JPH06504190A - アセンブルしたウイルス粒子およびロタウイルス疾患ワクチンにおけるその使用 - Google Patents
アセンブルしたウイルス粒子およびロタウイルス疾患ワクチンにおけるその使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
アセンブルしたウィルス粒子
およびロタウィルス疾患ワクチンにおけるその使用改血立工
本発明は、一般的に、ワクチンおよび免疫原として利用されるウィルス様粒子に
関連する。特に、本発明は、アセンブルしたロタウィルス構造タンパク質および
ロタウィルス感染症の予防および改善におけるアセンブリーの使用に関する。
ロタウィルスは、鳥類および哺乳類の広い種類で、消化管障害および下痢を引き
起こす。ロタウィルスの数種類の血清型が同定されており、そのうちの4種(血
清型1〜4)はヒトから、5種(血清型3〜7)他の動物から見いだされている
。最近の試験により、異なる血清型に属する株間の交配保護(cross pr
otection)がヒトを含む動物において起こり得ることが示されている。
Ijazら、LLL121990 ) (印刷中)HFl。
resら、J CM c obiol(1989)27:512−518゜ロタ
ウィルスゲノムは、二重鎖RNAの11のセグメントからなると考えられている
。この11のゲノムは、少なくとも6個のウィルス構造タンパク質の産生をコー
ドする。完全なウィルス粒子では、これらの6個のタンパク質は二重の設配列中
に存在する。外殻またはキャプシドは、3種のタンパク質、すなわちウィルスタ
ンパク質?(VF6)、ウィルスタンパク質4(VF6)、さらにまだ充分に特
徴付けられていない第3番目のタンパク質からなる。内殻タンパク質は、3種類
あり、ウィルスタンパク質f(VPl)、ウィルスタンパク質2(VPl)、
ウィルスタンパク質6(VF6)である。
VF6は、主要な外殻糖タンパク質であり、その非還元型は約38kD(SDS
−PAGE測定)、その還元型は約42kD(SDS−PAGE測定)の分子量
を持つ。VF6は、約325個のアミノ酸からなる。いくつかのロタウィルス分
離株のアミノ酸配列が決定されており、その配列は約75〜86%の相同性を有
している。ヒトおよび動物種の間の保存領域は、Estes、 M、 K、ら肛
以坦山山1虹(1989)d:410−449に概説されている。このタンパク
質は、宿主細胞に結合することが知られている(Sabara、 Mら、 L!
1xAi(1985)■:51]−66)。中和モノクローナル抗体を開いたV
F6のエピトープマツピングは、約14kDの分子量を持つペプチド成分に中和
−吸収ドメインを局在化した(Sabara、 Mら前記)。この14kDフラ
グメント中に由来する合成ペプチドはまた、ウィルス感染力を中和させることが
示されている(Ijazら、前記)。
第2番目の外側キャプシドタンパク質であるVF6(以前はVF6と呼ばれてい
た)は、776個のアミノ酸からなり、そしてその非還元型で約82kD、およ
び還元型で約84kDの分子量を持つ。
ウシVP4の配列は決定され、(Potter、A、A、ら、鳳坦」立lユU(
19g?) LL+4361>、サルvP4の一部(7)アミノ酸配列を有する
(Mackov、ら、 at a Sc’ U (198B) 85:645−
649)。VF6は、赤血球凝集活性を有し、インビボにおいてへテロタイプの
受動保護を提供する中和抗体の産生を誘導する(Offit、P、A、ら、LL
工虹(1986) J5ニア0O−703)。VF6は、VF6と結合して、ウ
ィルス血清型決定において反応性である。
VF6のダイマーは結合して、ロタウィルス外殻からより末端に伸びるロタウィ
ルスの表面スパイクを形成する。YF3は、ウィルスの宿主細胞内への貫通に於
て重要であり、そしてその感染力は、トリプシンによるVF6の切断により増加
する。トリプシンにより増強された感染力は、すべてのロタウィルスに共通した
特徴であり、そしてトリプシンの切断部位もまた、Estesら(前記)の概説
した通り、保存されている。
ロタウィルスの内側キャプシドは、少なくとも、 VPI、VPl、VF6と呼
ばれる3つのタンパク質を含む。本明細書に関連するのは45kDのタンパク質
であるVF6である。ウシVP6は、ウィルス粒子および感染細胞の両方におい
て、サブユニット間の結合が非共冑結合的相互作用でなる、ユニットのトリマー
で存在すると考えられる。これらのトリマーユニット複合体は、ジスルフィド架
橋により、数人の研究者が電子顕微鏡を用い観察している輪状構造を示すと考え
られる、より大きなユニットになる。
VF6は、サブグループ抗原として同定され、そしてこのタンパク質に対するモ
ノクローナル抗体の幾つかは、すべてのロタウィルスに反応し、そして単一のロ
タウィルス型に対するポリクローナルな血清は大部分のロタウィルス株を検出し
得るので、ロタウィルスグループ共通抗原と記載された。その抗原特性に加え、
このヌクレオ手中ブシドタンパク質は、免疫原性が非常に高く、数人の研究者は
、このタンパク質に対する抗体が中和能を示すことを見いだしている(例えば、
0ffitら、ムL工は(1986) 58ニア00−703を参照)。
VF6は効果的なキャリアータンパク質であり(Redmond、 M、 J、
ら、犯0−山11ユ1.(1990) (印刷中)、モしテVP4は、V6%7
7−およびオリゴマータンパク質のユニットと結合する(Red■ond、M、
J、ら前記)。VF6−VP6結合は、SDS中でのボイリングなどの過酷な処
理に耐えることが示されている。さらに、VF6は、インビトロにおいて、カル
シウムに依存する工程を用いて、VPlおよびVF6と、ウィルス粒子を形成し
得る(Ready、 K、 F、 M、ら、■匹江■(1988)工:269−
273)。得られたアセンブリーは、全ウィルスおよびVF6とVPT上の免疫
支配部位に対し特異的な抗体と免疫反応性で、そしてこの免疫反応性は、天然ウ
シロタウィルス(BRV)のそれと等価である(Ready、 K、 F、 M
、ら、前記)。
本発明は、VF6および/またはVF6、またはそれらの免疫原性領域に相当す
るペプチドまたはタンパク質を、VF6との組み合せで包含する、アセンブルし
たウィルス粒子を提供する。これらのアセンブルした粒子は、ワクチンおよび中
和抗体産生促進において有効である。このようなワクチンは弱毒化したウィルス
ワクチンの使用に代替を提供する。
l匪旦皿丞
本発明は、ウィルスペプチド、またはそのエピトープ領域の発見に基づき、ウィ
ルス粒子としてアセンブルすると、それを投与した被験動物の免疫反応を誘導し
得る。これらのアセンブリーを含むワクチンは、弱毒化ウィルスワクチンでなる
ワクチンに比べ、より安全でより扱いやすい。
従って、一つの局面において、本発明は、を推動物における免疫反応を誘導し得
るウィルス粒子アセンブリーを目的とする。このウィルス粒子アセンブリーは、
以下を包含する=(a)VF6と実質的に相同および機能的に等価である内側キ
ャプシドタンパク質;および
(b)以下の群から選択される一つ以上の外側キャブジッドタン゛ バク質、(
i)YF3と、実質的に相同および機能的に等価なタンパク質またはその機能的
なフラグメント、および(if)VF6と実質的に相同および機能的に等価なタ
ンパク質。
別の実施態様において、本発明は、を推動物被験体における免疫反応を誘導し得
るウィルス粒子アセンブリーであって、VF6およびVF6とアセンブルしたV
F6を包含するウィルス粒子アセンブリーを目的とする。
さらに別の実施態様において、本発明は、薬学的に許容し得る賦形剤、および上
記のアセンブルしたウィルス粒子を包含ワクチン組成物を目的とする。
他の実施態様において、本発明は、上記ワクチン組成物を用いて、を推動物被験
体においてロタウィルス性疾患の治療および予防法を目的とする。
本発明のこれらのおよび他の実施態様は、本明細書の開示を考慮すれば、当業者
により容易に実施し得る。
図面の簡単な説明
図1は、0486株(ウシ)のVP6タンパク質のヌクレオチド配列および推定
されるアミノ酸配列を示す。
図2は、数種の株由来のロタウィルスvP6のアミノ酸配列を比較する:ウシR
Fロタウィルス(ROBMCP>、ヒト10760タウイルス(ROIHVP6
)、ロタウィルスセグメント6内殻タンパク質vP6RNA(ROIS2VP6
)、+7v■20タウイルx (ROtVVP6H2)、つ?F1140タウイ
ルx (ROIVVP6F1)、ヒトWaa9tイ/’ X (RO2SEG6
)、ブタGottfriede2タウイルス(ROIPVP6)、ブタ0群ロタ
ウィルス(PRVVP6)、およびサル5A110タウイルX (ROTG6A
)。
図3は、数種の株由来のロタウィルスvP4のアミノ酸配列を比較する: K8
JU、DSL、M37.ST3,5AII、RRV0図4は、0486株(ウシ
)のVP4タンパク質のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。
図5は、C486株(ウシ)のVP7タンパク質のヌクレオチド配列および対応
するアミノ酸配列を示す。
図6は、数種の株由来のロタウィルスVP7のアミノ酸配列を比較する:サル1
10タウイルス(ROTVP7)、アカゲザルロタウイルス(RORVP7)、
ブタ0SUl:l’フィルス(PRvO3UvP7)、ヒトロタウィル7、 (
ROHVP7A)、ブ9 Gottfried O9’フィルス(PRVPRV
P7G)、ウシukロタウィルス(ROB7)、およびブタメジャーCロタウィ
ルス(PRVPRVVP7)。
図7は、インビトロにおけるアセンブルしたロタウィルス粒子の産生の図示した
ものである。
及旦旦1皿ユ鳳里
本発明の実施は、特に記載のない限り、免疫学、タンパク質化学、分子生物学、
