WO1999015630A1 - Virus artificiels derives de papillomavirus, et leurs utilisations, notamment en therapie genique - Google Patents

Virus artificiels derives de papillomavirus, et leurs utilisations, notamment en therapie genique Download PDF

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WO1999015630A1
WO1999015630A1 PCT/FR1998/002029 FR9802029W WO9915630A1 WO 1999015630 A1 WO1999015630 A1 WO 1999015630A1 FR 9802029 W FR9802029 W FR 9802029W WO 9915630 A1 WO9915630 A1 WO 9915630A1
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plasmid
protein
vector
pseudoviruses
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PCT/FR1998/002029
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Antoine Touze
Pierre Coursaget
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Inserm (Institut National De La Sante Et De
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    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]

Definitions

  • the subject of the present invention is artificial viruses (or pseudoviruses) derived from human or animal papillomaviruses, as well as their methods of obtaining, and their uses, in particular in pharmaceutical compositions in the context of gene therapies, or for the detection of antibodies neutralizing papillomaviruses.
  • the efficiency, specificity and safety of the vector systems used for gene transfer are important factors for their application in humans, especially in the context of gene therapy or immunization with l 'DNA.
  • the conventional techniques for transferring plasmids inside eukaryotic cells are essentially those using liposomes (Felgner et al., 1987;
  • Felgner and Ringold, 1989 likely to contain fusion peptides of viral origin, or using whole viruses to facilitate the release of DNA into the cytoplasm (Kamata et al. 1994; Wagner et al., 1994). Viruses currently represent the most efficient natural gene transfer system (II).
  • viral vectors pose problems, in particular the possible production of viruses capable of replicating in the event of recombination with wild viruses present in the target cells, the inactivation of the vectors by preexisting neutralizing antibodies directed against these viruses in the host organism, and the immunological response induced by the virus (Gah ⁇ ry-Ségard et al., 1997; Juillard et al., 1995).
  • VLPs viral pseudo-particles
  • Papillomaviruses are members of the papovaviridae family. These are non-enveloped DNA viruses that infect humans and some animals.
  • the papillomavirus capsid consists of two proteins, L1 and L2. L1 is the major capsid protein, and has already been described as being able to self-assemble into VLPs.
  • VLPs were obtained by transformation of hamster cells, carrying bovine papillomavirus type I (BPVI) genomes capable of replicating autonomously, with recombinant Semliki forest viruses (SVF) expressing structural structure proteins BPVI (Roden et al., 1996).
  • BPVI bovine papillomavirus type I
  • SVF Semliki forest viruses
  • the L1 protein expressed by the recombinant SVFs is capable of self-assembling into VLPs.
  • viral DNA could only be detected in the VLPs resulting from the co-expression of L1 and L2, which, according to these same authors, indicates that the packaging of DNA inside the VLPs, can only take place if these VLPs consist of both L1 and L2.
  • VLPs of HPV type 16 having packaged the genome of BPV according to a process which has the characteristic of being intracellular, since this process, described above, is carried out in hamster cells containing the BPV genome and transformed by SVFs expressing the HPV-16 L1 and L2 proteins.
  • VLPs consisting of the L1 protein of human papillomavirus type 11 (HPV-11), were obtained by transformation of E. coli bacteria with plasmids containing the sequence encoding the L1 protein (Li et al., 1997). The authors of this article have found that these VLPs obtained by transformation of E. coli are very difficult to disassemble.
  • VLPs consisting of the L1 protein, and VLPs consisting of the L1 and L2 proteins, human papillomavirus type 33 (HPV-33), were obtained by an intracellular process comprising the cotransformation of Cos-7 cells on the one hand with a marker plasmid coding for ⁇ -galactosidase and, on the other hand, with vaccinia virus as a vector containing the sequence coding for L1, or those coding for L1 and L2 (Unckell et al., 1997).
  • the rate of encapsidation by the aforementioned intracellular method, of the plasmid containing the sequence coding for ⁇ -galactosidase, is very low, since only 1 VLP out of 25,000 carries this plasmid. Furthermore, the infection rate of Cos-7 cells by VLPs carrying said plasmid is also very low, since only 1 in 2,000 VLPs carrying the plasmid is capable of infecting a Cos-7 cell.
  • VLPs Given the low rates of integration of plasmid DNA into VLPs, and of infection of cells by these VLPs, the authors of this article have in no way mentioned the possibility of using such VLPs as as gene transfer vectors, and focused on their possible use in the detection of neutralizing antibodies against HPV infections.
  • the present invention stems from the discovery by the inventors of the fact that papillomavirus VLPs are capable of integrating plasmid DNA with a rate of packaging much higher than those described above, insofar as this packaging is carried out by an extracellular process (that is to say which is not carried out inside host cells), in particular by disassembly-reassembly in vitro of these VLPs in the presence of plasmid.
  • the inventors have also demonstrated that the rates of infection of cells with VLPs carrying plasmid DNA obtained according to the extracellular encapsidation process indicated above, are much higher than those described in the prior art. above, even when said VLPs consist of the only L1 protein.
  • One of the aims of the present invention is to provide new vectors for transferring genetic material into target cells, in particular within the framework of gene therapy, or of gene immunization, these vectors being simpler to prepare and safer. to use only the vector viruses described so far.
  • Another object of the present invention is to provide a simple process for the preparation of these transfer vectors.
  • Another object of the present invention is to provide new pharmaceutical compositions containing said transfer vectors, and usable in gene therapy, or gene immunization.
  • Another object of the present invention is to provide new reagents for the detection of antibodies which neutralize papillomaviruses, as well as new kits for the implementation of such a detection method.
  • the subject of the present invention is the use of viral pseudo-particles (VLPs) of human or animal papillomaviruses, for the preparation of vector pseudoviruses which can be used for the transfer of genetic material of therapeutic interest, into target cells of the organism, particularly in the context of gene therapy or gene immunization.
  • VLPs viral pseudo-particles
  • the VLPs used in the context of the present invention contain the L1 protein, and where appropriate the L2 protein, papillomaviruses.
  • the above-mentioned VLPs contain only the L1 protein (namely that said
  • VLPs are made up of capsomers only made up of L1 proteins.
  • genetic material of therapeutic interest transferred by the pseudovirus vectors into target cells within the framework of the present invention means any heterologous nucleotide sequence (DNA or RNA) of therapeutic interest, namely any sequence capable of coding for a protein. capable of treating a determined pathology, or of immunizing an individual against a determined pathology, said sequence not being included in the natural genome of papillomaviruses.
  • said heterologous sequence may consist of a fragment of the papillomavirus genome, or a nucleotide sequence derived from this fragment.
  • heterologous DNA sequence of therapeutic interest means in particular: any DNA sequence capable of coding for a protein in the context of pathologies in which said protein is deficient, any DNA sequence coding for a protein acting as as a vaccine, any DNA sequence coding for a protein acting as an antibody neutralizing pathogens, any DNA sequence coding for a protein capable of interacting directly or indirectly with proteins involved in the development of certain pathologies, any DNA sequence coding for an antisense RNA capable of inhibiting the production of a protein involved in the development of a pathology.
  • the target cells into which the genetic material is transferred in the context of the present invention are all cells capable of being infected by papillomaviruses or VLPs of these papillomaviruses.
  • the pseudovirus vectors of the invention are either administered in the form of pharmaceutical compositions, in particular under the conditions defined above. after, either used for the implementation of a process for the in vitro transformation of cells, in particular cells of a patient, the cells thus transformed by the pseudoviruses then being re-administered to the patient.
  • VLPs used in the context of this
  • L1 protein of the papillomaviruses are as obtained by transformation of host cells with vectors containing a DNA sequence coding for the L1 protein of the papillomaviruses and, if appropriate, a DNA sequence coding for the L2 protein of the papillomaviruses, said sequences being placed under the control of a transcription promoter, and recovery of the VLPs produced in said ⁇ o host cells by assembling capsomers of L1 proteins and, where appropriate of L2 proteins.
  • capsomers themselves result from the assembly of the L1 proteins, at a rate of approximately 5 L1 proteins per capsomer, a VLP consisting of 7 capsomers. In the case where the VLPs contain both the L1 protein and the L2 protein, there are approximately 30 L2 proteins per
  • VLPs used in the context of the present invention are as obtained by transformation of insect cells, as host cells, with baculoviruses used as vectors containing the DNA sequences coding for the L1 protein and, where appropriate, the
  • L2 protein said baculovirus vectors being themselves obtained by transformation of the latter with plasmids containing said DNA sequences coding for the L1 protein and, where appropriate L2, under the control of elements for regulating their expression.
  • the VLPs are VLPs
  • yeasts or mammalian cells such as CHO cells
  • plasmids used as vectors, containing the sequences of DNA coding for the L1 protein, and where appropriate the L2 protein, said DNA sequences being placed under the control of elements
  • the VLPs produced in the host cells within the framework of the abovementioned methods are purified from the culture media of said host cells, generally after lysis of the latter; among the techniques that can be used to purify said VLPs from these supernatants
  • 35 culture we can cite: ultracentrifugation in sucrose, isopycnic, or in density gradient (ex CsCl), precipitation by salting out with polyethylene glycol (PEG), or with ammonium sulphate, exclusion or ion exchange chromatography, the use of immunoadsorbents, - isoelectric focusing.
  • a subject of the invention is also the use of papillomavirus VLPs defined above, for the preparation of a medicament comprising vector pseudoviruses as defined above, the latter corresponding to said VLPs in which one or more heterologous nucleotide sequences of therapeutic interest are packaged, said pseudoviruses being. in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle, said medicament being intended for the treatment or prevention of pathologies, as described above, capable of being treated by gene therapy or prevented by gene immunization.
