WO1997046693A1 - Pseudo-particules virales utiles en tant que vecteur de delivrance d'acide nucleique - Google Patents

Pseudo-particules virales utiles en tant que vecteur de delivrance d'acide nucleique Download PDF

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WO1997046693A1
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Marie-Aline Bloch
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Pasteur Merieux Serums Et Vaccins
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    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]

Definitions

  • the subject of the invention is new vectors for delivering genetic material for i.a. use. in gene therapy, immunotherapy or as a therapeutic or prophylactic vaccine.
  • the transfer of genetic material can be carried out according to various operating methods which, for the best known, are (i) transfer by viral vectors, (ii) transfer via encapsulation in liposomes or the like, (iii) transfer mediated by facilitating agents such as cationic lipids, gold beads or calcium phosphate and (iv) transfer by simple injection of naked DNA, i.e. -to say devoid of any other element which can enter into interaction or cooperation with DNA in order to promote its transfer
  • viral vectors such as the vaccine vectors are particularly suitable
  • vaccine vectors may be suitable.
  • the latter will be preferred to retroviral vectors, in particular for preventive vaccination.
  • the papillomavirus capsids can be reconstituted in vitro, in the presence of heterologous DNA or RNA, and that this genetic material is effectively encapsulated therein.
  • the capsids commonly called VLPs for virus-like particles, can be used as a vehicle for the transfer of genetic material, with various applications.
  • Papillomaviruses are small, non-enveloped DNA viruses of icosahedral structure. Their genome codes for up to eight early proteins and two late proteins. The open reading frames are listed from El to E7 without forgetting Ll and L2. The early genes (E for early) are associated with viral replication and cell transformation functions.
  • the papillomavirus capsids are made up of the two proteins L, and L 2 (L for late proteins), L being the major constituent A detailed information can be found in Virology, Second Ed by BN Fieids, Raven Press (1990)
  • VLPs imitating in all points the capsids of native virions can be obtained by recombinant expression either of L, only, or of L, + L 2 , in the vaccine system (Hagensee et al, J Virol (1993) 67 315) or in the baculovirus system (Kirnbauer et al, PNAS (1992) 89 12180, Kirnbauer et al, J Virol (1993) 67 6929, Rose et al, J. Virol (1993) 67 1936, Le Cann et al, FEMS Microbiol Lett (1994 ) 117.269)
  • VLPs adopt a native conformation and react with neutralizing antibodies known to recognize conformational epitopes present in native virions, it has already been suggested to use these VLPs as a vaccine against papillomavirus infections (WO 94/5792)
  • HPV human papillomaviruses
  • bovine papillomaviruses and human papillomaviruses HPV
  • different types of HPV are the cause of various diseases
  • Types 1, 2, 3, 4, 7, 10, and 26 - 29 are the cause of benign warts
  • Types 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 -25, 36, and 46 - 50 can induce lesions in immunologically deficient individuals
  • Types 6, 1 1, 34, 39, 41 - 44 and 51 - 55 are responsible for dysplasias or non-malignant warts genital and respiratory mucosa; in rare cases, some of these types can be found in invasive carcinomas
  • types 16 and 18 and to a lesser extent 31, 33, 35 and 45 cause epithelial dysplasias of the genital mucosa and are very widely associated with majority of invasive carcinomas
  • the present invention provides, for its part, non-infectious papillomavirus viral pseudo-particles (VLPs) which comprise a capsid delimiting an internal space and a nucleic acid molecule contained in this internal space; the molecule nucleic acid being different from the genome of a papillomavirus at least in that it is devoid of all or part of the regions of said genome coding for late wild type proteins
  • VLPs viral pseudo-particles
  • the capsid is mainly formed by all or part of an L1 protein or by all or part of an L1 protein and all or part of an L2 protein.
  • L1 protein a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is a protein that is mainly formed by all or part of an L1 protein or by all or part of an L1 protein and all or part of an L2 protein.
  • HPV HPV from which the proteins Ll and L2 can be derived
  • types 1, 6, 10, 1 1, 16, 18, 31, 33, 35 or 45 there are in particular types 1, 6, 10, 1 1, 16, 18, 31, 33, 35 or 45
  • the sequence of the L1 protein in use for the purposes of the invention is identical to that of the L1 protein which is present in the papillomavirus when the latter is initially isolated from a benign lesion (eg condyloma acuminatum or cervical dysplasia) Indeed, it seems that at the stage of a benign lesion, the papillomavirus can always replicate freely in the state of complete virion, while in the malignant stage, the virus would have this function altered in particular due to a mutation which would have intervened at the level of the ORF coding for LL This mutation would prevent inter alia the formation of capsids
  • the sequence of a protein L l of type 16 coming from a HPV isolated with starting from a condyloma is disclosed in the sequence identifier No.
  • amino acid in position 202 is an amino acid other than histidine i.e. an aspartic acid or glutamic acid residue
  • L2 protein this can optionally be deleted from its DNA binding site, in order to promote the elimination of any trace of DNA during the purification of the elements necessary for the implementation of the VLPs according to the invention In practice, this involves deleting or modifying one or more of the first 12 amino acids of the N-terminal end.
  • L2 proteins are in particular described in WO 95/20659 and Zhou et al, J Virol (1994) 68,619
  • the capsid may consist of one or more hybrid proteins (fusion proteins) corresponding to chimeras Ll - E6, Ll - E7, L2 - E6, L2 - E7 or any other form of chimera in which at least part of an L1 or L2 protein is found associated with a peptide or polypeptide heterologous to L1 or L2, for example a gag peptide from HIV (human immunodeficiency virus) to form such hybrids, several types of association are theoretically possible
  • the insertion in the sequence of the L1 or L2 protein can be carried out by preserving the entire L1 or L2 sequence or else by deleting a certain part thereof Obviously, the construction of appropriate expression cassettes (by genetic fusion) coding for these hybrid proteins will preside over the obtaining of these proteins
  • the element or elements constituting the capsid can be produced in recombinant systems, bacteria, yeast, mammalian or insect cells.
  • WO 95/31476 deals with the expression and the purification of a L1 protein in and from ⁇ " . coli
  • the expression and purification in and from yeast, L l proteins of HPV-6a, -1 1, -16 and -18 is described in WO 95 / 31532, as well as the co-expression and co-purification of these same proteins with the corresponding L2 proteins.
  • L 1 protein or of the type 16 and L1 and L2 proteins in mammalian cells, using of a vaccinia vector, is described in WO 93/2184 and Zhou et al, Virology (1991) J_85 .
