WO1998032861A1 - Composition comprenant une proteine e2 de papillomavirus ou une sequence de nucleotides codant pour une proteine e2 de papillomavirus - Google Patents

Composition comprenant une proteine e2 de papillomavirus ou une sequence de nucleotides codant pour une proteine e2 de papillomavirus Download PDF

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WO1998032861A1
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papillomavirus
modified
cells
nucleotide sequence
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PCT/FR1998/000169
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Christian Desaintes
Caroline Demeret
Sylvain Goyat
Moshe Yaniv
Françoise Thierry
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Institut Pasteur
Universidad Nacional Autonoma De Mexico
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to a composition comprising at least one protein.
  • the invention also relates to their use as a medicament, and in particular for the treatment of a papillomavirus infection and also for the treatment of cancer associated with a papillomavirus infection.
  • Papillomaviruses are DNA viruses identified in humans and animals, which cause damage to the skin and mucous membranes, which can progress to the formation of carcinomas or cancer, especially of the cervix.
  • HPV papillomavirus
  • the E2 protein of Papillomavirus plays an important role in the life cycle of the virus by regulating the transcription and replication of the viral genome.
  • the protein E2 regulates viral transcription when it is linked to a palindromic DNA sequence present in several copies in the regulatory region of all papillomaviruses.
  • the E2 protein, along with the E1 protein and cell replication factors, also acts at the level of initiation of viral DNA replication (Ustav, M. et al. (1991), EMBO J., 10, 449- 457; Chiang, CM. Et al. (1992), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89, 5799-5803; Del Vecchio, AM et al. (1992), J.
  • the E2 protein contains two regions that are relatively well conserved in all papillomaviruses; these two regions are separated by a non-conserved region of variable length, according to the types of papillomavirus, (region called "hinge", Giri, 1. et al. (1988), EMBO J., 10, 2931-2940).
  • the amino-terminal part of the E2 protein is necessary for transactivation; replication and association with the E1 protein (Benson, JD et al. (1995), J. Virol., 69, 4364-4372).
  • the carboxy-terminal part of the E2 protein is responsible for the dimerization of the protein and its specific binding with DNA (Androphy, EJ et al. (1987), Nature, 325, 70-73; Dostatni, N. and al. (1988), EMBO J., 7, 3807-3816; McBride, AA et al. (1989), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 510-514).
  • Bovine papillomavirus type 1 (BPV-1) has been extensively studied as a model for the replication, transcription and cellular transformation of papillomaviruses.
  • the expression of viral genes is controlled by seven promoters, four of which are activated by a complete 48 kDa E2 protein.
  • BPV-1 also codes for two truncated forms of E2, one of 28 kDa and the other of 31 kDa (Lambert, PF et al. (1989), J. Virol., 63, 3151-3154).
  • the 31 kDa form (E2TR) is obtained by transcription initiated upstream of an internal ATG codon, and is devoid of the N-terminal transactivation region.
  • Another approach chosen within the framework of the invention, consisted in defining means capable of slowing the viral development of papillomavirus and / or capable of preventing the formation or the evolution of cellular lesions caused by the infection and in particular to stop the cell proliferation of cancerous tumors or to kill the cells of these tumors.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising an E2 protein, wild or modified, of papillomavirus or a nucleotide sequence coding for an E2 protein, wild or modified, of papillomavirus, and a physiologically acceptable vehicle.
  • composition is capable of having effects in vitro and / or in vivo on cells infected with papillomavirus.
  • nucleotide sequence is meant a polynucleotide; and in particular a DNA, in particular a cDNA, an RNA, a nucleic acid fragment or a synthetic sequence.
  • DNA in particular a DNA, in particular a cDNA, an RNA, a nucleic acid fragment or a synthetic sequence.
  • DNA Preferably, we mean DNA.
  • the papillomavirus E2 protein has been described for the different types of viral isolates identified, in several publications.
  • the E2 DNA sequence of the viral genome isolated from a cervical carcinoma caused by infection with a human papillomavirus type 18 has been described by Cole et al., J. Mol. Biol., 1987, 193, 599-608.
  • the DNA sequence of the E2 protein of a human papillomavirus type 16 (HPV16) has been described by Seedorf et al., Virology, 1985, 145, 181-185; Kennedy et al., J. Virol., 1991, 65, 2093-2097.
