JP2000511773A

JP2000511773A - 核酸を送達するベクターとして有用なウイルス様粒子

Info

Publication number: JP2000511773A
Application number: JP10500269A
Authority: JP
Inventors: ブローク，マリー―アリーヌ
Original assignee: パストゥール・メリュー・セロム・エ・ヴァクサン
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2000-09-12
Also published as: FR2749323A1; US6420160B1; AU725518B2; FR2749323B1; WO1997046693A1; EP0910656A1; AU3098097A; CA2257389A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、（ｉ）内部空間を規定し、少なくともパピローマウイルスのＬ１タンパク質の全部または一部および所望によりＥ２タンパク質の全部または一部により構成されるキャプシド、ならびに（ii）該内部空間に含まれる核酸分子を含んでなる非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を記載する；該核酸分子は、目的のタンパク質、特に抗原またはサイトカインをコードする領域を含む。かかるＶＬＰはインビボで投与することができ、あらゆる種類の癌疾患または感染症に対する治療におけるまたは予防のためのワクチン目的に特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】核酸を送達するベクターとして有用なウイルス様粒子本発明の課題は、例えば遺伝子療法、免疫療法において、および治療用または予防用ワクチンとして使用するための遺伝物質を送達するための新規ベクターである。脊椎動物では、その最終的有用性に係わらず、遺伝物質の導入は様々な手法で行われ得る。この手法には、最も広範に知られているものについては、（ｉ）ウイルスベクターによる導入、（ii）リボソームなどへのパッケージングを介する導入、（iii）カチオン性脂質、金ビーズまたはリン酸カルシウムなどの促進剤によって媒介される導入、および（iv）裸のＤＮＡ（すなわち、導入を促進するためにＤＮＡと相互作用または共同作用する他の成分を欠いているＤＮＡ）の単なる注入による導入がある。それぞれの方法は一般的な用途を有する方法であるが、導入しようとする物質のタイプ、この物質の発現が望まれる部位、発現の永久的または一過性的性質などの様々な要因しだいで、一の方法が別の方法よりも適切であることもあるようである。例えば、それが個体の遺伝的欠損の補正を含む場合、レトロウイルス由来のウイルスベクターを使用する導入の組込み様式が好適であり得る。他の場合、例えば、癌の治療において、腫瘍部位を標的とする一過性発現が好ましい。この目的のために、ワクチンベクターなどのウイルスベクターが特に適切である。ワクチン治療の場合、ワクチンベクター、リポソームまたは裸のＤＮＡですら適切であり得る。後者は、特に予防用ワクチン接種のためには、レトロウイルスベクターよりも好適であろう。今、異種ＲＮＡまたはＤＮＡの存在下、パピローマウイルスのキャプシドをインビトロで再構築してもよく、その中にこの遺伝物質が効率的にパッケージングされることが見出された。従って、一般にウイルス様粒子についてＶＬＰと呼ばれるキャプシドは、様々な用途を有する遺伝物質導入用ビヒクルとして役立つことができる。パピローマウイルスは、エンベロープを持たない小さなＤＮＡウイルスで、二十面体構造を有する。それらのゲノムは、初期タンパク質８つまでおよび後期タンパク質２つをコードする。それらのオープンリーデングフレームは、Ｅ１〜Ｅ７ならびにＬ１およびＬ２に分類される。初期（Ｅは初期に対応する）遺伝子は、ウイルス複製および細胞形質転換機能に関連する。パピローマウイルスのキャプシドは、２つのタンパク質Ｌ₁およびＬ₂（Ｌは後期タンパク質に対応する）からなり、Ｌ₁は、主要な構成成分である。詳細な情報については、B．N．Fields によるVirology，第２版，Raven Press（1990）を参照してもよい。あらゆる面で天然ビリオンのキャプシドに類似しているＶＬＰは、これをワクチン系（Hagenseeら，J．Virol．（1993）67:315）またはバキュロウイルス系(K irnbauerら，PNAS（1992）89:12180；Kirnbauerら，J．Virol．（1993）67:6929 ；Roseら，J．Virol．