP3のカルボキシ末端領域と結合されている。前記領域Bは同一であるかまたは異なっており、それらはそれぞれ、同一であるかまたは相互に異なっている1個以上の目的のポリペプチドを含み得る。特定の態様では、融合タンパク質は、第1の目的のポリペプチド(B1)を含む第1の領域Bおよび第2の目的のポリペプチド(B2)を含む第2の領域Bと結合された領域Aを含んでなる。前記目的のポリペプチド(B1)および(B2)は同一であるかまたは異なっている。特定の態様では、前記目的のポリペプチド(B1)および(B2)は相互に異なっている。
一般に、領域A(IBDV VP3タンパク質によって構成される)は、前記領域B(目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される)と、直接ではなく、むしろ前記領域Aおよび前記領域B間のリンカーポリペプチドを通じて結合される。従って、必要に応じて、本発明の融合タンパク質は、前記領域Aと前記領域Bとの間に位置づけられたリンカーポリペプチドをさらに含み得る。有利には、前記リンカーポリペプチドは、構造的柔軟性を有するペプチド、好ましくは免疫応答を誘導し得るまたはし得ない非構造化ドメインをもたらすポリペプチドである。例として、前記フレキシブルペプチドは、アミノ酸残基(特に、GlyおよびSer残基)の繰り返しまたはアミノ酸残基の他の好適な繰り返しを含み得る。
本発明のCVLPは、前記IBDV pVP2タンパク質と、前記領域Aおよび前記領域Bを含んでなる前記融合タンパク質を好適な宿主細胞において同時発現させることによって得ることができる。前記好適な宿主細胞は、単一の遺伝子構築物または2個の遺伝子構築物のいずれかとして、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質のコーディングヌクレオチド配列とIBDV pVP2タンパク質のコーディングヌクレオチド配列を含む細胞である。特定の態様では、前記好適な宿主細胞は、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とIBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含んでなる発現系などの好適な発現系、あるいは領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第1の遺伝子構築物とIBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第2の遺伝子構築物を含んでなる発現系で形質転換される、トランスフェクトされる、または感染される細胞である。
従って、もう1つの態様では、本発明は核酸を提供する。この核酸のヌクレオチド配列は、本発明のCVLPの一部を形成する、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Bと結合されている、IBDV VP3タンパク質によって構成される領域Aを含む前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる(ここで、前記領域Bは前記IBDV VP3タンパク質のアミノ末端領域と結合されているか、または前記IBDV VP3タンパク質のカルボキシ末端領域と結合されている)。場合によっては、本発明によって提供される核酸は、必要に応じて、IBDV pVP2をコードするヌクレオチド配列を含み得る。さらに詳しく言えば、特定の態様では、本発明によって提供される核酸配列は、(i)IBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含むヌクレオチド配列と、(ii)1個以上の目的のポリペプチドを含んでなる1個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含むヌクレオチド配列、さらに場合によっては、必要に応じて、(iii)IBDV pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる。
もう1つの特定の態様では、本発明によって提供される核酸配列は、(i)IBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含むヌクレオチド配列と、(ii)1個以上の目的のポリペプチドを含んでなる1個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含む第1のヌクレオチド配列と、(ii')1個以上の目的のポリペプチドを含んでなる1個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む第2のヌクレオチド配列(ここで、前記ヌクレオチド配列は、各第1のヌクレオチド配列と同一であるかまたは異なっている)、さらに場合によっては、必要に応じて、(iii)IBDV pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる。この場合、前記第1のヌクレオチド配列または前記第2のヌクレオチド配列のうちの一方がIBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列の5’末端に作動可能なように連結され、もう一方がIBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列の3’末端に作動可能なように連結されている。
本説明において「pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレーム」または「IBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレーム」とは、前記オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列のほかに、IBDV pVP2タンパク質およびIBDV VP3タンパク質のそのコードフレームに類似した他のオープンリーディングフレームも含む。同様に、「1個以上のポリペプチドを含んでなる1個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレーム」とは、1個以上の目的のポリペプチドを含んでなる前記異種ポリペプチドのいずれのコードヌクレオチド配列も含む。本明細書において「類似した」とは、IBDV pVP2およびIBDV VP3のコードヌクレオチド配列に基づいて、単離され得るか、または、例えば、保存的または非保存的ヌクレオチド置換(1個以上のヌクレオチドの挿入、分子の末端への1個以上のヌクレオチドの付加または配列末端もしくは配列内での1個以上のヌクレオチドの欠失を含む)を導入することによって構築され得るいずれのヌクレオチド配列も含むことを意図している。一般に、別のヌクレオチド配列と類似したあるヌクレオチド配列は、前記別のヌクレオチド配列と実質的に相同である。本説明において使用される意味では、「実質的に相同の」とは、ヌクレオチドレベルにおいて、当該ヌクレオチド配列が少なくとも60%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、そしてさらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有することを意味する。
もう1つの態様では、本発明は、遺伝子構築物を提供する。この遺伝子構築物は、本発明によって提供される核酸、すなわち、そのヌクレオチド配列が領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、場合によっては、前記IBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含んでなる。さらに詳しく言えば、特定の態様では、本発明によって提供される遺伝子構築物は、(i)IBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、(ii)1個以上の目的のポリペプチドを含んでなる1個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列、さらに場合によっては、必要に応じて、(iii)IBDV pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列を含む。もう1つの特定の態様では、本発明によって提供される遺伝子構築物は、(i)IBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、(ii)1個以上の目的のポリペプチドを含んでなる1個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む第1のヌクレオチド配列と、(ii')1個以上の目的のポリペプチドを含んでなる1個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含む第2のヌクレオチド配列(ここで、前記第2のヌクレオチド配列は、前記第1のヌクレオチド配列と同一であるかまたは異なっている)、さらに場合によっては、必要に応じて、(iii)IBDV pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列を含む。この場合、前記第1のヌクレオチド配列または前記第2のヌクレオチド配列のうちの一方がIBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列の5’末端に作動可能なように連結され、もう一方がIBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列の3’末端に作動可能なように連結されている。
もう1つの態様では、本発明は、発現ベクターまたは系を提供する。この発現ベクターまたは系は、
a)転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む発現系(ここで、前記遺伝子構築物は領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、IBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる)、および
b)転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、本発明によって提供される第1の遺伝子構築物(ここで、前記第1の構築物は、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる)と、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、IBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる第2の遺伝子構築物を含む発現系