  • nucleotide sequences and in particular the DNA, encoding the E2 protein of other papillomaviruses have been published and are in particular accessible via the references of the GENBANK database.
  • an isolated protein or nucleotide sequence is usually used; preferably at least partially purified; and, particularly preferably, pure.
  • the composition according to the invention is devoid of the E1 protein of papillomavirus.
  • physiologically acceptable vehicle is meant any substance or composition compatible with administration in vivo.
  • composition according to the invention advantageously comprises an E2 protein which is a protein whose amino acid sequence is modified compared to that of the wild-type E2 protein, or a nucleotide sequence coding for an E2 protein, which sequence is modified by relative to the wild-type sequence, such that the resulting E2 protein has substantially the biological activity of the wild-type E2 protein on the cellular protein p53.
  • wild protein is meant a natural protein, found in viral clinical isolates, isolated from its natural environment in the papillomavirus, that is to say identified, isolated and purified from a papillomavirus. It is a protein that is encoded by a papillomavirus gene.
  • modified protein is meant a protein whose amino acid sequence is different from the wild protein sequence by at least one amino acid, in particular after mutation.
  • the modified sequence aims to make the synthesis of the protein more efficient and to give the protein increased intracellular stability.
  • it is different by 1 to 20 amino acids, usually by 1 to 15 amino acids, preferably by 1 to 10 amino acids and particularly preferably by 1 to 5 amino acids.
  • the invention relates, for example, to an E2 protein which has undergone a point mutation by substitution of an amino acid.
  • modified nucleotide sequence is meant a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence which codes for the wild-type protein with at least one nucleotide. Generally, it is different by 1 to 60 nucleotides, usually by 1 to 30 nucleotides, preferably by 1 to 20 nucleotides and in a particularly preferred manner by 1 to 6 nucleotides.
  • the invention relates to a nucleotide sequence different by a codon from the wild-type sequence coding for the protein E2.
  • sequence can be modified chemically or by a genetic engineering technique (mutated sequence). Methods of sequence modification are known.
  • the modified sequence of the E2 protein or of the nucleotide sequence, in particular DNA, coding for the E2 protein can be modified by being truncated at its N- and / or C-terminal end, or truncated in its internal part, or partially substituted. Under these conditions, it will be necessary to verify, for example on the basis of the tests proposed in the experimental part which follows, that the modified form is active for the desired properties with respect to a papillomavirus infection.
  • the cellular protein p53 is a nuclear phosphoprotein of 53 kDa. It has been described in Pathologie Biologie, March 1995, Vol. 43 (3), 166-173; and by Linda J. Ko et al., Genes & Development, 1996, 10, 1054-1072. Protein p53 is a transcription factor that specifically binds DNA sequences (Farmer et al; Nature, 1992, 358, 83-86; Funk et al., Mol. Cell Biol., 1992, 12, 2866-2871 and Kastan and al., Cell, 1992, 71, 587-597).
  • resulting protein is meant the protein obtained after the modification of the amino acid sequence or of the nucleotide sequence which codes for the protein.
  • the invention also relates to a composition comprising a protein.
  • E2 whose sequence is modified compared to that of wild type E2 protein, or a nucleotide sequence modified compared to wild type sequence, such that the resulting E2 protein participates in a biological activity of apoptosis of cells infected with a papillomavirus virus.
  • apoptosis By apoptosis is meant death of cells infected with the virus or cells derived from or descended from the latter.
  • the invention also relates to a composition comprising a modified E2 protein whose sequence is modified in the region regulating viral replication, so that the resulting E2 protein is defective for viral replication of papillomavirus.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising a nucleotide sequence coding for a modified E2 protein, the sequence of which is modified in the region responsible for viral replication, so that the resulting E2 protein is defective for viral replication of papillomavirus.
  • the sequence is preferably modified, in particular mutated by deletion, substitution, addition, in the N-terminal region of the E2 protein.
  • Such proteins are in particular described by Sakai et al., J. Virology, 1996, 70 (3), 1602-1611, by Brokaw et al., J. Virology, 1996, 70 (1), 23-29, and by Ferguson et al., J. Virology, 1996, 70 (7), 4193-4199; the process for obtaining such proteins is also described there.
