JPH01157379A - 麻疹ウィルス属の構造蛋白質（ｈａ、ｆおよび／またはｎｐ）の一つまたは二つ以上をコードするウィルスベクターおよび組換えｄｎａ、感染細胞培養物、それより得られた蛋白質、ワクチンおよび抗体 - Google Patents
麻疹ウィルス属の構造蛋白質（ｈａ、ｆおよび／またはｎｐ）の一つまたは二つ以上をコードするウィルスベクターおよび組換えｄｎａ、感染細胞培養物、それより得られた蛋白質、ワクチンおよび抗体Info
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- JPH01157379A JPH01157379A JP63170755A JP17075588A JPH01157379A JP H01157379 A JPH01157379 A JP H01157379A JP 63170755 A JP63170755 A JP 63170755A JP 17075588 A JP17075588 A JP 17075588A JP H01157379 A JPH01157379 A JP H01157379A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
- C12N2760/18422—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
麻疹ウィルスは、種々の症状（結膜炎、せきおよび発疹
）により特徴付けられる極めて感染性の強いヒトの一疾
患の原因となる。ＣＮＳ （中枢神経系）障害も起るこ
とがあり、これは脳炎またはより頻繁には亜急性硬化性
全脳炎をひき起す。これら種々の形態の疾患は、伝統的
方法に従っての弱毒化麻疹ウィルスの接種によって避け
ることができる。現今使用されているワクチンは、麻疹
症例数ならびにこのウィルスによる死亡例または合併症
例の数を劇的に減少させうるため、大抵は満足すべきも
のであるが、麻疹予防の改善を必要とする問題点がいく
つか残っている。第一の難点は、現在使用されているワ
クチンか弱毒化された生きたウィルスで構成されている
ことと関連しており、かかるウィルスの投与は、殺した
微生物をベースとするワクチンよりもより多くの問題を
提起する。
）により特徴付けられる極めて感染性の強いヒトの一疾
患の原因となる。ＣＮＳ （中枢神経系）障害も起るこ
とがあり、これは脳炎またはより頻繁には亜急性硬化性
全脳炎をひき起す。これら種々の形態の疾患は、伝統的
方法に従っての弱毒化麻疹ウィルスの接種によって避け
ることができる。現今使用されているワクチンは、麻疹
症例数ならびにこのウィルスによる死亡例または合併症
例の数を劇的に減少させうるため、大抵は満足すべきも
のであるが、麻疹予防の改善を必要とする問題点がいく
つか残っている。第一の難点は、現在使用されているワ
クチンか弱毒化された生きたウィルスで構成されている
ことと関連しており、かかるウィルスの投与は、殺した
微生物をベースとするワクチンよりもより多くの問題を
提起する。
死菌ワクチンを完全なものとぜんとする今日までの努力
は全て不成功に終ってきた。他方、現在使用されている
ワクチンは、ウィルスの物理化学的性質のために熱に対
して比較的敏感で、そのため、熱帯諸国での使用が困難
である。現在、麻疹は、熱帯的気候を持つ多くの国での
小児の死亡の主要な原因の一つである。
は全て不成功に終ってきた。他方、現在使用されている
ワクチンは、ウィルスの物理化学的性質のために熱に対
して比較的敏感で、そのため、熱帯諸国での使用が困難
である。現在、麻疹は、熱帯的気候を持つ多くの国での
小児の死亡の主要な原因の一つである。
麻疹ウィルスに関する以前の研究（ノルビー（Ｎｏｒｒ
ｂｙ ） 、１９８５年）および同じ科に属する他のウ
ィルスについてなしうる類推から、ウィルス粒子の表面
蛋白質、すなわち血球凝集蛋白質（ＨＡ）および融合蛋
白質（Ｆ）が防御免疫の誘発に十分であると考えられる
。
ｂｙ ） 、１９８５年）および同じ科に属する他のウ
ィルスについてなしうる類推から、ウィルス粒子の表面
蛋白質、すなわち血球凝集蛋白質（ＨＡ）および融合蛋
白質（Ｆ）が防御免疫の誘発に十分であると考えられる
。
さらに、麻疹ウィルスの表面蛋白質と他の麻疹ウィルス
属の蛋白質との間の免疫学的関係（参考資料５，１，４
，８．９）ならびにこれらの蛋白質のい（つかをコード
するＤＮＡの間の配列上の相同関係（参考資料１０）か
ら、麻疹ウィルスの抗原を用いて、カレ（Ｃａｒｒｅ）
病、牛疫および小反物動物ペストに対する予防接種を行
うことを考えることができる。また、麻疹ウィルス属の
各々に由来する表面抗原を同種または異種Ｙ防接種糸で
使用することを予見することも可能である。
属の蛋白質との間の免疫学的関係（参考資料５，１，４
，８．９）ならびにこれらの蛋白質のい（つかをコード
するＤＮＡの間の配列上の相同関係（参考資料１０）か
ら、麻疹ウィルスの抗原を用いて、カレ（Ｃａｒｒｅ）
病、牛疫および小反物動物ペストに対する予防接種を行
うことを考えることができる。また、麻疹ウィルス属の
各々に由来する表面抗原を同種または異種Ｙ防接種糸で
使用することを予見することも可能である。
他方、いくつかの研究によって、異なるウィルスの内部
蛋白質が細胞性免疫の誘発にとって重要であることが示
されている。麻疹ウィルス属に対するワクチンを完全な
ものとするためには、従って、組換えウィルスに核蛋白
質（ＮＰ）をコードする遺伝子を導入することが重要で
ありうる。
蛋白質が細胞性免疫の誘発にとって重要であることが示
されている。麻疹ウィルス属に対するワクチンを完全な
ものとするためには、従って、組換えウィルスに核蛋白
質（ＮＰ）をコードする遺伝子を導入することが重要で
ありうる。
発明の詳細な説明
それゆえに、本発明は、ゲノムの一つまたはいくつかの
必須でない部分に、麻疹ウィルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉ
ｖｉｒｕｓ）の少なくとも一つの表面蛋白質の全体また
は一部をコードする少なくとも一つのＤＮＡならびにこ
の蛋白質の発現を保証する諸要素を含むことを特徴とす
る組換えポックスウィルス（Ｐ ｏｘｖｉ ｒｕｓ ）
に関するものである。
必須でない部分に、麻疹ウィルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉ
ｖｉｒｕｓ）の少なくとも一つの表面蛋白質の全体また
は一部をコードする少なくとも一つのＤＮＡならびにこ
の蛋白質の発現を保証する諸要素を含むことを特徴とす
る組換えポックスウィルス（Ｐ ｏｘｖｉ ｒｕｓ ）
に関するものである。
使用しうる麻疹ウィルス属は、麻疹ウィルス、カレ病ウ
ィルス、中空ウィルスおよび小反剪動物ペストのうちか
ら選ばれる。
ィルス、中空ウィルスおよび小反剪動物ペストのうちか
ら選ばれる。
使用しうるポックスウィルスの中では、とりわけワクシ
ニアウィルスを挙げなければならない。
ニアウィルスを挙げなければならない。
特に興味ある構造蛋白質は、表面蛋白質、血球凝集蛋白
質（ＨＡ） 、融合蛋白質（Ｆ）および内部蛋白質の核
蛋白質（ＮＰ）である。相当するＤＮＡ配列は、蛋白質
の全長をコードしていてもよく、あるいは、麻疹ウィル
スまたは他の麻疹ウィルス属を中和する抗体あるいは細
胞性免疫応答を誘発するのに十分な断片をコードしてい
てもよい。
質（ＨＡ） 、融合蛋白質（Ｆ）および内部蛋白質の核
蛋白質（ＮＰ）である。相当するＤＮＡ配列は、蛋白質
の全長をコードしていてもよく、あるいは、麻疹ウィル
スまたは他の麻疹ウィルス属を中和する抗体あるいは細
胞性免疫応答を誘発するのに十分な断片をコードしてい
てもよい。
いくつかの蛋白質またはそれらのいくつかの断片をコー
ドするＤＮＡ配列を採用することも当然考えられる。
ドするＤＮＡ配列を採用することも当然考えられる。
本特許出願の実施例中で用いた麻疹ウィルスの系統は特
定のものであるが、他の系統も使用可能である。実際問
題として、種々の系統の麻疹ウィルスのＨＡ蛋白質およ
びＦ蛋白質と関連した抗原エピトープが少なからず保存
されれば、１ウイルス系統について記述した方法を他の
系統にも及ぼすことができるのである。
定のものであるが、他の系統も使用可能である。実際問
題として、種々の系統の麻疹ウィルスのＨＡ蛋白質およ
びＦ蛋白質と関連した抗原エピトープが少なからず保存
されれば、１ウイルス系統について記述した方法を他の
系統にも及ぼすことができるのである。
蛋白質発現要素は、本質的にはプロモーター、とりわけ
ワクシニアで有効なプロモーターであり、ワクシニアの
７．５Ｋｄの蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター
（略して７，５Ｋｄプロモーターと呼ぶこととする）を
使用することができる。
ワクシニアで有効なプロモーターであり、ワクシニアの
７．５Ｋｄの蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター
（略して７，５Ｋｄプロモーターと呼ぶこととする）を
使用することができる。
ＤＮＡの抑大は、ウィルスゲノムの非必須部分、すなわ
ちポックスウィルスの複製を阻害しない部分で行われな
ければならない。
ちポックスウィルスの複製を阻害しない部分で行われな
ければならない。
たとえば、ワクシニアのＴＫ遺伝子への組換えが行われ
る。それがウィルスにとって必須ではないということの
ほかに、この遺伝子は、関係配列を組込んだウィルスの
選択を可能ならしめる。
る。それがウィルスにとって必須ではないということの
ほかに、この遺伝子は、関係配列を組込んだウィルスの
選択を可能ならしめる。
あるタイプの細胞中でのウィルスの複製にしか必要でな
いｈｒと呼ばれる遺伝子中に組込みを行うことも可能で
ある。
いｈｒと呼ばれる遺伝子中に組込みを行うことも可能で
ある。
場合により、同一の組換えウィルスに、またはいくつか
のウィルスに、種々の麻疹ウィルス属蛋白質を同時に発
現させることができる。前者の場合、対応する遺伝子は
同一部位または異なる部位に、とくにＴＫ遺伝子および
ｈｒ遺伝子中に、組込みうる。
のウィルスに、種々の麻疹ウィルス属蛋白質を同時に発
現させることができる。前者の場合、対応する遺伝子は
同一部位または異なる部位に、とくにＴＫ遺伝子および
ｈｒ遺伝子中に、組込みうる。
それゆえに、本発明は、ゲノムの二つの非必須部分中に
同時に、異なる麻疹ウィルス属蛋白質をコードするＤＮ
Ａ配列を含むことを特徴とする組換えウィルスに関する
ものである。
同時に、異なる麻疹ウィルス属蛋白質をコードするＤＮ
Ａ配列を含むことを特徴とする組換えウィルスに関する
ものである。
かくして得られた組換えポックスウィルスは、生きてい
るものであれ、不活性化したものであれ、ワクチンとし
て、とくに麻疹、カー病、牛疫および小反芻動物ペスト
に対するワクチンとして、とりわけ有用である。
るものであれ、不活性化したものであれ、ワクチンとし
て、とくに麻疹、カー病、牛疫および小反芻動物ペスト
に対するワクチンとして、とりわけ有用である。
しかしながら、これらのポックスウィルスを間接的に使
用して試験管内で補乳動物細胞に感染させて、麻疹ライ
４レス属構造蛋白質特に麻疹構造蛋白質を得ることがで
き、それらは免疫・予防接種剤として使用し、あるいは
既知の方法に従って診断用要素として使用することがで
きよう。
用して試験管内で補乳動物細胞に感染させて、麻疹ライ
４レス属構造蛋白質特に麻疹構造蛋白質を得ることがで
き、それらは免疫・予防接種剤として使用し、あるいは
既知の方法に従って診断用要素として使用することがで
きよう。
それゆえに、本発明は、とりわけ前記の細胞培養から得
ることができるところの、前記構造蛋白質あるいは構造
蛋白質断片の予防接種剤としての使用に関するものでも
ある。
ることができるところの、前記構造蛋白質あるいは構造
蛋白質断片の予防接種剤としての使用に関するものでも
ある。
最後に、本発明は、血清療法に使用するための、本発明
のポックスウィルスまたは蛋白質に対して調製された抗
体を含有する抗血清に関するものでもある。
のポックスウィルスまたは蛋白質に対して調製された抗
体を含有する抗血清に関するものでもある。
実施例
実施例Ｉ ＨＡ蛋白質をコードするｃＤＮＡのワタシ
ニアウィルスゲノムへの移入を可能ならしめるベクター
の構築 ハレ（Ｈａｌｌｅ）系統のウィルスのＨＡ蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡが単離され、予め配列が決定されている
（参考資料３）。遺伝子操作を容易にすべく、プラスミ
ドｐＣＤ ＨＡ由来のｃＤＮＡＨＡを、これのわく組
をしている２か所のＢａｍＨＩ部位により切り出し、ベ