  • the invention also relates to any pseudovirus vector for the transfer of genetic material into target cells of the organism within the framework of gene therapy, or of gene immunization, characterized in that it corresponds to a VLP of human papillomaviruses or animals, in which one or more heterologous nucleotide sequences of therapeutic interest are packaged.
  • the subject of the invention is more particularly any pseudovirus transfer vector as defined above, characterized in that it is formed of a VLP in association with one or more heterologous nucleotide sequences encapsulated inside this VLP, said VLP comprising an assembly of capsomers of L1 protein, and if appropriate of L2 protein, of papillomavirus
  • the VLPs forming the aforementioned pseudoviruses include only the L1 protein of papillomavirus.
  • the vector pseudoviruses according to the invention are further characterized in that the heterologous nucleotide sequence (s) of therapeutic interest are inserted into a plasmid containing the elements necessary for regulating the expression of these DNA sequences, the maximum size of said plasmid being from about 8 to about 8.5 kb.
  • the vector pseudoviruses according to the invention are as obtained by an extracellular method of packaging one or more heterologous nucleotide sequences of therapeutic interest, inside said VLPs.
  • this extracellular encapsidation process is carried out by disassembly-reassembly of the VLPs defined above, in the presence of a vector, in particular a plasmid, containing the heterologous nucleotide sequence (s) (s) of therapeutic interest.
  • the invention relates more particularly to any vector pseudovirus as obtained by an in vitro process for disassembly-reassembly of the above-mentioned VLPs, this process comprising the following steps: disassembly of the VLPs into capsomeres, in particular by incubation of the latter with a chelating agent such as ethylene glycol tetracetate (EGTA), or ethylene diamine tetracetate (EDTA), and a reducing agent such as dithiothreitol (DTT), or ⁇ -mercaptoethanol, mixing the plasmid containing the heterologous DNA sequence (s) of therapeutic interest, advantageously in a ratio of one molecule of plasmid to one molecule of VLP (ie approximately 1 ⁇ g of plasmid, for approximately 5 ⁇ g of VLP), reassembly of capsomeres into VLPs containing the above-mentioned plasmid, especially by increasing the concentration of Ca + + ions, and
  • the aforementioned method comprises a step of separation, in particular by chromatographic techniques, on the one hand of the VLPs in which said heterologous nucleotide sequences of therapeutic interest are encapsulated and, on the other hand, of the VLPs which have remained empty (do not not containing said nucleotide sequences) after the implementation of said method.
  • the invention also relates to any pharmaceutical composition
  • vaccine in particular vaccine
  • the VLPs forming the pseudoviruses in the abovementioned pharmaceutical compositions comprise only the L1 protein of papillomavirus.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are further characterized in that they can be administered by the oral, intramuscular, intravenous, intradermal, subcutaneous, nasal, vaginal route, dermal, in particular at a rate of approximately 10 ng to approximately 10 ⁇ g of vector pseudoviruses per individual and per dose.
  • a subject of the present invention is also the use of vector pseudoviruses corresponding to the VLPs as defined above, in which one or more heterologous nucleotide sequences (in particular nucleotide sequences coding for reporter genes) are packaged, said vector pseudoviruses being obtained by an extracellular process of encapsidation, as described above, of said heterologous nucleotide sequences in said VLPs, for the implementation of a method of in vitro transfer of said heterologous nucleotide sequences into cells likely to be infected by said pseudovirus vectors.
  • vector pseudoviruses corresponding to the VLPs as defined above, in which one or more heterologous nucleotide sequences (in particular nucleotide sequences coding for reporter genes) are packaged, said vector pseudoviruses being obtained by an extracellular process of encapsidation, as described above, of said heterologous nucleotide sequences in said VLPs, for the implementation of a method of in vitro transfer of said
  • the VLPs forming the aforementioned pseudoviruses include only the L1 protein of papillomavirus.
  • the subject of the present invention is any method of in vitro transfer of heterologous nucleotide sequences into cells capable of being infected with vector pseudoviruses defined above, said pseudo viruses being obtained by an extracellular method of packaging said cells heterologous nucleotide sequences in papillomavirus VLPs, this extracellular packaging process being as described above (in which the plasmid containing the heterologous nucleotide sequence (s) of therapeutic interest is replaced by a plasmid containing the heterologous nucleotide sequence (s), said transfer method comprising a step of incubating said cells in the presence of the vector pseudoviruses defined above.
  • the invention also relates to the use of vector pseudoviruses corresponding to the VLPs as defined above, in which at least one reporter gene is encapsulated, said pseudoviruses being as obtained by an extracellular encapsidation method, as described below. above, of the reporter gene (s) in said VLPs, for the implementation of a method for detecting antibodies neutralizing the infection of human or animal papillomaviruses.
  • the VLPs forming the aforementioned pseudoviruses include only the L1 protein of papillomavirus.
  • the subject of the invention is also a method of in vitro detection of antibodies neutralizing human or animal papillomaviruses comprising the following steps: in vitro incubation of pseudovirus vectors defined above containing a reporter gene, with cells capable of being infected through vector pseudoviruses (such as HeLa or Cos-7 cells), in the presence of antibodies whose neutralizing power is tested, said vector pseudoviruses being obtained by an extracellular process for packaging the reporter gene (s) ( s) in papillomavirus VLPs, this extracellular packaging process being as described above (in which the plasmid containing the heterologous nucleotide sequence (s) of therapeutic interest is replaced by a plasmid containing the reporter gene (s), analysis of the expression or not of the reporter gene inside these cells, the absence of expression of the reporter gene in said cells being correlable to the fact that the antibodies tested have neutralized the infection of cells by said pseudoviruses, and therefore that these antibodies represent neutralizing antibodies capable of being used in the context of the treatment
  • reporter genes which may be used, there may be mentioned those of ⁇ -galactosidase, aequorin (GFP), luciferase, etc.
  • the invention also relates to a kit (or kit) for implementing a detection method as described above, this kit comprising: pseudovirus vectors containing at least one reporter gene, as obtained by a method extracellular packaging, as described above, of the reporter gene (s) in said VLPs, cells capable of being infected with said vector pseudoviruses, reagents necessary for revealing the activity encoded by the reporter gene.
  • the invention also relates to the method described above for the preparation of pseudoviruses as defined above of human or animal papillomaviruses capable of being used as a vector for the transfer of genetic material (namely heterologous nucleotide sequences, in the case if necessary of therapeutic interest, as defined above) in target cells, said method being carried out by disassembly-reassembly in vitro of the above-mentioned VLPs and comprises the following steps: disassembly of VLPs into capsomers, in particular by incubation of the latter with a chelating agent such as ethylene glycol tetracetate (EGTA), or ethylene diamine tetracetate (EDTA), and a reducing agent such as dithiothreitol (DTT), or ⁇ -mercaptoethanol, mixing the plasmid containing the heterologous DNA sequence (s), where appropriate of therapeutic interest, advantageously in a ratio of one plasmid molecule to one VLP molecule (ie approximately
  • VLPs as defined above, containing a heterologous DNA sequence containing the gene for ⁇ -galactosidase, or that of the protein fluorescent (GFP), as reporter genes.
  • GFP protein fluorescent
  • HPV-16 human papillomavirus type 16 VLPs
  • the gene is then subcloned into the vector pBlue Bac III (Invitrogen) derived from a baculovirus specific for the insect Autographa californica.
  • the plasmids are cotransfected with the DNA of the wild virus in insect cells, Sf9, Sf21, or "high-five".
  • the recombinant viruses are then selected by limiting dilution.
  • the Spodoptera Frugiperda (Sf21) cells infected with the recombinant baculovirus are harvested 4 days after infection and lysed with a solution of Nonidet® P40 in PBS for 15 mm at room temperature.
  • the nuclear fraction is recovered by centrifugation (10,000 xg, 15 min,
  • the positive ELISA fractions which have a density between 1.27-1.30 are pooled, diluted in PBS and subjected to ultracentrifugation in a SW 28 rotor (3 h, 28,000 rpm, 4 ° C).
  • the pellet is resuspended in 0.15M NaCl. Protein content was determined using the MicroBCA test
  • pGreenLantern (Life Technologies, Eragny, France) containing the gene coding for the fluorescent protein (GFP) of Aequoria Victoria under the control of the cytomegalovirus promoter.
  • pCMV- ⁇ gal containing the gene coding for the ⁇ -galactosidase of E. coli.
  • the plasmid pCMV-HBc was used for the immunization studies. This plasmid contains the truncated gene at the 3 'end of the hepatitis B core antigen under the control of the CMV promoter.
  • the HPV-16 VLPs purified to a concentration of 500 ⁇ g / ml are incubated in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl, EGTA ImM, and 20 mM DTT in a final volume of 50 ⁇ l at room temperature for 30 min.
  • a 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5
  • 150 mM NaCl 1 ⁇ g
  • 1 plasmid containing the reporter gene (GFP or ⁇ -gal) in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and 150 mM NaCl is added to the disassembled VLPs.
  • the CaCl2 concentration is then gradually increased to 5 mM and DMSO is added (1% final) (final volume 100 ⁇ l). This solution is incubated for 1 hour at 20 ° C.
