JPH06504190A - アセンブルしたウイルス粒子およびロタウイルス疾患ワクチンにおけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アセンブルしたウィルス粒子 およびロタウィルス疾患ワクチンにおけるその使用改血立工 本発明は、一般的に、ワクチンおよび免疫原として利用されるウィルス様粒子に 関連する。特に、本発明は、アセンブルしたロタウィルス構造タンパク質および ロタウィルス感染症の予防および改善におけるアセンブリーの使用に関する。

ロタウィルスは、鳥類および哺乳類の広い種類で、消化管障害および下痢を引き 起こす。ロタウィルスの数種類の血清型が同定されており、そのうちの４種（血 清型１〜４）はヒトから、５種（血清型３〜７）他の動物から見いだされている 。最近の試験により、異なる血清型に属する株間の交配保護（ｃｒｏｓｓ　ｐｒ ｏｔｅｃｔｉｏｎ）がヒトを含む動物において起こり得ることが示されている。

Ｉｊａｚら、ＬＬＬ１２１９９０　）　（印刷中）ＨＦｌ。

ｒｅｓら、Ｊ　ＣＭ　ｃ　ｏｂｉｏｌ（１９８９）２７：５１２−５１８゜ロタ ウィルスゲノムは、二重鎖ＲＮＡの１１のセグメントからなると考えられている 。この１１のゲノムは、少なくとも６個のウィルス構造タンパク質の産生をコー ドする。完全なウィルス粒子では、これらの６個のタンパク質は二重の設配列中 に存在する。外殻またはキャプシドは、３種のタンパク質、すなわちウィルスタ ンパク質？（ＶＦ６）、ウィルスタンパク質４（ＶＦ６）、さらにまだ充分に特 徴付けられていない第３番目のタンパク質からなる。内殻タンパク質は、３種類 あり、ウィルスタンパク質ｆ（ＶＰｌ）、ウィルスタンパク質２（ＶＰｌ）、　 ウィルスタンパク質６（ＶＦ６）である。

ＶＦ６は、主要な外殻糖タンパク質であり、その非還元型は約３８ｋＤ（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ測定）、その還元型は約４２ｋＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定）の分子量 を持つ。ＶＦ６は、約３２５個のアミノ酸からなる。いくつかのロタウィルス分 離株のアミノ酸配列が決定されており、その配列は約７５〜８６％の相同性を有 している。ヒトおよび動物種の間の保存領域は、Ｅｓｔｅｓ、　Ｍ、　Ｋ、ら肛 以坦山山１虹（１９８９）ｄ：４１０−４４９に概説されている。このタンパク 質は、宿主細胞に結合することが知られている（Ｓａｂａｒａ、　Ｍら、　Ｌ！ １ｘＡｉ（１９８５）■：５１］−６６）。中和モノクローナル抗体を開いたＶ Ｆ６のエピトープマツピングは、約１４ｋＤの分子量を持つペプチド成分に中和 −吸収ドメインを局在化した（Ｓａｂａｒａ、　Ｍら前記）。この１４ｋＤフラ グメント中に由来する合成ペプチドはまた、ウィルス感染力を中和させることが 示されている（Ｉｊａｚら、前記）。

第２番目の外側キャプシドタンパク質であるＶＦ６（以前はＶＦ６と呼ばれてい た）は、７７６個のアミノ酸からなり、そしてその非還元型で約８２ｋＤ、およ び還元型で約８４ｋＤの分子量を持つ。

ウシＶＰ４の配列は決定され、（Ｐｏｔｔｅｒ、Ａ、Ａ、ら、鳳坦」立ｌユＵ（ １９ｇ？）　ＬＬ＋４３６１＞、サルｖＰ４の一部（７）アミノ酸配列を有する （Ｍａｃｋｏｖ、ら、　ａｔ　ａ　Ｓｃ’　Ｕ　（１９８Ｂ）　８５：６４５− ６４９）。ＶＦ６は、赤血球凝集活性を有し、インビボにおいてへテロタイプの 受動保護を提供する中和抗体の産生を誘導する（Ｏｆｆｉｔ、Ｐ、Ａ、ら、ＬＬ 工虹（１９８６）　Ｊ５ニア０Ｏ−７０３）。ＶＦ６は、ＶＦ６と結合して、ウ ィルス血清型決定において反応性である。

ＶＦ６のダイマーは結合して、ロタウィルス外殻からより末端に伸びるロタウィ ルスの表面スパイクを形成する。ＹＦ３は、ウィルスの宿主細胞内への貫通に於 て重要であり、そしてその感染力は、トリプシンによるＶＦ６の切断により増加 する。トリプシンにより増強された感染力は、すべてのロタウィルスに共通した 特徴であり、そしてトリプシンの切断部位もまた、Ｅｓｔｅｓら（前記）の概説 した通り、保存されている。

ロタウィルスの内側キャプシドは、少なくとも、　ＶＰＩ、ＶＰｌ、ＶＦ６と呼 ばれる３つのタンパク質を含む。本明細書に関連するのは４５ｋＤのタンパク質 であるＶＦ６である。ウシＶＰ６は、ウィルス粒子および感染細胞の両方におい て、サブユニット間の結合が非共冑結合的相互作用でなる、ユニットのトリマー で存在すると考えられる。これらのトリマーユニット複合体は、ジスルフィド架 橋により、数人の研究者が電子顕微鏡を用い観察している輪状構造を示すと考え られる、より大きなユニットになる。

ＶＦ６は、サブグループ抗原として同定され、そしてこのタンパク質に対するモ ノクローナル抗体の幾つかは、すべてのロタウィルスに反応し、そして単一のロ タウィルス型に対するポリクローナルな血清は大部分のロタウィルス株を検出し 得るので、ロタウィルスグループ共通抗原と記載された。その抗原特性に加え、 このヌクレオ手中ブシドタンパク質は、免疫原性が非常に高く、数人の研究者は 、このタンパク質に対する抗体が中和能を示すことを見いだしている（例えば、 ０ｆｆｉｔら、ムＬ工は（１９８６）　５８ニア００−７０３を参照）。

ＶＦ６は効果的なキャリアータンパク質であり（Ｒｅｄｍｏｎｄ、　Ｍ、　Ｊ、 ら、犯０−山１１ユ１．（１９９０）　（印刷中）、モしテＶＰ４は、Ｖ６％７ ７−およびオリゴマータンパク質のユニットと結合する（Ｒｅｄ■ｏｎｄ、Ｍ、 Ｊ、ら前記）。ＶＦ６−ＶＰ６結合は、ＳＤＳ中でのボイリングなどの過酷な処 理に耐えることが示されている。さらに、ＶＦ６は、インビトロにおいて、カル シウムに依存する工程を用いて、ＶＰｌおよびＶＦ６と、ウィルス粒子を形成し 得る（Ｒｅａｄｙ、　Ｋ、　Ｆ、　Ｍ、ら、■匹江■（１９８８）工：２６９− ２７３）。得られたアセンブリーは、全ウィルスおよびＶＦ６とＶＰＴ上の免疫 支配部位に対し特異的な抗体と免疫反応性で、そしてこの免疫反応性は、天然ウ シロタウィルス（ＢＲＶ）のそれと等価である（Ｒｅａｄｙ、　Ｋ、　Ｆ、　Ｍ 、ら、前記）。

本発明は、ＶＦ６および／またはＶＦ６、またはそれらの免疫原性領域に相当す るペプチドまたはタンパク質を、ＶＦ６との組み合せで包含する、アセンブルし たウィルス粒子を提供する。これらのアセンブルした粒子は、ワクチンおよび中 和抗体産生促進において有効である。このようなワクチンは弱毒化したウィルス ワクチンの使用に代替を提供する。

ｌ匪旦皿丞 本発明は、ウィルスペプチド、またはそのエピトープ領域の発見に基づき、ウィ ルス粒子としてアセンブルすると、それを投与した被験動物の免疫反応を誘導し 得る。これらのアセンブリーを含むワクチンは、弱毒化ウィルスワクチンでなる ワクチンに比べ、より安全でより扱いやすい。

従って、一つの局面において、本発明は、を推動物における免疫反応を誘導し得 るウィルス粒子アセンブリーを目的とする。このウィルス粒子アセンブリーは、 以下を包含する＝（ａ）ＶＦ６と実質的に相同および機能的に等価である内側キ ャプシドタンパク質；および （ｂ）以下の群から選択される一つ以上の外側キャブジッドタン゛　バク質、（ ｉ）ＹＦ３と、実質的に相同および機能的に等価なタンパク質またはその機能的 なフラグメント、および（ｉｆ）ＶＦ６と実質的に相同および機能的に等価なタ ンパク質。

別の実施態様において、本発明は、を推動物被験体における免疫反応を誘導し得 るウィルス粒子アセンブリーであって、ＶＦ６およびＶＦ６とアセンブルしたＶ Ｆ６を包含するウィルス粒子アセンブリーを目的とする。