  • L1 protein type 1 1, 16 and 18, in the same system is reported by WO 94/20137 and Rose et al, J Virol. (1993) 67 1936
  • L1 protein type 1 1, 16 and 18 is reported by WO 94/20137 and Rose et al, J Virol. (1993) 67 1936
  • the development of a recombinant system intended for the expression of an L1 protein or of the L1 and L2 proteins is clearly within the reach of those skilled in the art.
  • these proteins When these proteins are produced in a prokaryotic system, they generally remain in the dissociated state after purification. There is no formation of VLPs unless these proteins are subjected to a specific renaturation treatment and even in this case, the yield remains very weak
  • VLPs will be placed in alkaline pH or a reducing agent such as dithiothreitol (DTT) will be used
  • DTT dithiothreitol
  • EGTA ethylene glycol-bis (beta-aminoethyl ether) - N, N, N ', N'- tetraacetic acid
  • the encapsulated nucleic acid may be RNA or DNA, the latter will be preferred above all.
  • the size of the molecule is not critical, it is however indicated that it is preferable that '' it does not exceed more than 8 kbp, at least with regard to DNA
  • a nucleic acid molecule useful for the purposes of the present invention must be different from the papillomavirus genome, although it may contain certain elements thereof.
  • this molecule does not have the structure of a papillomavirus genome and does not contain origin of specific replication of a papillomavirus
  • the DNA can be in linear or circular form, the latter form being preferred.
  • it will be a plasmid. This will be integrative or not, depending on the goal sought. Similarly, it may or may not replicate in a cell. mammal For production purposes, it will have an origin of replication eg prokaryote
  • the DNA molecule eg the plasmid, can optionally include a site which allows it to bind to the E2 protein of a papillomavirus. Such a site may have as sequence the formula ACCN 6 MT in which N is independently A, G, C or T and
  • M is G or T.
  • the DNA molecule can also contain all or part of the long control region (CSF) of the genome of a papillomavirus
  • this DNA (or RNA) molecule comprises a coding region placed under the control of an appropriate promoter.
  • an appropriate promoter By way of example, mention is made of the early promoter of the human cytomegalovirus, especially described in American patent USP 5,168,062 or a tissue-specific promoter such as the promoter of the gene coding for human desmin (Li et al, Gene (1989) 78: 243 and Li et al, Development (1993) JJ7: 947)
  • VLPs can be used as a vaccination agent against parasitic, bacterial or viral infections.
  • the peptide or polypeptide or the protein will be selected from the parasitic, bacterial or viral antigens.
  • the VLPs according to the invention is chosen to use as a therapeutic or preventive vaccination agent, against papillomavirus infections.
  • the peptide (s), polypeptide (s) or protein (s) encoded will be (will) advantageously be selected from all or part of the proteins E1 and E2 and non-oncogenic forms of the proteins E6 and E7 of a papillomavirus; preferably an HPV of type 16, 18, 31, 33, 35 or 45.
  • This papillomavirus may possibly be of a different type from that from which the capsid protein (s) is (are) derived.
  • Non-oncogenic forms include the E6 and E7 proteins of a non-oncogenic papillomavirus as well as the deleted forms of an E6 or E7 protein of an oncogenic papillomavirus.
  • a deleted form of an E6 protein does not contain all or part of the E6 region between amino acid residues 106 and 1 15 (for example, it may be an HPV-16 E6 ⁇ protein (106-1 10) or ⁇ (111-115) or ⁇ (106-115)).
  • a deleted form of an E7 protein does not contain all or part of the E7 region between amino acid residues 20 and 26 (for example, it may be an HPV-16 E7 ⁇ protein ( 21-24) or ⁇ (21-26)).
  • VLPs according to the invention can also consider using the VLPs according to the invention as an agent for vaccination against tumors induced by self antigens, preventively or therapeutically.
  • antigens associated with tumors there are in particular tyrosinase, glycoprotein gplOO, the family of proteins MAGE, CEA, ras protein, mutated or not, protein p53, mutated or not, Mucl and pSA
  • VLPs according to the invention could also be of great utility for delivering iii vivo cytokines or accessory molecules having an immunomodulatory function (eg cellular recognition by T-helper cells), in all the applications where these molecules are prescribed.
  • cytokines we notably mention interleukin-2 (IL-2), IL-4, -5, -7, -10, - 12, GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor), interferon gamma (IFN-gamma) and TGF- beta (tumor growth factor-beta)
  • IL-2 interleukin-2
  • IL-4 IL-4
  • -5, -7, -10 - 12
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • IFN-gamma interferon gamma
  • TGF- beta tumor growth factor-beta
  • a nucleic acid molecule useful for the purposes of the present invention may not only include a region coding for an antigen of an infectious agent
  • VLPs according to the invention may be useful in therapy as an element in the treatment of various pathologies such as tumors or auto diseases. -immune or even to prevent rejection after transplantation
  • VLPs according to the invention can also be useful in the treatment of genetic diseases.
  • a nucleic acid molecule is prepared comprising at least one region coding for a protein of interest correcting a genetic defect, such as factor VIII to treat hemophilia dystrophin to treat Duchennc muscular dystrophy (myopathy) or CFTR protein (cystic fibrosis transmembrane regulator) to treat cystic fibrosis
  • factor VIII to treat hemophilia dystrophin to treat Duchennc muscular dystrophy (myopathy)
  • CFTR protein cystic fibrosis transmembrane regulator
  • a pharmaceutical composition comprising, as active principle, at least one VLP according to the invention in combination with a diluent or a pharmaceutically acceptable carrier,
  • a pharmaceutical composition comprising at least two VLPs, in which a first VLP comprises a capsid constituted at least by all or part of the L1 protein of a first type, such as type 16 and in which a second
  • VLP comprises a capsid constituted at least by all or part of the protein L l of a second type different from the first type, such as type 18
  • VLP VLP according to the invention, in the preparation of a medicament intended for the prevention or treatment of a bacterial infection or viral, a tumor ia induced by a self-antigen or an autoimmune disease or even, intended for the prevention of transplant rejection,
  • a composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • at least one VLP is combined with a diluent or a support which is acceptable from a pharmaceutical point of view.
  • diluents or supports as well as formulation methods are indicated in Remington's Pharmaceutical Sciences The formulation may depend on the route of administration, aerosol, injectable formulation, suppositories, tablets, etc.
  • a composition according to the invention can be administered by any conventional route in use in the field of vaccines, when this composition is intended for this purpose. It is in particular the systemic routes eg subcutaneous, intra-dermal route, intramuscular or intravenous, and mucosal routes eg oral, nasal, pulmonary or anogenital When it comes to treating solid tumors, the previously stated routes remain in use and one can also add the intra-tumor route When it comes to treating genetic diseases, the choice of route of administration will essentially depend on the nature of the disease, for example the pulmonary route will advantageously be used in the case of cystic fibrosis (VLPs being formulated as an aerosol) or the intravenous route in the case of hemophilia.