  • the reconstituted VLPs are treated with 10 U of Benzonase® (Merck, Darmstadt, Germany) for 1 h at 20 ° C. to verify that the plasmid DNA is integrated into the VLPs, and not absorbed on their surface. d) Transfection / infection experiences
  • DMEM / Glutamax® (Life Technologies) supplemented with fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • penicillin 100 IU / ml and streptomycin 100 ⁇ g / ml were seeded on 6-well plates (Nunc, Life Technologies) and cultivated until
  • the pCMV- ⁇ gal-VLPs or pGreenLantern-VLPs viral pseudo-particles in 1 ml of culture medium were added to the wells and incubated for 4 h at 37 ° C. At this stage, the VLPs were removed, and 3 ml of DMEM / Glutamax supplemented with 10% FCS were added.
  • cells were transfected using the same amount of DNA (1 ⁇ g) with 10 ⁇ l of a liposome, lipofectamine® (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions. After 4 h of incubation at 37 ° C., 2 ml of culture medium containing fetal beef serum were added. The cells were then incubated for 48 h at 37 ° C.
  • MRC5 lung
  • HeLa cervix
  • CaCo2 colon
  • NIH 3T3 embryonic cells from mice and 4 other animal cell lines including Vero and Cos-7 (monkey, kidney), MDCK (dog, kidney) and CHO (hamster, ovary) cells were used.
  • the cells were washed with PBS and fixed for 10 mm at room temperature with a solution of formalin 2% -glutaraldehyde 0.2% in PBS for the detection of ⁇ -galactosidase. After three washes with PBS, the cells were exposed to 1 ml of a PBS solution containing K 3 Fe (CN) 6 4 mM, K 4 Fe (CN) 6 3 H 2 0 4 mM, MgCh 2 mM. Tris 100 mM (pH 7.4) and 1 mg / ml of X-gal at 37 ° C, for the expression of ⁇ -galactosidase. After the development of the color (2-4 h), the cells were washed with PBS and observed.
  • the cells were washed 3 times with PBS, 48 h after the transfection. The cells were lysed and, after centrifugation, the total protein content of the supernatants was determined using the Bradford method and adjusted to a concentration of 500 ⁇ g / ml before testing for the presence of ⁇ -galactosidase.
  • the number of fluorescent and non-fluorescent cells was determined using FAC Scan flow cytometry to measure the expression of the GFP protein.
  • the cells were treated with trypsin, centrifuged and resuspended in 1 ml of culture medium.
  • the cells were analyzed using a FAC Sort flow cytometer (Becton-Dickinson, Montain View, CA, USA). Furthermore, the cells were directly observed using a fluorescence microscope and photographed directly.
  • mice Female BALB / c (H-2 ⁇ ) mice, 12-16 weeks of age, were kept in pathogen-free conditions during the immunization protocol. BALB / c mice received two injections of 5 ⁇ g of reconstituted HPV-16 VLPs containing the plasmid pCMV-HBc in the Tibialis anterior muscle at two weeks apart.
  • mice received 100 ⁇ g of the plasmid pCMV-HBc at the same location, with or without cardiotoxin, 5 days before the vaccination injection, and a group of control mice received 5 ⁇ g of purified recombinant HBcAg.
  • the intramuscular injection of 100 ⁇ l of 10 mM cardiotoxin was carried out so as to increase the uptake of plasmid DNA by muscle cells. Blood samples were collected at each vaccination injection and 15 days after the second.
  • Recombinant HBcAg assembled with VLPs was purified from insect cells infected with a recombinant baculovirus encoding the HBc gene.
  • the antibodies directed against the VLPs of HBcAg and of HPV-16 were studied according to ELISA techniques.
  • HPV-16 or HBcAg VLPs 100 mg / well in PBS (pH 7.4) were incubated overnight at 4 ° C. After 4 washes with 0.1% PBS-Tween 20, the non-specific binding sites were blocked by incubation for 30 min at 37 ° C. with 1% PBS-NBS (bovine newborn serum).
  • the blocking solution was replaced by 100 ⁇ l of mouse serum diluted twice in 5xPBS containing 10% NBS and 2% Tween 20. After incubation at 45 ° C for 90 mm, and 4 washes, the bound antibodies were detected with an anti-mouse immunoglobulin covalently linked to horseradish peroxidase (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France).
  • the substrate solution containing o-phenylene diamine and H2O2 was added.
  • the reaction is stopped after 30 min by adding H2SO4 4N and the optical densities (492 nm) were read with an automatic reader (Microplate reader EL 311, Bioteck Instruments).
  • the titers or antibodies correspond to the inverse of the last dilution of serum giving a positive result (OD greater than 0.1).
  • the results are expressed as a geometric mean of titles calculated from the different titles obtained from each mouse in each group.
  • HPV-16 VLPs were produced in Sf21 insect cells using a recombinant baculovirus.
  • VLPs were purified by ultracentrifugation in sucrose, then in a CsCl gradient (Le Cann et al., 1994).
  • the CsCl gradient fractions containing the VLPs were pooled, diluted in PBS and then ultracentrifuged.
  • the pellet is then resuspended in a buffer containing EGTA and DTT and incubated at room temperature for 30 min. Under these conditions, the VLPs are completely disintegrated into structures resembling capsomers.
  • the plasmid DNA is then added and the preparation is diluted in a buffer containing a high concentration of calcium and 1% DMSO so as to reform the VLPs. About 75% of the L1 proteins seem to reassemble into VLPs under these conditions.
  • HeLa cells have been studied for their sensitivity to VLPs-pGreenLantern.
  • the fluorescence of the GFP protein produced in the transfected cells was analyzed by flow cytometry.
  • 70% of the HeLa cells transfected with the plasmid pGreenLantern encapsulated in the VLPs are fluorescent (Table 1).
  • the expression of ⁇ -galactosidase was measured by ELISA in the cell lysate. The results indicate that the level of expression corresponds to the amount of pCMV- ⁇ gal -VLPs used. An increase in the level of expression of ⁇ -galactosidase by approximately 100 has been observed between concentrations of VLP vector from 1 to 10 ⁇ g.
  • Anti-HBc antibodies were observed in all immunized animals. However, the anti-HBc titer (20, 138) is higher in mice immunized with pCMV-HBc encapsulated inside the HPV VLPs, than in mice immunized with pCMV-HBc alone (1,000 to 1 , 600), and higher than the title
  • Anti-HPV-16 antibodies were not detected in mice immunized with HBc VLPs or with HBc DNA, but are present in a titer 800 in mice immunized with HPV VLPs containing HBc DNA after the second injection.
  • the level of anti-HPV-16 antibodies is however much lower than that observed in mice immunized with 5 ⁇ g of HPV VLPs absorbed on Al (OH) 3 as an adjuvant, in which the anti-VLP titers reach 30,000 to 70,000.
  • the HPV-16 L1 protein VLPs obtained by expression of the major capsid protein of human papillomavirus type 16 in insect cells, can encapsulate a plasmid carrying either a gene for the GFP protein or a gene for ⁇ -galactosidase during the in vitro disassembly-reassembly of VLPs.
  • the introduction of the plasmid into different cells by these pseudovirions or artificial viruses is easily detected by the accumulation of the gene product, and the number of cells carrying the gene is a function of the concentration of HPV-16 VLPs in the transfer experience.
  • Benzonase® of DNA transfer mediated by VLPs inside cells Benzonase® of DNA transfer mediated by VLPs inside cells.
  • VLPs The efficiency of gene transfer by VLPs considerably exceeds that obtained by calcium phosphate or lipid transfection.
  • VLPs found in the heavy fraction of CsCl gradients can be compared to those of 1 / 25,000 VLPs of HPV-33 expressed in Cos-7 cells containing multiple copies of a plasmid marker. described in the article by Unckell et al. , mentioned above. Considering that the VLPs have 72 capsomers, each capsomer being an L1 pentamer and that the VLPs represent 50% of the protein content of the preparation, it has been calculated that 150 VLPs per cell are used during the transfection experiments. .
  • HPV pseudovirions described here also represent a useful system for the detection of anti-papillomavirus antibodies.
  • VLPs for gene transfer has advantages over the use of recombinant viruses.
  • the production of such pseudovirions is much easier than that of the usual viral vectors, and the risk of induction of neutralizing antibodies is lower.
  • these pseudovirions are safer to use because no recombination with a wild virus is possible, since they do not contain papillomavirus DNA sequence. 5

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation de pseudo-particules virales (VLPs) de papillomavirus pour la préparation de pseudovirus vecteurs utilisables pour le transfert de matériel génétique dans des cellules cibles de l'organisme.

Description

VIRUS ARTIFICIELS DERIVES DE PAPILLOMAVIRUS, ET LEURS UTILISATIONS, NOTAMMENT EN THÉRAPIE GÉNIQUE.
La présente invention a pour objet des virus artificiels (ou pseudovirus) dérivés de papillomavirus humains ou animaux, ainsi que leurs procédés d'obtention, et leurs utilisations, notamment dans des compositions pharmaceutiques dans le cadre de thérapies géniques, ou pour la détection d'anticorps neutralisant les papillomavirus.
L'efficacité, la spécificité et l'innocuité des systèmes de vecteurs utilisés pour le transfert de gènes, sont des facteurs importants en vue de leurs applications chez l'homme, notamment dans le cadre de la thérapie génique ou de l'immunisation par l ' ADN . Les techniques classiques pour le transfert de plasmides à l'intérieur des cellules eucaryotes, sont essentiellement celles utilisant les liposomes (Felgner et al. , 1987 ;
Felgner and Ringold, 1989) susceptibles de contenir des peptides de fusion d'origine virale, ou utilisant des virus entiers afin de faciliter le relargage de l'ADN dans le cytoplasme (Kamata et al. 1994 ; Wagner et al. , 1994). Les virus représentent actuellement le plus efficace système naturel de transfert de gènes (II).