さらに別の実施態様において、本発明は、薬学的に許容し得る賦形剤、および上 記のアセンブルしたウィルス粒子を包含ワクチン組成物を目的とする。

他の実施態様において、本発明は、上記ワクチン組成物を用いて、を推動物被験 体においてロタウィルス性疾患の治療および予防法を目的とする。

本発明のこれらのおよび他の実施態様は、本明細書の開示を考慮すれば、当業者 により容易に実施し得る。

図面の簡単な説明 図１は、０４８６株（ウシ）のＶＰ６タンパク質のヌクレオチド配列および推定 されるアミノ酸配列を示す。

図２は、数種の株由来のロタウィルスｖＰ６のアミノ酸配列を比較する：ウシＲ Ｆロタウィルス（ＲＯＢＭＣＰ＞、ヒト１０７６０タウイルス（ＲＯＩＨＶＰ６ ）、ロタウィルスセグメント６内殻タンパク質ｖＰ６ＲＮＡ（ＲＯＩＳ２ＶＰ６ ）、＋７ｖ■２０タウイルｘ　（ＲＯｔＶＶＰ６Ｈ２）、つ？Ｆ１１４０タウイ ルｘ　（ＲＯＩＶＶＰ６Ｆ１）、ヒトＷａａ９ｔイ／’　Ｘ　（ＲＯ２ＳＥＧ６ ）、ブタＧｏｔｔｆｒｉｅｄｅ２タウイルス（ＲＯＩＰＶＰ６）、ブタ０群ロタ ウィルス（ＰＲＶＶＰ６）、およびサル５Ａ１１０タウイルＸ　（ＲＯＴＧ６Ａ ）。

図３は、数種の株由来のロタウィルスｖＰ４のアミノ酸配列を比較する：　Ｋ８ ＪＵ、ＤＳＬ、Ｍ３７．ＳＴ３，５ＡＩＩ、ＲＲＶ０図４は、０４８６株（ウシ ）のＶＰ４タンパク質のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。

図５は、Ｃ４８６株（ウシ）のＶＰ７タンパク質のヌクレオチド配列および対応 するアミノ酸配列を示す。

図６は、数種の株由来のロタウィルスＶＰ７のアミノ酸配列を比較する：サル１ １０タウイルス（ＲＯＴＶＰ７）、アカゲザルロタウイルス（ＲＯＲＶＰ７）、 ブタ０ＳＵｌ：ｌ’フィルス（ＰＲｖＯ３ＵｖＰ７）、ヒトロタウィル７、　（ ＲＯＨＶＰ７Ａ）、ブ９　Ｇｏｔｔｆｒｉｅｄ　Ｏ９’フィルス（ＰＲＶＰＲＶ Ｐ７Ｇ）、ウシｕｋロタウィルス（ＲＯＢ７）、およびブタメジャーＣロタウィ ルス（ＰＲＶＰＲＶＶＰ７）。

図７は、インビトロにおけるアセンブルしたロタウィルス粒子の産生の図示した ものである。

及旦旦１皿ユ鳳里 本発明の実施は、特に記載のない限り、免疫学、タンパク質化学、分子生物学、 微生物学、および組み換えＤＮＡ技術の従来技術で、当業者に周知の技術を使用 し得る。これらの技術は、文献において充分に説明されている。例えば、展Ｏｏ 　’　ｍｕ　ｏ　、　Ｖｏｌｓ、　Ｉ−ＩＶ（Ｄ、ＭＪｅｉｒ　ａｎｄ　Ｃ，Ｃ Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ編、１９８６．　Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｌ ｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　）；　Ｍｅｔ　ａｄｓ　’　ｓｏ　ｏ　（Ｓ、 Ｃｏ１ｏｖｉｃｋ　ａｎｄ　Ｎ、Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅ＋＊ｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、Ｉｎｃ、）　；　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆　Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、ｏ　ｅｕａ　Ｃｏｎｎ：　ａｂｏａｔｏ　ＭａＬＬａ　２ｄＥｄｉｔｉｏ ｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓ ｓ、　１９８９）　；　シ］旦■１ｅｏｔｉ　ｅ　Ｓ　ｔ　ｓ’　（Ｍ、Ｊ、　 Ｇａｌｔ編、１９８４）：　およびＢ凹道玉、　ＶｏｌｕｍｅｓｌおよびＩＩ（ Ｄ、Ｎ、Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）を参照。

本明細書で記載されるすべての特許、特許出願、刊行物は、前述あるいは後述に かかわらず、本明細書によって、参照によって援用される。

Ａ、２！Ｊ 本発明の開示において、以下の用語は、以下に示すように定義される。

ｒ　ＶＰ６Ｊとは、当技術分野において認められたレオウィルス科（ｆａｍｉｌ ｙ　Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）のすべての橿または株からの内側キャプシドの主要 ウィルスタンパク質を意味する。例えば、Ｋａｐｉｋｉａｎら、■二■」ｕ（Ｂ 、Ｎ、Ｆｉｅｌｄｓら編、１９８８）を参照。ＶＰ６タンパク質が単離し得、本 発明で使用し得るロタウィルス株の例は、限定されないが、サル５ＡＩＬ、ヒト ロタウィルス、ウシＵＫロタウィルス、ヒトＷａまたはＷロタウィルス、ヒト３ ２０タウイルス、アカゲザルロタウイルス、”０”ａｇｅｎｔ、ウシＮＣＤＶロ タウィルス、ヒト３２０タウイルス、ヒト３２０タウイルス、ヒト３９０ロタウ イルス、ヒトロタウィルス、ヒトロタウィルス、ヒト１ｆａｌｋ　５７／１４０ タウイルス、ヒト３２０タウイルス、ヒト３２０タウイルス、ヒトＮｅｍｏｔｏ ロタウィルス、ヒト３２０タウイルス、ヒト３９０ロタウイルス、アカゲザルＭ Ｍ０１８００６０タウイルス、イヌＣＵ１０タウイルス、ネコＴａｋａロタウィ ルス、ウマ■２０タウイルス、ヒト　Ｓｔ、　Ｔｈｏ＋＊ａｓ　Ｎｏ、３および Ｎ０１４０タウイルス、ヒトＨｏ５ｏｋａ曹ａロタウィルス、ヒトＨｏｅｈｉロ タウィルス、ブタ５Ｂ２０タウイルス、ブタＧｏｔｔｆｒｉｅｄロタウィルス、 ブタ５ＢＩＡロタウイルス、ブタＯＳＵロタウィルス、ウマＨ１０タウイルス、 ニラ１Ｊｃｈ、２０タウイルス、シチメンチツウＴｙ、　１０タウイルス、ウシ ０４８６０タウイルスおよびこれらに由来した株を包含する。

このように、本発明で使用されるＶＦ６は、サブグループ！、サブグループ１■ 、またはまだ未同定のサブグループのすべて、および血清型１−７、および未同 定の血清型のすべてのロタウィルス系のＶＦ６を包含する。

ＶＰ６タンパク質は、ＶＰ６ポリペプチドのクラス、またはクラスのすべてのメ ンバーに特有なロタウィルスアミノ酸配列を包含する。代表的なウシ組み換え（ ＢＲ）ＶＰ６Ｃ４８６株のヌクレオチド配列および演鐸されるアミノ酸配列を図 １に示す。図２は、いくつかの異なるロタウィルス株のアミノ酸配列を示す。図 示されるように、記載されたロタウィルス株間で広く相同性が存在する。他のＶ Ｐ６ヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、本発明において用途を見いだし得、図 示した配列は、既知のｖＰ６配列の代表に過ぎない。

ｒ　ＶＰ４Ｊとは、当技術分野において認められた、レオウィルス科のすべての 種または株からの外側キャプシドのウィルスタンパク質を意味する。ＶＰ４タン パク質を単離し得、本発明で使用し得るロタウィルス株の例は、限定されないが 、ＶＦ６に参照して上記に記載された株である。

ＶＦ６　（以前はＶＦ６と呼ばれた）は、７７６個のアミノ酸からなる。

［８，ＭＵ、　ＤＳＬ、　Ｍ３７．　ＳＴ３．５ＡＩ１．およびＲＲＶ系由来の ＶＦ６アミノ酸配列を図３に示す。０４８６株（ウシ）からのＶＦ６のヌクレオ チド配列および演鐸されるアミノ酸配列を図４に示す。また、他の配列が、本明 細書において用途を見いだし得る。

ｒＶＰ７Ｊは、当技術分野において認められた、レオウィルス科のすべての種ま たは株からの外側キャプシドの主要ウィルスタンパク質を意味する。ＶＰ７タン パク質を単離し得、そして本発明で使用し得るロタウィルス株の例は、限定され ないが、ＶＦ６に参照して上記に記載された株である。

ＶＦ６は、約３２５個のアミノ酸からなり、そしてＣ４８６株（ウシ）からのＶ Ｔ’７のヌクレオチド配列および演鐸されるアミノ酸配列を図５に示す。Ａｒ１ ａｓら、ム刀エバ（１９８４）　５０：６５７−６６１は、サル５ＡＩＬからの ＶＦ６のヌクレオチド配列を開示する。図６は、ロタウィルス数珠のアミノ酸配 列を示す。ＶＦ６は、血清型で制限された相同性を示す。上記配列は、代表的な ものであり、これに限るわけではない。従って、他の機能配列がまた、本発明に おいて使用し得る。

２つのＤＮＡまたはタンパク質配列が、分子のある定義された長さで、そのヌク レオチドまたはアミノ酸が、少な（とも約８５％以上（好ましくは少なくとも約 ９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％）一致するとき「実質的相同 」という。実質的に相同なりＮＡ配列は、例えば、特定の系で規定されているよ うな厳格な条件下におけるサザーン／％イブリダイゼーシ１ン実験により同定し 得る。適当な／＼イブリダイゼーシ〕ン条件の規定は、当業者に周知である。例 として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記を膠照。

用語「機能的に等価」は、天然の配列により誘導される免疫反応と等価の免疫反 応を誘導するタンノくり質を産生じ得る鎖を定義し得る外側または内側キャプシ ドロタウィルスタンパク質のアナログの配列をいう。従って、本明細書で使用さ れるロタウィルスタンパク質は、生体内タンノくり質のアミノ酸配列と同じ配列 を有する必要がある。