  • VLPs cystic fibrosis
  • Administration can take place in a single dose or repeated once or several times after a certain interval interval
  • the appropriate dosage varies depending on various parameters, for example of the individual treated or the mode of administration.
  • a dose comprises from 1 to 250 ⁇ g of VLPs according to the invention.
  • the invention also relates to a process for preparing VLPs according to the invention, according to which a nucleic acid molecule defined as above is mixed with all or part of the L1 protein of a papillomavirus in dissociated form and so optional, all or part of the L2 protein of a papillomavirus, in the presence of an agent allowing the reassociation of the L l protein (or of the L l and L2 proteins) in the form of a capsid, eg a calcium salt, and recovers from the mixture, said VLPs.
  • a nucleic acid molecule defined as above is mixed with all or part of the L1 protein of a papillomavirus in dissociated form and so optional, all or part of the L2 protein of a papillomavirus, in the presence of an agent allowing the reassociation of the L l protein (or of the L l and L2 proteins) in the form of a capsid, eg a calcium salt, and
  • this aura protein was produced recombinantly, in a prokaryotic (bacteria) or eukaryotic system (i.e. yeasts, insect cells).
  • L1 protein Prior to the mixing stage, it is advantageous to express all or part of the L1 protein, optionally all or part of the L2 protein, recombinantly in a eukaryotic host cell.
  • empty pseudo-particles are recovered, and they are treated with a reducing agent and / or with a calcium ion chelating agent, to obtain all or part of the L1 protein, optionally all or part of the L2 protein, in dissociated form.
  • all or part of the L protein is expressed recombinantly in insect cells infected with a baculovirus into the genome of which is inserted a DNA fragment coding for all or part of the L protein, optionally for all or part of the L 2 protein, placed under the control of an appropriate promoter
  • VLPs according to the invention When the VLPs according to the invention are used in long-term treatments, such as for example in the treatment of cancer, the repeated administration of the same type of VLPs (that is to say VLPs having the even capsid) can be troublesome from an immunological point of view.
  • VLPs having different capsids For example, we can prepare a whole range of VLPs having the same nucleic acid molecule (having a region coding eg for IL-2 or IL-12) but differing by the type of papillomavirus from which the L1 protein is derived. and, optionally, the E2 protein. So we will use consecutively, type 16 capsid VLPs (one or more times), then type 18 capsid VLPs (one or more times), etc.
  • VLPs according to the invention are administered repeatedly to the mammal in need of such treatment at t n , t n ,,; n being a number greater than or equal to 1; the VLPs administered at t n M differ from the VLPs administered at t n in that the protein L, or the proteins L, and L 2 of the capsid of the VLPs administered at t n .
  • l5 derives (nt) from a papillomavian of a type other than that from which derives (nt) the protein L j or the proteins L, and L 2 from the capsid of the VLPs administered at thyroid;
  • a pharmaceutical composition which comprises several products for consecutive administration, the products each consisting of VLPs according to the invention and differing from each other in that the L protein, or the L proteins, and L 2 of the capsid of the VLPs derive (s) for each product from a different type of papillomavirus.
  • a stock of HPV-16 type VLPs is prepared from a culture of Sf-9 cells infected with a recombinant baculovirus.
  • This baculovirus has, inserted into its genome, the DNA fragments of HPV-16 coding for L, and L 2 , originally isolated from a conJylomata acuminata.
  • the sequence coding for L is disclosed in WO 94/5792 It is noted in particular that the codon corresponding to the amino acid at position 202 is an aspartic acid codon.
  • VLPs subjected to dissociation is of the order of 200 ⁇ g / ml
  • a variant of the dissociation protocol is also described in Volpers et al, J Virol (1995) 69 3258 This preparation is then dialyzed extensively against 1 mM phosphate buffer pH 8
  • the plasmid pnRSV-NP (A / PR / 8/34) which contains the cDNA coding for the nucleoprotein of the influenza virus A / PR / 8/34 under the control of the promoter of the Rous sarcoma virus (RSV), is prepared as described in Ulmer et al. Science (1993) 259 1745

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Abstract

L'invention a pour objet une pseudo-particule virale (VLP) non-infectieuse qui comprend (i) une capside délimitant un espace interne et constituée au moins par tout ou partie de la protéine L1 et éventuellement tout ou partie de la protéine E2 d'un papillomavirus, et (ii) une molécule d'acide nucléique contenue dans ledit espace interne; la molécule d'acide nucléique comportant une région codant pour une protéine d'intérêt, notamment un antigène ou une cytokine. De telles VLPs peuvent être administrées in vivo et sont notamment utiles à des fins vaccinales en thérapie ou en prévention à l'encontre de toutes espèces d'infections ou d'états cancéreux.

Description

Pseudoparticules virales utiles en tant que vecteur de déliyrance d'acide nucléique
L'invention a pour objet de nouveaux vecteurs de délivrance de matériel génétique pour usage i.a. en thérapie génique, en immunothérapie ou à titre de vaccin thérapeutique ou prophylactique.
Chez un vertébré, le transfert de matériel génétique, quel que soit son utilité finale, peut être réalisé selon divers modes opératoires qui, pour les plus connus, sont (i) le transfert par vecteurs viraux, (ii) le transfert via une encapsulation dans des liposomes ou équivalents, (iii) le transfert médié par des agents facilitants tels que les lipides cationiques, les billes d'or ou le phosphate de calcium et (iv) le transfert par simple injection d'ADN nu, c'est-à-dire dépourvu de tout autre élément pouvant entrer en interaction ou en coopération avec l'ADN afin d'en promouvoir le transfert
Chaque méthode est d'application générale , cependant, une méthode plutôt qu'une autre peut apparaître plus appropriée en fonction de divers facteurs, tels que le type de matériel à transférer, le lieu où l'expression de ce matériel est recherchée, la permanence ou le caractère transitoire de l'expression
Par exemple, si il s'agit de corriger une déficience génétique chez un individu, on peut songer à préférer un mode de transfert intégratif mettant en jeu des vecteurs viraux dérivés des rétrovirus.
