CN106983859A

CN106983859A - 免疫诱导剂的制造方法

Info

Publication number: CN106983859A
Application number: CN201611041668.6A
Authority: CN
Inventors: 半田宏; 川野雅章; 加藤昌彦
Original assignee: Sysmex Corp; Saitama Medical University
Current assignee: Sysmex Corp; Saitama Medical University
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2016-11-22
Publication date: 2017-07-28
Also published as: EP3173476A1; JP6675185B2; US10994007B2; US20170151326A1; JP2017100977A

Abstract

本发明提供诱导生物体对抗原的免疫作用的免疫诱导剂的制造方法。在此方法中，所述免疫诱导剂含病毒样粒子。病毒样粒子通过混合病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质来调制。在病毒样粒子中，所述外壳蛋白质构成所述病毒样粒子的外壳，所述抗原结合蛋白质内包于所述外壳内。

Description

免疫诱导剂的制造方法

【技术领域】

本发明涉及免疫诱导剂的制造方法。更具体而言，本发明涉及在其外壳中内包抗原的含病毒样粒子的免疫诱导剂的制造方法。

【背景技术】

已知使用病毒样粒子(Virus Like Particle)诱导细胞障碍性T细胞(CTL)可治疗病毒性疾病或癌。

例如，美国专利申请公开第2014-0286978号中记载，通过免疫向SV40的VP1的环区域导入CTL表位、使其表达而得到的病毒样粒子而可诱导CTL表位特异性的CTL。

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

但是，在美国专利申请公开第2014-0286978号中，由于必须要求表位整合入VP1的特定区域，只能使用表位公知的抗原。

【解决课题的技术方案】

本发明人经锐意探讨而发现，使用在其外壳中内包抗原的病毒样粒子也可诱导生物体的免疫反应，从而完成本发明。

即，本发明提供含病毒样粒子的免疫诱导剂，所述病毒样粒子含病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质，所述外壳蛋白质构成所述病毒样粒子的外壳，所述抗原结合蛋白质内包于所述外壳内，诱导生物体对所述抗原的免疫作用。

另外，本发明提供诱导生物体对抗原的免疫作用的含病毒样粒子的免疫诱导剂的制造方法，其包括通过混合病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质，调制病毒样粒子的工序，所述外壳蛋白质构成所述病毒样粒子的外壳，所述抗原结合蛋白质内包于所述外壳内。

【发明效果】

本发明提供无论表位公知还是未知，可诱导对特定的抗原的生物体的免疫反应的免疫诱导剂。

【附图说明】

【图1】是病毒样粒子的一例的模式图。

【图2A】是显示在自被重组杆状病毒感染的昆虫细胞纯化而得到的VLP中存在VP2-M1及wt VP1的SDS-PAGE的照片。

【图2B】是显示形成VP2-M1/wt SV40VP1VLP的电子显微镜照片。

【图2C】是显示对从小鼠的脾脏得到的淋巴细胞进行的ICS解析的结果的图，其中所述小鼠被施用自昆虫细胞纯化的VP2-M1/wt SV40VP1VLP。

【图3】是pM01载体的载体图谱。

【图4A】是显示对从小鼠的脾脏得到的淋巴细胞进行的ICS解析的结果的图，其中所述小鼠被腹腔内施用含VP2-M1/wt SV40VP1VLP的蚕蛹磨碎液(磷酸缓冲液酯)。

【图4B】是显示对从小鼠的脾脏得到的淋巴细胞进行的ICS解析的结果的图，其中所述小鼠被腹腔内施用含VP2-M1/wt SV40VP1VLP的蚕蛹磨碎液(Tris缓冲液基)。

【图4C】是显示对从小鼠的脾脏得到的淋巴细胞进行的ICS解析的结果的图，其中所述小鼠被腹腔内施用含VP2-M1/wt SV40VP1VLP的加热处理蚕蛹磨碎液(磷酸缓冲液酯)。

【图4D】是显示对从小鼠的脾脏得到的淋巴细胞进行的ICS解析的结果的图，其中所述小鼠被腹腔内施用含VP2-M1/wt SV40VP1VLP的加热处理蚕蛹磨碎液(Tris缓冲液基)。

【图5】是显示对从小鼠的脾脏得到的淋巴细胞进行的ICS解析的结果的图，其中所述小鼠被经鼻施用含VP2-M1/wt SV40VP1VLP的蚕蛹磨碎液(磷酸缓冲液酯)。

【图6A】是显示对从小鼠的脾脏得到的淋巴细胞进行的ICS解析的结果的图，其中所述小鼠被经口施用含VP2-M1/wt SV40VP1VLP的蚕蛹磨碎液(磷酸缓冲液酯)。

【图6B】是显示对从小鼠的脾脏得到的淋巴细胞进行的ICS解析的结果的图，其中所述小鼠被经口施用含VP2-M1/wt SV40VP1VLP的蚕蛹磨碎液(Tris缓冲液基)。

【图6C】是显示对从小鼠的脾脏得到的淋巴细胞进行的ICS解析的结果的图，其中所述小鼠被经口施用含VP2-M1/wt SV40VP1VLP的加热处理蚕蛹磨碎液(Tris缓冲液基)。

【图7】是显示对从小鼠的脾脏得到的淋巴细胞进行的ICS解析的结果的图，其中所述小鼠被注肠施用含VP2-M1/wt SV40VP1VLP的蚕蛹磨碎液(磷酸缓冲液酯)。

【图8A】是显示腹腔内施用VP2-OVA/wt SV40VP1VLP的小鼠的血清中的抗OVA抗体产生测定的结果的图。

【图8B】是显示经鼻施用VP2-OVA/wt SV40VP1VLP的小鼠的血清中的抗OVA抗体产生测定的结果的图。

【实施方式】

本实施方式的免疫诱导剂包含含有病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质的病毒样粒子。

病毒样粒子，如在现有技术领域公知一样，是指通常无病毒基因组的结构体。后述的外壳蛋白质及壳内肽可使用病毒来源的蛋白质。

本实施方式的免疫诱导剂中所含的病毒样粒子的一例的模式图示于图1。此模式图所表示的病毒样粒子有由外壳蛋白质VP1构成的外壳。外壳中内包有融合了抗原的VP2。VP1、VP2均来源于SV40。

成为外壳蛋白质及壳内肽的来源的病毒的种类只要有至少1种外壳蛋白质和至少1种壳内肽，就不特别限定。作为病毒的种类，可举出例如多瘤病毒属病毒(含SV40(猿猴病毒40)、JC病毒、BK病毒等)、属于乳头瘤病毒科的病毒(含α、β、γ及μ乳头瘤病毒属病毒等)、属于有尾噬菌体目管状病毒科的病毒(含HK97病毒等)、属于呼肠病毒科的病毒(含稻萎缩病毒(RDV)、蓝舌病毒等)及属于蕃茄丛矮病毒科的病毒(含番茄丛矮病毒(TBSV)等)等。病毒优选为多瘤病毒属的病毒，更优选为SV40、JC病毒、BK病毒等，特别优选为SV40。外壳蛋白质和壳内肽优选来源于相同的病毒。

多瘤病毒属(Genus：Polyomavirus)是指由国际病毒分类委员会(InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses：ICTV)于2014年公示的病毒分类中的一属。

病毒分类中频繁发生分类的再编或命名等的改变。从而，即使将来由ICTV或以其为准的学术的权威机关的分类而分类再编或命名等改变，只要是与2014年的ICTV分类中的属于多瘤病毒属的各病毒分类于相同的属(Genus)的病毒，就包含在本说明书中所说的多瘤病毒属病毒中。

另外，本领域中由于频频发现新种的病毒，在将来由ICTV或以其为准的学术权威机关公示的病毒分类中，属于现在的多瘤病毒属或与其相当的分类组的新种的病毒也包含在本说明书中所说的多瘤病毒属病毒中。

多瘤病毒属以外以上所举的病毒的目(Order)、科(Family)、属名等也基于2014年公示的ICTV分类。对于这些的定义也应与对多瘤病毒属所述的相同。

外壳蛋白质是指，构成病毒样粒子的外壳，并且构成的外壳可内包抗原结合蛋白质的蛋白质。其中，“外壳蛋白质构成病毒样粒子的外壳”是指外壳基本上由外壳蛋白质构成。即，外壳可仅由外壳蛋白质构成，或者也可在维持外壳的结构的范围内由外壳蛋白质及能与该外壳蛋白质结合的肽或蛋白质构成。例如，野生型SV40病毒的外壳由集合72个VP1五聚体单位而构成，在构成的外壳的内侧VP2及VP3作为衬里结合，但SV40的VP1，即使无VP2或VP3，也可仅由其构成外壳。即，在本实施方式中，外壳蛋白质，如SV40VP1一样，是指可基本上仅由它们构成外壳的蛋白质。外壳蛋白质可为至少含病毒来源的全长氨基酸序列中对于外壳形成最低限必须的氨基酸序列的肽或蛋白质，但优选为有全长氨基酸序列的蛋白质。作为这样的外壳蛋白质，可举出例如属于多瘤病毒属、乳头瘤病毒科、有尾噬菌体目管状病毒科、呼肠病毒科及蕃茄丛矮病毒科的病毒的外壳蛋白质、更具体而言作为多瘤病毒属病毒的SV40(猿猴病毒40)或JC病毒等的VP1、属于乳头瘤病毒科的病毒的L1、稻萎缩病毒(RDV)的P8等。作为至少含对于外壳形成最低限必须的氨基酸序列的肽或蛋白质，可举出例如番茄丛矮病毒(TBSV)来源的形成β-环结构的24聚体的肽等。外壳蛋白质更优选为多瘤病毒属病毒的外壳蛋白质、再优选为SV40、JC病毒、BK病毒等的外壳蛋白质，特别优选为SV40VP1。外壳蛋白质可为1种以上。

再者，如SV40的VP2或VP3一样，虽然其是在野生型病毒中构成其外壳的成员，但仅由它们无法构成外壳的蛋白质，在本实施方式中，可包含在以下说明的“壳内肽”中。但是，这不是指含如SV40的VP2或VP3一样的“壳内肽”的其他物质从外壳的构成要素被排除，这样的其他物质是构成外壳的非必须的成员，或者可以任何形式与外壳的形成相关。