から選択される。
a)転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む発現系(ここで、前記遺伝子構築物は領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、IBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる)、および
b)転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、本発明によって提供される第1の遺伝子構築物(ここで、前記第1の構築物は、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる)と、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、IBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる第2の遺伝子構築物を含む発現系
から選択される。
特定の態様では、本発明によって提供される発現系は、(i)IBDV VP3に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、(ii)1個以上の目的のポリペプチドを含んでなる1個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、(iii)IBDV pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子構築物(ここで、前記遺伝子構築物は、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい)を含む。
もう1つの特定の態様では、本発明によって提供される発現系は、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい第1の遺伝子構築物(前記第1の遺伝子構築物は、(i)IBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、(ii)1個以上の目的のポリペプチドを含んでなる1個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる)と、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい第2の遺伝子構築物(前記第2の遺伝子構築物はIBDV pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる)を含む。
本発明によって提供される発現系に存在する転写制御エレメント、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントとしては、目的のヌクレオチド配列(pVP2、VP3および異種ポリペプチド)に作動可能なように連結され、その目的のヌクレオチド配列の転写を命令するプロモーター、ならびに転写およびその転写の時間と場所の適切な調節に必要であるか、または好適である他の配列(例えば、開始シグナルおよび終止シグナル、切断部位、ポリアデニル化シグナル、複製起点、転写アクチベーター(エンハンサー)、転写サイレンサー(サイレンサー)など)が挙げられる。
実質的には、いかなる好適な発現系またはベクターも、本発明によって提供される発現系の作製に使用することができる。例として、前記好適な発現系またはベクター系は、それぞれの具体的なケースについての条件および必要性に従って、プラスミド、バクミド、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、バクテリオファージP1由来人工染色体(PAC)、コスミドまたはウイルス(異種複製起点(例えば、細菌または酵母において増幅し得るように、細菌または酵母の複製起点)、ならびに目的の遺伝子または遺伝子群とは異なるトランスフェクト細胞を選択するのに使用することができるマーカーをさらに有し得る)から選択することができる。これらの発現系またはベクターは、当業者に公知の従来の方法によって得ることができ[Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory]、本発明に含まれる。特定の態様では、前記発現系またはベクター系は、プラスミド(酵母の形質転換に好適なプラスミド(例えば、pESCURA/pVP2−VP3−GFPと呼ばれるプラスミド(実施例2))など)またはウイルス(組換えバキュロウイルス(rBV)(例えば、複製サイクル中に昆虫細胞において両方のタンパク質(IBDV pVP2およびhis−VP3)を同時に発現するFBD/pVP2−his−VP3と呼ばれるrBV(実施例1.2)、もしくは昆虫細胞を同時感染させたときにIBDV pVP2およびhis−VP3タンパク質それぞれを発現し、6ヒスチジン(6his)異種ポリペプチドを有するIBDV CVLPを得るFB/pVP2およびFB/his−VP3と呼ばれるrBV(実施例1.1)、もしくは昆虫細胞を同時感染させたときにIBDV pVP2タンパク質およびhis−CD8−VP3それぞれを発現し、CD8−CVLPと呼ばれるキャプシドを形成するFB/pVP2およびFB/his−CD8−VP3と呼ばれるrBV(実施例3))など)である。
もう1つの態様では、本発明は、宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、単一の遺伝子構築物または2個の異なる遺伝子構築物のいずれかとして、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質のコードヌクレオチド配列とIBDV pVP2タンパク質のコードヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、前記宿主細胞は、(i)前記IBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、IBDV pVP2タンパク質のコードヌクレオチド配列を含んでなる単独の遺伝子構築物を含む、本発明によって提供される発現系で、あるいは、(ii)領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる第1の構築物と、前記IBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる第2の遺伝子構築物とを含む発現系で形質転換される、トランスフェクトされる、または感染される宿主細胞である。
特定の態様では、本発明によって提供される宿主細胞は、(i)IBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、(ii)目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、(iii)IBDV pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子構築物を含む発現系(ここで、前記遺伝子構築物は転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい)で形質転換される、トランスフェクトされる、または感染される宿主細胞である。
もう1つの特定の態様では、本発明によって提供される宿主細胞は、(a)転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい第1の遺伝子構築物(前記第1の遺伝子構築物は、(i)IBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列と、(ii)目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる)で、および(b)転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに場合によっては、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい第2の遺伝子構築物(前記第2の遺伝子構築物は、IBDV pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレームまたはコード領域を含むヌクレオチド配列を含んでなる)で形質転換される、トランスフェクトされる、または感染される宿主細胞である。
実質的には、本発明によって提供される発現系での形質転換、トランスフェクションまたは感染を受け入れやすいいかなる宿主細胞も使用することができる(例えば、哺乳類細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母など)。しかしながら、特定の態様では、前記宿主細胞は酵母および昆虫細胞から選択される。容易さと製造コストから酵母が好適である。発現系が1種または2種の組換えバキュロウイルス(rBV)を含む場合には、昆虫細胞が好適である。バキュロウイルスの宿主域に関する生物学的研究における安全性の問題から、昆虫細胞以外の細胞種では複製することができないrBVを使用することが好都合である。
特定の態様では、本発明は宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とIBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む発現系(プラスミドまたは発現ベクターなど)で形質転換された宿主細胞(例えば、酵母(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)など))である。
もう1つの特定の態様では、本発明は宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とIBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む発現系(組換えバキュロウイルスなど)に感染された宿主細胞(例えば、昆虫細胞)である。