  • E39A protein gave good As a result, the residue located at position 39 in the sequence of the wild-type protein is substituted by an alanine in the modified sequence.
  • the present invention applies to E2 proteins and to the nucleotide sequences coding for an E2 protein of all papillomaviruses.
  • human papillomaviruses Preferably, it applies to a papillomavirus of the group comprising HPV16, HPV18, HPV31 and HPV33.
  • bovine papillomaviruses Preferably, it applies to a bovine papillomavirus BPV-1.
  • the present invention further relates to a nucleotide sequence coding for a protein derived from the E2 protein of papillomavirus HPV18, the residue located at position 2 in the sequence of the protein derived from E2 being a glutamic acid residue.
  • This nucleotide sequence results from the fact that the codon which follows the ATG codon for initiating the translation of the E2 protein was modified during the cloning by insertion of an NCOI restriction site. In other words, in the nucleotide sequence ATGC.AG. The Q has been replaced by a G.
  • the sequence of the E2 protein is particularly well conserved in all types of papillomavirus.
  • the alignment of the sequences of the E2 proteins of various papillomaviruses is illustrated in FIG. 13.
  • the DNA interaction domain of the E2 protein of various papillomaviruses contains two ⁇ helices, the largest of which is located between the acid residues amines at positions 288 to 305 of the human papillomavirus HPV18 sequence.
  • the sequence of this ⁇ helix is almost completely conserved in all human and bovine papillomaviruses.
  • the sequence of the E2 protein of bovine papillomavirus BPV-1 comprises an arginine residue at position 344 which corresponds according to the alignment of the sequences to position 305 in the sequence of the E2 protein of human papillomavirus HPV18.
  • the invention relates in this respect to a modified E2 protein or a nucleotide sequence which codes for a modified E2 protein in the region of the ⁇ helix as defined above.
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence coding for a protein derived from a human papillomavirus E2 protein, said protein comprising an amino acid sequence of which at least one residue chosen from the following is modified for example by substitution: - the praline residue in position 288,
  • the mutation can be a substitution with a residue such as an alanine or leucine residue.
  • the modified sequence of the E2 protein or of the nucleotide sequence, in particular DNA, coding for the modified E2 protein is truncated at its N- and / or C-terminal end, or truncated in its internal part, or partly substituted.
  • the modified form is active for the desired properties with respect to a papillomavirus infection or a transformation cell associated with a papillomavirus.
  • the proteins used in the present invention advantageously conserve the capacity for binding to the DNA of the wild-type E2 protein.
  • the invention also relates to a vector comprising a nucleotide sequence as defined above.
  • this vector is chosen from the group of vectors formed by plasmids, viruses, retroviruses, or synthetic vectors or inert vectors.
  • the vector is a virus, such as an adenovirus, a parvovirus or an AAV in particular.
  • this vector is an adenovirus.
  • a vector of adenovirus type which can be used to carry out the invention is in particular described by Qing Wang et al. (Nature Medicine, 1996, 2 (6), 714- 716).
  • the choice of vector will take into account the objectives sought, for example depending on whether it is a question of defining means of treatment, for example by gene therapy of infection by a papillomavirus in a host or of a malignant transformation in a host .
  • An example of construction of a recombinant vector, of viral origin, is in particular described in the international patent application WO 93/06223.
  • the vector of the invention is advantageously chosen from vectors having a high infectious titre and presenting the appropriate safety guarantees for, if necessary, administration in vivo in a patient infected with a papillomavirus.
  • synthetic vector any non-viral gene transfer system.
  • a synthetic vector can comprise naked DNA, a liposome, a DNA-protein complex, a DNA-cationic polymer complex.
  • Other examples are described by Yang (Critical rev. Biotech., 1992, 12, 335-356).
  • vectors which can be used in the context of the invention are inert vectors such as, for example, liposomes (FR 9402070).
  • the invention also relates to the plasmid pCGE2.18VoNCO deposited at the C.N.C.M. (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25, Rue de Do Budapest Roux, Paris, France) on January 29, 1997 under number 1-1839.
  • the invention also relates to the plasmid pCGE2TR deposited at the C.N.C.M. January 29, 1997 under number 1-1838.