“内包”是指抗原结合蛋白质中的至少抗原存在于由外壳蛋白质形成的外壳的内侧的状态。

外壳蛋白质没必要与野生型病毒有完全相同的氨基酸序列，只要对于外壳形成无障碍，并且形成的外壳可内包抗原结合蛋白质，也可有氨基酸序列变异。其中，氨基酸序列的变异是指，与野生型的序列比，氨基酸残基之一或多个被取代、缺失、或者附加。外壳蛋白质可由其自身集合化能而形成外壳，也可由宿主内在的因子的作用而形成外壳。外壳蛋白质可以单体原本的形式形成外壳，也可形成由多聚体构成的外壳形成单位(壳粒)，其再集合而形成外壳。外壳蛋白质优选为2～10聚体、更优选为3～5聚体的壳粒集合50～500个左右而形成外壳。外壳蛋白质可为提取－纯化天然的蛋白质而得的，也可为由基因工程学方法等人工合成的。

外壳的形状不特别限定。可为球状，也可为管状。外壳是，例如，正八面体～正二十面体的略球状。

当外壳由外壳蛋白质的单体构成时，构成1个外壳的单体的数虽不特别限定，但可举出优选为100～1000个、更优选为150～500个。

当外壳由壳粒构成时，构成1个外壳的壳粒的数优选为50～390个、更优选为72～260个。

外壳的直径虽不特别限定，但可举出优选为30～300nm、更优选为45～200nm。

抗原结合蛋白质是抗原与壳内肽的融合蛋白质。抗原结合蛋白质含期望的抗原的氨基酸序列和病毒来源的壳内肽的氨基酸序列。壳内肽只要构成本实施方式的病毒样粒子，就不特别限定。壳内肽，在病毒来源的全长氨基酸序列之中，至少含对于构成本实施方式的病毒样粒子必要的氨基酸序列。壳内肽优选有全长氨基酸序列。作为壳内肽，可举出例如SV40(猿猴病毒40)或JC病毒等的VP2及VP3、属于乳头瘤病毒科的病毒的L2、RDV的P3等。所述的病毒来源的全长氨基酸序列之中，作为至少含对于构成本实施方式的病毒样粒子必要的氨基酸序列的肽，可举出例如由SEQ ID NO：8的氨基酸序列构成的肽(具体而言由SV40的VP2及VP3上共同的VP1结合结构域构成的肽)等。更优选为，壳内肽是有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的蛋白质，再优选为由SEQ ID NO：9或11的氨基酸序列构成的蛋白质(具体而言，各自SV40的VP3及VP2；核酸序列各自示于SEQ ID NO：10及12)。壳内肽可为1种以上。

壳内肽可有与野生型病毒完全相同的氨基酸序列，只要构成本实施方式的病毒样粒子，氨基酸序列上也可有变异。壳内肽可结合在外壳蛋白质的内侧形成外壳的衬里，也可不与外壳蛋白质结合而被外壳中内包化，例如如RDV的P3一样在外壳的内侧形成内壳。再者，在使用这样的形成内壳的壳内肽的实施方式中，只要存在于外壳内，就使用“壳内”的用语。另外，当壳内肽以外的物质形成内壳时，无论壳内肽存在于内壳内及内壳外之任一侧，只要壳内肽存在于外壳内，就说成存在于“壳内”。壳内肽的一部分也可自外壳露出。在壳内肽上也可附加例如用于确认抗原结合蛋白质的表达的标签、例如FLAG标签等。

在优选的实施方式中，病毒是多瘤病毒属SV40。在此实施方式中，外壳蛋白质是VP1，抗原结合蛋白质是VP2及/或VP3与抗原的融合蛋白质。VP1被称为主外壳蛋白质、VP2及VP3被称为次外壳蛋白质。当使用SV40的VP1以及VP2及/或VP3时，VP2及VP3结合在外壳蛋白质VP1的内侧形成外壳的衬里。一般而言，由于病毒的外壳常被称为外壳，如SV40的VP2及VP3等一样与外壳形成相关的蛋白质在广义上也可被解释为外壳蛋白质。但是，在本实施方式中，将如SV40的VP1一样其自体构成外壳本身的蛋白质称为“外壳蛋白质”。即，一般而言，即使是外壳蛋白质或可被称为外壳蛋白质的蛋白质，有时也如SV40的VP2及VP3一样，在本说明书中被包含在“壳内肽”中。在本实施方式中，通过使VP2及/或VP3结合抗原，可在使外壳中内包抗原。

抗原的种类不特别限定，可例示多肽、糖链、核酸、脂质等。但是，在本说明书中，外壳蛋白质及壳内肽不包括在“抗原”中。在这些中，优选多肽。作为抗原使用多肽时，可以基因工程学方式容易地生产含抗原和壳内肽的融合蛋白质。另外，作为抗原，优选使用病原体来源的多肽。病原体来源的多肽可为全长多肽，也可为含仅一部分的序列的多肽。例如，可举出流感病毒的HA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2、PB1-F2等，HIV的Gag、Pol、Env、Tat、Nef、Rev等，C型肝炎病毒(HCV)的E1、E2、Core、NS2、NS3、NS4、NS5等，属于乳头瘤病毒科的病毒的E6、E7等，作为对于癌细胞特异性的蛋白质的Melan-A/MART-1、gp100、MAGEA3、MAGE-A10、CEA、HER2/new、NY-E50-1、WT-1、hTERT等。在这些之中，优选流感病毒的M1、NP、NS1、PA、PB1、PB2、作为对癌细胞特异性的蛋白质的HER2/new、WT-1、MAGE-A3等。

抗原与壳内肽结合至内包在病毒样粒子的外壳内。以往、已知将抗原表位整合到在外壳蛋白质形成外壳之时露出到所述外壳的外侧的所述外壳蛋白质中的部分的病毒样粒子(具体而言，将表位整合到SV40VP1的DE环或HI环的病毒样粒子)(美国专利申请公开第2014-0286978号)。此时，如果整合的抗原表位的氨基酸长过长，则由于外壳结构可破坏或有将表位整合到外壳蛋白质的特定区域的必要等，所以现实中表位短(5～15个氨基酸左右)、并且只能使用其序列公知的抗原。一方面，在本实施方式中，由于在外壳中内包抗原，与以往的将表位整合到外壳结构中的方法比较，内包有更长的氨基酸长的抗原变得可能，还可使用全长的抗原。而且，能无需对抗原加佐剂地进行免疫诱导。这是本发明人意外发现的观点。

抗原的尺寸只要可被外壳中内包，就不特别限定。抗原的尺寸优选为200～600氨基酸长。

融合抗原和壳内肽的方法不特别限定，可使用本领域技术人员公知的方法、例如基因重组技术等。抗原和壳内肽可经本领域技术人员公知的1种以上的接头、例如GGGGS接头融合。

本实施方式的免疫诱导剂诱导针对被病毒样粒子的外壳中内包的抗原的生物体的免疫作用。其中，“诱导免疫作用”是指通过诱导抗体或细胞伤害性T细胞，活化生物体的免疫。例如，可举出疾病(癌等)的发症前或病原体(病毒等)的感染前对生物体施用而增强产生抗体的作用及/或诱导记忆CTL的作用，通过预防将来的疾病(作为预防疫苗使用)、向有疾病(癌、感染症等)的生物体施用，诱导生物体的细胞伤害性T细胞(CTL)，治疗疾病(为了免疫疗法使用)等。

免疫诱导剂可作为病毒性疾病的预防或治疗用疫苗或各种癌的预防或治疗用疫苗使用。具体而言，免疫诱导剂可作为疾病、例如感染症(流感、免疫缺陷综合征、C型肝炎等)、癌(子宫颈癌、咽头乳头瘤等)、疣赘(寻常性疣赘、包含体疣赘、扁平疣赘等)、HPV关联表皮样囊肿、疣赘状表皮发育异常症、尖圭湿疣、鲍恩样丘疹症等的预防或治疗用疫苗使用。

在免疫诱导剂中，病毒样粒子可与本领域技术人员公知的药品添加物一同制剂化。作为这样的药品添加物，虽不限定，但可举出赋形剂、润滑剂、结合剂、崩解剂、包被剂、胶囊基剂、塑化剂、着色剂、溶剂、稳定剂、保存剂、缓冲剂、无痛化剂、基剂、乳化剂及悬浮化剂、此外矫味剂、甜味剂、吸附剂、溶解辅助剂、pH调节剂、增粘剂、张度剂、分散剂、防腐剂、湿润剂、着香剂、抗氧化剂等。

作为赋形剂，虽不限定，但可举出例如甘露糖醇、白糖、葡萄糖、玉米淀粉、结晶纤维素、磷酸氢钙等。

作为润滑剂，虽不限定，但可举出例如硬脂酸镁、滑石、胶体氧化硅等。

作为结合剂，虽不限定，但可举出例如阿拉伯胶、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素(MC)、聚维酮(PVP)、聚乙烯基醇(PVA)等。

作为崩解剂，虽不限定，但可举出例如交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、羧甲基淀粉钠等。

作为包被剂，虽不限定，但可举出白糖、滑石等的糖衣用包被剂、羧甲基乙基纤维素等的肠溶性包被剂、聚乙烯基乙缩醛二乙基氨基乙酸酯等的胃溶性包被剂等。

作为胶囊基剂，虽不限定，但可举出明胶等。

作为塑化剂，虽不限定，但可举出三醋汀、中链脂肪酸三甘油酯等。

作为着色剂，虽不限定，但可举出食用焦油染料、色淀染料、三氧化二铁等。

作为溶剂，虽不限定，但可举出注射用水、灭菌纯化水等的水性溶剂、植物油(含橄榄油、大豆油、芝麻油等)等的非水性溶剂等。

作为稳定剂，虽不限定，但可举出氮、二氧化碳等的惰性气体、EDTA等的鳌合剂、L-抗坏血酸等的还原物质等。

作为保存剂，虽不限定，但可举出对羟基安息香酸酯、氯丁醇等。

作为缓冲剂，虽不限定，但可举出柠檬酸、醋酸、磷酸等的钠盐等。

作为无痛化剂，虽不限定，但可举出苄基醇、普鲁卡因盐酸盐、葡萄糖等。

作为基剂，虽不限定，但可举出可可脂、明胶等的栓剂用基剂及流动石蜡、巴西棕榈蜡等的软膏用基剂等。

作为乳化剂，虽不限定，但可举出阿拉伯胶、聚山梨酯、月桂基硫酸钠等。

作为悬浮化剂，虽不限定，但可举出阿拉伯胶、藻酸钠、黄蓍胶、单硬脂酸铝等。

免疫诱导剂由于其自身就有充分的免疫诱导效果，可不含佐剂，但也可含佐剂。当免疫诱导剂含佐剂时，作为使用的佐剂，可举出氢氧化铝凝胶、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、百日咳菌佐剂、聚(I,C)、CpG-DNA等。