もう1つの特定の態様では、本発明は宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む第1の組換えバキュロウイルスを含む発現系と、IBDV pVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、本発明によって提供される遺伝子構築物を含む第2の組換えバキュロウイルスに同時感染された宿主細胞(例えば、昆虫細胞)である。
もう1つの態様では、本発明は、本発明のCVLPの製造のための方法を提供する。この方法は、単一の遺伝子構築物または2個の異なる遺伝子構築物のいずれかとして、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質のコードヌクレオチド配列とIBDV pVP2のコードヌクレオチド配列を含む、本発明によって提供される宿主細胞を培養することおよび前記IBDV pVP2タンパク質と領域AおよびBを含んでなる融合タンパク質を同時発現させること、さらに、必要に応じて、前記本発明のCVLPを回収することを含む。特定の態様では、本発明によって提供される前記宿主細胞は、好適な発現系(領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とIBDV pVP2をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含んでなる発現系など)で、あるいは、領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第1の遺伝子構築物とIBDV pVP2をコードするヌクレオチド配列を含む第2の遺伝子構築物を含んでなる発現系で形質転換される、トランスフェクトされる、または感染される細胞である。
前記方法は、従って、前記IBDV pVP2タンパク質と領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質を、2つの独立した遺伝子として、遺伝子を同時発現させることを含む。前記タンパク質(IBDV pVP2と領域Aおよび領域Bを含んでなる融合タンパク質)の前記細胞における同時発現後、発現タンパク質が構成され、本発明のCVLPを生成する。このCVLPは培地から単離するか、または回収することができ、さらに必要に応じて精製することができる。前記本発明のCVLPの単離および精製は、従来の方法により(例えば、スクロース勾配による分画により)行うことができる。
特定の態様では、IBDV pVP2タンパク質と領域Aおよび領域Bを含んでなる融合タンパク質の同時に起こる遺伝子同時発現は、昆虫細胞における2つの独立したキメラ遺伝子からの前記タンパク質の同時発現を可能にするrBVを使用することによって行われる。この場合、本発明によって提供される本発明のCVLPの製造のための方法は、第一に、IBDV pVP2タンパク質と領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質を同時にコードする遺伝子構築物を含むrBV(FBD/pVP2−his−VP3と呼ばれるrBV(実施例1.2)など)によって構成される遺伝子発現系の獲得、あるいは、IBDV pVP2タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む1つのrBVの獲得と領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質をコードする遺伝子構築物を含むもう1つのrBVの獲得(FB/pVP2およびFB/his−VP3と呼ばれるrBV(実施例1.1)またはFB/pPV2およびFB/his−CD8−VP3と呼ばれるrBV(実施例3)など)それぞれの獲得に続いて、前記組換えバキュロウイルスに基づく前記発現系での昆虫細胞の感染、組換えタンパク質の発現、さらに必要に応じて、前記IBDV pVP2タンパク質と領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質の組み立てによって生成された本発明のCVLPの単離、さらに場合によっては、前記本発明のCVLPのその後の精製を含む。
IBDV pVP2タンパク質と領域Aおよび領域Bを含んでなる融合タンパク質の独立した発現を可能にする組換えバキュロウイルスの構築は、当業者ならば本明細書において記載されているようなことやこのテクノロジーに関する技術水準に基づいて行うことができる(Cold Spring Harbor, N. Y.; Leusch MS, Lee SC, Olins PO. 1995. A novel host-vector system for direct selection of recombinant baculoviruses (bacmids) in Escherichia coli. Gene 160: 191-4; Luckow VA, Lee SC, Barry GF, Olins PO. 1993. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol 67: 4566-79)。
もう1つの特定の態様では、IBDV pVP2タンパク質と領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質の遺伝子同時発現は、酵母細胞における前記タンパク質の発現を可能にするベクターを使用することによって行われる。この場合、本発明によって提供される本発明のCVLPの製造のための方法は、第一に、IBDV pVP2タンパク質と領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質を同時にコードする遺伝子構築物を含むプラスミドによって構成される遺伝子発現系の獲得、その獲得に続いて、前記発現系での酵母の形質転換、組換えタンパク質の発現、さらに必要に応じて、前記IBDV pVP2タンパク質と領域Aおよび領域Bを含んでなる前記融合タンパク質の組み立てによって生成された本発明のCVLPの単離、さらに場合によっては、前記本発明のCVLPのその後の精製を含む。特定の態様では、酵母の形質転換に好適な発現系は、例えば、IBDV pVP2およびVP3−GFPタンパク質をコードする遺伝子構築物を含むプラスミドpESCURA/pVP2/VP3−GFP(実施例2)のようなpESC酵母(Stratagene)発現系に基づくものである。
遺伝子構築物またはIBDV pVP2タンパク質と領域Aおよび領域Bを含んでなる融合タンパク質の同時発現を可能にする好適な発現系もしくはベクターで形質転換された酵母の獲得は、当業者ならば本明細書において記載されているようなことやこのテクノロジーに関する技術水準に基づいて行うことができる(pESC epitope tagging vectors Instructions manual. Stratagene www.stratasene.com; Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory)。
もう1つの態様では、本発明は、本発明のCVLPを製造し、獲得するための、本発明によって提供される遺伝子発現系の使用に関する。
本発明のCVLPは、目的の産物(例えば、生物活性を有する分子(例えば、薬物、ポリペプチド、タンパク質、核酸など))のベクターまたはビヒクルとして使用することができるため、CVLPは治療目的もしくは診断目的または研究目的に使用することができる。特定の態様では、生物学的に関心の高い前記分子としては、目的のポリペプチド、例えば、(供給される)動物またはヒトにおける抗原もしくは免疫応答誘導物質、または遺伝子療法において有用な、好適な細胞内に導入することを目的とする核酸配列を包含する。
従って、もう1つの態様では、本発明は、医薬(例えば、ワクチン、遺伝子治療ベクター(送達系)など)の製造における本発明のCVLPの使用に関する。特定の態様では、前記医薬は、ウイルス、細菌、寄生生物または他の種類の微生物によって引き起こされるヒト疾患または動物疾患に対する防御、あるいは腫瘍疾患に対する防御を与えることを目的とするワクチンである。もう1つの特定の態様では、前記医薬は遺伝子治療ベクターである。
もう1つの態様では、本発明は、本発明のCVLPの治療上有効な量と、場合によっては、1種以上の医薬上許容されるアジュバントおよび/またはビヒクルを含んでなるワクチンを提供する。前記ワクチンは、動物およびヒトを、微生物(ウイルス、細菌、寄生生物など)によって引き起こされる疾患、あるいは腫瘍疾患から防御するのに有用である。特定の態様では、前記ワクチンは、動物またはヒトを、2種類以上の感染性病原体によって引き起こされる感染から同時に防御するのに特に有用である。例として、本発明によって提供されるワクチンは、鳥類(例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、キジ、ウズラ、ダチョウなど)を、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)や鳥類疾患に関与する1種類以上の感染性病原体(鳥類病原体)から防御するために使用することができる。
本説明において使用される意味では、「治療上有効な量」とは、所望の効果をもたらすための算出された本発明のCVLPの量を指し、この量は、一般に、とりわけ、CVLPの性質と達成すべき免疫効果によって決定される。
前記ワクチンに使用することができる医薬上許容されるアジュバントおよびビヒクルは、当業者には公知であり、ワクチンの製造において通常使用されるアジュバントおよびビヒクルである。
特定の態様では、前記ワクチンは、医薬上許容される希釈液(例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または他の任意の医薬上許容される希釈液)中水溶液または懸濁液の形態で調製される。
本発明によって提供されるワクチンは、使用される異種配列またはエピトープに対する防御免疫応答を引き起こす任意の好適な投与経路により投与することができ、そのため、前記ワクチンは、選択される投与経路に適した投与形に製剤される。特定の態様では、本発明によって提供されるワクチンの投与は、非経口的(例えば、腹膜内、皮下など)に行われる。
以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1
昆虫細胞におけるIBDV CVLPの獲得
1.1 昆虫細胞における、2つの独立したrBVを用いたIBDV CVLP、VP2−his−VP3の獲得