Dans d'autres cas, par exemple dans le traitement des cancers, on favorisera une expression transitoire et ciblée au lieu de la tumeur A cette fin, des vecteurs viraux tels que les vecteurs vaccine sont particulièrement appropriés
Pour ce qui est des traitements vaccinaux, les vecteurs vaccine, les liposomes ou même l'ADN nu peuvent convenir Ces derniers seront préférés aux vecteurs rétroviraux, en particulier pour la vaccination préventive
On a maintenant découvert que les capsides des papillomavirus peuvent être reconstituées in vitro, en présence d'ADN ou d'ARN hétérologue, et que ce matériel génétique s'y trouvait efficacement encapsulé Ainsi les capsides, communément appelées VLPs pour virus-like particles, peuvent servir à titre de véhicule de transfert de matériel génétique, avec des applications diverses. Les papillomavirus sont de petits virus à ADN, non-enveloppés de structure icosaèdrique Leur génome code pour jusqu'à huit protéines précoces et deux protéines tardives. Les cadres de lecture ouverts sont répertoriés de El à E7 sans oublier Ll et L2. Les gènes précoces (E pour early) sont associés aux fonctions de réplication virale et de transformation cellulaire Les capsides des papillomavirus sont constituées des deux protéines L, et L2 (L pour late proteins ou protéines tardives) , L, étant le constituant majeur Une information détaillée peut être trouvée dans Virology, Second Ed by B N Fieids, Raven Press (1990)
Des VLPs imitant en tout point les capsides des virions natifs peuvent être obtenus par expression recombinante soit de L, seulement, soit de L, + L2, dans le système vaccine (Hagensee et al, J Virol (1993) 67 315) ou dans le système baculovirus (Kirnbauer et al, PNAS ( 1992) 89 12180 , Kirnbauer et al, J Virol (1993) 67 6929 , Rose ét al, J. Virol (1993) 67 1936 , Le Cann et al, FEMS Microbiol Lett (1994) 117 . 269)
Dans la mesure où ces VLPs adoptent une conformation native et réagissent avec des anticorps neutralisants connus pour reconnaître des épitopes conformationels présents chez les virions natifs, il a déjà été suggéré d'utiliser ces VLPs en tant que vaccin à l'encontre des infections à papillomavirus (WO 94/5792)
De nombreuses espèces animales, y compris les humains sont sujettes à des infections a papillomavirus Ces agents infectieux sont spécifiques du groupe qu'ils infectent Ainsi on distingue entre autres, les papillomavirus bovins et les papillomavirus humains (HPV) Chez les humains, différents types d'HPV sont a l'origine de maladies diverses Les types 1, 2, 3, 4, 7, 10, et 26 - 29 sont la cause de verrues bénignes Les types 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 -25, 36, et 46 - 50 peuvent induire des lésions chez les individus déficients du point de vue immunologique Les types 6, 1 1, 34, 39, 41 - 44 et 51 - 55 sont responsables des dysplasies ou des condylomes non malins des muqueuses génitale et respiratoire ; dans de rares cas, certains de ces types peuvent se retrouver dans des carcinomes invasifs Enfin les types 16 et 18 et dans une moindre mesure 31, 33, 35 et 45, provoquent des dysplasies épitheliales de la muqueuse génitale et sont très largement associés à la majorité des carcinomes invasifs
La présente invention propose quant à elle, des pseudo-particules virales (VLPs) de papillomavirus non-infectieuses qui comprennent une capside délimitant un espace interne et une molécule d'acide nucléique contenu dans cet espace interne ; la molécule d'acide nucléique étant différente du génome d'un papillomavirus au moins en ce qu'elle est dépourvue de tout ou partie des régions dudit génome codant pour les protéines tardives de type sauvage
Aux fins de la présente invention, la capside est principalement formée par tout ou partie d'une protéine Ll ou par tout ou partie d'une protéine Ll et tout ou partie d'une protéine L2 Par souci de simplicité, on se bornera dans la suite du texte à ne parler que de protéine Ll ou L2 pour désigner les protéines entières ainsi que leurs fragments On peut aussi prévoir qu'il y aura plusieurs protéines Ll ou L2, provenant de types différents
Parmi les types de HPV dont peuvent être issues les protéines Ll et L2, on cite notamment les types 1, 6, 10, 1 1, 16, 18, 31, 33, 35 ou 45
Lorsque les protéines proviennent d'un HPV- 16, -18, -33 ou 35 ou de tout autre
HPV pouvant induire un carcinome invasif, il est préférable que la séquence de la protéine Ll en usage aux fins de l'invention soit identique a celle de la protéine Ll qui est présente chez le papillomavirus lorsque ce dernier est initialement isole à partir d'une lésion bénigne (e.g. condyloma acuminatum ou dysplasie cervicale) En effet, il semble bien qu'au stade d'une lésion bénigne, le papillomavirus puisse toujours se répliquer librement à l'état de virion complet , tandis qu'au stade malin, le virus aurait cette fonction altérée en raison notamment d'une mutation qui serait intervenue au niveau de l'ORF codant pour Ll Cette mutation empêcherait entre autre la formation des capsides La séquence d'une protéine L l de type 16 provenant d'un HPV isolé à partir d'un condylome est divulguée dans l'identificateur de séquence n° 2 de la demande WO 94/5792 On note que cette séquence se distingue de celle d'une protéine Ll d'un HPV- 16 isolé d'un carcinome malin, en ce que l'acide aminé en position 202 est un acide aminé autre que l'histidine i.e un résidu acide aspartique ou acide glutamique
En ce qui concerne la protéine L2, celle-ci peut être éventuellement délétée de son site de liaison à l'ADN, afin de favoriser l'élimination de toute trace d'ADN lors de la purification des éléments nécessaires à la mise en oeuvre des VLPs selon l'invention En pratique, il s'agit de supprimer ou de modifier un ou plusieurs des 12 premiers acides aminés de l'extrémité N-terminale De telles protéines L2 sont notamment décrites dans WO 95/20659 et Zhou et al, J Virol (1994) 68 619
De manière alternative, la capside peut être constituée par une ou des protéines hybrides (protéines de fusion) correspondant à des chimères Ll - E6, Ll - E7, L2 - E6, L2 - E7 ou à toute autre forme de chimère dans laquelle on retrouverait au moins une partie d'une protéine Ll ou L2 associé à un peptide ou polypeptide hétérologue à Ll ou L2, par exemple un peptide gag du HIV (human immunodeficiency virus) Afin de former de tels hybrides, plusieurs types d'association sont en théorie possibles
