ES2307345A1 - Capsidas vacias quimericas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. - Google Patents
Capsidas vacias quimericas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Cápsidas vacías quiméricas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), su procedimiento de obtención y aplicaciones. Las cápsidas vacías quiméricas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV) están constituidas por ensamblaje de (i) proteínas pVP2 de IBDV y (ii) proteínas de fusión que comprenden una región A constituida por la proteína VP3 de IBDV unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés, tal como un polipéptido útil en vacunación, terapia o diagnóstico.
Description
Cápsidas vacías quiméricas del virus causante de
la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), su procedimiento de
obtención y aplicaciones.
La invención se relaciona con la producción de
partículas vacías quiméricas del virus causante de la enfermedad de
la bursitis infecciosa (IBDV) y sus aplicaciones.
Las partículas virales son estructuras
especializadas en el empaquetamiento y la vehiculización de ácidos
nucleicos y proteínas. Una característica general de las partículas
virales es su excelente capacidad para la estimulación de la
respuesta inmune del hospedador. Estas propiedades convierten a las
partículas virales en agentes de extraordinario interés para el
desarrollo tanto de sistemas de transporte intracelular (delivery
systems) como para la generación de vacunas particuladas. La
utilización de diferentes sistemas de expresión genética ha
facilitado la producción de pseudopartículas virales o cápsidas
virales vacías (VLPs) de diferentes tipos de virus (Patente US
6,458,362 Casal, et al. 2002. Recombinant VP2 parvoviral
pseudo-particles encoding CTL or
T-helper cell epitopes; US 5,932,426 Baralle, et
al. 1999. Molecular presenting system; US 6,602,705 Barnett,
et al. 2003 Expression of HIV polypeptides and production of
virus-like particles). La manipulación genética de
estos sistemas de expresión permite, a su vez, la producción de
VLPs que contienen secuencias aminoacídicas heterólogas, procedentes
de proteínas distintas de aquéllas que conforman la cápsida viral
nativa. Estas VLPs se denominan genéricamente VLPs heterotípicas,
recombinantes o quiméricas (QVLPs). Las QVLPs han sido empleadas
fundamentalmente con dos finalidades: (i) generación de vacunas
multivalentes, mediante péptidos heterólogos inmunogénicamente
relevantes (Kingsman, A. J., N. R. Bums, G. T. Layton, and S. E.
Adams. 1995. Yeast retrotransposon particles as antigen delivery
systems. Ann. N. Y. Acad. Sci. 754: 202-213;
Lo-Man, R., P. Rueda, C. Sedlik, E. Deriaud, I.
Casal, and C. Leclerc. 1998. A recombinant
virus-like particle system derived from parvovirus
as an efficient antigen carrier to elicit a polarized Th1 immune
response without adjuvant. Eur. J. Immunol. 28:
1401-1407; Qiu, Z., D. Ou, H. Wu, T. C. Hobma, and
S. Gillam. 1994. Expression and characterization of
virus-like particles containing rubella virus
structural proteins. J. Virol. 68: 4086-4091); y
(ii) modificación del tropismo, mediante inserción de secuencias
aminoacídicas involucradas en interacciones con
receptor-ligando (Schmidt, U., Rudolf, R, and Bömh,
G. 2001. Binding of external ligands onto an engineered virus
capsid. Prot. Eng. 14: 769-774; Shin, Y.C., and
Folk, W.R. 2003. Formation of polyoma virus-like
particles with different VP 1 molecules that bind the urokinase
plasminogen activator receptor. J. Virol. 77:
11491-11498).
Las QVLPs se obtienen, en general, mediante la
expresión de la(s) proteína(s) viral(es)
responsable(s) de la formación de la cápsida viral, fusionada
a la región que codifica el polipéptido de interés.
El virus causante de la enfermedad de la
bursitis infecciosa (IBDV), perteneciente a la familia
Birnaviridae, infecta diferentes especies aviares y es el
responsable directo de una grave enfermedad inmunosupresora
causante de importantes pérdidas económicas en la industria avícola
mundial.
Las partículas de IBDV son icosaédricas, con una
simetría T=13, carecen de envuelta y están formadas por una única
capa proteica. Hasta el momento, las aproximaciones encaminadas a
la obtención un modelo atómico para las partículas de IBDV han
fracasado. Por ello, la información estructural disponible está
basada en modelos tridimensionales generados a partir de imágenes
obtenidas por criomicroscopía electrónica del virus purificado y de
VLPs. En base a esos estudios, se ha comprobado que la superficie
externa de la partícula está formada por un entramado continuo de
260 trímeros de la proteína VP2 (37 kDa) ordenados en cinco
conformaciones diferentes. La cara interna de las partículas
contiene 200 trímeros de la proteína VP3 (29 kDa), estos últimos,
independientes entre sí, se encuentran unidos a la zona basal de los
trímeros de VP2. Se ha sugerido que un tercer polipéptido, VP4 (28
kDa), también podría formar parte de las partículas, estando
situado en la base de los pentámeros que forman los vértices de la
estructura icosaédrica.
Los polipéptidos VP2, VP3 y VP4 se producen a
partir del procesamiento proteolítico de un polipéptido precursor
de un tamaño de 109 kDa. Este precursor se procesa
auto-catalíticamente liberando los polipéptidos pVP2
(48 kDa), VP3 y VP4. El dominio VP4, que se localiza en la región
central de la poliproteína, pertenece a la familia de las proteasas
Lon y es el responsable del corte proteolítico. Los polipéptidos
pVP2 y VP3 son los responsables directos del ensamblaje de las
cápsidas. El producto pVP2 sufre un último corte en su extremo
C-terminal antes de dar lugar a la forma madura de
la proteína, VP2, que es la que se encuentra en las partículas
purificadas (Da Costa, B., Chevalier, C., Henry, C., Huet, J. C.,
Petit, S., Lepault, J., Boot, H. & Delmas, B. (2002). The
capsid of infectious bursal disease virus contains several small
peptides arising from the maturation process of pVP2. Journal of
Virology 76, 2393-2402). Este procesamiento de
pVP2 es necesario para la correcta formación de las cápsidas y
requiere de la presencia de VP3, aunque la proteasa responsable aún
no ha sido identificada (Maraver, A., Oña, A., Abaitua, F.,
González, D., Clemente, R., Díaz-Ruiz, A., Castón,
J. R., Pazos, F. & Rodríguez, J. F. (2003). The oligomerization
domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease
virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of
Virology 77 :6438-49).
\newpage
En líneas generales, la morfogénesis es un
proceso vital para el ciclo vírico que requiere de pasos sucesivos
asociados a modificaciones en los polipéptidos precursores. Por
ello, los virus han desarrollado estrategias que permiten la
secuencial y correcta interacción entre cada uno de sus
componentes. Una de estas estrategias, utilizada con frecuencia por
virus icosaédricos, es la utilización de polipéptidos provenientes
de una única poliproteína como base de sus componentes
estructurales. En estos casos, el adecuado procesamiento
proteolítico de dicha poliproteína juega un papel crucial en el
proceso de ensamblaje.
En trabajos previos se ha demostrado este
principio para el ensamblaje de las cápsidas de IBDV
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79, 1047-1054).
La expresión en células eucarióticas del gen codificador para la
poliproteína de IBDV da lugar a la formación de VLPs totalmente
indistinguibles morfológica y bioquímicamente de los viriones de
IBDV. Asimismo, se ha comprobado que el ensamblaje de las cápsidas
necesita únicamente de la síntesis y del correcto procesamiento de
la poliproteína viral, y es independiente de la presencia del genoma
vírico o de otras proteínas codificadas por el genoma viral como
son VP5 y VP1.
Los resultados obtenidos hasta la fecha a partir
de la expresión de los genes de IBDV en distintos sistemas
recombinantes ha permitido concluir que: i) el proceso de
ensamblaje es independiente de la presencia del material genético
del virus, ii) para el ensamblaje sólo son necesarios los
polipéptidos codificados por el gen de la poliproteína, y iii) el
ensamblaje requiere de una interacción coordinada entre los
polipéptidos VP2 y VP3.
Sin embargo, hay que indicar que no se conoce si
la interacción pVP2/VP3 se establece entre dominios de VP2 y VP3 de
la poliproteína precursora cuando aún no ha sufrido modificaciones,
o si por el contrario, esta interacción ocurre tras el procesamiento
del precursor. Además, la información actual no excluye la
posibilidad de que VP4 pudiera jugar un papel relevante en la
morfogénesis de la cápsida. De hecho, se han descrito VLPs de IBDV
formadas por ensamblaje de las proteínas VP2, VP3 y VP4 de IBDV (US
6,528,063; US 5,788,970 y JP 5194597).
El trabajo desarrollado por estos mismos
inventores ha permitido establecer sistemas para la obtención de
VLPs de IBDV empleando diferentes vectores de expresión
eucariótica. Estos vectores han sido utilizados para la expresión de
la poliproteína de IBDV en ausencia o presencia de la RNA
polimerasa viral VP1. La caracterización bioquímica de las VLPs
purificadas demuestra que contienen las proteínas pVP2, VP2 y VP3,
cuando se expresa únicamente la poliproteína viral y las proteínas
pVP2, VP2, VP3 y VP1 cuando se realiza la expresión simultánea de
la poliproteína y la RNA polimerasa viral
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79: 1047-1054;
Martínez-Torrecuadrada, J. L., Castón, J. R.,
Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodríguez, J. F. & Casal, J. I.
(2000). Different architectures in the assembly of infectious
bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells.
Virology 278: 322-331; Maraver, A., et
al., (2003) citado supra; Lombardo, E., Maraver, A.,
Castón, J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A.,
Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1,
the putative RNA-dependent RNA polymerase of
infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid
protein VP3, leading to efficient encapsidation into
virus-like particles. Journal of Virology
73: 6973-6983).
Por otra parte, la solicitud de patente WO
02/088339 describe unas partículas pseudovirales de IBDV formadas
por ensamblaje de proteínas quiméricas que comprenden la
poliproteína de IBDV unida en su extremo carboxilo terminal a un
polipéptido.
Sin embargo, no se han descrito previamente
QVLPs basadas únicamente en pVP2 y VP3 de IBDV, estando esta última
proteína VP3 fusionada a un polipéptido de interés, ni su potencial
como vehiculizadoras de productos de interés.
La invención se enfrenta con el problema de
proporcionar nuevas herramientas para vectorizar o vehiculizar
productos de interés, tales como moléculas con actividad biológica,
por ejemplo, fármacos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos,
etc.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que es posible generar, basado en la expresión simultánea
de las proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, esta última modificada
genéticamente para incluir una secuencia de nucleótidos que codifica
para un polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de
interés, cápsidas vacías quiméricas (QVLPs) de IBDV. Las QVLPs
resultantes están formadas por ensamblaje de (i) proteínas pVP2 de
IBDV y (ii) proteínas de fusión que comprenden una región A
constituida por la proteína VP3 de IBDV unida a una región B
constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un
polipéptido de interés, en donde dicha región B está unida al
extremo amino- o carboxi-terminal de dicha proteína
VP3 de IBDV. Estas QVLPs pueden ser utilizadas con fines
terapéuticos, preventivos, de diagnóstico, etc., por ejemplo, en la
elaboración de vacunas o vectores para terapia génica.