  • the invention also relates to a protein derived from the E2 protein of HPV18 papillomavirus, said protein comprising an amino acid sequence of which at least the residue located at position 2 is a glutamic acid residue.
  • the invention relates to a papillomavirus E2 protein, which comprises an amino acid sequence of which at least one residue chosen from the following is modified, for example by substitution:
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleotide sequence or a vector as defined above and a physiologically acceptable vehicle.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a protein, as defined above, and for example E2TR and a physiologically acceptable vehicle.
  • E2TR protein is a form of E2 protein from BPV-1. It does not contain most of the N-terminal transactivation domain. It has a molecular weight of 31 kDa (Lambert et al., Cell, 1989, 50, 69-78).
  • pharmaceutical composition designates any composition compatible with a use in the field of pharmacy, whether it is a curative or prophylactic therapeutic use, or a use in maintenance treatment or complementary to a treatment therapeutic. More generally, it is a composition compatible with use in humans.
  • the means of the invention defined in the preceding pages namely the nucleotide sequences coding for an E2 protein or for a modified E2 protein, the vectors containing them, the E2 proteins or modified E2 proteins are the active principles of a composition capable of constituting a medicament or of entering into the composition of a medicament.
  • the composition defined above as well as the nucleotide sequences coding for an E2 protein or for a modified E2 protein, the vectors containing them, the E2 proteins or modified E2 proteins can be used for the treatment of 'a papillomavirus infection, and in particular for the treatment of cancer associated with a papillomavirus infection or with a cell transformation associated with a papillomavirus.
  • the invention also relates to the plasmid pCGE2.18VoNCO deposited at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25, Rue de Do Frankfurt Roux, Paris, France) on January 29, 1997 under the number 1-1839 for l use as a medicine.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25, Rue de Do Frankfurt Roux, Paris, France
  • it is applicable for the treatment of a papillomavirus infection, and in particular for the treatment of cancer associated with a papilloma
  • the invention also relates to the plasmid pCGE2TR deposited at the C.N.C.M. January 29, 1997 under number 1-1838 for use as a medicine.
  • it is applicable for the treatment of a papillomavirus infection, and in particular for the treatment of cancer associated with a papillomavirus infection or with a cell transformation associated with a papillomavirus.
  • the invention also relates to a use of a composition according to the invention as well as the nucleotide sequences coding for an E2 protein or for a modified E2 protein, the vectors containing them, the E2 proteins or modified E2 proteins for obtaining a medicament intended for therapeutic use against a papillomavirus infection, and in particular against a cancer associated with a papillomavirus infection or with a cell transformation associated with a papillomavirus.
  • the invention relates in particular to the use of a vector containing a nucleotide sequence coding for the modified or wild-type papillomavirus E2 protein, or of a vector as defined above, or of the plasmid pCGE2.18VoNCO, or of the plasmid pCGE2TR for obtaining a medicament intended for therapeutic use against a papillomavirus infection, and in particular against a cancer associated with a papillomavirus infection.
  • the expression “treatment of an infection due to a papillomavirus” applies to the biological activities developed in vitro or in vivo at the level of cells infected with a papillomavirus or of cells derived from the latter, in particular by proliferation , activities resulting directly or indirectly from the contacting of said cells with the compositions, nucleotide sequences or proteins described above. These activities include the effects observed on the virus, in particular on viral replication, after bringing the cells into contact with the means of the invention, as well as the effects observed on the metabolism or growth of infected cells or cells derived from the latter, in particular by proliferation.
  • Treatment of infection includes therapy, including controlling the course of infection including prevention or inhibition in an infected host, development of lesions or tumors associated with the infection and likely to progress towards the clinical phase of cancer (stage of infection succeeding the asymptomatic phase in the patient) or towards the development of metastases or the fatal stage of the disease.
  • this expression encompasses the ability to reduce the viral load in the host, including until the elimination or latency of the virus in the infected patient and / or preferably this expression encompasses growth arrest. lesions or tumors developed as a result of HPV infection.
  • the invention relates to the use of the means described above, to cause apoptosis of cells infected with papillomaviruses or cells derived therefrom, in particular by proliferation, in particular cancer cells.
