PARTICULES PSEUDOVIRALES DE BIRNAVIRUS
L'invention est relative à des particules pseudovirales de birnavirus et à leurs utilisations.
La famille des Birnaviridae regroupe 3 genres : les aquabirnavirus, pathogènes des poissons, représentés par le virus de la nécrose infectieuse pancréatique (IPNV) , les avibirnavirus, pathogènes des oiseaux, représentés par le virus de .la bursite infectieuse (IBDV), et les entomobirnavirus représentés par le virus X de la drosophile (DXV) .
Le virus IBDV est l'agent causal de la bursite infectieuse, également dénommée maladie de Gumboro, maladie contagieuse qui cause des dommages importants dans les élevages de volaille. Le virus qui infecte les lymphocytes B dans la bourse de Fabricius, entraîne une immunosuppression qui favorise les atteintes infectieuses, notamment respiratoires et digestive.
Les birnavirus sont des virus à ARN double-brin, qui se présentent sous forme de particules icosaédriques non- enveloppées de 60 nm de diamètre environ. Le génome des birnavirus est constitué de 2 segments, A et B. Le segment B code pour une protéine de 100 Da, dénommée VPl, qui possède une activité ARN polymérase. Le segment A code pour une polyprotéine qui est clivée en trois protéines : pVP2 (également dénommée VPX) , VP3 et VP4. La protéine VP2 est issue du clivage protéolytique de pVP2.
Dans le cas du virus IBDV, pVP2 correspond aux acides aminés 1 à 512 de la polyprotéine alors que la VP2 mature correspond aux acides aminés 1 à 441. VP4 correspond aux acides aminés 513 à 755 et VP3 aux acides aminés 756 à
1012.
VP2 (38 kDa) et VP3 (33 kDa) sont les constituants majeurs de la capside virale. VP4 est la protéase virale responsable du clivage de la polyprotéine et ne semble pas associée aux particules virales.
VP2 porte les épitopes inducteurs d'anticorps neutralisants alors que VP3 est associée à l'ARN génomique.
Les vaccins actuellement disponibles pour prévenir la bursite infectieuse sont dans la plupart des cas, constitués de virus vivants atténués. Ils possèdent toutefois les inconvénients classiques de ce type de vaccins, notamment le risque de mutations qui peut donner naissance à des virus plus virulents ou ayant perdu leur immunogénicité.
Des essais d'immunisation des poulets ont été effectués avec la protéine VP2 produite par génie génétique. Ils n'ont toutefois pas permis d'obtenir une protection satisfaisante, quel que soit le système d'expression utilisé (E. coli, levure, baculovirus) .
Une alternative à l'utilisation de vaccins vivants atténués ou de vaccins à base de sous-unités virales consiste en l'utilisation de particules pseudovirales (également dénommées VLP pour « virus-like-particles », produites par autoassemblage des sous-unités constitutives de la capside virale. Ces particules imitent la structure et les propriétés antigéniques du virion natif, mais sont dépourvues d'acide nucléique et donc incapables de se répliquer. Il a ainsi été possible d'obtenir des particules pseudovirales pour certains virus, parmi lesquels on citera à titre d'exemple, les papillomavirus, le poliovirus, certains rétrovirus, le virus de l'hépatite B, les rotavirus, etc.
Des particules pseudovirales ont été utilisées non seulement en tant que vaccins, mais également comme vecteurs de molécules d'intérêt biologique, notamment de peptides ou d'acides nucléiques. On citera notamment des particules pseudovirales dérivées du virus HBV (KOLETZKI et al . , Journal of General Virology, 78, 2049-2053, 1997), de papillomavirus (TOUZE et COURSAGET, Nucleic Acids Research., 26, 1317-1323, 1998), ou de rotavirus (Demande PCT/FR01/00676 au nom de l' INRA) .
Cependant, dans le cas de certains virus, 1' autoassemblage des protéines de capside n'intervient pas, ou produit une structure différente de celle de la particule virale native. C'est notamment le cas du virus IBDV. MARTINEZ-TORRECUADRADA et al. Virology, 278, 322-331, (2000) ont ainsi observé que l'expression de la polyprotéine pVP2-
VP4-VP3 de l'IBDV dans un système baculovirus ne génère pas efficacement de particules pseudovirales, mais aboutit principalement à la formation de structures tubulaires constituées de précurseur pVP2. Les Inventeurs sont maintenant parvenus à obtenir des particules pseudovirales dérivées de birnavirus, et reproduisant la structure du virion natif.