クターＭ１３ＴＧ１３１ （参考資料６）に挿入して、
プラスミドＭ１３ＴＧ２１０１を生ぜしめた。Ｍ１３７
Ｇ２１０１に担持されているＨＡ遺伝子をコードしてい
る部分の上流での下記合成オリゴヌクレオチドを用いて
の局所的変異によって、？ｓｔＩ部位を導入した。
ニアウィルスゲノムへの移入を可能ならしめるベクター
の構築 ハレ（Ｈａｌｌｅ）系統のウィルスのＨＡ蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡが単離され、予め配列が決定されている
（参考資料３）。遺伝子操作を容易にすべく、プラスミ
ドｐＣＤ ＨＡ由来のｃＤＮＡＨＡを、これのわく組
をしている２か所のＢａｍＨＩ部位により切り出し、ベ
クターＭ１３ＴＧ１３１ （参考資料６）に挿入して、
プラスミドＭ１３ＴＧ２１０１を生ぜしめた。Ｍ１３７
Ｇ２１０１に担持されているＨＡ遺伝子をコードしてい
る部分の上流での下記合成オリゴヌクレオチドを用いて
の局所的変異によって、？ｓｔＩ部位を導入した。
ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣ（
：ＡＣＡＡＴＧ変異プラスミドをＭ１３ＴＧ２１０６と
名付けた。
：ＡＣＡＡＴＧ変異プラスミドをＭ１３ＴＧ２１０６と
名付けた。
ＨＡ遺伝子を含むＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をＭ１３Ｔ
Ｇ２１０６から切り出し、前もってＰｓｔＩ −Ｂａｍ
ＨＩで切断したＭ１３Ｔ０１３０ベクター（参考資料６
）に組込んで、プラスミドＭｌ ３ＴＧ２１０７を生ぜ
しめた。ｃＤＮＡ ＨＡの変異領域のヌクレオチド配
列をジデオキシヌクレオチド、法によってチエツクし、
つぎに、このｃＤＮＡＨＡをＭ１３ＴＧ２１０７からＰ
ｓｔＩ −ＥｃｏＲＩの両酵素を用いて切り出し、前も
って酵素ＰｓｔＩ−ＥｅｏＲＩで切断しておいた伝達ベ
クターｐＴＧ１８６ＰＯＬＹ （フランス特許８４．０
６４９９）の７．５Ｋｄプロモーターの下流に抑大して
、プラスミドｐＴＧ１１６９を生ぜしめた。
Ｇ２１０６から切り出し、前もってＰｓｔＩ −Ｂａｍ
ＨＩで切断したＭ１３Ｔ０１３０ベクター（参考資料６
）に組込んで、プラスミドＭｌ ３ＴＧ２１０７を生ぜ
しめた。ｃＤＮＡ ＨＡの変異領域のヌクレオチド配
列をジデオキシヌクレオチド、法によってチエツクし、
つぎに、このｃＤＮＡＨＡをＭ１３ＴＧ２１０７からＰ
ｓｔＩ −ＥｃｏＲＩの両酵素を用いて切り出し、前も
って酵素ＰｓｔＩ−ＥｅｏＲＩで切断しておいた伝達ベ
クターｐＴＧ１８６ＰＯＬＹ （フランス特許８４．０
６４９９）の７．５Ｋｄプロモーターの下流に抑大して
、プラスミドｐＴＧ１１６９を生ぜしめた。
これら工程の全部は第１図に図式的に示されている。
実施例２ 蛋白質ＦをコードするｃＤＮＡのツクシニア
ウィルスゲノムへの移入を可能ならしめるベクターの構
築 ハレ系統のウィルスの蛋白質ＦをコードするｃＤＮＡが
単離され、先に配列が決定されている（参考資料２）。
ウィルスゲノムへの移入を可能ならしめるベクターの構
築 ハレ系統のウィルスの蛋白質ＦをコードするｃＤＮＡが
単離され、先に配列が決定されている（参考資料２）。
遺伝子操作を容易にすべく、蛋白質ＦをコードするｃＤ
ＮＡをｐＣＤ Ｆベクター（参考資料２）からＢａｍ
ＨＩ酵素を用いて切り出した。これは２種の断片、すな
わち該遺伝子の５′部分をカバーする断片と該遺伝子の
３′部分をカバーする断片、を与える。５′断片を、前
もってＢａｍＨＩ酵素により切断したＭ１３ＴＧ１３１
に挿入して、プラスミドＭ１３Ｔ０２１０３−５’ を
生ぜしめた。３′部分を同様にしてＭ１３ＴＧ１３１ベ
クターに組込んで、Ｍ１３ＴＧ２１０３−３’を得た。
ＮＡをｐＣＤ Ｆベクター（参考資料２）からＢａｍ
ＨＩ酵素を用いて切り出した。これは２種の断片、すな
わち該遺伝子の５′部分をカバーする断片と該遺伝子の
３′部分をカバーする断片、を与える。５′断片を、前
もってＢａｍＨＩ酵素により切断したＭ１３ＴＧ１３１
に挿入して、プラスミドＭ１３Ｔ０２１０３−５’ を
生ぜしめた。３′部分を同様にしてＭ１３ＴＧ１３１ベ
クターに組込んで、Ｍ１３ＴＧ２１０３−３’を得た。
下記合成オリゴヌクレオチドを用いての、Ｍ１３ＴＧ２
１０３−５′が担持するＦ遺伝子をコードする部分の上
流での局所的変異によって、Ｎ５ｉＩ部位を導入した。
１０３−５′が担持するＦ遺伝子をコードする部分の上
流での局所的変異によって、Ｎ５ｉＩ部位を導入した。
５ｉｌ
ＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＣＡＴＧＧ
ＧＴ（：ＴＣＡＡＧ変異プラスミドをＭ１３ＴＧ２１０
９と名付けた。
ＧＴ（：ＴＣＡＡＧ変異プラスミドをＭ１３ＴＧ２１０
９と名付けた。
Ｆ遺伝子の５′部分を含有するＮｓｉ Ｉ −ＢａｍＨ
Ｉ断片をＭ１３ＴＧ２１０９から切り出し、前もって酵
素ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩで切断した伝達プラスミドｐＴ
Ｇ１８６ＰＯＬＹの７，５Ｋｄプロモーターの下流に挿
入して、ベクター１）ＴＧ１１７２を生ぜしめた。Ｆ遺
伝子の３′部分をＢａｍＨＩ酵素によりＭ１３ＴＧ２１
０Ｂ−３’から切り出し、次に、前もってＢａｍＨＩで
切断したｐＴＧ１１７２に、天然遺伝子を再構成するよ
うなオリエンテーションで挿入して、ベクターｐＴＧ１
１７３を得た。これらの工程の全てが第２図に図式的に
示されている。
Ｉ断片をＭ１３ＴＧ２１０９から切り出し、前もって酵
素ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩで切断した伝達プラスミドｐＴ
Ｇ１８６ＰＯＬＹの７，５Ｋｄプロモーターの下流に挿
入して、ベクター１）ＴＧ１１７２を生ぜしめた。Ｆ遺
伝子の３′部分をＢａｍＨＩ酵素によりＭ１３ＴＧ２１
０Ｂ−３’から切り出し、次に、前もってＢａｍＨＩで
切断したｐＴＧ１１７２に、天然遺伝子を再構成するよ
うなオリエンテーションで挿入して、ベクターｐＴＧ１
１７３を得た。これらの工程の全てが第２図に図式的に
示されている。
実施例３ 麻疹ウィルスのＨＡ遺伝子を含有し、対応蛋
白質を発現し得るワクシニアウィルス組換え体の構築 ｐＴＧ１１６９プラスミドに含まれているＨＡ蛋白質を
コードする遺伝子を、文献記載の慣用的操作（フランス
特許８４．０６４９９０）によって、ワクシニアウィル
スのゲノム中へ移入させた。
白質を発現し得るワクシニアウィルス組換え体の構築 ｐＴＧ１１６９プラスミドに含まれているＨＡ蛋白質を
コードする遺伝子を、文献記載の慣用的操作（フランス
特許８４．０６４９９０）によって、ワクシニアウィル
スのゲノム中へ移入させた。
要約して述べれば、メントリ胚細胞を、細胞１個当り０
．１ｐｆｕの割合でワクシニアウィルスの熱感受性変異
株ｔｓＮ７に感染させ、３３℃（該変異株にとっての許
容温度）で２時間インキュベートした。細胞をつぎに、
ワクシニアウィルスの野生株のＤＮＡ１μｇとプラスミ
ドｐＴＧ１１６９ １１００ｎとを含有する燐酸カルシ
ウム沈澱によりトランスフェクトした。室温で１時間の
インキュベーションの後、沈澱を除去することなく、新
鮮な培地を細胞に加え、インキュベーションを３９．５
℃（変異株にとっての非許容温度）で２時間続けた。こ
の期間の後、沈澱を含む培地を除去し、１０％グリセロ
ール含有培地で１分間の間置換した。最後に、細胞をＰ
ＢＳで洗い、ついで、通常培地中３９．５℃で２日間イ
ンキュベートした。ついで、組換えウィルスのうち、チ
ミジンキナーゼ陰性のものを先のトランスフェクション
で生じた非熱感受性ウィルスから選択した。
．１ｐｆｕの割合でワクシニアウィルスの熱感受性変異
株ｔｓＮ７に感染させ、３３℃（該変異株にとっての許
容温度）で２時間インキュベートした。細胞をつぎに、
ワクシニアウィルスの野生株のＤＮＡ１μｇとプラスミ
ドｐＴＧ１１６９ １１００ｎとを含有する燐酸カルシ
ウム沈澱によりトランスフェクトした。室温で１時間の
インキュベーションの後、沈澱を除去することなく、新
鮮な培地を細胞に加え、インキュベーションを３９．５
℃（変異株にとっての非許容温度）で２時間続けた。こ
の期間の後、沈澱を含む培地を除去し、１０％グリセロ
ール含有培地で１分間の間置換した。最後に、細胞をＰ
ＢＳで洗い、ついで、通常培地中３９．５℃で２日間イ
ンキュベートした。ついで、組換えウィルスのうち、チ
ミジンキナーゼ陰性のものを先のトランスフェクション
で生じた非熱感受性ウィルスから選択した。
このステップを実施するため、上記のようにして感染、
形質転換したメントリ細胞を凍結と超音波処理により溶
解し、それらが含有するウィルスを、１％アガロース層
の下で１００μｇ／−のブロモデオキシウリジンの存在
下にＬＴＫ−細胞上で検定した。ＴＫ’″ウィルス域を
再びとり、それらが含むウィルスを新鮮なメントリ胚細
胞培地上で増殖させた。かくして得たウィルス株を免疫
蛍光法または免疫沈降法により分析して、それらのＨＡ
蛋白質合成能を調べた。
形質転換したメントリ細胞を凍結と超音波処理により溶
解し、それらが含有するウィルスを、１％アガロース層
の下で１００μｇ／−のブロモデオキシウリジンの存在
下にＬＴＫ−細胞上で検定した。ＴＫ’″ウィルス域を
再びとり、それらが含むウィルスを新鮮なメントリ胚細
胞培地上で増殖させた。かくして得たウィルス株を免疫
蛍光法または免疫沈降法により分析して、それらのＨＡ
蛋白質合成能を調べた。
免疫蛍光法では、ＬＴＫ−細胞を、細胞１個当り約１
ｐｆｕの割合の組換えウィルスに１５時間感染させた。
ｐｆｕの割合の組換えウィルスに１５時間感染させた。
感染細胞をつぎにアセトンで固定し、ＰＢＳで再び水を
補給し、ついで半時間、麻疹ウィルスのＨＡ蛋白質に対
するマウスモノクローナル抗体を１／２００に希釈した
ものと共に、インキュベートした。ＰＢＳで洗って未固
定抗体を除いたのち、細胞を、フルオレセイン標識抗マ
ウス抗体を１／１００に希釈したものの存在下に、イン
キュベートした。非特異的に固定された標識抗体を洗っ
て除去したのち、試料を蛍光顕微鏡下に観察した。第３
図の写真は、上で単離した組換え体が麻疹ウィルス感染
細胞の蛍光特性を示すが、野生ワクシニアウィルス感染
細胞はこの蛍光を示さないことを示している。蛋白質Ｈ
Ａを合成しうるワクシニアウィルス組換え体の一つを選
び、ＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ２−２と名付けた。それが他
の非組換えウィルスによる汚染を含んでいないことを確
実ならしめるため、もう−度、感染域の単離とメンドリ
胚細胞での増殖により精製した。
補給し、ついで半時間、麻疹ウィルスのＨＡ蛋白質に対
するマウスモノクローナル抗体を１／２００に希釈した
ものと共に、インキュベートした。ＰＢＳで洗って未固
定抗体を除いたのち、細胞を、フルオレセイン標識抗マ
ウス抗体を１／１００に希釈したものの存在下に、イン
キュベートした。非特異的に固定された標識抗体を洗っ
て除去したのち、試料を蛍光顕微鏡下に観察した。第３
図の写真は、上で単離した組換え体が麻疹ウィルス感染
細胞の蛍光特性を示すが、野生ワクシニアウィルス感染
細胞はこの蛍光を示さないことを示している。蛋白質Ｈ
Ａを合成しうるワクシニアウィルス組換え体の一つを選
び、ＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ２−２と名付けた。それが他
の非組換えウィルスによる汚染を含んでいないことを確
実ならしめるため、もう−度、感染域の単離とメンドリ
胚細胞での増殖により精製した。
期待通りの大きさのＨＡ蛋白質の合成を確認するため、
ＢＨＫ２１細胞を、細胞１個当り約０、 １ｐｆｕの割
合で１５時間感染させ、ついで普通のメチオニンを含ま
ないで３５Ｓ標識放射性メチオニンを含有する培地中で
インキュベートした。
ＢＨＫ２１細胞を、細胞１個当り約０、 １ｐｆｕの割
合で１５時間感染させ、ついで普通のメチオニンを含ま
ないで３５Ｓ標識放射性メチオニンを含有する培地中で
インキュベートした。
４時間の標識化ののち、感染細胞を免疫沈降緩衝液中で
溶解し、ＨＡ蛋白質を、麻疹ウィルスの蛋白質に対して
のモルモットポリクローナル抗体により、セファロース
固定黄色ぶどう球菌蛋白質への存在下に、免疫沈降させ
た。免疫沈降蛋白質を、ＳＤＳの存在下にポリアクリル
アミドゲル上で分析した。乾燥したゲルをオートラジオ
グラフィーに付した。結果（第４図）は、ワクシニアウ
ィルス組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ２−２が、麻疹ウ
ィルスノＨＡ蛋白質の標品と同じ大きさの蛋白質の合成
を誘起することを示している。