  • the treatment of papillomavirus infection therefore relates, within the framework defined above, to the treatment of the cause of the infection or of the observed or latent effects in a patient infected with a papillomavirus, whether these effects are linked to viral replication.
  • the effects observed in the patient correlatively to the course of the infection such as the development of precancerous or cancerous lesions and tumors.
  • the subject of the invention is also a recombinant prokaryotic or eukaryotic cell, characterized in that it comprises a nucleotide sequence as described above or a vector according to the invention, under conditions allowing the expression in vitro or in vivo of said sequence.
  • Eukaryotic cells of interest are human or animal cells.
  • the recombinant cells can be transient or permanent lines, for example HeLa lines.
  • compositions for therapeutic use characterized in that it comprises an active principle chosen from an E2 protein of papillomavirus or a protein modified according to the invention or a DNA coding for an E2 protein of papillomavirus or coding for a modified protein according to the invention, a vector according to the invention, or also a recombinant cell as defined above.
  • this composition for therapeutic use may present in association with an appropriate pharmaceutically acceptable vehicle, in particular an aqueous vehicle or a vehicle in the form of liposomes.
  • the formulation of the composition may vary depending on whether the patient is looking for a transient effect or a delayed effect of the active principle.
  • the E2 protein or the modified E2 protein according to the invention or the DNA which codes for the E2 protein or for a modified E2 protein according to the invention, as well as the compositions, vectors and / or cells comprising them can be used alone or in combination or in combination, for separate or simultaneous administration with other active molecules for the treatment of papillomavirus infection.
  • an agent active in the treatment of a infection due to a papillomavirus selected from the compounds having an activity of inhibitor or regulator of viral cell cycle, or a compound active in immunotherapy can be associated with the reagents of the invention.
  • the transient expression of the E2 protein of human or bovine papillomavirus, or of an E2 protein whose sequence has been modified, in tumor cells infected with a papillomavirus induces a arrest of the cell cycle in phase G1 and / or leads to cellular apoptosis.
  • the arrest of the cell cycle by the protein is due to a post-tarnscriptional activation of the p53 protein, either by negative regulation of the expression of the E6 gene, which is known to negatively regulate the stability of the p53 protein, or by a independent route of expression of the E6 gene.
  • the present invention has shown the inducing effect of apoptosis of the E2 protein of a papillomavirus, or of an E2 protein whose sequence has been modified.
  • the present invention relates to the use of the E2 protein as an anti-tumor compound in the case of papillomavirus infections leading to the development of cancer.
  • the present invention has also shown the synergistic action of the E2TR protein and the E2K344 protein in the post-transcriptional activation of the p53 gene.
  • the invention has shown that the protein E2K344 is capable of inducing apoptosis in tumor cells infected with a papillomavirus.
  • Gene cancer therapy approaches can be carried out along two axes: in the context of the tumor phase of a solid tumor or in the post-surgical micrometastatic context.
  • a proximity effect (“by-stander") has been observed, that is to say that the tumor cells which have not been the subject of a treatment have been destroyed by the effect of continuity.
  • the present invention shows that the injection of a plasmid containing the E2 gene under the control of the CMV promoter causes a decrease in tumors of HeLa cells grafted in nude mice. This demonstrates anti-activity in vivo tumor expression of the E2 gene in tumor cells initially infected with a papillomavirus.
  • composition protein; the vector, the nucleotide sequence, such as the DNA containing the E2 gene, according to the invention can be injected into the patient after having been coupled to compounds which promote the penetration of these, in particular DNA at 1 inside the cell or its transport to the cell nucleus.
  • the resulting conjugates can be encapsulated in polymer microparticles, as described in international patent application WO 94/27238.
  • the nucleotide sequence according to the invention can be complexed with
  • DEAE-dextran as described by Pagano et al., J. Virol., 1967, 1, 891
  • nuclear proteins as described by Kaneda et al., Science, 1989, 243, 375
  • lipids as described by Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1987, 84, 7413
  • encapsulated in liposomes as described by Fralkey et al. J. Biol. Chem., 1980, 255, 10431).
  • the nucleotide sequence according to the invention can be introduced in the form of a gel facilitating its transfection in the cells.