Ils ont en effet constaté que, de façon surprenante, lorsque la polyprotéine du virus IBDV était fusionnée, à son extrémité C-terminale, à une séquence peptidique exogène, les protéines chimériques ainsi obtenues s'assemblaient entre elles pour reconstituer des particules pseudovirales possédant la morphologie et les propriétés antigéniques du virus IBDV natif. La présente invention a pour objet une protéine chimérique comprenant la polyprotéine d'un birnavirus, liée à son extrémité C-terminale à un polypeptide X.
La présente invention a également pour objet : les séquences d'acide nucléique codant des protéines chimériques conformes à l'invention ;
- les cassettes d'expression, dans lesquelles une séquence d'acide nucléique codant une protéine chimérique conforme à l'invention est associée à des éléments appropriés de contrôle de la transcription, et éventuellement de la traduction ;
- les vecteurs recombinants comprenant au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention ;
- les cellules-hôtes transformées par au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention, et capables d'exprimer ladite séquence. les particules pseudovirales de birnavirus résultant de l'assemblage d'une ou plusieurs protéine (s) chimérique (s) conforme (s) à l'invention ;
- l'utilisation desdites particules pseudovirales pour la préparation de médicaments, notamment de vaccins, ou en tant que vecteurs de molécules d'intérêt thérapeutique, notamment de peptides ou d'acides nucléiques, vers des cellules cibles.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit birnavirus est le virus IBDV.
La taille du polypeptide X peut varier de quelques acides aminés à quelques centaines d'acides aminés. Avantageusement, elle est comprise entre 5 et 2000 acides aminés, de préférence entre 10 et 500 acides aminés.
Le polypeptide X peut être lié avec la polyprotéine de birnavirus directement ou bien par l'intermédiaire d'un lieur peptidique. La nature du polypeptide X dépend de l'usage envisagé pour les particules pseudovirales résultant de l' autoassemblage de protéines de fusion conformes à 1 "invention.
Si ces particules pseudovirales sont uniquement destinées à l'obtention de vaccins contre les infections à birnavirus, la nature du polypeptide X est sans importance. Il peut s'agir d'un polypeptide de séquence quelconque.
Pour utiliser ces particules pseudovirales dans le cadre de vaccins divalents, destinés à protéger l'animal vacciné non seulement contre un burnavirus, mais également contre un autre pathogène, viral ou bactérien, le polypeptide X sera constituée par un antigène dudit pathogène. A titres d'exemples non-limitatifs : - pour obtenir un vaccin divalent permettant d'immuniser des poulets contre le virus IBDV et le virus de Marek, le polypeptide X pourra être constitué par l'une quelconque des protéines pp38, glycoprotéine B, eq, ICP4 ou ICP 27 du virus de Marek, ou par un fragment i munogène de l'une de ces protéines, par exemple le fragment codé par le segment d'ADN situé entre les sites Eco47III-BamHI (nucléotides 1515-1800) du gène de la glycoprotéine B. pour obtenir un vaccin divalent permettant d'immuniser des poulets contre le virus IBDV et le virus de la Bronchite Infectieuse, le polypeptide X pourra être constituée par l'une quelconque des protéines S ou N du virus de la Bronchite Infectieuse, ou par un fragment immunogène de l'une de ces protéines, par exemple le fragment Si de la protéine S ;
pour obtenir un vaccin divalent permettant d' immuniser des poulets contre le virus IBDV et le virus de
Newcastle, le polypeptide X pourra être constituée par l'une quelconque des protéines HN ou F du virus de Newcastle, ou par un fragment immunogène de l'une de celles-ci.
Si ces particules pseudovirales sont destinées à être utilisées comme vecteurs d'une protéine active sur des fonctions cellulaires, par exemple une cytokine ou toute autre protéine modulant la réponse immunitaire, le polypeptide X pourra être constitué par ladite protéine active.
Si ces particules pseudovirales sont destinées à être utilisées comme vecteurs d'acide nucléique, le polypeptide X pourra être constituée par un polypeptide comprenant un domaine peptidique de liaison à un acide nucléique, capable de reconnaître spécifiquement une séquence d'ADN ou d'ARN, permettant ainsi la fixation à une protéine chimérique conforme à l'invention d'une séquence d'acide nucléique comprenant ladite séquence, et son encapsidation dans une particule pseudovirale résultant de l'assemblage de protéines chimériques conformes à l'invention.