免疫诱导剂可为固体制剂、半固体制剂、液状制剂、注射剂、栓剂、此外本领域技术人员公知的制剂形态的任何。作为具体的剂形，虽不限定，但可举出例如片剂、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、锭剂、注射剂、液剂、酏剂、糖浆剂、柠檬水剂、栓剂、软膏剂、悬浮剂、乳剂、搽剂、洗剂、经皮吸收型制剂、贴附剂、泥敷剂、气溶胶剂等。

液状制剂通过，例如，自表达病毒样粒子的宿主细胞提取病毒样粒子，根据需要用适宜的溶剂稀释而调制。

悬浮剂通过，例如，将表达病毒样粒子的宿主细胞均化而得到的匀浆物纯化，根据需要提取、纯化、由溶剂稀释等而调制。具体而言，当以蚕等的鳞翅目昆虫个体作为宿主时，可将表达病毒样粒子的个体摩碎，粗纯化而调制。

免疫诱导剂的施用途径虽不特别限定，但可举出例如经口施用、经粘膜施用(例如经鼻施用、鼻内施用、口腔施用及注肠施用等)、非经口施用(例如腹腔内注射、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、向组织的间隙的空间注射等)、经皮施用等。即，本实施方式的免疫诱导剂不仅可由负担大的注射等施用，还可由经口摄取、点鼻药施用、灌肠等负担少的施用。例如，可通过将免疫诱导剂混入动物的饵而作为动物用疫苗使用。

本领域技术人员可根据抗原的种类、施用对象的动物种、施用对象的症状、年龄、体重、施用形态等适宜确定免疫诱导剂的施用量及施用次数，通常为0.01μg～100mg、优选为0.1μg～50mg、更优选为1.0μg～10mg，优选将其数天～数月1次施用。

免疫诱导剂可以生物体、更具体而言人或人以外的动物(人以外哺乳类、鸟类、爬行类等)作为施用对象。作为人以外的动物，可举出例如，牛、马、猪、鸡、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、猴等。

本实施方式的免疫诱导剂从免疫诱导的观点是含有药理学有效的量的病毒样粒子的医药组合物。病毒样粒子可在施用时发生医学上可容许的副作用，但优选对于施用对象的动物无病原性，不发生副作用。

本实施方式的免疫诱导剂可通过根据本领域技术人员公知的方法调制病毒样粒子，根据需要与医药上容许的赋形剂等混合而制剂化来制造。

病毒样粒子的调制，例如，可通过混合病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质来进行。混合条件可由本领域技术人员适宜设定。通过混合外壳蛋白质和抗原结合蛋白质，抗原结合蛋白质被由外壳蛋白质形成的外壳中内包化。

在调制病毒样粒子之前，可通过将编码外壳蛋白质的DNA和编码抗原结合蛋白质的DNA转入宿主细胞，在所述宿主细胞表达所述外壳蛋白质和所述抗原结合蛋白质，由此取得所述外壳蛋白质和所述抗原结合蛋白质。这些蛋白质的取得可由本领域技术人员公知的方法、例如基因重组等进行。

宿主细胞只要对病毒样粒子的形成无障碍，就不特别限定。宿主细胞选自例如昆虫细胞(含如蚕一样的昆虫个体)、大肠杆菌、酵母、植物。宿主细胞优选为昆虫细胞、更优选为鳞翅目昆虫个体、再优选为蚕。

当在宿主细胞中表达外壳蛋白质及抗原结合蛋白质时，病毒样粒子也可通过在宿主细胞内表达的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质接触而调制。或者，也可在对宿主细胞的均化、纯化、提取等的制造过程中形成病毒样粒子。

在宿主细胞内形成的病毒样粒子可根据需要回收。回收方法虽不特别限定，但可由本领域技术人员主要根据宿主细胞的种类而适宜选择。例如，当宿主细胞是昆虫细胞或大肠杆菌细胞等时可由超声波处理等的细胞溶解等、当宿主细胞是鳞翅目昆虫的蛹时可由磨碎等溶出病毒样粒子，使用离心分离后回收上清的方法。

在优选的实施方式中，首先向昆虫细胞或昆虫个体感染整合了编码外壳蛋白质的DNA及编码抗原结合蛋白质的DNA的杆状病毒。接下来，将昆虫细胞或昆虫个体超声波处理或磨碎，其后离心分离或过滤而回收上清，由此可取得病毒样粒子。或者，也可代替整合了编码外壳蛋白质的DNA及编码抗原结合蛋白质的DNA的杆状病毒而向宿主细胞感染整合了编码外壳蛋白质的DNA的第1杆状病毒及整合了编码抗原结合蛋白质的DNA的第2杆状病毒。

病毒样粒子可根据需要纯化。作为纯化方法，不特别限定，可举出例如密度梯度离心分离、层析法等的本领域技术人员公知的方法等。

病毒样粒子可根据需要加热处理。作为加热方法，不特别限定，可举出例如将作为宿主细胞的蚕蛹在沸腾水中温育的方法等。

制剂化可通过由本领域技术人员公知的方法，例如将病毒样粒子和适宜的药品添加物混合，成型为期望的剂形，根据需要包被来进行。

具体而言，将剂形作为固体制剂、例如片剂时，可通过例如将病毒样粒子和适宜的赋形剂、结合剂及/或崩解剂混合，添加适宜的润滑剂而进一步混合，将混合物打锭，根据需要包被等而制剂化。

当将剂形作为注射剂或液状制剂时，可通过例如将病毒样粒子分散于适宜的溶剂，根据需要过滤或灭菌处理，填充到指定的容器等而制剂化。

将剂形作为软膏剂时，例如，可通过将适宜的软膏用基剂在附带加温装置的混合机中溶融，停止加温，低速混合至固化为软膏状，在马上要固化前加病毒样粒子，填充到指定的容器等而制剂化。

将剂形作为栓剂时，可通过例如将病毒样粒子与预先低温融解的适宜的栓剂用基剂混合，注到模板而冷却而固化等来制剂化。

别的实施方式涉及用于诱导生物体的免疫作用的病毒样粒子。更具体而言，涉及含病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质的，用于诱导生物体对所述抗原的免疫作用的病毒样粒子，所述外壳蛋白质构成所述病毒样粒子的外壳，所述抗原结合蛋白质内包于所述外壳内。

病毒样粒子、病毒、外壳蛋白质、外壳、抗原结合蛋白质、抗原等如上所述。

本实施方式的病毒样粒子可通过施用于生物体诱导生物体对被其外壳中内包的抗原的免疫作用而作为病毒性疾病的预防或治疗用疫苗或各种癌的预防或治疗用疫苗使用。从而，所述的病毒样粒子可作为疾病、例如感染症(流感、HIV、C型肝炎等)、癌(子宫颈癌、咽头乳头瘤等)、疣赘(寻常性疣赘、包含体疣赘、扁平疣赘等)、HPV关联表皮样囊肿、疣赘状表皮发育异常症、尖圭湿疣、鲍恩样丘疹症等的预防或治疗用疫苗使用。

从而，别的实施方式也可称为涉及用于治疗疾病的病毒样粒子。更具体而言，本实施方式涉及含病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质的，用于治疗疾病的病毒样粒子，所述外壳蛋白质构成所述病毒样粒子的外壳，所述抗原结合蛋白质内包于所述外壳内。

病毒样粒子、病毒、外壳蛋白质、外壳、抗原结合蛋白质、抗原、疾病等如上所述。

另外，别的实施方式涉及诱导生物体的免疫作用的方法，其包括向生物体施用含病毒样粒子的免疫诱导剂。更具体而言，本实施方式涉及诱导生物体的免疫作用的方法，其包括向生物体施用含病毒样粒子的免疫诱导剂，所述病毒样粒子含病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质，所述外壳蛋白质构成所述病毒样粒子的外壳，所述抗原结合蛋白质内包于所述外壳内，诱导生物体对所述抗原的免疫作用。

病毒样粒子、病毒、外壳蛋白质、外壳、抗原结合蛋白质、抗原、免疫诱导剂及其施用方法、生物体等如上所述。

另外，别的实施方式可涉及预防或治疗疾病的方法，其包括向生物体施用含病毒样粒子的免疫诱导剂。更具体而言，本实施方式涉及预防或治疗疾病的方法，其包括向生物体施用含病毒样粒子的免疫诱导剂，所述病毒样粒子含病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质，所述外壳蛋白质构成所述病毒样粒子的外壳，所述抗原结合蛋白质内包于所述外壳内，诱导生物体对所述抗原的免疫作用。

病毒样粒子、病毒、外壳蛋白质、外壳、抗原结合蛋白质、抗原、免疫诱导剂及其施用方法、生物体、疾病等如上所述。

另外，别的实施方式涉及免疫诱导剂用于诱导生物体对抗原的免疫作用的用途。

另外，别的实施方式涉及病毒样粒子用于制造免疫诱导剂的用途。

以下，由实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

【实施例】

【实施例1：内包VP2-M1的SV40VP1VLP的调制及经其免疫导致的FMP:58-66表位特异性的细胞伤害性T细胞的诱导】

【表达野生型(wt：wild type)猿猴病毒40(SV40)VP1的杆状病毒的制作】

将wt SV40VP1基因(SEQ ID NO：1；氨基酸序列示于SEQ ID NO：2)插入pFastBac1质粒(invitrogen)的Sal I位点及Kpn I位点。用得到的质粒转化保持杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10bac(invitrogen)，调制整合了VP1的重组杆状病毒基因组。用重组杆状病毒基因组转染Sf-9细胞。在三天后回收其上清，作为含重组杆状病毒的溶液。通过用此溶液的一部分再次感染Sf-9细胞(invitrogen)，使重组杆状病毒滴度升高。将其作为重组杆状病毒的浓储溶液。

【表达VP2融合M1蛋白质的杆状病毒的制作】

向编码wt SV40VP2的氨基末端(N末端：amino terminus)的密码子的上游附加FLAG标签的编码序列(SEQ ID NO：13)，再向其上游导入BamHI位点。另外，除wt SV40VP2的终止密码子之外导入EcoRI位点。将得到的多核苷酸经pFastBac1质粒的BamHI位点、及EcoRI位点插入，制作含wt SV40VP2基因的质粒。向编码M1蛋白质的N末端的密码子的上游导入GGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO：3；核酸序列示于SEQ ID NO：14)的编码序列，再向其上游导入EcoRI位点。另外，向M1蛋白质编码序列的下游附加终止密码子，再向其下游导入Sal I位点。将得到的多核苷酸经含所述的wt SV40VP2基因的质粒的EcoRI位点、及Sal I位点导入，制作了在VP2编码序列的下游保持融合M1编码序列的基因的质粒。