  • a gel composition may be a poly-L-lysine and lactose complex, as described by Midoux et al. (Nucieic Acids Research, 1993, 21, 871-878), or with a polymer of the brand POLOXAMER 407, as described by Pastore (Circulation, 1994, 90, I, 517).
  • the nucleotide sequence according to the invention can also be suspended in a buffer solution to be applied to the patient.
  • nucleotide sequence according to the invention can also be associated with liposomes.
  • DNA can be encapsulated in a lipid bilayer, as described in international patent application WO 95/22961.
  • DNA-coated microbeads biolistics process
  • DNA complexing agent such as cationic polymers and cationic lipids.
  • the cationic polymers which can be used are in particular poiylysine, protamine, and spermine.
  • the lipids which can be used are in particular DOTMA 1, 2-dioleyloxypropyl-3-trimethyl ammonium bromide. Certain polycationic lipids can also be used.
  • the present invention also relates to a mixture containing the E2 protein, an E2 protein whose sequence has been modified, the nucleotide sequence which codes for the E2 protein or for an E2 protein whose sequence has been modified, and an additive which promotes their effect.
  • additive which promotes their effect is meant an inhibitor or regulator of the cell cycle, an agent which promotes the increase in the synthesis of the induced p53 protein, a chemotherapeutic substance, such as in particular taxol, cisplatin.
  • the E2 protein or the nucleotide sequence coding for the E2 protein or the composition according to the invention can be delivered directly into the interstitial space of the infected tissues or inside the cells infected with a papillomavirus and / or cells carrying pre-cancerous lesions and / or cancer cells.
  • a method applied to naked DNA is described in particular in international patent application WO 90/11092.
  • the present invention also relates to a local or topical formulation comprising a wild-type or modified E2 protein or a nucleotide sequence coding for a wild-type or modified E2 protein, a composition as described above or a vector as described above.
  • the wild-type or modified E2 protein, or the nucleotide sequence coding for an E2 protein can be used at various doses depending on the extent of the surface to be treated and the extent of the lesions associated with the infection.
  • a composition is used containing a dose which usually comprises from 1 to 1000 ⁇ g of nucleotide sequence, and preferably from 10 to 500 ⁇ g of nucleotide sequence.
  • a composition is used containing a dose which usually comprises from 0.05 to 10 ⁇ g of protein, and preferably 0.1 to 1 ⁇ g of protein.
  • the treatment is local, the composition being applied directly to the level of the lesion, either once or several times at regular intervals of several days, for example 5 to 10 days.
  • the composition comprises an E2 protein
  • the composition additionally comprises a complexing agent which facilitates the internalization of the protein in infected cells.
  • the present invention also relates to a method for selecting derivatives of the E2 protein capable of inducing apoptosis of cells infected with a virus of the papillomavirus type.
  • a method for selecting derivatives of the E2 protein capable of inducing apoptosis of cells infected with a virus of the papillomavirus type will advantageously include the use of a host cell in culture containing the part of the genome of a human or bovine papillomavirus corresponding to the E6 and E7 genes, this part of the genome also comprising the P105 promoter region, placed upstream of the sequences encoding the E6 and E7 genes.
  • the part of the papillomavirus genome contained in the host cell in culture will be either integrated into the genome of said host cell or in the form of a vector containing said part of the genome of a papillomavirus.
  • the part of the genome of a papillomavirus containing the genes E6 and E7, as well as their promoter region will be integrated into the genome of said eukaryotic host cell, which will preferably be a mammalian cell and even more preferably a human cell, advantageously an immortalized human cell.
  • the host cell used in the " method for selecting biologically active E2 derivatives according to the invention is is transfected with a vector, in particular a recombinant adenovirus or a plasmid, containing a nucleic sequence coding for a candidate derived from the protein E2 to be tested placed under the control of elements allowing its expression in the host cell.
  • a vector in particular a recombinant adenovirus or a plasmid, containing a nucleic sequence coding for a candidate derived from the protein E2 to be tested placed under the control of elements allowing its expression in the host cell.
  • the activity of the E2 protein derivatives according to the invention is then evaluated by implementing the apoptosis test described in Example 12 or in Example 13, for example by measuring the degree of mortality in the culture of transfected host cells.