2つの独立したキメラ遺伝子からのIBDV pVP2タンパク質およびIBDV VP3タンパク質と異種ポリペプチドの同時発現によりIBDV CVLPを獲得する可能性を解析するように設計された一連の試験の結果を、本実施例において記載する。そこで、上述の2つの組換えバキュロウイルス(rBV)、FB/his−VP3(Kochan, G., Gonzalez, D. & Rodriguez, J. F. (2003). Characterization of the RNA binding activity of VP3, a major structural protein of IBDV. Archives of Virology 148, 723-744)とFB/VPX(本明細書ではFB/pVP2として記載)(Martinez-Torrecuadrada, J. L., Caston, J. R., Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodriguez, J. F. & Casal, J. I. (2000). Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells. Virology 278: 322-331)を使用した。これらのrBVは、IBDV pVP2タンパク質およびIBDV pVP3タンパク質の相補DNA(cDNA)エンコーダーを好適なベクターにクローニングすることによって作製した。前記cDNAは、血清型I型IBDV Soroa株ゲノムa(NCBI受託番号AAD30136)のAセグメントからRT−PCRによって得た。rBV FB/his−VP3は、そのN末端においてhis−VP3と呼ばれる、VP3配列(ポリタンパク質のMet754−Glu1012)と融合されたタンデム型6ヒスチジンを含むキメラVP3タンパク質を発現する。rBV FB/pVP2は、pVP2タンパク質(Met1−Ala512)のコード領域を発現する。
昆虫細胞におけるIBDV CVLPの獲得
1.1 昆虫細胞における、2つの独立したrBVを用いたIBDV CVLP、VP2−his−VP3の獲得
2つの独立したキメラ遺伝子からのIBDV pVP2タンパク質およびIBDV VP3タンパク質と異種ポリペプチドの同時発現によりIBDV CVLPを獲得する可能性を解析するように設計された一連の試験の結果を、本実施例において記載する。そこで、上述の2つの組換えバキュロウイルス(rBV)、FB/his−VP3(Kochan, G., Gonzalez, D. & Rodriguez, J. F. (2003). Characterization of the RNA binding activity of VP3, a major structural protein of IBDV. Archives of Virology 148, 723-744)とFB/VPX(本明細書ではFB/pVP2として記載)(Martinez-Torrecuadrada, J. L., Caston, J. R., Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodriguez, J. F. & Casal, J. I. (2000). Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells. Virology 278: 322-331)を使用した。これらのrBVは、IBDV pVP2タンパク質およびIBDV pVP3タンパク質の相補DNA(cDNA)エンコーダーを好適なベクターにクローニングすることによって作製した。前記cDNAは、血清型I型IBDV Soroa株ゲノムa(NCBI受託番号AAD30136)のAセグメントからRT−PCRによって得た。rBV FB/his−VP3は、そのN末端においてhis−VP3と呼ばれる、VP3配列(ポリタンパク質のMet754−Glu1012)と融合されたタンデム型6ヒスチジンを含むキメラVP3タンパク質を発現する。rBV FB/pVP2は、pVP2タンパク質(Met1−Ala512)のコード領域を発現する。
これらのpVP2タンパク質およびhis−pVP3タンパク質の発現の解析は、独立試験、同時試験に関係なく、細胞培養物において実施した。これらの試験を実施するために、昆虫Trichloplusia ni(H5、Invitrogen)の単層細胞培養物を使用し、それをカバーガラス上で増殖させた。前記培養物を独立にFB/pVP2に感染させ、FB/his−VP3に感染させるか、または両方のrBVに同時感染させた。その多重感染度は5pfu/細胞であった。感染後の経過時間(h.p.i.)48時間の時点でそれらの細胞を固定し、ウサギ抗VP2ポリクローナル血清とともにインキュベートし、ラット抗VP3ポリクローナル血清とともにインキュベートした(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。連続洗浄後、カバーガラスをAlexa 594と結合したヤギ抗ラット血清およびAlexa 488と結合したヤギ抗ウサギ血清とともにインキュベートした(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.)。細胞核を特定のTo−Pro−3マーカー(Molecular Probes, Inc.)で染色した。最後にそれらのサンプルを、Bio Rad Radiance 2100共焦点系を装備したZeiss Axiovert 200顕微鏡を使用してエピ蛍光により観察した。Laser Sharp Package (Bio Rad)ソフトウェア装置を使用して得られた画像を保存した。図2aに示されるように、FB/pVP2に感染させた培養物では、抗VP2血清が、管状構造物の混じった細粒シグナルを示し、その両方が細胞質全体に分布した。rBV FB/his−VP3に感染させた細胞で検出される抗VP3シグナルは、核周囲の球状で明らかに中空の蓄積物の存在によって確認された。両方のrBVに同時感染させた培養物では、両方のタンパク質の分布パターンからの著しい変化が検出された。これらの細胞では、pVP2およびVP3特有のシグナルが球形で高密度の蓄積物として一所に存在していた。このことはそれらの同時発現がpVP2/his−VP3複合体の形成を可能にしたことを示唆する(図2c〜2e)。
これらの構造をさらに詳細に特性決定するために、FB/pVP2+FB/hisVP3に感染させた細胞に対応する同様の抽出物を透過型電子顕微鏡(TEM)により解析した。対照として、並行して、野生株のFBD(FastBacDual, Invitrogen)ウイルスに感染させたH5細胞培養物を同じ方法により解析した。感染させた後、48時間後に細胞を回収し、透過型電子顕微鏡による超薄切片でのそれらの解析についてこれまでに記載されているように処理した(Fernandez-Arias, A, Risco, C, Martinez, S, Albar, JP & Rodriguez JF. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。図2に示されるように、同時感染細胞の細胞質は、管状構造物とキャプシドに類似した構造物の混合物によって形成された組み立て物を含む(図2g、図2hおよび図2i)。野生株FBDウイルスに感染させた細胞に相当するサンプルでは、いずれの場合においてもこれらの会合体は観察されなかった(図2f)。管状構造物ならびにキャプシドに類似した構造物の概観およびサイズは、VT7/Poly(IBDVポリタンパク質の遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体)に感染させた細胞培養物においてこれまでに記載されているものと同様であった(Fernandez-Arias, A, Risco C, Martinez, S, Albar JP & Rodriguez JF. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。
pVP2およびhis−VP3の同時発現が会合を可能にし、その結果として、CVLPの獲得を可能にすることを明白に確立するために、生成された粒子を精製することを決定した。そこで、H5細胞培養物をFB/pVP2+FB/his−VP3に感染させた。これまでに記載されているように、h.p.i.60時間の時点で、細胞をホモジナイズし、抽出物をスクロース勾配により分離した(Lombardo E, Maraver, A, Caston, JR, Rivera J, Fernandez-Arias A, Serrano A, Carrascosa JL & Rodriguez JF. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。これまでに記載されているように、それらを遠心分離した後、勾配を分画し、異なる画分をTEMにより解析した(Lombardo, E, Maraver A, Caston JR, Rivera J, Fernandez-Arias A, Serrano A, Carrascosa JL & Rodriguez JF. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。対照として、同じ方法に従った、rBV FB/VPXに感染させた細胞抽出物またはrBV FBD/Poly−VP1に感染させた細胞抽出物に相当する勾配を分画した。組換えウイルスFBD/Poly−VP1はVP1ポリペプチドおよびポリタンパク質を同時に発現する。予測されるように、FBD/Poly−VP1での感染では、VLPの効率的な製造がもたらされた(Maraver A, Ona A, Abaitua F, Gonzalez D, Clemente R, Diaz-Ruiz A, Caston JR, Pazos F & Rodriguez JF. (2003). The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology 77: 6438-49)。もう一方で、FB/VPX単独に感染させた細胞に相当する画分はねじれた外観の管状構造物を含む。FB/pVP2+FB/his−VP3 rBVに同時感染させた細胞に相当する勾配は、勾配の最下層に近い画分に硬質のI型管状構造物、中間画分と上部画分にCVLPを含む(図3b)。RBV FB/pVP2+FB/his−VP3に同時感染させた細胞から単離されたCVLPは、直径65〜70nmを有し、FBD/Poly−VP1に感染させた培養物の精製VLPと完全には区別できない典型的な多角形の輪郭を有していた(Maraver, A., Ona, A., Abaitua, F., Gonzalez, D., Clemente, R., Diaz-Ruiz, A., Caston, J. R., Pazos, F. & Rodriguez, J. F. (2003). The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology 77: 6438-49)またはVT7/Polyに感染させた培養物の精製VLP(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。