用此质粒转化保持杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10bac(invitrogen)，调制表达在wt SV40VP2上融合M1的蛋白质VP2-M1(SEQ ID NO：4；核酸序列示于SEQ ID NO：5)的重组杆状病毒基因组。将这些重组杆状病毒基因组转染到Sf-9细胞。三天后回收其上清，作为含重组杆状病毒的溶液。

通过使在上述得到的溶液的一部分再感染Sf-9细胞，使重组杆状病毒滴度升高。将其作为重组杆状病毒的浓储溶液。

【含VP2-M1的wtSV40VP1VLP的调制】

使整合了wt SV40VP1的重组杆状病毒(M.O.I.(感染复数)＝0.05～0.2)和整合了VP2-M1的杆状病毒(M.O.I.＝0.015～0.06)，共感染接种了3×10⁷个Sf-9细胞的15cm培养皿中(wt SV40VP1:VP2-M1＝1:0.3的感染比率(基于M.O.I.))。将其制成共计10个。感染3天后，回收接种到这10个皿的共计3×10⁸个Sf-9细胞。用PBS(-)清洗后，使细胞再悬浮于10ml的VP1超声波处理用缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.9),1％(w/vol)脱氧胆酸)。其后，为了抑制内在性的蛋白酶活性，加2mM苯甲基磺酰氟(最终浓度2μM)、及糜蛋白酶抑制素(最终浓度1μg/ml)、抑肽酶(最终浓度1μg/ml)、亮抑酶肽(最终浓度1μg/ml)、抗蛋白酶素(最终浓度1μg/ml)、胃酶抑素(最终浓度1μg/ml)，超声波破碎。其后，以15,000rpm、于4℃离心分离5分钟而分成上清和沉淀，将上清作为裂解物溶液。

向每个Ultra-Clear离心分离用管(14x 89mm,Beckman coulter)以密度从高到低的顺序覆盖1.5ml的氯化铯密度梯度离心分离用的20％CsCl溶液(20mM Tris-HCl(pH7.9),20％(w/vol)氯化铯),30％CsCl溶液(20mM Tris-HCl(pH7.9),30％(w/vol)氯化铯),40％CsCl溶液(20mM Tris-HCl(pH7.9),40％(w/vol)氯化铯),50％CsCl溶液(20mM Tris-HCl(pH7.9),50％(w/vol)氯化铯)。进而，再覆盖包含含有VP2-M1的wt SV40VP1的裂解物溶液5ml。其后，以35,000rpm,3小时,于4℃超离心分离(SW41Ti rotor,Beckman)。

超离心分离后，将呈现在中央的白色条带用23G,1ml的TERUMO注射器(0.60x32mm、TERUMO)回收。将此级分与37％CsCl溶液(20mM Tris-HCl(pH7.9),37％(w/vol)氯化铯)混合，移到Ultra-Clear离心分离用管(11x 60mm,Beckman coulter)。其后，以50,000rpm、于4℃超离心分离20小时(SW60Ti rotor,Beckman)。超离心分离后，将呈现在中央的白色条带用23G,1ml的TERUMO注射器(0.60x 32mm、TERUMO)回收。将此级分用PBS(-)的溶剂透析(Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units,3,500MWCO,ThermoSCIENTIFIC)，将该级分以15,000rpm,于4℃离心分离5分钟。将上清回收纯化而作为含VP2-M1的wt SV40VP1VLP级分。将此级分用SDS-PAGE展开后，进行CBB染色。结果得知，确实VP2-M1来源的条带和wtSV40VP1VLP来源的条带这2条被纯化(图2A)。另外，用电子显微镜观察含在此级分中的内包VP2-M1的wt SV40VP1VLP(VP2-M1/wt SV40VP1VLP)样品。结果，可确认由wt SV40VP1形成的VLP(图2B)。提示在此VLP内部内包有VP2-M1。

【VP2-M1/wt SV40VP1VLP的免疫】

以下的实验以C57BL/6作为背景，使用表达在HLA-A*0201和H-2Db的嵌合体上再融合人的β2m的基因的转基因小鼠(以下，HHD小鼠)。此小鼠由于敲除了小鼠的β2m及H-2Db，从而认为小鼠来源的I型MHC不露出到细胞表面。

对8周龄的转基因小鼠以腹腔内的途径免疫所述的100μl的VP2-M1/wtSV40VP1VLP(500μg/ml)。在免疫中，使用插入27号的针的1ml的注射器(微注射器、注射针附带注射器、胰岛素用、TERUMO,SS-10M2713)。或者，对实施全身麻醉的8周龄的转基因小鼠以点鼻施用的经鼻途径投入40μl的VP2-M1/wt SV40VP1VLP(500μg/ml)。

投入后1周后，回收免疫的小鼠的脾脏。用下述的方法调制淋巴细胞，进行下述的细胞内染色(ICS)解析。

【来自小鼠的脾脏的淋巴细胞的调制】

从免疫的小鼠摘出脾脏，置于放入5ml的RPMI-1640培养基的皿。使用镊子将脾脏在培养基内良好解离，将含溶出到培养基中的淋巴细胞的溶液移到15ml管中。再一次、将皿用5ml的RPMI-1640培养基清洗。将上清加到所述的15ml管中，总量设为10ml。立即将沉积在15ml管的底的组织片段留下，将上清再移到新的15ml管中。其后，于室温、以1,200rpm离心分离5分钟，得到含淋巴细胞的沉淀。除去上清，将沉淀疏解。其后，为了除去红细胞，边加250μl的NH₄Cl-三溶液边混合。其后，快速加10ml的RPMI-1640培养基，于室温、以1,2000rpm离心分离5分钟，得到含淋巴细胞的沉淀。除去上清，将沉淀疏解。其后，再加10ml的RPMI-1640培养基。尽可能不吸变性的红细胞而用移液器将含淋巴细胞的培养基移到新的15ml管中。其后，再于室温、以1,200rpm离心分离5分钟。除去上清之后，将沉淀疏解。再一次用10ml的RPMI-1640培养基悬浮，于室温、以1,200rpm离心分离5分钟。除去上清，最后用2ml的混入10％FCS的RPMI-1640培养基悬浮。为了数淋巴细胞而向490μl的2％醋酸溶液加10μl的所述悬浮溶液。用Burker-Turk血细胞计数板算出细胞数。用混入10％FCS的RPMI-1640培养基稀释至成1×10⁷细胞/ml。

【细胞内染色(ICS)解析】

对小鼠免疫后，为了研究在自脾脏回收的淋巴细胞中存在与M1的CTL表位序列(GILGFVFTL)反应而诱导的CTL，进行ICS解析。向96孔圆底板每1孔加5μl用混入10％FCS的RPMI-1640培养基25倍稀释的BD GolgiPlug(商标)(BD)。向其中再加100μl用混入10％FCS的RPMI-1640培养基稀释的20μM的M1的CTL表位的肽(GILGFVFTL,Operon)。作为阴性对照，加100μl不含肽的混入10％FCS的RPMI-1640培养基。向此孔加100μl上述调制的淋巴细胞。其后，于37℃、5％CO₂温育5小时。

温育后，于4℃、以1,400rpm旋转沉降而除去上清，用涡旋混合器疏解细胞。其后，每1孔加200μl的FACS缓冲液(2％FCS,0.1％叠氮化钠,1×PBS(-))。再于4℃、以1,400rpm旋转沉降而除去上清，将细胞疏解。其后，加100μl用FACS缓冲液稀释成5μg/ml的小鼠BD FcBlock(商标)(BD Pharmingen)，于4℃温育10分钟。

温育后，于4℃、以1,400rpm旋转沉降而除去上清，将细胞疏解。其后，每1孔加200μl的FACS缓冲液，再于4℃、1,400rpm旋转沉降而除去上清。再一次由FACS缓冲液进行清洗操作。向疏解的细胞每1孔加50μl用FACS缓冲液稀释成10μg/ml的FITC大鼠抗-小鼠CD8aClone：53-6.7(BD Pharmingen)，于4℃在暗处温育30分钟。

温育后，用200μl的FACS缓冲液进行2次清洗操作。其后，向疏解的细胞每1孔加100μl的BD Cytofix/Cytoperm(商标)(BD Biosciences)，于4℃在暗处温育20分钟。温育后，代替FACS缓冲液而使用200μl的1×BD Perm/Wash(商标)(BD biosciences)，进行2次与上述同样的清洗操作。其后，向疏解的细胞加50μl用1×BD Perm/Wash(商标)稀释成10μg/ml的PE抗-小鼠IFN-γClone：XMG1.2(BioLegend)，于4℃在暗处温育30分钟。

温育后，使用200μl的1×BD Perm/Wash(商标)进行2次与上述同样的清洗操作。其后，向疏解的细胞每1孔加100μl的FACS固定缓冲液(1％甲醛,1×FACS缓冲液)，于4℃在暗处温育一晚。

温育后，向5ml的聚苯乙烯管(BD Falcon,5ml聚苯乙烯圆底管12x 75mm style)加400μl的FACS缓冲液。向其中加用100μl的FACS固定缓冲液固定的样品。其后，用FACScan(BD)进行斑点印迹解析。在解析中使用Cell Quest(BD)的软件。ICS的2维解析的结果示于图2C。

ICS解析的结果，腹腔内(i.p.)途径的免疫和经鼻途径的免疫均FMP:58-66肽添加依赖性地出现CD8+IFN-γ+T细胞。因此得知，确实由VP2-M1/wt SV40VP1VLP免疫而诱导M1蛋白质中所含的FMP:58-66表位特异性的细胞伤害性T细胞(CTL：细胞毒性T淋巴细胞)(图2C)。

这些结果显示，将自昆虫细胞纯化的VP2-M1/wt SV40VP1VLP经腹腔内途径或经鼻施用给HHD小鼠，则可诱导M1CTL表位特异性CTL。

【实施例2：通过VP2-M1、及SV40野生型VP1共表达的蚕蛹磨碎液的免疫(腹腔内、经鼻、经口、注肠施用)诱导FMP:58-66表位特异性的细胞伤害性T细胞的】