溶解し、ＨＡ蛋白質を、麻疹ウィルスの蛋白質に対して
のモルモットポリクローナル抗体により、セファロース
固定黄色ぶどう球菌蛋白質への存在下に、免疫沈降させ
た。免疫沈降蛋白質を、ＳＤＳの存在下にポリアクリル
アミドゲル上で分析した。乾燥したゲルをオートラジオ
グラフィーに付した。結果（第４図）は、ワクシニアウ
ィルス組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ２−２が、麻疹ウ
ィルスノＨＡ蛋白質の標品と同じ大きさの蛋白質の合成
を誘起することを示している。
実施例４ 麻疹ウィルスのＦ蛋白質をコードする遺伝子
を含有するワクシニアウィルス組換え体の構築 プラスミドｐＴＧ１１７３に担持されたＦ蛋白質をコー
ドする遺伝子を、遺伝子ＨＡについて実施例３に記載し
たのと同じ操作法に従って、ワクシニアウィルスゲノム
へ移入した。かくして、ＶＶ、ＴＧ、ＦＭ１１７３と名
付けたウィルス組換え体を単離した。この組換え体が蛋
白質下の合成を誘起することを確認すべく、ＢＨＫ２１
細胞を、細胞１個当り約０． １ｐｆｕにより１５時間
感染させ、ついで、通常のメチオニンを含まず、代りに
３５８標識放射性メチオニンを含有する培地中でインキ
ュベートシた。４時間の標識化ののち、感染細胞を免疫
沈降緩衝液中で溶解し、蛋白質Ｆを、セファロース固定
黄色ぶどう球菌の存在下に、麻疹ウィルスの蛋白質に対
するモルモットポリクローナル抗体により免疫沈降させ
た。
を含有するワクシニアウィルス組換え体の構築 プラスミドｐＴＧ１１７３に担持されたＦ蛋白質をコー
ドする遺伝子を、遺伝子ＨＡについて実施例３に記載し
たのと同じ操作法に従って、ワクシニアウィルスゲノム
へ移入した。かくして、ＶＶ、ＴＧ、ＦＭ１１７３と名
付けたウィルス組換え体を単離した。この組換え体が蛋
白質下の合成を誘起することを確認すべく、ＢＨＫ２１
細胞を、細胞１個当り約０． １ｐｆｕにより１５時間
感染させ、ついで、通常のメチオニンを含まず、代りに
３５８標識放射性メチオニンを含有する培地中でインキ
ュベートシた。４時間の標識化ののち、感染細胞を免疫
沈降緩衝液中で溶解し、蛋白質Ｆを、セファロース固定
黄色ぶどう球菌の存在下に、麻疹ウィルスの蛋白質に対
するモルモットポリクローナル抗体により免疫沈降させ
た。
免疫沈降蛋白質を、ＳＤＳの存在下にポリアクリルアミ
ドを用いて分析した。乾燥したゲルをオートラジオグラ
フィーに付した。結果（第４図）は、組換え体ＶＶ、Ｔ
Ｇ、ＦＭＩＬ７３が、Ｆ遺伝子の翻訳ノ最初の産物に相
当する蛋白質ＦＯならびに麻疹感染時に当然のこととし
て現われる蛋白質加水分解生成物Ｆ１およびＦ２の合成
を誘起することを示している。蛋白質ＦＯ，Ｆｌおよび
Ｆ２は、標準麻疹ウィルス蛋白質について予期される大
きさを有していた。これらの蛋白質が、麻疹ウィルス感
染時と同様に感染細胞の膜と関連していることを証明す
るために、ＬＴＫ−細胞を、細胞１個当り約１ ｐｆｕ
の割合の組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＦＭｌ１７３に１５時間
感染させた。感染細胞をつぎにアセトンで固定し、ＰＢ
Ｓで再度水分を補給し、麻疹ウィルスのＦ蛋白質に対す
るマウスモノクローナル抗体を１／１００に希釈したも
のと共に半時間インキュベートシた。ＰＢＳで洗ったの
ち、細胞を、フルオレセイン標識抗マウス抗体の１／１
００希釈物の存在下にインキュベートした。さらに洗っ
て非特異的に固定された標識抗体を除去したのち、試料
を蛍光顕微鏡下に観察した。第３図の写真は、組換え体
ＶＶ、ＴＧ、ＦＭ１１７３に感染した細胞は麻疹ウィル
ス感染細胞の嘆賞光特性をもっていたが、野生型ワタシ
ニアウィルス感染細胞は蛍光を示さないことを示してい
る。
ドを用いて分析した。乾燥したゲルをオートラジオグラ
フィーに付した。結果（第４図）は、組換え体ＶＶ、Ｔ
Ｇ、ＦＭＩＬ７３が、Ｆ遺伝子の翻訳ノ最初の産物に相
当する蛋白質ＦＯならびに麻疹感染時に当然のこととし
て現われる蛋白質加水分解生成物Ｆ１およびＦ２の合成
を誘起することを示している。蛋白質ＦＯ，Ｆｌおよび
Ｆ２は、標準麻疹ウィルス蛋白質について予期される大
きさを有していた。これらの蛋白質が、麻疹ウィルス感
染時と同様に感染細胞の膜と関連していることを証明す
るために、ＬＴＫ−細胞を、細胞１個当り約１ ｐｆｕ
の割合の組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＦＭｌ１７３に１５時間
感染させた。感染細胞をつぎにアセトンで固定し、ＰＢ
Ｓで再度水分を補給し、麻疹ウィルスのＦ蛋白質に対す
るマウスモノクローナル抗体を１／１００に希釈したも
のと共に半時間インキュベートシた。ＰＢＳで洗ったの
ち、細胞を、フルオレセイン標識抗マウス抗体の１／１
００希釈物の存在下にインキュベートした。さらに洗っ
て非特異的に固定された標識抗体を除去したのち、試料
を蛍光顕微鏡下に観察した。第３図の写真は、組換え体
ＶＶ、ＴＧ、ＦＭ１１７３に感染した細胞は麻疹ウィル
ス感染細胞の嘆賞光特性をもっていたが、野生型ワタシ
ニアウィルス感染細胞は蛍光を示さないことを示してい
る。
実施例５ 組換えＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ２−２によるマ
ウスの予防接種 ４〜５週令のＢａ１ｂ／Ｃマウスに、尾を傷つけること
によって、組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ２−２または
野生のｖｖウィルス４Ｘ１０ｐｆｕを接種した。接種か
ら３週間後に、動物から血液を採取し、ウィルスの血球
凝集活性を阻害しうる、またインビトロでウィルスを中
和しうる抗体のレベルを測定した。
ウスの予防接種 ４〜５週令のＢａ１ｂ／Ｃマウスに、尾を傷つけること
によって、組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ２−２または
野生のｖｖウィルス４Ｘ１０ｐｆｕを接種した。接種か
ら３週間後に、動物から血液を採取し、ウィルスの血球
凝集活性を阻害しうる、またインビトロでウィルスを中
和しうる抗体のレベルを測定した。
第１表は、ＶＶ、ＴＧ、ｌＩＡＭ２−２を接種したマウ
スの大部分が抗血球凝集抗体および中和抗体の両方を示
したことを示している。予防接種３週間後に、動物に試
験接種材料を与えた。すなわち、前もって神経適応麻疹
株（参考資料１１）に感染させたマウスの脳の１０％に
希釈した懸濁液５０１１ρを各マウスに与えた。動物を
１か月間観察した。第２表は、ＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ２
−２株予防接種マウスは保護され、他の動物は試験接種
材料で死ぬことを示している。
スの大部分が抗血球凝集抗体および中和抗体の両方を示
したことを示している。予防接種３週間後に、動物に試
験接種材料を与えた。すなわち、前もって神経適応麻疹
株（参考資料１１）に感染させたマウスの脳の１０％に
希釈した懸濁液５０１１ρを各マウスに与えた。動物を
１か月間観察した。第２表は、ＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ２
−２株予防接種マウスは保護され、他の動物は試験接種
材料で死ぬことを示している。
実施例６ 組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＰＭＩＬ７３によるマ
ウスの予防接種 ５週令の雌性Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに、尾を傷つけること
によって、組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＦＭ１１７３または野
生ｖＶウィルスを４Ｘ１０７ｐｆｕで予防接種した。
ウスの予防接種 ５週令の雌性Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに、尾を傷つけること
によって、組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＦＭ１１７３または野
生ｖＶウィルスを４Ｘ１０７ｐｆｕで予防接種した。
接種から２５日後に、動物から血液を採取し、インビト
ロでウィルスを中和しうる抗体のレベルを測定した。第
３表は、ＶＶ、ＴＧ、ＦＭＩＬ７３で予防接種したマウ
スの大部分が中和抗体を示したことを示している。血液
サンプル採取口に、麻疹ウィルスの神経適応ビルレント
株をマウスに脳内接種した。
ロでウィルスを中和しうる抗体のレベルを測定した。第
３表は、ＶＶ、ＴＧ、ＦＭＩＬ７３で予防接種したマウ
スの大部分が中和抗体を示したことを示している。血液
サンプル採取口に、麻疹ウィルスの神経適応ビルレント
株をマウスに脳内接種した。
各マウスには、前もって神経適応ビルレント株に感染さ
せたマウスの脳の１０％に希釈した懸濁液５０μｐを与
えた。動物を１か月間観察した。
せたマウスの脳の１０％に希釈した懸濁液５０μｐを与
えた。動物を１か月間観察した。
ＶＶ、ＴＧ、ＦＭｌ１７３株予防接種マウスのみが試験
接種材料に対して保護された（第２表）。
接種材料に対して保護された（第２表）。
第１表 組換えウィルス■■、ＴＧ、ｌｌＡＭ２−２の
接種によるマウスの免疫 雌マウス 抗血球凝集抗体 中和抗体 雄マウス ４ １６０ Ｂ２Ｏ１３８０Ｂ
２０ 力価は、５０ ｐｆｕの麻疹ウィルスを完全に中和する
または血球凝集活性を完全に阻害する血清の最高希釈度
の逆数として表わした。野生ＶＶ株で予防接種したまた
は予防接種しなかったマウスの血清の抗血球凝集抗体力
価は２０未満、中和抗体力価は４０未満であった。
接種によるマウスの免疫 雌マウス 抗血球凝集抗体 中和抗体 雄マウス ４ １６０ Ｂ２Ｏ１３８０Ｂ
２０ 力価は、５０ ｐｆｕの麻疹ウィルスを完全に中和する
または血球凝集活性を完全に阻害する血清の最高希釈度
の逆数として表わした。野生ＶＶ株で予防接種したまた
は予防接種しなかったマウスの血清の抗血球凝集抗体力
価は２０未満、中和抗体力価は４０未満であった。
第２表 マウスの保護
＊予防接種の３週間後に、マウス適応麻疹株５ＳＰＥで
マウスをテストした。最初の３日間に生じた死亡は、接
種経路の外傷に帰しうるので、結果には参入しなかった
。
マウスをテストした。最初の３日間に生じた死亡は、接
種経路の外傷に帰しうるので、結果には参入しなかった
。
第３ 表ＶＶ、ＴＧ、ＰＭＬ１７３ウィルスの接種によ
るマウスの免疫。
るマウスの免疫。
雌マウス 中和抗体
１０’ ４０
力価は、麻疹ウィルス５０ｐｆｕを完全に中和する血清
の最高希釈度の逆数として表わした。予防接種しなかっ
たまたは野生株で予防接種したマウスの血清の中和抗体
力価は４０未満であった。
の最高希釈度の逆数として表わした。予防接種しなかっ
たまたは野生株で予防接種したマウスの血清の中和抗体
力価は４０未満であった。
実施例７ 麻疹ウィルスの蛋白質Ｆをコードする遺伝子
および蛋白質ＨＡをコードする遺伝子を含有するワクシ
ニアウィルス組換え体の構築ＨＡ遺伝子およびＦ遺伝子
のツクシニアウィルスゲノムへの同時移入を可能ならし
める組換えプラスミドを次のようにして構築した（第５
図に図解）：Ｍ１３７Ｇ２１１９ベクターからＢａ１Ｉ
Ｉ酵素による部分消化とＥｃｏＲＩによる完全消化によ
って７．５Ｋｄプロモーターを切り出した。こうして得
たＢａ１ｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、前もってＢａｍＨＩ
およびＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＴＧ１１６９
に挿入した。このようにして新しいプラスミドを単離し
、ｐＴＧ２１２１と名付けた。
および蛋白質ＨＡをコードする遺伝子を含有するワクシ
ニアウィルス組換え体の構築ＨＡ遺伝子およびＦ遺伝子
のツクシニアウィルスゲノムへの同時移入を可能ならし
める組換えプラスミドを次のようにして構築した（第５
図に図解）：Ｍ１３７Ｇ２１１９ベクターからＢａ１Ｉ
Ｉ酵素による部分消化とＥｃｏＲＩによる完全消化によ
って７．５Ｋｄプロモーターを切り出した。こうして得
たＢａ１ｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、前もってＢａｍＨＩ
およびＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＴＧ１１６９
に挿入した。このようにして新しいプラスミドを単離し
、ｐＴＧ２１２１と名付けた。
この構造では、ＨＡ遺伝子の３′末端に、ＨＡ遺伝子と
同じ転写方向に配向された７、５Ｋｄプロモーターが続