微生物学、および組み換えDNA技術の従来技術で、当業者に周知の技術を使用
し得る。これらの技術は、文献において充分に説明されている。例えば、展Oo
’ mu o 、 Vols、 I−IV(D、MJeir and C,C
Blackvell編、1986. Blackvell 5cientifl
c Publications ); Met ads ’ so o (S、
Co1ovick and N、Kaplan編、Acade+*ic Pre
ss、Inc、) ; Sambrook、Fr1tsch & Maniat
is、o eua Conn: aboato MaLLa 2dEditio
n(Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s、 1989) ; シ]旦■1eoti e S t s’ (M、J、
Galt編、1984): およびB凹道玉、 VolumeslおよびII(
D、N、Glover編、1985)を参照。
本明細書で記載されるすべての特許、特許出願、刊行物は、前述あるいは後述に
かかわらず、本明細書によって、参照によって援用される。
A、2!J
本発明の開示において、以下の用語は、以下に示すように定義される。
r VP6Jとは、当技術分野において認められたレオウィルス科(famil
y Reoviridae)のすべての橿または株からの内側キャプシドの主要
ウィルスタンパク質を意味する。例えば、Kapikianら、■二■」u(B
、N、Fieldsら編、1988)を参照。VP6タンパク質が単離し得、本
発明で使用し得るロタウィルス株の例は、限定されないが、サル5AIL、ヒト
ロタウィルス、ウシUKロタウィルス、ヒトWaまたはWロタウィルス、ヒト3
20タウイルス、アカゲザルロタウイルス、”0”agent、ウシNCDVロ
タウィルス、ヒト320タウイルス、ヒト320タウイルス、ヒト390ロタウ
イルス、ヒトロタウィルス、ヒトロタウィルス、ヒト1falk 57/140
タウイルス、ヒト320タウイルス、ヒト320タウイルス、ヒトNemoto
ロタウィルス、ヒト320タウイルス、ヒト390ロタウイルス、アカゲザルM
M0180060タウイルス、イヌCU10タウイルス、ネコTakaロタウィ
ルス、ウマ■20タウイルス、ヒト St、 Tho+*as No、3および
N0140タウイルス、ヒトHo5oka曹aロタウィルス、ヒトHoehiロ
タウィルス、ブタ5B20タウイルス、ブタGottfriedロタウィルス、
ブタ5BIAロタウイルス、ブタOSUロタウィルス、ウマH10タウイルス、
ニラ1Jch、20タウイルス、シチメンチツウTy、 10タウイルス、ウシ
04860タウイルスおよびこれらに由来した株を包含する。
このように、本発明で使用されるVF6は、サブグループ!、サブグループ1■
、またはまだ未同定のサブグループのすべて、および血清型1−7、および未同
定の血清型のすべてのロタウィルス系のVF6を包含する。
VP6タンパク質は、VP6ポリペプチドのクラス、またはクラスのすべてのメ
ンバーに特有なロタウィルスアミノ酸配列を包含する。代表的なウシ組み換え(
BR)VP6C486株のヌクレオチド配列および演鐸されるアミノ酸配列を図
1に示す。図2は、いくつかの異なるロタウィルス株のアミノ酸配列を示す。図
示されるように、記載されたロタウィルス株間で広く相同性が存在する。他のV
P6ヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、本発明において用途を見いだし得、図
示した配列は、既知のvP6配列の代表に過ぎない。
r VP4Jとは、当技術分野において認められた、レオウィルス科のすべての
種または株からの外側キャプシドのウィルスタンパク質を意味する。VP4タン
パク質を単離し得、本発明で使用し得るロタウィルス株の例は、限定されないが
、VF6に参照して上記に記載された株である。
VF6 (以前はVF6と呼ばれた)は、776個のアミノ酸からなる。
[8,MU、 DSL、 M37. ST3.5AI1.およびRRV系由来の
VF6アミノ酸配列を図3に示す。0486株(ウシ)からのVF6のヌクレオ
チド配列および演鐸されるアミノ酸配列を図4に示す。また、他の配列が、本明
細書において用途を見いだし得る。
rVP7Jは、当技術分野において認められた、レオウィルス科のすべての種ま
たは株からの外側キャプシドの主要ウィルスタンパク質を意味する。VP7タン
パク質を単離し得、そして本発明で使用し得るロタウィルス株の例は、限定され
ないが、VF6に参照して上記に記載された株である。
VF6は、約325個のアミノ酸からなり、そしてC486株(ウシ)からのV
T’7のヌクレオチド配列および演鐸されるアミノ酸配列を図5に示す。Ar1
asら、ム刀エバ(1984) 50:657−661は、サル5AILからの
VF6のヌクレオチド配列を開示する。図6は、ロタウィルス数珠のアミノ酸配
列を示す。VF6は、血清型で制限された相同性を示す。上記配列は、代表的な
ものであり、これに限るわけではない。従って、他の機能配列がまた、本発明に
おいて使用し得る。
2つのDNAまたはタンパク質配列が、分子のある定義された長さで、そのヌク
レオチドまたはアミノ酸が、少な(とも約85%以上(好ましくは少なくとも約
90%、そして最も好ましくは少なくとも約95%)一致するとき「実質的相同
」という。実質的に相同なりNA配列は、例えば、特定の系で規定されているよ
うな厳格な条件下におけるサザーン/%イブリダイゼーシ1ン実験により同定し
得る。適当な/\イブリダイゼーシ〕ン条件の規定は、当業者に周知である。例
として、Sambrookら、前記を膠照。
用語「機能的に等価」は、天然の配列により誘導される免疫反応と等価の免疫反
応を誘導するタンノくり質を産生じ得る鎖を定義し得る外側または内側キャプシ
ドロタウィルスタンパク質のアナログの配列をいう。従って、本明細書で使用さ
れるロタウィルスタンパク質は、生体内タンノくり質のアミノ酸配列と同じ配列
を有する必要がある。
ロタウィルスタンパク質の「機能フラグメント」と(マ、全体配列により誘導さ
れる免疫反応と等価の免疫反応を起こす能力のあるフラグメントである。感染は
VF6の末端領域に対するモノクローナル抗体により抑制し得るので、VF6の
末端は、ピリオンの細胞への最初の吸着に関与することが示された。
さらに、酵素トリプシンは、ウィルスの感染力を増強する。
この増強は、トリプシンがウィルスの細胞への吸着の効率または速度に影響せず
、細胞内にみられる非被覆粒子の濃度を増加するので、吸着の後に作用すると考
えられる。トリプシンの感染力増強分子メカニズムは、VP4タンパク質を、そ
れぞれ分子量約28 kDaおよび60kDaの2つのフラグメントに切断を経
由して起こる。このため、VF6のトリプシン分解部位は、ロタウィルス複製に
おいて重要である。従って、少な(とも最初の255個のN末端アミノ酸に実質
的に相同であるアミノ酸配列からなるフラグメントは、図4に示すように、そし
てそれがトリプシン分解部位を含み、これらの7ラグメントが上記で定義したよ
うに免疫反応を生じ得る限りまた、本発明において用途を見いだし得る。
「ウィルス粒子アセンブリー」は、ロタウィルスの外側および内側キャプシドタ
ンパク質、またはそれらに実質的に相同および機能的に等価なタンパク質、また
はそれらの機能フラグメントのアセンブリーをいう。以下により詳細に記載する
通り、この粒子は、インビトロでアセンブルし、二重殻を持つロタウィルスと類
似する。
用語「エピトープ」は、特異的抗体分子が結合する抗原またはハプテンの部位を
いう。この用語は、「抗原決定基」あるいは「抗原決定部位」に置き換えて使用
される。
ある組成物またはワクチンに対する「免疫反応」は、を推動物被験体において、
目的の組成物またはワクチンに対する細胞性および/または抗体媒介性免疫反応
の発現である。通常、このような反応は、目的の組成物またはワクチンに含まれ
る抗原または抗原(複数)に特定的に佳句けられた、被験体が生産する抗体、B
細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、および/または細胞毒性T細胞か
ら成る。
「免疫原性タンパク質」は、投与された被験体で免疫反応を誘導するタンパク質
である。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では置き換えて使用さ
れ、その最も広い意味で用いられる。
すなわち、ペプチド結合により結合したアミノ酸のすべてのポリマー(ジペプチ
ドまたはそれ以上)を示す。従って、この用語は、オリゴペプチド、タンパク質
フラグメント、アナログ、改変体、融合タンパク質等を包含する。
「天然」タンパク質またはポリペプチドは、ロタウィルスまたはロタウィルス感
染細胞から採取したタンパク質またはポリペプチドをいう。従って、この用語は
、天然に存在するロタウィルスタンパク質およびそのフラグメントを含むロ 「
非天然」ポリペプチドは、組み換えDNA法または直接合成により産生されるポ
リペプチドをいう。「組み換え」ポリペプチドは、組み換えDNA技術により;
すなわち・所望のポリペプチドをコードする外部DNA構築物により形質転換さ
れた細胞から産生されたブリペプチドをいう。
「レプリコン」は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律ユニットとして働く;
すなわち、それ自身の制御で複製し得る、すべての遺伝子要素(例、プラスミド
、染色体、ウィルス)である。
「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが付着したレプリコンで、付
着したセグメントの複製および/または発現が起こる。「発現ベクター」は、自