【共表达VP2-M1和wt SV40VP1的蚕蛹磨碎液的调制】

将wt SV40VP1基因片段整合入pM01载体(Sysmex株式会社；在图3示载体图谱)的多克隆位点(限制性内切酶SmaI)。将得到的质粒构建体称为wtSV40VP1_pM01。

再将VP2-M1基因整合入pM01载体(Sysmex株式会社)的多克隆位点(限制性内切酶SmaI)。将得到的质粒构建体称为VP2-M1_pM01。

重组杆状病毒的制作通过改变Maeda等的方法(InverterbrateCell system andApplications,Vol.1,p.167-181,CRC Press,Boca Raton(1989))而进行。具体而言，将所述的质粒构建体wtSV40VP1_pM01、或者VP2-M1_pM01(各50ng)和直链化的CPd杆状病毒(半胱氨酸蛋白酶缺损病毒株、Sysmex)的DNA(20ng)使用脂转染试剂(X-tremeGENE9DNATransfection Reagent：Roche公司)共转染到BmN细胞(Maeda,1989)。确认感染迹象之后，回收培养上清。由此得到整合wtSV40VP1基因或者VP2-M1的重组杆状病毒。

向蚕蛹(品种：锦秋钟和,自上田蚕种公司购入蚕卵，由Sysmex株式会社人工饲育至蛹)接种重组杆状病毒。自病毒接种起6天后回收蛹而于-80℃冷冻。

向5只冷冻的蛹、或者5只自冷冻状态起在沸腾水中温育10分钟的蛹的每只加25mL的Tris缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0),150mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,10％(w/v)甘油,1mM DTT,蛋白酶抑制剂混合物(Roche公司Complete-EDTA-free))、或者磷酸缓冲液(137mM NaCl,2.7mM KCl,8.1mM Na₂HPO₄,1.47mM KH₂PO₄(pH7.4))。使用均浆器(ELMEX,型式SH-IIM,桨式破碎)将蛹破碎而得到悬浮液。通过将此悬浮液用网过滤而除去蛹表皮等的残渣，将此滤液作为蚕蛹磨碎液。

【(腹腔内施用)VP2-M1/wt SV40VP1VLP的免疫】

向8周龄的HHD小鼠通过腹腔内途径免疫100μl从使表达VP2-M1/wt SV40VP1VLP的蚕调制的磨碎液(用磷酸缓冲液调制的蚕蛹磨碎液(图4A)、用Tris缓冲液调制的蚕蛹磨碎液(图4B)、用磷酸缓冲液调制的加热处理蚕蛹磨碎液(图4C)、及用Tris缓冲液调制的加热处理蚕蛹磨碎液(图4D))。在免疫中使用插27号针的1ml的注射器(微注射器、注射针附带注射器、胰岛素用、TERUMO,SS-10M2713)。

投入后1周后，回收免疫的小鼠的脾脏。用实施例1中记载的方法调制淋巴细胞而进行细胞内染色(ICS)解析。

ICS解析的结果，在i.p.免疫中，FMP:58-66肽添加依赖性地确认CD8+IFN-γ+T细胞的出现(图4A～4D)。从这些结果得知，通过从使表达VP2-M1/wt SV40VP1VLP的蚕蛹调制的磨碎液的i.p.免疫而诱导M1蛋白质中所含的FMP:58-66表位特异性的细胞伤害性T细胞(CTL：细胞毒性T淋巴细胞)。此CTL的诱导与有无蛹的加热处理无关地，还与调制中使用的缓冲液的种类(Tris缓冲液或磷酸缓冲液)无关地被检测到。

【(经鼻施用)VP2-M1/wt SV40VP1VLP的免疫】

向实施全身麻醉的8周龄的HHD小鼠以点鼻施用的经鼻途径投入从使表达VP2-M1/wt SV40VP1VLP的蚕调制的磨碎液20μl。自投入起1周后，回收免疫的小鼠的脾脏。用实施例1中记载的方法调制淋巴细胞而进行细胞内染色(ICS，Intra-cellular staining)解析。

ICS解析的结果，在经鼻免疫中，以FMP:58-66肽添加依赖性地出现CD8+IFN-γ+T细胞(图5)。因此得知，确实由VP2-M1/wt SV40VP1VLP的经鼻免疫诱导了M1蛋白质中所含的FMP:58-66表位特异性的细胞伤害性T细胞(CTL：细胞毒性T淋巴细胞)。

【(经口施用)VP2-M1/wt SV40VP1VLP的免疫】

向实施全身麻醉的8周龄的HHD小鼠以经口途径投入使表达VP2-M1/wtSV40VP1VLP的蚕磨碎液(用磷酸缓冲液调制的非加热蚕蛹磨碎液100μl(图6A)、用Tris缓冲液调制的非加热蚕蛹磨碎液100μl(图6B)、及用Tris缓冲液调制的加热处理蚕蛹磨碎液100μl(图6C))。在投入中使用插了经口探测器(经口探测器针小鼠用(A),夏目制造,KN-348)的1ml的注射器(TERUMO)。自投入起1周后，回收免疫的小鼠的脾脏。用实施例1中记载的方法调制淋巴细胞而进行细胞内染色(ICS)解析。

所述ICS解析的结果，在经口免疫中，以FMP:58-66肽添加依赖性地出现CD8+IFN-γ+T细胞(图6A～6C)。因此得知，确实由含进行非加热或加热处理的VP2-M1/wtSV40VP1VLP的蚕磨碎液的经口免疫而诱导了M1蛋白质中所含的FMP:58-66表位特异性的细胞伤害性T细胞(CTL：细胞毒性T淋巴细胞)。

【(注肠施用)VP2-M1/wt SV40VP1VLP的免疫】

向实施全身麻醉的8周龄的HHD小鼠以注肠途径投入100μl、或者200μl的使表达VP2-M1/wt SV40VP1VLP的蚕磨碎液。在投入中使用插了经口探测器(DISPOSABLE经口探测器、小鼠用减菌济、5200S,FUCHIGAMI)的1ml的注射器(TERUMO)。

自投入起1周后，回收免疫的小鼠的脾脏。用实施例1中记载的方法调制淋巴细胞而进行细胞内染色(ICS)解析。

ICS解析的结果，在注肠免疫中，以FMP:58-66肽添加依赖性地出现CD8+IFN-γ+T细胞(图7)。因此得知，确实由VP2-M1/wt SV40VP1VLP免疫而诱导了M1蛋白质中所含的FMP:58-66表位特异性的细胞伤害性T细胞(CTL：细胞毒性T淋巴细胞)。

【实施例3：由内包VP2-卵清蛋白(Ovalbmin,OVA)的wt SV40VP1VLP的免疫诱导抗OVA抗体产生】

【表达野生型(wt：野生型)猿猴病毒40(SV40)VP1的杆状病毒的制作】

如实施例1中记载制作表达wt SV40VP1的杆状病毒。

【表达VP2融合OVA蛋白质的杆状病毒的制作】

首先，在编码wt SV40VP2的氨基末端(N末端：amino terminus)的密码子的上游附加FLAG标签的编码序列(SEQ ID NO：13)而再在其上游导入BamHI位点。另外，除去wtSV40VP2的终止密码子而导入EcoRI位点。将得到的多核苷酸经pFastBac1质粒的BamHI位点、及EcoRI位点插入，制作含wt SV40VP2基因的质粒。向编码OVA蛋白质的N末端的密码子的上游导入GGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO：3；核酸序列示于SEQ ID NO：14)的编码序列，再在其上游导入EcoRI位点。另外，在OVA蛋白质编码序列的下游附加终止密码子，在再其下游导入Sal I位点。将得到的多核苷酸经含所述的wt SV40VP2基因的质粒的EcoRI位点、及Sal I位点导入，制作保持了在VP2编码序列的下游融合OVA编码序列的基因的质粒。

用此质粒转化保持了杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10bac(invitrogen)，调制表达在wt SV40VP2上融合OVA的蛋白质VP2-OVA(SEQ ID NO：6；核酸序列示于SEQ ID NO：7)的重组杆状病毒基因组。向Sf-9细胞转染重组杆状病毒基因组。三天后回收其上清，作为含重组杆状病毒的溶液。通过用此溶液的一部分再感染Sf-9细胞，升高重组杆状病毒滴度。将其作为重组杆状病毒的浓储溶液。

【含VP2-OVA的wtSV40VP1VLP的调制】

用与实施例1的“含VP2-M1的wtSV40VP1VLP的调制”相同的方法调制含VP2-OVA的wtSV40VP1VLP。

【VP2-OVA/wt SV40VP1VLP的免疫(腹腔内施用、及经鼻施用)】

向8周龄的HHD小鼠以腹腔内的途径免疫所述的100μl VP2-OVA/wt SV40VP1VLP(500μg/ml)。在免疫中使用插了27号的针的1ml的注射器(微注射器、注射针附带注射器、胰岛素用、TERUMO,SS-10M2713)。另外，作为VP2-OVA/wt SV40VP1VLP免疫的对象组，向小鼠的皮下接种100μL OVA溶液(1mg/mL)。

或者，向实施全身麻醉的8周龄的HHD小鼠以点鼻施用的经鼻途径投入40μl VP2-OVA/wt SV40VP1VLP(500μg/ml)。

自免疫起1周后进行追加免疫。自初次免疫起2周后对小鼠进行全身麻醉之后，从小鼠心脏回收血液。在得到的血液中诱导血饼形成，回收上清的小鼠血清。

【由免疫诱导的抗体的检测(ELISA法)】

为了与OVA反应而确认在血清中存在诱导的抗OVA抗体，使用如上所述回收的小鼠血清，如以下一样进行抗体检测。将OVA溶解于TBS(20mM Tris-HCl(pH 8.0),150mM NaCl)至成1μg/100μL。将其向96孔板(Nunc MaxiSorp flat-bottom 96well plate)的各孔各添加100μL。于室温静置2小时、或者于4℃静置一晚，使OVA与板底面结合。OVA固定化后，用TBS-T(20mM Tris-HCl(pH 8.0),150mM NaCl、0.005％(w/v)Tween 20)清洗板。其后，向各孔各添加300μL的5％(w/v)脱脂乳溶液，于室温静置2小时、或者于4℃静置一晚。除去脱脂乳溶液之后，用TBS-T清洗各孔。向各50μL各孔添加将如上述得到的小鼠血清用TBS-T稀释至期望的浓度的溶液而于室温静置1小时。去除小鼠血清溶液，用TBS-T清洗各孔。其后，向各孔添加各100μL用TBS-T稀释2,000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L链)(MBL公司)而于室温静置1小时。静置后，将各孔用TBS-T清洗。根据试剂盒所附说明书向各孔添加TMB过氧化酶EIA复合物底物试剂盒(Bio-Rad公司)，测定各孔中存在的HRP标记抗小鼠IgG(H+L链)。再者，测定是使用iMark microplate Absorbance Reader(Bio Rad公司)测定655nm的吸光值。