Los inventores habían observado previamente que
cuando las proteínas VPX (pVP2) y VP3 de IBDV son expresadas a
partir de dos genes independientes se forman partículas vacías
(VLPs) de IBDV. Estas VLPs son estructuralmente idénticas a las
obtenidas mediante expresión de la ORF correspondiente a la
poliproteína de IBDV. Como parte del desarrollo de nuevas
estrategias de vacunación se analizó la posibilidad de emplear esta
estrategia de producción de VLPs de IBDV para la obtención de QVLPs
que contuvieran secuencias aminoacídicas heterólogas,
correspondientes a péptidos y proteínas de interés, tales como una
cola de histidinas (Ejemplo 1), GFP (Ejemplo 2) y finalmente
péptidos implicados en la inducción de respuesta inmune (Ejemplo 3).
Tal como se demuestra la fusión de secuencias heterólogas en estas
construcciones no es un obstáculo para la formación de QVLPs.
Como modelo de estudio de QVLPs transportadoras
de péptidos implicados en una respuesta inmune se abordó la
posibilidad de obtener QVLPs que contuvieran la secuencia
correspondiente al epítopo CD8 (E-CD8) de la
proteína CS de malaria (Plasmodium yoelii). Ese epítopo es
responsable de la inducción de la respuesta inmune celular
CD8-específica frente a ese patógeno, la cual puede
ser cuantificada mediante la técnica de ELISPOT en cultivos de
esplenocitos de ratones BALB/c (Ejemplo 3).
A modo de resumen, los resultados obtenidos
ponen de manifiesto que: (i) el sistema de expresión empleado
permite la obtención de QVLPs de IBDV conteniendo secuencias
aminoacídicas heterólogas; y (ii) la inmunización con dichas QVLPs
de IBDV induce una respuesta inmune específica frente a la
secuencia aminoacídica heteróloga presente en las QVLPs.
Por tanto, un aspecto de la presente invención
se relaciona con una cápsida vacía quimérica de IBDV caracterizada
porque está constituida por ensamblaje de (i) proteínas pVP2 de
IBDV y (ii) proteínas de fusión que comprenden una región A
constituida por la proteína VP3 de IBDV unida a una región B
constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un
polipéptido de interés.
Un aspecto adicional de esta invención se
relaciona con un procedimiento para la producción de dichas QVLPs
de IBDV proporcionadas por esta invención, basado en la
co-expresión génica de dichas proteínas pVP2 de IBDV
y proteínas de fusión como dos genes independientes.
Los ácidos nucleicos, construcciones génicas,
sistemas de expresión y células huésped desarrollados para la
puesta en práctica de dicho procedimiento de producción de dichas
QVLPs de IBDV, así como su empleo para la producción de dichas QVLPs
de IBDV, constituyen aspectos adicionales de la presente
invención.
Dichas QVLPs de IBDV tienen la capacidad de
vectorizar o vehiculizar productos de interés, tales como moléculas
con actividad biológica, por ejemplo, fármacos, polipéptidos,
proteínas, ácidos nucleicos, etc. En una realización particular,
dichas QVLPs de IBDV pueden vehiculizar antígenos e inductores de
respuestas inmunes en animales o humanos a los que se suministre,
por lo que pueden ser utilizadas en la elaboración de vacunas
frente a enfermedades humanas y animales causadas por virus,
bacterias, parásitos o cualquier otro tipo de microorganismos o
frente enfermedades tumorales. En otra realización realización
particular, dichas QVLPs de IBDV se utilizan en la elaboración de
vectores para terapia génica.
Por tanto, en otro aspecto adicional, la
presente invención se relaciona con el empleo de dichas QVLPs de
IBDV, en la elaboración de medicamentos, tales como vacunas y
vectores para terapia génica. Dichas vacunas y vectores constituyen
aspectos adicionales de la presente invención.
Figura 1. (a) El diagrama esquematiza los pasos
de procesamiento proteolítico necesarios para la formación de las
proteínas maduras de la cápsida VP2 y VP3 a partir de la
poliproteína precursora. (b) El diagrama refleja diferentes
construcciones genéticas derivadas de la poliproteína de IBDV
descritas hasta el momento, así como las estructuras producidas
mediante su expresión en diferentes sistemas heterólogos. Los
números indican la posición correspondiente al primer y último
residuo aminoacidico de la poliproteína presente en cada una de las
construcciones. La parte inferior de la figura muestra imágenes
obtenidas mediante microscopia electrónica de transmisión de las
estructuras obtenidas mediante expresión de las diferentes
construcciones. La barra corresponde a 50 nm. Los datos han sido
tomados de las siguientes referencias:
Fernández-Arias et al., (1998), citado
supra; Maraver et al., (2003), citado supra;
Martínez-Torrecuadrada et al., (2000), citado
supra; Castón et al., 2001. C terminus of infectious
bursal disease virus major capsid protein VP2 is involved in
definition of the t number for capsid assembly. Journal of
Virology 75, 10815-10828.
Figura 2. Análisis microscópico de células de
insecto 115 que coexpresan pVP2 y VP3. La distribución
subcelular de las proteínas pVP2 y VP3 fue analizada mediante
inmunomicroscopía confocal. Células infectadas con los rBVs FB/pVP2
(a), FB/VP3 (b), o FBD/pVP2-VP3
(c-e) fueron incubadas con suero de conejo
anti-pVP2 y suero de rata anti-VP3.
A continuación las células fueron incubadas con suero de cabra
anti-Ig de conejo acoplada a Alexa 488 (rojo) y con
suero de cabra anti-Ig de rata acoplada a Alexa 594
(verde). Los núcleos se tiñeron con To-Pro 3 (azul).
(e) Superposición de las imágenes mostradas en los paneles (c) y
(d). Imágenes de microscopía electrónica correspondientes a
secciones de células H5 infectadas con diferentes construcciones
genéticas derivadas de la poliproteína de IBDV. (f) Imagen a baja
magnificación de una célula H5 infectada con virus FB parental. El
inserto corresponde a un detalle ampliado del área indicada por el
recuadro. (g) Imagen a baja magnificación de una célula H5
infectada con el virus FBD/pVPX-VP3. El inserto
corresponde a un detalle ampliado del area indicada por el
recuadro. (h) Imagen de alta magnificación de una célula H5
infectada con el virus FBD/pVPX-VP3 que muestra en
detalle la formación de estructuras de IBDV. (i) Imagen de alta
magnificación de una célula BSC1 infectada con el virus vacunal
recombinante VTLacOUPOLY mostrando estructuras similares a las
detectadas en el panel (h). Las barras indican 600 nm (paneles f y
g) y 200 nm (paneles h é i).
Figura 3. Caracterización estructural y
bioquímica de las estructuras derivadas de IBDV producidas en
células de insecto co-infectadas con los
baculovirus recombinantes (rBV) FB/pVP2 +
FB/his-VP3. Células
co-infectadas con los rBV FB/pVP2 y
FB/his-VP3, o infectadas con el virus
FBD/Poly-VP1 o FB/pVP2 fueron empleadas para
purificar estructuras derivadas de IBDV mediante centrifugación en
gradientes de sacarosa. Los paneles (a), (b), y (c) muestran
imágenes de microscopía electrónica de transmisión correspondientes
a la fracción 4 de los gradientes obtenidos a partir de las
infecciones con FBD/Poly-VP1,
FB/pVP2+FB/his-VP3, y FB/pVP2, respectivamente. El
panel (d) muestra los resultados de un análisis mediante Western
blot de los gradientes de sacarosa correspondientes a cultivos
infectados con FBD/Poly-VP1 y
FB/pVP2+FB/his-VP3, respectivamente. Los extractos
totales (input) y las diferentes fracciones de los gradientes de
sacarosa (la fracción F1 corresponde al fondo del gradiente) fueron
analizadas mediante Westen blot empleando sueros específicos frente
a las proteínas VP1, pVP2, VP3, y VP4 de IBDV, respectivamente. Se
indica la masa molecular en kDa de los polipéptidos
inmunoreactivos.
Figura 4. Caracterización bioquímica y
estructural de VLPs de IBDV producidas en S. cerevisiae
transformadas con el plásmido
pESCURAIpVP2-VP3-GFP. Un cultivo
de S. cerevisiae transformada con el plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP fue crecido a
30°C en medio suplementado con el inductor galactosa. A las 18 h el
cultivo fue recogido y centrifugado. El sedimento resultante fue
procesado mediante fraccionamiento en un gradiente lineal
25-50% de sacarosa. A) Análisis bioquímico de
muestras correspondientes al sedimento antes de fraccionar (T) así
como de las diferentes fracciones del gradiente de sacarosa. Las
muestras fueron analizadas mediante SDS-PAGE y
western blot empleando anticuerpos específicos frente a las
proteínas VP3 (anti-VP3) y pVP2
(anti-pVP2). Las flechas indican las posiciones de
las bandas inmunoreactivas correspondientes a las proteínas
VP3-GFP (61 kDa) y pVP2 (48 kDa), respectivamente.
B) El análisis estructural de las muestras obtenidas fue realizado
mediante TEM. La imagen corresponde a una micrografia obtenida a
partir de una alicuota correspondiente a la mezcla de las
fracciones 7, 8 y 9 del gradiente de sacarosa. La muestra fue
teñida con acetato de uranilo y observada mediante TEM. La barra
corresponde a 65 nm. C) Muestra de VLPs obtenidas mediante la
expresión de la poliproteína de IBDV en células de mamífero
mediante infección con el virus vacunal recombinante VT7/Poly
(Fernández-Arias et al., (1998), citado
supra). La barra corresponde a 65 nm.
Figura 5.- Caracterización estructural y
bioquímica de QVLPs-CD8. El panel A muestra una
imagen de TEM de una muestra teñida con acetato de uranilo
correspondiente a la fracción 4 de un gradiente de sacarosa empleado
para la purificación de estructuras realizado sobre un extracto de
células de insecto co-infectadas con los rBVs
FB/pVP2 y PF/his-CD8-VP3. La barra
indica 100 nm. El panel B muestra el análisis por
SDS-PAGE y Western blot, realizado con un anticuerpo
frente a la proteína VP3, de una muestra correspondiente a la
fracción 4 (QVLPs-CD8) de un gradiente de sacarosa
empleado para la purificación de estructuras realizado sobre un
extracto de células de insecto co-infectadas con
los rBVs FB/pVP2 y PF/his-CD8-VP3
(ver panel A). Como control se empleó una muestra de virus IBDV
purificado (IBDV). Se indican los tamaños de los marcadores de masa
molecular (MW), así como la masa molecular estimada para las
proteínas VP3 y his-CD8-VP3.