律複製または組み込みの可能なベクターをいい、そして適切な宿主内の所望のD
NA配列の転写および翻訳を指示する制御配列を含む。
「コード配列」は、ポリペプチドのに転写および/または翻訳されるポリヌクレ
オチド配列である。
「プロモーター配列」は、RNAポリメラーゼと結合し、そして下流(すなわち
3′方向)コード配列の転写を開始し得るDNA制御領域である。
RNAポリメラーゼとプロモータ配列の結合によりコード配列の転写が起こり;
得られたmRNAの翻訳によりコード配列中にフードされたポリペプチドが得ら
れる場合、フード配列は細胞内でプロモーター配列の「制御下」にある。
「作動可能に結合された」は、要素が、通常の機能を遂行するように配置された
並置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結した制御配列は、コード配列
を発現し得る。
「制御配列」は、コード配列の転写および/または翻訳を制御する配列である;
これらは、限定されないが、ブロモータ−配列、転写開始および終結配列、翻訳
開始および終結配列を包含し得る。さらに「制御配列」は、コード配列中にコー
ドされたポリペプチドのプロセ・ノシングを制御する配列である;これらは、限
定されないが、配列制御分泌、プロテアーゼ切断、およびポリペプチドのグリコ
ジル化を制御する配列を包含し得る。
「シグナル配列」は、コード配列の前に含み得る。この配列は、シグナルペプチ
ド、ポリペプチドのN末端をコードし、これが、宿主細胞に対し、ポリペプチド
を細胞表面に移動、またはポリペプチドを培地中に分泌するのを伝える。そして
このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞により切り取
られる。
「宿主細胞」は、外因性DNA配列により、形質転換された、あるいは形質転換
し得る細胞である。
細胞は、細胞膜の内側にこのような外因性DNAが導入された時外因性DNAに
より「形質転換される」。外因性DNAは、細胞のゲノムを形成する染色体DN
Aに組み込まれ得(共有結合的に結合される)、または得ない。例として、原核
生物および酵母において、外因性DNAは、プラスミド等のエピゾーム要素に維
持され得る。真核細胞に関しては、安定に形層転換した細胞は、外因性DNAが
染色体に組み込まれ、染色体複製により娘細胞に遺伝される細胞である。この安
定性は、外因性DNAを包含する娘細胞の集団でなる細胞株、またはクローンを
確立する真核細胞の能力により示される。
「クローン」は、単一細胞またはその体細胞分裂による共通の祖先に由来した細
胞集団である。「細胞株」は、インビトロで多世代にわたり安定に増殖し得る主
要細胞のクローンである。
DNA構築物の「異種」領域は、天然に他の分子と結合することが見いだされな
い、別のDNA分子内の、または別のDNA分子に結合した、同定可能なセグメ
ントである。従って、異種領域が細菌遺伝子をコードする時、その遺伝子は、通
常、起源細菌のゲノム中の細菌遺伝子に側面を接しないDNAにより部面を接し
得る。異種コード配列の別の例は、コード配列それ自身が天然で見いだされてい
ない構築物である(例、天然遺伝子と異なるコドンを持つ合成配列)。アレリッ
クな改変体または自然発生的な突然変異は、本明細書では、DNAの異種領域と
ならない。
Aを含む組成物が、その組成物中のA+B合計重量の少なくとも約85%がAで
ある時、Bを「本質的に含まない」。
好適には、Aが組成物中のA+B合計重量の少なくとも約90%、より好適には
、少な(とも約95%重量または99%重量に同等である。
本発明に記載の「ワクチン組成物」は、ウィルス粒子アセンブリー単独で、ある
いは1つ以上のアセンブルしていない精製ウィルスタンパク質との組み合せで、
または、それぞれ外側および/または内側キャプシドタンパク質を1つ以上有す
る細胞溶解物組み合せを用いた従来とは別のワクチン製剤である。特に有用なの
は、本発明のワクチン組成物にVp4を含有する細胞溶解物組添加である。上記
活性成分を含むワクチンの調製は、当該技術分野において十分理解されている。
典型的には、ワクチンは、溶液または懸濁液の注射剤として調製される;注射前
に液体中に溶解または懸濁するのに適した固型形態もまた、調製し得る。調製は
また、活性成分を乳化または、リポソームに包括し得る。活性な免疫原性成分は
、しばしば、薬学的に受容可能なおよび活性成分に適合する賦形剤と混合し得る
。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、
エタノールなど、およびこれらの組み合せである。さらに、所望されるなら、ワ
クチンは、保湿または乳化剤、pFi緩衝剤、またはワクチンの有効性を増強す
るアジニバント等の補助物質を少量含み得る。
ワクチンは、注射により通常、非経口投与され、例えば、皮下あるいは筋肉注射
される。注射用ワクチン製剤は、活性成分を有効量を含み得、その正確な量は、
当業者により容易に決定され得る。活性成分は、注射用組成物の約0.01%〜
約95%(W/W)の範囲であり得、または、もし適切であれば、より高濃度ま
たはより低濃度であり得る。
他の投与方法に適切なワクチン製剤は、生薬を包含し、ある場合には、経口製剤
を包含する。生薬には、ワクチン組成物は、ポリアルカリグリコールまたはトリ
グリセリド等の従来のバインダーおよびキャリアを包含し得る。このような生薬
では、活性成分を約0.5%〜約10% CW/W)の範囲で、好ましくは、約
1%〜約2%の範囲で包含する混合物から形成し得る。
経口製剤は、通常使用される、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトー
ス、デンプン、マグネシウム、ステアリン酸塩、サッカリンセルロースナトリウ
ム、炭酸マグネシウムなどの賦形剤を包含する。これらの経口ワクチン組成物は
、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、除数製剤、または粉末の形態をとり得
、そして活性成分を約10%〜約95%、好ましくは約95%重量70%を含有
する。
さらに、ウィルス粒子は、中性のまたは塩形態でワクチン組成物に製剤され得る
。塩として用いる場合、最終製剤は、典型的には、0.15M未満の塩を含む。
薬学的に受容可能な塩は、酸添加塩を含み(活性ポリペプチドの遊離アミノ基と
形成される)、そしてそれらは。例えば、塩酸またはリン酸等の無機酸、または
、酢酸、シニウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成される。遊離のカルボ
キシル基から形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウ
ム、または水酸化鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミ
ン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から由
来し得る。
「処理」は、ロタウィルス感染の被験者の治療または改善を意味する。ロタウィ
ルス疾患の「予防」は、感染の発生を妨げ、または本発明の組成物のその後投与
されたなら、感染の重症を緩和することを意味する。
本発明のワクチン組成物は、用量処方により投与し得、そして治療的に有効およ
び免疫原性であり得る量で投与し得る。
ワクチン組成物の「治療的に有効な鳳」は、組成物が投与された被験体で、ロタ
ライスル感染の予防または処理に十分な用量である。ロタライスル感染を処理ま
たは予防し得るウィルス粒子アセンブリーの用量は、本明細書の開示を考慮すれ
ば、当業者が適当な対照とで日常的な試験を行うことによりで決定し得る。適切
な処理群の対照との比較は、管理された試験で用いられた特定の用量が、疾患の
予防または処理で有効かどうかを示し得る。一般に、有効用量は投与法に依存し
て変動し得る。例えば、筋肉内注射の場合、一般的にo、ootμg/kg〜1
0μg/kgが本発明で用途を見いだし得る。
B、二艦呵方造
本発明の主題は、ロタウィルス内側および外側キャプシドタンパク質を包含する
アセンブルしたウィルス粒子が、それらが投与された被験体において免疫反応を
誘導し得るという発見である。ウィルス粒子は、ロタウィルスの内側および外側
キャプシドタンパク質のアセンブリーである。特に有用なのは、内側キャプシド
タンパク質、VF6を、外側キャプシドタンパク質VP4およびVF6のいずれ
かまたは両方とともに包含するアセンブリーである。VF6は、より詳細に以下
に示すように、2つの外側キャプシドタンパク質の「キャリア」として作用する
。これらのアセンブリーは、単独、または精製されたまたは部分精製された、ま
たは粗細胞溶解物として提供される、アセンブルしていない外側キャプシドタン
パク質と組み合わせて、ロタウィルス感染の処理または予防のためのワクチン組
成物として使用し得る。
本発明のウィルス粒子において使用される内側および外側キャプシドタンパク質
は、任意の方法で調整し得る。まず、EDTAおよび塩化カルシウム(CaC1
2)または塩化リチウム(Liel)のいずれかとの標準法による処理により、
精製ウィルスの連続分解により、各タンパク質を単離し得る。例えば、Alme
idaら、J、Med Vi ol(1979)4:269−277; Bic
anら、J、Vir。
1(1982) 43:1113−1117; Gorzigliaら、L」皇
Lj1ム1(1985) 66:11189−1900: Readyら、u1
訂」「(1987) 1jfi:189−198を参照。
あるいは、ウィルスタンパク質は、組み換えDNA技術により生産し得、この方
法は文献に十分説明されている。例えば、Sa+abrookら、前記;および
DN人匹且坦」、前記を参照。