结果示于图8A及图8B。如图8A所示，在腹腔内施用VP2-OVA/SV40wtVP1VLP的小鼠中诱导了抗OVA抗体的产生，显示比单独施用OVA的小鼠更高的抗体价。也在经鼻施用VP2-OVA/SV40wtVP1VLP的小鼠中见到抗OVA抗体产生的诱导(图8B)。这些结果显示，可由VP2-OVA/SV40wtVP1VLP的腹腔内施用或经鼻施用而诱导对于OVA特异性的抗体的产生。

序列表

<110> SYSMEX CORPORATION

Saitama Medical University

Hiroshi HANDA

<120> 免疫诱导剂的制造方法

<130> 15-045CN

<150> JP2015-234206

<151> 2015-11-30

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1095

<212> DNA

<213> 多瘤病毒属（Polyomavirus）SV40

<400> 1

atgaagatgg ccccaacaaa aagaaaagga agttgtccag gggcagctcc caaaaaacca 60

aaggaaccag tgcaagtgcc aaagctcgtc ataaaaggag gaatagaagt tctaggagtt 120

aaaactggag tagacagctt cactgaggtg gagtgctttt taaatcctca aatgggcaat 180

cctgatgaac atcaaaaagg cttaagtaaa agcttagcag ctgaaaaaca gtttacagat 240

gactctccag acaaagaaca actgccttgc tacagtgtgg ctagaattcc tttgcctaat 300

ttaaatgagg acttaacctg tggaaatatt ttgatgtggg aagctgttac tgttaaaact 360

gaggttattg gggtaactgc tatgttaaac ttgcattcag ggacacaaaa aactcatgaa 420

aatggtgctg gaaaacccat tcaagggtca aattttcatt tttttgctgt tggtggggaa 480

cctttggagc tgcagggtgt gttagcaaac tacaggacca aatatcctgc tcaaactgta 540

accccaaaaa atgctacagt tgacagtcag cagatgaaca ctgaccacaa ggctgttttg 600

gataaggata atgcttatcc agtggagtgc tgggttcctg atccaagtaa aaatgaaaac 660

actagatatt ttggaaccta cacaggtggg gaaaatgtgc ctcctgtttt gcacattact 720

aacacagcaa ccacagtgct tcttgatgag cagggtgttg ggcccttgtg caaagctgac 780

agcttgtatg tttctgctgt tgacatttgt gggctgttta ccaacacttc tggaacacag 840

cagtggaagg gacttcccag atattttaaa attaccctta gaaagcggtc tgtgaaaaac 900

ccctacccaa tttccttttt gttaagtgac ctaattaaca ggaggacaca gagggtggat 960

gggcagccta tgattggaat gtcctctcaa gtagaggagg ttagggttta tgaggacaca 1020

gaggagcttc ctggggatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 1080

actagaatgc agtga 1095

<210> 2

<211> 364

<212> PRT

<213> 多瘤病毒属（Polyomavirus）SV40

<400> 2

Met Lys Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Ser Cys Pro Gly Ala Ala

1 5 10 15

Pro Lys Lys Pro Lys Glu Pro Val Gln Val Pro Lys Leu Val Ile Lys

20 25 30

Gly Gly Ile Glu Val Leu Gly Val Lys Thr Gly Val Asp Ser Phe Thr

35 40 45

Glu Val Glu Cys Phe Leu Asn Pro Gln Met Gly Asn Pro Asp Glu His

50 55 60

Gln Lys Gly Leu Ser Lys Ser Leu Ala Ala Glu Lys Gln Phe Thr Asp

65 70 75 80

Asp Ser Pro Asp Lys Glu Gln Leu Pro Cys Tyr Ser Val Ala Arg Ile

85 90 95

Pro Leu Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr Cys Gly Asn Ile Leu Met

100 105 110

Trp Glu Ala Val Thr Val Lys Thr Glu Val Ile Gly Val Thr Ala Met

115 120 125

Leu Asn Leu His Ser Gly Thr Gln Lys Thr His Glu Asn Gly Ala Gly

130 135 140

Lys Pro Ile Gln Gly Ser Asn Phe His Phe Phe Ala Val Gly Gly Glu

145 150 155 160

Pro Leu Glu Leu Gln Gly Val Leu Ala Asn Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro

165 170 175

Ala Gln Thr Val Thr Pro Lys Asn Ala Thr Val Asp Ser Gln Gln Met

180 185 190

Asn Thr Asp His Lys Ala Val Leu Asp Lys Asp Asn Ala Tyr Pro Val

195 200 205

Glu Cys Trp Val Pro Asp Pro Ser Lys Asn Glu Asn Thr Arg Tyr Phe

210 215 220

Gly Thr Tyr Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro Pro Val Leu His Ile Thr

225 230 235 240

Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Gln Gly Val Gly Pro Leu

245 250 255

Cys Lys Ala Asp Ser Leu Tyr Val Ser Ala Val Asp Ile Cys Gly Leu

260 265 270

Phe Thr Asn Thr Ser Gly Thr Gln Gln Trp Lys Gly Leu Pro Arg Tyr

275 280 285

Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Ser Val Lys Asn Pro Tyr Pro Ile

290 295 300

Ser Phe Leu Leu Ser Asp Leu Ile Asn Arg Arg Thr Gln Arg Val Asp

305 310 315 320

Gly Gln Pro Met Ile Gly Met Ser Ser Gln Val Glu Glu Val Arg Val

325 330 335

Tyr Glu Asp Thr Glu Glu Leu Pro Gly Asp Pro Asp Met Ile Arg Tyr

340 345 350

Ile Asp Glu Phe Gly Gln Thr Thr Thr Arg Met Gln

355 360

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GS接头

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 638

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 经GS接头与M1融合的VP2蛋白

<400> 4

Met Gly Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Ser Gly Thr

1 5 10 15

Arg Met Gly Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly Asp Leu Ile Ala Thr Val

20 25 30

Ser Glu Ala Ala Ala Ala Thr Gly Phe Ser Val Ala Glu Ile Ala Ala

35 40 45

Gly Glu Ala Ala Ala Ala Ile Glu Val Gln Leu Ala Ser Val Ala Thr

50 55 60

Val Glu Gly Leu Thr Thr Ser Glu Ala Ile Ala Ala Ile Gly Leu Thr

65 70 75 80

Pro Gln Ala Tyr Ala Val Ile Ser Gly Ala Pro Ala Ala Ile Ala Gly

85 90 95

Phe Ala Ala Leu Leu Gln Thr Val Thr Gly Val Ser Ala Val Ala Gln

100 105 110

Val Gly Tyr Arg Phe Phe Ser Asp Trp Asp His Lys Val Ser Thr Val

115 120 125

Gly Leu Tyr Gln Gln Pro Gly Met Ala Val Asp Leu Tyr Arg Pro Asp

130 135 140

Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Phe Pro Gly Val Gln Thr Phe Val His Ser

145 150 155 160

Val Gln Tyr Leu Asp Pro Arg His Trp Gly Pro Thr Leu Phe Asn Ala

165 170 175

Ile Ser Gln Ala Phe Trp Arg Val Ile Gln Asn Asp Ile Pro Arg Leu

180 185 190

Thr Ser Gln Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln Arg Tyr Leu Arg Asp Ser

195 200 205

Leu Ala Arg Phe Leu Glu Glu Thr Thr Trp Thr Val Ile Asn Ala Pro

210 215 220

Val Asn Trp Tyr Asn Ser Leu Gln Asp Tyr Tyr Ser Thr Leu Ser Pro

225 230 235 240

Ile Arg Pro Thr Met Val Arg Gln Val Ala Asn Arg Glu Gly Leu Gln

245 250 255

Ile Ser Phe Gly His Thr Tyr Asp Asn Ile Asp Glu Ala Asp Ser Ile

260 265 270

Gln Gln Val Thr Glu Arg Trp Glu Ala Gln Ser Gln Ser Pro Asn Val

275 280 285

Gln Ser Gly Glu Phe Ile Glu Lys Phe Glu Ala Pro Gly Gly Ala Asn

290 295 300

Gln Arg Thr Ala Pro Gln Trp Met Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Tyr