ロタウィルスタンパク質の「機能フラグメント」と（マ、全体配列により誘導さ れる免疫反応と等価の免疫反応を起こす能力のあるフラグメントである。感染は ＶＦ６の末端領域に対するモノクローナル抗体により抑制し得るので、ＶＦ６の 末端は、ピリオンの細胞への最初の吸着に関与することが示された。

さらに、酵素トリプシンは、ウィルスの感染力を増強する。

この増強は、トリプシンがウィルスの細胞への吸着の効率または速度に影響せず 、細胞内にみられる非被覆粒子の濃度を増加するので、吸着の後に作用すると考 えられる。トリプシンの感染力増強分子メカニズムは、ＶＰ４タンパク質を、そ れぞれ分子量約２８　ｋＤａおよび６０ｋＤａの２つのフラグメントに切断を経 由して起こる。このため、ＶＦ６のトリプシン分解部位は、ロタウィルス複製に おいて重要である。従って、少な（とも最初の２５５個のＮ末端アミノ酸に実質 的に相同であるアミノ酸配列からなるフラグメントは、図４に示すように、そし てそれがトリプシン分解部位を含み、これらの７ラグメントが上記で定義したよ うに免疫反応を生じ得る限りまた、本発明において用途を見いだし得る。

「ウィルス粒子アセンブリー」は、ロタウィルスの外側および内側キャプシドタ ンパク質、またはそれらに実質的に相同および機能的に等価なタンパク質、また はそれらの機能フラグメントのアセンブリーをいう。以下により詳細に記載する 通り、この粒子は、インビトロでアセンブルし、二重殻を持つロタウィルスと類 似する。

用語「エピトープ」は、特異的抗体分子が結合する抗原またはハプテンの部位を いう。この用語は、「抗原決定基」あるいは「抗原決定部位」に置き換えて使用 される。

ある組成物またはワクチンに対する「免疫反応」は、を推動物被験体において、 目的の組成物またはワクチンに対する細胞性および／または抗体媒介性免疫反応 の発現である。通常、このような反応は、目的の組成物またはワクチンに含まれ る抗原または抗原（複数）に特定的に佳句けられた、被験体が生産する抗体、Ｂ 細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞毒性Ｔ細胞か ら成る。

「免疫原性タンパク質」は、投与された被験体で免疫反応を誘導するタンパク質 である。

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では置き換えて使用さ れ、その最も広い意味で用いられる。

すなわち、ペプチド結合により結合したアミノ酸のすべてのポリマー（ジペプチ ドまたはそれ以上）を示す。従って、この用語は、オリゴペプチド、タンパク質 フラグメント、アナログ、改変体、融合タンパク質等を包含する。

「天然」タンパク質またはポリペプチドは、ロタウィルスまたはロタウィルス感 染細胞から採取したタンパク質またはポリペプチドをいう。従って、この用語は 、天然に存在するロタウィルスタンパク質およびそのフラグメントを含むロ　「 非天然」ポリペプチドは、組み換えＤＮＡ法または直接合成により産生されるポ リペプチドをいう。「組み換え」ポリペプチドは、組み換えＤＮＡ技術により； すなわち・所望のポリペプチドをコードする外部ＤＮＡ構築物により形質転換さ れた細胞から産生されたブリペプチドをいう。

「レプリコン」は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律ユニットとして働く； すなわち、それ自身の制御で複製し得る、すべての遺伝子要素（例、プラスミド 、染色体、ウィルス）である。

「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが付着したレプリコンで、付 着したセグメントの複製および／または発現が起こる。「発現ベクター」は、自 律複製または組み込みの可能なベクターをいい、そして適切な宿主内の所望のＤ ＮＡ配列の転写および翻訳を指示する制御配列を含む。

「コード配列」は、ポリペプチドのに転写および／または翻訳されるポリヌクレ オチド配列である。

「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして下流（すなわち ３′方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ制御領域である。

ＲＮＡポリメラーゼとプロモータ配列の結合によりコード配列の転写が起こり； 得られたｍＲＮＡの翻訳によりコード配列中にフードされたポリペプチドが得ら れる場合、フード配列は細胞内でプロモーター配列の「制御下」にある。

「作動可能に結合された」は、要素が、通常の機能を遂行するように配置された 並置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結した制御配列は、コード配列 を発現し得る。

「制御配列」は、コード配列の転写および／または翻訳を制御する配列である； これらは、限定されないが、ブロモータ−配列、転写開始および終結配列、翻訳 開始および終結配列を包含し得る。さらに「制御配列」は、コード配列中にコー ドされたポリペプチドのプロセ・ノシングを制御する配列である；これらは、限 定されないが、配列制御分泌、プロテアーゼ切断、およびポリペプチドのグリコ ジル化を制御する配列を包含し得る。

「シグナル配列」は、コード配列の前に含み得る。この配列は、シグナルペプチ ド、ポリペプチドのＮ末端をコードし、これが、宿主細胞に対し、ポリペプチド を細胞表面に移動、またはポリペプチドを培地中に分泌するのを伝える。そして このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞により切り取 られる。

「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列により、形質転換された、あるいは形質転換 し得る細胞である。

細胞は、細胞膜の内側にこのような外因性ＤＮＡが導入された時外因性ＤＮＡに より「形質転換される」。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを形成する染色体ＤＮ Ａに組み込まれ得（共有結合的に結合される）、または得ない。例として、原核 生物および酵母において、外因性ＤＮＡは、プラスミド等のエピゾーム要素に維 持され得る。真核細胞に関しては、安定に形層転換した細胞は、外因性ＤＮＡが 染色体に組み込まれ、染色体複製により娘細胞に遺伝される細胞である。この安 定性は、外因性ＤＮＡを包含する娘細胞の集団でなる細胞株、またはクローンを 確立する真核細胞の能力により示される。

「クローン」は、単一細胞またはその体細胞分裂による共通の祖先に由来した細 胞集団である。「細胞株」は、インビトロで多世代にわたり安定に増殖し得る主 要細胞のクローンである。

ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然に他の分子と結合することが見いだされな い、別のＤＮＡ分子内の、または別のＤＮＡ分子に結合した、同定可能なセグメ ントである。従って、異種領域が細菌遺伝子をコードする時、その遺伝子は、通 常、起源細菌のゲノム中の細菌遺伝子に側面を接しないＤＮＡにより部面を接し 得る。異種コード配列の別の例は、コード配列それ自身が天然で見いだされてい ない構築物である（例、天然遺伝子と異なるコドンを持つ合成配列）。アレリッ クな改変体または自然発生的な突然変異は、本明細書では、ＤＮＡの異種領域と ならない。

Ａを含む組成物が、その組成物中のＡ＋Ｂ合計重量の少なくとも約８５％がＡで ある時、Ｂを「本質的に含まない」。

好適には、Ａが組成物中のＡ＋Ｂ合計重量の少なくとも約９０％、より好適には 、少な（とも約９５％重量または９９％重量に同等である。

本発明に記載の「ワクチン組成物」は、ウィルス粒子アセンブリー単独で、ある いは１つ以上のアセンブルしていない精製ウィルスタンパク質との組み合せで、 または、それぞれ外側および／または内側キャプシドタンパク質を１つ以上有す る細胞溶解物組み合せを用いた従来とは別のワクチン製剤である。特に有用なの は、本発明のワクチン組成物にＶｐ４を含有する細胞溶解物組添加である。上記 活性成分を含むワクチンの調製は、当該技術分野において十分理解されている。

典型的には、ワクチンは、溶液または懸濁液の注射剤として調製される；注射前 に液体中に溶解または懸濁するのに適した固型形態もまた、調製し得る。調製は また、活性成分を乳化または、リポソームに包括し得る。活性な免疫原性成分は 、しばしば、薬学的に受容可能なおよび活性成分に適合する賦形剤と混合し得る 。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、 エタノールなど、およびこれらの組み合せである。さらに、所望されるなら、ワ クチンは、保湿または乳化剤、ｐＦｉ緩衝剤、またはワクチンの有効性を増強す るアジニバント等の補助物質を少量含み得る。

ワクチンは、注射により通常、非経口投与され、例えば、皮下あるいは筋肉注射 される。注射用ワクチン製剤は、活性成分を有効量を含み得、その正確な量は、 当業者により容易に決定され得る。活性成分は、注射用組成物の約０．０１％〜 約９５％（Ｗ／Ｗ）の範囲であり得、または、もし適切であれば、より高濃度ま たはより低濃度であり得る。

他の投与方法に適切なワクチン製剤は、生薬を包含し、ある場合には、経口製剤 を包含する。生薬には、ワクチン組成物は、ポリアルカリグリコールまたはトリ グリセリド等の従来のバインダーおよびキャリアを包含し得る。このような生薬 では、活性成分を約０．５％〜約１０％　ＣＷ／Ｗ）の範囲で、好ましくは、約 １％〜約２％の範囲で包含する混合物から形成し得る。

経口製剤は、通常使用される、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトー ス、デンプン、マグネシウム、ステアリン酸塩、サッカリンセルロースナトリウ ム、炭酸マグネシウムなどの賦形剤を包含する。これらの経口ワクチン組成物は 、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、除数製剤、または粉末の形態をとり得 、そして活性成分を約１０％〜約９５％、好ましくは約９５％重量７０％を含有 する。