ウィルスポリペプチドをコードするDNAフード配列は、特定のmRNAに由来
し得る。例として、Estesら、前記HBothら、ムーLLIL(1984
) 51:97−101; Cohenら、Ll旦お■1(1984)u!I:
17 B−182を参照。あるいは特定のウィルスタンパク質をコードするDN
A配列は、クローニングよりむしろ合成的に調整し得る。DNA配列は、ウィル
スタンパク質アミノ酸配列の適切なコドンで設計し得る。一般に、配列を発現に
使用し得る場合、目的とする宿主に好ましいコドンを選択し得る。
完全な配列は、標準法により調整された重複するオリゴヌクレオチドからアセン
ブルされ、そして完全なフード配列にアセンブルされる。例えば、Edge、
Mi3ixi(1981) Lv+756; Nambairら、シ壮旦■J(
1984) ip:1299; Jayら、ム」1G−立hem(1984)讃
:6311を参照。
ウィルスタンパク質のコード配列が調製または単離されたなら、適切なベクター
またはレプリコンにクローニングされ得る。当業者には多(のクローニングベク
ターが知られ、そして適切なりローコングベクターの選択はg由である。クロー
ニングの用の組み換えDNAベクターおよび形質転換し得る宿主細胞(カッコ内
)の例は、バクテリオファージλ(E。
colt)、pBR322(E、 colt)、pAcYc177(E、col
i)、pKT23G (グラム陰性綿m>、pGV1106 (グラム陰性綿m
>、pLAFRl (グラム陰性細II)、pME29Q (non−E、 c
ol iグラム陰性細菌)、pHV14 (E、 col iおよびBacil
lus 5ubtilis)、pBD9 (Bacillus)、plJ61
(Streptomyces)、pUC6(Streptomyces)、YI
p5 (Saccharomycecs)、YCp19 (Saccharom
yces)、ウシパピローマウィルス(哺乳類細胞)を包含する。一般的には、
DN人n旦n :Vols、 I&II、前記; およびSambrookら、
前記を参照。
ウィルスタンパク質のコード配列は、プロモーター、リボゾーム結合部位(細菌
での発現のため)および任意にオペレーター(本明細書では集合的に「制御」要
素という)の制御下に配置され得、ウィルスタンパク質をコードするDNA配列
は、この発現構築物を含むベクターにより形質転換された宿主細胞中でRNAに
転写される。このコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含み得
、または含み得ない。
例えば、細菌では、ウィルスタンパク質は、好ましくは、翻訳後のプロセッシン
グで細菌宿主により除去されるリーダー配列を含むコード配列の発現により得ら
れる。例えば、米国特許第4.431.フ39; 4,425,437.4,3
38,397号を参照。
発現ベクターは、特定のコード配列が適切な制御配列と共にベクター内に位置す
るよう構築され、制御配列に対してコード配列の位置と方向は、コード配列が制
御配列の「制御」下に転写されるように構築される(すなわち、制御配列でDN
A分子に結合するRNAポリメラーゼが、コード配列を転写する)。制御配列は
、上記クローニングベクター等のベクター内に挿入する前に、コード配列に結合
し得る。あるいは、コード配列は、既に制御配列および適切な制限部位を含む発
現ベクターに直接クローニングし得る。
多くの原核生物発現ベクターが当該技術分野で知られている。例えば、米国特許
第4,440,859.4.436,815.4,431,740゜4.431
,739: 4.428.941: 4.425,437.4,418,149
.4,411,994、4,366.246; 4.342.832号を参照。
さらに英国特許出願GB2゜121.054. CB2.008,123. C
B2,007,675および欧州特許出願103.395を参照。酵母発現ベク
ターも、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第4,446,235.
4.443,539.4,430,428゜さらに欧州特許出願103.409
; 100,561;および96.491を参照。
本発明のロタウィルス遺伝子の発現に特に有用なのは、昆虫細胞およびこれらの
細胞において使用に適切なベクターである。このような系は、当該技術分野で公
知であり、そして例えば、バ牛二〇ウィルスAuto肛uh■」L口江姐m多s
体病ウィルス(AcN1’V)から構築された、昆虫発現伝達ベクターを含む。
このような発現ベクターは、典型的には、異種遺伝子の発現を制御するため、強
力なウィルス多角体病遺伝子ブo%−9−を用いる。異種DNAを、バキニロウ
ィルスの所望の部位に導入する方法は、当該技術分野で公知である(例えば、S
g+ithら、Mol and Cel B’o (1983) i、2156
−2165;およびLuckov and Sumners ■皿に■(198
9) lJ:31を参照)0例えば、挿入は、多角体病遺伝子等の遺伝子に、相
同的組換えにより可能である。また、挿入は、所望のバキ10ウィルス遺伝子に
組み込まれた制限酵素部位にも可能である。シグナルペプチドをコードする配列
はまた、これらのペプチドが昆虫細胞により認識され、そして発現された産物が
発現培地中への分泌を生じ得るので、これら発現系において使用し得る。
発現系および選択された宿主に依存して、ウィルスタンパク質が、上記の発現ベ
クターにより形質転換された宿主細胞ノ増殖ニヨリ、タンパク質発現条件下で産
生される。次に、このタンパク質を宿主細胞から単離し精製する。この発現系で
タンパク質が増殖培地中に分泌される場合は、このタンパク質を細胞を含まない
培地から直接精製し得る。タンパク質が分泌されない場合は、細胞溶解物から単
離する。適切な増殖条件と回収方法の選択は、当該技術分野の範囲内である。
精製したVP6タンパク質は、構造冬型性を示す。特にサンプルの多くにヘキサ
マーと小さな六角形の格子がみられる。約pH5,0〜約pH,0の間で管状粒
子が形成され、そして温度およびイオン強度の変化に対し中等度の安定性を示す
。これら粒子の形成は、完全に可逆的である。約1)H4,Oで単一般ウィルス
に似た球状粒子を形成し得る。約pi、O〜約pFI4. Oにシフトしたサン
プル中において、小穴の格子でなるシート状形態新規構造が形成される。これら
の結果は、ロタウィルスアセンブリーにとうて、VF6およびタンパク賀−タン
パク質相互作用の重要性を示す。
(以下余白)
このようなタンパク質−タンパク質相互作用は、以下のように観察される現象に
関与するようである。この現象は、ある種のペプチドが、モノマー形態のVF6
、あるいはインビトロにおいてアセンブルされるチューブ状ならびに球状のよう
な、VF6のモノマーから形成される種々のオリゴマー構造に結合し得るもので
ある。この付着は、VF6内の特異結合部位により媒介される。
個別の外側および内側キャプシドタンパク質が、単離、合成あるいは組換え手法
での産生のいずれかがなされた後に、これらのタンパク質は、カルシウムによる
方法を使用してウィルス粒子に7センブルされる。この方法は、実施例およびR
eady、 K、F、M、ら、■ユ匡■(198g) ■l:269−273に
記載されている。図7は、インビトロにおいてアセンブルされたロタウィルス粒
子の生産の図式を示す。
上記に説明したように、ウィルス粒子は、ワクチン組成物として、精製された非
アセンブル外側キャプシドタンパク質と組み合わせて、あるいは1種以上の別の
外側キャプシドタンパク質を含む細胞抽出物と組み合わせて、投与され得る。
これらの細胞抽出物は、当該分野に公知の方法により調製され得る。例えば、細
胞抽出物は、アフリカミドリザルMA104細胞中でロタウィルスを培養し、細
胞と培地をともに回収し、そして遠心分離により細胞を除去することによって、
調製され得る。得られた上清には、ロタウィルスタンパク質が含まtLル。この
タンパク質は、密度勾配超遠心分離によりさらに精製され得る。次に、ウィルス
ペレットを、Ready、 K、F、M、および5abara、 M、■以立1
■(19g?) lji:189−198に記載のように、CaCl2およびL
iCl2で処理して個別のウィルス粒子を得る。
VF6は、このような調製では極少量で存在する。さらに、少量のVF6は、V
PT画分中に存在する。
以下に本発明を実施するための特定の実施態様を示す。この実施例は、例を示す
ことを目的とし、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することは意図し
ていない。
訝 の に な の
次の菌株の生物学的に純粋な培養物は、メリーランド州、ロックビル、パークロ
ードドライブ12301のアメリカンタイプカルチ中−コレクシjン(Amer
ican Type Cu1ture Co11ection)に寄託されてい
る。示されている受託番号は、生存試験後に付与されて、必要な料金は支払っで
ある。米国特許法施行規則1.14および米国特許法122条に従い、コミッシ
ョナーにより権利を与えられた者は、特許出願が係属している間、その培養物を
入手することが可能である。出願に基づく特許が許可されると、上記培養物の公
衆に対する入手の制限は最終的に撤廃される。さらに、この指定された寄託物は
、寄託日から30年間、あるいは寄託物の分譲の請求のあった最終の日から5年
間:または米国特許の存続期間2のいずれか最長の期間の間保持される。培養物
が死滅するか不測の事故により破壊されたり、あるいはプラスミド含有味のとき
、プラスミドが脱落した場合には、同一の分類学上の種類の生存している培養物
と差し換えられる。
u I−丘旦 旺匹l豆
pAC373BRV6 1987年 8月31日 40362(Lc立Hにおけ