（1993）67:1936；Le Cannら，FEMS Microbiol．Lett．（ 1994）117:269)におけるＬ₁単独またはＬ₁＋Ｌ₂のいずれかの組換え発現によって入手してもよい。これらのＶＬＰは、天然のコンホメーションを採り、天然ビリオンに存在するコンホメーションエピトープを認識することが知られている中和抗体と反応するので、すでに、これらのＶＬＰをパピローマウイルス感染症に対するワクチンとして使用することが示唆されてきた(WO 94/5792)。ヒトを含む多くの動物種は、パピローマウイルス感染症に罹患しやすい。これらの感染因子は、それらが感染する群に対して特異的である。したがって、特に、ウシパピローマウイルスとヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）とを区別することが可能である。ヒトでは、ＨＰＶの種々の型が様々な疾患の原因となっている。１型、２型、３型、４型、７型、１０型、および２６型〜２９型は、良性のゆうぜいの原因である。５型、８型、９型、１２型、１４型、１５型、１７型、１９型〜２５型、３６型、および４６型〜５０型は、免疫学的欠損個体において病変を誘発し得る。６型、１１型、３４型、３９型、４１型〜４４型および５１型〜５５型は、生殖器および呼吸器粘膜の形成異常または非悪性コンジロームの原因であり；稀ではあるが、これらの型のいくつかは、侵食癌に関与し得る。最後に、１６型および１８型、ならびに、より低い程度で、３１型、３３型、３５型および４５型は、生殖器粘膜の上皮形成異常を引き起こし、大部分の侵食癌に関与する。本発明は、その一部については、内部空間を規定するキャプシドおよびこの内部空間に含有される核酸分子を含む非感染性パピローマウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、該核酸分子が、少なくとも、野生型後期タンパク質をコードするパピローマウイルスのゲノムの領域の全部または一部を欠くという点で該ゲノムと異なるウイルス様粒子を提供するものである。本発明の目的のために、該キャプシドは、主に、タンパク質Ｌ１の全部もしくは一部から、またはタンパク質Ｌ１の全部もしくは一部およびタンパク質Ｌ２の全部もしくは一部から作製される。簡単のため、本明細書ではＬ１またはＬ２タンパク質のみを用いるが、これは、全タンパク質およびそのフラグメントを表す。異なるタイプから得られるいくつかのＬ１またはＬ２タンパク質があることも予想することができる。Ｌ１およびＬ２タンパク質が誘導され得るＨＰＶタイプの中でも、特に１型、６型、１０型、１１型、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型または４５型について記載され得る。タンパク質がＨＰＶ−１６、−１８、−３３もしくは−３５から、または侵食癌を誘発し得るいずれかの他のＨＰＶから得られる場合、本発明の目的のための使用におけるＬ１タンパク質の配列は、パピローマウイルスに存在するＬ１タンパク質の配列と同一である(後者が良性の病変（例えば、尖圭コンジロームまたは子宮頚部形成異常）から最初に単離される場合)。実際には、良性病変の病期で、パピローマウイルスは完全なビリオン状態で自由に複製することができるが、悪性の病期では、特にＬ１をコードするＯＲＦに生じる突然変異のために、ウイルスのこの機能は損なわれる。この突然変異は、特にキャプシドの形成を妨げる。コンジロームから単離されるＨＰＶから得られる１６型Ｌ１タンパク質の配列は、出願WO 94/5792の配列番号２に開示されている。この配列は、２０２位のアミノ酸がヒスチジン以外のアミノ酸、すなわち、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基である点で、悪性癌から単離されるＨＰＶ−１６のＬ１タンパク質の配列と区別可能である。Ｌ２タンパク質については、後者は、本発明のＶＬＰを使用するのに必要な成分を精製する間に如何なる極微量のＤＮＡの消失をも促進するために、ＤＮＡ結合部位を欠失させることができる。実際には、このことは、Ｎ末端の最初の１２個のアミノ酸の１つまたはいくつかを抑制あるいは修飾することを含む。かかるＬ２タンパク質については、特に、WO 95/20659およびZhouら，J．Virol．（199 4）68:619に記載されている。あるいは、キャプシドは、キメラＬ１−Ｅ６、Ｌ１−Ｅ７、Ｌ２−Ｅ６、Ｌ２ −Ｅ７、またはＬ１またはＬ２タンパク質の少なくとも一部がＬ１またはＬ２に非相同のペプチドまたはポリペプチド、例えば、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）のgagペプチドと結合して存在し得る他のキメラ形態に対応する１つ以上のハイブリッドタンパク質（融合タンパク質）からなる。