得られた材料の生化学的特性を決定するために、ウエスタンブロット試験を実施した。この試験では、VP1タンパク質、pVP2タンパク質、VP3タンパク質およびVP4タンパク質に対して特異的な血清を用いて、異なる画分を比較した(Fernandez-Arias et al. 1998, 前掲; Lombardo et al., 2000)。IBDVに感染させた細胞抽出物を対照として使用した。得られた結果を図3dに示す。予測されるように、VP1ポリペプチドおよびVP4ポリペプチドに相当するバンドは、FBD/Poly−VP1に感染させた細胞に相当するサンプルにおいてのみ検出された。FBD/Poly−VP1に感染させた細胞に相当するサンプルまたはFB/VPX+FB/his−VP3に同時感染させた細胞に相当するサンプルにおけるpVP2/VP3に相当するパターンは類似しており、pVP2およびVP3それぞれに相当する2つのバンドが検出された。
1.2 昆虫細胞における、単一のrBVを用いたIBDV CVLP、pVP2−his−VP3の獲得
さらに、プラスミドpFBD/pVP2−his−VP3の構築を行った。構築の第1の段階を、pVP2タンパク質コード領域をpFBDualベクター(Invitrogen)にクローニングすることによって行った。pVP2に対応するDNA断片を、プラスミドpVOTE.2/Polyを鋳型に、オリゴI(配列番号1)およびオリゴII(配列番号2)と同定されたオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。その断片を精製し、BglII酵素およびHindIII酵素で消化を行い、予めBamHI酵素およびHindi酵素で消化しておいたpFBDualベクター(Invitrogen)にクローニングした。得られたプラスミドをpFBD/pVP2と呼んだ。次いで、VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むDNA断片を、プラスミドpFB/his−VP3(Kochan et al., 2003, 前掲)をRsrII酵素での消化し、クレノウにより処理し、その後、KpnIで制限処理することによって得た。このDNA断片を精製し、予めSmaI酵素およびKpnI酵素で消化しておいたプラスミドpFBD/pVP2にクローニングした。得られたプラスミドをpFBD/pVP2−his−VP3(配列番号3)と呼んだ。このプラスミドは、pVP2タンパク質のコードヌクレオチド配列と、異種his6配列を含むhis−pVP3融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を含む(後者は、配列番号3のヌクレオチド6734〜7585の相補鎖によってコードされる)。前記プラスミドpFBD/pVP2−his−VP3に含まれるヌクレオチド配列によってコードされる、pVP2タンパク質とhis−VP3融合タンパク質(pVP2−his−VP3)のアミノ酸配列を配列番号4に示す。
さらに、プラスミドpFBD/pVP2−his−VP3の構築を行った。構築の第1の段階を、pVP2タンパク質コード領域をpFBDualベクター(Invitrogen)にクローニングすることによって行った。pVP2に対応するDNA断片を、プラスミドpVOTE.2/Polyを鋳型に、オリゴI(配列番号1)およびオリゴII(配列番号2)と同定されたオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。その断片を精製し、BglII酵素およびHindIII酵素で消化を行い、予めBamHI酵素およびHindi酵素で消化しておいたpFBDualベクター(Invitrogen)にクローニングした。得られたプラスミドをpFBD/pVP2と呼んだ。次いで、VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むDNA断片を、プラスミドpFB/his−VP3(Kochan et al., 2003, 前掲)をRsrII酵素での消化し、クレノウにより処理し、その後、KpnIで制限処理することによって得た。このDNA断片を精製し、予めSmaI酵素およびKpnI酵素で消化しておいたプラスミドpFBD/pVP2にクローニングした。得られたプラスミドをpFBD/pVP2−his−VP3(配列番号3)と呼んだ。このプラスミドは、pVP2タンパク質のコードヌクレオチド配列と、異種his6配列を含むhis−pVP3融合タンパク質のコードヌクレオチド配列を含む(後者は、配列番号3のヌクレオチド6734〜7585の相補鎖によってコードされる)。前記プラスミドpFBD/pVP2−his−VP3に含まれるヌクレオチド配列によってコードされる、pVP2タンパク質とhis−VP3融合タンパク質(pVP2−his−VP3)のアミノ酸配列を配列番号4に示す。
プラスミドpFBD/pVP2−his−VP3は、その複製サイクル中に両方のタンパク質を同時に発現するFBD/pVP2−his−VP3と呼ばれるrBVの獲得を可能にする[http://invitrogen.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf]。
昆虫細胞においてFBD/pVP2−his−VP3を用いて得られた結果は、FB/pVP2 rBVおよびFD/his−VP3 rBVでの同時感染によって得られた結果と同一であり、異種6ヒスチジン(6his)ポリペプチドを有するIBDV CVLPが得られる。
実施例2
酵母におけるIBDV CVLP、pVP2−VP3−GFPの獲得
酵母培養物(サッカロミセス・セレビシエ)においてIBDV CVLPを獲得する可能性を研究するために、ベクターpESCURA/pVP2−VP3−GFPを、VP3N末端と結合された異種GFP遺伝子を用いて作製した。ベクター構築の第1の段階を、pVP2タンパク質コード領域をベクターpESCURAinvにクローニングすることによって行った。プラスミドpESCURAinvを、ベクターpRS426(Stratagene)をPvuII酵素で消化し、消化混合物を再連結することによって作製した。得られたベクター、pESCURAinvは、親ベクターpRS426とは逆位置に多重クローニング領域を含む。pVP2タンパク質に対応するDNA断片を、プラスミドpVOTE.2/Polyを鋳型に、オリゴIII(配列番号5)およびオリゴIV(配列番号6)と呼ばれるオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。その断片を精製し、BglII酵素およびHindIII酵素で消化を行い、予めBamHI酵素およびHindIII酵素で消化しておいたベクターpESCURA.invにクローニングした。得られたプラスミドをpESCURA/pVP2と呼んだ。
酵母におけるIBDV CVLP、pVP2−VP3−GFPの獲得
酵母培養物(サッカロミセス・セレビシエ)においてIBDV CVLPを獲得する可能性を研究するために、ベクターpESCURA/pVP2−VP3−GFPを、VP3N末端と結合された異種GFP遺伝子を用いて作製した。ベクター構築の第1の段階を、pVP2タンパク質コード領域をベクターpESCURAinvにクローニングすることによって行った。プラスミドpESCURAinvを、ベクターpRS426(Stratagene)をPvuII酵素で消化し、消化混合物を再連結することによって作製した。得られたベクター、pESCURAinvは、親ベクターpRS426とは逆位置に多重クローニング領域を含む。pVP2タンパク質に対応するDNA断片を、プラスミドpVOTE.2/Polyを鋳型に、オリゴIII(配列番号5)およびオリゴIV(配列番号6)と呼ばれるオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって得た(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。その断片を精製し、BglII酵素およびHindIII酵素で消化を行い、予めBamHI酵素およびHindIII酵素で消化しておいたベクターpESCURA.invにクローニングした。得られたプラスミドをpESCURA/pVP2と呼んだ。
プラスミドpFB/VP3−GFPを2段階で構築した。第1の段階は、PCRによって作製された、終止コドンのないVP3タンパク質のORFを含む、DNA断片のクローニングであった。このPCRは、プラスミドpVOTE.2/Polyを鋳型に、オリゴV(配列番号9)およびオリゴVI(配列番号10)と呼ばれるオリゴヌクレオチドを用いて実施した(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054)。得られたDNAをEcoRI酵素およびBamHI酵素で消化し、同様に同じ酵素で消化しておいたベクターpEGFP−N3(Clontech)にクローニングした。得られたプラスミドをpVP3−GFPと呼んだ。次いで、そのプラスミドpEGFP−GFPをEcoRI酵素およびNotI酵素で消化し、ベクターpFastBacl(Invitrogen)にクローニングした。得られたプラスミドをpFB/VP3−GFPと呼んだ。
次に、EGFPタンパク質コード領域と融合されたVP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むDNA断片を、プラスミドpFB/VP3−GFPをEcoRI酵素およびNotI酵素で消化することによって得た。このDNA断片を精製し、予めEcoRI酵素およびNotI酵素で消化しておいたプラスミドpESCURA/pVP2にクローニングした。得られたプラスミドをpESCURA/pVP2−VP3−GFP(配列番号7)と呼んだ。このプラスミドは、2つの独立したプロモーター、GAL1およびGAL10(いずれもガラクトースによって誘導される)の転写制御下でpVP2タンパク質のORFおよびVP3−GFPタンパク質のORFを含む(pVP2タンパク質は、配列番号7のヌクレオチド5862〜7343と相補的であるヌクレオチド鎖によってコードされる)。前記プラスミドpESCURA/pVP2−VP3−GFPに含まれるヌクレオチド配列によってコードされる、pVP2タンパク質とVP3−GFP融合タンパク質(pVP2−VP3−GFP)のアミノ酸配列を配列番号8に示す。