る)
BVLVP4 1990年10月24日(A−坦JAL田住競における)
BYVP7 1990年10月24日
(Δ、j且り山江廿における)
C9支−豆
区社亙圭話五座
酵素は、市販のものを購入し、製造業者の指示通りに使用した。放射性ヌクレオ
チドおよびニトロセルロースフィルターもまた市販のものを購入した。
DNAフラグメントのクローニングにおいては、記載されているところ以外は、
DNAの全操作は標準的な方法に従って実施した。上記のSa■brookらを
参照のこと。制限酵素、Ta DNA リガーゼ、L 皿、DNAポリメラーゼ
!、フレノウフラグメント、ならびに他の生物学的試薬は販売業者から購入し、
製造業者の指示通りに使用した。二本鎖DNAフラグメントはアガロースゲル上
で分離した。
LJl:
ロタウィルスに感染していないマウス(CDI)をHarlan Spragu
e Davley Inc、、 (Indianapolis、 IN)から購
入した。購入時のマウスの齢は、約6適齢であった。マウスの体重は、25グラ
ムと30グラムとの間であった。全マウスは、 ELISAアッセイ (Ija
z、 MJ、ら、m工th (1989) il:186−204)によりロタ
ウィルスの抗体に対して血清陰性であることが認められた。動物は、実験中を通
して分離ユニット中に置いた。
およ イルス:
MA104細胞(アフリカミドリザル)を、10%胎児ウシ血清(FBS) (
Gibco Laboratories、 Grand l5land、 NY
)を添加したイーグルの最少必須培地(MEM)中で培養した。ウシロタウィル
ス分離株0486を、以前に記載(Babiuk、 L、A、ら、L虹江]R匡
■虹(1977) i:610−617) (D方法ニ、J、l)、仔つシノ下
痢便から培養した。ロタウィルスc486は、ATCC,ロックビル、MD(寄
託番号VR−917)から公的に入手可能である。サル(si■1an) oタ
ウイルス株5AII (血清型3)は、Dr、 H,Malherba (Sa
n Antonio、 TX)から得、そして、ヒトロタウィルス株DSI (
血清型2)およびヒトロタウィルス株Wa (血清型1)は、Dr、 H,Gr
eenberg (Stanford University、 CA)から得
た。
これらのウィルスを、FBSを含まない、lslあたり1μgのトリプシン(D
ifco Laboratories、 Detroit、 Ml)存在下に〜
集密的MA104細胞中で増殖させた。細胞および上清をともに回収し、細胞を
500g、 20分間の遠心分離により除去した。ウィルスを、透明の上清液体
から、15℃、2172時間、too、ooo gでの40%スクロース−クッ
ションを通してのベレット化により濃縮した。そのウィルスベレットを、2回蒸
留した水に再懸濁させ、ウィルスのタンパク質量を、以前に記載(Ijaz、
M、K。
ら、紅旦」」吐ユ並(19g?)旦:283−298)のように分光光学的に評
価した。再懸濁ウィルスを−70”Cで保存した。個別の内側および外側キャプ
シドタンパク質を、以下の実施例に記載のように調製物から単離1.た。
プラークアッセイ:
感染ロタウィルスの定量のためのプラークアッセイは、以前に記載(Aha、
P、M、および5abara、 M、1. LL工は(1990) @8:25
−32)の方法に従って実施した。簡単には、集密的単層のMA104細胞を有
する12ウエルの組織培養プレート(NUNC)を、MEM(FBSを含まない
)で2回洗浄した。各ロタウィルス分離株の段階10倍希釈物を、トリプシン含
有MEM(Difco Laboratories、 Detroit、Ml)
中で調製して、最終濃度を10μg/mlにした。
37℃で1時間、ウィルスを吸着後、接種物を吸引しくaspriated)、
細胞をMEMで洗浄して、4%セファデックスG−75ビーズ(Pharmac
ia)を含むダルヘッコ変法イーグル培地(DMEM)を重層した。プレートを
37℃で2日間インキュベートし、重層を吸引し、そしてプレートを0.5%ク
リスタルバイオレット/80%メタノール/ PBSで染色して洗浄し、プラー
クを計数した。
■刀法広:
ELISA法は、以前に記載(5abara、 M、ら、L!1L91(198
5)■:58−66) +71方法の変法であった。全インキュベーションは、
記載のない限り、室温(20℃)で1時間行った。ポリスチレンの96ウ工ルI
mmunolon 2プレート(Dynatech Labs Inc、。
Alexandria、 VA)を各アッセイシステムについて感受性にし、以
下のように使用した。
タンパク質特異的抗体の検出用には、プレートを、0.05M炭酸塩重炭酸塩(
carbonate bicarbonate)緩衝液、pH9,6で希釈した
それぞれのタンパク質で、−晩かけて被覆した。吸着されていないタンパク質を
希釈水で十分に洗浄して除去した。
プレートの覆われていない部分を、0.OIM PAS中の3%ウマ血清で一晩
処理してブロックし、次に2回蒸留したH2Oで洗浄した。
プレートに入れた抗原に、1%ウマ血清およびO,OS%Tween 20を含
む0.OIM PAS中の、ウェルあたり75μlのマウス抗血清を重ねた。イ
ンキュベーションを室温で2時間行った後、結合されテl、Nない抗体をO,O
S%Tveen 20を含む0.OIM PAS (PBST)で洗浄して除去
した。次に、ビオチン化ヤギ抗マウス血清(Zytaed Laborator
ies Inc、、 San Francisco、 CA)の175000希
釈物をウェルごとに加え、室温で1時間インキ品ベートした。
PBSTで洗浄した後、プレートを、PBSTおよび1%ウマ血清中で希釈した
ストレプトアビジン(streptavidin)ホースラディッ’/ x ヘ
ルオキシダーゼ複合体の75μlと、1時間インキュベートシタ。PBSTで洗
浄後、基質(2,2°−アジノージ−[3エチル−ベンズチアゾリンスルホネー
ト]、ABTS、 Boehringer−Mannheim)を加えた。10
分後に10%SOSを加えて発色を停止させた。ウェルの光学密度をELISA
リーダー(BioRad Laboratories、 Richwand、
CA)により405nmにおいて測定した。力価は、平均バッフグラウンドレベ
ルに対する>2SDのODの最高希釈の逆数で示した。
ドデシル ナト1ウムポリアクIルアミドゲル 。
跋辷臥■):
ウィルスタンパク質を、還元および非還元の同条件下で、Laemmli (L
aew+mli、 U、に、 Nature (1970) 12ユニ680−
685)の記載の方法に従って5DS−PAGEにより分離した。ウィルス試料
を、非還元条件下の操作用に電気泳動試料緩衝液(0,337M トリスpH6
,8,6% SDS、 30%グリセロール、0.03%ブロモフェノールブル
ー)に再懸濁させ、そして還元条件下用には3.75%メルカプトエタノール(
BME)を含ませた。試料を5から1o分間沸騰させ、次に3蔦スクツキングゲ
ルをもつ10%ポリアクリルアミド分離ゲル上での電気泳動により分析した。
ロ ウィルス ンパク のウェス ンプロテイン :タンパク質特異的抗体を、
Tovbinらによる記載(Towbin。
H8ら、oc Nat Acad Sc’ [JS (1979) 76:43
50−4354)のウェスタンプロティング法により検出した。10%ポリアク
リルアミドゲルで分離したウィルスタンパク質を、ニトロセルロースベーパー(
0,45μm) (BioRad Laboratories)に移した。
これは、20mM)リス−19hMグリシンー20%メタノールを含有する緩衝
液中で1時間エレクトロブロッティングすることにより行なった。複写のニトロ
セルロースのストリップ(strips)をアミノブラックで染色してタンパク
質の転写率を測定した。
転写の後、ウィルスタンパク質の血清試料との反応を以前に記載(Braun、
D、 K、ら、LLエバ(1983) 46:103−112)のように測定
した。非特異反応を0.OIM TBS中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)
でブロックした。TBSTでの洗浄後、反応をプロティンAゴールド(BioR
ad Laboratories)を用いて1時間発色させた。発色後、タンパ
ク質のバンドを銀促進剤(JanssenBiotech、 N、V、、 Be
lgium)で増感させた。
L惠五上
ウィルス ンバク の
A、i佐コニ目四1鳳
VP6ウイルスタンパク質を、以下のように、EDTAおよびCaCl2あるい
はLiC1のいずれかでの精製ウィルスの連続的な分解により、精製ウィルス懸
濁物(上記記載)から単離した。外側牛ヤブシドタンパク質は、ウィルスを、5
0mM EDTASo、01Mトリス−EICl、 pH7,4中、4℃で30
分間インキュベートして取り出した。サブウィルス粒子を超遠心分離(100,
0OOx g、2−3時間、4℃)により回収し、G、OIM トリス−HCl
、 pH7,4アルいは0.OIMホウ酸ナトリウム、pl’19. O中に再
懸濁させた。次に、これらを0.04M )リス−EICI、 pH7,4を含
む1.5M CaCl2で、20℃で20−30分間処理するか、あるいは2M
LiC1,0,01Mdtつ酸ナトリウム、pH9,0中で、4日間−70”
Cで凍結した。コアおよび分解されなかった粒子を、超遠心分離により可溶化タ
ンパク質から分離した。EDTAおよび塩類は、記載のないかぎり、0、OIM
トリス−11CI、 pH7,4に対して4℃で十分に透析して除去した。試
料の純度は、上記のようにポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により
確かめた。
B、天然」1へ星!