かかるハイブリッドを形成するために、いくつかのタイプの会合が理論的に可能である。例えば、ペプチド結合によって、全Ｌ１およびＬ２タンパク質のＮ末端またはＣ末端をＥ６またはＥ７タンパク質の対向端に結合させることを考慮することができる。同じ作用が短縮型タンパク質でも予想することができる。Ｅ６またはＥ７の全部または一部をペプチド結合によってＬ１またはＬ２タンパク質の配列の中央に挿入することも予想できる；好ましくは、独特なエピトープに対応するＥ６またはＥ７のフラグメントが挿入される。Ｌ１またはＬ２配列全体を保存したまま、あるいは代わりにその一部を欠失することによって、Ｌ１またはＬ２タンパク質の配列に挿入することができる。明らかに、これらのハイブリッドタンパク質をコードする適切な発現カセットの（遺伝子融合による）構築により、これらのタンパク質が産生される。上記のように、キャプシドを構成する成分は、組換え系、細菌、酵母、哺乳動物または昆虫細胞において産生され得る。例えば、WO 95/31476は、イー・コリ（E.coli）におけるおよびイー・コリからのＬ１タンパク質の発現および精製を扱っている。WO 95/31532には、酵母におけるおよび酵母からのＨＰＶ−６ａ、 −１１、−１６および−１８のＬ１タンパク質の発現および精製、ならびに、これら同タンパク質の対応するＬ２タンパク質との同時発現および同時精製が開示されている。WO 93/2184およびZhouら，Virology（1991）185:251には、ワクチンベクターの補助による哺乳動物細胞での１６型のＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の発現が開示されている。WO 94/152およびGhimら，Virolog y（1992）190:548には、プラスミドｐＳＶＬの補助による哺乳動物細胞ＣＯＳにおける１型Ｌ１タンパク質の発現が開示されている。また、Hagenseeら，J．Vir ol．（1993）67:315には、ワクチン系による１型Ｌ１タンパク質の発現が開示されている。W094/5792およびKirnbauerら，J．Virol．（1993）67:6929には、バキュロウイルスの補助による昆虫細胞での１６型Ｌ１タンパク質の発現および対応するＬ２タンパク質との同時発現が開示されている。同じ課題について、Xiら，J．Gen．Virol．(1991)，72:2981にも開示される。WO 94/20137およびRoseら，J．Virol．（1993）67:1936には、同一系における１１型、１６型および１８型Ｌ１タンパク質の発現が開示されている。したがって、Ｌ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の発現を目的とする組換え系の開発は、明らかに当業者の能力の範囲内である。これらのタンパク質が原核系で産生される場合、それらは、一般に、精製後も解離状態を保持する。これらのタンパク質は、特定の再生処理に供されない限りＶＬＰの形成は認められず、特にこの場合、回収率は極めて低いままである。これらのタンパク質が真核系で発現される場合、一般に、発現レベルが極めて低い場合を除いて、産生されたタンパク質がＶＬＰの形態で自発的に再構成することが予想される。したがって、精製後に得られた生成物は、ＶＬＰであり、解離したタンパク質ではない。したがって、本発明の対象を実施するために、真核系において産生されるＶＬＰは、それらの構成成分に解離するように処理されるべきである。解離にはジスルフィド結合を還元すること、および、カルシウムイオンを除去することが必要とされる(Volpersら，J．Virol．（1995）69:3258およびColomarら，J．Virol．（1993）67:2779)。例えば、ＶＬＰをアルカリｐＨ下に置くかまたはジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を使用する。ＥＧＴＡ（エチレングリコール− ビス(ベータ−アミノエチルエーテル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−四酢酸)などのカルシウム錯形成性キレート化剤も使用される。本発明の目的のために、包膜化された核酸は、ＲＮＡであってもまたはＤＮＡであってもよく；主として後者が好ましい。分子のサイズは重要ではない；しかし、少なくともＤＮＡについては、８kbpを超えないことが好ましいことはいうまでもない。本発明の目的に有用な核酸分子は、パピローマウイルスゲノムとは異なるべきであるが、核酸分子は、そのいくつかの成分を含有することができる。