Les adénovirus (Berkner, 1992 ; Kozarsky and Wilson, 1993 ; Kremer and
Perricaudet, 1995), les virus associés aux adénovirus (Kremer and Perricaudet, 1995 :
Kotin, 1994 ; Fisher et al. , 1997), le virus Epstein-Barr (Banerjee et al.. 1995) et les rétrovirus (Miller, 1992 ; Danos and Mulligan, 1988 ; Naldini et al. , 1996), ont été modifiés pour transporter des gènes d'intérêt thérapeutique et pour intégrer leur propre génome à l'intérieur de cellules cibles.
L'utilisation de vecteurs viraux pose cependant des problèmes, notamment la production possible de virus capables de se répliquer dans le cas où se produit une recombinaison avec des virus sauvages présents dans les cellules cibles, l'inactivation des vecteurs par des anticorps neutralisant préexistants dirigés contre ces virus dans l'organisme hôte, et la réponse immunologique induite par le virus (Gahëry-Ségard et al. , 1997 ; Juillard et al. , 1995).
Durant les dix dernières années, il a été montré que les protéines de structure de nombreux virus sont capables de s'auto-assembler en pseudo-particules virales (encore désignées ci-après par l'expression VLPs) lorsqu'elles sont exprimées dans des systèmes d'expression eucaryotes ou procary otes. Les papillomavirus sont des membres de la famille des papovaviridae . Ce sont des virus à ADN non enveloppés, qui infectent les humains ainsi que certains animaux. La capside du papillomavirus est constituée de deux protéines, Ll et L2. Ll est la protéine majeure de capside, et a déjà été décrite comme étant capable de s'auto-assembler en VLPs.
Des VLPs ont été obtenues par transformation de cellules de hamster, porteuses de génomes de papillomavirus bovin de type I (BPVI) capables de se répliquer de façon autonome, avec des virus de la forêt de Semliki (SVF) recombinants exprimant les protéines de structure de BPVI (Roden et al. , 1996). Selon les auteurs de cet article, la protéine Ll exprimée par les SVF recombinants, est capable de s'auto- assembler en VLPs. Toutefois, de l'ADN viral n'a pu être détecté que dans les VLPs résultant de la co-expression de Ll et L2, ce qui, toujours selon ces mêmes auteurs, indique que l'encapsidation d'ADN à l'intérieur des VLPs, ne peut avoir lieu que si ces VLPs sont constituées à la fois de Ll et L2. Le but du travail décrit dans cet article de Roden et al. , est celui de l'obtention de particules infectieuses de papillomavirus humain (HPV) capables d'infecter des cellules de souris, et d'étudier la possibilité de neutraliser cette infection par des anticorps. Ainsi, les auteurs de cet article ont préparé des VLPs d'HPV type 16 ayant encapsidé le génome du BPV selon un procédé qui a la caractéristique d'être intracellulaire, puisque ce procédé, décrit ci-dessus, est effectué dans des cellules de hamster contenant le génome de BPV et transformées par des SVF exprimant les protéines Ll et L2 d'HPV-16.
Des VLPs constituées de la protéine Ll de papillomavirus humain de type 11 (HPV-11), ont été obtenues par transformation de bactéries E. coli avec des plasmides contenant la séquence codant la protéine Ll (Li et al. , 1997). Les auteurs de cet article, ont constaté que ces VLPs obtenues par transformation d'E.coli sont très difficiles à désassembler.
Des VLPs constituées de la protéine Ll , et des VLPs constituées des protéines Ll et L2, des papillomavirus humains de type 33 (HPV-33), ont été obtenues par un procédé intracellulaire comprenant la cotransformation de cellules Cos-7 d'une part avec un plasmide marqueur codant pour la β-galactosidase et, d'autre part, avec le virus de la vaccine en tant que vecteur contenant la séquence codant pour Ll , ou celles codant pour Ll et L2 (Unckell et al. , 1997).
Le taux de l'encapsidation par la méthode intracellulaire susmentionnée, du plasmide contenant la séquence codant pour la β-galactosidase, est très faible, puisque seulement 1 VLP sur 25.000 porte ce plasmide. Par ailleurs, le taux d' infection des cellules Cos-7 par les VLPs porteurs dudit plasmide est également très faible, puisque seulement 1 sur 2.000 VLPs porteuses du plasmide est capable d'infecter une cellule Cos-7.
Enfin, les auteurs de cet article insistent sur le caractère essentiel de la protéine L2 dans le cadre de l'infection des cellules par les VLPs.
Compte tenu des faibles taux d'intégration d'ADN plasmidique dans les VLPs, et d' infection de cellules par ces VLPs, les auteurs de cet article n'ont en aucun cas fait part de la possibilité d'utiliser de telles VLPs en tant que vecteurs de transfert de gènes, et se sont focalisés sur leur utilisation possible dans le cadre de la détection d'anticorps neutralisant contre les infections des papillomavirus.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du fait que les VLPs de papillomavirus sont capables d'intégrer de l'ADN plasmidique avec un taux d'encapsidation bien supérieur à ceux décrits ci-dessus, dans la mesure où cette encapsidation est effectuée par un procédé extracellulaire (c'est-à-dire qui n'est pas effectué à l'intérieur de cellules hôtes), notamment par désassemblage- réassemblage in vitro de ces VLPs en présence de plasmide.
De plus, les Inventeurs ont également mis en évidence que les taux d'infection de cellules par des VLPs porteurs d'ADN plasmidique obtenus selon le procédé extracellulaire d'encapsidation indiqué ci-dessus, sont bien supérieurs à ceux décrits dans l'art antérieur susmentionné, et ce même lorsque lesditεs VLPs sont constituées de la seule protéine Ll .
Un des buts de la présente invention est de fournir de nouveaux vecteurs de transfert de matériel génétique dans des cellules cibles, notamment dans le cadre de la thérapie génique, ou de l' immunisation génique, ces vecteurs étant plus simples à préparer, et plus sûrs à utiliser que les virus vecteurs décrits jusqu'à présent.
Un autre but de la présente invention est celui de fournir un procédé simple de préparation de ces vecteurs de transfert.
Un autre but de la présente invention est celui de fournir de nouvelles compositions pharmaceutiques contenant lesdits vecteurs de transfert, et utilisables en thérapie génique, ou immunisation génique.
Un autre but de la présente invention est celui de fournir de nouveaux réactifs pour la détection d'anticorps neutralisant les papillomavirus, ainsi que de nouveaux kits pour la mise en oeuvre d'une telle méthode de détection.
La présente invention a pour objet l'utilisation de pseudo-particules virales (VLPs) de papillomavirus humains ou animaux, pour la préparation de pseudovirus vecteurs utilisables pour le transfert de matériel génétique d'intérêt thérapeutique, dans des cellules cibles de l'organisme, notamment dans le cadre de thérapie génique ou d' immunisation génique. Avantageusement, les VLPs utilisées dans le cadre de la présente invention, contiennent la protéine Ll , et le cas échéant la protéine L2, des papillomavirus.
Selon un mode préféré de réalisation de l' invention, les VLPs susmentionnées contiennent uniquement la protéine Ll (à savoir que lesdites
VLPs sont formées de capsomères uniquement constitués de protéines Ll).
Par matériel génétique d' intérêt thérapeutique transféré par les pseudovirus vecteurs dans des cellules cibles dans le cadre de la présente invention, on entend toute séquence nucleotidique (ADN ou ARN) hétérologue d'intérêt thérapeutique, à savoir toute séquence susceptible de coder pour une protéine capable de traiter une pathologie déterminée, ou d' immuniser un individu contre une pathologie déterminée, ladite séquence n'étant pas comprise dans le génome naturel des papillomavirus.
Dans le cas particulier du traitement des pathologies dues aux infections par des papillomavirus, notamment des tumeurs associées à ces infections, ou de l' immunisation contre ces infections (et donc de la prévention de ces pathologies), ladite séquence hétérologue peut consister en un fragment du génome des papillomavirus, ou en une séquence nucleotidique dérivée de ce fragment. Par séquence d'ADN hétérologue d'intérêt thérapeutique, on entend notamment : toute séquence d'ADN susceptible de coder pour une protéine dans le cadre de pathologies dans lesquelles ladite protéine est déficiente, toute séquence d'ADN codant pour une protéine agissant en tant que vaccin, toute séquence d'ADN codant pour une protéine agissant en tant qu'anticorps neutralisant des pathogènes, toute séquence d'ADN codant pour une protéine susceptible d' interagir directement ou indirectement avec des protéines impliquées dans le développement de certaines pathologies, toute séquence d'ADN codant pour un ARN antisens susceptible d' inhiber la production d'une protéine impliquée dans le cadre du développement d'une pathologie.
Les cellules cibles dans lesquelles le matériel génétique est transféré dans le cadre de la présente invention, sont toutes cellules susceptibles d'être infectées par des papillomavirus ou des VLPs de ces papillomavirus.
Les pseudovirus vecteurs de l'invention sont soit administrés sous forme de compositions pharmaceutiques, notamment dans les conditions définies ci- après, soit utilisés pour la mise en oeuvre d'un procédé de transformation in vitro de cellules, notamment des cellules d'un patient, les cellules ainsi transformées par les pseudovirus étant ensuite réadministrées au patient.