ウィルス粒子あたりのVP4タンパク質のコピー数が限られていることが、この
タンパク質の多量精製を困難にしている。
しかし、VF6は、天然VP6の単離のところに記載したように、サブウィルス
粒子の1.5M CaCl2処理後、あるいは元来の完全なウィルス粒子の2M
LiCl処理後の超遠心分離の後に得られる上清に認められる。ざらにVF6
は、例えば、HPLC,アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーなどにより、このベレツトから精製され得る。
C1天然」1悲艶凰
VF6のようにVF6もまた、上記上清中に見いだされるが、多量に存在する。
Ready、に、F、M、ら、■胆m■(1988) ljJ:269−273
を参照のこと。VF6はさらに、HPLC、アフィニティークロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィーなどにより精製され得る。
見立且旦
えウィルス ンパク の
A9組1」Jl旺し【生
ウシロタウィルス(B[iV)由来の遺伝子6を含む、組換えオートグラファカ
ルフォルニ力核ポリへドロンウィルス(Autographa califor
nica nuclear polyhedrosis virus) (Ac
NPV)の構築およびgpodopeera frugrperda (SF9
)感染後のVPI5粒子のアセンブリーは、以前に記載されている(Redmo
nd、 M、J、ら、しL]l姐は、 印刷中)。簡単には、精製ウシロタウィ
ルス株C486から抽出されたゲノムRNAを使用してcDNAを生成した。こ
のcDNAをpBR322のPst 1部位に連結して、これを使用してL皿株
Dlllを形質転換した。得られたコロニーを、鋳型としての精製されたゲノム
RNAセグメント6から調製された放射標識cDNAを用いてプローブした。
遺伝子6RNAの完全コピーを含むクローンpR6−42を、部分的にAhal
llで消化して、7つの5°非コーデイングヌクレオチドおよびcDNAクロー
ニング中に付加されたオリゴ−dCテールを除去した。次に、Bag Hrリン
カ−を付加した。
3°オリゴ罰Cテールおよび非コーディング領域を、Ace Iで消化して除去
し、VP6遺伝子から56の非コーディングヌクレオチドを除いた。次にBag
111りンカーを加え、遺伝子6cDNAをバキニロウイルス転移ベクターp
Ac373のBa+* H1部位に連結した。
このベクターをpAc373BRV6 (ATCCno、40362)と命名し
た。ロタウィルス遺伝子のA、■L1w江恒ゲノムへの組み込みは、Summe
rs、 M、D、およびSm1th、 G、E、、 T xas ’eu u
a tation Bu t’ 1555;26−27に概説されている茎、
江uEシ江ム(SF9)細胞での同様の組換えにより行った。組換え体は、上記
記載のように、精製ゲノムRNAセグメント6から調製された放射様11cDN
Aを使用してのプラークハイプリダイゼーシ1ンにより同定した。組換え体を、
プラーク精製し、組換え遺伝子6により産生されるタンパク質の発現を上記記載
の方法を用いた5DS−1’AGE分析およびウェスタンブロッティングにより
分析した。
遺伝子6を含む組換えウィルスをSF9細胞を感染させるために使用した。27
Cでの72時間のインキ1ベージ1ン後、細胞を、0.05%トリトンX−10
0および0.2ユニツト/■lのトリプシンインヒビターを含む2ml NaH
CO’緩衝液(pH7,5)中で溶解した。細胞の破片を1500gでの遠心分
離により除去した。上清を0.1Mグリシン緩衝液(pH3,0)に対して24
時間透析した。このことによりVP6凝集物はモノマーに分離される。透析溶液
を0.01Mクエン酸緩衝液(pH4,0)に取り替え、24時間透析を続ける
と、この間球状の%’P6が形成された。この透析緩衝液を0、OIMl−リス
−HCl (pH7,4) +1mM 7 シウム7 ’、; l’l:取’)
替した。次に、透析を4℃で一晩続けた。凝集していない物質を、300.00
0ダルトン分子量カットオフフィルターを使用して、超遠心分離により取り出し
た。この方法により生成された球状VP6の性質を電子顕微鏡により確認し、純
度は5DS−PAGEにより確認した。
B−監遺孟11Δ星生
遺伝子4(VF6をフードする遺伝子)を含むc DNAの翻訳開始コドンのす
ぐ上流にBa■旧制限部位を挿入するために部位特異的変異誘発を使用したこと
以外は、VF6について記載したようにVF6を組換え手法で産生じた。そのこ
とにより通常存在するVF6の開始コドンの前にある9ヌクレオチドを欠損する
ことができる。遺伝子の3°末端は改変しながった。
改変された遺伝子4を転移ベクターpVL941 (寄託番号)に連結した。遺
伝子4のΔ、姐且Lし江競ゲノムへの組み込みは、上記のように行って、発現ベ
クターBVLVP4にした。
VF6−バキニロウイルス感染SF9細胞の粗界面活性剤溶解産物を、以下に記
載のウィルス粒子産生の出発物質として使用した。VI’4とVF6と間の相互
作用は、親和精製工程に類似する。
従って、VF6−VP4複合体は、スクロース密度勾配による超遠心分離により
、結合されていないVF6および他の細胞タンパク質から分離され得る。
C1鼠1LlユΔL生
VF6に対する遺伝子(遺伝子8)の全長コピーを含むcDNAを、上記記載の
ようにクローン化して同定した。l/P7遺伝子の全長cDNAコピーを含むク
ローン(クローンpr 8−G )をAha IIIおよびsph Iで消化し
て、遺伝子の5°および3゛末端からそれぞれ7および27ヌクレオチドを除去
した。次に、Ba園+11リンカ−をDNAの両末端に付加した。
遺伝子8をpAcYMlのBaI2旧部位に連結し、前述のVF6の記載のよう
に、この遺伝子8をΔ、慕■L田江劇のゲノムに組み込み、発現ベクターBYV
P7を得た。上記のように、組換え体を同定し、プラーク精製して発現のアッセ
イを行った。
VF6−バキエロウイルス感染SF9細胞は、増殖培地中に直接VP7を分泌す
る。 VF6は、50mM CaCl2の存在下で2重層(double 5h
elled) (VF6−VF6)粒子の形成により実質的に親和精製される。
このことにより、増殖培地中に存在する他の成分からVF6が分離される。最
終精製工程は、スクロース密度勾配による超遠心分離である。
爽1k」−
ウィルス のアセンブリー
VF6およびVP4タンパク質の増殖培地ならびに感染細胞溶解物中の濃度を、
クーマシーブルー染色の5DS−PGEゲルおよびVF6およびVP4特異的抗
血清プローブによるウェスタンプロティングによって、評価した。天然BRVを
予め決定した濃度で使用して標準にした。使用したタンパク質の濃度は、VF6
に対して以下の割合である。
VF6−VF6. 1:10 v/v
VP6−VF6. 1:10 W/W
全粒子調製物の開始物質は、10μgのVF6であった。VF6−VP4粒子を
:+it、iするために、SF9細胞を界面活性剤で溶解しく実施例2Bニ記載
)、10mMトリス+ 501CaC12pH8に、4℃で一晩透析して得たV
P4タンパク質の1oOμgを、VF6と37℃で2時間混合した。ワクチンと
して使用する場合には、この調製物をioo。
000gm’ 2時間、40%スクロース密度勾配により遠心分離した。
’/P6−4−7粒子を調製するために、上記調製されたVF6−4粒子を10
0μgノVP71.l:加えた。VP71m製物は、50mM CaCl2を含
む0゜1Mトリス−11CI pE[8,0に一晩透析した細胞培養培地から構
成されていた。
VF6−4+7混合物を、次に、50mM CaCl2を含む0.1M)リス−
■CI pH8,0に対して3−4日間透析した。粒子を前記のようにスクロー
スにより精製した。
VF6−VF6を調製するために、球状vP6の10μgを、調製物中に含マレ
るVF6の100μgと混合したこの調製物は、VF6−バキュロウィルスに感
染したSF9細胞からの、組織培養増殖培地を50簡M CaCl2を含む0.