特に、この分子は、パピローマウイルスゲノムの構造を有さず、パピローマウイルスに特異的な複製開始点を含有しない。ＤＮＡは、線状の形態でも、または環状の形態であってもよいが、後者の形態が好ましい。好都合には、それはプラスミドである。後者は、所望の目的に依存して、組込み状であるか、または組込み状ではない。同様に、それは、哺乳動物細胞内で複製してもまたはしなくてもよい。産生目的のために、それは、例えば原核複製開始点を含む。ＤＮＡ分子、例えばプラスミドは、所望により、パピローマウイルスのＥ２タンパク質への結合を可能にする部位を含んでいてもよい。かかる部位は、配列として式ＡＣＣＮ₆ＭＴ（式中、Ｎは、独立して、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴであり、Ｍは、ＧまたはＴである）を有してもよい。ＤＮＡ分子はまた、パピローマウイルスのゲノムの長い調節領域（ＬＣＲ）の全部または一部を含んでもよい。このＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子の本質的な機能は、哺乳動物細胞において１つ以上の目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現を可能にすることである。したがって、それは、適切なプロモターの制御下に配置されたコード化領域を含む。例として、特に米国特許USP 5,168,062に開示されているヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターまたはヒトデスミンをコードする遺伝子の 117:947）などの組織特異的プロモーターを挙げることができる。コード化領域の選択は、本発明のＶＬＰの所定の使用により決定されるであろうい。したがって、これらのＶＬＰを、寄生生物感染、細菌感染またはウイルス感染に対するワクチン剤と使用することができる。この場合、ペプチドまたはポリペプチドまたはタンパク質は、寄生生物抗原、細菌抗原またはウイルス抗原から選択される。特定の実施態様によれば、パピローマウイルス感染症に対する治療用または予防用ワクチン接種剤として本発明のＶＬＰの使用が選択される。この場合、コードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、パピローマウイルス（好ましくは、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型または45型ＨＰＶ）のＥ１およびＥ２タンパク質の全部または一部、ならびにＥ６およびＥ７タンパク質の非発癌性形態から有利に選択される。このパピローマウイルスは、所望により、キャプシドタンパク質が誘導される型とは異なる型のものであってもよい。非発癌性形態としては、非発癌性パピローマウイルスのＥ６およびＥ７タンパク質ならびに発癌性パピローマウイルスのＥ６またはＥ７タンパク質の欠失形態が挙げられる；有利なことに、Ｅ６タンパク質のそのような欠失形態は、アミノ酸残基１０６から１１５の間のＥ６領域の全部または一部を含まない(例えば、それはＨＰＶ−１６Ｅ６Δ(１０６−１１０)またはΔ(１１１−１１５)または Δ(１０６−１１５）タンパク質であってもよい)。同様に、Ｅ７タンパク質の欠失形態は、アミノ酸残基２０〜２６の間のＥ７領域の全部または一部を含まない (例えば、それはＨＰＶ−１６Ｅ７Δ(２１−２４)またはΔ(２１−２６)タンパク質であってもよい)。 Crookら，Cell（1991）67:547およびMungerら，EMBO J．（1998）8:4099には、これらの初期タンパク質、それらの対応ＤＮＡフラグメントおよびそれらの非発癌性形態が開示されている。例として、タンパク質の起源について、起こり得る様々な組み合わせを以下に示す(ここに挙げたものが全てではない)：キャプシド核酸Ｌ１Ｌ２Ｅ６Ｅ７ＨＰＶ−１６ＨＰＶ−１６ＨＰＶ−１６ＨＰＶ−１６ＨＰＶ−１６ＨＰＶ−１６ＨＰＶ−１８ＨＰＶ−１８ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１６ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−１８ＨＰＶ−１８ＨＰＶ−１８ＨＰＶ−１６および −−− ＨＰＶ−３３ −−− ＨＰＶ−１８ＨＰＶ−１６ −−− ＨＰＶ−１６ −−− ＨＰＶ−１６ −−− −−− ＨＰＶ−１６もう１つの局面では、自己抗原によって誘発される腫瘍に対して、本発明のＶＬＰをワクチン接種剤として予防的または治療的に使用することを考慮することもできる。