さらに、ウィルス粒子は、中性のまたは塩形態でワクチン組成物に製剤され得る 。塩として用いる場合、最終製剤は、典型的には、０．１５Ｍ未満の塩を含む。

薬学的に受容可能な塩は、酸添加塩を含み（活性ポリペプチドの遊離アミノ基と 形成される）、そしてそれらは。例えば、塩酸またはリン酸等の無機酸、または 、酢酸、シニウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成される。遊離のカルボ キシル基から形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウ ム、または水酸化鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミ ン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から由 来し得る。

「処理」は、ロタウィルス感染の被験者の治療または改善を意味する。ロタウィ ルス疾患の「予防」は、感染の発生を妨げ、または本発明の組成物のその後投与 されたなら、感染の重症を緩和することを意味する。

本発明のワクチン組成物は、用量処方により投与し得、そして治療的に有効およ び免疫原性であり得る量で投与し得る。

ワクチン組成物の「治療的に有効な鳳」は、組成物が投与された被験体で、ロタ ライスル感染の予防または処理に十分な用量である。ロタライスル感染を処理ま たは予防し得るウィルス粒子アセンブリーの用量は、本明細書の開示を考慮すれ ば、当業者が適当な対照とで日常的な試験を行うことによりで決定し得る。適切 な処理群の対照との比較は、管理された試験で用いられた特定の用量が、疾患の 予防または処理で有効かどうかを示し得る。一般に、有効用量は投与法に依存し て変動し得る。例えば、筋肉内注射の場合、一般的にｏ、ｏｏｔμｇ／ｋｇ〜１ ０μｇ／ｋｇが本発明で用途を見いだし得る。

Ｂ、二艦呵方造 本発明の主題は、ロタウィルス内側および外側キャプシドタンパク質を包含する アセンブルしたウィルス粒子が、それらが投与された被験体において免疫反応を 誘導し得るという発見である。ウィルス粒子は、ロタウィルスの内側および外側 キャプシドタンパク質のアセンブリーである。特に有用なのは、内側キャプシド タンパク質、ＶＦ６を、外側キャプシドタンパク質ＶＰ４およびＶＦ６のいずれ かまたは両方とともに包含するアセンブリーである。ＶＦ６は、より詳細に以下 に示すように、２つの外側キャプシドタンパク質の「キャリア」として作用する 。これらのアセンブリーは、単独、または精製されたまたは部分精製された、ま たは粗細胞溶解物として提供される、アセンブルしていない外側キャプシドタン パク質と組み合わせて、ロタウィルス感染の処理または予防のためのワクチン組 成物として使用し得る。

本発明のウィルス粒子において使用される内側および外側キャプシドタンパク質 は、任意の方法で調整し得る。まず、ＥＤＴＡおよび塩化カルシウム（ＣａＣ１ ２）または塩化リチウム（Ｌｉｅｌ）のいずれかとの標準法による処理により、 精製ウィルスの連続分解により、各タンパク質を単離し得る。例えば、Ａｌｍｅ ｉｄａら、Ｊ、Ｍｅｄ　Ｖｉ　ｏｌ（１９７９）４：２６９−２７７；　Ｂｉｃ ａｎら、Ｊ、Ｖｉｒ。

１（１９８２）　４３：１１１３−１１１７；　Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、Ｌ」皇 Ｌｊ１ム１（１９８５）　６６：１１１８９−１９００：　Ｒｅａｄｙら、ｕ１ 訂」「（１９８７）　１ｊｆｉ：１８９−１９８を参照。

あるいは、ウィルスタンパク質は、組み換えＤＮＡ技術により生産し得、この方 法は文献に十分説明されている。例えば、Ｓａ＋ａｂｒｏｏｋら、前記；および ＤＮ人匹且坦」、前記を参照。

ウィルスポリペプチドをコードするＤＮＡフード配列は、特定のｍＲＮＡに由来 し得る。例として、Ｅｓｔｅｓら、前記ＨＢｏｔｈら、ムーＬＬＩＬ（１９８４ ）　５１：９７−１０１；　Ｃｏｈｅｎら、Ｌｌ旦お■１（１９８４）ｕ！Ｉ： １７　Ｂ−１８２を参照。あるいは特定のウィルスタンパク質をコードするＤＮ Ａ配列は、クローニングよりむしろ合成的に調整し得る。ＤＮＡ配列は、ウィル スタンパク質アミノ酸配列の適切なコドンで設計し得る。一般に、配列を発現に 使用し得る場合、目的とする宿主に好ましいコドンを選択し得る。

完全な配列は、標準法により調整された重複するオリゴヌクレオチドからアセン ブルされ、そして完全なフード配列にアセンブルされる。例えば、Ｅｄｇｅ、　 Ｍｉ３ｉｘｉ（１９８１）　Ｌｖ＋７５６；　Ｎａｍｂａｉｒら、シ壮旦■Ｊ（ １９８４）　ｉｐ：１２９９；　Ｊａｙら、ム」１Ｇ−立ｈｅｍ（１９８４）讃 ：６３１１を参照。

ウィルスタンパク質のコード配列が調製または単離されたなら、適切なベクター またはレプリコンにクローニングされ得る。当業者には多（のクローニングベク ターが知られ、そして適切なりローコングベクターの選択はｇ由である。クロー ニングの用の組み換えＤＮＡベクターおよび形質転換し得る宿主細胞（カッコ内 ）の例は、バクテリオファージλ（Ｅ。

ｃｏｌｔ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ、　ｃｏｌｔ）、ｐＡｃＹｃ１７７（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）、ｐＫＴ２３Ｇ　（グラム陰性綿ｍ＞、ｐＧＶ１１０６　（グラム陰性綿ｍ ＞、ｐＬＡＦＲｌ　（グラム陰性細ＩＩ）、ｐＭＥ２９Ｑ　（ｎｏｎ−Ｅ、　ｃ ｏｌ　ｉグラム陰性細菌）、ｐＨＶ１４　（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉおよびＢａｃｉｌ ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐＢＤ９　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｐｌＪ６１　 （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ＹＩ ｐ５　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｓ）、ＹＣｐ１９　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ）、ウシパピローマウィルス（哺乳類細胞）を包含する。一般的には、 ＤＮ人ｎ旦ｎ　：Ｖｏｌｓ、　Ｉ＆ＩＩ、前記；　およびＳａｍｂｒｏｏｋら、 前記を参照。

ウィルスタンパク質のコード配列は、プロモーター、リボゾーム結合部位（細菌 での発現のため）および任意にオペレーター（本明細書では集合的に「制御」要 素という）の制御下に配置され得、ウィルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列 は、この発現構築物を含むベクターにより形質転換された宿主細胞中でＲＮＡに 転写される。このコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含み得 、または含み得ない。

例えば、細菌では、ウィルスタンパク質は、好ましくは、翻訳後のプロセッシン グで細菌宿主により除去されるリーダー配列を含むコード配列の発現により得ら れる。例えば、米国特許第４．４３１．フ３９；　４，４２５，４３７．４，３ ３８，３９７号を参照。

発現ベクターは、特定のコード配列が適切な制御配列と共にベクター内に位置す るよう構築され、制御配列に対してコード配列の位置と方向は、コード配列が制 御配列の「制御」下に転写されるように構築される（すなわち、制御配列でＤＮ Ａ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼが、コード配列を転写する）。制御配列は 、上記クローニングベクター等のベクター内に挿入する前に、コード配列に結合 し得る。あるいは、コード配列は、既に制御配列および適切な制限部位を含む発 現ベクターに直接クローニングし得る。

多くの原核生物発現ベクターが当該技術分野で知られている。例えば、米国特許 第４，４４０，８５９．４．４３６，８１５．４，４３１，７４０゜４．４３１ ，７３９：　４．４２８．９４１：　４．４２５，４３７．４，４１８，１４９ ．４，４１１，９９４、４，３６６．２４６；　４．３４２．８３２号を参照。

さらに英国特許出願ＧＢ２゜１２１．０５４．　ＣＢ２．００８，１２３．　Ｃ Ｂ２，００７，６７５および欧州特許出願１０３．３９５を参照。酵母発現ベク ターも、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第４，４４６，２３５． ４．４４３，５３９．４，４３０，４２８゜さらに欧州特許出願１０３．４０９ ；　１００，５６１；および９６．４９１を参照。

本発明のロタウィルス遺伝子の発現に特に有用なのは、昆虫細胞およびこれらの 細胞において使用に適切なベクターである。このような系は、当該技術分野で公 知であり、そして例えば、バ牛二〇ウィルスＡｕｔｏ肛ｕｈ■」Ｌ口江姐ｍ多ｓ 体病ウィルス（ＡｃＮ１’Ｖ）から構築された、昆虫発現伝達ベクターを含む。

このような発現ベクターは、典型的には、異種遺伝子の発現を制御するため、強 力なウィルス多角体病遺伝子ブｏ％−９−を用いる。異種ＤＮＡを、バキニロウ ィルスの所望の部位に導入する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｓ ｇ＋ｉｔｈら、Ｍｏｌ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　Ｂ’ｏ　（１９８３）　ｉ、２１５６ −２１６５；およびＬｕｃｋｏｖ　ａｎｄ　Ｓｕｍｎｅｒｓ　■皿に■（１９８ ９）　ｌＪ：３１を参照）０例えば、挿入は、多角体病遺伝子等の遺伝子に、相 同的組換えにより可能である。また、挿入は、所望のバキ１０ウィルス遺伝子に 組み込まれた制限酵素部位にも可能である。シグナルペプチドをコードする配列 はまた、これらのペプチドが昆虫細胞により認識され、そして発現された産物が 発現培地中への分泌を生じ得るので、これら発現系において使用し得る。