Figura 6.- Efecto potenciador de la respuesta
inmune celular específica anti-CD8 de malaria
mediante la inmunización con QVLPs de IBDV que contienen el epítopo
CD8 de Plasmodium yoelii. Grupos de 4 ratones de la cepa
BALB/c se inocularon intraperitonelamente. con 50 \mug/ratón de
QVLPs-CD8 (grupo IV) o VLPs no quiméricas (grupo
IIII). Como control se inoculó un grupo con VVpJRCS (10^{7}
ufp/ratón), un virus vaccinia recombinante que expresa la proteína
completa CS de Plasmodium yoelii (grupo II). 15 días
después, los ratones de todos los grupos se inmunizaron
intraperitonelamente con VVpJRCS (10^{7} ufp/ratón). Uno de los
grupos recibió en este momento una única dosis del vector viral
(grupo I). 15 días después de la segunda inmunización, los animales
fueron sacrificados, se extrajo el bazo y se llevó a cabo el
ELISPOT frente al péptido CD8 de malaria. El panel A muestra la
imagen de los pocillos de ELISPOT realizados con diferentes
concentraciones de esplenocitos obtenidos a partir de los ratones
pertenecientes a cada uno de los grupos tras su incubación en
presencia (+ péptido CD8) o ausencia (- péptido CD8) del péptido
CD8. El panel B muestra una gráfica de los resultados obtenidos
como número de células específicas secretoras de
IFN-g/10^{6} esplenocitos.
En un primer aspecto, la invención proporciona
una cápsida vacía quimérica del virus causante de la enfermedad
de la bursitis infecciosa (IBDV), en adelante QVLP de la
invención, caracterizada porque está constituida por ensamblaje de
(i) proteínas pVP2 de IBDV y (ii) proteínas de fusión que
comprenden una región A constituida por la proteína VP3 de IBDV
unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que
comprende un polipéptido de interés.
El término "IBDV", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a las diferentes cepas de IBDV
pertenecientes a cualquiera de los serotipos (1 ó 2) conocidos [a
título ilustrativo véase la revisión realizada por van den Berg TP,
Eterradossi N, Toquin D, Meulemans G., en Rev Sci Tech 2000
19: 509-43] y los términos "proteína pVP2 de
IBDV" y "proteína VP3 de IBDV" se refieren a las diferentes
formas de las proteínas pVP2 y VP3 representativas de cualquiera de
las mencionadas cepas de IBDV [NCBI protein databank], de acuerdo
con la definición realizada por Sánchez y Rodríguez (1999) (Sánchez
AB, Rodríguez JF. Proteolytic processing in infectious bursal
disease virus: identification of the polyprotein cleavage sites by
site-directed mutagenesis. Virology. 1999 Sep 15;
262(1):190-199) así como a proteínas
sustancialmente homólogas a dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, es
decir, proteínas cuyas secuencias de aminoácidos tienen un grado de
identidad, respecto a dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, de, al
menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 80%, más
preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más preferentemente de,
al menos, un 95%.
La proteína pVP2 de IBDV presente en la QVLP de
la invención puede ser cualquier proteína pVP2 representativa de
cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, la proteína pVP2, longitud
completa, de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de acceso AAD30136].
La proteína de fusión presente en la QVLP de la
invención comprende una región A constituida por la proteína VP3 de
IBDV unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo
que comprende un polipéptido de interés. En una realización
particular, dicha región B está unida a la región
amino-terminal o a la región
carboxi-terminal de dicha proteína VP3 de IBDV.
La proteína VP3 de IBDV, que constituye la
región A de dicha proteína de fusión puede ser cualquier proteína
VP3 representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, la
proteína VP3, longitud completa, de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de
acceso AAD30136].
La región B presente en dicha proteína de fusión
está constituida por un polipéptido heterólogo que comprende un
polipéptido de interés. Tal como se utiliza en la presente
invención el término "polipéptido heterólogo" se refiere a un
polipéptido no propio de la cápsida de IBDV nativo. El tamaño del
polipéptido de interés puede variar dentro de un amplio intervalo,
desde unos pocos aminoácidos hasta cientos de aminoácidos. Dicho
polipéptido de interés puede ser prácticamente cualquier
polipéptido, independientemente de su origen (eucarótico,
procariótico, viral, etc.), susceptible de ser expresado de forma
recombinante. No obstante, en una realización particular, dicho
polipéptido de interés es un polipéptido útil en vacunación, terapia
o diagnóstico, tal como un epítopo o determinante antigénico capaz
de inducir una respuesta inmune en animales y humanos frente a
enfermedades causadas por virus, bacterias, parásitos o cualquier
otro tipo de microorganismos o frente a enfermedades tumorales.
En una realización particular, dicha región B
comprende un único polipéptido de interés. Sin embargo, en otra
realización particular, dicha región B comprende dos o más
polipéptidos de interés, iguales o diferentes, los cuales pueden
estar formando tándems.
En una realización particular, dicha proteína de
fusión comprende una región A unida a una única región B. En este
caso, dicha región B puede estar unida a la región
amino-terminal de la VP3 o, alternativamente, a la
región carboxi-terminal de VP3, presente en la
región A. La región B, tal como se ha mencionado previamente, puede
contener uno o más polipéptidos de interés. En una realización
particular, dicha región B contiene un único polipéptido de interés
mientras que en otra realización particular, dicha región B
comprende dos o más polipéptidos de interés diferentes.
En otra realización particular, dicha proteína
de fusión comprende una región A unida a dos regiones B, una de
ellas unida a la región amino-terminal de la VP3
presente en la región A y la otra a la región
carboxi-terminal de VP3 presente en la región A.
Dichas regiones B pueden ser iguales o diferentes y cada una de
ellas puede contener uno o más polipéptidos de interés, los cuales
pueden ser iguales o diferentes entre sí. En una realización
concreta, la proteína de fusión comprende una región A unida a una
primera región B que contiene un primer polipéptido de interés (B
1) y una segunda región B que contiene un segundo polipéptido de
interés (B2). Dichos polipéptidos de interés (B1) y (B2) pueden ser
iguales o diferentes. En una realización concreta, dichos
polipéptidos de interés (B1) y (B2) son distintos entre sí.
Generalmente, la región A (constituida por la
proteína VP3 de IBDV) no está unida directamente a dicha región B
(constituida por el polipéptido heterólogo que comprende un
polipéptido de interés), sino a través de un polipéptido espaciador
(linker) entre dichas regiones A y B. Por tanto, si se desea, la
proteína de fusión de la invención puede contener, además, un
polipéptido espaciador situado entre dichas regiones A y B.
Ventajosamente, dicho polipéptido espaciador es un péptido con
flexibilidad estructural, preferentemente, un polipéptido que dé
lugar a un dominio no estructurado capaz o no de inducir una
respuesta inmune. A modo ilustrativo, dicho péptido flexible puede
contener repeticiones de restos de aminoácidos, en particular de
restos de Gly y Ser o cualquier otra repetición de restos de
aminoácidos adecuada.
Las QVLPs de la invención pueden obtenerse
mediante la expresión simultánea de dichas proteínas pVP2 de IBDV y
dichas proteínas de fusión que comprenden dichas regiones A y B, en
células huésped apropiadas. Dichas células huésped apropiadas son
células que contienen la secuencia de nucleótidos codificantes de
dicha proteína de fusión que comprende las regiones A y B, y la
secuencia de nucleótidos codificante de la pVP2 de IBDV, bien en
una única construcción génica o bien en dos construcciones génicas.
En una realización particular, dichas células huésped apropiadas
son células transformadas, transfectadas o infectadas con un
sistema de expresión adecuado, tal como un sistema de expresión que
comprende una construcción génica, en donde dicha construcción
génica comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para
dicha proteína de fusión que comprende las regiones A y B, y la
secuencia de nucleótidos que codifica para la pVP2 de IBDV, o bien,
alternativamente, con un sistema de expresión que comprende una
primera construcción génica que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión que
comprende las regiones A y B, y una segunda construcción génica que
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la pVP2 de
IBDV.
Por tanto, en otro aspecto, la invención
proporciona un ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha
proteína de fusión que forma parte de las QVLPs de la invención y
que comprende una región A constituida por la proteína VP3 de IBDV
unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que
comprende un polipéptido de interés, en donde dicha región B unida
a la región amino-terminal o a la región
carboxi-terminal de dicha proteína VP3 de IBDV.
Opcionalmente, el ácido nucleico proporcionado por esta invención
puede contener, si se desea, la secuencia de nucleótidos que
codifica para la pVP2 de IBDV. De forma más concreta, en una
realización particular, la secuencia del ácido nucleico
proporcionado por esta invención comprende (i) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, y (ii) una
secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o
región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos que
comprende uno o más polipéptidos de interés y, opcionalmente, si se
desea, (iii) una secuencia de nucléotidos que comprende la fase de
lectura abierta o región codificante correspondiente a la proteína
pVP2 de IBDV.
En otra realización particular, la secuencia del
ácido nucleico proporcionado por esta invención comprende una (i)
una secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura
abierta o región codificante correspondiente a la proteína VP3 de
IBDV, (ii) una primera secuencia de nucleótidos que comprende la
fase de lectura abierta o región codificante de uno o más
polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de
interés, (ii') una segunda secuencia de nucleótidos que comprende la
fase de lectura abierta o región codificante de uno o más
polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de
interés, en donde dicha segunda secuencia de nucleótidos puede ser
igual o diferente a dicha primera secuencia de nucleótidos, y,
opcionalmente, si se desea, (iii) una secuencia de nucléotidos que
comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV. En este caso, una de
dichas primera o segunda secuencia de nucleótidos está
operativamente unida al extremo 5' de la secuencia de nucléotidos
que comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a la proteína VP3 de IBDV y la otra está
operativamente unida al extremo 3' de la secuencia de nucléotidos
que comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a la proteína VP3 de IBDV.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "fase de lectura abierta correspondiente a la proteína
pVP2" o "fase de lectura abierta correspondiente a la
proteínas VP3 de IBDV" incluye, además de las secuencias de
nucleótidos de dichas fases de lectura abierta, otras fases de
lectura abiertas análogas a las mismas codificantes de las
proteínas pVP2 y VP3 de IBDV. Asimismo, el término "fase de
lectura abierta de uno o más polipéptidos heterólogos que
comprenden uno o más polipéptidos de interés" incluye cualquier
secuencia de nucleótidos codificante de dicho(s)
polipéptido(s) heterólogo(s) que comprende(n)
uno o más polipéptidos de interés. El término "análoga", tal
como aquí se utiliza, pretende incluir cualquier secuencia de
nucleótidos que puede ser aislada o construida sobre la base de la
secuencia de nucleótidos codificantes de pVP2 y VP3 de IBDV, por
ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos
conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o
más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia.
En general, una secuencia de nucleótidos análoga a otra secuencia de
nucleótidos es sustancialmente homóloga a dicha secuencia de
nucleótidos. En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "sustancialmente homóloga" significa que las
secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad,
a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de,
al menos, un 80%, más preferentemente de, al menos, un 90% y, aún
más preferentemente de, al menos, un 95%.