いている。
同じ転写方向に配向された７、５Ｋｄプロモーターが続
いている。
ｐＴＧ２１２１プラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩ酵素により、第二の７．５Ｋｄプロモーターの下流
で開き、ｐＴＧ１１７３プラスミドから酵素Ｂａ１ｍお
よびＥｃｏＲＩで切り出したＦ遺伝子をそこへ挿入した
；この新しいプラスミドをｐＴＧ２１２２と名付けた。
ＲＩ酵素により、第二の７．５Ｋｄプロモーターの下流
で開き、ｐＴＧ１１７３プラスミドから酵素Ｂａ１ｍお
よびＥｃｏＲＩで切り出したＦ遺伝子をそこへ挿入した
；この新しいプラスミドをｐＴＧ２１２２と名付けた。
かくして、ｐＴＧ２１２２プラスミドは、各々が７．５
Ｋｄプロモーターの制御下におかれた遺伝子ＨＡおよび
Ｆの挿入されたプラスミドｐＴＧ１８６ＰＯＬＹに相当
する。この全体を、実施例３に記載した操作によってツ
クシュアウィルスゲノム中へ移入した。
Ｋｄプロモーターの制御下におかれた遺伝子ＨＡおよび
Ｆの挿入されたプラスミドｐＴＧ１８６ＰＯＬＹに相当
する。この全体を、実施例３に記載した操作によってツ
クシュアウィルスゲノム中へ移入した。
ＨＡ蛋白質およびＦ蛋白質の合成を誘起しうる組換えウ
ィルス（ＶＶ、ＴＧ、ｔｌＡＰＭ２１２２）を単離し、
実施例３および４に記載した通りの免疫蛍光および免疫
沈降により特性を確認した（免疫沈降については第６図
参照）。
ィルス（ＶＶ、ＴＧ、ｔｌＡＰＭ２１２２）を単離し、
実施例３および４に記載した通りの免疫蛍光および免疫
沈降により特性を確認した（免疫沈降については第６図
参照）。
実施例８ 麻疹ウィルスのＦ蛋白質をコードする遺伝子
およびＨＡ蛋白質をコードする遺伝子を含有するワクシ
ニアウィルスの第二の組換え体の構築 組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＨＡＦＭ２１２２は不安定である
ことが判明した。実際、数組換え体のクローニングに由
来するウィルス母集団の解析により、それらの１００％
が依然Ｆ蛋白質をコードしているが、５０％しかＨＡ蛋
白質をコードしていないことが示された。常に、画工白
質をコードするウィルスクローンから出発する同タイプ
の連続クローニングでも同様の結果が得られた。恐らく
、直接反復（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ）
における７、５Ｋｄプロモーターの存在が、反復により
フレーム（ｆｒａｍｅ）される遺伝子（結局ＨＡ遺伝子
）の欠失を引き起こすものと考えられる。
およびＨＡ蛋白質をコードする遺伝子を含有するワクシ
ニアウィルスの第二の組換え体の構築 組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＨＡＦＭ２１２２は不安定である
ことが判明した。実際、数組換え体のクローニングに由
来するウィルス母集団の解析により、それらの１００％
が依然Ｆ蛋白質をコードしているが、５０％しかＨＡ蛋
白質をコードしていないことが示された。常に、画工白
質をコードするウィルスクローンから出発する同タイプ
の連続クローニングでも同様の結果が得られた。恐らく
、直接反復（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ）
における７、５Ｋｄプロモーターの存在が、反復により
フレーム（ｆｒａｍｅ）される遺伝子（結局ＨＡ遺伝子
）の欠失を引き起こすものと考えられる。
ＨＡ及びＦ蛋白質を安定してコードする組換体を生成す
るために、２個の７，５Ｋｄプロモーターを逆反復（ｒ
ｅｖｅｒｓｅ ｒｅｐｅｔｉｔｆｏｎ）に置き、その結
果、どの組換えも非生存のトランケートされたウィルス
ゲノムをもたらすようにした。従って、これにより、Ｈ
Ａ遺伝子の欠失に抗する選択システムが構成され、組換
えウィルスの安定性が確保される。
るために、２個の７，５Ｋｄプロモーターを逆反復（ｒ
ｅｖｅｒｓｅ ｒｅｐｅｔｉｔｆｏｎ）に置き、その結
果、どの組換えも非生存のトランケートされたウィルス
ゲノムをもたらすようにした。従って、これにより、Ｈ
Ａ遺伝子の欠失に抗する選択システムが構成され、組換
えウィルスの安定性が確保される。
構築は、下記の方法で実施された。まず、第２７．５Ｋ
ｄプロモーターをｐＴＧ１１６９プラスミドに導入した
。Ｍ１３ＴＧ２１１９をＢｇｌＩＩで部分消化し、更に
ＢａｍＨＩで完全消化して、７．５Ｋｄプロモーターを
切り出した。」三原においてはＢｇｌＩＩで、下流にお
いてはＢａｍＨＩで切断されたプロモーターを有するＤ
ＮＡフラグメントを単離し、予めＢａｍＨＩで切断して
ホスファターゼで処理したｐＴＧ１１６９プラスミドに
結合した。
ｄプロモーターをｐＴＧ１１６９プラスミドに導入した
。Ｍ１３ＴＧ２１１９をＢｇｌＩＩで部分消化し、更に
ＢａｍＨＩで完全消化して、７．５Ｋｄプロモーターを
切り出した。」三原においてはＢｇｌＩＩで、下流にお
いてはＢａｍＨＩで切断されたプロモーターを有するＤ
ＮＡフラグメントを単離し、予めＢａｍＨＩで切断して
ホスファターゼで処理したｐＴＧ１１６９プラスミドに
結合した。
大腸菌をライゲーション混合物（ｌｉｇａｔｌｏｎｍｉ
ｘｔｕｒｅ ）で形質転換後、第二の７．５Ｋｄプロモ
ーターが第一のプロモーターの反対の転写方向にあるプ
ラスミドｐＴＧ２１３０を単離した。次いで、酵素Ｂｇ
ｌＩＩ及びＢａｍＨＩでｐＴＧ１１７３を切断し、Ｆ蛋
白質のＮ末端部分をコードする末端を切り出し、予めＢ
ａｍＨＩで切断して脱燐酸させた（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｙｌａｔｅｄ） ｐ Ｔ Ｇ ２１３０に挿入した。
ｘｔｕｒｅ ）で形質転換後、第二の７．５Ｋｄプロモ
ーターが第一のプロモーターの反対の転写方向にあるプ
ラスミドｐＴＧ２１３０を単離した。次いで、酵素Ｂｇ
ｌＩＩ及びＢａｍＨＩでｐＴＧ１１７３を切断し、Ｆ蛋
白質のＮ末端部分をコードする末端を切り出し、予めＢ
ａｍＨＩで切断して脱燐酸させた（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｙｌａｔｅｄ） ｐ Ｔ Ｇ ２１３０に挿入した。
これによって、プラスミドＢＴＧ２１３３を得た。
Ｆ遺伝子のＣ末端部分を加えるために、オリジナルｃＤ
ＮＡにおいて存在し、かつＭ１３ＴＧ２１０３ ３’
に移入されていたｐｏｌｙＡ末端をまず欠失させること
が必要なことが見出された。
ＮＡにおいて存在し、かつＭ１３ＴＧ２１０３ ３’
に移入されていたｐｏｌｙＡ末端をまず欠失させること
が必要なことが見出された。
これを実施するため、下記オリゴヌクレオチド５’ 、
ＡＡＴＴＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣ
ＧＡＡＣＡＡＴＡＴＣＧＧを用いて、局在性突然変異を
誘発させ、Ｆ遺伝子内に在るＢａｍＨＩサイトから２４
６ヌクレオチド下流でＢｇｌＩＩサイトを導入した。Ｍ
１３７Ｇ２１４３と称せられる変異されたＭ１３ファー
ジは、Ｆ遺伝子のＣ末端配列をコードするＢａｍＨＩ−
ＢｇｌＩＩフラグメントの供給源として用いられた。
ＡＡＴＴＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣ
ＧＡＡＣＡＡＴＡＴＣＧＧを用いて、局在性突然変異を
誘発させ、Ｆ遺伝子内に在るＢａｍＨＩサイトから２４
６ヌクレオチド下流でＢｇｌＩＩサイトを導入した。Ｍ
１３７Ｇ２１４３と称せられる変異されたＭ１３ファー
ジは、Ｆ遺伝子のＣ末端配列をコードするＢａｍＨＩ−
ＢｇｌＩＩフラグメントの供給源として用いられた。
このファージを予めＢａｍＨＩで開裂され、脱燐酸化さ
れた。プラスミドｐＴＧ２１３３に挿入した。
れた。プラスミドｐＴＧ２１３３に挿入した。
得られた組換えプラスミドｐＴＧ３１１５は、互いに反
対方向に位置し、且つ、各々がその反対にある７、５Ｋ
ｄプロモーターにより支配されているＨＡ及びＦ遺伝子
を持つ。ｐＴＧ３１１５プラスミドを構築するために実
施された操作を第７図にまとめる。
対方向に位置し、且つ、各々がその反対にある７、５Ｋ
ｄプロモーターにより支配されているＨＡ及びＦ遺伝子
を持つ。ｐＴＧ３１１５プラスミドを構築するために実
施された操作を第７図にまとめる。
ワクシニアのウィルスのゲノムへの上記の配列移入は、
前述の方法に従って行われ、ウィルスＶＶ、ＴＧ、ｌｌ
Ａｒ’Ｍ３１１５を単離した。この組換えウィルスは、
上記で用いた免疫蛍光法及び免疫沈降法の判断基準によ
れば、ＨＡ及びＦ蛋白質をコードし、更に、連続的クロ
ーニング後も安定な表現型（蛋白質ＨＡ及びＦの発現）
を表す。
前述の方法に従って行われ、ウィルスＶＶ、ＴＧ、ｌｌ
Ａｒ’Ｍ３１１５を単離した。この組換えウィルスは、
上記で用いた免疫蛍光法及び免疫沈降法の判断基準によ
れば、ＨＡ及びＦ蛋白質をコードし、更に、連続的クロ
ーニング後も安定な表現型（蛋白質ＨＡ及びＦの発現）
を表す。
実施例９ ｈｒ遺伝子を置換することによる、麻疹ウ
ィルスのＦ蛋白質をコードするワクシニアウィルスの組
換え体の構築 従来の研究（参考資料１２）で、ワクシニアウィルスは
ｈｒ遺伝子という遺伝子を有することが明らかにされた
。該遺伝子は、ヒト起源のある種の細胞タイプにおける
ウィルス増殖には不可欠であるが、他の細胞タイプ（鶏
胎児細胞、ハムスターＢＨＫ２１細胞、マウスＬ細胞）
においては不可欠ではない。この結果は、ｈｒ遺伝子を
欠失させ、他の遺伝子で置換することができ得ることを
示唆するものである。
ィルスのＦ蛋白質をコードするワクシニアウィルスの組
換え体の構築 従来の研究（参考資料１２）で、ワクシニアウィルスは
ｈｒ遺伝子という遺伝子を有することが明らかにされた
。該遺伝子は、ヒト起源のある種の細胞タイプにおける
ウィルス増殖には不可欠であるが、他の細胞タイプ（鶏
胎児細胞、ハムスターＢＨＫ２１細胞、マウスＬ細胞）
においては不可欠ではない。この結果は、ｈｒ遺伝子を
欠失させ、他の遺伝子で置換することができ得ることを
示唆するものである。
ｈｒ遺伝子の代わりに、麻疹ウィルスのＦ蛋白質をコー
ドする遺伝子を下記の方法にて挿入した。
ドする遺伝子を下記の方法にて挿入した。
１、ワタシニアのウィルスのゲノムにおけるｈｒ遺伝子
にがわるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の組込み まず、ｐ７．５Ｋｄプロモーターの後にβ−ガラクトシ
ダーゼの遺伝子を有する発現単位によりｈｒ遺伝子が置
換されているプラスミドを構築した。欠失させたｈｒ遺
伝子の上流及び下流で発生するウィルスＤＮＡをｐＵＣ
７ベクターに導入し、ｐＢＡＣｌを作成した。該プラス
ミドの単一ＢｇｌＩＩサイトは、ｈｒ遺伝子が存在して
いたサイトに相当する。
にがわるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の組込み まず、ｐ７．５Ｋｄプロモーターの後にβ−ガラクトシ
ダーゼの遺伝子を有する発現単位によりｈｒ遺伝子が置
換されているプラスミドを構築した。欠失させたｈｒ遺
伝子の上流及び下流で発生するウィルスＤＮＡをｐＵＣ
７ベクターに導入し、ｐＢＡＣｌを作成した。該プラス
ミドの単一ＢｇｌＩＩサイトは、ｈｒ遺伝子が存在して
いたサイトに相当する。
ｐＢＡｃ１プラスミドをＢｇｌＩＩで開裂し、ｐＴＧ１
１７４山来で、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するＢ
ｇｌＩＩ −ＢａｍＨＩフラグメントをここに挿入し、
これにより、遺伝子の読取り方向をウィルスゲノムの通
常の方向に関連し左から右とした。得られたプラスミド
ｐＴＧ２１２８をβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の上流の
単一ＢｇｌＩＩサイトで開裂し、Ｍ１３ＴＧ２１１９由
来のＤＮＡフラグメントＢｇｌＩＩ −ＢｇｌＩＩに担
われるｐ７．５Ｋｄプロモーターをβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の転写を可能とする方向に組込んだ。このライ
ゲーションによるプラスミドをｐＴＧ２１３１とする；
その構築ステップを第８図に図示する。
１７４山来で、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するＢ
ｇｌＩＩ −ＢａｍＨＩフラグメントをここに挿入し、
これにより、遺伝子の読取り方向をウィルスゲノムの通
常の方向に関連し左から右とした。得られたプラスミド
ｐＴＧ２１２８をβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の上流の