Avantageusement, les VLPs utilisées dans le cadre de la présente
5 invention, sont telles qu'obtenues par transformation de cellules hôtes avec des vecteurs contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine Ll des papillomavirus et, le cas échéant, une séquence d'ADN codant pour la protéine L2 des papillomavirus, lesdites séquences étant placées sous le contrôle d'un promoteur de transcription, et récupération des VLPs produites dans lesdites ι o cellules hôtes par assemblage des capsomères de protéines Ll et, le cas échéant de protéines L2. Les capsomères susmentionnés résultent eux-mêmes de l'assemblage des protéines Ll , à raison d'environ 5 protéines Ll par capsomère, une VLP étant constituée de 7 capsomères. Dans le cas où les VLPs contiennent à la fois la protéine Ll et la protéine L2, il y a environ 30 protéines L2 par
15 VLP.
Avantageusement encore, les VLPs utilisées dans le cadre de la présente invention, sont telles qu'obtenues par transformation de cellules d' insectes, à titre de cellules hôtes, avec des baculovirus utilisés en tant que vecteurs contenant les séquences d'ADN codant pour la protéine Ll et, le cas échéant la
2û protéine L2, lesdits baculovirus vecteurs étant eux-mêmes obtenus par transformation de ces derniers avec des plasmides contenant lesdites séquences d'ADN codant pour la protéine Ll et, le cas échéant L2, sous le contrôle d'éléments de régulation de leur expression.
Selon un autre mode avantageux de réalisation de l' invention, les VLPs
25 utilisées dans le cadre de la présente invention, sont telles qu'obtenues par transformation de levures ou de cellules de mammifères (telles que les cellules CHO), à titre de cellules hôtes, avec des plasmides utilisés en tant que vecteurs, contenant les séquences d'ADN codant pour la protéine Ll , et le cas échéant la protéine L2, lesdites séquences d'ADN étant placées sous le contrôle d'éléments
30 de régulation de leur expression.
Avantageusement, les VLPs produites dans les cellules hôtes dans le cadre des procédés susmentionnés, sont purifiées à partir des milieux de culture desdites cellules hôtes, généralement après lyse de ces dernières ; parmi les techniques utilisables pour purifier lesdites VLPs à partir de ces surnageants de
35 culture, on peut citer : l'ultracentrifugation en sucrose, isopycnique, ou en gradient de densité (ex CsCl), la précipitation par relargage au polyéthylène glycol (PEG), ou au sulfate d'ammonium, la chromatographie d'exclusion, ou d'échange d'ions, l 'utilisation d' immunoadsorbants, - l' isoélectrofocalisation.
L' invention a également pour objet l'utilisation de VLPs de papillomavirus définies ci-dessus, pour la préparation d'un médicament comprenant des pseudovirus vecteurs tels que définis ci-dessus, ces derniers correspondant auxdites VLPs dans lesquelles une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont encapsidées, lesdits pseudovirus étant. en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ledit médicament étant destiné au traitement ou à la prévention de pathologies, telles que décrites ci-dessus, susceptibles d'être traitées par thérapie génique ou prévenues par immunisation génique. L' invention concerne également tout pseudovirus vecteur de transfert de matériel génétique dans des cellules cibles de l'organisme dans le cadre de la thérapie génique, ou de l'immunisation génique, caractérisé en ce qu' il correspond à une VLP de papillomavirus humains ou animaux, dans laquelle une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont encapsidées.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout pseudovirus vecteur de transfert tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu' il est formé d'une VLP en association avec une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues encapsidées à l' intérieur de cette VLP, ladite VLP comprenant un assemblage de capsomères de protéine Ll , et le cas échéant de protéine L2, de papillomavirus
(notamment dans les proportions indiquées ci-dessus).
Avantageusement, les VLPs formant les pseudovirus susmentionnés, comprennent uniquement la protéine Ll de papillomavirus.
Les pseudovirus vecteurs selon l'invention sont davantage caractérisés en ce que la ou les séquences nucléotidiques hétérologues d' intérêt thérapeutique sont insérées dans un plasmide contenant les éléments nécessaires à la régulation de l'expression de ces séquences d'ADN, la taille maximale dudit plasmide étant d'environ 8 à environ 8,5 kb.
Avantageusement, les pseudovirus vecteurs selon l' invention, sont tels qu'obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique, à l' intérieur desdites VLPs. De préférence, ce procédé extracellulaire d'encapsidation est effectué par désassemblage-reassemblage des VLPs définies ci-dessus, en présence d'un vecteur, notamment d'un plasmide, contenant la (ou les) séquence(s) nucléotidique(s) hétérologue(s) d' intérêt thérapeutique. A ce titre, l' invention vise plus particulièrement tout pseudovirus vecteur tel qu'obtenu par un procédé in vitro de désassemblage-reassemblage des VLPs susmentionnées, ce procédé comprenant les étapes suivantes : désassemblage des VLPs en capsomères, notamment par incubation de ces dernières avec un agent chelateur tel que l'éthylène glycol tétracétate (EGTA), ou l'éthylène diamine tétracétate (EDTA), et d'un agent réducteur tel que le dithiothréitol (DTT), ou le β-mercaptoéthanol, mise en mélange du plasmide contenant la (ou les) séquence(s) d'ADN hétérologue(s) d'intérêt thérapeutique, avantageusement dans un rapport d'une molécule de plasmide pour une molécule de VLP (soit environ lμg de plasmide, pour environ 5μg de VLP), réassemblage des capsomères en VLPs contenant le plasmide susmentionné, notamment par augmentation de la concentration en ions Ca+ + , et addition d'un agent oxydant tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou par toute autre méthode neutralisant l'action de l'agent réducteur susmentionné, notamment par dialyse.
Le cas échéant, le procédé susmentionné comprend une étape de séparation, notamment par des techniques chromatographiques, d'une part des VLPs dans lesquelles lesdites séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont encapsidées et, d'autre part, des VLPs demeurées vides (ne contenant pas lesdites séquences nucléotidiques) après la mise en oeuvre dudit procédé.
L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique
(notamment vaccin), caractérisée en ce qu'elle comprend un pseudovirus vecteur de transfert contenant au moins une séquence d'ADN d' intérêt thérapeutique, et tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
De préférence, les VLPs formant les pseudovirus dans les compositions pharmaceutiques susmentionnées, comprennent uniquement la protéine Ll de papillomavirus. Avantageusement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont davantage caractérisées en ce qu'elles sont administrables par voie orale, intramusculaire, intraveineuse, intradermique, sous-cutanée, nasale, vaginale, dermique, notamment à raison d'environ 10 ng à environ 10 μg de pseudovirus vecteurs par individu et par prise.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de pseudovirus vecteurs correspondant aux VLPs telles que définies ci-dessus, dans lesquelles une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues (notamment des séquences nucléotidiques codant pour des gènes rapporteurs) sont encapsidées, lesdits pseudovirus vecteurs étant obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation, tel que décrit ci-dessus, desdites séquences nucléotidiques hétérologues dans lesdites VLPs, pour la mise en oeuvre d'un procédé de transfert in vitro desdites séquences nucléotidiques hétérologues dans des cellules susceptibles d'être infectées par lesdits pseudovirus vecteurs.
Avantageusement, les VLPs formant les pseudovirus susmentionnés, comprennent uniquement la protéine Ll de papillomavirus.
A ce titre, la présente invention a pour objet tout procédé de transfert in vitro de séquences nucléotidiques hétérologues dans des cellules susceptibles d'être infectées par des pseudovirus vecteurs définis ci-dessus, lesdits pseudo virus étant obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation desdites séquences nucléotidiques hétérologues dans des VLPs de papillomavirus, ce procédé extracellulaire d'encapsidation étant tel que décrit ci- dessus (dans lequel le plasmide contenant la (ou les) séquence(s) nucléotidique(s) hétérologue(s) d'intérêt thérapeutique est remplacé par un plasmide contenant la (ou les) séquence(s) nucléotidique(s) hétérologue(s)), ledit procédé de transfert comprenant une étape d'incubation desdites cellules en présence des pseudovirus vecteurs définis ci-dessus. L'invention concerne également l'utilisation de pseudovirus vecteurs correspondant aux VLPs telles que définies ci-dessus, dans lesquelles au moins un gène rapporteur est encapside, lesdits pseudovirus étant tels qu'obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation, tel que décrit ci-dessus, du ou des gène(s) rapporteurs dans lesdites VLPs, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection d'anticorps neutralisant l'infection des papillomavirus humains ou animaux.
Avantageusement, les VLPs formant les pseudovirus susmentionnés, comprennent uniquement la protéine Ll de papillomavirus.
L'invention a également pour objet un procédé de détection in vitro d'anticorps neutralisant les papillomavirus humains ou animaux comprenant les étapes suivantes : incubation in vitro de pseudovirus vecteurs définis ci-dessus contenant un gène rapporteur, avec des cellules susceptibles d'être infectées par des pseudovirus vecteurs (telles que les cellules HeLa ou Cos-7), en présence d 'anticorps dont le pouvoir neutralisant est testé, lesdits pseudovirus vecteurs étant obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation du (ou des) gène(s) rapporteur(s) dans des VLPs de papillomavirus, ce procédé extracellulaire d'encapsidation étant tel que décrit ci-dessus (dans lequel le plasmide contenant la (ou les) séquence(s) nucléotidique(s) hétérologue(s) d' intérêt thérapeutique, est remplacé par un plasmide contenant le (ou les) gène(s) rapporteur (s)), analyse de l'expression ou non du gène rapporteur à l'intérieur de ces cellules, l'absence d'expression du gène rapporteur dans lesdites cellules étant correlable au fait que les anticorps testés ont neutralisé l' infection des cellules par lesdits pseudovirus, et donc que ces anticorps représentent des anticorps neutralisant susceptibles d'être utilisés dans le cadre du traitement des pathologies dues à l'infection par des papillomavirus.