腫瘍に関連する抗原の中でも、特にチロシナーゼ、糖タンパク質gp １００、ＭＡＧＥタンパク質ファミリー、ＣＥＡ、rasタンパク質(突然変異型または天然)、p５３タンパク質(突然変異型または天然)、MuclおよびpＳＡが挙げられる。本発明のＶＬＰはまた、これらの分子が処方される全ての用途において、インビボで、サイトカイン、または免疫調節機能（例えば、ヘルパーＴ細胞による細胞認識）を有する二次分子を送達するのにかなり有用であり得る。サイトカインの中でも、特にインターロイキン−２(ＩＬ−２)、ＩＬ−４、−５、−７、−１０、−１２、ＧＭ−ＣＳＦ(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)、ガンマインターフェロン（ガンマ−ＩＮＦ）およびＴＧＦ−ベータ（腫瘍増殖因子−ベータ）が挙げられる。二次分子の中でも、特にＢ７.１、Ｂ７.２、ＣＤ４０、ＣＤ２８およびＣＩＩＴＡが挙げられる。例えば、本発明の目的に有用な核酸分子は、感染因子の抗原または腫瘍に関連する自己抗原をコードする領域を含むだけではなく、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１２をコードする領域を含んでもよい。パピローマウイルス感染症を治療または予防するために、かかる領域は、先に考慮したように核酸分子に付加されてもよい。一般に、このことは、いずれの他のワクチン用途のために行われてもよい。同様に、核酸分子が実質的に少なくとも１つのサイトカインまたは少なくとも１つの二次分子をコードする本発明のＶＬＰは、腫瘍または自己免疫疾患などの様々な病理を治療するため、あるいは移植後の拒絶反応を防止するための成分として治療に有用であり得る。最後に、本発明のＶＬＰはまた、遺伝病の治療にも有用であり得る。この特定の場合、包膜化のために、血友病を治療するためには第VIII因子、デュシェーヌジストロフィー（ミオパシー）を治療するためにはジストロフィンまたは嚢胞性線維症を治療するためにはタンパク質ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症トランスメンブランレギュレーター）などの遺伝子欠損を補正する目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの領域を含む核酸分子が調製される。したがって、本発明の対象は、以下のものでもある：（ｉ）医薬品としての本発明のＶＬＰ；（ii）医薬上許容される希釈剤または担体と組み合わせて、有効成分として本発明の少なくとも１つのＶＬＰを含有してなる医薬組成物；（iii）少なくとも２つのＶＬＰを含有してなる医薬組成物であって、第１のＶＬＰが１６型などの第１の型のＬ１タンパク質の少なくとも全部または一部からなるキャプシドを含み、第２のＶＬＰが１８型などの第１の型とは異なる第２のタイプのＬ１タンパク質の少なくとも全部または一部からなるキャプシドを含む医薬組成物；（iv）細菌もしくはウイルス感染症、例えば自己抗原によって誘発されるような腫瘍または自己免疫疾患の予防薬または治療薬、あるいは移植片拒絶反応の防止薬の調製における本発明のＶＬＰの使用；（ｖ）細菌もしくはウイルス感染症、例えば自己抗原によって誘発されるような腫瘍または自己免疫疾患の治療方法または予防方法、あるいは移植片拒絶反応の防止方法であって、かかる治療を必要とする個体に治療的または予防的に有効な量の本発明のＶＬＰの少なくとも１つを投与することからなる方法；（vi）哺乳動物に生理学的に活性な形態でペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を提供することが可能であるインビボでの発現方法であって、核酸分子が該ペプチドもしくはポリペプチドまたは該タンパク質をコードする領域を含み、ＤＮＡ分子が関与する場合は適切なプロモーターの制御下に配置される本発明のＶＬＰの少なくとも１つを哺乳動物に投与することからなる方法。本発明の組成物は、慣用的な方法で製造され得る。特に、少なくとも１つのＶＬＰが医薬上許容される希釈剤または担体と組み合わされる。希釈剤または担体および処方方法の例については、Remington's Pharmaceutical Scienceに示されている。処方は、投与経路；エアロゾル、注射用処方物、坐剤、錠剤等に依存し得る。本発明の組成物は、この組成物がワクチン効果を目的とする場合、ワクチンの分野で用いられているいずれの慣用的な経路によっても投与され得る。それらは、特に、全身経路、例えば、皮下、皮内、筋肉内または静脈内経路、および粘膜経路、例えば、口腔、鼻腔、肺または肛門経路である。充実性腫瘍の治療が関与する場合、上記の経路が継続して使用され、腫瘍内経路もそれに加えられる；例えば、好都合には、嚢胞性線維症の場合の肺経路（ＶＬＰはエアロゾル形態で処方される）または血友病の場合の静脈内経路が挙げられる。