単一ＢｇｌＩＩサイトで開裂し、Ｍ１３ＴＧ２１１９由
来のＤＮＡフラグメントＢｇｌＩＩ −ＢｇｌＩＩに担
われるｐ７．５Ｋｄプロモーターをβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の転写を可能とする方向に組込んだ。このライ
ゲーションによるプラスミドをｐＴＧ２１３１とする；
その構築ステップを第８図に図示する。
鶏胎児細胞をワクシニアウィルスの変異体ｔ ｓＮ７で
予め感染し、野生型ウィルスＤＮＡ及びｐＴ０２１３１
のＤＮＡを同時に用いて、該細胞をトランスフェクトし
た。１％寒天を含有する培地の層の下に領域（ａｒｅａ
ｓ ）を形成させるため、この実験で得られた非感温性
ウィルスを鶏胎児細胞上に広げた。２日後、寒天及び１
−につき６０ｍｇのＸ−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を
含有する培地の第二層を添加した。この方法により、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込み、かつ発現するウ
ィルスを含有する青色領域が認識できた。
予め感染し、野生型ウィルスＤＮＡ及びｐＴ０２１３１
のＤＮＡを同時に用いて、該細胞をトランスフェクトし
た。１％寒天を含有する培地の層の下に領域（ａｒｅａ
ｓ ）を形成させるため、この実験で得られた非感温性
ウィルスを鶏胎児細胞上に広げた。２日後、寒天及び１
−につき６０ｍｇのＸ−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を
含有する培地の第二層を添加した。この方法により、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込み、かつ発現するウ
ィルスを含有する青色領域が認識できた。
この方法で認識された多数の組換えウィルスのうち、一
つの領域を単離し、ウィルスを再クローン化し、次いで
増幅し、これをＶＶ、ＴＧ、ｈｒβｇａ１゜２１３１と
命名した。数種の細胞型についてこのウィルスの宿主ス
ペクトル（ｈｏｓｔ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を試験した
結果、該ウィルスは、ウサギＲＫ１３細胞及びヒト１４
３ Ｂ ｔ ｋ−細胞上で増殖しないことが明らかにさ
れた。この表現型は、ｈｒ遺伝子を失ったウィルスにつ
いて予期されるものに相当する。一方、ＶＶ、ＴＧ、ｈ
ｒβｇａ１．２１３１ウイルスはヒトＨｅｐＩＩ細胞上
で生育できる。
つの領域を単離し、ウィルスを再クローン化し、次いで
増幅し、これをＶＶ、ＴＧ、ｈｒβｇａ１゜２１３１と
命名した。数種の細胞型についてこのウィルスの宿主ス
ペクトル（ｈｏｓｔ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を試験した
結果、該ウィルスは、ウサギＲＫ１３細胞及びヒト１４
３ Ｂ ｔ ｋ−細胞上で増殖しないことが明らかにさ
れた。この表現型は、ｈｒ遺伝子を失ったウィルスにつ
いて予期されるものに相当する。一方、ＶＶ、ＴＧ、ｈ
ｒβｇａ１．２１３１ウイルスはヒトＨｅｐＩＩ細胞上
で生育できる。
２、感温性ｈｒβｇａ１表現型のウィルスの構築ｔｓ表
現型を持ち、ｈｒ遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
により置換されているウィルスを得るために、変異体Ｖ
Ｖ ｔｓＮ７及びウィルスＶＶ、ＴＧ、ｈｒβｇａ１
．２１３１を用いて、鶏胎児細胞を混合感染させた。１
細胞にっき５ｕｆｐの各ウィルスで感染の後、３３℃に
て１日細胞をインキュベートした。次いで、細胞を凍結
させた後、解凍し、解凍物を３３℃にて鶏胎児細胞上で
滴定した。
現型を持ち、ｈｒ遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
により置換されているウィルスを得るために、変異体Ｖ
Ｖ ｔｓＮ７及びウィルスＶＶ、ＴＧ、ｈｒβｇａ１
．２１３１を用いて、鶏胎児細胞を混合感染させた。１
細胞にっき５ｕｆｐの各ウィルスで感染の後、３３℃に
て１日細胞をインキュベートした。次いで、細胞を凍結
させた後、解凍し、解凍物を３３℃にて鶏胎児細胞上で
滴定した。
３３°Ｃにて２日後、感染細胞をニュートラルレッドで
染色し、更に２０間３９．５℃にて移入させた。最後の
２日間生育しなかったウィルス領域は、明らかにｔｓ型
ウィルスである。このウィルスの内約４０を再度取り出
し、増幅させ、次いで、ｔｓ特性及びＸ−ｇａｌの存在
下における青色領域形成能についてスクリーニングした
。この方法で、５個のｔｓβｇ ａｌｈｒ組換え体を同
定し、このうちの−”）ＶＶ、ＴＧ、 ｔ ｓβｇ ａ
ｌｈｒ、 １を再クローン化し、下記の実験に用いた
。
染色し、更に２０間３９．５℃にて移入させた。最後の
２日間生育しなかったウィルス領域は、明らかにｔｓ型
ウィルスである。このウィルスの内約４０を再度取り出
し、増幅させ、次いで、ｔｓ特性及びＸ−ｇａｌの存在
下における青色領域形成能についてスクリーニングした
。この方法で、５個のｔｓβｇ ａｌｈｒ組換え体を同
定し、このうちの−”）ＶＶ、ＴＧ、 ｔ ｓβｇ ａ
ｌｈｒ、 １を再クローン化し、下記の実験に用いた
。
３、ｈｒ遺伝子を置換することによる、ワクシニアウィ
ルスのゲノム中に如何なる遺伝子をも組込める様にデザ
インされたベクタープラスミドの構その天然隣接配列に
より各サイドをフレームされたワタシニアウィルスのｈ
ｒｉ伝子をバクテリアのプラスミドｐＵＣ７中でクロー
ン化した。この構造をｐＢＡＣＤ２と命名した。該プラ
スミドにおいて、ｈｒ遺伝子を修飾し、その両端をＸ）
］ｏＩサイト及びＢｇｌＩＩサイトにした。
ルスのゲノム中に如何なる遺伝子をも組込める様にデザ
インされたベクタープラスミドの構その天然隣接配列に
より各サイドをフレームされたワタシニアウィルスのｈ
ｒｉ伝子をバクテリアのプラスミドｐＵＣ７中でクロー
ン化した。この構造をｐＢＡＣＤ２と命名した。該プラ
スミドにおいて、ｈｒ遺伝子を修飾し、その両端をＸ）
］ｏＩサイト及びＢｇｌＩＩサイトにした。
ＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩでｐＢＡＣＤ２を切断すること
により、ｈｒ遺伝子を欠失させた。次いで、５ａｌＩ及
びＢｇｌＩＩサイトで取り囲まれた７、５Ｋｄプロモー
ター（Ｍ１３ＴＧ２１１９由来）をそこに挿入した。得
られたプラスミドをｐＴＧ２１４１と命名した。このプ
ラスミドにおいて７．５Ｋｄプロモーターは、ワタシニ
アウィルスゲノムで採用されている取り決めに従って、
左から右に方向付けされている。選択された組込みモー
ドは、該プロモーターの上流のＸｈｏＩサイトを欠失さ
せる作用及び下流にＢｇｌＩＩサイトを保持する作用を
もつ。
により、ｈｒ遺伝子を欠失させた。次いで、５ａｌＩ及
びＢｇｌＩＩサイトで取り囲まれた７、５Ｋｄプロモー
ター（Ｍ１３ＴＧ２１１９由来）をそこに挿入した。得
られたプラスミドをｐＴＧ２１４１と命名した。このプ
ラスミドにおいて７．５Ｋｄプロモーターは、ワタシニ
アウィルスゲノムで採用されている取り決めに従って、
左から右に方向付けされている。選択された組込みモー
ドは、該プロモーターの上流のＸｈｏＩサイトを欠失さ
せる作用及び下流にＢｇｌＩＩサイトを保持する作用を
もつ。
ｐＵＣ７部分の末端にあるＥｃｏＲＩサイトを除去する
ために、ｐＴＧ２１４１プラスミドを修飾した。かくし
て、プラスミドを一度だけ切断するように、限界濃度の
ＥｃｏＲＩでｐＴＧ２１４１のプラスミド性ＤＮＡを消
化した。線状化したベクターを単離し、４種のヌクレオ
チドトリホスフェートの存在下にＤＮＡポリメラーゼの
クレノーフラグメントで滴定し、次いで、リガーゼで閉
環した。大腸菌細胞を形質転換後、１つのＥｃｏＲＩサ
イトのみを有するプラスミドを単離し、これをＥｃｏＲ
Ｉで同様に処理し、ＥｃｏＲＩサイトの無い他のプラス
ミドを生成し、ｐＴＧ２１４１−ＥｃｏＲＩとした。
ために、ｐＴＧ２１４１プラスミドを修飾した。かくし
て、プラスミドを一度だけ切断するように、限界濃度の
ＥｃｏＲＩでｐＴＧ２１４１のプラスミド性ＤＮＡを消
化した。線状化したベクターを単離し、４種のヌクレオ
チドトリホスフェートの存在下にＤＮＡポリメラーゼの
クレノーフラグメントで滴定し、次いで、リガーゼで閉
環した。大腸菌細胞を形質転換後、１つのＥｃｏＲＩサ
イトのみを有するプラスミドを単離し、これをＥｃｏＲ
Ｉで同様に処理し、ＥｃｏＲＩサイトの無い他のプラス
ミドを生成し、ｐＴＧ２１４１−ＥｃｏＲＩとした。
得られたプラスミドをＢｇｌｌＩで開裂し、ＢｇｌＩＩ
及びＢａｍＨＩサイトでフレームされているＰｏ１ｙＩ
Ｉ（参考資料１３）ベクター由来であるアダプターＤＮ
Ａセグメントを挿入した；この構造をｐＴＧ２１４７と
する。従って、ｐＴＧ２１４７ベクターは、どんな遺伝
子でも組込める一連の制限部位が後に続くプロモーター
領域（ｐ７．５Ｋｄ）を有する。このベクターの構築に
おける種々のステップを第９図に図示する。
及びＢａｍＨＩサイトでフレームされているＰｏ１ｙＩ
Ｉ（参考資料１３）ベクター由来であるアダプターＤＮ
Ａセグメントを挿入した；この構造をｐＴＧ２１４７と
する。従って、ｐＴＧ２１４７ベクターは、どんな遺伝
子でも組込める一連の制限部位が後に続くプロモーター
領域（ｐ７．５Ｋｄ）を有する。このベクターの構築に
おける種々のステップを第９図に図示する。
４、ツクシニアウィルスゲノムにおけるｈｒ遺伝子の置
換による麻疹ウィルスのＦ遺伝子の組込みプラスミドｐ
ＴＧ２１４７を酵素ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲｌで開裂し
、そこにｐＴＧ１１７３山来であり、麻疹ウィルスのＦ
蛋白質をコードするＤＮＡフラグメントＢｇｌＩＩ −
ＥｃｏＲＩを挿入した。
換による麻疹ウィルスのＦ遺伝子の組込みプラスミドｐ
ＴＧ２１４７を酵素ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲｌで開裂し
、そこにｐＴＧ１１７３山来であり、麻疹ウィルスのＦ
蛋白質をコードするＤＮＡフラグメントＢｇｌＩＩ −
ＥｃｏＲＩを挿入した。
・麻疹ウィルスのＦ遺伝子によりウィルスＶＶ、ＴＧ。
ｔｉｒβｇａ１．２１３１中のβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子を置換させるため、得られたプラスミドｐＴＧ２１
４８を用いた。
伝子を置換させるため、得られたプラスミドｐＴＧ２１
４８を用いた。
このため、鶏胎児細胞をウィルスＶＶ、ＴＧ。
ｔｓβｇ ａｌｈｒ、 １で感染させ、プラスミドｐ
ＴＧ２１４８及びウィルスＶＶ、ＴＧ、ｈｒβｇａ１．
２１３１から精製されたＤＮＡを用いて、トランスフェ
クトさせた。細胞を３９．５℃にて、４８時間培養後、
１％寒天を含有する培地の下に、実験で得られた非感温
性ウィルスを鶏胎児細胞上に広げた。
ＴＧ２１４８及びウィルスＶＶ、ＴＧ、ｈｒβｇａ１．
２１３１から精製されたＤＮＡを用いて、トランスフェ
クトさせた。細胞を３９．５℃にて、４８時間培養後、
１％寒天を含有する培地の下に、実験で得られた非感温
性ウィルスを鶏胎児細胞上に広げた。
２０後、寒天及び１−につきＸ ｇａ１６０ｍｇを含
有する培地を添加し、青色を早さない領域のウィルスを
再度取り出し、増幅した。
有する培地を添加し、青色を早さない領域のウィルスを
再度取り出し、増幅した。
得られたウィルスが、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を持
つ非感温性ウィルスと麻疹ウィルスのＦ遺伝子を持つプ
ラスミドとの組換えにより生成したものであることは、
明らかである。事実、この実験により得られる組換えウ
ィルスＶＶ、ＴＧ、ＰＭ２１４８は、上記で用いられた
蛍光抗体法の判断基準によれば、感染された細胞におい
てＦ蛋白質の合成を誘発する。
つ非感温性ウィルスと麻疹ウィルスのＦ遺伝子を持つプ
ラスミドとの組換えにより生成したものであることは、
明らかである。事実、この実験により得られる組換えウ
ィルスＶＶ、ＴＧ、ＰＭ２１４８は、上記で用いられた
蛍光抗体法の判断基準によれば、感染された細胞におい
てＦ蛋白質の合成を誘発する。
実施例１０ ゲノムの２つの異なる領域に麻疹ウィルス
の蛋白質ＨＡおよびＦをコードする遺伝子Ｔｋおよびｈ
ｒを有するワクシニアのウィルスの組換え体の構築 ワクシニアのＴｋ遺伝子に代えてＨＡ遺伝子を、またワ
クシニアのｈｒ遺伝子に代えてＦ遺伝子を有する新規な
組換えウィルスを選択した。
の蛋白質ＨＡおよびＦをコードする遺伝子Ｔｋおよびｈ