1m)リス−[IC1pH8,0に対して透析して得た。
1/P6を添加後、同じ緩衝液に対する透析を3〜4日間継続した。
必要であれば、VF6−7粒子を超遠心分離により精製した。VF6−7−4粒
子を生産するために、精製ウィルスの100μgに相当するVF6を含有する細
胞溶解物を、VF6−7と37℃で2時間混合し、次に、40%スクロースによ
る、100.000 G、 2時間の超遠心分離をおこなった。この時間後、粒
子を上記のように遠心分離することにより精製した。
この実施例において使用されるワクチン組成物は、以下のようであるニー次免疫
用の使用には、各免疫原(表1)を70インド完全アジユバントに乳化させた。
二次および三次免疫用+=+t、各免疫[を70インドの不完全アジユバントに
乳化させた。等容量の免疫原とアジ1バントとを使用した。
13グループのマウスを、表1に挙げである調製物を筋肉内注射により免疫した
。各マウスを繁殖の前後に3回免疫した。
最初の免疫は、マウスが7週齢のときに行い、2適間隔で第二回および第三回の
ワクチン接種を行った。子は、マウスが12から144週齢ときに生まれた。
誕生後、マウスの子は雌親の乳を飲ませ、7日齢のときに口タウイルスの4つの
分離株の1つでチャレンジさせた。これらの分離株は、ウシロタウィルス株C4
86(血清型6)、サルロタウィルス株5AIL (血清型3)、ヒトロタウィ
ルス株DSL(血清型1)およびWa (血清型2)であった。5A11分離株
は、Dr。
H,Malherbe (San Antonio、 Texas)から得、分
離株WaおよびDSLはDr、 H,Greenberg (Stanford
University、 Ca1ifornia)から得た。ローカルの分離
株である0486株は、MA104細胞中で増殖した(Babiuk、 L、A
、ら、J C1’n Mic ob’ l (1977) i:610−617
)。これらのウィルスをMA104細胞中で増殖させ、回収し、前記記載(lj
azら、■息犯二吐ユg3 (1987) i:283−298)のようにチャ
レンジ用に濃縮した。各分離株のチャレンジ用量は、100μl容量のMEM、
約10’ PFU/マウスであった。チャレンジ用には、ウィルス調製物は、柔
軟性プラスチックの供給用チューブによる胃への挿管法により投与した。Try
pan bIue dye (GIBCO)を使用して挿管法の精度を評価した
。
下痢の発生を、以下にような臨床得点記録により、チャレンジ後72時間まで臨
床的に得点を記録した。
(−)生存マウスあるいは検屍において下痢が認められなかった;
(+)外見上の下痢は認められないが、検屍において半液体の結腸内容物が認め
られた;
(+十)腹部の触診では液体が存在し、結腸は液状の大便およびガスで満たされ
ていた;
(+++)外見上肛門付近は大便で汚れていて、触診では腸液が存在した;およ
び
(++++)液状の大便が肛門付近に存在し、腹部の触診では腸液が存在して肛
門から流れだし、重篤な脱水、結腸および盲腸内の腸液内容物ならびにガスの蓄
積にょる膨満が認められた。
(以下余白)
認められるように、ウィルス粒子、VP4単独、および混合粗細胞溶解物による
ワクチン接種は、チャレンジされた新生マウスに対して防御した。
従って、ウィルス粒子アセンブリー、これらのアセンブリーを含むワクチン組成
物、ならびにを推動物被検体におけるロタウィルス疾患の治療および予防の方法
が開示されている。
本発明の好ましい実施態様が詳細に記載されているが、添付の請求の範囲により
明確にされる趣旨の意図および範囲から逸脱することなく明白な改変がなされ得
ることは理解される。
45: 46: 47: 48: 49:Figure 1 (Sheet 3
of 6)6B: 69: 70: 71:
Figure 1 (Sheet 4 of 61CAG TTG ATG A
GA CCA CCA AAT ATG ACA CCA GCG GTA G
CG GCG TTAGTCAACTACTCT GGT GGT TTA T
ACTGT GGT CGCCAT CGCCGCMTGin Leu Mat
Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val
Ala Ala Leu>TTT CCA AAT GCG CAG CCA
TTT GAA CAT CACGCA ACA GTA GGA CTCT
GCGM TCT TAA CTT AGA CGT CAA ACA CTT
AGT CAT GAA CGG CTGThr Leu Arg Ile
Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu
Ala Asp>GCA AGCGAA ACA ATG CTA GCA A
AT GTG ACA TCT GTT AGA CAA GAACGT TC
G CTT TGT TACGAT CGT TTA CACTGT AGA
CAA TCT G’M’ C’ITAla Ser Glu Thr Met
Leu Ala Asn Val Thr Ser Van Arg Gin
Glu>TACGCG ATA CCA GT’r GGA CCA GTT
TTT CCA CCA GGT ATG MT TGGATG CGCTA
T GGT CAA CCT GGT CAA AAA GGT GGT CC
A TACTTA ACCTyr Ala Ile Pro Val Gly
Pro Val Pha Pro Pro Gly Mat Asn Trp>
Figure l (Sheeセ 5 of 6)11コ0 1140 115
0 11601コ50
TGT GACC
ACA CTG G
Figura l (Sheet 6 of 6)Figure ] (She
e虹17 of 17)−眸
2B: 29: :lO: 31:
Figure 4 (Sheet 2 of 9)^sn Gly Glu T
hr Pro Asn Ala Thr Thr Gly Tyr Tyr S
er Thr Thr>590 600 610 620 6]0AACTTT
GACACT GTA AACATG ACA GCA TAT TGT G
AT TTT TAT ATAAsn Phe Asp Thr Val As
n Met Thr Ala Tyr Cys Asp Pha Tyr Il
a>ATT CCA TTA GCA CAA GAA GCA AAA TG
CACT GM TACATA AAT MTlla Pro Leu Ala
Gun Glu Ala Lys Cys Thr Glu Tyr Ila
Asn Asn>GGA TTA CCA CCA ATA CAA MT
ACG AGA AAT ATCGTA CCA GTT TCGGly La
u Pro Pro Ile Gin Asn Thr Arq Asn 工l
a Val Pro Val Sar>ATA GTA TCA AGG AA
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CAAAla Val Ser Arq Asn IIs Val Tyr
Thr Arg Ala Gin Pro Asn Gln>GACATA G
TG GTA TCA AAA ACT TCA TTA TGG AAA G
AG ATG CAA TATAsp Ila Val Val Ser Ly
s Thr Sar Lau Trp Lys Glu Met Gin Ty
r>Figure 4 (Sheet 3 of 9)820 EDO8408
50
Lys Ser Gly Gly Leu Gly Tyr Lys Trp
Ser Glu Val Ser Pha Lys>910 920 9:10
940
CCA GCT AAT TAT CAG TACACA TAT ACCAG
A GAT GGT GM GAA GTTPro Ala Asn Tyr
Gin Tyr Thr Tyr Thr Arg Asp Gly Glu
Glu Val>Thr Ala His Thr Thr Cys Ser
Val Asn Gly lie Asn Asp Pha Asn>1000
1010 1020 10:10TAT MT GGT GGA TCA T
TA CCG ACT GAT TTCGTA ATA TCA AAA TA
TTyr Asn Gly Gly Ser Leu Pro Thr Asp
Pha Val Ile Ser Lys Tyr>GAA GTG AT’
r AAG GM AAT TCT TTT GTG TAT ATA GAC
TACTGG GACGlu Val 工1e Lys Glu Asn Se
r Phe Val Tyr IIeAsp Tyr Trp Asp>Fig
ure 4 (Sheet 4 of 9)GAT TCA CAA GCA
’I’rT AGA AACATG GTA TAT GTA CGCTCG
TTG GCAAsp Sar Gin Ala Pha Arg Asn M
et Val Tyr Val Arg Sar Leu Ala>Ala A
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ly Asp Tyr Ser Phe>GCG ATT CCA GTT G
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T GTGAla Ila Pro Val Gly Asn Tyr Pro
Val Mat Thr Gly Gly Ala Val>TCA TTG
CAT TCA GCA GGT GTA ACT T’rA TCA AC
G CAG T’IT ACA GATSar Lau His Sar Al
a Gly Val Thr Lau Ser Thr Gin Phe Th
r Asp>Phe Val Sar Leu Asn Ser Lau Ar
g Phe Arg Pha Arq Leu Sar Val>Figure
4 (Sheet 5 of 9)1360 1:I70 1380 139
0Asp Leu Glu Arg Gin Leu Gly Glu Leu
Arg Asp Glu Pha Asn Asn>rtqure 4 (S
haeセ 6 of 9)AAA MG TCA AGT CTCGCT AA
CTCA GTG TCA ACG CTCACT GAT TCALY!!