A titre d'exemples de polypeptides comprenant un domaine peptidique de liaison à un acide nucléique, et pouvant faire partie d'une protéine chimérique conforme à l'invention on citera notamment :
- des protéines d'origine virale ou des fragments de celles-ci comprenant des séquences d' encapsidation. A titre d'exemples non-limitatifs de protéines d' origine virale comprenant un domaine de liaison à l'ARN, on peut citer la protéine de capside du phage MS2, la protéine N du virus de la rage, la protéine NCp7 des lentivirus, la protéine NSP3 des rotavirus. A titre d'exemples non- limitatifs de protéines d'origine virale comprenant un domaine de liaison à l'ADN, on peut citer les protéines intervenant dans l' encapsidation d'un génome viral, telles que la protéine ICP 8 du virus
Herpès simplex, la protéine gpNul du phage lambda, ou la protéine de liaison à l'ADN des adénovirus. des facteurs de régulation en trans de la transcription, ou des fragments de ceux- ci comprenant un domaine de liaison à l'ADN. On citera par exemple le trans-activateur du promoteur du gène lad ou des doigts à zinc naturels ou artificiels [WU et al . , Proceedings National
Academy Science USA, 92, 344-8, (1995)]. La fixation d'une séquence d'acide nucléique à une protéine chimérique conforme à l'invention comprenant un domaine peptidique de liaison à un acide nucléique peut s'effectuer : dans le cas d'une séquence d'ARN, par co- expression dans une même cellule-hôte, d'une séquence d'ADN codant ladite protéine chimérique, et d'une séquence d'ADN pouvant être transcrite en un ARN comprenant une séquence cible reconnue par le domaine peptidique de liaison à un acide nucléique de ladite protéine chimérique ; ou dans le cas d'une séquence d'ADN, par transfection avec ladite séquence, des cellules où sont assemblées les particules pseudovirales, ou par assemblage in vitro des protéines des particules pseudovirales.
La présente invention englobe également des protéines chimériques, telles que définies ci-dessus, et dans lesquelles la séquence de la polyprotéine de birnavirus a été modifiée, au niveau de la séquence comprise, entre les acides aminés 1 à 512 de la protéine pVP2, pour introduire au moins un motif peptidique constituant un ligand pour un récepteur cellulaire.
Cette modification permet de moduler le ciblage des particules pseudovirales conformes à l'invention, en en modifiant la spécificité, et/ou en élargissant l'éventail des cellules-cibles .
Habituellement, les birnavirus IBDV et IPNV se lient à leurs cellules cibles, respectivement les lymphocytes
B de la bourse de Fabricius ou leurs précurseurs cellulaires, et les cellules pancréatiques ou les cellules des muscles striés par l'intermédiaire de la protéine VP2.
Pour cibler d'autres cellules, on peut introduire par exemple :
- Le motif Arg-Gly-Asp, qui est un ligand des intégrines présentes à la surface de nombreuses cellules.
Un domaine immunoglobuline d'une molécule d'adhésion ; de tels domaines sont des ligands de différentes protéines présentées à la surface de différents types de cellules. Le choix du domaine immunoglobuline dépendra du type de cellule que l'on souhaite cibler.
Les particules pseudovirales conformes à l'invention peuvent être constituées de protéines chimériques conformes à l'invention, identiques entre elles. Elles peuvent également être constituées de sous-unités différant entre elles par la nature de le polypeptide X et/ou par la présence, dans la polyprotéine, de motifs peptidiques ciblant des cellules différentes. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de particules pseudovirales conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'une cellule-hôte exprimant une séquence d'acide nucléique codant une protéine chimérique conforme à l'invention, et la récupération des particules pseudovirales à partir de la culture.
Des séquences d'acide nucléique, les cassettes d'expression, et les vecteurs recombinants permettant la production des protéines chimériques conformes à l'invention peuvent être obtenus par les techniques classiques du génie génétique, telles que celles décrites par SAMBROOK et al . , [MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]. Des éléments de contrôle de la transcription et de la traduction, ainsi que les vecteurs utilisables pour la construction de cassettes d'expression et de vecteurs recombinants conformes à l'invention seront choisis notamment en fonction de la cellule-hôte que l'on souhaite utiliser.