Par exemple, on peut prévoir d'associer par liaison peptidique l'extrémité N- terminale ou C-terminale de la protéine entière Ll et L2 avec l'extrémité inverse de la protéine E6 ou E7 On peut prévoir d'agir de même avec des protéines tronquées. Toujours par liaison peptidique, on peut aussi prévoir d'insérer au coeur de la séquence de la protéine Ll ou L2, tout ou partie de E6 ou E7 , de préférence on insérera des fragments de E6 ou E7 correspondant à des épitopes remarquables L'insertion dans la séquence de la protéine Ll ou L2 pourra s'effectuer en conservant l'intégralité de la séquence Ll ou L2 ou bien en en délétant une certaine partie Bien évidemment, la construction de cassette d'expression appropriées (par fusion génétique) codant pour ces protéines hybrides présidera à l'obtention de ces protéines
Ainsi que précédemment évoqué, le ou les éléments constituant la capside peuvent être produits dans des systèmes recombinants, bactéries, levure, cellule de mammifères ou d'insectes Par exemple, WO 95/31476 traite de l'expression et de la purification d'une protéine Ll dans et à partir d'Λ". coli L'expression et la purification dans et à partir de la levure, des protéines L l de HPV-6a, -1 1 , -16 and -18 est décrite dans WO 95/31532, ainsi que la co-expression et la co-purification de ces mêmes protéines avec les protéines L2 correspondantes L'expression de la protéine L l ou des protéines Ll et L2 de type 16, dans des cellules de mammifères, a l'aide d'un vecteur vaccine, est décrite dans WO 93/2184 et Zhou et al, Virology ( 1991 ) J_85. 251 L'expression de la protéine Ll de type 1 , dans des cellules de mammifères (OS, à l'aide du plasmide pSVL est décrite dans WO 94/152 et Ghim et al, Virology ( 1992) 190 548 L'expression de la protéine Ll de type 1, grâce au système vaccine, est aussi divulguée par Hagensee et al, J Virol (1993) 67 315 L'expression de la protéine L l de type 16 et sa co-expression avec la protéine L2 correspondante, dans des cellules d'insectes, a l'aide d'un baculovirus, est décrite dans WO 94/5792 et Kirnbauer et al, J Virol (1993) 67 6929. Sur le même sujet on cite aussi Xi et al, J Gen Virol ( 1991) 72 2981 L'expression de la protéine Ll de type 1 1 , 16 et 18, dans le même système, est reportée par WO 94/20137 et Rose et al, J Virol. (1993) 67 1936 Ainsi la mise au point d'un système recombinant destiné à l'expression d'une protéine Ll ou des protéines Ll et L2 est clairement à la portée de l'homme de l'art Lorsque ces protéines sont produites dans un système procaryote, elles restent généralement à l'état dissocié après purification II n'y a pas formation de VLPs sauf si on soumet ces protéines à un traitement spécifique de renaturation et même dans ce cas là, le rendement reste très faible
Lorsque ces protéines sont exprimées dans un système eucaryote, on s'attend généralement à ce que les protéines produites se réassemblent spontanément sous forme de VLPs, sauf par exemple si le taux d'expression était trop faible Par conséquent le produit que l'on obtient après purification est bien des VLPs et non des protéines dissociées
Afin de mettre en oeuvre l'objet de la présente invention, il convient donc de traiter les VLPs produites en système eucaryote, de manière à les dissocier en ses éléments La dissociation requiert que l'on réduise les ponts disulphures et que l'on supprime les ions calcium (Volpers et al, J. Virol (1995) 69 3258 et Colomar et al, J Virol (1993) 67 2779) Par exemple on placera les VLPs en pH alcalin ou on utilisera un agent réducteur comme le dithiothréitol (DTT) On utilisera aussi un agent chélateur complexant le calcium comme l'EGTA (ethylene glycol-bis (bêta-aminoethyl ether)- N,N,N',N'- tetraacetic acid)
Aux fins de la présente invention, l'acide nucléique encapsulé peut être de l'ARN ou de l'ADN , ce dernier sera avant tout préféré La taille de la molécule n'est pas critique , on indique toutefois qu'il est préférable qu'elle n'excède pas plus de 8 kbp, du moins en ce qui concerne l'ADN
Une molécule d'acide nucléique utile aux fins de la présente invention doit être différente du génome de papillomavirus, bien qu'elle puisse en contenir certains éléments En particulier cette molécule n'a pas la structure d'un génome de papillomavirus et ne contient pas d'origine de réplication spécifique d'un papillomavirus
L'ADN peut être sous forme linéaire ou circulaire , cette dernière forme étant préférée Avantageusement il s'agira d'un plasmide Celui-ci sera intégratif ou pas, selon le but recherché De même, il pourra ou non se répliquer dans une cellule de mammifère A des fins de production, il comportera une origine de réplication e.g. procaryote La molécule d'ADN e.g. le plasmide, peut éventuellement comporter un site qui lui permette de se lier à la protéine E2 d'un papillomavirus. Un tel site peut avoir pour séquence la formule ACCN6MT dans laquelle N est indépendamment A, G, C ou T et
M est G ou T. La molécule d'ADN peut aussi comporter tout ou partie de la longue région de contrôle (LCR) du génome d'un papillomavirus
La finalité essentielle de cette molécule d'ADN (ou d'ARN) est de permettre l'expression d'une ou de plusieurs peptides, polypeptides ou protéines d'intérêt dans une cellule de mammifère. En conséquence, elle comporte une région codante placée sous le contôle d'un promoteur approprié. A titre d'exemple, on cite le promoteur précoce du cytomégalovirus humain notamment décrit dans le brevet américain USP 5 168 062 ou un promoteur tissu-spécifique tel que le promoteur du gène codant pour la desmine humaine (Li et al, Gène (1989) 78 : 243 et Li et al, Development ( 1993) JJ7 : 947)
Le choix de la région codante sera déterminé par l'usage auquel les VLPs selon l'invention seront destinées. Ainsi on peut utiliser ces VLPs comme agent de vaccination à rencontre des infections parasitaires, bactériennes ou virales Dans ce cas, le peptide ou polypeptide ou la protéine sera sélectionnée parmi les antigènes parasitaires, bactériens ou viraux.
Selon un mode de réalisation particulier, on choisit d'utiliser les VLPs selon l'invention à titre d'agent de vaccination thérapeutique ou préventif, à l'encontre des infections à papillomavirus. Pour ce faire, le ou les peptide(s), polypeptide(s) ou protéine(s) codé(s) sera (seront) avantageusement sélectionné(s) parmi tout ou partie des protéines El et E2 et des formes non-oncogéniques des protéines E6 et E7 d'un papillomavirus ; preferentiellement d'un HPV de type 16, 18, 31, 33, 35 ou 45. Ce papillomavirus peut être éventuellement d'un type différent de celui dont est (sont) issue(s) la ou les protéine(s) de capside.