Parmi les gènes rapporteurs susceptibles d'être utilisés, on peut citer ceux de la β-galactosidase, l'aequorine (GFP), la luciférase, etc ..
L'invention concerne également un kit (ou trousse) pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection tel que décrit ci-dessus, ce kit comprenant : des pseudovirus vecteurs contenant au moins un gène rapporteur, tels qu'obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation, tel que décrit ci- dessus, du ou des gènes rapporteurs dans lesdites VLPs, des cellules susceptibles d'être infectées par lesdits pseudovirus vecteurs, des réactifs nécessaires à la révélation de l'activité codée par le gène rapporteur. L' invention concerne également le procédé décrit ci-dessus de préparation de pseudovirus tels que définis ci-dessus de papillomavirus humains ou animaux susceptibles d'être utilisés en tant que vecteur de transfert de matériel génétique (à savoir de séquences nucléotidiques hétérologues, le cas échéant d'intérêt thérapeutique, telles que définies ci-dessus) dans des cellules cibles, ledit procédé étant effectué par désassemblage-reassemblage in vitro des VLPs susmentionnées et comprend les étapes suivantes : désassemblage des VLPs en capsomères, notamment par incubation de ces dernières avec un agent chelateur tel que l'éthylène glycol tétracétate (EGTA), ou l'éthylène diamine tétracétate (EDTA), et d'un agent réducteur tel que le dithiothréitol (DTT), ou le β-mercaptoéthanol, mise en mélange du plasmide contenant la (ou les) séquence(s) d'ADN hétérologue(s), le cas échéant d' intérêt thérapeutique, avantageusement dans un rapport d 'une molécule de plasmide pour une molécule de VLP (soit environ lμg de plasmide, pour environ 5μg de VLP), réassemblage des capsomères en VLPs contenant le plasmide susmentionné, notamment par augmentation de la concentration en ions Ca + + , et addition d'un agent oxydant tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou par toute autre méthode neutralisant l'action de l'agent réducteur susmentionné, notamment par dialyse, le cas échéant, séparation, notamment par des techniques chromatographiques, d'une part des VLPs dans lesquelles lesdites séquences nucléotidiques hétérologues sont encapsidées et, d'autre part, des VLPs demeurées vides (ne contenant pas lesdites séquences nucléotidiques) après le réassemblage des capsomères en VLPs.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit du procédé de préparation de VLPs telles que définies ci-dessus, contenant une séquence d'ADN hétérologue contenant le gène de la β-galactosidase, ou celui de la protéine fluorescente (GFP), à titre de gènes rapporteurs.
I - Matériels et Méthodes
a) Expression in vitro des VLPs de papillomavirus
Les VLPs du papillomavirus humain de type 16 (HPV-16) sont obtenues par expression du gène Ll de HPV-16 dans le système d'expression du baculovirus selon la méthode décrite dans l'article de Le Cann et al. , 1994, et résumée ci-après : Le gène Ll d'HPV-16 a été amplifié à partir d'un produit pathologique, puis clone dans le vecteur pTAG.
Le gène est ensuite sous-cloné dans le vecteur pBlue Bac III (Invitrogen) dérivé d'un baculovirus spécifique de l' insecte Autographa californica.
Les plasmides sont cotransfectés avec l'ADN du virus sauvage dans des cellules d'insectes, Sf9, Sf21 , ou "high-five" .
Les virus recombinants sont ensuite sélectionnés par dilution limite.
Les cellules de Spodoptera Frugiperda (Sf21) infectées avec le baculovirus recombinant, sont récoltées 4 jours après l'infection et lysées par une solution de Nonidet® P40 dans du PBS pendant 15 mm à température ambiante. La fraction nucléaire est récupérée par centrifugation (10,000 xg, 15 mn,
4°C) et soumise à 3 x 15s aux ultrasons à la puissance maximale (Vibra-cell®, Bioblock Scientific, Strasbourg, France). Le lysat nucléaire est déposé sur un gradient de CsCl. centrifugé à l 'équilibre dans un rotor Beckman® SW 28 (20 h, 27,000 rpm, 4°C) et récolté en fractions de 1 ,5 ml.
La densité et la réactivité des HPV en ELISA ont été vérifiées selon la méthode décrite dans l'article de Touzé et al. , 1996.
Les fractions positives en ELISA qui ont une densité se situant entre 1.27-1 ,30, ont été réunies, diluées dans du PBS et soumises à une ultracentrifugation dans un rotor SW 28 (3 h, 28,000 rpm, 4°C).
Le culot est resuspendu dans du NaCl 0, 15M. Le contenu en protéines a été déterminé en utilisant le test MicroBCA
Pierce®.
b) Plasmides
Deux plasmides portant différents gènes rapporteurs ont été utilisés. pGreenLantern (Life Technologies, Eragny, France) contenant le gène codant pour la protéine fluorescente (GFP) de Aequoria Victoria sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus. pCMV-βgal contenant le gène codant pour la β-galactosidase d'E. coli. Le plasmide pCMV-HBc a été utilisé pour les études d' immunisation. Ce plasmide contient le gène tronqué à l'extrémité 3' de l'antigène du noyau de l'hépatite B sous le contrôle de promoteur CMV.
c) Désassemblage et réassemblage des VLPs d' HPV- 16
Le désassemblage et le réassemblage des VLPs recombinantes d' HPV- 16 ont été réalisés selon une méthode adaptée de celle décrite dans l'article de Colomar et al. , 1993, dans le cadre des virions SV40.
En résumé, les VLPs d' HPV- 16 purifiées à une concentration de 500 μg/ml, sont incubées dans un tampon Tris-HCl à 50 mM (pH 7,5) contenant NaCl 150 mM, EGTA ImM, et DTT 20mM dans un volume final de 50 μl à température ambiante pendant 30 mn. A cette étape, 1 μg de plasmide contenant le gène rapporteur (GFP ou β-gal) dans un tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) et NaCl 150 mM est ajouté aux VLPs désassemblées.
Pour encapsider l'ADN dans les particules virales, la concentration en CaCl2 est ensuite augmentée graduellement jusqu'à 5mM et du DMSO est ajouté (1 % final) (volume final 100 μl). Cette solution est incubée 1 h à 20°C.
Les VLPs reconstituées sont traitées avec 10 U de Benzonase® (Merck, Darmstadt, Allemagne) pendant 1 h à 20°C pour vérifier que l'ADN plasmidique est intégré dans les VLPs, et non pas absorbé à leur surface. d) Expériences de transfection / infection
Les cellules cultivées en monocouche dans du milieu
DMEM/Glutamax® (Life Technologies) complété avec du sérum de veau foetal
(FCS), 10% , de la pénicilline 100 IU/ml et de la streptomycine 100 μg/ml, ont été ensemencées sur des plaques à 6 puits (Nunc, Life Technologies) et cultivées jusqu'à
80 % de confluence. Les cellules ont été lavées deux fois avec du DMEM/Glutamax.
Les pseudo-particules virales pCMV-βgal-VLPs ou pGreenLantern-VLPs dans 1 ml de milieu de culture on été additionnées aux puits et incubées pendant 4 h à 37°C. A cette étape, les VLPs ont été retirées, et 3 ml de DMEM/Glutamax complété avec du FCS 10 % ont été additionnés.
A titre de témoin positif, des cellules ont été transfectées en utilisant la même quantité d'ADN (1 μg) avec 10 μl d'un liposome, la lipofectamine® (Life Technologies) selon les instructions du fabricant. Après 4 h d'incubation à 37 °C, 2 ml de milieu de culture contenant du sérum foetal de boeuf ont été additionnés. Puis les cellules ont été incubées pendant 48 h à 37°C.
A ce stade, les activités GFP ou β-galactosidase des cellules ont été analysées. Pour les expériences de neutralisation, des virus artificiels ont été préincubés pendant 30 mm à 37 °C avec du PBS contenant un antisérum de souris anti-HPV16-VLPs dilué au 1/100. Cet antisérum a été obtenu par immunisation sous- cutanée de souris avec 5 μg de VLPs d 'HPV- 16 absorbés sur AIOH3 en tant qu'adjuvant.
e) Lignées cellulaires
Huit lignées cellulaires ont été utilisées pour ces expériences.
Trois lignées cellulaires humaines comprenant MRC5 (poumon), HeLa (col de l'utérus) et CaCo2 (colon).
Les cellules embryonnaires NIH 3T3 provenant de souris et 4 autres lignées cellulaires animales comprenant les cellules Vero et Cos-7 (singe, rein), MDCK (chien, rein) et CHO (hamster, ovaire), ont été utilisées.
f) Détection de l'activité du gène rapporteur
Pour la détermination de l'activité β-galactosidase in situ, les cellules ont été lavées avec du PBS et fixées pendant 10 mm à température ambiante avec une solution de formaline 2 % -glutaraldéhyde 0,2 % dans du PBS pour la détection de la β-galactosidase. Après trois lavages avec du PBS, les cellules ont été exposées à 1 ml d'une solution de PBS contenant K3Fe(CN)6 4mM, K4Fe(CN)6 3H20 4 mM, MgCh 2 mM. Tris 100 mM (pH 7,4) et 1 mg/ml de X-gal à 37 °C, pour l'expression de la β- galactosidase. Après le développement de la coloration (2-4 h), les cellules ont été lavées avec du PBS et observées.