Des cellules-hôtes utilisables pour l'expression de protéines chimériques et la production de particules pseudovirales conformes à l'invention, sont en particulier des cellules eucaryotes, et notamment des cellules d'insectes, par exemple des cellules de Spodoptera frugiperda .
Des vecteurs utilisables dans ces cellules d'insectes sont notamment des vecteurs dérivés de baculovirus. Des méthodes de clonage et d'expression de protéines recombinantes dans un système baculovirus/cellules d'insectes, et des vecteurs utilisables pour la mise en œuvre de ces méthodes sont connus de l'homme de l'art, et sont décrits par exemple dans BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS : A LABORATORY MANUAL Freeman and Cie, New York, (1992) . D'autres méthodes et d'autres vecteurs également utilisables sont décrits par exemple dans la Demande EP 0 345 152, dans la Demande EP 0 651 815, dans la Demande EP 0 638 647, ou dans la Demande PCT WO 95/20672.
Des particules pseudovirales conformes à l'invention peuvent être utilisées pour la préparation de vaccins, notamment de vaccins permettant l'immunisation de poulets contre la bursite infectieuse. Elles peuvent également être utilisées pour administrer et véhiculer in vivo des molécules d'intérêt thérapeutique, notamment des protéines ou des acides nucléiques, en les mettant à l'abri, de la dégradation dans les fluides biologiques, et de les cibler sur les cellules souhaitées.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation et d'utilisation de particules pseudovirales conformes à l'invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION DE BACULOVIRUS RECOMBINANTS EXPRIMANT LA POLYPROTEINE DU BIRNAVIRUS IBDV
Trois baculovirus recombinants ont été construits : l'un exprime la polyprotéine pVP2-VP4-VP3 codée par le segment genomique A du virus IBDV, le second exprime la même polyprotéine fusionnée en COOH avec la protéine eGFP (Green Fluorescent protein) , et le troisième exprime la même polyprotéine fusionnée en COOH avec la protéine OVA (ovalbumine) . Construction des vecteurs de transfert Obtention du plasmide pFBΔlBDA
La totalité du segment A (3261 paires de bases) du virus IBDV (souche CT, numéro d'accès GENBANK EMBL AJ310185) a été clonée dans le plasmide pUC19 au site EcoRI pour donner le plasmide pUC19-IBDA.
L' insert EcoRI-EcoRI du plasmide pUC19-IBDA contenant le segment A a été sous-cloné dans le plasmide de transfert pFASTBAC™(GIBCO-BRL) , en plaçant la séquence codant pour la polyprotéine sous contrôle du promoteur polyhédrine de baculovirus porté par pFASTBAC™' pour obtenir le plasmide pFBIBDA.
Une délétion de 114 bases, entre les nucléotides 6 à 120 situés dans la séquence 5' non codante du segment A, a été réalisée par coupure par Pvul et auto-ligation de pFBIBDA. Le plasmide obtenu est dénommé pFBΔlBDA.
Obtention du plasmide pFBΔlBDA-GFP
Un site de restriction unique Nhel a été introduit par mutagénèse dirigée dans le plasmide pFBΔlBDA pour détruire le codon stop de la séquence codant la polyprotéine du virus IBDV. Le plasmide obtenu est dénommé pFBΔlBDANhel .
La séquence codant pour la protéine EGFP-C1 a été récupérée à partir du plasmide pEGFP-Cl (CLONTECH) par coupure Nhel-Kpnl, puis clonée au site Nhel-Kp'nl de pFBΔlBDANhel, en phase avec la séquence codant pour la
polyprotéine du virus IBDV. Le plasmide obtenu est dénommé pFBΔlBDA-GFP.