En otro aspecto, la invención proporciona una
construcción génica que comprende un ácido nucleico
proporcionado por esta invención, es decir, un ácido nucleico cuya
secuencia comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para
dicha proteína de fusión que comprende las regiones A y B, y,
opcionalmente, la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha
proteína pVP2 de IBDV. De forma más concreta, en una realización
particular, la construcción génica proporcionada por esta invención
comprende una secuencia de nucléotidos que comprende (i) una
secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o
región codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV y (ii)
una secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura
abierta o región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos
que comprenden uno o más polipéptidos de interés, y, opcionalmente,
si se desea, (iii) una secuencia de nucléotidos que comprende la
fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a la
proteína pVP2 de IBDV. En otra realización particular, la
construcción génica proporcionada por esta invención comprende una
secuencia de nucleótidos que comprende una (i) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, (ii) una
primera secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura
abierta o región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos
que comprende uno o más polipéptidos de interés, (ii') una segunda
secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o
región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos que
comprende uno o más polipéptidos de interés, en donde dicha segunda
secuencia de nucleótidos puede ser igual o diferente a dicha primera
secuencia de nucleótidos, y, opcionalmente, si se desea, (iii) una
secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o
región codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV. En
este caso, una de dichas primera o segunda secuencia de nucleótidos
está operativamente unida al extremo 5' de la secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV y la otra
está operativamente unida al extremo 3' de la secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV.
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV.
En otro aspecto, la invención proporciona un
sistema o vector de expresión seleccionado entre:
- a)
- un sistema de expresión que comprende una construcción génica proporcionada por esta invención, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, en donde dicha construcción génica comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión que comprende las regiones A y B, y la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína pVP2 de IBDV; y
- b)
- un sistema de expresión que comprende una primera construcción génica proporcionada por esta invención, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, en donde dicha primera construcción comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión que comprende las regiones A y B, y una segunda construcción génica, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína pVP2 de IBDV.
En una realización particular, el sistema de
expresión proporcionado por esta invención comprende una
construcción génica que comprende (i) una secuencia de nucléotidos
que comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, (ii) una secuencia de
nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante de uno o más polipéptidos heterólogos que comprenden
uno o más polipéptidos de interés, y (iii) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, en donde
dicha construcción génica está operativamente unida a unos
elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de
traducción.
En otra realización particular, el sistema de
expresión proporcionado por esta invención comprende una primera
construcción génica, operativamente unida a unos elementos de
control de transcripción y, opcionalmente, de traducción,
comprendiendo dicha primera construcción génica (i) una secuencia
de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, y (ii) una
secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o
región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos que
comprenden uno o más polipéptidos de interés, y una segunda
construcción génica, operativamente unida a unos elementos de
control de transcripción y, opcionalmente, de traducción,
comprendiendo dicha segunda construcción génica una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV.
Los elementos de control de transcripción y,
opcionalmente, de traducción, presentes en el sistema de expresión
proporcionado por esta invención incluyen promotores, que dirigen
la transcripción de las secuencias de nucleótidos de interés (pVP2,
VP3 y polipéptido heterólogo) al que está operativamente enlazado, y
otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su
regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de
inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación,
origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers),
silenciadores transcripcionales (silencers), etc.
Prácticamente cualquier sistema o vector de
expresión apropiado puede ser utilizado en la generación del
sistema de expresión proporcionado por esta invención. A modo
ilustrativo, dichos sistemas o vectores de expresión apropiados
pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades
de cada caso concreto entre plásmidos, bácmidos, cromosomas
artificiales de levadura (YACS), cromosomas artificiales de
bacteria (BACs), cromosomas artificiales basados en el bacteriófago
P1 (PACs), cósmidos, o virus, que pueden contener, además, un
origen de replicación heterólogo, por ejemplo, bacteriano o de
levadura para que pueda ser amplificado en bacterias o levaduras,
así como un marcador utilizable para seleccionar las células
transfectadas diferente al gen o genes de interés. Estos sistemas o
vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrook,
J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a
laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory] y forman
parte de la presente invención. En una realización particular,
dicho sistema o vector de expresión es un lo plásmido, tal como un
plásmido adecuado para transformar levaduras, por ejemplo, el
plásmido denominado
pESCURA/pVP2-VP3-GFP (Ejemplo 2), o
un virus, tal como un baculovirus recombinante (rBV), por ejemplo,
el rBV denominado FBD/pVP2-his-VP3
(Ejemplo 1.2), que expresa durante su ciclo de replicación ambas
proteínas (pVP2 de IBDV e his-VP3) simultáneamente
en células de insecto, o los rBVs denominados FB/pVP2 y
FB/his-VP3 (Ejemplo 1.1) que expresan las proteínas
pVP2 de IBDV e his-VP3, respectivamente, cuando
co-infectan células de insecto, obteniéndose QVLPs
de IBDV con el polipéptido heterólogo de seis histidinas (6 his), o
los rBVs denominados FB/pVP2 y
FB/his-CD8-VP3 (Ejemplo 3) que
expresan las proteínas pVP2 de IBDV e
his-CD8-VP3, respectivamente, cuando
co-infectan células de insecto, formándose las
cápsidas denominadas QVLPs-CD8.
En otro aspecto, la invención proporciona una
célula huésped que contiene la secuencia de nucleótidos
codificantes de dicha proteína de fusión que comprende las regiones
A y B, y la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína pVP2
de IBDV, bien en una única construcción génica o bien en dos
construcciones génicas diferentes. En una realización particular,
dicha célula huésped es una célula huésped transformada,
transfectada o infectada con (i) un sistema de expresión
proporcionado por esta invención que comprende bien una
construcción génica, en donde dicha construcción génica comprende
la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de
fusión que comprende las regiones A y B, y la secuencia de
nucleótidos que codifica para la proteína pVP2 de IBDV, o bien,
alternativamente, con (ii) un sistema de expresión que comprende
una primera construcción génica que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión que
comprende las regiones A y B, y una segunda construcción génica que
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
pVP2 de IBDV.
En una realización particular, la célula huésped
proporcionada por esta invención es una célula huésped
transformada, transfectada o infectada con un sistema de expresión
que comprende una construcción génica que comprende (i) una
secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o
región codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, (ii)
una secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura
abierta o región codificante de un polipéptido heterólogo que
comprende un polipéptido de interés, y (iii) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, en donde
dicha construcción génica está operativamente unida a unos elementos
de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción.
En otra realización particular, la célula
huésped proporcionada por esta invención es una célula huésped
transformada, transfectada o infectada con (a) una primera
construcción génica, operativamente unida a unos elementos de
control de transcripción y, opcionalmente, de traducción,
comprendiendo dicha primera construcción génica (i) una secuencia
de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, y (ii) una
secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta o
región codificante de un polipéptido heterólogo que comprende un
polipéptido de interés, y con (b) una segunda construcción génica,
operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y,
opcionalmente, de traducción, comprendiendo dicha segunda
construcción génica una secuencia de nucléotidos que comprende la
fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a la
proteína pVP2 de IBDV.
Prácticamente cualquier célula huésped
susceptible de ser transformada, transfectada o infectada por un
sistema de expresión proporcionado por esta invención puede ser
utilizada, por ejemplo, células de mamífero, células aviares,
células de insecto, levaduras, etc.; no obstante, en una
realización particular, dicha célula huésped se selecciona entre
levaduras y células de insecto. Las levaduras son adecuadas por
razones de simplicidad y coste de producción. Las células de
insecto son adecuadas cuando el sistema de expresión comprende uno
o dos baculovirus recombinantes (rBV). El empleo de rBV es
ventajoso por cuestiones de bioseguridad relacionadas con el rango
de huésped de los baculovirus, incapaces de replicar en otros tipos
celulares que no sean de insecto.
En una realización particular, la invención
proporciona una célula huésped, tal como una levadura, por ejemplo,
Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces pombe, etc.,
transformada con un sistema de expresión, tal como un plásmido o un
vector de expresión, que comprende una construcción génica
proporcionada por esta invención que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión que comprende
las regiones A y B, y la secuencia de nucleótidos que codifica para
la proteína pVP2 de IBDV.
En otra realización particular, la invención
proporciona una célula huésped, tal como una célula de insecto,
infectada con un sistema de expresión, tal como un baculovirus
recombinante, que comprende una construcción génica proporcionada
por esta invención que comprende la secuencia de nucleótidos que
codifica para dicha proteína de fusión que comprende las regiones A
y B, y la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
pVP2 de IBDV.
En otra realización particular, la invención
proporciona una célula huésped, tal como una célula de insecto,
co-infectada con un sistema de expresión que
comprende un primer baculovirus recombinante que comprende una
construcción génica proporcionada por esta invención que comprende
la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de
fusión que comprende las regiones A y B, y con un segundo
baculovirus recombinante que comprende una construcción génica
proporcionada por esta invención que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para la proteína pVP2 de IBDV.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para la producción de QVLPs de la invención
que comprende cultivar una célula huésped proporcionada por esta
invención que contiene la secuencia de nucleótidos codificantes de
dicha proteína de fusión que comprende las regiones A y B, y la
secuencia de nucleótidos codificante de la pVP2 de IBDV, bien en
una única construcción génica o bien en dos construcciones génicas
diferentes, y que expresa simultáneamente dichas proteínas pVP2 de
IBDV y proteína de fusión que comprende dichas regiones A y B, y,
si se desea, recuperar dichas QVLPs de la invención. En una
realización particular, dicha célula huésped proporcionada por esta
invención es una célula transformada, transfectada o infectada con
un sistema de expresión adecuado, tal como un sistema de expresión
que comprende una construcción génica, en donde dicha construcción
génica comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para
dicha proteína de fusión que comprende las regiones A y B, y la
secuencia de nucleótidos que codifica para la pVP2 de IBDV, o bien,
alternativamente, con un sistema de expresión que comprende una
primera construcción génica que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión que comprende
las regiones A y B, y una segunda construcción génica que comprende
la secuencia de nucleótidos que codifica para la pVP2 de IBDV.
Dicho procedimiento comprende, por tanto, la
co-expresión génica de dichas proteínas pVP2 de
IBDV y dichas proteínas de fusión que comprenden las regiones A y B
como dos genes independientes. Tras la expresión simultánea de
dichas proteínas (pVP2 de IBDV y las proteínas de fusión que
comprenden las regiones A y B) en dichas células, las proteínas
expresadas se ensamblan y forman las QVLPs de la invención, las
cuales pueden ser aisladas o retiradas del medio, y, si se desea,
purificadas. El aislamiento y purificación de dichas QVLPs de la
invención puede realizarse por métodos convencionales, por ejemplo,
mediante fraccionamiento en gradientes de sacarosa.