L!/S Ser Ser Leu Ala Asn Sar Val Ser
Thr Lau Thr Asp Ser>T’rG TCT GAT GC
A GCA TCA TCA ATT TCT AGA AGT GCA TC
G GTT AGALau Sar Asp Ala Ala Ser Ser
Ile Ser Arq Ser Ala Ser Val Arg>TCA
GTT AGT TCA ACT GCA TCA GCT TGG ACG
GM GTA TCT MCATTSer Val Sar Ser Thr
Ala Ser Ala Trp Thr Glu Val Sar Asn
Ila>Thr Sar Asp IIs Asn Val Thr Thr
Sar Sar Ila Ser Thr Gin Thr>1850 18
60 1870 18B0 1890TCA ACA ATA AGCAGA
AGG TTA AGA CTA AAA GAA ATG GCG ACT
CAASer Thr 工la Ser Arg Arg Lau Arg L
au t、ys alu Met Ala Thr Gin>Figure 4
(Sheaセ 7 of 9)ACG GACGGT ATG AAT TT
T GAT GAT ATA TCA GCA GCA GTA CTCMGT
hr Asp Gly Met Asn Pha Asp Asp Ila S
er Ala Ala Val Lau Lys>ACT AAA ATT G
AT MA TCA ACCCAG TTA AAT ACA AAT ACA
TTG CCGThr Lys Ile Asp Lys Ser Thr
Gin Leu Asn Thr Asn Thr Lau Pro>GAA
ATA GTA ACT GAG GCT TCA GAA AAG TTT
ATA CCA AAT AGA GCGGlu Ile Val Tbr G
lu Ala Ser Glu Lys Phe IIs Pro Asn A
rg Ala>TACCGT GTA ATT AAA GAT GAT GA
A GTG CTA GAG GCT AGT ACT GATTyr Arg
Val Ile Lys Asp Asp Glu Val Leu Glu
Ala Ser Thr Asp>GGT AAA TAT TTCGCT
TACMA GTT GAA ACCATT TTG AAG AGA TTC
Gly Lys Tyr Phe Ala Tyr Lys Val Glu
Thr Ile Lau Lys Arq Phe>Figure 4 (Sh
eet 8 of 91Asp Pro Arg Val Leu Arg G
lu Phe Ila Asn Gin Asp Asn Pro IIs>2
300 2:llO2]20 2330 2コ402コ50 2360
Figure 4 (Sheet 9 of 9)2:10 240 250
260 270ACA GGT TCA ATG GAT ACT GCG T
AT GCA GACTCT ACA CM AGT GAGTGT CCA
AGT TACCTA TGA CGCATA CGT CTG AGA TG
T GTT TCA CTCThr Gly Ser Met Asp Thr
Ala Tyr Ala Asp Ser Thr Gin Ser Glu
>280 290 :lOO310
CCA T’l’r TTG ACA TCA ACCC’l’r TGT T
TG TAT TAT CCT GTT GAG GCAGGT AAA AA
CTGT AGT TGG GAA ACA AACATA ATA GGA
CAA CTCCGTPro Pha Leu Thr Ser Thr La
u Cys Leu Tyr Tyr Pro Val Glu Ala>32
0 1:10 340 350 :160TCA AACGAA ATA GC
T GAT ACCGAA TGG AAA GAT ACCTTA TCA
CAAAGT TTG CTr TAT CGA CTA TGG CTT A
CCTTT CTA TGG MT AGT GTTSer Asn Glu
Ile Ala Asp Thr Glu Trp Lys Asp Thr
Lau Ser Gin>:I70 380 390 400
410 420 4:10 440 450Figure 5 (Sheet
2 of 51TGCGAT TAT AAT T’rA GTT TTA A
TG MA TAT GACTCT ACA CAA G入AACG CTA
ATA TTA AAT CAA AAT TACTl’r ATA CTG
AGA TGT GTT C?rCys Asp Tyr Asn Leu V
al Leu Mat Lys Tyr Asp Ser Thr Gin G
lu>CTA GAT ATG TCT GAA TTG GCCGAT CT
T ATA TTG AACGAA TGG CTG590 600 11+1
0 620 630Figure 5 (Sheet 3 of 51AGG
GAG AACGTA GCA GTCATA CAG GTA GGCGGC
GCG AACATT TTAGACATCACA GCT GAT CCA
ACA ACT ACA CCA CAG ACA GAG ACA ATGF
iqura 5 (Shaat 4 of 5)Figura 5 (Shee
t 5 of 5)堪11店 YDVT
RORVi’7 1060
1060Fi 6 (Shaat 7 of 7)VF6.7 VP64
VP6.7−J VF84.7
国際調査報告
Fttm pev/lsAMo +−−−−1111’wl 1211 ・P&
a12I O&’tl国際調査報告
フロントページの続き
(51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号C12R1:91)
(81)指定国 EP(A’r、BE、CH,DE。
DK、 ES、 FR,GB、 GR,IT、 LU、 NL、 SE)、0A
(BF、BJ、CF、CG、CI、CM、GA、GN、ML、MR,SN、TD
、TG)、AT、AU、 BB、 BG、 BR,CA、 CH,DE、 DK
、 ES。
FI、GB、HU、JP、KP、KR,LK、LU、MC,MG、 MW、 N
L、 No、PL、 RO,SD、 SE、SU
FI
(72)発明者 イジャズ、モハメッド クハリッドカナダ国 サスカチェワン
ニス7ジエイ4ジェイ6;サスカトウーン、キンゲスメロ プルバード 21
5−エイピーティー(72)発明者 パーカー、マイケル ディー。
カナダ国 サスカチェワン ニス7ケイ2ニス3.サスカトウーン、シックスス
アベニュー−311−エイピーティー 1706
Claims (21)
- 1.脊椎動物被検体において免疫学的応答を誘起し得るウイルス粒子アセンブリ ーであって、 (a)VP6と実質的に相同で機能的に等価である内側のキヤプシドタンパク質 ;および (b)(i)VP4と実質的に相同で機能的に等価であるタンパク質、あるいは その機能的フラグメント、および(ii)VP7と実質的に相同で機能的に等価 であるタンパク質、からなる群より選択される1つ以上の外側キャプシドタンパ ク質;を含む、ウイルス粒子アセンブリー。
- 2.(b)がVP4と実質的に相同で機能的に等価であるタンパク貧あるいはそ の機能的フラグメントを含む、請求項1に記載のウイルス粒子アセンブリー。
- 3.(b)がVP7と実質的に相同で機能的に等価であるタンパク質あるいはそ の機能的フラグメントを含む、請求項1に記載のウイルス粒子アセンブリー。
- 4.(b)がVP4と実質的に相同で機能的に等価であるタンパク質あるいはそ の機能的フラグメント、ならびにVP7と実質的に相同で機能的に等価であるタ ンパク質あるいはその機能的フラグメントを含む、請求項1に記載のウイルス粒 子アセンブリー。
- 5.(a)がVP6を含み、そして(b)がVP4を含む、請求項1に記載のウ イルス粒子アセンブリー。
- 6.(a)がVP6を含み、そして(b)がVP7を含む、請求項1に記載のウ イルス粒子アセンブリー。
- 7.(a)がVP6を含み、そして(b)がVP4およびVP7を含む、請求項 1に記載のウイルス粒子アセンブリー。
- 8.前記(a)および(b)のタンパク質が組換え手法で産生される、請求項1 に記載のウイルス粒子アセンブリー。
- 9.VP4およびVP7とともにアセンブルされたVP6を含む、脊椎動物被検 体において免疫学的応答を誘起し得るウイルス粒子アセンブリー。
- 10.薬学的に受容可能な賦形剤および請求項1に記載のウイルス粒子アセンブ リーを含む、ワクチン組成物。
- 11.薬学的に受容可能な賦形剤および請求項9に記載のウイルス粒子アセンブ リーを含む、ワクチン組成物。
- 12.VP6、VP4およびVP7からなる群より選択される、1つ以上のアセ ンブルされていないタンパク質をさらに含む、請求項10に記載のワクチン組成 物。
- 13.VP6、VP4およびVP7からなる群より選択される、1つ以上のアセ ンブルされていないタンパク質をさらに含む、請求項11に記載のワクチン組成 物。
- 14.前記アセンブルされていないタンパク質が、細胞溶解物中に提供される、 請求項12に記載のワクチン組成物。
- 15.前記アセンブルされていないタンパク質が細胞溶解物中に提供される、請 求項13に記載のワクチン組成物。
- 16.さらにアジュバントを含む、請求項10に記載のワクチン組成物。
- 17.さらにアジュバントを含む、請求項11に記載のワクチン組成物。
- 18.脊椎動物被検体におけるロタウイルス疾患を治療あるいは予防する方法で あって、請求項10に記載のワクチン組成物の治療上有効な量を該被検体に投与 することを包含する、方法。
- 19.脊椎動物被検体におけるロタウイルス疾患を治療あるいは予防する方法で あって、請求項11に記載のワクチン組成物の治療上有効な量を該被検体に投与 することを包含する、方法。
- 20.脊椎動物被検体におけるロタウイルス疾患を治療あるいは予防する方法で あって、請求項12に記載のワクチン組成物の治療上有効な量を該被検体に投与 することを包含する、方法。
- 21.脊椎動物被検体におけるロタウイルス疾患を治療あるいは予防する方法で あって、請求項13に記載のワクチン組成物の治療上有効な量を該被検体に投与 することを包含する、方法。
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