投与は、単回投与あるいは特定の時間間隔後に１回または数回繰り返される投与で実施され得る。適切な用量は、様々なパラメータ、例えば、治療される個体または投与様式に従つて変化する。一般に、１回の用量は、本発明のＶＬＰを１〜２５０μｇ含んでなる。本発明はまた、本発明のＶＬＰの調製方法であって、カルシウム塩のようなキャプシド形態でＬ１タンパク質（またはＬ１およびＬ２タンパク質）の再会合を可能にする薬剤の存在下、上記で定義した核酸分子を解離形態のパピローマウイルスのＬ１タンパク質の全部または一部および所望によりパピローマウイルスのＬ２タンパク質の全部または一部と混合し、該混合物から該ＶＬＰを回収することからなる方法に関する。包膜化されることを目的とするＤＮＡがＥ２タンパク質に結合可能にする部位を含む場合、このタンパク質を再構築混合物に添加することが有利になる。このタンパク質は、例えば、原核系（細菌）または真核系（例えば、酵母、昆虫細胞）における組換え経路によって既に産生されている。混合工程の前に、Ｌ１タンパク質の全部または一部、所望によりＬ２タンパク質の全部または一部を真核宿主細胞における組換え経路によって発現させることが好都合である。この場合、空のウイルス様粒子が回収され、Ｌ１タンパク質の全部または一部、所望によりＬ２タンパク質の全部または一部を解離形態で得るために、それらは還元剤および／またはカルシウムイオンキレート化剤で処理される。好都合には、Ｌ１タンパク質の全部または一部、所望によりＬ２タンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡフラグメントがゲノム中に挿入され、適切なプロモーターの制御下に配置されているバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞における組換え経路によって、Ｌ１タンパク質の全部または一部、所望によりＬ２タンパク質の全部または一部が発現される。。本発明のＶＬＰを、例えば、癌の治療などの長期間の治療に使用する場合、同一型のＶＬＰ（すなわち、同じキャプシドを有するＶＬＰ）の反復投与が免疫学的見地から問題となる場合がある。この不利益の可能性を克服するために、異なるキャプシドを有するＶＬＰの連続使用を考慮することができる。例えば、同一の核酸分子を有する（例えばＩＬ−２またはＩＬ−１２をコードする領域を有する）が、Ｌ１タンパク質および所望によりＥ２タンパク質が誘導されるパピローマウイルスの型が異なるＶＬＰの全範囲を調製することができる。したがって、１６型キャプシドＶＬＰ(１回または数回)、次いで１８型キャプシドＶＬＰ（１回または数回）などが連続して使用されるであろう。したがって、本発明の対象はまた以下のものでもある：（ｉ）遺伝病、癌性病状またはパピローマウイルス感染症の治療方法であって、かかる治療を必要とする哺乳動物に本発明のＶＬＰをｔ_n、ｔ_n+1で反復投与することからなる方法(nは、１以上の数であり；ｔ_n+1で投与されるＶＬＰは、ｔ_nで投与されるＶＬＰのキャプシドのＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質が誘導される型以外の型のパピローマウイルスからｔ_n+1で投与されるＶＬＰのキャプシドのＬ₁タンパク質またはＬ₁およびＬ₂タンパク質が誘導される点で、ｔ_nで投与されるＶＬＰとは異なる)；および（ii）連続投与のためのいくつかの生成物を含有してなる医薬組成物(該生成物は、それぞれ、本発明のＶＬＰからなり、ＶＬＰのキャプシドのＬ₁タンパク質またはＬ₁およびＬ₂タンパク質がそれぞれの生成物について別の型のパピローマウイルスから誘導される点で相互に異なる)。実施例空のＶＬＰの調製ＨＰＶ−１６型ＶＬＰのストックを組換えパピローマウイルスを感染させたＳｆ−９細胞の培養物から調製する。このバキュロウイルスは、そのゲノムに挿入する形で、初めに尖圭コンジローマから単離されたＬ₁およびＬ₂をコードするＨＰＶ−１６のＤＮＡフラグメントを有する。Ｌ₁をコードする配列は、WO 94/579 2に開示されている。特に、２０２位のアミノ酸に対応するコドンがアスパラギン酸コドンであることに注目すべきである。該バキュロウイルスの構築、Ｓｆ−９細胞の培養およびＶＬＰの精製については、Kirnbauerら，J．Virol．（1993）67:6929またはSuzichら，PNAS（1995）92 :11553に開示されている。