En una realización particular, la
co-expresión génica de las proteínas pVP2 de IBDV,
y las proteínas de fusión que comprenden dichas regiones A y B, se
realiza mediante el empleo de un rBV que permite la expresión
simultánea de dichas proteínas a partir de dos genes quiméricos
independientes en células de insecto. En este caso, el
procedimiento para la producción de QVLPs de la invención,
proporcionado por esta invención, comprende, en primer lugar, la
obtención de un sistema de expresión génica constituido por un rBV
que contiene una construcción génica que codifica simultáneamente
para las proteínas pVP2 de IBDV y para dichas proteínas de fusión
que comprenden dichas regiones A y B, tal como el rBV denominado
FBD/pVP2-his-VP3 (Ejemplo 1.2) o
bien, alternativamente, la obtención de un rBV que contiene una
construcción génica que codifica para la proteína pVP2 de IBDV y la
obtención de otro rBV que contiene una construcción génica que
codifica para dicha proteína de fusión que comprende dichas
regiones A y B, tal como los rBVs denominados FB/pPV2 y
FB/his-VP3 (Ejemplo 1.1), o rBVs denominados FB/pPV2
y FB/his-CD8-VP3 (Ejemplo 3),
respectivamente, seguido de la infección de células de insecto con
dicho sistema de expresión basado en dicho(s) baculovirus
recombinante(s), expresión de las proteínas recombinantes y,
si se desea, aislamiento de las QVLPs de la invención formadas por
ensamblaje de dichas proteínas pVP2 de IBDV y proteínas de fusión
que comprenden dichas regiones A y B, y, opcionalmente,
purificación posterior de dichas QVLPs de la invención.
La construcción de un baculovirus recombinante
que permite la expresión de forma independiente de las proteínas
pVP2 de IBDV y las proteínas de fusión que comprenden dichas
regiones A y B se puede realizar por cualquier experto en la materia
en base a lo a quí descrito y al estado de la técnica sobre esta
tecnología (Cold Spring Harbor, N.Y.; Leusch MS, Lee SC, Olins PO.
1995. A novel host-vector system for direct
selection of recombinant baculoviruses (bacmids) in Escherichia
coli. Gene 160: 191-4; Luckow VA, Lee SC, Barry
GF, Olins PO. 1993. Efficient generation of infectious recombinant
baculoviruses by site-specific
transposon-mediated insertion of foreign genes into
a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol
67: 4566-79).
En otra realización particular, la
co-expresión génica de las proteínas pVP2 de IBDV y
de las proteínas de fusión que comprenden las regiones A y B
previamente definidas, se realiza mediante el empleo de un vector
que permite la expresión de dichas proteínas en células de
levadura. En este caso, el procedimiento para la producción de
QVLPs de la invención, proporcionado por esta invención, comprende,
en primer lugar, la obtención de un sistema de expresión génica
constituido por un plásmido que contiene una construcción génica
que codifica simultáneamente para las proteínas pVP2 de IBDV y para
dichas proteínas de fusión que comprenden dichas regiones A y B,
seguido de la transformación de levaduras con dicho sistema de
expresión, expresión de las proteínas recombinantes y, si se desea,
aislamiento de las QVLPs de la invención formadas por ensamblaje de
dichas proteínas pVP2 de IBDV y proteínas de fusión que comprenden
dichas regiones A y B, y, opcionalmente, purificación posterior de
dichas QVLPs de la invención. En una realización concreta, el
sistema de expresión adecuado para transformar levaduras está
basado en un sistema de expresión pESC Yeast (Stratagene) tal como,
por ejemplo, el plásmido pESCURA/pVP2NP3-GFP
(Ejemplo 2) que contiene una construcción génica que codifica para
las proteínas pVP2 de IBDV y VP3-GFP.
La obtención de levaduras transformadas con una
construcción génica o con un sistema o vector de expresión
apropiado que permite la expresión simultánea de las proteínas pVP2
de IBDV y las proteínas de fusión que comprenden dichas regiones A y
B, se puede realizar por cualquier experto en la materia en base a
lo aquí descrito y al estado de la técnica sobre esta tecnología
(pESC epitope tagging vectors Instructions manual. Stratagene
www.stratagene.com; Sambrook, J., Fritsch, E.F., and
Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd
ed. Cold Spring Harbor Laboratory).
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo del sistema de expresión génica proporcionado por
esta invención para la producción y obtención de QVLPs de la
invención.
Las QVLPs de la invención pueden ser utilizadas
como vectores o vehiculizadores de productos de interés, tales como
moléculas con actividad biológica, por ejemplo, fármacos,
polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc., por lo que pueden
ser utilizadas con fines terapéuticos, de diagnóstico o de
investigación. En una realización particular, dichas moléculas de
interés biológico incluyen polipéptidos de interés, tales como
antígenos o inductores de respuestas inmune en animales o humanos a
los que se suministre, o bien incluyen secuencias de ácido
nucleico, útiles en terapia génica, destinadas a ser introducidas
en el interior de las células apropiadas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de las QVLPs de la invención en la
elaboración de medicamentos, por ejemplo, vacunas, vectores para
terapia génica (delivery systems), etc. En una realización
particular, dicho medicamento es una vacuna destinada a conferir
protección frente a enfermedades humanas o animales causadas por
virus, bacterias, parásitos o cualquier otro tipo de
microorganismos, o frente a enfermedades tumorales. En otra
realización particular, dicho medicamento es un vector para terapia
génica.
En otro aspecto, la invención proporciona una
vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
QVLPs de la invención, junto con, opcionalmente, uno o más
adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dicha vacuna
es útil para proteger animales y humanos frente a enfermedades
causadas por microorganismos (virus, bacterias, parásitos, etc.), o
frente a enfermedades tumorales. En una realización particular,
dicha vacuna resulta especialmente útil para proteger animales y
humanos simultáneamente frente a la infección causada por dos o más
agentes infecciosos causantes de enfermedades. A modo ilustrativo,
la vacuna proporcionada por esta invención puede ser utilizada para
proteger aves, por ejemplo, pollos, pavos, ocas, gansos, faisanes,
codornices, avestruces, etc., frente al virus causante de la
bursitis infecciosa (IBDV) y frente a uno o más agentes infecciosos
responsables de enfermedades aviares (patógenos aviares).
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad de QVLPs de la invención calculada para producir el efecto
deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por
las características propias de las QVLPs y el efecto de
inmunización a conseguir.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas vacunas son los
adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y
utilizados habitualmente en la elaboración de vacunas.
En una realización particular, dicha vacuna se
prepara en forma de una solución o suspensión acuosa, en un
diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina,
solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otro
diluyente farmacéuticamente aceptable.
La vacuna proporcionada por esta invención puede
ser administrada por cualquier vía de administración apropiada que
dé como resultado una respuesta inmune protectora frente a la
secuencia heteróloga o epítopo utilizado, para lo cual dicha vacuna
se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de
administración elegida. En una realización particular, la
administración de la vacuna proporcionada por esta invención se
efectúa por vía parenteral, por ejemplo, por vía intraperitoneal,
subcutánea, etc.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
En este ejemplo se describen los resultados de
una serie de experimentos diseñados para analizar la posibilidad de
obtener QVLPs de IBDV a partir de la coexpresión de las proteínas
pVP2 y VP3 de IBDV y un péptido heterólogo a partir de dos genes
quiméricos independientes. Para ello, se han utilizado dos
baculovirus recombinantes (rBVs) descritos previamente,
FB/his-VP3 (Kochan, G., González, D. &
Rodríguez, J. F. (2003). Characterization of the RNA binding
activity of VP3, a major structural protein of IBDV. Archives of
Virology 148, 723-744) y FB/VPX, aquí citado
como FB/pVP2, (Martínez-Torrecuadrada, J. L.,
Castón, J. R., Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodríguez, J. F. &
Casal, J. I. (2000). Different architectures in the assembly of
infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect
cells. Virology 278, 322-331). Estos rBVs
fueron generados mediante el clonaje en vectores apropiados de los
DNA complementarios (cDNAs) codificadores de las proteínas pVP2 y
pVP3 de IBDV. Dichos cDNAs fueron obtenidos por
RT-PCR a partir del segmento A del genoma de IBDV
serotipo I cepa Soroa (número de acceso al NCBI, AAD30136). El rBV
FB/his-VP3 expresa una proteína VP3 quimérica que en
su extremo N-terminal contiene un tándem de 6
histidinas fusionadas a la secuencia de VP3
(Met754-G1u1012 de la poliproteína) denominada
his-VP3. El rBV FB/pVP2 expresa la región
codificadora de la proteína pVP2 (Met1-A1a512).
El análisis de la expresión de estas proteínas
pVP2 y his-pVP3, bien de forma independiente o
conjunta, se realizó en cultivos celulares. Para la realización de
estos experimentos, se utilizaron cultivos en monocapa de células
procedentes del insecto Trichloplusia ni (H5, Invitrogen) que
fueron crecidos sobre cubreobjetos de cristal. Dichos cultivos
fueron infectados independientemente con FB/pVP2,
FB/his-VP3, o co-infectados con
ambos rBVs. La multiplicidad de infección fue de 5 ufp/célula. A las
48 horas después de la infección (hpi) las células fueron fijadas, e
incubadas con sueros policlonales de conejo
anti-VP2 y policlonales de rata
anti-VP3 (Fernández-Arias, A.,
Risco, C., Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998).
Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus infectious
bursal disease virus results in the formation of
virus-like particles. Journal of General
Virology 79, 1047-1054). Después de sucesivos
lavados, los cubreobjetos fueron incubados con sueros de cabra
anti-rata conjugado con Alexa 594 y de cabra
anti-conejo conjugado a Alexa 488 (Jackson
Immunoresearch Laboratories, Inc.). Los núcleos celulares fueron
teñidos con el marcador especifico
To-Pro-3 (Molecular Probes, Inc.).
Finalmente, las muestras se visualizaron por epifluorescencia con
un microscopio Zeiss Axiovert 200 equipado con el sistema confocal
Bio Rad Radiance 2100. Las imágenes obtenidas se almacenaron
utilizando el equipo de software Laser Sharp Package (Bio Rad).
Como se muestra en la Figura 2a, en los cultivos infectados con
FB/pVP2 el suero anti-VP2 mostró una señal granular
fina mezclada con estructuras tubulares ambas distribuidas en todo
el citoplasma. La señal anti-VP3, detectada en las
células infectadas con el rBV FB/his-VP3, se
caracterizó por la presencia de acumulaciones de forma esférica
alrededor del núcleo y aparentemente huecas. En los cultivos
coinfectados con ambos virus recombinantes se detectó una notable
modificación en el patrón de distribución de ambas proteínas. En
estas células, las señales específicas de pVP2 y VP3 se
colocalizaron en acumulaciones esféricas y densas, sugiriendo que su
coexpresión permitía la formación de complejos
pVP2/his-VP3 (Figura 2c a la 2e).
Con la intención de caracterizar estas
estructuras en mayor detalle, extractos similares, correspondientes
a células infectadas con FB/pVP2+FB/hisVP3 fueron analizados por
microscopía electrónica de transmisión (TEM). Como control, y en
paralelo, se analizaron por la misma técnica cultivos de células H5
infectadas con la cepa silvestre del virus FBD (FastBacDual,
Invitrogen). Después de la infección, las células fueron recogidas
a las 48 h, y procesadas como se ha descrito previamente
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79: 1047-1054)
para su análisis en cortes ultrafinos por TEM. Como se muestra en
la Figura 2, el citoplasma de las células coinfectadas contiene
agregados formados por una mezcla de túbulos y estructuras
similares a cápsidas (Figura 2g, 2h y 2i). Estos agregados no fueron
observados en ningún caso en las muestras correspondientes a
células infectadas con el virus silvestre FBD (Figura 20. El aspecto
y el tamaño de los túbulos, así como de las estructuras similares a
cápsidas fue semejante a los descritos previamente en cultivos
celulares infectados con VT7/Poly, un recombinante del virus
vaccinia que expresa el gen de la poliproteína de IBDV
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79:
1047-1054).