ｒを有するワクシニアのウィルスの組換え体の構築 ワクシニアのＴｋ遺伝子に代えてＨＡ遺伝子を、またワ
クシニアのｈｒ遺伝子に代えてＦ遺伝子を有する新規な
組換えウィルスを選択した。
雌鶏の胚細胞をウィルスＶＶ、ＴＧ、ＦＭ２１４ｇおよ
びウィルスＶＶ、ＴＧ、ＨＡＭ２−２により同時感染さ
せた。感染２４時間後の細胞を凍結し、解凍し、次いで
５′−ブロモデオキシウリジンの存在下に、溶解産物を
種々の希釈度でＬＴｋ−細胞上に散布した。この第１ス
テツプにより、Ｔｋ遺伝子に組込まれたＨＡ遺伝子を保
持しているＴｋ″″組換えウィルスを選択することが出
来た。
びウィルスＶＶ、ＴＧ、ＨＡＭ２−２により同時感染さ
せた。感染２４時間後の細胞を凍結し、解凍し、次いで
５′−ブロモデオキシウリジンの存在下に、溶解産物を
種々の希釈度でＬＴｋ−細胞上に散布した。この第１ス
テツプにより、Ｔｋ遺伝子に組込まれたＨＡ遺伝子を保
持しているＴｋ″″組換えウィルスを選択することが出
来た。
雌鶏の胚細胞をこのステップ中に単離された領域からの
ウィルスにより感染させた。培養２日後に、細胞を中性
赤により染色し、ｈｒ表現型の特徴的外観を示す領域を
再び取り上げ、雌鶏の胚細胞の感染により、ウィルスの
増殖を行なった。
ウィルスにより感染させた。培養２日後に、細胞を中性
赤により染色し、ｈｒ表現型の特徴的外観を示す領域を
再び取り上げ、雌鶏の胚細胞の感染により、ウィルスの
増殖を行なった。
単離された多数の組換えウィルス中の一つを保持し、こ
れをＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡ、／Ｔｋ、Ｆ／ｈｒと命名した
。このウィルスは、前述の免疫螢光検査基準によれば、
Ｆ蛋白質およびＨＡ蛋白質の合成を誘発した。
れをＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡ、／Ｔｋ、Ｆ／ｈｒと命名した
。このウィルスは、前述の免疫螢光検査基準によれば、
Ｆ蛋白質およびＨＡ蛋白質の合成を誘発した。
実施例１１ 麻疹ウィルスのＮＰ遺伝子を含み、対応す
る蛋白質を発現し得るワクシニアウィルスの２つの組換
え体の構築 麻疹のウィルス（ハレ（Ｈａｌｌｅ）株）に感染したベ
ロ（Ｖｃｒｏ）細胞のＲＮＡから作られたｃＤＮＡバン
クをベクターｐＣＤ中に構築した（参考資料２．３）。
る蛋白質を発現し得るワクシニアウィルスの２つの組換
え体の構築 麻疹のウィルス（ハレ（Ｈａｌｌｅ）株）に感染したベ
ロ（Ｖｃｒｏ）細胞のＲＮＡから作られたｃＤＮＡバン
クをベクターｐＣＤ中に構築した（参考資料２．３）。
ゴレッキ及びローゼンブラット（Ｇｏｒｅｃｋｉ ａｎ
ｄ Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ ）の方法に従って（参考
資料１４） 、ｃＤＮＡ相同体を使用するハイブリダイ
ゼイションにより、核蛋白質（ＮＰ）をコードするｃＤ
ＮＡを選択した。ベクターｐｃＤｌ中でクローン化され
た、核蛋白質（Ｎ Ｐ）をコードするこのｃＤＮＡは、
プラスミドｐＣＤＮＰを与えた。
ｄ Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ ）の方法に従って（参考
資料１４） 、ｃＤＮＡ相同体を使用するハイブリダイ
ゼイションにより、核蛋白質（ＮＰ）をコードするｃＤ
ＮＡを選択した。ベクターｐｃＤｌ中でクローン化され
た、核蛋白質（Ｎ Ｐ）をコードするこのｃＤＮＡは、
プラスミドｐＣＤＮＰを与えた。
ハレ株のＮＰ遺伝子のヌクレオチド配列の決定の結果、
ローゼンブラットら（参考資料１５）により発表されて
いる麻疹ウィルスからの他の単離物のＮＰ遺伝子の配列
との近い関係が明らかとなった。しかしながら、ローゼ
ンブラット配列では、１４８９位に付加的なＧがあるこ
と注目され、このことは、カッタネオら（Ｃａｔｔａｎ
ｅｏ ｅｔ ａｌ ）によっても、確認されている。こ
の修正は、カルボキシ末端での２９個のアミノ酸につい
て公表されている読み枠を変えるものである。
ローゼンブラットら（参考資料１５）により発表されて
いる麻疹ウィルスからの他の単離物のＮＰ遺伝子の配列
との近い関係が明らかとなった。しかしながら、ローゼ
ンブラット配列では、１４８９位に付加的なＧがあるこ
と注目され、このことは、カッタネオら（Ｃａｔｔａｎ
ｅｏ ｅｔ ａｌ ）によっても、確認されている。こ
の修正は、カルボキシ末端での２９個のアミノ酸につい
て公表されている読み枠を変えるものである。
さらに、これまでに発表されていないＮＰ遺伝子の５′
末端の配列も、下記の局部的な突然変異誘発を容易なら
しめるために、決定された。ＮＰ蛋白質（約１６２０個
のヌクレオチド）をコードするｃＤＮＡが、酵素Ｐｓｔ
ｌおよびＸｂａｌにより切り出され、同じ酵素により開
かれたベクターＭ１３ＴＧ１３１に挿入され、ファージ
Ｍ １３ Ｔ Ｇ１３１が得られた。ＮＰをコードし且
つＭ１３ＴＧ２１２４により保持されたｃＤＮＡは、Ｎ
Ｐ遺伝子の第１のコドンからヌクレオチド３個分上流に
ＢｇｌＩＩ部位を導入するために、下記のオリゴヌクレ
オチドにより、定方向突然変異を起こされる。
末端の配列も、下記の局部的な突然変異誘発を容易なら
しめるために、決定された。ＮＰ蛋白質（約１６２０個
のヌクレオチド）をコードするｃＤＮＡが、酵素Ｐｓｔ
ｌおよびＸｂａｌにより切り出され、同じ酵素により開
かれたベクターＭ１３ＴＧ１３１に挿入され、ファージ
Ｍ １３ Ｔ Ｇ１３１が得られた。ＮＰをコードし且
つＭ１３ＴＧ２１２４により保持されたｃＤＮＡは、Ｎ
Ｐ遺伝子の第１のコドンからヌクレオチド３個分上流に
ＢｇｌＩＩ部位を導入するために、下記のオリゴヌクレ
オチドにより、定方向突然変異を起こされる。
ＣＣＴＴＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣ’Ｉ”ｌ”Ａ
ＧＡＴｃＴＣＣＣＴＡＡＴＣＣＴＧＣＴにの様に修飾さ
れたＮＰ遺伝子は、新たに形成されたＢｇｌｎ部位およ
びＮＰ遺伝子の３′末端に位置するＥｃｏＲＩ部位を利
用して、変位せしめられたファージ（Ｍｌ ３ＴＧ２１
２６と呼ばれる）から切り出される。
ＧＡＴｃＴＣＣＣＴＡＡＴＣＣＴＧＣＴにの様に修飾さ
れたＮＰ遺伝子は、新たに形成されたＢｇｌｎ部位およ
びＮＰ遺伝子の３′末端に位置するＥｃｏＲＩ部位を利
用して、変位せしめられたファージ（Ｍｌ ３ＴＧ２１
２６と呼ばれる）から切り出される。
次いで、ＮＰをコードするＢｇｌＩＩ −ＥｃｏＲＩフ
ラグメントは、あらかじめＢａａ＋ＨＩおよびＥｃｏＲ
Ｉにより開裂されたポリｐＴＧ１８６ベクター（参考資
料１３）に保持された７、５Ｋｄプロモーターの下流側
に挿入され、プラスミドｐＴ０２１３９を形成する。上
記のクローニングのためにＸ ｂａ１部位を使用するこ
とにより、ＮＰ遺伝子から一つのコドンが除去され、一
つの融合遺伝子が形成される。この融合遺伝子では、最
後の２２個のコドンの一部は、使用したＭ１３ベクター
に由来し、一部は、ワクチンのウィルスのＴｋ遺伝子に
出来する。
ラグメントは、あらかじめＢａａ＋ＨＩおよびＥｃｏＲ
Ｉにより開裂されたポリｐＴＧ１８６ベクター（参考資
料１３）に保持された７、５Ｋｄプロモーターの下流側
に挿入され、プラスミドｐＴ０２１３９を形成する。上
記のクローニングのためにＸ ｂａ１部位を使用するこ
とにより、ＮＰ遺伝子から一つのコドンが除去され、一
つの融合遺伝子が形成される。この融合遺伝子では、最
後の２２個のコドンの一部は、使用したＭ１３ベクター
に由来し、一部は、ワクチンのウィルスのＴｋ遺伝子に
出来する。
ｐＴＧ２１３９に類似するが完全なＮＰ遺伝子を含むと
ともに他に出来するコドンを欠く構造を得るために、酵
素ＸｂａｌおよびＨｐａｌにより、ｐＣＤＮＰからＮＰ
遺伝子の末端カルボキシ部分が切り出され、得られたフ
ラグメントが、Ｘ ｂａｌおよびＳｍａｌにより開裂さ
れたＭ１３７Ｇ２１２６に挿入され、Ｍ１３ＴＧ２１４
２が得られる。次いで、ＮＰをコードする完全なｃＤＮ
Ａが、ＢｇｌｌＩ−ＥｃｏＲＩによりＭ１３ＴＧ２１４
２から取り出され、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより
開裂されたｐＴＧ１８６ポリに挿入される。これのクロ
ーニングにより、得られたプラスミドは、ｐＴＧ３１０
９と呼ばれる。ベクターｐＴＧ２１３９およびｐＴＧ３
１０９の構築における異なるステップは、概略的に第１
０図に示されている。
ともに他に出来するコドンを欠く構造を得るために、酵
素ＸｂａｌおよびＨｐａｌにより、ｐＣＤＮＰからＮＰ
遺伝子の末端カルボキシ部分が切り出され、得られたフ
ラグメントが、Ｘ ｂａｌおよびＳｍａｌにより開裂さ
れたＭ１３７Ｇ２１２６に挿入され、Ｍ１３ＴＧ２１４
２が得られる。次いで、ＮＰをコードする完全なｃＤＮ
Ａが、ＢｇｌｌＩ−ＥｃｏＲＩによりＭ１３ＴＧ２１４
２から取り出され、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより
開裂されたｐＴＧ１８６ポリに挿入される。これのクロ
ーニングにより、得られたプラスミドは、ｐＴＧ３１０
９と呼ばれる。ベクターｐＴＧ２１３９およびｐＴＧ３
１０９の構築における異なるステップは、概略的に第１
０図に示されている。
切断された（プラスミドｐＴＧ２１３９）または完全な
（プラスミドｐＴＧ３１０９）ＮＰ遺伝子は、実施例３
に示す手法により、ワクチンのウィルスのゲノム内に移
された。これらの操作により得られたワクチンのウィル
スの２種の組換え体は、それぞれＶＶ、ＴＧ、ＮＰ２１
３９およびＶＶ、ＴＧ、ＮＰ３１０９と命名された。
（プラスミドｐＴＧ３１０９）ＮＰ遺伝子は、実施例３
に示す手法により、ワクチンのウィルスのゲノム内に移
された。これらの操作により得られたワクチンのウィル
スの２種の組換え体は、それぞれＶＶ、ＴＧ、ＮＰ２１
３９およびＶＶ、ＴＧ、ＮＰ３１０９と命名された。
これらが、麻疹ウィルスのＮＰ蛋白質を効果的にコード
していることを確認するために、マウスのし細胞に感染
させ、１６時間後に抗ＮＰモノクローナル抗体を使用す
る免疫螢光検査法により、分析を行なった。この反応に
より、２種の組換ウィルスに感染した細胞の細胞質およ
び核内にＮＰ抗原が存在することが、明確に示された。
していることを確認するために、マウスのし細胞に感染
させ、１６時間後に抗ＮＰモノクローナル抗体を使用す
る免疫螢光検査法により、分析を行なった。この反応に
より、２種の組換ウィルスに感染した細胞の細胞質およ
び核内にＮＰ抗原が存在することが、明確に示された。
これに対し、ワクチンのウィルスの野生株による感染の
場合には、特定の免疫螢光は、示されなかった。
場合には、特定の免疫螢光は、示されなかった。
ＮＰ蛋白質の合成は、免疫沈降法とそれに引続いて行わ
れたポリアクリルアミドゲル上での電気泳動分析によっ
ても、確認された。この方法により、ＮＰ蛋白質につい
て予測された値に相当する約６０Ｋｄの蛋白質が、組換
体ＶＶ、ＴＧ、ＮＰ２１３９により感染された細胞中で
合成されていることが、明らかとなった（第１１図参照
）。
れたポリアクリルアミドゲル上での電気泳動分析によっ
ても、確認された。この方法により、ＮＰ蛋白質につい
て予測された値に相当する約６０Ｋｄの蛋白質が、組換
体ＶＶ、ＴＧ、ＮＰ２１３９により感染された細胞中で
合成されていることが、明らかとなった（第１１図参照
）。
４Ｘ１０ｕｆｐの組換体ＶＶ、ＴＧ、ＮＰ２１３９を含
むＢａ１ｂ／Ｃマウスの乱切により、麻疹のウィルスに
感染した細胞の蛋白質を免疫沈降させることが出来る抗
体の合成が行われた。
むＢａ１ｂ／Ｃマウスの乱切により、麻疹のウィルスに
感染した細胞の蛋白質を免疫沈降させることが出来る抗
体の合成が行われた。
本発明を特徴付ける系統の寄託
下記の菌株が、１９８７年４月３日にパリ、リュ デュ
ドクトゥール ルー２５のコレクシオン ナシオナル
ドウ クルチュール ドゥミクロオルガニスムに寄託
された。
ドクトゥール ルー２５のコレクシオン ナシオナル
ドウ クルチュール ドゥミクロオルガニスムに寄託
された。
番号ｌ−６５４： ５に／ｐＴＧ１１７Ｂ番号ｌ−６５
７ ： ５に／ｐＴＧ１１６９また、１９８８年６月１
７日に下記の菌株が寄託された。
７ ： ５に／ｐＴＧ１１６９また、１９８８年６月１
７日に下記の菌株が寄託された。
番号ｌ−７６９： ５に／ｐＴＧ３１０９参考資料
１）アペルら、“アーカイブス オン ヴイロロジー”
（Ａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ” ）８２．７３−８２ （１９８
４） ２）バックランドら、“ジャーナル オン ジェネラル
ヴイロロジー” （Ｂｕｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｔ、