305 310 315 320

Gly Ser Val Thr Ser Ala Leu Lys Ala Tyr Glu Asp Gly Pro Asn Lys

325 330 335

Lys Lys Arg Lys Leu Ser Arg Gly Ser Ser Gln Lys Thr Lys Gly Thr

340 345 350

Ser Ala Ser Ala Lys Ala Arg His Lys Arg Arg Asn Arg Ser Ser Arg

355 360 365

Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile

385 390 395 400

Ile Pro Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp

405 410 415

Val Phe Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu

420 425 430

Lys Thr Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe

435 440 445

Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg

450 455 460

Phe Val Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp

465 470 475 480

Lys Ala Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His

485 490 495

Gly Ala Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser

500 505 510

Cys Met Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val

515 520 525

Ala Phe Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln

530 535 540

His Arg Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg

545 550 555 560

His Glu Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu

565 570 575

Gln Met Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala

580 585 590

Ser Gln Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His

595 600 605

Pro Ser Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln

610 615 620

Ala Tyr Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys

625 630 635

<210> 5

<211> 1917

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码经GS接头与M1融合的VP2的基因

<400> 5

atgggcagca gcgactacaa ggacgacgat gacaagagca gcggcacgcg tatgggtgct 60

gctttaacac tgttggggga cctaattgct actgtgtctg aagctgctgc tgctactgga 120

ttttcagtag ctgaaattgc tgctggagag gccgctgctg caattgaagt gcaacttgca 180

tctgttgcta ctgttgaagg cctaacaacc tctgaggcaa ttgctgctat aggcctcact 240

ccacaggcct atgctgtgat atctggggct cctgctgcta tagctggatt tgcagcttta 300

ctgcaaactg tgactggtgt gagcgctgtt gctcaagtgg ggtatagatt ttttagtgac 360

tgggatcaca aagtttctac tgttggttta tatcaacaac caggaatggc tgtagatttg 420

tataggccag atgattacta tgatatttta tttcctggag tacaaacctt tgttcacagt 480

gttcagtatc ttgaccccag acattggggt ccaacacttt ttaatgccat ttctcaagct 540

ttttggcgtg taatacaaaa tgacattcct aggctcacct cacaggagct tgaaagaaga 600

acccaaagat atttaaggga cagtttggca aggtttttag aggaaactac ttggacagta 660

attaatgctc ctgttaattg gtataactct ttacaagatt actactctac tttgtctccc 720

attaggccta caatggtgag acaagtagcc aacagggaag ggttgcaaat atcatttggg 780

cacacctatg ataatattga tgaagcagac agtattcagc aagtaactga gaggtgggaa 840

gctcaaagcc aaagtcctaa tgtgcagtca ggtgaattta ttgaaaaatt tgaggctcct 900

ggtggtgcaa atcaaagaac tgctcctcag tggatgttgc ctttacttct aggcctgtac 960

ggaagtgtta cttctgctct aaaagcttat gaagatggcc ccaacaaaaa gaaaaggaag 1020

ttgtccaggg gcagctccca aaaaaccaaa ggaaccagtg caagtgccaa agctcgtcat 1080

aaaaggagga atagaagttc taggagtgaa ttcggtggtg gtggaagtgg tggtggtgga 1140

agtggtggtg gtggaagtat gtcactccta accgaagtcg agacttatgt cctgagcatt 1200

ataccgtcag gtcctctaaa agccgaaatt gcccagcgtt tagaggatgt gttcgcaggg 1260

aagaacactg accttgaggt gctgatggag tggctgaaaa cccgacccat tcttagccca 1320

cttaccaaag gcatcctggg attcgtgttc acactgactg ttccatctga gagaggcttg 1380

cagaggagac gatttgttca gaatgccctc aatgggaatg gtgatcccaa caacatggac 1440

aaagccgtga agctttatcg caagctcaaa cgggagataa ccttccatgg agcgaaggaa 1500

atctccctca gttactctgc aggtgccttg gcgagctgta tgggcctgat ctacaatcgg 1560

atgggagccg tgacaacgga agtggctttt ggcctggtat gcgctacttg cgaacagatc 1620

gcagatagcc aacacaggtc ccacaggcag atggtcacca caaccaaccc tctgattcgg 1680

cacgagaaca gaatggtgtt agcgtccaca acggcaaaag ccatggaaca gatggccggc 1740

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gctatgagga ctatcgggac acatccctct tccagtgctg ggctgaagaa cgacctgttg 1860

gagaatctcc aagcctacca aaagcgcatg ggagtccaga tgcagcgctt taagtga 1917

<210> 6

<211> 772

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 经GS接头与OVA融合的VP2

<400> 6

Met Gly Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Ser Gly Thr

1 5 10 15

Arg Met Gly Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly Asp Leu Ile Ala Thr Val

20 25 30

Ser Glu Ala Ala Ala Ala Thr Gly Phe Ser Val Ala Glu Ile Ala Ala

35 40 45

Gly Glu Ala Ala Ala Ala Ile Glu Val Gln Leu Ala Ser Val Ala Thr

50 55 60

Val Glu Gly Leu Thr Thr Ser Glu Ala Ile Ala Ala Ile Gly Leu Thr

65 70 75 80

Pro Gln Ala Tyr Ala Val Ile Ser Gly Ala Pro Ala Ala Ile Ala Gly

85 90 95

Phe Ala Ala Leu Leu Gln Thr Val Thr Gly Val Ser Ala Val Ala Gln

100 105 110

Val Gly Tyr Arg Phe Phe Ser Asp Trp Asp His Lys Val Ser Thr Val

115 120 125

Gly Leu Tyr Gln Gln Pro Gly Met Ala Val Asp Leu Tyr Arg Pro Asp

130 135 140

Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Phe Pro Gly Val Gln Thr Phe Val His Ser

145 150 155 160

Val Gln Tyr Leu Asp Pro Arg His Trp Gly Pro Thr Leu Phe Asn Ala

165 170 175

Ile Ser Gln Ala Phe Trp Arg Val Ile Gln Asn Asp Ile Pro Arg Leu

180 185 190

Thr Ser Gln Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln Arg Tyr Leu Arg Asp Ser

195 200 205

Leu Ala Arg Phe Leu Glu Glu Thr Thr Trp Thr Val Ile Asn Ala Pro

210 215 220

Val Asn Trp Tyr Asn Ser Leu Gln Asp Tyr Tyr Ser Thr Leu Ser Pro

225 230 235 240

Ile Arg Pro Thr Met Val Arg Gln Val Ala Asn Arg Glu Gly Leu Gln

245 250 255

Ile Ser Phe Gly His Thr Tyr Asp Asn Ile Asp Glu Ala Asp Ser Ile

260 265 270

Gln Gln Val Thr Glu Arg Trp Glu Ala Gln Ser Gln Ser Pro Asn Val

275 280 285

Gln Ser Gly Glu Phe Ile Glu Lys Phe Glu Ala Pro Gly Gly Ala Asn

290 295 300

Gln Arg Thr Ala Pro Gln Trp Met Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Tyr

305 310 315 320

Gly Ser Val Thr Ser Ala Leu Lys Ala Tyr Glu Asp Gly Pro Asn Lys

325 330 335

Lys Lys Arg Lys Leu Ser Arg Gly Ser Ser Gln Lys Thr Lys Gly Thr

340 345 350

Ser Ala Ser Ala Lys Ala Arg His Lys Arg Arg Asn Arg Ser Ser Arg

355 360 365

Ser Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Met Gly Ser Ile Gly Ala Ala Ser Met Glu Phe Cys Phe Asp

385 390 395 400

Val Phe Lys Glu Leu Lys Val His His Ala Asn Glu Asn Ile Phe Tyr

405 410 415

Cys Pro Ile Ala Ile Met Ser Ala Leu Ala Met Val Tyr Leu Gly Ala

420 425 430

Lys Asp Ser Thr Arg Thr Gln Ile Asn Lys Val Val Arg Phe Asp Lys

435 440 445

Leu Pro Gly Phe Gly Asp Ser Ile Glu Ala Gln Cys Gly Thr Ser Val

450 455 460

Asn Val His Ser Ser Leu Arg Asp Ile Leu Asn Gln Ile Thr Lys Pro

465 470 475 480

Asn Asp Val Tyr Ser Phe Ser Leu Ala Ser Arg Leu Tyr Ala Glu Glu

485 490 495

Arg Tyr Pro Ile Leu Pro Glu Tyr Leu Gln Cys Val Lys Glu Leu Tyr

500 505 510

Arg Gly Gly Leu Glu Pro Ile Asn Phe Gln Thr Ala Ala Asp Gln Ala

515 520 525

Arg Glu Leu Ile Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile

530 535 540

Arg Asn Val Leu Gln Pro Ser Ser Val Asp Ser Gln Thr Ala Met Val

545 550 555 560

Leu Val Asn Ala Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Ala Phe Lys

565 570 575

Asp Glu Asp Thr Gln Ala Met Pro Phe Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser

580 585 590

Lys Pro Val Gln Met Met Tyr Gln Ile Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser

595 600 605

Met Ala Ser Glu Lys Met Lys Ile Leu Glu Leu Pro Phe Ala Ser Gly

610 615 620

Thr Met Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu

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Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser

645 650 655

Ser Asn Val Met Glu Glu Arg Lys Ile Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met

660 665 670

Lys Met Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr Ser Val Leu Met Ala Met Gly

675 680 685

Ile Thr Asp Val Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gly Ile Ser Ser

690 695 700

Ala Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu

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Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val

725 730 735

Asp Ala Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu

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Phe Cys Ile Lys His Ile Ala Thr Asn Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg

755 760 765

Cys Val Ser Pro

770

<210> 7

<211> 2319

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码经GS接头与OVA融合的VP2的基因

<400> 7

atgggcagca gcgactacaa ggacgacgat gacaagagca gcggcacgcg tatgggtgct 60

gctttaacac tgttggggga cctaattgct actgtgtctg aagctgctgc tgctactgga 120

ttttcagtag ctgaaattgc tgctggagag gccgctgctg caattgaagt gcaacttgca 180

tctgttgcta ctgttgaagg cctaacaacc tctgaggcaa ttgctgctat aggcctcact 240

ccacaggcct atgctgtgat atctggggct cctgctgcta tagctggatt tgcagcttta 300

ctgcaaactg tgactggtgt gagcgctgtt gctcaagtgg ggtatagatt ttttagtgac 360

tgggatcaca aagtttctac tgttggttta tatcaacaac caggaatggc tgtagatttg 420

tataggccag atgattacta tgatatttta tttcctggag tacaaacctt tgttcacagt 480

gttcagtatc ttgaccccag acattggggt ccaacacttt ttaatgccat ttctcaagct 540

ttttggcgtg taatacaaaa tgacattcct aggctcacct cacaggagct tgaaagaaga 600

acccaaagat atttaaggga cagtttggca aggtttttag aggaaactac ttggacagta 660

attaatgctc ctgttaattg gtataactct ttacaagatt actactctac tttgtctccc 720

attaggccta caatggtgag acaagtagcc aacagggaag ggttgcaaat atcatttggg 780

cacacctatg ataatattga tgaagcagac agtattcagc aagtaactga gaggtgggaa 840

gctcaaagcc aaagtcctaa tgtgcagtca ggtgaattta ttgaaaaatt tgaggctcct 900

ggtggtgcaa atcaaagaac tgctcctcag tggatgttgc ctttacttct aggcctgtac 960

ggaagtgtta cttctgctct aaaagcttat gaagatggcc ccaacaaaaa gaaaaggaag 1020

ttgtccaggg gcagctccca aaaaaccaaa ggaaccagtg caagtgccaa agctcgtcat 1080

aaaaggagga atagaagttc taggagtgaa ttcggtggtg gtggaagtgg tggtggtgga 1140

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gaggagagga agatcaaggt gtacctgccc aggatgaaga tggaggagaa gtacaacctg 2040

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<210> 8

<211> 36

<212> PRT

<213> 多瘤病毒属（Polyomavirus）SV40

<400> 8

Ser Gly Glu Phe Ile Glu Lys Phe Glu Ala Pro Gly Gly Ala Asn Gln

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Arg Thr Ala Pro Gln Trp Met Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Tyr Gly

20 25 30

Ser Val Thr Ser

35

<210> 9

<211> 234

<212> PRT

<213> 多瘤病毒属（Polyomavirus）SV40

<400> 9

Met Ala Val Asp Leu Tyr Arg Pro Asp Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Phe