ＶＬＰの解離３００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）および４０ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイトール）を含有する１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）２５０μｌを、１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に対する透析後に得られたＶＬＰの調製物２５０μｌに添加する。インキュベーションを３７℃で１時間継続させる。解離に供するＶＬＰの最終濃度は、２００μｇ／ｍｌのオーダーである。解離プロトコルの改変については、Volpersら，J．Virol．（1995）69:3258にも開示されている。次いで、この調製物を１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に対して広範に透析する。包膜化されることを目的とするＤＮＡの調製 Ulmerら，Science（1992）259:1745の記載に従って、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターの制御下でインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の核タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド_pnＲＳＶ−ＮＰ(Ａ／ＰＲ／８／３４)を調製する。ＤＮＡの包膜化上記で得られた解離ＶＬＰの調製物５００μｌに５００μｌの容積中５０ngの精製ＤＮＡを添加する。次いで、２０ｍＭ塩化カルシウム溶液２５μｌを添加する。該混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、これを４０％ショ糖中、ＳＷ２８ローター内２８,０００rpmで２０時間遠心分離に供する。包膜化されたＤＮＡを含有するバンドを１.３３g／mlの密度で回収し、１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に対して透析する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/025 Ｃ０７Ｋ 14/025 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）内部空間を規定し、パピローマウイルスのＬ₁タンパク質の少なくとも全部または一部からなるキャプシド、および（ii）該内部空間に含まれる核酸分子であって、少なくとも野生型後期タンパク質をコードするパピローマウイルスのゲノム領域の全部または一部を欠く点で該ゲノムとは異なる核酸分子を含んでなる非感染性ウイルス様粒子(ＶＬＰ)。２．前記キャプシドがＬ₁−Ｅ₇キメラタンパク質状態でＬ₁タンパク質の少なくとも全部または一部からなる請求項１記載のウイルス様粒子。３．前記キャプシドがヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＬ₁タンパク質の少なくとも全部または一部からなる請求項１または２記載のウイルス様粒子。４．前記キャプシドが１型、６型、１０型、１１型、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型または４５型ヒトパピローマウイルスのＬ₁タンパク質の少なくとも全部または一部からなる請求項３記載のウイルス様粒子。５．前記キャプシドが良性の病変（尖圭コンジロームまたは子宮頚部形成異常）から最初に単離されるＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５または −４５のＬ₁タンパク質の少なくとも全部または一部からなる請求項４記載のウイルス様粒子。６．前記キャプシドが２０２位でヒスチジン以外のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＨＰＶ−１６のＬ₁タンパク質の少なくとも全部または一部からなる請求項５記載のウイルス様粒子。７．前記キャプシドが２０２位でアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含むアミノ酸配列を有するＨＰＶ−１６のＬ₁タンパク質の少なくとも全部または一部からなる請求項６記載のウイルス様粒子。８．前記キャプシドがさらにパピローマウイルスのＬ₂タンパク質の全部または一部からなる請求項１〜７のいずれか１項記載のウイルス様粒子。９．前記キャプシドがさらにＬ₂−Ｅ₇キメラ状態でＬ₂タンパク質の全部または一部からなる請求項８記載のウイルス様粒子。１０．前記核酸分子が目的タンパク質をコードする領域を含む請求項１〜９のいずれか１項記載のウイルス様粒子。