発現系および選択された宿主に依存して、ウィルスタンパク質が、上記の発現ベ クターにより形質転換された宿主細胞ノ増殖ニヨリ、タンパク質発現条件下で産 生される。次に、このタンパク質を宿主細胞から単離し精製する。この発現系で タンパク質が増殖培地中に分泌される場合は、このタンパク質を細胞を含まない 培地から直接精製し得る。タンパク質が分泌されない場合は、細胞溶解物から単 離する。適切な増殖条件と回収方法の選択は、当該技術分野の範囲内である。

精製したＶＰ６タンパク質は、構造冬型性を示す。特にサンプルの多くにヘキサ マーと小さな六角形の格子がみられる。約ｐＨ５，０〜約ｐＨ，０の間で管状粒 子が形成され、そして温度およびイオン強度の変化に対し中等度の安定性を示す 。これら粒子の形成は、完全に可逆的である。約１）Ｈ４，Ｏで単一般ウィルス に似た球状粒子を形成し得る。約ｐｉ、Ｏ〜約ｐＦＩ４．　Ｏにシフトしたサン プル中において、小穴の格子でなるシート状形態新規構造が形成される。これら の結果は、ロタウィルスアセンブリーにとうて、ＶＦ６およびタンパク賀−タン パク質相互作用の重要性を示す。

（以下余白） このようなタンパク質−タンパク質相互作用は、以下のように観察される現象に 関与するようである。この現象は、ある種のペプチドが、モノマー形態のＶＦ６ 、あるいはインビトロにおいてアセンブルされるチューブ状ならびに球状のよう な、ＶＦ６のモノマーから形成される種々のオリゴマー構造に結合し得るもので ある。この付着は、ＶＦ６内の特異結合部位により媒介される。

個別の外側および内側キャプシドタンパク質が、単離、合成あるいは組換え手法 での産生のいずれかがなされた後に、これらのタンパク質は、カルシウムによる 方法を使用してウィルス粒子に７センブルされる。この方法は、実施例およびＲ ｅａｄｙ、　Ｋ、Ｆ、Ｍ、ら、■ユ匡■（１９８ｇ）　■ｌ：２６９−２７３に 記載されている。図７は、インビトロにおいてアセンブルされたロタウィルス粒 子の生産の図式を示す。

上記に説明したように、ウィルス粒子は、ワクチン組成物として、精製された非 アセンブル外側キャプシドタンパク質と組み合わせて、あるいは１種以上の別の 外側キャプシドタンパク質を含む細胞抽出物と組み合わせて、投与され得る。

これらの細胞抽出物は、当該分野に公知の方法により調製され得る。例えば、細 胞抽出物は、アフリカミドリザルＭＡ１０４細胞中でロタウィルスを培養し、細 胞と培地をともに回収し、そして遠心分離により細胞を除去することによって、 調製され得る。得られた上清には、ロタウィルスタンパク質が含まｔＬル。この タンパク質は、密度勾配超遠心分離によりさらに精製され得る。次に、ウィルス ペレットを、Ｒｅａｄｙ、　Ｋ、Ｆ、Ｍ、および５ａｂａｒａ、　Ｍ、■以立１ ■（１９ｇ？）　ｌｊｉ：１８９−１９８に記載のように、ＣａＣｌ２およびＬ ｉＣｌ２で処理して個別のウィルス粒子を得る。

ＶＦ６は、このような調製では極少量で存在する。さらに、少量のＶＦ６は、Ｖ ＰＴ画分中に存在する。

以下に本発明を実施するための特定の実施態様を示す。この実施例は、例を示す ことを目的とし、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することは意図し ていない。

訝　の　に　な　の 次の菌株の生物学的に純粋な培養物は、メリーランド州、ロックビル、パークロ ードドライブ１２３０１のアメリカンタイプカルチ中−コレクシｊン（Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託されてい る。示されている受託番号は、生存試験後に付与されて、必要な料金は支払っで ある。米国特許法施行規則１．１４および米国特許法１２２条に従い、コミッシ ョナーにより権利を与えられた者は、特許出願が係属している間、その培養物を 入手することが可能である。出願に基づく特許が許可されると、上記培養物の公 衆に対する入手の制限は最終的に撤廃される。さらに、この指定された寄託物は 、寄託日から３０年間、あるいは寄託物の分譲の請求のあった最終の日から５年 間：または米国特許の存続期間２のいずれか最長の期間の間保持される。培養物 が死滅するか不測の事故により破壊されたり、あるいはプラスミド含有味のとき 、プラスミドが脱落した場合には、同一の分類学上の種類の生存している培養物 と差し換えられる。

ｕ　Ｉ−丘旦　旺匹ｌ豆 ｐＡＣ３７３ＢＲＶ６　１９８７年　８月３１日　４０３６２（Ｌｃ立Ｈにおけ る） ＢＶＬＶＰ４　１９９０年１０月２４日（Ａ−坦ＪＡＬ田住競における） ＢＹＶＰ７　１９９０年１０月２４日 （Δ、ｊ且り山江廿における） Ｃ９支−豆 区社亙圭話五座 酵素は、市販のものを購入し、製造業者の指示通りに使用した。放射性ヌクレオ チドおよびニトロセルロースフィルターもまた市販のものを購入した。

ＤＮＡフラグメントのクローニングにおいては、記載されているところ以外は、 ＤＮＡの全操作は標準的な方法に従って実施した。上記のＳａ■ｂｒｏｏｋらを 参照のこと。制限酵素、Ｔａ　ＤＮＡ　リガーゼ、Ｌ　皿、ＤＮＡポリメラーゼ ！、フレノウフラグメント、ならびに他の生物学的試薬は販売業者から購入し、 製造業者の指示通りに使用した。二本鎖ＤＮＡフラグメントはアガロースゲル上 で分離した。

ＬＪｌ： ロタウィルスに感染していないマウス（ＣＤＩ）をＨａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕ ｅ　Ｄａｖｌｅｙ　Ｉｎｃ、、　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）から購 入した。購入時のマウスの齢は、約６適齢であった。マウスの体重は、２５グラ ムと３０グラムとの間であった。全マウスは、　ＥＬＩＳＡアッセイ　（Ｉｊａ ｚ、　ＭＪ、ら、ｍ工ｔｈ　（１９８９）　ｉｌ：１８６−２０４）によりロタ ウィルスの抗体に対して血清陰性であることが認められた。動物は、実験中を通 して分離ユニット中に置いた。

およ　イルス： ＭＡ１０４細胞（アフリカミドリザル）を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）　（ Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ ）を添加したイーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。ウシロタウィル ス分離株０４８６を、以前に記載（Ｂａｂｉｕｋ、　Ｌ、Ａ、ら、Ｌ虹江］Ｒ匡 ■虹（１９７７）　ｉ：６１０−６１７）　（Ｄ方法ニ、Ｊ、ｌ）、仔つシノ下 痢便から培養した。ロタウィルスｃ４８６は、ＡＴＣＣ，ロックビル、ＭＤ（寄 託番号ＶＲ−９１７）から公的に入手可能である。サル（ｓｉ■１ａｎ）　ｏタ ウイルス株５ＡＩＩ　（血清型３）は、Ｄｒ、　Ｈ，Ｍａｌｈｅｒｂａ　（Ｓａ ｎ　Ａｎｔｏｎｉｏ、　ＴＸ）から得、そして、ヒトロタウィルス株ＤＳＩ　（ 血清型２）およびヒトロタウィルス株Ｗａ　（血清型１）は、Ｄｒ、　Ｈ，Ｇｒ ｅｅｎｂｅｒｇ　（Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　ＣＡ）から得 た。

これらのウィルスを、ＦＢＳを含まない、ｌｓｌあたり１μｇのトリプシン（Ｄ ｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ）存在下に〜 集密的ＭＡ１０４細胞中で増殖させた。細胞および上清をともに回収し、細胞を ５００ｇ、　２０分間の遠心分離により除去した。ウィルスを、透明の上清液体 から、１５℃、２１７２時間、ｔｏｏ、ｏｏｏ　ｇでの４０％スクロース−クッ ションを通してのベレット化により濃縮した。そのウィルスベレットを、２回蒸 留した水に再懸濁させ、ウィルスのタンパク質量を、以前に記載（Ｉｊａｚ、　 Ｍ、Ｋ。

ら、紅旦」」吐ユ並（１９ｇ？）旦：２８３−２９８）のように分光光学的に評 価した。再懸濁ウィルスを−７０”Ｃで保存した。個別の内側および外側キャプ シドタンパク質を、以下の実施例に記載のように調製物から単離１．た。

プラークアッセイ： 感染ロタウィルスの定量のためのプラークアッセイは、以前に記載（Ａｈａ、　 Ｐ、Ｍ、および５ａｂａｒａ、　Ｍ、１．　ＬＬ工は（１９９０）　＠８：２５ −３２）の方法に従って実施した。簡単には、集密的単層のＭＡ１０４細胞を有 する１２ウエルの組織培養プレート（ＮＵＮＣ）を、ＭＥＭ（ＦＢＳを含まない ）で２回洗浄した。各ロタウィルス分離株の段階１０倍希釈物を、トリプシン含 有ＭＥＭ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｌ） 中で調製して、最終濃度を１０μｇ／ｍｌにした。

３７℃で１時間、ウィルスを吸着後、接種物を吸引しくａｓｐｒｉａｔｅｄ）、 細胞をＭＥＭで洗浄して、４％セファデックスＧ−７５ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）を含むダルヘッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を重層した。プレートを ３７℃で２日間インキュベートし、重層を吸引し、そしてプレートを０．５％ク リスタルバイオレット／８０％メタノール／　ＰＢＳで染色して洗浄し、プラー クを計数した。