Para establecer de forma inequívoca que la
coexpresión de pVP2 y his-VP3 permitía el
ensamblaje y, por tanto, la obtención de QVLPs, se decidió purificar
las partículas formadas. Para ello, se infectaron con
FB/pVP2+FB/his-VP3 cultivos de células H5. 60 bpi,
las células se homogeneizaron y los extractos se separaron en
gradientes de sacarosa tal y como se ha descrito previamente
(Lombardo, E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J.,
Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L.
& Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73,
6973-6983). Después de su centrifugación, los
gradientes fueron fraccionados, y las distintas fracciones fueron
analizadas por TEM como se ha descrito previamente (Lombardo, E.,
Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J.,
Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L.
& Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73,
6973-6983). Como control, y sujetos al mismo
procedimiento, se fraccionaron gradientes correspondientes a
extractos de células infectadas con el rBV FBNPX o con el rBV
FBD/Poly-VP1. El virus recombinante
FBD/Poly-VP1 expresa simultáneamente la poliproteína
y el polipéptido VP1. Como era predecible, la infección con
FBD/Poly-VP 1 tenía como resultado una eficiente
producción de VLPs (Maraver, A., Oña, A., Abaitua, F., González,
D., Clemente, R., Díaz-Ruiz, A., Castón, J. R.,
Pazos, F. & Rodríguez, J. F. (2003). The oligomerization domain
of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus,
plays a critical role for capsid formation. Journal of
Virology 77:6438-49). Por otra parte, las
fracciones correspondientes a las células infectadas con FB/VPX
sólamente contenían túbulos de aspecto retorcido. Los gradientes
correspondientes a células coinfectadas con los rBVs
FB/pVP2+FB/his-VP3 contenían túbulos rígidos de tipo
I en las fracciones cercanas al fondo del gradiente, y QVLPs en las
centrales y en las fracciones superiores (Figura 3b). Las QVLPs
aisladas de las células co-infectadas con rBV
FB/pVP2+FB/his-VP3 tenían un diámetro de
65-70 nm, así como un contorno poligonal
característico, absolutamente indistinguible de las VLPs
purificadas de cultivos infectados con FBD/Poly-VP1
(Maraver, A., Oña, A., Abaitua, F., González, D., Clemente, R.,
Díaz-Ruiz, A., Castón, J. R., Pazos, F. &
Rodríguez, J. F. (2003). The oligomerization domain of VP3, the
scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a
critical role for capsid formation. Journal of Virology
77:6438-49) o de los cultivos infectados con
VT7/Poly (Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez,
S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF
A1 of infectious bursal disease virus infectious bursal disease
virus results in the formation of virus-like
particles. Journal of General Virology 79,
1047-1054).
Con la intención de conseguir una
caracterización bioquímica del material obtenido, se realizaron
experimentos de western-blot en los que las
distintas fracciones se enfrentaron a sueros específicos contra las
proteínas VP1, pVP2, VP3 y VP4 (Fernández-Arias
et al. 1998, citado supra; Lombardo et al.,
1999). Como control se utilizaron extractos de células infectadas
con IBDV. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3d.
Como se esperaba, las bandas correspondientes a los polipéptidos VP1
y VP4 sólo fueron detectadas en muestras correspondientes a células
infectadas con FBD/Poly-VP1. Los patrones
correspondientes a pVP2/VP3 en muestras correspondientes a células
infectadas con FBD/Poly-VP 1 o coinfectadas con
FB/VPX+ FB/his-VP3 fueron similares, detectándose
dos bandas correspondientes a pVP2 y VP3, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se procedió a la construcción del
plásmido pFBD/pVP2-his-VP3. El
primer paso de la construcción se realizó mediante el clonaje de la
región codificante de la proteína pVP2 en el vector pFBDual
(Invitrogen). El fragmento de DNA correspondiente a pVP2 se obtuvo
mediante PCR con los oligonucleótidos identificados como Oligo I
(SEQ ID NO: 1) y Oligo II (SEQ ID NO: 2) empleando como molde el
plásmido pVOTE.2/Poly (Fernández-Arias, A., Risco,
C., Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998).
Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus infectious
bursal disease virus results in the formation of
virus-like particles. Journal of General
Virology 79, 1047-1054). El fragmento fue
purificado, sometido a digestión con los enzimas BglII y HindIII y
donado en el vector pFBDual (Invitrogen) previamente digerido con
los enzimas BamHI y HindIII. El plásmido resultante se denominó
pFBD/pVP2. A continuación, se obtuvo un fragmento de DNA
conteniendo la fase de lectura abierta correspondiente a la
proteína VP3 mediante digestión del plásmido
pFB/his-VP3 (Kochan et al., 2003, citado
supra) con el enzima RsrII, tratamiento con Klenow, y
posterior restricción con KpnI. Este fragmento de DNA fue
purificado y donado en el plásmido pFBD/pVP2 previamente digerido
con los enzimas SmaI y KpnI. El plásmido resultante se denominó
pFBD/pVP2-his-VP3 (SEQ ID NO: 3) y
contiene la secuencia de nucleótidos codificante de las proteínas
pVP2 y de la proteína de fusión his-VP3 que
contiene una secuencia heteróloga de 6 his (esta última está
codificada por la cadena complementaria a los nucleótidos
6734-7585 de la SEQ ID NO: 3). La secuencia de
aminoácidos de la proteína pPV2 codificada por la secuencia de
nucleótidos contenida en dicho plásmido
pFBD/pVP2-his-VP3 se muestra en la
SEQ ID NO: 4.
El plásmido
pFBD/pVP2-his-VP3 permitió la
obtención de un rBV, denominado
FBD/pVP2-his-VP3, que expresa
durante su ciclo de replicación ambas proteínas simultáneamente
[http://invitrogen.com/content/sfs/manuals/bevtest.
pdf].
pdf].
Los resultados obtenidos con
FBD/pVP2-his-VP3 en células de
insecto son idénticos a los obtenidos mediante la coinfección con
los rBVs FB/pVP2 y FD/his-VP3, obteniéndose QVLPs
de IBDV con el péptido heterólogo de seis histidinas (6his).
Con el fin de estudiar la posibilidad de obtener
QVLPs de IBDV en cultivos de levadura (Saccharomyces
cerevisiae) se generó el vector
pESCURA/pVP2-VP3-GFP con el gen
heterólogo GFP unido al extremo N-terminal de VP3.
El primer paso en la construcción del vector se realizó mediante el
clonaje de la región codificante de la proteína pVP2 en el vector
pESCURAinv. El plásmido pESCURAinv se generó mediante digestión del
vector pRS426 (Stratagene) con el enzima Pvull y religación de la
mezcla de digestión. El vector resultante, pESCURAinv, contiene la
región de clonaje múltiple en posición invertida con respecto a la
del vector parental pRS426. El fragmento de DNA correspondiente a
la proteína pVP2 se obtuvo mediante PCR con los oligonucleótidos
identificados como Oligo III (SEQ ID NO: 5) y Oligo IV (SEQ ID NO:
6) empleando como molde el plásmido pVOTE.2/Poly
(Fernández-Arias. A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez. J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursa] disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79, 1047-1054).
El fragmento fue purificado, sometido a digestión con los enzimas
BglII y HindIII y clonado en el vector pESCURA.inv previamente
digerido con los enzimas BamHI y HindII. El plásmido resultante se
denominó pESCURA/pVP2.
El plásmido pFB/VP3-GFP fue
construido en dos etapas. La primera consistió en el clonaje de una
fragmento de DNA, generado mediante PCR, que contiene la ORF de la
proteína VP3 carente del codón de terminación. Este PCR se realizó
utilizando los oligonucleótidos identificados como Oligo V (SEQ ID
NO: 9) y Oligo VI (SEQ ID NO: 10) y empleando como molde el
plásmido pVOTE.2/Poly (Fernández-Arias, A., Risco,
C., Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998).
Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in
the formation of virus-like particles. Journal of
General Virology 79, 1047-1054). El DNA
resultante fue digerido con los enzimas EcoRI y BamHI y clonado en
el vector pEGFP-N3 (Clontech) también digerido con
los mismos enzimas. El plásmido resultante se denominó
pVP3-GFP. A continuación, el plásmido
pEGFP-GFP fue digerido con los enzimas EcoRI y NotI
y clonado en le vector pFastBacl (Invitrogen). El plásmido
resultante se denominó pFB/VP3-GFP.
Seguidamente, se obtuvo un fragmento de DNA que
contenía la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína
VP3 fusionada a la región codificante de la proteína EGFP mediante
digestión del plásmido pFB/VP3-GFP con los enzimas
EcoRI y NotI. Este fragmento de DNA fue purificado y clonado en el
plásmido pESCURA/pVP2 previamente digerido con los enzimas EcoRI y
Notl. El plásmido resultante se denominó
pESCURA/pVP2-VP3-GFP (SEQ ID NO: 7)
y contiene las ORFs de la proteína pVP2 y VP3-GFP
bajo el control transcripcional de dos promotores independientes,
GAL 1 y GAL 10, ambos inducibles por galactosa (la proteína pVP2
está codifica por la cadena nucleótidos complementaria a los
nucleótidos 5862-7343 de la SEQ ID NO: 7). La
secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión
VP3-GFP codificada por la secuencia de nucleótidos
contenida en dicho plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP se muestra en
la SEQ ID NO: 8.
Posteriormente,
pESCURA/pVP2-VP3-GFP se empleó para
transformar un cultivo de la levadura S. cerevisiae haploide
cepa 499 según un protocolo previamente descrito (Gietz, R.D. and
R.A. Woods. (2002) Transformation of yeast by the Liac/SS carrier
DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96).
Las levaduras transformadas con el plásmido fueron seleccionadas
mediante crecimiento en placas de medio SC (CSM + YNB, glucosa 2% y
bacto agar) suplementadas con los aminoácidos triptófano, leucina e
histidina y carentes de uracilo (-Ura). Tras una incubación de 48 h
a 30°C, se seleccionó una colonia que fue empleada para la
realización de los subsiguientes análisis de expresión de proteínas
y formación de QVLPs.
El análisis de la expresión de las proteínas
pVP2 y VP3 y formación de QVLPs se realizó siguiendo un protocolo
descrito previamente para la caracterización de VLPs de IBDV en
otros sistemas de expresión (Fernández-Arias, A.,
Risco, C., Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F.
(1998). Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79, 1047-1054;
Lombardo, E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J.,
Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L.
& Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73,
6973-698). La colonia seleccionada fue cultivada en
medio liquido CSM (-Ura) + YNB suplementado con rafinosa al 2%. El
cultivo se incubó a 30°C durante 24 h. Este cultivo fue empleado
para inocular, a una densidad óptica (D.O.) de 0,2, un matraz de 200
ml de medio CSM (-Ura) + YNB suplementado con el inductor galactosa
al 2%. El cultivo fue mantenido a 30°C durante 18 horas (hasta una
D.O. entre 1,0 y 2,0). Las levaduras fueron centrifugadas a 3000
rpm, 5 min a 4°C, se lavaron con agua destilada 1 vez, y el pellet
fue resuspendido en tampón de lisis (TEN: Tris 10 mM, pH 8,0; NaCl
150 mM; EDTA 1 mM) + inhibidores de proteasas 2X (Compl Roche).