１１．前記核酸分子がＤＮＡであり、呻乳動物細胞において転写促進可能なプロモーターの制御下に配置された目的タンパク質をコードする領域を含む請求項１０記載のウイルス様粒子。１２．前記ＤＮＡ分子がさらに式ＡＣＣＮ₆ＭＴ（式中、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴであり、Ｍは、ＧまたはＴである）で示されるパピローマウイルスＥ₂タンパク質結合部位を含む請求項１１記載のウイルス様粒子。１３．前記ＤＮＡ分子がさらにパピローマウイルスのゲノムの長い調節領域（ＬＣＲ）の全部または一部も含む請求項１１記載のウイルス様粒子。１４．前記核酸分子が大きくても８kbpである請求項１０〜１３のいずれか１項記載のウイルス様粒子。１５．前記核酸分子がサイトカインおよびヘルパーＴ細胞による細胞認識を容易にする二次分子から選択される目的タンパク質をコードする少なくとも１つの領域を含む請求項１０〜１４のいずれか１項記載のウイルス様粒子。１６．前記核酸分子が腫瘍関連抗原から選択される目的タンパク質をコードする少なくとも１つの領域を含む請求項１０〜１４のいずれか１項記載のウイルス様粒子。１７．前記核酸分子が寄生生物、細菌またはウイルス抗原から選択される目的タンパク質をコードする少なくとも１つの領域を含む請求項１０〜１４のいずれか１項記載のウイルス様粒子。１８．前記核酸分子がパピローマウイルスのＥ₁およびＥ₂タンパク質ならびにＥ₆およびＥ₇タンパク質の非発癌性形態から選択される目的タンパク質をコードする少なくとも１つの領域を含む請求項１７記載のウイル様粒子。１９．前記核酸分子がＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５または −４５型のパピローマウイルスのＥ₁およびＥ₂タンパク質ならびにＥ₆およびＥ₇ タンパク質の非発癌性形態から選択される目的タンパク質をコードする少なくとも１つの領域を含む請求項１８記載のウイルス様粒子。２０．前記核酸分子が、前記キャプシドタンパク質が誘導される型とは異なる型のパピローマウイルスのＥ₁およびＥ₂タンパク質ならびにＥ₆およびＥ₇タンパク質の非発癌性形態から選択される目的タンパク質をコードする少なくとも１つの領域を含む請求項１８または１９記載のウイルス様粒子。２１．請求項１５および１６、１８、１９または２０記載のウイルス様粒子。２２．前記核酸分子が遺伝病の治療における目的タンパク質をコードする少なくとも１つの領域を含む請求項１０〜１４のいずれか１項記載のウイルス様粒子。２３．医薬品としての請求項１〜２２のいずれか１項記載のウイルス様粒子。２４．請求項１〜２２のいずれか１項記載のウイルス様粒子の調製方法であって、少なくとも野生型後期タンパク質をコードするパピローマウイルスのゲノム領域の全部または一部を欠く点で該ゲノムと異なる核酸分子を解離形態のパピローマウイルスのL₁タンパク質の全部または一部とカルシウム塩の存在下で混合し、該混合物からウイルス様粒子を回収することを特徴とする調製方法。２５．パピローマウイルスのＥ₂タンパク質の全部または一部を前記核酸分子および前記Ｌ₁タンパク質と混合する請求項２４記載の調製方法。２６．Ｎ末端部分を欠失したパピローマウイルスＥ₂タンパク質を混合時に添加する請求項２５記載の調製方法。２７．混合工程の前に、（ｉ）Ｌ₁タンパク質の全部または一部、所望によりＬ₂タンパク質の全部または一部を組換え経路によって発現させ、（ii）空のウイルス粒子を回収し、（iii）Ｌ₁タンパク質の全部または一部、所望によりＬ₂タンパク質の全部または一部を解離形態で得るために前記空のウイルス粒子を還元剤および／またはカルシウムイオンキレート化剤で処理する請求項２４〜２６のいずれか１項記載のウイルス様粒子の調製方法。２８．ゲノム内にＬ₁タンパク質の全部または一部、所望によりＬ₂タンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡフラグメントが挿入され、適切なプロモーターの制御下に配置されているバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞において組換え経路によってＬ₁タンパク質の全部または一部、所望によりＬ₂タンパク質の全部または一部を発現させる請求項２７記載の調製方法。２９．連続投与のためのいくつかの生成物を含む医薬組成物であって、該生成物がそれぞれ請求項１〜２２のいずれか１項記載のウイルス様粒子からなり、該ウイルス様粒子のキャプシドのＬ₁タンパク質またはＬ₁およびＬ₂タンパク質がそれぞれの生成物について異なる型のパピローマウイルスから誘導される点で互いに異なることを特徴とする医薬組成物。