■刀法広： ＥＬＩＳＡ法は、以前に記載（５ａｂａｒａ、　Ｍ、ら、Ｌ！１Ｌ９１（１９８ ５）■：５８−６６）　＋７１方法の変法であった。全インキュベーションは、 記載のない限り、室温（２０℃）で１時間行った。ポリスチレンの９６ウ工ルＩ ｍｍｕｎｏｌｏｎ　２プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｓ　Ｉｎｃ、。

Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ）を各アッセイシステムについて感受性にし、以 下のように使用した。

タンパク質特異的抗体の検出用には、プレートを、０．０５Ｍ炭酸塩重炭酸塩（ ｃａｒｂｏｎａｔｅ　ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）緩衝液、ｐＨ９，６で希釈した それぞれのタンパク質で、−晩かけて被覆した。吸着されていないタンパク質を 希釈水で十分に洗浄して除去した。

プレートの覆われていない部分を、０．ＯＩＭ　ＰＡＳ中の３％ウマ血清で一晩 処理してブロックし、次に２回蒸留したＨ２Ｏで洗浄した。

プレートに入れた抗原に、１％ウマ血清およびＯ，ＯＳ％Ｔｗｅｅｎ　２０を含 む０．ＯＩＭ　ＰＡＳ中の、ウェルあたり７５μｌのマウス抗血清を重ねた。イ ンキュベーションを室温で２時間行った後、結合されテｌ、Ｎない抗体をＯ，Ｏ Ｓ％Ｔｖｅｅｎ　２０を含む０．ＯＩＭ　ＰＡＳ　（ＰＢＳＴ）で洗浄して除去 した。次に、ビオチン化ヤギ抗マウス血清（Ｚｙｔａｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）の１７５０００希 釈物をウェルごとに加え、室温で１時間インキ品ベートした。

ＰＢＳＴで洗浄した後、プレートを、ＰＢＳＴおよび１％ウマ血清中で希釈した ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）ホースラディッ’／　ｘ　ヘ ルオキシダーゼ複合体の７５μｌと、１時間インキュベートシタ。ＰＢＳＴで洗 浄後、基質（２，２°−アジノージ−［３エチル−ベンズチアゾリンスルホネー ト］、ＡＢＴＳ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えた。１０ 分後に１０％ＳＯＳを加えて発色を停止させた。ウェルの光学密度をＥＬＩＳＡ リーダー（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｗａｎｄ、　 ＣＡ）により４０５ｎｍにおいて測定した。力価は、平均バッフグラウンドレベ ルに対する＞２ＳＤのＯＤの最高希釈の逆数で示した。

ドデシル　ナト１ウムポリアクＩルアミドゲル　。

跋辷臥■）： ウィルスタンパク質を、還元および非還元の同条件下で、Ｌａｅｍｍｌｉ　（Ｌ ａｅｗ＋ｍｌｉ、　Ｕ、に、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　１２ユニ６８０− ６８５）の記載の方法に従って５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウィルス試料 を、非還元条件下の操作用に電気泳動試料緩衝液（０，３３７Ｍ　トリスｐＨ６ ，８，６％　ＳＤＳ、　３０％グリセロール、０．０３％ブロモフェノールブル ー）に再懸濁させ、そして還元条件下用には３．７５％メルカプトエタノール（ ＢＭＥ）を含ませた。試料を５から１ｏ分間沸騰させ、次に３蔦スクツキングゲ ルをもつ１０％ポリアクリルアミド分離ゲル上での電気泳動により分析した。

ロ　ウィルス　ンパク　のウェス　ンプロテイン　：タンパク質特異的抗体を、 Ｔｏｖｂｉｎらによる記載（Ｔｏｗｂｉｎ。

Ｈ８ら、ｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃ’　［ＪＳ　（１９７９）　７６：４３ ５０−４３５４）のウェスタンプロティング法により検出した。１０％ポリアク リルアミドゲルで分離したウィルスタンパク質を、ニトロセルロースベーパー（ ０，４５μｍ）　（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移した。

これは、２０ｍＭ）リス−１９ｈＭグリシンー２０％メタノールを含有する緩衝 液中で１時間エレクトロブロッティングすることにより行なった。複写のニトロ セルロースのストリップ（ｓｔｒｉｐｓ）をアミノブラックで染色してタンパク 質の転写率を測定した。

転写の後、ウィルスタンパク質の血清試料との反応を以前に記載（Ｂｒａｕｎ、 　Ｄ、　Ｋ、ら、ＬＬエバ（１９８３）　４６：１０３−１１２）のように測定 した。非特異反応を０．ＯＩＭ　ＴＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） でブロックした。ＴＢＳＴでの洗浄後、反応をプロティンＡゴールド（ＢｉｏＲ ａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて１時間発色させた。発色後、タンパ ク質のバンドを銀促進剤（ＪａｎｓｓｅｎＢｉｏｔｅｃｈ、　Ｎ、Ｖ、、　Ｂｅ ｌｇｉｕｍ）で増感させた。

Ｌ惠五上 ウィルス　ンバク　の Ａ、ｉ佐コニ目四１鳳 ＶＰ６ウイルスタンパク質を、以下のように、ＥＤＴＡおよびＣａＣｌ２あるい はＬｉＣ１のいずれかでの精製ウィルスの連続的な分解により、精製ウィルス懸 濁物（上記記載）から単離した。外側牛ヤブシドタンパク質は、ウィルスを、５ ０ｍＭ　ＥＤＴＡＳｏ、０１Ｍトリス−ＥＩＣｌ、　ｐＨ７，４中、４℃で３０ 分間インキュベートして取り出した。サブウィルス粒子を超遠心分離（１００， ０ＯＯｘ　ｇ、２−３時間、４℃）により回収し、Ｇ、ＯＩＭ　トリス−ＨＣｌ 、　ｐＨ７，４アルいは０．ＯＩＭホウ酸ナトリウム、ｐｌ’１９．　Ｏ中に再 懸濁させた。次に、これらを０．０４Ｍ　）リス−ＥＩＣＩ、　ｐＨ７，４を含 む１．５Ｍ　ＣａＣｌ２で、２０℃で２０−３０分間処理するか、あるいは２Ｍ 　ＬｉＣ１，０，０１Ｍｄｔつ酸ナトリウム、ｐＨ９，０中で、４日間−７０” Ｃで凍結した。コアおよび分解されなかった粒子を、超遠心分離により可溶化タ ンパク質から分離した。ＥＤＴＡおよび塩類は、記載のないかぎり、０、ＯＩＭ 　トリス−１１ＣＩ、　ｐＨ７，４に対して４℃で十分に透析して除去した。試 料の純度は、上記のようにポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により 確かめた。

Ｂ、天然」１へ星！ ウィルス粒子あたりのＶＰ４タンパク質のコピー数が限られていることが、この タンパク質の多量精製を困難にしている。

しかし、ＶＦ６は、天然ＶＰ６の単離のところに記載したように、サブウィルス 粒子の１．５Ｍ　ＣａＣｌ２処理後、あるいは元来の完全なウィルス粒子の２Ｍ 　ＬｉＣｌ処理後の超遠心分離の後に得られる上清に認められる。ざらにＶＦ６ は、例えば、ＨＰＬＣ，アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマ トグラフィーなどにより、このベレツトから精製され得る。

Ｃ１天然」１悲艶凰 ＶＦ６のようにＶＦ６もまた、上記上清中に見いだされるが、多量に存在する。

Ｒｅａｄｙ、に、Ｆ、Ｍ、ら、■胆ｍ■（１９８８）　ｌｊＪ：２６９−２７３ を参照のこと。ＶＦ６はさらに、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー 、イオン交換クロマトグラフィーなどにより精製され得る。

見立且旦 えウィルス　ンパク　の Ａ９組１」Ｊｌ旺し【生 ウシロタウィルス（Ｂ［ｉＶ）由来の遺伝子６を含む、組換えオートグラファカ ルフォルニ力核ポリへドロンウィルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒ ｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）　（Ａｃ ＮＰＶ）の構築およびｇｐｏｄｏｐｅｅｒａ　ｆｒｕｇｒｐｅｒｄａ　（ＳＦ９ ）感染後のＶＰＩ５粒子のアセンブリーは、以前に記載されている（Ｒｅｄｍｏ ｎｄ、　Ｍ、Ｊ、ら、しＬ］ｌ姐は、　印刷中）。簡単には、精製ウシロタウィ ルス株Ｃ４８６から抽出されたゲノムＲＮＡを使用してｃＤＮＡを生成した。こ のｃＤＮＡをｐＢＲ３２２のＰｓｔ　１部位に連結して、これを使用してＬ皿株 Ｄｌｌｌを形質転換した。得られたコロニーを、鋳型としての精製されたゲノム ＲＮＡセグメント６から調製された放射標識ｃＤＮＡを用いてプローブした。

遺伝子６ＲＮＡの完全コピーを含むクローンｐＲ６−４２を、部分的にＡｈａｌ ｌｌで消化して、７つの５°非コーデイングヌクレオチドおよびｃＤＮＡクロー ニング中に付加されたオリゴ−ｄＣテールを除去した。次に、Ｂａｇ　Ｈｒリン カ−を付加した。

３°オリゴ罰Ｃテールおよび非コーディング領域を、Ａｃｅ　Ｉで消化して除去 し、ＶＰ６遺伝子から５６の非コーディングヌクレオチドを除いた。次にＢａｇ 　１１１りンカーを加え、遺伝子６ｃＤＮＡをバキニロウイルス転移ベクターｐ Ａｃ３７３のＢａ＋＊　Ｈ１部位に連結した。