“Ｊ。
（Ａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ” ）８２．７３−８２ （１９８
４） ２）バックランドら、“ジャーナル オン ジェネラル
ヴイロロジー” （Ｂｕｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｔ、
“Ｊ。
Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、” ｌ ６８． １６９５−１７
０３３）ジエラルドら、“ジャーナル オン ジェネラ
ル ヴイロロジー” （Ｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ、
“Ｊ、Ｇｅｎ。
０３３）ジエラルドら、“ジャーナル オン ジェネラ
ル ヴイロロジー” （Ｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ、
“Ｊ、Ｇｅｎ。
Ｖｉｒｏｌ、” ｌ ６８ （１９８６）４）ホールら
、“ヴイロロジー” （ｌｌａｌｌ ｏｔ ａｔ、“
Ｖｌｒｏｌｏｇｙ” ｌ １００．４３３−４４９５
）イマガワら、“プログレス イン メディカル ヴイ
ロロジー” （１ｍａｇａｗａ ｅｔ ａｔ、 ”Ｐｒ
ｏｇ、Ｍａｄ、Ｖｉｒｏｌ” ） ｖｏｌ、１０．
ｐｐ、 １６０−１９３ ｃｄ。
、“ヴイロロジー” （ｌｌａｌｌ ｏｔ ａｔ、“
Ｖｌｒｏｌｏｇｙ” ｌ １００．４３３−４４９５
）イマガワら、“プログレス イン メディカル ヴイ
ロロジー” （１ｍａｇａｗａ ｅｔ ａｔ、 ”Ｐｒ
ｏｇ、Ｍａｄ、Ｖｉｒｏｌ” ） ｖｏｌ、１０．
ｐｐ、 １６０−１９３ ｃｄ。
Ｋａｒｇｅｒ、Ｂａ５ｅｌ／Ｎｅｗ ＹＯＲＫ （１
９６８）６）キーニーら、“ジーン” （Ｋｉｅｎｙ
ｅｔ ａｔ。
９６８）６）キーニーら、“ジーン” （Ｋｉｅｎｙ
ｅｔ ａｔ。
”Ｇｅｎｅ” ｌ ２６． ９１−９９ （１９
８３）７）ノルビー、“ミーズルズ イン ヴイロロジ
ー” （Ｎｏｒｒｂｙ、Ｅ、 “）ｉｅａｓｌｃ
ｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ” ）ｅｄ、Ｂ
、Ｎ、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）５５．１３０５−１３２１
（１９８５）８）ツリーら、“インター ヴイロロジー
”（Ｎｏｒｒｙ ｅｔ ａｔ、 、”ｌｎｔｅｒｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ｌｌｌ ２３゜９）オーヴエルら、“ジ
ャーナル オン ジェネラル ヴイロロジー” （Ｏ
ｒｖｃｌｌ ｅｔ ａｔ、 “Ｊ、Ｃｃｎ。
８３）７）ノルビー、“ミーズルズ イン ヴイロロジ
ー” （Ｎｏｒｒｂｙ、Ｅ、 “）ｉｅａｓｌｃ
ｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ” ）ｅｄ、Ｂ
、Ｎ、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）５５．１３０５−１３２１
（１９８５）８）ツリーら、“インター ヴイロロジー
”（Ｎｏｒｒｙ ｅｔ ａｔ、 、”ｌｎｔｅｒｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ｌｌｌ ２３゜９）オーヴエルら、“ジ
ャーナル オン ジェネラル ヴイロロジー” （Ｏ
ｒｖｃｌｌ ｅｔ ａｔ、 “Ｊ、Ｃｃｎ。
Ｖｉｒｏｌ、“）５０，２３１−２４５ （１９８０）
１０）ヴアルサニイら、“ヴイロロジー“（Ｖａｒｓａ
ｎｙｉ ａｔ ａｔ、 ”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ” ）
１５７゜１１）ワイルドら、”ジャーナル オン メ
ディカル ヴイロロジー” （Ｇｅｒａｌｄ ｅｔ
ａｌ、 Ｊ、Ｇｃｎ。
１０）ヴアルサニイら、“ヴイロロジー“（Ｖａｒｓａ
ｎｙｉ ａｔ ａｔ、 ”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ” ）
１５７゜１１）ワイルドら、”ジャーナル オン メ
ディカル ヴイロロジー” （Ｇｅｒａｌｄ ｅｔ
ａｌ、 Ｊ、Ｇｃｎ。
Ｖｉｒｏｌ、” ）４，１０３−１１４ （１９７９）
１２）ジラードら、“プロシーデインゲス オンザ ナ
ショナル アカデミ−オン サイエンス オン ザ ニ
ーニス−１−−” （Ｇｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ“
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、−ＬＩＳＡ
” ｌ ８３． ５５７３１３）ラテら、“ジーン”
（Ｌａｔｈｅ ｅｔ ａｔ。
１２）ジラードら、“プロシーデインゲス オンザ ナ
ショナル アカデミ−オン サイエンス オン ザ ニ
ーニス−１−−” （Ｇｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ“
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、−ＬＩＳＡ
” ｌ ８３． ５５７３１３）ラテら、“ジーン”
（Ｌａｔｈｅ ｅｔ ａｔ。
“Ｇｅｎｅ” ）５７，１９３−２０１ （１９８７）
１４）ゴレッキら、“プロシーデインゲス オンザ ナ
ショナル アカデミ−オン サイエンス オン ザ ニ
ーニスニー” （Ｇｏｒｅｃｋｉ ａｔ ａｌ“Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、−ＵＳＡ”）７７
．３６８６１５）ローゼンブラットら、“ジャーナル
オンヴイロロジー” １Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ ｅｔ
ａｌ。
１４）ゴレッキら、“プロシーデインゲス オンザ ナ
ショナル アカデミ−オン サイエンス オン ザ ニ
ーニスニー” （Ｇｏｒｅｃｋｉ ａｔ ａｌ“Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、−ＵＳＡ”）７７
．３６８６１５）ローゼンブラットら、“ジャーナル
オンヴイロロジー” １Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ ｅｔ
ａｌ。
“Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、”） ５３，６８４−６９０ （
１９８５）１６）カッタネオら、′ジャーナル オン
ヴイロロジー” （Ｃａｔｔａｎｅｏ ｅｔ ａｌ、
”Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、” １６２．１３８８−１３９７
（１９８８）
１９８５）１６）カッタネオら、′ジャーナル オン
ヴイロロジー” （Ｃａｔｔａｎｅｏ ｅｔ ａｌ、
”Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、” １６２．１３８８−１３９７
（１９８８）
以下の図面は実施例を説明するものである：第１図：Ｈ
Ａ蛋白質をコードするｃＤＮＡのワクシニアウィルスゲ
ノムへの移入を可能ならしめるベクターの構築。 麻疹配列（ＨＡ麻疹）は、遺伝子翻訳の方向を示す矢印
を含む白抜きの弧によって示されている。 ｐＣＤベクターであり、Ｍ１３７Ｇ２１０１中およびＭ
１３ＴＧ２１０６中の大きいＢａｍＨＩ断片はベクター
Ｍ１３ＴＧ１３１である。工程３では、組換えプラスミ
ドＭ１３ＴＧ１２０７は示されていない。プラスミドｐ
ＴＧ１１６９において、小さいＨｉｎｄＩＩＩ断片はｐ
ＴＧＩＨに相当し、連続線はＴＫ遺伝子中で中断された
ワクシニアウィルスのＨｉｎｄｍＪ断片に、太い矢印は
７．５Ｋｄ蛋白質のプロモーターに相当する。 第２図：蛋白質ＦをコードするｃＤＮＡのワクシニアウ
ィルスゲノムへの移入を可能ならしめるベクターの構築
。 麻疹配列（Ｆ麻疹）は、翻訳方向を示す矢印を含む白抜
きの弧によって示されている。その他の記号は第１図で
用いたものと同じである。 第３図：ワクシニアウィルスの組換え体に感染した細胞
の中で合成され、免疫蛍光法により証明された麻疹ウィ
ルスの蛋白質ＨＡおよびＦ０パネルＡは、組換え体ＶＶ
、ＴＧ、ＨＡＭ２−２＋、：： ヨルＬＴＫ−細胞の感
染および抗ＨＡモノクローナル抗体との反応、それに続
くフルオレセイン標識抗マウス抗体との反応のあとに得
られた細胞膜免疫蛍光を示す。パネルＢは、組換え体Ｖ
Ｖ、ＴＧ、ＦＭＩＬ７３によるＬＴＫ″″細胞の感染お
よび抗Ｆモノクローナル抗体、それに続くフルオレセイ
ン標識抗マウス抗体との反応のあとに観察される免疫蛍
光を示す。 第４図：ワクシニアウィルスの組換え体に感染した細胞
の中で合成された麻疹ウィルスのＨＡおよびＦ蛋白質の
免疫沈降。 免疫沈降した蛋白質が沈積しているポリアクリルアミド
ゲルのオートラジオグラフィー。ＶＶ、ＴＧ。 ＨＡＭ２−２感染細胞中にヘマグルチニン（ＨＡ）が存
在し、ＶＶ、ＴＧ、ＦＭＬ１７３感染細胞中には融合蛋
白質（ＦＯ）およびその切断生成物Ｆ１とＦ２が存在す
る。 第５図：蛋白質ＦおよびＨＡをコードするｃＤＮＡのワ
クシニアウィルスゲノムへの移入を可能ならしめるベク
ターの（１η築。 記号は第１図および第２図で用いたものと同じである。 第６図：−上２２種の蛋白質をコードする組換え体ＶＶ
、ＴＧ、ＩＩＡＰＭ２１２２に感染した細胞の中で合成
された麻疹ウィルスのＨＡおよびＦ蛋白質の免疫沈降。 免疫沈降した蛋白質が沈積しているポリアクリルアミド
ゲルのオートラジオグラフィー。ＶＶ、ＴＧ。 ＦＭ１１７３ （カラム１ ）、ＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ
２−２ （カラム２）およびＶＶ、ＴＧ、ｌｌＡＦＭ２
１２２ （ｈ ラム） ｉ： ソｔＬ ツレ感染した細
胞の抽出物をモルモットポリクローナル血清を用いて免
疫沈降させた。組換え体ＶＶ、ＴＧ、ｌｌＡＦＭ２１２
２による感染後に予想される蛋白質ＨＡＳＦＯ１Ｆ１お
よびＦ２がカラム３に明瞭に現われている。 第７図：蛋白質ＦおよびＨＡをコードするｃＤＮＡのワ
クシニアウィルスゲノムへの移入を可能ならしめる第二
のベクターの構築。 蛋白質ＨＡおよびＦをコードする麻疹ウィルスの配列は
、ＨＡおよびＦの記号を付された円弧により示されてい
る。それら遺伝子は矢印が示す方向をとっている。ワク
シニアウィルスのＦ７．５Ｋｄプロモーターは太い矢印
により図式的に示されている。Ｈ１ｎｄＩＩＩ部位には
さまれたＤＮＡ領域は、細菌ベクターｐＴＧＩＨに対応
する。この細菌ベクターの一ト流および下流に、ワクシ
ニアウィルスのＨｉｎｄＵＩＪ断片の左手側部分および
右手側部分がそれぞれ一重円弧によって示されている。 記号ＢＯは、ＢａｌＩＩ部位がＢａｍＨＩ部位との結合
によって融合している位置を示す。 第８図：大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｔ）のβ−ガラクトシダ
ーゼをコードする遺伝子をワクシニアウィルスゲノム中
のｈｒ遺伝子のところへ移入するのを可能ならしめるベ
クターの構築。 ｐＵＣ７細菌ベクターに相当する部分が一本線の円弧で
示されている。ＢａｌＩＩ部位の両側に位置するワクシ
ニアウィルスのＤＮＡ部位の配列は円弧または二重線に
より示されていて、３０Ｋｄおよび５０Ｋｄ （Ｂａｌ
ＩＩ部位の左）または４２Ｋｄ（Ｂ ａｔ ＩＩ部位の
右）の蛋白質をコードするゲノムの領域に対応する。β
−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子はＩａｃ Ｚの
記号を付されており、そのオリエンテーションはＦ７．
５Ｋｄプロモーターとの関連で示されている。後者は太
い矢印で示されている。記号ＢＯは、ＢａｌＩＩ部位が
ＢａｍＨＩ部位との結合によって融合してしまった個所
を示す。 第９図：麻疹ウィルスのＦ蛋白質をコードする遺伝子を
ワクシニアウィルスゲノム中のｈｒ遺伝子のところへ移
入するのを可能ならしめるベクターの構築。 記号は第８図で用いたものと同じである。記号ＥＯは、
ベクターＥｃｏＲＩ部位が除去された個所を示す。ベク
ターｐＴＧ２１４７のＢａｌＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位
との間に位置する領域は、アダプターセグメントに相当
する。蛋白質をコードする麻疹遺伝子は二重線の円弧で
示されており、麻疹Ｆ（Ｆ−ＭＥＡＳＬＥＳ）の記号を
付されている。 第１０図：麻疹ウィルスのＮＰ蛋白質のワクシニアウィ