Les formes non-oncogéniques incluent les protéines E6 et E7 d'un papillomavirus non-oncogène ainsi que les formes délétées d'une protéine E6 ou E7 d'un papillomavirus oncogène. avantageusement, une telle forme délétée d'une protéine E6 ne comporte pas tout ou partie de la région de E6 comprise entre les résidus acide aminé 106 et 1 15 (par exemple, il peut s'agir d'une protéine HPV- 16 E6 Δ (106-1 10) ou Δ (111-115) ou Δ (106-115)). De même, une forme délétée d'une protéine E7 ne comporte pas tout ou partie de la région de E7 comprise entre les résidus acide aminé 20 et 26 (par exemple, il peut s'agir d'une protéine HPV- 16 E7 Δ (21-24) ou Δ (21-26)). Ces protéines précoces, leur fragment d'ADN correspondant ainsi que leur forme non-oncogénique sont décrites dans Crook et al, Cell (1991) 67 547 et Munger et al, EMBO J (1988) 8 4099
A titre d'exemple, on présente ci-après diverses combinaisons possibles en ce qui concerne l'origine des protéines (présentation non-exhaustive)
Capside Acide nucléique Ll L2 E6 E7
HPV- 16 HPV- 16 HPV- 16 HPV- 16
HPV- 16 HPV- 16 HPV- 18 HPV- 18
HPV- 16 HPV- 16 HPV- 16 HPV- 18 et HPV- 18 et HPV- 18 et HPV-1
HPV- 16 — HPV-33 — et HPV- 18
HPV- 16 — HPV- 16 —
HPV- 16 .... HPV- 16
Sous un autre aspect, on peut aussi envisager d'utiliser les VLPs selon l'invention a titre d'agent de vaccination à l'encontre des tumeurs induites par les antigènes du soi, en préventif ou en thérapeutique. Parmi, les antigènes associés aux tumeurs, on cite notamment la tyrosinase, la glycoproteine gplOO, la famille des protéines MAGE, le CEA, la protéine ras, mutée ou non, la protéine p53, mutée ou non, Mucl et pSA
Des VLPs selon l'invention pourraient être aussi d'une grande utilité pour délivrer iii vivo des cytokines ou des molécules accessoires ayant une fonction immunomodulatrice (e.g reconnaissance cellulaire par les cellules T-helper), dans toutes les applications où ces molécules sont prescrites Parmi les cytokines, on cite notamment l'interleukine-2 (IL-2), l'IL-4, -5, -7, -10, - 12, le GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor), l'interféron gamma (IFN-gamma) et le TGF- bêta (tumor growth factor-bêta) Parmi les molécules accessoires on cite notamment B7 1, B7.2, CD40, CD28 et CIITA Par exemple, une molécule d'acide nucléique utile aux fins de la présente invention, peut non seulement comporter une région codant pour un antigène d'un agent infectieux ou d'un antigène du soi associe a une tumeur, mais aussi une région codant pour une cytokine, e g l'IL-2 ou l'IL-12 Afin de traiter ou de prévenir des infections a papillomavirus, une telle région peut être ajoutée a la molécule d'acide nucléique telle que précédemment envisagée D'une manière générale ceci peut être aussi mis en oeuvre pour toute autre application vaccinale
De même, des VLPs selon l'invention dont la molécule d'acide nucléique coderait essentiellement pour au moins une cytokine ou au moins une molécule accessoire, peuvent être utiles en thérapie comme élément de traitement de diverses pathologies telles que les tumeurs ou les maladies auto-immunes ou bien encore pour prévenir un rejet après transplantation
Enfin des VLPs selon l'invention peuvent être aussi utiles dans le traitement des maladies génétiques Dans ce cas la, pour encapsidation on prépare une molécule d'acide nucléique comportant au moins une région codant pour une protéine d'intérêt corrigeant un défaut génétique, telle que le facteur VIII pour traiter l'hémophilie la dystrophine pour traiter la dystrophie musculaire de Duchennc (myopathie) ou la protéine CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) pour traiter la mucoviscidose
En conséquence, l'invention a aussi pour objet
(i) A titie de médicament, une VLP selon 1 invention
(n) Une composition pharmaceutique comprenant a titre de principe actif, au moins une VLP selon l'invention en association avec un diluant ou un support acceptable du point de vue pharmaceutique ,
(m) Une composition pharmaceutique comprenant au moins deux VLPs, dans laquelle une première VLP comprend une capside constituée au moins par tout ou partie de la protéine Ll d'un premier type, tel que le type 16 et dans laquelle une deuxième
VLP comprend une capside constituée au moins par tout ou partie de la protéine L l d'un deuxième type différent du premier type, tel que le type 18
(îv) L'usage d'une VLP selon l'invention, dans la préparation d'un médicament destine a la prévention ou au traitement d'une infection bactérienne ou virale, d'une tumeur i.a induite par un antigène du soi ou d'une maladie auto-immune ou bien encore, destiné à la prévention d'un rejet de greffe ,
(v) Une méthode de traitement ou de prévention d'une infection bactérienne ou virale, d'une tumeur i.a induite par un antigène du soi ou d'une maladie auto- immune ou bien encore, de prévention d'un rejet de greffe, selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace d'au moins une VLP selon l'invention à un individu ayant besoin d'un tel traitement , et
(vi) Une méthode d'expression in vivo, permettant de fournir à un mammifère, un peptide, un polypeptide ou une protéine sous une forme physiologiquement active, selon laquelle on administre au mammifère, au moins une VLP selon l'invention dans laquelle la molécule d'acide nucléique comporte une région codant pour ledit peptide ou polypeptide ou pour ladite protéine, placée sous le contrôle d'un promoteur approprié si il s'agit d'une molécule d'ADN
Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle En particulier on associe au moins une VLP avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique Des exemples de diluants ou de supports ainsi que des méthodes de formulation sont indiqués dans le Remington's Pharmaceutical Sciences La formulation pourra dépendre de la voie d'administration , aérosol, formulation injectable, suppositoirs, comprimés, etc
Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, lorsque cette composition est destinée à cet effet II s'agit notamment des voies systémiques e.g. voie sous-cutanée, intra-dermique, intra-musculaire ou intra-veineuse, et des voies mucosales e.g voie orale, nasale, pulmonaire ou ano-génitale Lorsqu'il s'agit de traiter des tumeurs solides, les voies précédemment énoncées restent d'usage et on peut y adjoindre aussi la voie intra-tumorale Lorsqu'il s'agit de traiter des maladies génétiques, le choix de la voie d'administration dépendra essentiellement de la nature de la maladie , par exemple on retiendra avantageusement la voie pulmonaire dans le cas de la mucoviscidose (les VLPs étant formulées sous forme d'aérosol) ou la voie intra-veineuse dans le cas de l'hémophilie.
L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple de l'individu traité ou du mode d'administration. De manière générale, une dose comprend de 1 à 250 μg de VLPs selon l'invention.