Para la lisis se añadió 1 volumen de "glass beads" (cuentas o
perlas de vidrio) de un tamaño aproximado de 425-600
micrones (Sigma). Esta mezcla fue sometida al vortex vigoroso
durante 30 segundos 4 veces, con intervalos de 30 segundos, y todo
ello a 4°C. Tras ello se recuperó la fracción soluble por
centrifugación de la mezcla de lísis a 13.000 rpm durante 15 min a
4°C. Esta muestra fue sometida a fraccionamiento en un gradiente de
sacarosa de acuerdo al protocolo previamente descrito (Lombardo,
E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J.,
Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L.
& Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73,
6973-6983). Las muestras obtenidas tras el
fraccionamiento así como una muestra del material de partida fueron
analizadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) [Current Protocols
in Molecular Biology] e inmunodetección por Western blot (Figura
4A) empleando sueros anti-pVP2 y
anti-VP3 [Current Protocols in Molecular Biology].
Como se muestra en la Figura 4A, el Western blot reveló la
presencia de bandas, con la masa molecular predicha correspondiente
a las proteínas pVP2 (48 kDa) y VP3-GFP (61 kDa),
así como otras bandas inmunoreactivas de menor tamaño producidas
probablemente por degradación proteolítica tanto en la muestra
inicial como en las diferentes fracciones del gradiente. Estos
resultados demostraron de forma fehaciente la correcta expresión de
ambos polipéptidos en el cultivo de S. cerevisiae
transformado con el plásmido pESCURA/pVP2-VP3. A
continuación, las distintas fracciones del gradiente fueron
analizadas mediante TEM como se ha descrito previamente (Lombardo,
E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J.,
Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L.
& Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73:,
6973-6983). Como se muestra en la Figura 4B, el
análisis mediante TEM de las fracciones del gradiente reveló la
existencia de QVLPs de IBDV en las fracciones superiores del
gradiente. Estas QVLPs presentan un diámetro de
65-70 nm y un contorno poligonal indistinguible de
las VLPs de IBDV obtenidas en otros sistemas de expresión (Figura
4C).
Como parte del desarrollo de nuevas estrategias
de vacunación se analizó la posibilidad de emplear esta estrategia
de producción de VLPs quiméricas (QVLPs) de IBDV que contuvieran
secuencias aminoacídicas heterólogas, correspondientes a otras
proteínas o péptidos implicados en la inducción de una respuesta
inmune. Como modelo de estudio se abordó la posibilidad de obtener
QVLPs que contuvieran, como polipéptido heterólogo que comprende un
polipéptido de interés, la secuencia de aminoácidos correspondiente
al epítopo CD8 (E-CD8) de la proteína CS de malaria
(Plasmodium yoelii). Quantification of antigen specific CD8+
T cells using an ELISPOT assay. J Immunol Methods 181:
45-54; Zavala, F., Rodrigues, M., Rodriguez, D.,
Rodriguez, J. R., Nussenzweig, R. S. and Esteban, M. (2001). A
striking property of recombinant poxviruses: efficient inducers of
in vivo expansion of primed CD8(+) T cells. Virology 280:
155-159). Este epítopo es responsable de la
inducción de la respuesta inmune celular
CD8-específica frente a este patógeno
(Oliveira-Ferreira J, Miyahira Y, Layton GT, Savage
N, Esteban M, Rodriguez D, Rodriguez JR, Nussenzweig RS, Zavala F,
Myahira Y. (2000). Immunogenicity of Ty-VLP bearing
a CD8(+) T cell epitope of the CS protein of P. yoelii: enhanced
memory response by boosting with recombinant vaccinia virus.
Vaccine 18: 1863-1869). Esta respuesta puede ser
cuantificada mediante la técnica de ELISPOT (Miyahira Y, Murata K,
Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M, Rodrigues MM, Zavala F.
(1995) Quantification of antigen specific CD8+ T cells using an
ELISPOT assay. J Immunol Methods 181: 45-54) en
cultivos de esplenocitos de ratones BALB/c.
Con este fin, se realizó la construcción del
plásmido pFB/his-CD8-VP3 (SEQ ID
NO: 13) siguiendo la estrategia de clonaje descrita más adelante.
Este vector fue construido mediante inserción de un fragmento de
DNA de 36 bp, generado mediante hibridación de los oligonucleótidos
sintéticos identificados como CD8 A (SEQ ID NO: 11) y CD8 B (SEQ ID
NO: 12), que contiene la secuencia codificadora del epítopo CD8
(SYVPSAEQI, ver los residuos 29 a 37 de las SEQ ID NO: 13 y 14) de
la proteína CS de malaria en la ORF que codifica la proteína
his-VP3 integrada en el vector
pFB/his-VP3. El clonaje se realizó mediante
ligación del fragmento de DNA generado mediante hibridación de los
oligonucleótidos sintéticos CD8 A y B (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO:
12) al plásmido pFB/his-VP3 digerido con el enzima
de restricción EheI. Este plásmido
pFB/his-CD8-VP3 (SEQ ID NO: 13)
contiene una ORF que codifica una proteína de fusión denominada
his-CD8-VP3 que contiene el epítopo
CD8 insertado en el extremo correspondiente a la secuencia
N-terminal de la ORF de proteína
his-VP3. La secuencia de aminoácidos de la proteína
de fusión his-CD8-GFP codificada por
la secuencia de nucleótidos contenida en dicho plásmido
pFB/his-CD8-VP3 se muestra en la SEQ
ID NO: 14.
El plásmido
pFB/his-CD8-VP3 fue purificado y
empleado para generar el correspondiente baculovirus recombinante
(rBV), denominado FB/his-CD8-VP3,
siguiendo la tecnología Bac-to-Bac
de acuerdo con los protocolos descritos por el fabricante
(Invitrogen By, Groningen, The Netherlands).
Cultivos de células H5 fueron infectados
simultaneamente con los baculovirus recombinantes
FB/His-CD8-VP3 y FB/pVP2. El rBV FB/
pVP2 (véase el Ejemplo 1.1) expresa la región correspondiente a la
proteína pVP2 (Met1-Ala 512) de la poliproteína de
IBDV. A las 48 horas post-infección (pi) las células
fueron recogidas y los extractos correspondientes sometidos al
protocolo de purificación de VLPs de IBDV mediante fraccionamiento
en gradientes lineales de sacarosa (Lombardo, E., Maraver, A.,
Castón, J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A.,
Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1,
the putative RNA-dependent RNA polymerase of
infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid
protein VP3, leading to efficient encapsidation into
virus-like particles. Journal of Virology 73:
6973-6983). Cada una de las fracciones obtenidas
fue visualizada mediante microscopía electrónica de transmisión
(TEM) y analizada mediante SDS-PAGE e inmmunoblot
empleando un anticuerpo específico frente a VP3. Como se observa en
la Figura 5A, la fracción 4 del gradiente contenía abundantes
ensamblados con una estructura idéntica (perímetro poligonal y un
diámetro de 65-70 nm) a las VLPs de IBDV obtenidas
mediante expresión de la poliproteína viral. La caracterización
bioquímica, mediante SDS-PAGE y Western blot (Figura
5B), demostró que estas QVLPs contienen una proteína,
inmunoreactiva frente al suero anti-VP3, cuya masa
molecular (33,5 kDa) es idéntica a la predicha para la proteína de
fusión his-CD8-VP3 (33,591 kDa).
Estos resultados permiten concluir que la
co-expresion de los genes pVP2 e
his-CD8-VP3 en células de insecto da
lugar a la formación de VLPs quiméricas (QVLPs) que contienen la
proteína de fusión his-CD8-VP3.
Estas QVLPs se denominaron QVLPs-CD8.
Con el fin de determinar la capacidad
inmunogénica de las QVLPs-CD8 se realizaron dos
ensayos idénticos empleando dos lotes de QVLPs-CD8
producidas y purificadas de forma independiente. Se emplearon 4
grupos (I, II, III y IV) de tres ratones hembra BalbC de ocho
semanas de edad. Los grupos fueron formados al azar. La estrategia
de inmunización fue similar a la empleada previamente en la
caracterización de otros inmunógenos. Esta estrategia se basa en el
empleo de una primera dosis (priming) de inmunización con el
antígeno bajo estudio seguida por una segunda dosis de recuerdo
(booster), que amplifica la respuesta primaria, con el virus
vaccinia recombinante VVpJRCS que expresa la proteína CS de malaria.
La respuesta inmune inducida se determinó mediante la detección de
las células T CD8^{+} específicas de antígeno, en función de su
cualidad para producir IFN-\gamma, mediante un
ensayo de ELISPOT (Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D, Rodriguez JR,
Esteban M, Rodrigues MM, Zavala F. (1995). Quantification of
antigen specific CD8+ T cells using an ELISPOT assay. J Immunol
Methods 181: 45-54). En resumen, placas de 96
pocillos con fondos de nitrocelulosa (Millipore) se cubrieron con
75 \mul/pocillo de una solución que contenía 6 \mug/ml del
anticuerpo monoclonal de rata
anti-IFN-\gamma murino
(R4-6A2, Pharmingen, San Diego, CA) resuspendido en
PBS. Las placas fueron incubadas toda la noche a temperatura
ambiente. Posteriormente, se lavaron los pocillos tres veces con
medio RPMI y, finalmente, se incubaron con medio RPMI suplementado
con 10% suero fetal de ternera (FCS) durante una hora a 37°C en
atmósfera de CO_{2} al 5%. Por otro lado, los bazos de los ratones
inmunizados, mantenidos en medio RPMI suplementado con 10% de FCS,
se dispusieron en una rejilla estéril sobre una placa de 60 mm, y
se homogeneizaron, disgregando el extracto mediante su paso por
agujas de diferente calibre (21G->25G). Las células así
disgregadas se centrifugaron 5 min a 1.500 rpm a 4°C, y se lavaron
dos veces con medio RPMI + 10% FCS. Para lisar los eritrocitos de
las muestras, se añadió NH4C1 0,1 M estéril (2 ml/bazo) y se
mantuvo a 4°C durante 3-5 min, se añadió RPMI + 10%
FCS y se centrifugó. Después, se lavaron 2 veces, y finalmente se
resuspendió en 1-2 ml RPMI + 10% FCS. El recuento
de la viabilidad de los esplenocitos se realizó mediante tinción con
azul tripan (4% en agua, Sigma).