1 5 10 15

Pro Gly Val Gln Thr Phe Val His Ser Val Gln Tyr Leu Asp Pro Arg

20 25 30

His Trp Gly Pro Thr Leu Phe Asn Ala Ile Ser Gln Ala Phe Trp Arg

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Gln Val Ala Asn Arg Glu Gly Leu Gln Ile Ser Phe Gly His Thr Tyr

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Asp Asn Ile Asp Glu Ala Asp Ser Ile Gln Gln Val Thr Glu Arg Trp

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Glu Ala Gln Ser Gln Ser Pro Asn Val Gln Ser Gly Glu Phe Ile Glu

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Lys Phe Glu Ala Pro Gly Gly Ala Asn Gln Arg Thr Ala Pro Gln Trp

165 170 175

Met Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Tyr Gly Ser Val Thr Ser Ala Leu

180 185 190

Lys Ala Tyr Glu Asp Gly Pro Asn Lys Lys Lys Arg Lys Leu Ser Arg

195 200 205

Gly Ser Ser Gln Lys Thr Lys Gly Thr Ser Ala Ser Ala Lys Ala Arg

210 215 220

His Lys Arg Arg Asn Arg Ser Ser Arg Ser

225 230

<210> 10

<211> 705

<212> DNA

<213> 多瘤病毒属（Polyomavirus）SV40

<400> 10

atggctgtag atttgtatag gccagatgat tactatgata ttttatttcc tggagtacaa 60

acctttgttc acagtgttca gtatcttgac cccagacatt ggggtccaac actttttaat 120

gccatttctc aagctttttg gcgtgtaata caaaatgaca ttcctaggct cacctcacag 180

gagcttgaaa gaagaaccca aagatattta agggacagtt tggcaaggtt tttagaggaa 240

actacttgga cagtaattaa tgctcctgtt aattggtata actctttaca agattactac 300

tctactttgt ctcccattag gcctacaatg gtgagacaag tagccaacag ggaagggttg 360

caaatatcat ttgggcacac ctatgataat attgatgaag cagacagtat tcagcaagta 420

actgagaggt gggaagctca aagccaaagt cctaatgtgc agtcaggtga atttattgaa 480

aaatttgagg ctcctggtgg tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat gttgccttta 540

cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct gctctaaaag cttatgaaga tggccccaac 600

aaaaagaaaa ggaagttgtc caggggcagc tcccaaaaaa ccaaaggaac cagtgcaagt 660

gccaaagctc gtcataaaag gaggaataga agttctagga gttaa 705

<210> 11

<211> 352

<212> PRT

<213> 多瘤病毒属（Polyomavirus）SV40

<400> 11

Met Gly Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly Asp Leu Ile Ala Thr Val Ser

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Ala Thr Gly Phe Ser Val Ala Glu Ile Ala Ala Gly

20 25 30

Glu Ala Ala Ala Ala Ile Glu Val Gln Leu Ala Ser Val Ala Thr Val

35 40 45

Glu Gly Leu Thr Thr Ser Glu Ala Ile Ala Ala Ile Gly Leu Thr Pro

50 55 60

Gln Ala Tyr Ala Val Ile Ser Gly Ala Pro Ala Ala Ile Ala Gly Phe

65 70 75 80

Ala Ala Leu Leu Gln Thr Val Thr Gly Val Ser Ala Val Ala Gln Val

85 90 95

Gly Tyr Arg Phe Phe Ser Asp Trp Asp His Lys Val Ser Thr Val Gly

100 105 110

Leu Tyr Gln Gln Pro Gly Met Ala Val Asp Leu Tyr Arg Pro Asp Asp

115 120 125

Tyr Tyr Asp Ile Leu Phe Pro Gly Val Gln Thr Phe Val His Ser Val

130 135 140

Gln Tyr Leu Asp Pro Arg His Trp Gly Pro Thr Leu Phe Asn Ala Ile

145 150 155 160

Ser Gln Ala Phe Trp Arg Val Ile Gln Asn Asp Ile Pro Arg Leu Thr

165 170 175

Ser Gln Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln Arg Tyr Leu Arg Asp Ser Leu

180 185 190

Ala Arg Phe Leu Glu Glu Thr Thr Trp Thr Val Ile Asn Ala Pro Val

195 200 205

Asn Trp Tyr Asn Ser Leu Gln Asp Tyr Tyr Ser Thr Leu Ser Pro Ile

210 215 220

Arg Pro Thr Met Val Arg Gln Val Ala Asn Arg Glu Gly Leu Gln Ile

225 230 235 240

Ser Phe Gly His Thr Tyr Asp Asn Ile Asp Glu Ala Asp Ser Ile Gln

245 250 255

Gln Val Thr Glu Arg Trp Glu Ala Gln Ser Gln Ser Pro Asn Val Gln

260 265 270

Ser Gly Glu Phe Ile Glu Lys Phe Glu Ala Pro Gly Gly Ala Asn Gln

275 280 285

Arg Thr Ala Pro Gln Trp Met Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Tyr Gly

290 295 300

Ser Val Thr Ser Ala Leu Lys Ala Tyr Glu Asp Gly Pro Asn Lys Lys

305 310 315 320

Lys Arg Lys Leu Ser Arg Gly Ser Ser Gln Lys Thr Lys Gly Thr Ser

325 330 335

Ala Ser Ala Lys Ala Arg His Lys Arg Arg Asn Arg Ser Ser Arg Ser

340 345 350

<210> 12

<211> 1059

<212> DNA

<213> 多瘤病毒属（Polyomavirus）SV40

<400> 12

atgggtgctg ctttaacact gttgggggac ctaattgcta ctgtgtctga agctgctgct 60

gctactggat tttcagtagc tgaaattgct gctggagagg ccgctgctgc aattgaagtg 120

caacttgcat ctgttgctac tgttgaaggc ctaacaacct ctgaggcaat tgctgctata 180

ggcctcactc cacaggccta tgctgtgata tctggggctc ctgctgctat agctggattt 240

gcagctttac tgcaaactgt gactggtgtg agcgctgttg ctcaagtggg gtatagattt 300

tttagtgact gggatcacaa agtttctact gttggtttat atcaacaacc aggaatggct 360

gtagatttgt ataggccaga tgattactat gatattttat ttcctggagt acaaaccttt 420

gttcacagtg ttcagtatct tgaccccaga cattggggtc caacactttt taatgccatt 480

tctcaagctt tttggcgtgt aatacaaaat gacattccta ggctcacctc acaggagctt 540

gaaagaagaa cccaaagata tttaagggac agtttggcaa ggtttttaga ggaaactact 600

tggacagtaa ttaatgctcc tgttaattgg tataactctt tacaagatta ctactctact 660

ttgtctccca ttaggcctac aatggtgaga caagtagcca acagggaagg gttgcaaata 720

tcatttgggc acacctatga taatattgat gaagcagaca gtattcagca agtaactgag 780

aggtgggaag ctcaaagcca aagtcctaat gtgcagtcag gtgaatttat tgaaaaattt 840

gaggctcctg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt ggatgttgcc tttacttcta 900

ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagcttatg aagatggccc caacaaaaag 960

aaaaggaagt tgtccagggg cagctcccaa aaaaccaaag gaaccagtgc aagtgccaaa 1020

gctcgtcata aaaggaggaa tagaagttct aggagttaa 1059

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FLAG标签编码序列

<400> 13

gactacaagg acgacgatga caag 24

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GS接头编码序列

<400> 14

ggtggtggtg gaagtggtgg tggtggaagt ggtggtggtg gaagt 45

Claims

1.诱导生物体对抗原的免疫作用的免疫诱导剂的制造方法，其包括：通过混合病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质，调制病毒样粒子的工序，其中

所述外壳蛋白质构成所述病毒样粒子的外壳，所述抗原结合蛋白质内包于所述外壳内，

所述免疫诱导剂含所述病毒样粒子。

2.权利要求1所述的制造方法，其中在所述调制工序之前包括如下工序：

通过将编码所述外壳蛋白质的DNA和编码所述抗原结合蛋白质的DNA导入宿主细胞，在所述宿主细胞中表达所述外壳蛋白质和所述抗原结合蛋白质，取得所述外壳蛋白质和所述抗原结合蛋白质。

3.权利要求2所述的方法，其中所述宿主细胞选自：昆虫细胞、大肠杆菌、酵母及植物细胞。

4.权利要求1～3之任一项所述的方法，其中所述外壳蛋白质来源于多瘤病毒属病毒。

5.权利要求4所述的方法，其中

所述多瘤病毒属病毒是SV40，

所述外壳蛋白质是VP1。

6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白质含

所述抗原的氨基酸序列、和

SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

7.免疫诱导剂用于诱导生物体对抗原的免疫作用的用途，其中

所述免疫诱导剂含病毒样粒子，

所述病毒样粒子

·含病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质，

·所述外壳蛋白质构成所述病毒样粒子的外壳，所述抗原结合蛋白质内包于所述外壳内，

·诱导生物体对所述抗原的免疫作用。

8.权利要求7所述的用途，其中所述外壳蛋白质来源于多瘤病毒属病毒。

9.权利要求8所述的用途，其中

所述多瘤病毒属病毒是SV40，

所述外壳蛋白质是VP1。

10.权利要求7～9之任一项所述的用途，其中所述抗原结合蛋白质含

所述抗原的氨基酸序列、和

SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

11.病毒样粒子用于制造免疫诱导剂的用途，其中

所述免疫诱导剂含所述病毒样粒子，

所述病毒样粒子

·含病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质，

·诱导生物体对所述抗原的免疫作用。

12.权利要求11所述的用途，其中所述外壳蛋白质来源于多瘤病毒属病毒。

13.权利要求12所述的用途，其中

所述多瘤病毒属病毒是SV40，

所述外壳蛋白质是VP1。

14.权利要求11～13之任一项所述的用途，其中所述抗原结合蛋白质含

所述抗原的氨基酸序列、和

SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

15.含病毒样粒子的免疫诱导剂，其中所述病毒样粒子

·含病毒来源的外壳蛋白质和抗原结合蛋白质，

·诱导生物体对所述抗原的免疫作用。

16.权利要求15所述的免疫诱导剂，其中所述外壳蛋白质来源于多瘤病毒属病毒。

17.权利要求16所述的免疫诱导剂，其中

所述多瘤病毒属病毒是SV40，

所述外壳蛋白质是VP1。

18.权利要求15～17之任一项所述的免疫诱导剂，其中所述抗原结合蛋白质含

所述抗原的氨基酸序列、和

SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。