L'invention se rapporte aussi à un procédé de préparation de VLPs selon l'invention, selon lequel on mélange une molécule d'acide nucléique définie comme précédemment, avec tout ou partie de la protéine Ll d'un papillomavirus sous forme dissociée et de manière optionnelle, tout ou partie de la protéine L2 d'un papillomavirus, en présence d'un agent permettant la réassociation de la protéine L l (ou des protéines L l et L2) sous forme de capside, e.g. un sel de calcium, et on récupère à partir du mélange, lesdites VLPs.
Lorsque l'ADN destiné à être encapsidé comporte un site qui lui permette de se lier à la protéine E2, il devient avantageux de rajouter cette protéine au mélange de reconstitution. Auparavant cette protéine aura par exemple était produite par voie recombinante, dans un sytème procaryote (bactéries) ou eucaryote (i.a. levures, cellules d'insectes).
Préalablement à l'étape du mélange, il est avantageux d'exprimer tout ou partie de la protéine Ll, optionnellement tout ou partie de la protéine L2, par voie recombinante dans une cellule-hôte eucaryote. Dans ce cas, on récupère des pseudo-particules vides, et on les traite par un agent réducteur et/ou par un agent chélateur des ions calcium, pour obtenir tout ou partie de la protéine Ll , optionnellement tout ou partie de la protéine L2, sous forme dissociée.
De manière avantageuse, tout ou partie de la protéine L, optionnellement tout ou partie de la protéine L2, est exprimée par voie recombinante dans des cellules d'insectes infectées par un baculovirus dans le génome duquel est inséré un fragment d'ADN codant pour tout ou partie de la protéine L, optionnellement pour tout ou partie de la protéine L2, placé sous le contrôle d'un promoteur approprié
Lorsque les VLPs selon l'invention sont utilisées dans des traitements de longue durée, comme par exemple dans le traitement d'un cancer, l'administration répétée d'un même type de VLPs (c'est-à-dire de VLPs ayant la même capside) peut être gênante d'un point de vue immunologique. Afin de surmonter ce désavantage potentiel, on peut prévoir d'utiliser de manière séquentielle, des VLPs ayant des capsides différentes. Par exemple on peut préparer tout une gamme de VLPs ayant la même molécule d'acide nucléique (ayant une région codant e.g. pour l'IL-2 ou l'IL- 12) mais différant par le type de papillomavirus dont est issue la protéine Ll et, optionnellement la protéine E2. Ainsi on utilisera de manière consécutive, des VLPs de capside type 16 (une ou plusieurs fois), puis des VLPs de capside type 18 (une ou plusieurs fois), etc.
C'est pourquoi l'invention a aussi pour objet :
(i) Une méthode de traitement d'une maladie génétique, d'un état cancéreux, ou d'une infection à papillomavirus selon laquelle on administre au mammifère ayant besoin d'un tel traitement, des VLPs selon l'invention, de manière répétée à tn, tn, , ; n étant un nombre supérieur ou égal à 1 ; les VLPs administrées à tn M différant des VLPs administrées à tn en ce que la protéine L, ou les protéines L, et L2 de la capside des VLPs administrées à tn. l5 dérive(nt) d'un papillomaviais de type autre que celui dont dérive(nt) la protéine Lj ou les protéines L, et L2 de la capside des VLPs administrées à t„ ; et
(ii) Une composition pharmaceutique qui comprend plusieurs produits pour administration consécutive , les produits étant chacuns constitués de VLPs selon l'invention et différant les uns des autres en ce que la protéine L, ou les protéines L, et L2 de la capside des VLPs dérive(nt) pour chaque produit d'un papillomavirus de type différent.
EXEMPLE
Préparation de VLPs vides
Un stock de VLPs de type HPV- 16 est préparé à partir d'une culture de cellules Sf-9 infectées par un baculovirus recombinant. Ce baculovirus possède, insérés dans son génome, les fragments d'ADN de HPV- 16 codant pour L, et L2, originellement isolés à partir d'un conJylomata acuminata. La séquence codant pour L, est divulguée dans WO 94/5792 On note en particulier que le codon correspondant à l'acide aminé en position 202 est un codon acide aspartique.
La construction du baculovirus, la culture des cellules Sf-9 ainsi que la purification des VLPs sont décrites dans Kirnbauer et al, J Virol. ( 1993) 67 : 6929 ou dans Suzich et al, PNAS ( 1995) 92 : 1 1553.
Dissociation des VLPs A 250 μl d'une préparation de VLPs obtenues après dialyse contre du tampon phosphate 1 mM pH 8, on ajoute 250 μl de tampon phosphate 1 mM pH 8 contenant 300 mM NaCl, 2 mM EGTA (ethylene glycol tetracetic acid) et 40 mM DTT (dithiotreitol) On laisse se poursuivre l'incubation à 37°C pendant une heure La concentration finale en VLPs soumise à dissociation est de l'ordre de 200 μg / ml Une variante du protocole de dissociation est aussi décrite dans Volpers et al, J Virol (1995) 69 3258 Cette préparation est ensuite dialysée de manière extensive contre du tampon phosphate 1 mM pH 8
Préparation de l'APN destiné à être encapsidé
Le plasmide pnRSV-NP (A/PR/8/34) qui comporte le cDNA codant pour la nucléoprotéine du virus de la grippe A/PR/8/34 sous le contrôle du promoteur du virus du sarcome de Rous (RSV), est préparé comme décrit dans Ulmer et al. Science ( 1993) 259 1745
Encapsidation de l'ADN
50 ng d'ADN purifié sous un volume de 500 μl sont ajoutes a 500 μl de la préparation de VLPs dissociées obtenues précédemment Puis on ajoute 25 μl d'une solution de chlorure de calcium 20 mM On laisse incuber 30 min a 37°C Le mélange est ensuite soumis à une centrifugation en sucrose 40 % dans un rotor SW28 à 28 000 rpm pendant 20 heures On récupère une bande a la densité de 1 33 g/ml qui contient l'ADN encapsidé et que l'on dialyse contre du tampon phosphate 1 mM pH 8

Claims

Revendications
Une pseudo-particule virale (VLP) non-infectieuse qui comprend
(i) une capside délimitant un espace interne et constituée au moins par tout ou partie de la protéine L, d'un papillomavirus, et (n) une molécule d'acide nucléique contenue dans ledit espace interne , la molécule d'acide nucléique étant différente du génome d'un papillomavirus au moins en ce qu'elle est dépourvue de tout ou partie des régions dudit génome codant pour les protéines tardives de type sauvage
Une pseudo-particule virale selon la revendication 1, dans laquelle la capside est constituée au moins par tout ou partie de la protéine L, a l'état de protéine chimère T - F
Une pseudo-particule virale selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la capside est constituée au moins par tout ou partie de la protéine L, d'un papillomavirus humain (HPV)
Une pseudo-particule virale selon la revendication 3, dans laquelle la capside est constituée au moins par tout ou partie de la protéine L, d'un papillomavirus humain de type 1 , 6, 10, 1 1, 16, 18, 31, 33, 35 ou 45
Une pseudo-particule virale selon la revendication 4, dans laquelle la capside est constituée au moins par tout ou partie de la protéine L, d'un HPV- 16, - 18, -3 1, - 33, -35 ou -45 initialement isole a partir d'une lésion bénigne (condyloma acuminatum ou dysplasie cervicale)
Une pseudo-particule virale selon la revendication 5, dans laquelle la capside est constituée au moins par tout ou partie de la protéine L, d'un HPV- 16 ayant une séquence d'acide aminés qui comporte en position 202, un acide aminé autre que l'histidine
Une pseudo-particule virale selon la revendication 6, dans laquelle la capside est constituée au moins par tout ou partie de la protéine L[ d'un HPV- 16 ayant une séquence d'acides aminés qui comporte en position 202, un résidu acide aspartique ou acide glutamique 8 Une pseudo-particule virale selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle la capside est en outre constituée par tout ou partie de la protéine L2 d'un papillomavirus.