  • the host cells containing the part of the genome of a papillomavirus comprising E6 and E7 and P105 are cotransfected respectively by a first vector (plasmid for example) containing an expressible marker gene in said host cells and a second vector containing a nucleic sequence coding for a candidate derived from the E2 protein to be tested placed under the cotrole of elements allowing its expression in this host cell.
  • the marker gene is advantageously a gene coding for a protein easily detected in cell culture, advantageously a fluorescent protein, and more particularly a GFP protein.
  • the evolution of cell mortality is then followed by observing the fluorescence of the culture of the transfected host cells using a fluorescence microscope.
  • the present invention has shown that inactivation of the viral E2 protein plays an essential role in the development of cervical cancer.
  • the progression of dysplasia associated with the HPV18 papillomavirus to a malignant stage is related to the rupture of the open reading phase of E2 or its lack of expression which is a consequence of the integration of viral DNA into the genome cell (Berumen, J. et al., 1994, Int. J. Cancer, 56, 640-645).
  • One such case occurred in HeLa cells from a carcinoma of the cervix due to a human papillomavirus HPV18 (Schwarz, E. et al., 1985, Nature, 314, 111-114).
  • the transformed phenotype is dependent on the continuous expression of the viral E6 and E7 proteins (Bosch, FX et al., 1990, J. Virol., 64, 4743-4754). These genes were transcribed from the p105 promoter which contains the binding sites for the E2 protein (Gold, F. et al., 1987b, J. Virol., 61, 134-142). It has been shown in co-transfection trials that E2 represses the P 105 promoter by specifically binding its DNA sequences located near the TATA box (Gold, F. et al., 1991, New Biol., 3, 90 -100; and Demeret, C. et al., 1994, J. Virol., 68, 7075-7082). O 98 61
  • BPV-1 protein E2 has been shown to be able to increase the level of p53 protein in HeLa cells by 8 to 20 times (Hwang, E.-S. et al., 1993, J. Virol. , 67, 3720-3729 and 1996, Oncogene, 12, 795-803; and Dowhanick, JJ et al., 1995, J. Virol., 69, 7791-7799). It has been hypothesized that this increase in the level of p53 caused by E2 could be due to a reverse regulation of the expression of E6 through a transcriptional repression of the P 105 promoter.
  • the present invention has shown that the E2 proteins of HPV18 and BPV-1 expressed in HeLa cells can activate the two reporter plasmids (PG13-CAT and MDM2-CAT) carrying the interaction sites of the p53 protein.
  • the truncated versions of E2 (modified proteins) moderately induced activation of the transcription activity of p53 (less than 10% of that obtained with the complete E2 protein).
  • These trials showed a clear gap between the capacities of the two forms of E2 to activate p53, while the two suppressed the transcription of endogenous E6 / E7.
  • fine variations in the repression rates of E6 transcription may exist between the complete and modified E2 proteins. Cells expressing E2TR could continue to produce enough E6 protein to degrade p53.
  • the assays of the present invention have shown that activation of E2-induced transcription and activation of p53 are independent events.
  • E2 could interact with p53, leading to the stabilization of the protein. An auxiliary factor would then be involved.
  • E2 could interfere with factors which increase the binding activity of p53 DNA, such as casein kinase II (Hupp, TR et al., 1992, Cell , 71, 875-886), protein kinase C (Hupp, TR et al., 1994, Curr. Biol., 4, 865-875); Takenaka, I. et al., 1995, J. Biol. Chem., 270, 5405-5411) or dependent cyclin kinases (Wang, Y. et al., 1995, Nature, 376, 88-91).
  • E2 could interact with a factor that inhibits the transcription activity of p53, for example MDM2 (Momand, J. et al., 1992, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 91, 1998-2002).
  • E2 should activate the transcription activity of p53 in HPV-negative cell lines.
  • E2 induced moderate but regular activation of the reporter plasmid PG13-CAT in HPV-negative cells containing wild type p53, such as HepG2 or NIH3T3.
  • p53-null SAOS cells or cells containing point mutations in the p53 gene SW13, C33 or HaCaT
  • E2 was able to increase the activation of PG13-CAT when it was co-expressed with the p53 protein exogenous.
  • the level of activation induced by E2 in HPV-negative cells remained 10 times lower than that obtained in HeLa cells.