続いて、pESCURA/pVP2−VP3−GFPを使用して、これまでに記載されているプロトコールに従って、S.セレビシエ酵母ハプロイド株499の培養物を形質転換した(Gietz, R. D. and R. A. Woods. (2002), Transformation of yeast by the Liac/SS carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96)。プラスミドで形質転換した酵母を、アミノ酸、トリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを添加した、ウラシルを含まない(−Ura)SC培地プレート(CSM+YNB、2%グルコースおよびバクトアガー(bacto agar))で増殖させることによって選抜した。30℃にて48時間インキュベートした後、コロニーを選抜した。このコロニーを使用して、以下のタンパク質発現およびCVLP形成についての解析を行った。
pVP2タンパク質およびVP3タンパク質発現、ならびにCVLP形成についての解析を、他の発現系におけるIBDV VLPの特性決定についてこれまでに記載されているプロトコールに従って行った(Fernandez-Arias, A., Risco, C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodriguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054; Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R., Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。選抜したコロニーを2%ラフィノースを添加した液体CSM(−Ura)+YNB培地で培養した。この培養物を30℃にて24時間インキュベートした。この培養物を用いて、2%誘導物質(ガラクトース)を添加したCSM(−Ura)+YNB培地200mlのフラスコに光学濃度(O.D.)0.2にて接種した。培養物を30℃にて18時間維持した(O.D.1.0〜2.0間まで)。酵母を3,000放射力にて4℃にて5分遠心分離し、蒸留水で1回洗浄し、ペレットを溶解バッファー(TEN:Tris 10mM、pH8.0;NaCl 150mM;EDTA 1mM)+2×プロテアーゼ阻害剤(Compl Roche)に再懸濁した。溶解用に、サイズ約425〜600ミクロンの多量のガラスビーズ(Sigma)を加えた。この混合物を、4℃にて30秒間、30秒間隔で4回、強いボルテックス攪拌を行った。この後、溶解混合物を13,000rpmにて4℃にて15分間遠心分離することによって、可溶性画分を回収した。このサンプルを、これまでに記載されているプロトコールに従ってスクロース勾配による分画を行った(Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R., Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。分画後に得られたサンプル、ならびに出発物質サンプルを、抗pVP2血清および抗VP3血清を使用したドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)[Current Protocols in Molecular Biology]およびウエスタンブロットによる免疫検出(図4A)[Current Protocols in Molecular Biology]によって解析した。図4Aに示されるように、ウエスタンブロットでは、pVP2タンパク質(48kDa)およびVP3−GFP(61kDa)タンパク質に対応する推定分子量を有するバンドの存在だけでなく、最初のサンプルにおいても勾配の異なる画分においても、タンパク質分解によっておそらく生じるであろう、より小さいサイズの他の免疫反応性バンドも示した。これらの結果は、プラスミドpESCURA/pVP2VP3で形質転換したS.セレビシエ培養物における両方のポリペプチドの正確な発現を正確に示した。次いで、これまでに記載されているように、勾配の異なる画分をTEMによって解析した(Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R., Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。図4Bに示されるように、勾配の画分のTEM解析では、勾配の上部画分においてIBDV CVLPの存在を示した。これらのCVLPは直径65〜70nmを有し、他の発現系において得られるIBDV CVLPと区別できない多角形の輪郭を有する(図4C)。
実施例3
IBDV CVLPの免疫原性の獲得および特性決定
新規ワクチン接種戦略開発の一環として、免疫応答の誘導に関与する他のタンパク質またはペプチドに対応する異種アミノ酸配列を含むキメラIBDV VLP(CVLP)を製造する戦略が使用される可能性を解析した。研究モデルとして、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドとして、マラリアCSタンパク質(マウスマラリア原虫)のCD8エピトープ(E−CD8)に対応するアミノ酸配列を含むCVLPを獲得する可能性に取り組んだ。Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54; Zavala, F., Rodrigues, M., Rodriguez, D., Rodriguez, J. R., Nussenzweig, R. S. and Esteban, M. (2001). A striking property of recombinant poxviruses: efficient inducers of in vivo expansion of primed CD8(+) T cells. Virology 280: 155-159)。このエピトープは、この病原体に対するCD8特異的細胞性免疫応答の誘導に関与する(Oliveira-Ferreira J, Miyahira Y, Layton GT, Savage N, Esteban M, Rodriguez D, Rodriguez, JR, Nussenzweig RS, Zavala F, Miyahira Y. (2000).Immunogenicity of Ty-VLP bearing a CD8(+) T cell epitope of the CS protein of P. yoelii: enhanced memory response by boosting with recombinant vaccinia virus. Vaccine 18: 1863-1869)。この応答はBALB/cマウス由来の脾細胞培養物においてELISPOT技術を用いて定量することができる(Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M, Rodrigues MM, Zavala F. (1995) Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54)。
IBDV CVLPの免疫原性の獲得および特性決定
新規ワクチン接種戦略開発の一環として、免疫応答の誘導に関与する他のタンパク質またはペプチドに対応する異種アミノ酸配列を含むキメラIBDV VLP(CVLP)を製造する戦略が使用される可能性を解析した。研究モデルとして、目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドとして、マラリアCSタンパク質(マウスマラリア原虫)のCD8エピトープ(E−CD8)に対応するアミノ酸配列を含むCVLPを獲得する可能性に取り組んだ。Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54; Zavala, F., Rodrigues, M., Rodriguez, D., Rodriguez, J. R., Nussenzweig, R. S. and Esteban, M. (2001). A striking property of recombinant poxviruses: efficient inducers of in vivo expansion of primed CD8(+) T cells. Virology 280: 155-159)。このエピトープは、この病原体に対するCD8特異的細胞性免疫応答の誘導に関与する(Oliveira-Ferreira J, Miyahira Y, Layton GT, Savage N, Esteban M, Rodriguez D, Rodriguez, JR, Nussenzweig RS, Zavala F, Miyahira Y. (2000).Immunogenicity of Ty-VLP bearing a CD8(+) T cell epitope of the CS protein of P. yoelii: enhanced memory response by boosting with recombinant vaccinia virus. Vaccine 18: 1863-1869)。この応答はBALB/cマウス由来の脾細胞培養物においてELISPOT技術を用いて定量することができる(Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M, Rodrigues MM, Zavala F. (1995) Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54)。