ルスゲノムへの移入を可能ならしめる２種のベクターの
構築。 プラスミドｐＣＤＮＰにおいて、−本線の円弧はｐＣＤ
部分を表わしている。Ｍ１３の記号を付されたプラスミ
ドでは、−本線領域がＭ１３ＴＧ１３１部分を表わす。 ｐＴＧプラスミドは、先行の諸量と同様に図式的に示さ
れている。結合（ライゲーション）により破壊された部
位は、ＢａｌＩＩ部位のＢａｍＨＩ部位への融合の場合
ＢＯなる記号で、Ｓ ｍａ Ｉ部位のＨｐａＩ部位への
融合の場合Ｓｍａ■０なる記号で示されている。 第１１図：ウィルスＶＶ、ＴＧ、２１３９に感染した細
胞中のＮＰ蛋白質の証明。 ワクシニアウィルスの野生株（記号Ｔのトラック）また
は組換え体ＶＶ、ＴＧ、２１３９の単離株（記号１．２
および３）に感染させたＢＨＫ２１ハムスター細胞の溶
解産物を、モルモットポリクローナル血清を用いて免疫
沈降させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析
した。ゲルのオートラジオグラフィーは、ウィルスＶＶ
、ＴＧ、２１３９に感染した細胞の試料中にのみ、ＮＰ
蛋白質（６０Ｋｄ）が存在することを示す。 （以 上） Ｎ ＶＶＷ２１３９ Ｔ １２３ ｉＧ−１ｉ
Ａ蛋白質をコードするｃＤＮＡのワクシニアウィルスゲ
ノムへの移入を可能ならしめるベクターの構築。 麻疹配列（ＨＡ麻疹）は、遺伝子翻訳の方向を示す矢印
を含む白抜きの弧によって示されている。 ｐＣＤベクターであり、Ｍ１３７Ｇ２１０１中およびＭ
１３ＴＧ２１０６中の大きいＢａｍＨＩ断片はベクター
Ｍ１３ＴＧ１３１である。工程３では、組換えプラスミ
ドＭ１３ＴＧ１２０７は示されていない。プラスミドｐ
ＴＧ１１６９において、小さいＨｉｎｄＩＩＩ断片はｐ
ＴＧＩＨに相当し、連続線はＴＫ遺伝子中で中断された
ワクシニアウィルスのＨｉｎｄｍＪ断片に、太い矢印は
７．５Ｋｄ蛋白質のプロモーターに相当する。 第２図：蛋白質ＦをコードするｃＤＮＡのワクシニアウ
ィルスゲノムへの移入を可能ならしめるベクターの構築
。 麻疹配列（Ｆ麻疹）は、翻訳方向を示す矢印を含む白抜
きの弧によって示されている。その他の記号は第１図で
用いたものと同じである。 第３図：ワクシニアウィルスの組換え体に感染した細胞
の中で合成され、免疫蛍光法により証明された麻疹ウィ
ルスの蛋白質ＨＡおよびＦ０パネルＡは、組換え体ＶＶ
、ＴＧ、ＨＡＭ２−２＋、：： ヨルＬＴＫ−細胞の感
染および抗ＨＡモノクローナル抗体との反応、それに続
くフルオレセイン標識抗マウス抗体との反応のあとに得
られた細胞膜免疫蛍光を示す。パネルＢは、組換え体Ｖ
Ｖ、ＴＧ、ＦＭＩＬ７３によるＬＴＫ″″細胞の感染お
よび抗Ｆモノクローナル抗体、それに続くフルオレセイ
ン標識抗マウス抗体との反応のあとに観察される免疫蛍
光を示す。 第４図：ワクシニアウィルスの組換え体に感染した細胞
の中で合成された麻疹ウィルスのＨＡおよびＦ蛋白質の
免疫沈降。 免疫沈降した蛋白質が沈積しているポリアクリルアミド
ゲルのオートラジオグラフィー。ＶＶ、ＴＧ。 ＨＡＭ２−２感染細胞中にヘマグルチニン（ＨＡ）が存
在し、ＶＶ、ＴＧ、ＦＭＬ１７３感染細胞中には融合蛋
白質（ＦＯ）およびその切断生成物Ｆ１とＦ２が存在す
る。 第５図：蛋白質ＦおよびＨＡをコードするｃＤＮＡのワ
クシニアウィルスゲノムへの移入を可能ならしめるベク
ターの（１η築。 記号は第１図および第２図で用いたものと同じである。 第６図：−上２２種の蛋白質をコードする組換え体ＶＶ
、ＴＧ、ＩＩＡＰＭ２１２２に感染した細胞の中で合成
された麻疹ウィルスのＨＡおよびＦ蛋白質の免疫沈降。 免疫沈降した蛋白質が沈積しているポリアクリルアミド
ゲルのオートラジオグラフィー。ＶＶ、ＴＧ。 ＦＭ１１７３ （カラム１ ）、ＶＶ、ＴＧ、ＩＩＡＭ
２−２ （カラム２）およびＶＶ、ＴＧ、ｌｌＡＦＭ２
１２２ （ｈ ラム） ｉ： ソｔＬ ツレ感染した細
胞の抽出物をモルモットポリクローナル血清を用いて免
疫沈降させた。組換え体ＶＶ、ＴＧ、ｌｌＡＦＭ２１２
２による感染後に予想される蛋白質ＨＡＳＦＯ１Ｆ１お
よびＦ２がカラム３に明瞭に現われている。 第７図：蛋白質ＦおよびＨＡをコードするｃＤＮＡのワ
クシニアウィルスゲノムへの移入を可能ならしめる第二
のベクターの構築。 蛋白質ＨＡおよびＦをコードする麻疹ウィルスの配列は
、ＨＡおよびＦの記号を付された円弧により示されてい
る。それら遺伝子は矢印が示す方向をとっている。ワク
シニアウィルスのＦ７．５Ｋｄプロモーターは太い矢印
により図式的に示されている。Ｈ１ｎｄＩＩＩ部位には
さまれたＤＮＡ領域は、細菌ベクターｐＴＧＩＨに対応
する。この細菌ベクターの一ト流および下流に、ワクシ
ニアウィルスのＨｉｎｄＵＩＪ断片の左手側部分および
右手側部分がそれぞれ一重円弧によって示されている。 記号ＢＯは、ＢａｌＩＩ部位がＢａｍＨＩ部位との結合
によって融合している位置を示す。 第８図：大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｔ）のβ−ガラクトシダ
ーゼをコードする遺伝子をワクシニアウィルスゲノム中
のｈｒ遺伝子のところへ移入するのを可能ならしめるベ
クターの構築。 ｐＵＣ７細菌ベクターに相当する部分が一本線の円弧で
示されている。ＢａｌＩＩ部位の両側に位置するワクシ
ニアウィルスのＤＮＡ部位の配列は円弧または二重線に
より示されていて、３０Ｋｄおよび５０Ｋｄ （Ｂａｌ
ＩＩ部位の左）または４２Ｋｄ（Ｂ ａｔ ＩＩ部位の
右）の蛋白質をコードするゲノムの領域に対応する。β
−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子はＩａｃ Ｚの
記号を付されており、そのオリエンテーションはＦ７．
５Ｋｄプロモーターとの関連で示されている。後者は太
い矢印で示されている。記号ＢＯは、ＢａｌＩＩ部位が
ＢａｍＨＩ部位との結合によって融合してしまった個所
を示す。 第９図：麻疹ウィルスのＦ蛋白質をコードする遺伝子を
ワクシニアウィルスゲノム中のｈｒ遺伝子のところへ移
入するのを可能ならしめるベクターの構築。 記号は第８図で用いたものと同じである。記号ＥＯは、
ベクターＥｃｏＲＩ部位が除去された個所を示す。ベク
ターｐＴＧ２１４７のＢａｌＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位
との間に位置する領域は、アダプターセグメントに相当
する。蛋白質をコードする麻疹遺伝子は二重線の円弧で
示されており、麻疹Ｆ（Ｆ−ＭＥＡＳＬＥＳ）の記号を
付されている。 第１０図：麻疹ウィルスのＮＰ蛋白質のワクシニアウィ
ルスゲノムへの移入を可能ならしめる２種のベクターの
構築。 プラスミドｐＣＤＮＰにおいて、−本線の円弧はｐＣＤ
部分を表わしている。Ｍ１３の記号を付されたプラスミ
ドでは、−本線領域がＭ１３ＴＧ１３１部分を表わす。 ｐＴＧプラスミドは、先行の諸量と同様に図式的に示さ
れている。結合（ライゲーション）により破壊された部
位は、ＢａｌＩＩ部位のＢａｍＨＩ部位への融合の場合
ＢＯなる記号で、Ｓ ｍａ Ｉ部位のＨｐａＩ部位への
融合の場合Ｓｍａ■０なる記号で示されている。 第１１図：ウィルスＶＶ、ＴＧ、２１３９に感染した細
胞中のＮＰ蛋白質の証明。 ワクシニアウィルスの野生株（記号Ｔのトラック）また
は組換え体ＶＶ、ＴＧ、２１３９の単離株（記号１．２
および３）に感染させたＢＨＫ２１ハムスター細胞の溶
解産物を、モルモットポリクローナル血清を用いて免疫
沈降させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析
した。ゲルのオートラジオグラフィーは、ウィルスＶＶ
、ＴＧ、２１３９に感染した細胞の試料中にのみ、ＮＰ
蛋白質（６０Ｋｄ）が存在することを示す。 （以 上） Ｎ ＶＶＷ２１３９ Ｔ １２３ ｉＧ−１ｉ
Claims (21)
- （１）組換えポックスウィルスであって、そのゲノムの
一乃至数箇所の非必須部分に麻疹ウィルス属の少なくと
も一つの構造蛋白質の全てまたは一部をコードする少な
くとも一つのＤＮＡ配列ならびに該蛋白質の発現を確実
ならしめるエレメントを有する組換えポックスウィルス
。 - （２）麻疹ウィルス属が、麻疹ウィルス、カレ病ウィル
ス、牛疫ウィルスおよび小反芻動物ペスト（ｓｍａｌｌ
ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｐｅｓｔ）から選ばれた一種で
ある特許請求の範囲第１項に記載のポックスウィルス。 - （３）血球凝集性蛋白質（ＨＡ）をコードするＤＮＡ配
列を有する特許請求の範囲第１項または第２項に記載の
ポックスウィルス。 - （４）融合蛋白質（Ｆ）をコードするＤＮＡ配列を有す
る特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の
ポックスウィルス。 - （５）核蛋白質（ＮＰ）をコードするＤＮＡ配列を有す
る特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の
ポックスウィルス。 - （６）ＨＡ蛋白質、Ｆ蛋白質および／またはＮＰ蛋白質
をコードするＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第１項
乃至第４項のいずれかに記載のポックスウィルス。 - （７）ワクシニアウィルスからなる特許請求の範囲第１
項乃至第４項のいずれかに記載のポックスウィルス。 - （８）ＤＮＡ配列が、ワクシニアのプロモーターの制御
の下にあることを特徴とする特許請求の範囲第７項に記
載のポックスウィルス。 - （９）ワクシニアのプロモーターが、ワクシニアの７．
５Ｋｄプロモーターである特許請求の範囲第８項に記載
のポックスウィルス。 - （１０）一つまたは複数個のＤＮＡ配列が、ワクシニア
のＴＫ遺伝子中でクローンされる特許請求の範囲第９項
に記載のポックスウィルス。 - （１１）一つまたは複数個のＤＮＡ配列が、ワクシニア
のｈｒ遺伝子中でクローンされる特許請求の範囲第９項
に記載のポックスウィルス。 - （１２）麻疹ウィルス属の構造蛋白質の全てまたは一部
をコードする少なくとも２つのＤＮＡ配列を含み、該配
列が、ＴＫ遺伝子およびｈｒ遺伝子から選ばれたゲノム
の２つの領域に組込まれている特許請求の範囲第９項に
記載のポックスウィルス。 - （１３）特許請求の範囲第１項乃至第１２項のいずれか
に記載のポックスウィルスに対応する組換えＤＮＡ。 - （１４）特許請求の範囲第１項乃至第１２項のいずれか
に記載のポックスウィルスに感染した哺乳類動物細胞。 - （１５）麻疹ウィルス属の構造蛋白質の全てまたは一部
を製造する方法であって、特許請求の範囲第１４項に記
載の細胞を培養し、該構造蛋白質を回収することを特徴
とする方法。 - （１６）特許請求の範囲第１５項に記載の方法で得られ
た麻疹ウィルス属の構造蛋白質。 - （１７）特許請求の範囲第１６項に記載の蛋白質の単独
または２種以上の組合わせからなる免疫原性剤。 - （１８）特許請求の範囲第１項乃至第１２項のいずれか
に記載のポックスウィルスおよび／または特許請求の範
囲第１６項に記載の蛋白質の単独または２種以上の組合
わせを含むワクチン。 - （１９）ポックスウィルスが、活性ウィルスである特許
請求の範囲第１８項に記載のワクチン。 - （２０）ポックスウィルスが、不活性ウィルスである特
許請求の範囲第１８項に記載のワクチン。 - （２１）特許請求の範囲第１項乃至第１２項のいずれか
に記載のポックスウィルスに対応してまたは特許請求の
範囲第１６項に記載の蛋白質に対応して配列された抗体
を含む抗血清。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| FR8709629A FR2617715B1 (fr) | 1987-07-07 | 1987-07-07 | Vecteur viral et adn recombinant codant pour une ou des proteines de surface (ha et/ou f) d'un morbillivirus, culture cellulaire infectee, proteines obtenues, vaccin et anticorps obtenus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP2819023B2 JP2819023B2 (ja) | 1998-10-30 |
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Country Status (7)
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