このベクターをｐＡｃ３７３ＢＲＶ６　（ＡＴＣＣｎｏ、４０３６２）と命名し た。ロタウィルス遺伝子のＡ、■Ｌ１ｗ江恒ゲノムへの組み込みは、Ｓｕｍｍｅ ｒｓ、　Ｍ、Ｄ、およびＳｍ１ｔｈ、　Ｇ、Ｅ、、　Ｔ　ｘａｓ　’ｅｕ　ｕ　 ａ　ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕ　ｔ’　１５５５；２６−２７に概説されている茎、　 江ｕＥシ江ム（ＳＦ９）細胞での同様の組換えにより行った。組換え体は、上記 記載のように、精製ゲノムＲＮＡセグメント６から調製された放射様１１ｃＤＮ Ａを使用してのプラークハイプリダイゼーシ１ンにより同定した。組換え体を、 プラーク精製し、組換え遺伝子６により産生されるタンパク質の発現を上記記載 の方法を用いた５ＤＳ−１’ＡＧＥ分析およびウェスタンブロッティングにより 分析した。

遺伝子６を含む組換えウィルスをＳＦ９細胞を感染させるために使用した。２７ Ｃでの７２時間のインキ１ベージ１ン後、細胞を、０．０５％トリトンＸ−１０ ０および０．２ユニツト／■ｌのトリプシンインヒビターを含む２ｍｌ　ＮａＨ ＣＯ’緩衝液（ｐＨ７，５）中で溶解した。細胞の破片を１５００ｇでの遠心分 離により除去した。上清を０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３，０）に対して２４ 時間透析した。このことによりＶＰ６凝集物はモノマーに分離される。透析溶液 を０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，０）に取り替え、２４時間透析を続ける と、この間球状の％’Ｐ６が形成された。この透析緩衝液を０、ＯＩＭｌ−リス −ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）　＋１ｍＭ　７　シウム７　’、；　ｌ’ｌ：取’） 替した。次に、透析を４℃で一晩続けた。凝集していない物質を、３００．００ ０ダルトン分子量カットオフフィルターを使用して、超遠心分離により取り出し た。この方法により生成された球状ＶＰ６の性質を電子顕微鏡により確認し、純 度は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。

Ｂ−監遺孟１１Δ星生 遺伝子４（ＶＦ６をフードする遺伝子）を含むｃ　ＤＮＡの翻訳開始コドンのす ぐ上流にＢａ■旧制限部位を挿入するために部位特異的変異誘発を使用したこと 以外は、ＶＦ６について記載したようにＶＦ６を組換え手法で産生じた。そのこ とにより通常存在するＶＦ６の開始コドンの前にある９ヌクレオチドを欠損する ことができる。遺伝子の３°末端は改変しながった。

改変された遺伝子４を転移ベクターｐＶＬ９４１　（寄託番号）に連結した。遺 伝子４のΔ、姐且Ｌし江競ゲノムへの組み込みは、上記のように行って、発現ベ クターＢＶＬＶＰ４にした。

ＶＦ６−バキニロウイルス感染ＳＦ９細胞の粗界面活性剤溶解産物を、以下に記 載のウィルス粒子産生の出発物質として使用した。ＶＩ’４とＶＦ６と間の相互 作用は、親和精製工程に類似する。

従って、ＶＦ６−ＶＰ４複合体は、スクロース密度勾配による超遠心分離により 、結合されていないＶＦ６および他の細胞タンパク質から分離され得る。

Ｃ１鼠１ＬｌユΔＬ生 ＶＦ６に対する遺伝子（遺伝子８）の全長コピーを含むｃＤＮＡを、上記記載の ようにクローン化して同定した。ｌ／Ｐ７遺伝子の全長ｃＤＮＡコピーを含むク ローン（クローンｐｒ　８−Ｇ　）をＡｈａ　ＩＩＩおよびｓｐｈ　Ｉで消化し て、遺伝子の５°および３゛末端からそれぞれ７および２７ヌクレオチドを除去 した。次に、Ｂａ園＋１１リンカ−をＤＮＡの両末端に付加した。

遺伝子８をｐＡｃＹＭｌのＢａＩ２旧部位に連結し、前述のＶＦ６の記載のよう に、この遺伝子８をΔ、慕■Ｌ田江劇のゲノムに組み込み、発現ベクターＢＹＶ Ｐ７を得た。上記のように、組換え体を同定し、プラーク精製して発現のアッセ イを行った。

ＶＦ６−バキエロウイルス感染ＳＦ９細胞は、増殖培地中に直接ＶＰ７を分泌す る。　ＶＦ６は、５０ｍＭ　ＣａＣｌ２の存在下で２重層（ｄｏｕｂｌｅ　５ｈ ｅｌｌｅｄ）　（ＶＦ６−ＶＦ６）粒子の形成により実質的に親和精製される。

　このことにより、増殖培地中に存在する他の成分からＶＦ６が分離される。最 終精製工程は、スクロース密度勾配による超遠心分離である。

爽１ｋ」− ウィルス　のアセンブリー ＶＦ６およびＶＰ４タンパク質の増殖培地ならびに感染細胞溶解物中の濃度を、 クーマシーブルー染色の５ＤＳ−ＰＧＥゲルおよびＶＦ６およびＶＰ４特異的抗 血清プローブによるウェスタンプロティングによって、評価した。天然ＢＲＶを 予め決定した濃度で使用して標準にした。使用したタンパク質の濃度は、ＶＦ６ に対して以下の割合である。

ＶＦ６−ＶＦ６．　１：１０　ｖ／ｖ ＶＰ６−ＶＦ６．　１：１０　Ｗ／Ｗ 全粒子調製物の開始物質は、１０μｇのＶＦ６であった。ＶＦ６−ＶＰ４粒子を ：＋ｉｔ、ｉするために、ＳＦ９細胞を界面活性剤で溶解しく実施例２Ｂニ記載 ）、１０ｍＭトリス＋　５０１ＣａＣ１２ｐＨ８に、４℃で一晩透析して得たＶ Ｐ４タンパク質の１ｏＯμｇを、ＶＦ６と３７℃で２時間混合した。ワクチンと して使用する場合には、この調製物をｉｏｏ。

０００ｇｍ’　２時間、４０％スクロース密度勾配により遠心分離した。

’／Ｐ６−４−７粒子を調製するために、上記調製されたＶＦ６−４粒子を１０ ０μｇノＶＰ７１．ｌ：加えた。ＶＰ７１ｍ製物は、５０ｍＭ　ＣａＣｌ２を含 む０゜１Ｍトリス−１１ＣＩ　ｐＥ［８，０に一晩透析した細胞培養培地から構 成されていた。

ＶＦ６−４＋７混合物を、次に、５０ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む０．１Ｍ）リス− ■ＣＩ　ｐＨ８，０に対して３−４日間透析した。粒子を前記のようにスクロー スにより精製した。

ＶＦ６−ＶＦ６を調製するために、球状ｖＰ６の１０μｇを、調製物中に含マレ るＶＦ６の１００μｇと混合したこの調製物は、ＶＦ６−バキュロウィルスに感 染したＳＦ９細胞からの、組織培養増殖培地を５０簡Ｍ　ＣａＣｌ２を含む０． １ｍ）リス−［ＩＣ１ｐＨ８，０に対して透析して得た。

１／Ｐ６を添加後、同じ緩衝液に対する透析を３〜４日間継続した。

必要であれば、ＶＦ６−７粒子を超遠心分離により精製した。ＶＦ６−７−４粒 子を生産するために、精製ウィルスの１００μｇに相当するＶＦ６を含有する細 胞溶解物を、ＶＦ６−７と３７℃で２時間混合し、次に、４０％スクロースによ る、１００．０００　Ｇ、　２時間の超遠心分離をおこなった。この時間後、粒 子を上記のように遠心分離することにより精製した。

この実施例において使用されるワクチン組成物は、以下のようであるニー次免疫 用の使用には、各免疫原（表１）を７０インド完全アジユバントに乳化させた。

二次および三次免疫用＋＝＋ｔ、各免疫［を７０インドの不完全アジユバントに 乳化させた。等容量の免疫原とアジ１バントとを使用した。

１３グループのマウスを、表１に挙げである調製物を筋肉内注射により免疫した 。各マウスを繁殖の前後に３回免疫した。

最初の免疫は、マウスが７週齢のときに行い、２適間隔で第二回および第三回の ワクチン接種を行った。子は、マウスが１２から１４４週齢ときに生まれた。

誕生後、マウスの子は雌親の乳を飲ませ、７日齢のときに口タウイルスの４つの 分離株の１つでチャレンジさせた。これらの分離株は、ウシロタウィルス株Ｃ４ ８６（血清型６）、サルロタウィルス株５ＡＩＬ　（血清型３）、ヒトロタウィ ルス株ＤＳＬ（血清型１）およびＷａ　（血清型２）であった。５Ａ１１分離株 は、Ｄｒ。