このために、プラスミドpFB/his−CD8−VP3(配列番号13)の構築を後述のクローニング戦略に従って行った。マラリアCSタンパク質のCD8エピトープのコード配列(SYVPSAEQI、配列番号13および配列番号14の残基29〜37参照)を含む、CD8 A(配列番号11)およびCD8 B(配列番号12)として同定された合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって作製した36含有部分のDNA断片を、pFB/his−VP3ベクターに組み込まれるhis−VP3タンパク質をコードするORFに挿入することによって、このベクターを構築した。合成オリゴヌクレオチドCD8 AおよびCD8 B(配列番号11および配列番号12)を、EheI制限酵素で消化したプラスミドpFB/his−VP3とハイブリダイズすることによって作製したDNA断片を連結することによって、クローニングを行った。このプラスミドpFB/his−CD8−VP3(配列番号13)は、his−VP3タンパク質ORFのN末端配列に対応する末端に挿入されるCD8エピトープを含む、his−CD8−VP3と呼ばれる融合タンパク質をコードするORFを含む。前記プラスミドpFB/his−CD8−VP3に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるhis−CD8−VP3融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号14に示す。
プラスミドpFB/his−CD8−VP3を精製し、製造業者(Invitrogen BV,Groningen, The Netherlands)によって記載されているプロトコールに従い、Bac−to−Bac技術によって、それを使用して、FB/his−CD8−VP3と呼ばれる対応する組換えバキュロウイルス(rBV)を作製した。
3.1 CVLPの製造
H5細胞培養物を、組換えバキュロウイルスFB/His−CD8−VP3およびFB/pVP2に同時に感染させた。FB/pVP2 rBV(実施例1.1参照)は、IBDVポリタンパク質のpVP2タンパク質(Met1−Ala512)に相当する領域を発現する。感染後(pi)48時間の時点で細胞を回収し、該当する抽出物を、直線スクロース勾配による分画を用いるIBDV VLP精製プロトコールを行った(Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R., Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。得られた画分をそれぞれ、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して観察し、VP3特異的抗体を使用したSDS−PAGEおよび免疫ブロットにより解析した。図5Aに見られるように、勾配の画分4には、ウイルスポリタンパク質の発現によって得られるIBDV VLPと同じ構造(多角形の輪郭、直径65〜70nm)を有する会合体が豊富に含まれていた。生化学的特性については、SDS−PAGEおよびウエスタンブロットにより(図5B)、これらのCVLPが抗VP3血清に対して免疫反応性を有するタンパク質を含有し、そのタンパク質の分子量(33.5kDa)がhis−CD8−VP3融合タンパク質(33.591kDa)の分子量と同じであることが示された。これらの結果から、昆虫細胞におけるpVP2遺伝子およびhis−CD8−VP3遺伝子の同時発現がhis−CD8−VP3融合タンパク質を含むキメラVLP(CVLP)の形成をもたらすという結論を下すことができる。これらのCVLPはCD8−CVLPと呼ばれる。
H5細胞培養物を、組換えバキュロウイルスFB/His−CD8−VP3およびFB/pVP2に同時に感染させた。FB/pVP2 rBV(実施例1.1参照)は、IBDVポリタンパク質のpVP2タンパク質(Met1−Ala512)に相当する領域を発現する。感染後(pi)48時間の時点で細胞を回収し、該当する抽出物を、直線スクロース勾配による分画を用いるIBDV VLP精製プロトコールを行った(Lombardo, E., Maraver, A., Caston, J. R., Rivera, J., Fernandez-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodriguez, J. F. (1999). VP1, the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983)。得られた画分をそれぞれ、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して観察し、VP3特異的抗体を使用したSDS−PAGEおよび免疫ブロットにより解析した。図5Aに見られるように、勾配の画分4には、ウイルスポリタンパク質の発現によって得られるIBDV VLPと同じ構造(多角形の輪郭、直径65〜70nm)を有する会合体が豊富に含まれていた。生化学的特性については、SDS−PAGEおよびウエスタンブロットにより(図5B)、これらのCVLPが抗VP3血清に対して免疫反応性を有するタンパク質を含有し、そのタンパク質の分子量(33.5kDa)がhis−CD8−VP3融合タンパク質(33.591kDa)の分子量と同じであることが示された。これらの結果から、昆虫細胞におけるpVP2遺伝子およびhis−CD8−VP3遺伝子の同時発現がhis−CD8−VP3融合タンパク質を含むキメラVLP(CVLP)の形成をもたらすという結論を下すことができる。これらのCVLPはCD8−CVLPと呼ばれる。
3.2 CD8−CVLPの免疫原性解析
CD8−CVLPの免疫原性を決定するために、独立に製造し、精製した2バッチのCD8−CVLPを使用して、2つの同一アッセイを行った。雌8週齢BalbCラット3匹からなる4群(I、II、IIIおよびIV)を使用した。ランダムに群にした。免疫戦略は、他の免疫原の特性決定においてこれまでに使用されたものと同様であった。この戦略は、研究対象の抗原の初回抗原投与量の使用、その後の、一次応答を増幅する、マラリアCSタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスVVpJRCSの2回目の追加免疫投与量の使用に基づく。誘導された免疫応答を、ELISPOTアッセイを用いた、IFN−γを産生するそれらの能力による抗原特異的CD8+T細胞の検出によって決定した(Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M, Rodrigues MM, Zavala F. (1995). Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54)。要するに、ニトロセルロース(Millipore)ボトムを有する96ウェルプレートを、PBSに再懸濁した、6μg/mlのラット抗ネズミIFN−γモノクローナル抗体(R4−6A2、Pharmingen, San Diego, CA)を含有する溶液、75μl/ウェルでコーティングした。このプレートを室温にて一晩インキュベートした。続いて、ウェルをRPMI培地で3回洗浄し、最後に10%ウシ胎児血清(FCS)を添加したRPMI培地とともに37℃にて5%CO2雰囲気にて1時間インキュベートした。一方、10%FCS添加RPMI培地で維持した免疫ラットの脾臓を60可動メンバープレートの滅菌グリッド上に準備し、ホモジナイズし、異なるゲージ(21G→25G)のニードルをそれに通すことによって抽出物を破壊した。このようにして破壊した細胞を4℃にて1,500rpmにて5分間遠心分離し、RPMI+10%FCS培地で2回洗浄した。サンプルの赤血球を溶解するために、滅菌済みの、0.1M NH4Cl(2ml/脾臓)を加え、それを4℃にて3〜5分間維持し、RPMI+10%FCSを加え、それを遠心分離した。次いで、それらを2回行い(They were twice)、それを最後に1〜2ml RPMI+10%FCSに再懸濁した。脾細胞生存率の測定をトリパンブルー染色(水中4%、Sigma)により行った。
CD8−CVLPの免疫原性を決定するために、独立に製造し、精製した2バッチのCD8−CVLPを使用して、2つの同一アッセイを行った。雌8週齢BalbCラット3匹からなる4群(I、II、IIIおよびIV)を使用した。ランダムに群にした。免疫戦略は、他の免疫原の特性決定においてこれまでに使用されたものと同様であった。この戦略は、研究対象の抗原の初回抗原投与量の使用、その後の、一次応答を増幅する、マラリアCSタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスVVpJRCSの2回目の追加免疫投与量の使用に基づく。誘導された免疫応答を、ELISPOTアッセイを用いた、IFN−γを産生するそれらの能力による抗原特異的CD8+T細胞の検出によって決定した(Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M, Rodrigues MM, Zavala F. (1995). Quantification of antigen specific CD8+ T cell using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54)。要するに、ニトロセルロース(Millipore)ボトムを有する96ウェルプレートを、PBSに再懸濁した、6μg/mlのラット抗ネズミIFN−γモノクローナル抗体(R4−6A2、Pharmingen, San Diego, CA)を含有する溶液、75μl/ウェルでコーティングした。このプレートを室温にて一晩インキュベートした。続いて、ウェルをRPMI培地で3回洗浄し、最後に10%ウシ胎児血清(FCS)を添加したRPMI培地とともに37℃にて5%CO2雰囲気にて1時間インキュベートした。一方、10%FCS添加RPMI培地で維持した免疫ラットの脾臓を60可動メンバープレートの滅菌グリッド上に準備し、ホモジナイズし、異なるゲージ(21G→25G)のニードルをそれに通すことによって抽出物を破壊した。このようにして破壊した細胞を4℃にて1,500rpmにて5分間遠心分離し、RPMI+10%FCS培地で2回洗浄した。サンプルの赤血球を溶解するために、滅菌済みの、0.1M NH4Cl(2ml/脾臓)を加え、それを4℃にて3〜5分間維持し、RPMI+10%FCSを加え、それを遠心分離した。次いで、それらを2回行い(They were twice)、それを最後に1〜2ml RPMI+10%FCSに再懸濁した。脾細胞生存率の測定をトリパンブルー染色(水中4%、Sigma)により行った。