La détermination quantitative de la β-galactosidase produite dans les lignées cellulaires transfectées a été testée par une méthode ELISA-β-gal (Boehringer,
Mannheim, Dassel, Allemagne) selon les instructions du fabricant. En résumé, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS, 48 h après la transfection. Les cellules ont été lysées et, après centrifugation, le contenu en protéines total des surnageants a été déterminé en utilisant la méthode Bradford et ajusté à une concentration de 500 μg/ml avant de tester la présence de β-galactosidase.
Des échantillons du surnageant ont ensuite été additionnés aux puits d'une microplaque de 96 puits préenduite avec un anticorps anti-β-galactosidase.
Après une heure d'incubation à 37 °C, les puits ont été lavés et une immunoglobuline anti-β-galactosidase d 'E.coli conjuguée à la digoxigénine a été additionnée.
Après une deuxième incubation d'une heure à 37°C et trois lavages, les anticorps spécifiquement liés ont été détectés par incubation d'une heure à 37 °C avec une immunoglobuline anti-digoxigénine conjuguée à la peroxydase du raifort.
Après trois lavages, une solution d'ABTS a été additionnée et les densités optiques ont été lues à 405 nm après une incubation de 20 mn à température ambiante. La concentration de β-galactosidase (pg/ml) a été déterminée par rapport à une courbe d'étalonnage.
Pour la détermination de l'activité GFP, le nombre de cellules fluorescentes et non fluorescentes a été déterminé en utilisant la cytométrie en flux FAC Scan pour mesurer l'expression de la protéine GFP.
A cet effet, les cellules ont été traitées par la trypsine, centrifugées et resuspendues dans 1 ml de milieu de culture. Les cellules ont été analysées à l'aide d'un cytometre en flux FAC Sort (Becton-Dickinson, Montain View, CA, USA). Par ailleurs, les cellules ont été directement observées à l'aide d'un microscope à fluorescence et photographiées directement.
g) Etude d ' immunisation
Des souris femelles BALB/c (H-2^), âgées de 12 à 16 semaines, ont été gardées dans des conditions exemptes de pathogènes durant le protocole d' immunisation. Les souris BALB/c ont reçu deux injections de 5 μg de VLPs d' HPV- 16 reconstituées contenant le plasmide pCMV-HBc dans le muscle Tibialis anterior à deux semaines d' intervalle.
Deux groupes de souris de contrôle ont reçu 100 μg du plasmide pCMV- HBc au même endroit, avec ou sans cardiotoxine, 5 jours avant l' injection vaccinante, et un groupe de souris de contrôle a reçu 5 μg de HBcAg recombinant purifié.
L'injection intramusculaire de 100 μl de cardiotoxine 10 mM a été réalisée de façon à augmenter la capture de l'ADN plasmidique par les cellules musculaires. Des échantillons de sang ont été recueillis à chaque injection vaccinante et 15 jours après la seconde.
L'HBcAg recombinant assemblé au VLPs a été purifié à partir des cellules d' insectes infectées avec un baculovirus recombinant codant le gène HBc.
h) Détection des anticorps anti-HBc et anti-HPV16
Les anticorps dirigés contre les VLPs d'HBcAg et d 'HPV- 16, ont été étudiés suivant les techniques ELISA.
Les VLPs d'HPV-16 ou d'HBcAg (100 mg/puits) dans du PBS (pH 7,4) ont été incubées une nuit à 4°C. Après 4 lavages avec du PBS-Tween 20 0, 1 % , les sites de liaison non spécifiques ont été bloqués par incubation pendant 30 mn à 37 °C avec du PBS-NBS 1 % (sérum de nouveau-né bovin).
La solution bloquante a été remplacée par 100 μl de sérum de souris dilué deux fois dans 5xPBS contenant du NBS 10 % et du Tween 20 2 % . Après incubation à 45 °C pendant 90 mm, et 4 lavages, les anticorps liés ont été détectés avec une immunoglobuline anti-souris liée de façon covalente à la peroxydase de raifort (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France).
Après incubation à 45 °C pendant 90 mm, et 4 lavages, la solution de substrat contenant de l'o-phénylène diamine et H2O2 a été additionnée. La réaction est arrêtée après 30 mn par addition d'H2S04 4N et les densités optiques (492 nm) ont été lues avec un lecteur automatique (Microplate reader EL 311 , Bioteck Instruments).
Les titres ou anticorps correspondent à l' inverse de la dernière dilution de sérum donnant un résultat positif (DO supérieur à 0, 1). Les résultats sont exprimés en moyenne géométrique de titres calculée à partir des différents titres obtenus à partir de chaque souris de chaque groupe. II - Résultats
a) Désassemblage - réassemblage des VLPs de papillomavirus
Les VLPs d'HPV-16 ont été produites dans des cellules d' insectes Sf21 en utilisant un baculovirus recombinant.
Les VLPs ont été purifiées par ultracentrifugation en sucrose, puis en gradient de CsCl (Le Cann et al. , 1994).
Les fractions du gradient de CsCl contenant les VLPs ont été regroupées, diluées dans du PBS puis ultracentrifugées.
Le culot est ensuite resuspendu dans un tampon contenant EGTA et DTT et incubé à température ambiante pendant 30 mn. Dans ces conditions, les VLPs sont complètement désagrégées en structures ressemblant aux capsomères.
L'ADN plasmidique est alors ajouté et la préparation est diluée dans un tampon contenant une forte concentration en calcium et du DMSO 1 % de manière à reformer les VLPs. Environ 75 % des protéines Ll semblent se réassembler en VLPs dans ces conditions.
b) Transfert in vitro d'ADN plasmidique par l'intermédiaire des VLPs de papillomavirus
Les cellules HeLa ont été étudiées pour leur sensibilité aux VLPs- pGreenLantern. La fluorescence de la protéine GFP, produite dans les cellules transfectées a été analysée par cytométrie en flux. 70 % des cellules HeLa transfectées par le plasmide pGreenLantern encapside dans les VLPs sont fluorescentes (Tableau 1).
En comparaison, aucune cellule fluorescente n'a été trouvée lorsque les cellules sont incubées avec l'ADN plasmidique seul, ou avec le plasmide et la protéine Ll assemblée en capsomères, et 40 % des cellules sont fluorescentes lorsqu'elles sont traitées avec le plasmide pGreenLantern et la lipofectamine®. La spécificité du transfert par les VLPs a de plus été démontrée par le fait que des anticorps anti-VLPs d 'HPV- 16 bloquent complètement le transfert de gènes et que le traitement par la Benzonase n'affecte pas le transfert. Les capsomères libres ne peuvent pas agir en tant que vecteurs pour le transfert de gènes. De plus, aucun transfert de gène n'a pu être identifié avec 0,5 μg de VLPs-pGreenLantern lorsque les cellules HeLa ont été incubées avec 10 μg (excès de 20 fois) de VLPs d'HPV-16 vides (Tableau 1). Tableau 1 :
Transfert du gène de la GFP par les pseudo-particules virales de VPH-16 mise en évidence et spécificité
Figure imgf000018_0001
Le transfert de l'ADN de pCMV-βgal a également été étudié.
Les résultats montrent que les deux plasmides ont été transfectés avec la même efficacité et la proportion des cellules transfectées est similaire à celle évaluée par cytométrie en flux.
L'expression de la β-galactosidase a été mesurée par ELISA dans le lysat cellulaire. Les résultats indiquent que le niveau d'expression correspond avec la quantité de pCMV-βgal -VLPs utilisée. Une augmentation du niveau d'expression de la β-galactosidase d'environ 100, a été observée entre des concentrations de vecteur VLP de 1 à 10 μg.
Huit lignées cellulaires ont été étudiées pour leur capacité à être transfectées par le plasmide pCMV-βgal encapside dans les VLPs d' HPV- 16.
Les résultats (Tableau 2) montrent que toutes les lignées cellulaires peuvent être transfectées par ce vecteur et que le niveau d'expression β-gal obtenu est généralement 3 à 6 fois plus élevé que celui observé après transfection des mêmes cellules par lipofection. Toutefois, le niveau d'expression de la β-galactosidase varie de 102 pg/ml dans les cellules Vero à 2253 pg/ml dans les cellules CaCo2. Tableau 2 :
Efficacité du transfert de gène médié par les pseudo-particules virales dans différentes lignées cellulaires animales et humaines
Figure imgf000019_0001
c) Réponse immune humorale chez les souris immunisées avec l'ADN de pCMV-HBc encapside à l'intérieur des VLPs d' HPV- 16 L'immunisation par l'ADN a été étudiée chez les souris BALB/c, en utilisant le plasmide pCMV-HBc codant pour l'antigène du noyau de l'hépatite B comme application possible du transfert de gène au moyen d'un gène encapside dans les VLPs d 'HPV- 16.
Les résultats de deux injections intramusculaires de 5 μg de pCMV-HBc- HPV-VLPs dans un intervalle de deux semaines ont été comparés à ceux obtenus par injection intramusculaire de 100 μg d'ADN plasmidique seul, et à ceux obtenus par injection intramusculaire de 5 μg de VLPs d'HBc produites dans les cellules Sf21 avec un baculovirus recombinant.