9. Une pseudo-particule virale selon la revendication 8, dans laquelle la capside est en i outre constituée par tout ou partie de la protéine L2 à l'état de chimère L2 - E7.
10. Une pseudo-particule virale selon l'une des revendications 1 à 9, dans laquelle la molécule d'acide nucléique comporte une région codant pour une protéine d'intérêt
1 1. Une pseudo-particule virale selon la revendication 10, dans laquelle la molécule d'acide nucléique est de l'ADN et comporte une région codant pour une protéine d'intérêt placée sous le contrôle d'un promoteur capable de promouvoir la transcription dans les cellules de mammifères
12 Une pseudo-particule virale selon la revendication 1 1, dans laquelle la molécule d'ADN comporte en outre un site de liaison de la protéine E2 d'un papillomavirus, de formule ACCN6MT dans laquelle N est A, G, C ou T et M est G ou T.
13 Une pseudo-particule virale selon la revendication 1 1, dans laquelle la molécule d'ADN comporte en outre tout ou partie de la longue région de contrôle (LCR) du génome d'un papillomavirus
14 Une pseudo-particule virale selon l'une des revendications 10 à 13, dans laquelle la molécule d'acide nucléique est d'au plus 8 kbp
15 Une pseudo-particule virale selon l'une des revendications 10 à 14, dans laquelle la molécule d'acide nucléique comporte au moins une région codant pour une protéine d'intérêt sélectionnée parmi les cytokines et les molécules accessoires facilitant la reconnaissance cellulaire par les cellules T helper
16 Une pseudo-particule virale selon l'une des revendications 10 à 14, dans laquelle la molécule d'acide nucléique comporte au moins une région codant pour une protéine d'intérêt sélectionnée parmi les antigènes associés aux tumeurs Une pseudo-particule virale selon l'une des revendications 10 à 14, dans laquelle la molécule d'acide nucléique comporte au moins une région codant pour une protéine d'intérêt sélectionnée parmi les antigènes parasitaires, bactériens ou viraux
Une pseudo-particule virale selon la revendication 17, dans laquelle la molécule d'acide nucléique comporte au moins une région codant pour une protéine d'intérêt sélectionnée parmi les protéines E, et E2 et les formes non-oncogéniques des protéines E6 et E7 d'un papillomavirus
Une pseudo-particule virale selon la revendication 18, dans laquelle la molécule d'acide nucléique comporte au moins une région codant pour une protéine d'intérêt sélectionnée parmi les protéines E, et E2 et les formes non-oncogeniques des protéines E6 et E7 d'un papillomavirus de type HPV-16, -18, -31, -33, -35 ou - 45
Une pseudo-particule virale selon la revendication 18 ou 19, dans laquelle la molécule d'acide nucléique comporte au moins une région codant pour une protéine d'intérêt sélectionnée parmi les protéines E, et E2 et les formes non- oncogeniques des protéines E6 et E7 d'un papillomavirus d'un type différent de celui dont est (sont) ιssue(s) la ou les proteιne(s) de capside
Une pseudo-particule virale selon les revendications 1 5 et 16, 18, 19 ou 20
Une pseudo-particule virale selon l'une des revendications 10 a 14, dans laquelle la molécule d'acide nucléique comporte au moins une région codant pour une protéine d'intérêt en thérapie des maladies génétiques
A titre de médicament, une pseudo particule virale selon l'une des revendications 1 à 22
Un procédé de préparation de pseudo-particules virales selon l'une des revendications 1 à 22, selon lequel on mélange une molécule d'acide nucléique différente du génome d'un papillomavirus au moins en ce qu'elle est dépourvue de tout ou partie des régions dudit génome codant pour les protéines tardives de type sauvage, avec tout ou partie de la protéine L, d'un papillomavirus sous forme dissociée, en présence d'un sel de calcium et on récupère a partir du mélange, lesdites pseudo-particules virales 6693 PC17FR97/00962
- 16 -
Un procède de préparation selon la revendication 24, selon lequel on mélange en outre tout ou partie de la protéine E2 d'un papillomavirus a la molécule d'acide nucléique et a la protéine L,
Un procédé de préparation selon la revendication 25, selon lequel on ajoute au moment du mélange la protéine E2 d'un papillomavirus délétée de sa partie N - terminale
Un procède de préparation selon l'une des revendications 24 a 26, selon lequel préalablement a l'étape du mélange,
(i) on exprime tout ou partie de la protéine L,, optionnellement tout ou partie de la protéine L2, par voie recombinante,
(n) on récupère des pseudo-particules vides, et
(m) on traite les pseudo-particules vides par un agent réducteur et/ou par un agent chelateur des ions calcium, pour obtenir tout ou partie de la protéine L,, optionnellement tout ou partie de la protéine L2, sous forme dissociée
Un procède de préparation selon la revendication 27, dans lequel tout ou partie de la protéine L, optionnellement tout ou partie de la protéine L2, est exprimée par voie recombinante dans des cellules d'insectes infectées par un baculovirus dans le génome duquel est insère un fragment d'ADN codant pour tout ou partie de la protéine L, optionnellement pour tout ou partie de la protéine L2, place sous le contrôle d'un promoteur approprie
Une composition pharmaceutique qui comprend plusieurs produits pour administration consécutive , les produits étant chacuns constitues de pseudo particules virales selon l'une des revendications 1 a 22 et différant les uns des autres en ce que la protéine L, ou les protéines L, et L2 de la capside des pseudo¬ particules deπve(nt) pour chaque produit d'un papillomavirus de type différent
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