Ｈ，Ｍａｌｈｅｒｂｅ　（Ｓａｎ　Ａｎｔｏｎｉｏ、　Ｔｅｘａｓ）から得、分 離株ＷａおよびＤＳＬはＤｒ、　Ｈ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　（Ｓｔａｎｆｏｒｄ 　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）から得た。ローカルの分離 株である０４８６株は、ＭＡ１０４細胞中で増殖した（Ｂａｂｉｕｋ、　Ｌ、Ａ 、ら、Ｊ　Ｃ１’ｎ　Ｍｉｃ　ｏｂ’　ｌ　（１９７７）　ｉ：６１０−６１７ ）。これらのウィルスをＭＡ１０４細胞中で増殖させ、回収し、前記記載（ｌｊ ａｚら、■息犯二吐ユｇ３　（１９８７）　ｉ：２８３−２９８）のようにチャ レンジ用に濃縮した。各分離株のチャレンジ用量は、１００μｌ容量のＭＥＭ、 約１０’　ＰＦＵ／マウスであった。チャレンジ用には、ウィルス調製物は、柔 軟性プラスチックの供給用チューブによる胃への挿管法により投与した。Ｔｒｙ ｐａｎ　ｂＩｕｅ　ｄｙｅ　（ＧＩＢＣＯ）を使用して挿管法の精度を評価した 。

下痢の発生を、以下にような臨床得点記録により、チャレンジ後７２時間まで臨 床的に得点を記録した。

（−）生存マウスあるいは検屍において下痢が認められなかった； （＋）外見上の下痢は認められないが、検屍において半液体の結腸内容物が認め られた； （＋十）腹部の触診では液体が存在し、結腸は液状の大便およびガスで満たされ ていた； （＋＋＋）外見上肛門付近は大便で汚れていて、触診では腸液が存在した；およ び （＋＋＋＋）液状の大便が肛門付近に存在し、腹部の触診では腸液が存在して肛 門から流れだし、重篤な脱水、結腸および盲腸内の腸液内容物ならびにガスの蓄 積にょる膨満が認められた。

（以下余白） 認められるように、ウィルス粒子、ＶＰ４単独、および混合粗細胞溶解物による ワクチン接種は、チャレンジされた新生マウスに対して防御した。

従って、ウィルス粒子アセンブリー、これらのアセンブリーを含むワクチン組成 物、ならびにを推動物被検体におけるロタウィルス疾患の治療および予防の方法 が開示されている。

本発明の好ましい実施態様が詳細に記載されているが、添付の請求の範囲により 明確にされる趣旨の意図および範囲から逸脱することなく明白な改変がなされ得 ることは理解される。

４５：　４６：　４７：　４８：　４９：Ｆｉｇｕｒｅ　１　（Ｓｈｅｅｔ　３ 　ｏｆ　６）６Ｂ：　６９：　７０：　７１： Ｆｉｇｕｒｅ　１　（Ｓｈｅｅｔ　４　ｏｆ　６１ＣＡＧ　ＴＴＧ　ＡＴＧ　Ａ ＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＣＧ　ＧＴＡ　Ｇ ＣＧ　ＧＣＧ　ＴＴＡＧＴＣＡＡＣＴＡＣＴＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＴＴＡ　Ｔ ＡＣＴＧＴ　ＧＧＴ　ＣＧＣＣＡＴ　ＣＧＣＣＧＣＭＴＧｉｎ　Ｌｅｕ　Ｍａｔ 　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ 　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ＞ＴＴＴ　ＣＣＡ　ＡＡＴ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＣＣＡ 　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＣＡＣＧＣＡ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＣＴＣＴ ＧＣＧＭ　ＴＣＴ　ＴＡＡ　ＣＴＴ　ＡＧＡ　ＣＧＴ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＣＴＴ 　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＣＧＧ　ＣＴＧＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　 Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ａｓｐ＞ＧＣＡ　ＡＧＣＧＡＡ　ＡＣＡ　ＡＴＧ　ＣＴＡ　ＧＣＡ　Ａ ＡＴ　ＧＴＧ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＧＡＡＣＧＴ　ＴＣ Ｇ　ＣＴＴ　ＴＧＴ　ＴＡＣＧＡＴ　ＣＧＴ　ＴＴＡ　ＣＡＣＴＧＴ　ＡＧＡ　 ＣＡＡ　ＴＣＴ　Ｇ’Ｍ’　Ｃ’ＩＴＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ 　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ 　Ｇｌｕ＞ＴＡＣＧＣＧ　ＡＴＡ　ＣＣＡ　ＧＴ’ｒ　ＧＧＡ　ＣＣＡ　ＧＴＴ 　ＴＴＴ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＭＴ　ＴＧＧＡＴＧ　ＣＧＣＴＡ Ｔ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＣＣ Ａ　ＴＡＣＴＴＡ　ＡＣＣＴｙｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　 Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｍａｔ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ＞ Ｆｉｇｕｒｅ　ｌ　（Ｓｈｅｅセ　５　ｏｆ　６）１１コ０　１１４０　１１５ ０　１１６０１コ５０ ＴＧＴ　ＧＡＣＣ ＡＣＡ　ＣＴＧ　Ｇ Ｆｉｇｕｒａ　ｌ　（Ｓｈｅｅｔ　６　ｏｆ　６）Ｆｉｇｕｒｅ　］　（Ｓｈｅ ｅ虹１７　ｏｆ　１７）−眸 ２Ｂ：　２９：　：ｌＯ：　３１： Ｆｉｇｕｒｅ　４　（Ｓｈｅｅｔ　２　ｏｆ　９）＾ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔ 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ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ 、　ＥＳ。

ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＣ，ＭＧ、　ＭＷ、　Ｎ Ｌ、　Ｎｏ、ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、　ＳＥ、ＳＵ ＦＩ （７２）発明者　イジャズ、モハメッド　クハリッドカナダ国　サスカチェワン 　ニス７ジエイ４ジェイ６；サスカトウーン、キンゲスメロ　プルバード　２１ ５−エイピーティー（７２）発明者　パーカー、マイケル　ディー。

カナダ国　サスカチェワン　ニス７ケイ２ニス３．サスカトウーン、シックスス アベニュー−３１１−エイピーティー　１７０６

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．脊椎動物被検体において免疫学的応答を誘起し得るウイルス粒子アセンブリ ーであって、 （ａ）ＶＰ６と実質的に相同で機能的に等価である内側のキヤプシドタンパク質 ；および （ｂ）（ｉ）ＶＰ４と実質的に相同で機能的に等価であるタンパク質、あるいは その機能的フラグメント、および（ｉｉ）ＶＰ７と実質的に相同で機能的に等価 であるタンパク質、からなる群より選択される１つ以上の外側キャプシドタンパ ク質；を含む、ウイルス粒子アセンブリー。
2. ２．（ｂ）がＶＰ４と実質的に相同で機能的に等価であるタンパク貧あるいはそ の機能的フラグメントを含む、請求項１に記載のウイルス粒子アセンブリー。
3. ３．（ｂ）がＶＰ７と実質的に相同で機能的に等価であるタンパク質あるいはそ の機能的フラグメントを含む、請求項１に記載のウイルス粒子アセンブリー。
4. ４．（ｂ）がＶＰ４と実質的に相同で機能的に等価であるタンパク質あるいはそ の機能的フラグメント、ならびにＶＰ７と実質的に相同で機能的に等価であるタ ンパク質あるいはその機能的フラグメントを含む、請求項１に記載のウイルス粒 子アセンブリー。
5. ５．（ａ）がＶＰ６を含み、そして（ｂ）がＶＰ４を含む、請求項１に記載のウ イルス粒子アセンブリー。
6. ６．（ａ）がＶＰ６を含み、そして（ｂ）がＶＰ７を含む、請求項１に記載のウ イルス粒子アセンブリー。
7. ７．（ａ）がＶＰ６を含み、そして（ｂ）がＶＰ４およびＶＰ７を含む、請求項 １に記載のウイルス粒子アセンブリー。
8. ８．前記（ａ）および（ｂ）のタンパク質が組換え手法で産生される、請求項１ に記載のウイルス粒子アセンブリー。
9. ９．ＶＰ４およびＶＰ７とともにアセンブルされたＶＰ６を含む、脊椎動物被検 体において免疫学的応答を誘起し得るウイルス粒子アセンブリー。
10. １０．薬学的に受容可能な賦形剤および請求項１に記載のウイルス粒子アセンブ リーを含む、ワクチン組成物。
11. １１．薬学的に受容可能な賦形剤および請求項９に記載のウイルス粒子アセンブ リーを含む、ワクチン組成物。
12. １２．ＶＰ６、ＶＰ４およびＶＰ７からなる群より選択される、１つ以上のアセ ンブルされていないタンパク質をさらに含む、請求項１０に記載のワクチン組成 物。
13. １３．ＶＰ６、ＶＰ４およびＶＰ７からなる群より選択される、１つ以上のアセ ンブルされていないタンパク質をさらに含む、請求項１１に記載のワクチン組成 物。
14. １４．前記アセンブルされていないタンパク質が、細胞溶解物中に提供される、 請求項１２に記載のワクチン組成物。
15. １５．前記アセンブルされていないタンパク質が細胞溶解物中に提供される、請 求項１３に記載のワクチン組成物。
16. １６．さらにアジュバントを含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
17. １７．さらにアジュバントを含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
18. １８．脊椎動物被検体におけるロタウイルス疾患を治療あるいは予防する方法で あって、請求項１０に記載のワクチン組成物の治療上有効な量を該被検体に投与 することを包含する、方法。
19. １９．脊椎動物被検体におけるロタウイルス疾患を治療あるいは予防する方法で あって、請求項１１に記載のワクチン組成物の治療上有効な量を該被検体に投与 することを包含する、方法。
20. ２０．脊椎動物被検体におけるロタウイルス疾患を治療あるいは予防する方法で あって、請求項１２に記載のワクチン組成物の治療上有効な量を該被検体に投与 することを包含する、方法。
21. ２１．脊椎動物被検体におけるロタウイルス疾患を治療あるいは予防する方法で あって、請求項１３に記載のワクチン組成物の治療上有効な量を該被検体に投与 することを包含する、方法。