Les anticorps anti-HBc ont été observés chez tous les animaux immunisés. Toutefois, le titre anti-HBc (20, 138) est plus élevé chez les souris immunisées avec pCMV-HBc encapside à l'intérieur des VLPs d'HPV, que chez les souris immunisées avec pCMV-HBc seul (1 ,000 à 1 ,600), et plus élevé que le titre
(6,400) observé par injection intra-musculaire de capsides HBc.
Des anticorps anti-HPV-16 n'ont pas été détectés chez les souris immunisées avec les VLPs d'HBc ou avec l'ADN d'HBc, mais sont présents à un titre du 800 chez les souris immunisées avec les VLPs d'HPV contenant l'ADN d 'HBc après la deuxième injection. Le niveau d'anticorps anti-HPV-16 est toutefois beaucoup plus faible que celui observé chez les souris immunisées avec 5 μg de VLPs d'HPV absorbées sur Al(OH)3 en tant qu'adjuvant, chez lesquelles les titres anti-VLP atteignent 30,000 à 70,000.
III- Conclusion
Les VLPs de protéine Ll d'HPV-16, obtenues par expression de la protéine majeure de capside du papillomavirus humain de type 16 dans des cellules d' insectes, peuvent encapsider un plasmide portant soit un gène pour la protéine GFP, soit un gène pour la β-galactosidase lors du déassemblage-réassemblage in vitro des VLPs. L' introduction du plasmide dans différentes cellules par ces pseudovirions ou virus artificiels, est facilement détectée par l'accumulation du produit du gène, et le nombre de cellules porteuses du gène est fonction de la concentration en VLPs d'HPV- 16 dans l'expérience de transfert.
La mise en évidence de l'encapsidation du plasmide plutôt qu'une association entre le plasmide et la protéine Ll est basée sur la résistance à la
Benzonase® du transfert d'ADN médié par les VLPs à l'intérieur des cellules.
L'efficacité du transfert de gène par les VLPs excède considérablement celle obtenue par le phosphate de calcium ou la transfection lipidique.
Par opposition aux résultats obtenus par d'autres équipes (Zhou et al. , 1994 ; Roden et al. , 1996 ; Unckell et al. , 1997), les résultats présentés ici indiquent que la protéine L2 d'HPV n'est pas nécessaire pour une encapsidation efficace de l'ADN, ni pour son transfert dans une cellule hôte. De plus, le transfert du gène est 10- à 10^ fois plus efficace qu'avec les systèmes décrits par ces auteurs.
D'après les résultats obtenus, entre environ 1/3 et 1/6 des VLPs d'HPV- 16 contiennent un plasmide, ces proportions étant en corrélation avec le nombre de
VLPs trouvé dans la fraction lourde des gradients de CsCl. On peut comparer ces proportions à celles de 1/25 000 VLPs d'HPV-33 exprimées dans les cellules Cos-7 contenant des copies multiples d'un marqueur plasmidique. décrites dans l'article d'Unckell et al. , susmentionné. Si l'on considère que les VLPs ont 72 capsomères, chaque capsomère étant un pentamère de Ll et que les VLPs représentent 50% du contenu en protéines de la préparation, il a été calculé que 150 VLPs par cellules sont utilisées lors des expériences de transfection. Lors des expériences de transfection des cellules HeLa par pCMV-βgal ci-dessus, on peut estimer que 6000 VLPs par cellules sont nécessaires pour observer l 'expression de β-galactosidase, tandis que l'article Unckell et al fait état de 5x10^ VLPs par cellule. Si l'on considère que 1 VLP sur 6 contient le plasmide, on peut calculer que 1 sur 1000 VLPs contenant le plasmide est capable de transfecter le plasmide pCMV-βgal dans les cellules HeLa.
Le transfert de gène a été spécifiquement inhibé soit par préincubation des VLPs avec un antisérum anti-VLP, soit par compétition avec des VLPs d'HPV- 16 vides. Par conséquent, les pseudovirions d'HPV décrits ici représentent également un système utile pour la détection d'anticorps neutralisant anti-papillomavirus.
L'utilisation des VLPs pour le transfert de gènes présente des avantages par rapport à l'utilisation des virus rεcombinants. La production de tels pseudovirions est beaucoup plus facile que celle des vecteurs viraux usuels, et le risque d'induction d'anticorps neutralisant est plus faible. De plus, ces pseudovirions sont plus sûrs d'utilisation car aucune recombinaison avec un virus sauvage n'est possible, puisqu'ils ne contiennent pas de séquence d'ADN de papillomavirus. 5
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Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Utilisation de pseudo-particules virales (VLPs) de papillomavirus
^ humains ou animaux, pour la préparation de pseudovirus vecteurs utilisables pour le transfert de matériel génétique d' intérêt thérapeutique dans des cellules cibles de l'organisme, en particulier dans le cadre d'une thérapie génique, ou d'une immunisation génique.
0 2. Utilisation selon la revendication 1 , de VLPs contenant la protéine
Ll , et le cas échéant la protéine L2, des papillomavirus.
3. Utilisation de VLPs de papillomavirus définies dans les revendications 1 ou 2, pour la préparation d'un médicament comprenant des 5 pseudovirus vecteurs correspondant auxdites VLPs dans lesquelles une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont encapsidées, lesdits pseudovirus étant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ledit médicament étant destiné au traitement ou à la prévention de pathologies, telles que décrites ci-dessus, susceptibles d'être 0 traitées par thérapie génique ou d'être prévenues par immunisation génique.
4. Pseudo virus vecteur de transfert de matériel génétique dans des cellules cibles de l'organisme dans le cadre de la thérapie génique, ou de l' immunisation génique, caractérisé en ce qu' il correspond à une VLP de 5 papillomavirus humains ou animaux, dans laquelle une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique sont encapsidées.
5. Pseudovirus vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce que les VLPs contiennent la protéine Ll et, le cas échéant, la protéine L2, des 0 papillomavirus.
6. Pseudovirus vecteur selon la revendication 4 ou 5 , tel qu'obtenu par un procédé extracellulaire d'encapsidation d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues d'intérêt thérapeutique à l' intérieur des VLPs,
35 notamment par un procédé de désassemblage-reassemblage in vitro des VLPs, en présence d'un plasmide contenant la (ou les) séquence(s) d'ADN hétérologue(s) d'intérêt thérapeutique.
7. Pseudovirus vecteur selon la revendication 6, tel qu'obtenu par un procédé de désassemblage-reassemblage in vitro des VLPs comprenant les étapes suivantes : désassemblage des VLPs en capsomères, notamment par incubation de ces dernières avec un agent chelateur tel que l'éthylène glycol tétracétate
(EGTA), ou l'éthylène diamine tétracétate (EDTA), et d 'un agent réducteur tel que le dithiothréitol (DTT), ou le β-mercaptoéthanol, mise en mélange du plasmide contenant la (ou les) séquence(s) d'ADN hétérologue(s) d' intérêt thérapeutique, avantageusement dans un rapport d'une molécule de plasmide pour une molécule de VLP (soit environ lμg de plasmide, pour environ 5μg de VLP), réassemblage des capsomères en VLPs contenant le plasmide susmentionné, notamment par augmentation de la concentration en ions Ca+ + , et addition d'un agent oxydant tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou par toute autre méthode neutralisant l'action de l'agent réducteur susmentionné, notamment par dialyse.
8. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un pseudovirus vecteur selon l'une des revendications 4 à 7, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
9. Utilisation de pseudovirus vecteurs correspondant aux VLPs contenant la protéine Ll et, le cas échéant, de la protéine L2, des papillomavirus humains ou animaux, dans lesquelles une ou plusieurs séquences nucléotidiques hétérologues (notamment des séquences nucléotidiques codant pour des gènes rapporteurs) sont encapsidées, lesdits pseudovirus vecteurs étant obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation desdites séquences nucléotidiques hétérologues dans lesdites VLPs, pour la mise en oeuvre d'un procédé de transfert in vitro desdites séquences nucléotidiques hétérologues dans des cellules susceptibles d'être infectées par lesdits pseudovirus vecteurs.
10. Utilisation de pseudovirus vecteurs correspondant aux VLPs contenant la protéine Ll et, le cas échéant, de la protéine L2, des papillomavirus humains ou animaux, dans lesquelles au moins un gène rapporteur est encapside, lesdits pseudovirus étant tels qu'obtenus par un procédé extracellulaire d'encapsidation du (ou des) gène(s) rapporteur(s) dans lesdites VLPs, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection d'anticorps neutralisant l'infection des papillomavirus humains ou animaux.
11. Procédé de préparation de pseudovirus de papillomavirus humains et animaux, lesdits pseudovirus étant susceptibles d'être utilisés en tant que vecteur de transfert de matériel génétique dans des cellules cibles, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : désassemblage des VLPs en capsomères, notamment par incubation de ces dernières avec un agent chelateur tel que l'éthylène glycol tétracétate (EGTA), ou l'éthylène diamine tétracétate (EDTA), et d'un agent réducteur tel que le dithiothréitol (DTT), ou le β-mercaptoéthanol, - mise en mélange du plasmide contenant la (ou les) séquence(s) d'ADN hétérologue(s), le cas échéant d'intérêt thérapeutique, avantageusement dans un rapport d'une molécule de plasmide pour une molécule de VLP (soit environ lμg de plasmide, pour environ 5μg de VLP), réassemblage des capsomères en VLPs contenant le plasmide susmentionné, notamment par augmentation de la concentration en ions Ca+ + , et addition d'un agent oxydant tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou par toute autre méthode neutralisant l'action de l'agent réducteur susmentionné, notamment par dialyse.
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