Las células presentadoras profesionales (APC)
utilizadas en este ensayo, fueron las P815. Estas células se
ajustaron a una concentración de 10^{6} células/ml y se incubaron
con el péptido sintético SYVPSAEQI (correspondiente a la región CD8
de la proteína CS de malaria) 10^{-6} M. Tras el tratamiento con
el péptido, las células fueron lavadas y tratadas con mitomicina C
(30 \mug/ml) (Sigma) durante 15 minutos a 37ºC y en atmósfera de
CO_{2}. Después de subsiguientes lavados, las células
presentadoras, a las que se adicionó 30 U/ml de interleuquina 2
murina (IL-2), se añadieron a una concentración de
10^{5} células/pocillo. Asimismo, se añadió 100 \mul/pocillo
de 10^{6} esplenocitos/ml y diluciones 1/4 y 1/16. Las placas se
incubaron durante 18 horas a 37°C en atmósfera de CO_{2}, se
lavaron 5 veces con PBST y se incubaron con 2 gg/ml del anticuerpo
monoclonal de rata biotinilado
anti-IFN-\gamma XMG1.2
(Pharmingen) diluido en PBST, durante 2 horas a temperatura
ambiente. Después se lavaron las placas 5 veces con PBST y se
añadió una dilución 1/800 de avidina-peroxidasa (0,5
mg/ml) (Sigma). Tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente,
se lavó 3 veces con PBST y 2 con PBS, añadiéndose finalmente la
mezcla reveladora con 1 \mug/ml del sustrato DAB (Sigma),
resuspendido en Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM,
conteniendo 0,015% de H_{2}O_{2}. La reacción se detuvo lavando
la placa con abundante agua, y una vez seca se llevó a cabo el
recuento de las marcas de deposición (spots) con la ayuda de un
estereomicrocopio de Leica MZ122 APO y el software Imaging System
QWIN (Leica, Cambridge, United kingdom).
Las inmunizaciones fueron realizadas de acuerdo
al programa de inmunización descrito en la siguiente tabla:
Las inmunizaciones con VVpJRCS se realizaron por
vía intraperitoneal empleando 10^{7} unidades formadoras de
placa (ufp) por animal. Las inmunizaciones con VLPs, tanto VLPs de
IBDV no quiméricas como QVLPs-CD8, fueron realizadas
por vía intraperitoneal con una dosis de 50 \mug de antígeno por
animal. En todos los casos las preparaciones antigénicas fueron
diluidas en tampón fosfáto salino (PBS).
28 días después de la primera inmunización los
animales fueron sacrificados y sus bazos empleados para la
realización de los ensayos de ELISPOT. Estos ensayos se realizaron
siguiendo el protocolo descrito anteriormente. En ambos ensayos se
obtuvieron resultados prácticamente idénticos. La Figura 6 muestra
los resultados correspondientes al primer ensayo. Los resultados
obtenidos demuestran que cuando se emplean QVLPs-CD8
como primera dosis de inmunización seguida por una dosis de
recuerdo con el virus VVpJRCS (grupo IV) se produce una potente
estimulación de la respuesta inmune celular específica frente al
epítopo CD8 de malaria. Esta estimulación es muy superior (20 veces
aproximadamente) a la obtenida tras la inmunización con una (grupo
I) ó dos dosis de VVpJRCS (grupo II). El hecho de que no se
produzca una estimulación significativa de la respuesta frente a
E-CD8 en animales inmunizados con VLPs no quiméricas
de IBDV (grupo III), respecto al grupo I, que recibió una única
dosis de VVpJRCS, demuestra que la respuesta obtenida en el grupo IV
es inducida específicamente por el E-CD8 presente
en las proteína de fusión
his-CD8-VP3 que forma parte integral
de las QVLPs-CD8.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTIFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> BIONOSTRA, S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CÁPSIDAS VACÍAS QUIMÉRICAS DEL VIRUS
CAUSANTE DE LA ENFERMEDAD DE LA BURSITIS INFECCIOSA (IBDV), SU
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> QVLPs de IBDV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcagatct atgacaaacc tgtcagatca aaccc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aggcgagagt cagctgcctt atgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7595
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pFBD/pVP2-his-VP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (157)..(285)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor ppolh
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (291)..(1289)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVP2 ORF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7443)..(7503)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor p10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pFBD/pVP2-his-VP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcagatct atgacaaacc tgtcagatca aaccc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo IV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aggcgagagt cagctgcctt atgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5649)..(5859)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor 1 (pVP2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7402)..(8080)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor 2
(VP3-GFP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8086)..(9597)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VP3-GFP ORF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 503
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo V
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgaattc gatggcatca gagttcaaag aga
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo VI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccc tcaaggtcct catcagagac gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo CD8 A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacgaggaca gttatgtccc aagcgcagaa caaata
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo CD8 B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatttgttct gcgcttggga cataactgtc ctcgtt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5676
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pFB/his-CD8-VP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(129)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor de poliedrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (147)..(1043)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
His-CD8-VP3 ORF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (222)..(257)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His-CD8 ORF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pFB/his-CD8-VP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
Claims (31)
1. Una cápsida vacía quimérica del virus
causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV),
caracterizada porque está constituida por ensamblaje de (i)
proteínas pVP2 de IBDV y (ii) proteínas de fusión que comprenden
una región A constituida por la proteína VP3 de IBDV unida a una o
más regiones B, estando constituida cada una de dichas regiones B
por un polipéptido heterólogo que comprende uno o más polipéptidos
de interés.
2. Cápsida según la reivindicación 1, en la que
dicha región B está unida a la región
amino-terminal de la VP3 de IBDV, o,
alternativamente, a la región carboxi-terminal de
VP3 IBDV.
3. Cápsida según la reivindicación 1, en la que
dicho polipéptido de interés es un polipéptido para su uso en
vacunación, terapia o diagnóstico.
4. Cápsida según la reivindicación 1, en la que
dicha región B comprende un único polipéptido de interés.
5. Cápsida según la reivindicación 1, en la que
dicha región B comprende dos o más polipéptidos de interés.
6. Cápsida según la reivindicación 1, en la que
dicha proteína de fusión comprende una región A unida a una única
región B.
7. Cápsida según la reivindicación 1, en la que
dicha proteína de fusión comprende una región A unida a dos
regiones B, iguales o diferentes, una de ellas unida a la región
amino-terminal de la VP3 presente en la región A y
la otra a la región carboxi-terminal de VP3
presente en la región A.
8. Cápsida según la reivindicación 7, en la que
dichas regiones B contienen unos polipéptidos de interés iguales o
diferentes entre sí.
9. Cápsida según la reivindicación 1, en la que
dicha proteína de fusión comprende, además, un polipéptido
espaciador situado entre dichas regiones A y B.
10. Un ácido nucleico caracterizado
porque su secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de
nucléotidos que codifica para la proteína de fusión definida en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un ácido nucleico caracterizado
porque su secuencia de nucleótidos comprende (i) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta
correspondiente a la proteína VP3 de IBDV y (ii) una secuencia de
nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta de uno o más
polipéptidos heterólogos que comprenden uno o más polipéptidos de
interés.
12. Ácido nucleico según la reivindicación 11,
que comprende, además, (iii) una secuencia de nucléotidos que
comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína
pVP2 de IBDV.
13. Una construcción génica que comprende un
ácido nucleico según la reivindicación 10 ú 11.
14. Una construcción génica que comprende un
ácido nucleico según la reivindicación 12.
15. Un sistema de expresión seleccionado
entre:
a) un sistema de expresión que comprende una
primera construcción génica según la reivindicación 13,
operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y,
opcionalmente, de traducción, y una segunda construcción génica,
operativamente unida a unos elementos de control de transcripción
y, opcionalmente, de traducción, comprendiendo dicha segunda
construcción génica una secuencia de nucléotidos que comprende la
fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV;
y
b) un sistema de expresión que comprende una
construcción génica según la reivindicación 14, operativamente
unida a unos elementos de control de transcripción y,
opcionalmente, de traducción.
16. Sistema de expresión según la reivindicación
15, caracterizado porque dicho sistema se selecciona entre
plásmidos, bácmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACS),
cromosomas artificiales de bacteria (BACs), cromosomas artificiales
basados en el bacteriófago P1 (PACs), cósmidos, o virus, que pueden
contener, opcionalmente, un origen de replicación heterólogo.
17. Una célula huésped que contiene un ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, o una
construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó
14, o un sistema de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16.
18. Una célula huésped transformada,
transfectada o infectada con un sistema de expresión según
cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16.
19. Célula huésped según la reivindicación 17 ó
18, caracterizada porque se selecciona entre una célula de
mamífero, una célula aviar, una célula de insecto y una
levadura.
20. Un procedimiento para la producción de
cápsidas vacías quiméricas del virus causante de la enfermedad de
la bursitis infecciosa (IBDV) según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que comprende cultivar una célula huésped
según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, y, si se desea,
recuperar dichas cápsidas vacías quiméricas de IBDV.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicha célula huésped es una célula de insecto, que comprende
las etapas de:
- a)
- preparar un sistema de expresión seleccionado entre (I) y (II), en donde:
- -
- el sistema de expresión (I) está constituido por un baculovirus recombinante que contiene una construcción génica según la reivindicación 14; y
- -
- el sistema de expresión (II) está constituido por un primer baculovirus recombinante que contiene una construcción génica que codifica para la proteína pVP2 de IBDV y por un segundo baculovirus recombinante que contiene una construcción génica según la reivindicación 13;
- b)
- infectar células de insecto con dicho sistema de expresión preparado en la etapa a);
- c)
- cultivar las células de insecto infectadas obtenidas en la etapa b) bajo condiciones que permiten la expresión de las proteínas recombinantes y su ensamblaje para formar cápsidas vacías quiméricas de IBDV; y
- d)
- si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, las cápsidas vacías quiméricas de IBDV.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicha célula huésped es una levadura, que comprende las
etapas de:
- a)
- preparar un sistema de expresión constituido por un plásmido que contiene una construcción génica según la reivindicación 14;
- b)
- transformar células de levadura con dicho sistema de expresión preparado en la etapa a);
- c)
- cultivar las levaduras transformadas obtenidas en la etapa b) bajo condiciones que permiten la expresión de las proteínas recombinantes y su ensamblaje para formar cápsidas vacías quiméricas de IBDV; y
- d)
- si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, las cápsidas vacías quiméricas de IBDV.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Empleo de un sistema de expresión génica
según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, para la
producción y obtención de cápsidas vacías quiméricas de IBDV según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
24. Empleo de cápsidas vacías quiméricas del
virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV)
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la elaboración
de un medicamento.
25. Empleo según la reivindicación 24, en el que
dicho medicamento es una vacuna. IBDV según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9.
24. Empleo de cápsidas vacías quiméricas del
virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV)
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la elaboración
de un medicamento.
25. Empleo según la reivindicación 24, en el que
dicho medicamento es una vacuna.
26. Empleo según la reivindicación 24, en el que
dicho medicamento es un vector para terapia génica.
27. Una vacuna que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva de cápsidas vacías quiméricas del virus
causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV) según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, junto con, opcionalmente,
uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente
aceptables.
28. Vacuna según la reivindicación 27, para
proteger animales y humanos simultáneamente frente a la infección
causada por dos o más agentes infecciosos causantes de
enfermedades.
29. Un vector para terapia génica que comprende
una cápsida vacía quimérica del virus causante de la enfermedad de
la bursitis infecciosa (IBDV) según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9.
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