Obtention du plasmide pFBΔlBDA-OVA
Un polynucléotide comprenant une séquence codant pour un polypeptide (OVA) correspondant à l' ovalbumine de poulet délétée de ses acides aminés 18 à 143 a été clone aux sites Nhel-Kpnl de pFBΔlBDANhel, en phase avec la séquence codant pour la polyprotéine pVP2-VP4-VP3 du virus IBDV. Le plasmide obtenu est dénommé pFBΔlBDA-OVA. pFBΔlBDA, pFBΔlBDA-GFP ou pFBΔlBDA-OVA ont ensuite été introduits dans des cellules compétentes E. coli DHlOBac (GIBCO-BRL) . Deux jours plus tard, les colonies contenant des Bacmides™ recombinants ont été isolées, et les Bacmides™ recombinants de haut poids moléculaire ont été isolés, en suivant les instructions du manuel d'utilisation « BAC-TO-BAC™ Baculovirus expression Systems », et utilisés pour transfecter des cellules d'insectes de la lignée Sf9 de Spodoptera frugiperda pour produire des baculovirus recombinants . Trois baculovirus recombinants ont ainsi été obtenus :
BacΔlBDA, qui exprime la polyprotéine pVP2-VP4-VP3 de IBDV seule ;
BacΔlBDA-GFP qui exprime la polyprotéine pVP2-VP4-VP3 de IBDV fusionnée en COOH avec la protéine eGFP ;
- BacΔlBDA-OVA qui exprime la polyprotéine pVP2- VP4-VP3 de IBDV- fusionnée en COOH avec la protéine OVA.
Ces baculovirus recombinants sont amplifiés par passages successifs en cellules Sf9 pour générer des stocks viraux d'environ 108 UFP (unités formant plaque) /ml. EXEMPLE 2 : PRODUCTION ET PURIFICATION DE PARTICULES PSEUDOVIRALES DE BIRNAVIRUS
Des cellules Sf9 sont infectées, à une multiplicité d'infection de 3 à 10 UFP par cellule, par le baculovirus recombinant BacΔlBDA, par le baculovirus recombinant BacΔlBDA-GFP ou par le baculovirus recombinant
BacΔlBDA-OVA. Après 1 h d'incubation à 27 °C pour permettre l'adsorption des virus, l'inoculum est retiré et remplacé par du milieu contenant 1% de sérum de veau fœtal.
Expression de la GFP dans les cellules infectées par BacΔlBDA-GFP
Deux jours post-infection les cellules infectées par BacΔlBDA-GFP sont analysées par FACSCAN et par fluorescence directe, selon les protocoles suivants :
2 x 106 cellules Sf9 infectées sont reprises dans 500 microlitres de tampon phosphate (PBS) pour centrifugation à 500 x g pendant 10 min. Les cellules sont reprises en paraformaldéhyde 2,5% (300 microlitres) et incubées 20 min. à température ambiante. Après deux rinçages en PBS, les cellules sont resuspendues dans 500 microlitres de PBS et analysées par FACS sur FACScan (BECTON DICKINSON) .
Résultats :
On observe que l'ensemble des cellules fluorescent, ce qui permet de vérifier l'expression de la GFP dans les cellules Sf9 infectées par BacΔlBDA-GFP. Analyse des lysats cellulaires par immunoprécipitation :
Deux jours post-infection, les cellules ensemencées à 3 x 106 par puits sont reprises dans 1 ml de tampon de lyse (Tris 50 mM, pH 8, 150 mM NaCl, 2% Triton X- 100 complémenté par un cocktail anti-protéases) et le lysat clarifié par centrifugation à 13000 x g pendant 15 min. Le surnageant est repris pour analyse en immunoprécipitation.
Les immunoprécipitations sont effectuées selon les protocoles suivants :
500 microlitres de lysat sont mis à agiter doucement en présence de 2 microlitres de liquide d'ascites d'anticorps anti-VP2/pVP2 ou anti-VP3 ou anti-VP4 et billes de protéine A Sepharose (PHARMACIA) pendant 2 heures à température ambiante. Les billes sont ensuite lavées 3 fois par ajout d' 1 ml de tampon de lyse et centrifugation pour ôter le surnageant des billes. Les billes sont ensuite reprises dans 35 microlitres de tampon de charge dénaturant et réducteur pour solubiliser les antigènes et les anticorps
complexés aux billes par ébullition pendant 3 min. Après une courte centrifugation, le surnageant des billes est repris et déposé sur gel SDS-PAGE.
Résultats : Pour BacΔlBDA l'analyse par immunoprécipitation avec des anticorps monoclonaux révèle que l'expression de la polyprotéine génère les produits de clivage pVP2, VP3 et VP4. Il n'est pas observé de clivage de maturation de pVP2 en VP2.
Pour BacΔlBDA-GFP, l'analyse révèle les produits de clivage pVP2, VP3-GFP et VP4. On observe également le clivage de maturation de pVP2 en VP2. Environ 80% de la pVP2 est convertie en VP2.