このアッセイに使用されたプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)はP815であった。これらの細胞を濃度106細胞/mlに調整し、合成ペプチドSYVPSAEQI(マラリアCSタンパク質のCD8領域に相当する)10−6Mとともにインキュベートした。ペプチドでの処置後、細胞を洗浄し、マイトマイシンC(30μg/ml)(Sigma)で37℃にて、CO2雰囲気中15分間処理した。その後洗浄した後、30U/mlのネズミインターロイキン2(IL−2)を加えた抗原提示細胞を濃度105細胞/ウェルに加えた。100μl/ウェルの106脾細胞/mlならびに1/4および1/16希釈物も加えた。プレートを37℃にて、CO2雰囲気中18時間インキュベートし、それらをPBSTで5回洗浄し、2μg/mlの、PBSTで希釈したビオチン化ラット抗IFN−γXMG1.2モノクローナル抗体(Pharmingen)とともに室温にて2時間インキュベートした。その後、プレートをPBSTで5回洗浄し、1/800アビジン−ペルオキシダーゼ希釈物を加えた(0.5mg/ml)(Sigma)。室温にて1時間インキュベートした後、それをPBSTで3回、PBSで2回洗浄し、最後に1μg/mlのDAB基質(Sigma)を含む顕色剤混合物を加え、0.015%H2O2を含有するTris−HCl、pH7.5、50mMに再懸濁した。プレートを多量の水で洗浄することによって、反応を終了させ、一度乾燥させ、Leica MZ122 APO 立体顕微鏡とQWIN Imaging System ソフトウェア(Leica, Cambridge, United kingdom)を用いてスポットを数えた。
以下の表に記載されている免疫プログラムに従って免疫を行った:
以下の表に記載されている免疫プログラムに従って免疫を行った:
VVpJRCSでの免疫を、腹膜内に、動物当たり(per anima)107プラーク形成単位(pfu)を用いて行った。VLP、非キメラIBDV VLPおよびCDS−CVLPの両方での免疫を、腹膜内に、投与量、動物当たり抗原50μgを用いて行った。総ての場合において、抗原調製物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した。
初回免疫の28日後、動物を犠牲にし、そこで脾臓を使用して、ELISPOTアッセイを実施した。これらのアッセイを上述のプロトコールに従って実施した。両方のアッセイにおいて実質的に同じ結果が得られた。図6は、第1のアッセイの結果を示す。得られた結果は、CD8−CVLPを初回抗原投与に使用し、その後、VVpJRCSウイルスを用いて追加免疫投与を行った場合(群IV)に、マラリアCD8エピトープに対して特異的な細胞性免疫応答の強い誘導が起こることを示している。この誘導は、VVpJRCSを1回投与(群I)または2回投与(群II)することによって免疫した後に得られた誘導よりもずっと強い(約20倍強い)。VVpJRCSの単回投与を受けた群Iに対し、非キメラIBDV VLPで免疫した動物(群III)では、E−CD8に対する応答の有意な誘導が起こらないという事実は、群IVにおいて得られた応答が、CD8−CVLPの不可欠な部分を形成しているhis−CD8−VP3融合タンパク質に存在するE−CD8によって特異的に誘導されることを示している。
Claims (29)
- 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のキメラエンプティーキャプシドであって、
(i)IBDV pVP2タンパク質と、
(ii)目的のポリペプチドを含む異種ポリペプチドによって構成される領域Bと結合されている、IBDV VP3タンパク質によって構成される領域Aを含む融合タンパク質と
の組み立て(assembly)によって構成されることを特徴とする、キメラエンプティーキャプシド。 - 領域Bが、IBDV VP3のアミノ末端領域と結合されているか、あるいはIBDV VP3のカルボキシ末端領域と結合されている、請求項1に記載のキャプシド。
- 目的のポリペプチドが、ワクチン接種、治療または診断において有用なポリペプチドである、請求項1に記載のキャプシド。
- 領域Bが、単一の目的のポリペプチドを含んでなる、請求項1に記載のキャプシド。
- 領域Bが、2個以上の目的のポリペプチドを含んでなる、請求項1に記載のキャプシド。
- 融合タンパク質が、単一の領域Bと結合された領域Aを含んでなる、請求項1に記載のキャプシド。
- 融合タンパク質が、2個の領域Bと結合された領域Aを含んでなり、その2個の領域Bは同一であるかまたは異なっており、それらのうちの一方のものが領域Aに存在するVP3のアミノ末端領域と結合されており、もう一方のものが領域Aに存在するVP3のカルボキシ末端領域と結合されている、請求項1に記載のキャプシド。
- 領域Bが、同一であるかまたは相互に異なっている2個以上の目的のポリペプチドを含む、請求項7に記載のキャプシド。
- 融合タンパク質が、領域Aと領域Bとの間に位置づけられたリンカーポリペプチドをさらに含んでなる、請求項1に記載のキャプシド。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列を有する、核酸。
- (i)IBDV VP3タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列と、
(ii)1個以上の目的のポリペプチドを含んでなる1個以上の異種ポリペプチドのオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列と
を含んでなるヌクレオチド配列を有する、核酸。 - (iii)IBDV pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項11に記載の核酸。
- 請求項10または11に記載の核酸を含んでなる、遺伝子構築物。
- 請求項12に記載の核酸を含んでなる、遺伝子構築物。
- a)転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに必要に応じて、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、請求項13に記載の第1の遺伝子構築物と、転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに必要に応じて、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、第2の遺伝子構築物と、を含む発現系であって、
ここで、前記第2の遺伝子構築物はIBDV pVP2タンパク質に対応するオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を含んでなる、発現系、および
b)転写制御エレメントに作動可能なように連結され、さらに必要に応じて、翻訳制御エレメントに作動可能なように連結されていてもよい、請求項14に記載の遺伝子構築物を含む発現系
から選択される、発現系。 - 必要に応じて、異種複製起点を含んでいてもよい、プラスミド、バクミド、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、バクテリオファージP1由来人工染色体(PAC)、コスミドmまたはウイルスから選択される、請求項15に記載の発現系。
- 請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸、または請求項13もしくは14に記載の遺伝子構築物、または請求項15もしくは16に記載の発現系を含む、宿主細胞。
- 請求項15または16に記載の発現系で、形質転換された、トランスフェクトされた、または感染された、宿主細胞。
- 哺乳類細胞、鳥類細胞、昆虫細胞および酵母から選択される、請求項17または18に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のキメラエンプティーキャプシドの製造方法であって、
請求項17〜19のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、必要に応じて、前記キメラエンプティーIBDVキャプシドを回収することを含んでなる、方法。 - 前記宿主細胞が昆虫細胞であり、
a)発現系(I)および(II)から選択される発現系を調製する段階、
ここで、
発現系(I)は請求項14に記載の遺伝子構築物を含む組換えバキュロウイルスによって構成され、かつ
発現系(II)はIBDV pVP2タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む第1の組換えバキュロウイルスと、請求項13に記載の遺伝子構築物を含む第2の組換えバキュロウイルスによって構成されおり、
b)段階a)で調製された前記発現系に、昆虫細胞を感染させる段階、
c)段階b)で得られた感染昆虫細胞を、組換えタンパク質およびそれらの組み立て物の発現を可能にする条件下で培養して、キメラエンプティーIBDVキャプシドを生成する段階、および
d)必要に応じて、キメラエンプティーIBDVキャプシドを単離し、さらに必要に応じて、精製する段階
を含んでなる、請求項20に記載の方法。 - 前記宿主細胞が酵母であり、
a)請求項14に記載の遺伝子構築物を含むプラスミドによって構成される発現系を調製する段階、
b)段階a)で調製された前記発現系により酵母細胞を形質転換する段階、
c)段階b)で得られた形質転換酵母を、組換えタンパク質およびそれらの組み立て物の発現を可能にする条件下で培養して、キメラエンプティーIBDVキャプシドを生成する段階、および
d)必要に応じて、キメラエンプティーIBDVキャプシドを単離し、さらに必要に応じて、精製する段階
を含んでなる、請求項20に記載の方法。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載のキメラエンプティーIBDVキャプシドを製造するための、請求項15または16に記載の遺伝子発現系の使用。
- 医薬の製造における、請求項1〜9のいずれか一項に記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のキメラエンプティーキャプシドの使用。
- 前記医薬がワクチンである、請求項24に記載の使用。
- 前記医薬が遺伝子治療ベクターである、請求項24に記載の使用。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のキメラエンプティーキャプシドの治療上有効な量と、必要に応じて、1種以上の医薬上許容されるアジュバントおよび/またはビヒクルとを含んでなる、ワクチン。
- 動物またはヒトを、2種類以上の感染性病原体によって引き起こされる感染から同時に防御するのに有用な、請求項27に記載のワクチン。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のキメラエンプティーキャプシドを含んでなる、遺伝子治療ベクター。
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