Pour BacΔlBDA-OVA, l'analyse révèle les produits de clivage pVP2, VP3-0VA et VP4. On observe également le clivage de maturation de pVP2 en VP2. Environ 80% de la pVP2 est convertie en VP2. Purification des particules pseudovirales :
Le lysat cellulaire est traité selon le protocole suivant : Quatre jours post-infection, 6 boîtes F150 ensemencées chacune avec 35 x 106 cellules Sf9 infectées à une multiplicité d'infection de 10 sont congelées à -20 °C avec leurs surnageants de culture. Après décongélation, l'ensemble est clarifié à 5000 rpm pendant 10 min. à 4°C. Le surnageant est repris pour ultracentrifugation à 40000 rpm en 45Ti (BECKMAN) pendant 1 heure. Le culot est repris en Tris 10 mM, pH 8, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA avec un cocktail d'antiprotéases. Des extractions successives au Fréon à l'aide d'un broyeur POLYTRON sont réalisées jusqu'à ce que le surnageant soit limpide. Du chlorure de césium est ajouté au surnageant pour obtenir un indice de réfraction η = 1,362, soit une densité de 1,30. Les gradients de chlorure de césium sont établis par centrifugation isopycnique à 35000 rpm en SW55 (BECKMAN) à 4°C. La concentration en protéines dans les bandes isolées à partir du gradient est mesurée par la méthode de BRADFORD, avec comme référence la sérum albumine bovine.
L'analyse du contenu protéique de chaque bande est effectuée par SDS-10% PAGE en présence de 5% β- mercaptoéthanol suivie de coloration au Bleu de Coomassie, et par transfert immunoélectrophorétique sur membrane IMMOBILON à 50V pendant 1 heure. Après rinçage et saturation de la membrane, des dilutions d'anticorps monoclonaux anti- pVP2/VP2, anti-VP3, anti-VP4 et anti-GFP sont utilisés pour révéler spécifiquement les antigènes. La révélation de la fixation des anticorps est réalisée avec le système ECL (AMERSHAM) .
Résultats :
Cellules infectées par BacΔlBDA
Dans le cas des cellules infectées par le baculovirus recombinant BacΔlBDA, on observe une bande majeure, correspondant à une densité de 1,3. Son observation en microscopie électronique révèle la présence d'un grand nombre de tubules d'environ 60 nm de diamètre ainsi que quelques particules pseudovirales et quelques tubules d'environ 25 nm de diamètre. L'analyse par SDS-PAGE révèle une bande de 48 kDa très majoritaire. L'analyse par transfert immunoélectrophorétique montre que la bande de 48 kDa correspond à la protéine pVP2.
Il apparaît donc que l'expression de la polyprotéine sauvage d' IBDV en système baculovirus n'aboutit pas à la production efficace de particules pseudovirales, mais résulte en l'assemblage de pVP2 en tubules. Cellules infectées par BacΔlBDA-GFP Dans le cas des cellules infectées par BacΔlBDA-GFP, une bande majeure a été identifiée, à une densité de 1,3. Son observation en microscopie électronique montre qu' elle contient une très grande proportion de particules, d'environ 60 nm de diamètre, de structure icosaédrique et de morphologie identique à celle des virions IBDV de type sauvage. L'observation par microscopie optique montre que ces particules sont fluorescentes.
L'analyse par SDS-PAGE et coloration par Bleu de Coomassie révèle des bandes de 60 kDa, 48 kDa et 38 kDa.
L'analyse par transfert immunoélectrophorétique montre que ces bandes correspondent respectivement aux protéines
VP3-GFP, pVP2 et VP2 mature.
Cellules infectées par BacΔlBDA-OVA Dans le cas des cellules infectées par BacΔlBDA-
OVA, une bande majeure a été identifiée à une densité de 1,3.
Son observation en microscopie électronique montre qu'elle contient une très grande proportion de particules, d'environ
60 nm de diamètre, de structure icosaédrique et de morphologie identique à celle des virions IBDV de type sauvage.
L'analyse par SDS-PAGE et coloration par Bleu de
Coomassie révèle des bandes de 58 kDa, 48 kDa et 38 kDa.
L'analyse par transfert immunoélectrophorétique montre que ces bandes correspondent respectivement aux protéines VP3-
OVA, pVP2 et VP2.
Ces résultats montrent que l'addition d'une séquence polypeptidique exogène à l'extrémité COOH de la polyprotéine permet l'assemblage des protéines pVP2 et VP3 en particules pseudovirales, et la maturation finale de pVP2 en
VP2.