  • the E2 protein of BPV-1 induces growth arrest in G1 phase in HeLa cells, by an increase in the level of p53 (Hwang, E.-S. et al., 1993, J. Virol., 67, 795 -803; Dowhanick, JJ et al., 1995, J. Virol., 69, 7791-7799).
  • the present invention confirmed these observations for the E2 protein of BPV-1 and showed that the homologous HPV18 E2 protein behaved similarly.
  • the present invention has shown that the expression of c-p53 (transdominant negative mutant) has overcome the blocking of the cell cycle induced by E2, proving clearly that the specific transactivation function of p53 sequence is responsible for this effect.
  • the present invention has shown that the E2 proteins of BPV-1 and HPV18 cause cell death when they are transiently expressed in HeLa cells.
  • E2-induced cell death shows the characteristics of apoptosis, such as chromatin condensation, DNA content less than 2n, and double-stranded DNA clippings.
  • the procedure leading to E2-induced cell death seems to diverge, at least partially, from that involved in arresting growth in G1 phase induced by E2, since this does not require the transcription activity of p53.
  • the role of p53 as a transcription regulator cannot be completely ruled out.
  • E2-induced cell death appears to be, at least in part, independent of repression of E6 / E7 transcription, since E2TR was unable to induce an abnormal cell phenotype, while E2K344 may have caused cell death in some case.
  • the lack of effect observed with E2TR can be explained in two ways. On the one hand, E2TR does not only suppress the synthesis of E6, but also that of E7. Reverse modulation of E7 activates the retinoblastoma protein, which protects cells from apoptosis (Almasan, A. et al., 1995, Proc. Natl Acad. Sci.
  • E2 induces p53 in HeLa cells by at least two pathways. One is achieved by repressing the transcription of endogenous E6 / E7. In the other pathway, E2 activates p53 either through a direct interaction or through an auxiliary factor.
  • the figurel represents the analysis of the primer extension carried out with the specific probe of the E6 protein, on the total RNA extracted from the transfected cells expressing the membrane marker H2Kd.
  • the two proteins E2 from HPV18 (lane 5) and BPV-1 (lane 3) reduced the level of E6 specific RNA initiated by the P 105 promoter (upper arrows in FIG. 1).
  • a comparable level of repression was obtained with the truncated form of the E2 protein of BPV-1, the E2TR protein, in which most of the amino-terminal activation region is lacking (lane 2).
  • HeLa cells are transfected into 10 cm Petri dishes with 1 ⁇ g of the plasmid expressing H2Kd and 1 ⁇ g of one of the vectors coding either for the E2 protein of BPV-1 (lane 3), or for the E2TR protein of BPV- 1 (lane 2), either for the E2 protein of HPV18 (lane 5) or for a negative E1TTL control (lanes 1 and 4).
  • ⁇ -act. represents ⁇ -actin.
  • Figure 2 Figure 2 ( Figures 2A, 2B, 2C) shows that E2 activates promoters containing the p53 binding sites.
  • FIG. 2A shows that the expression of the E2 protein of BPV-1 throughout its length resulted in an increase in CAT activity from the plasmids directed by the MDM2 promoter responding to p53 naturally, or a framed synthetic promoter by 13 binding sites for p53 (PG13-CAT).
  • FIG. 2B shows that the truncated protein of p53 was detected by immunology using the monoclonal antibody Ab421.
  • FIG. 2C shows that the expression of c-p53 has completely eliminated the transcriptional activity of p53 induced by E2.
  • FIG. 3 shows that E2 does not activate p53 only by repressing the endogenous transcription of E6, because the two truncated and deleted forms of E2 are not capable of inducing activation of the p53 dependent transcription at high levels.
  • FIG. 4 shows Western Blot analyzes (Figure 4A).
  • FIG. 4 shows that the amounts of p53 RNA did not vary in the cells expressing the two E2 proteins, in comparison with the cells transfected with the negative control vector (FIG. 4B).
  • the concomitant action of the two forms of E2 leads to activation of p53 as good as the complete E2 protein.
  • Figure 5 shows that at optimal concentrations, the protein E2K344 induced PG13-CAT 20 times more (Figure 5A). This activation was 3 times lower and 7 times higher than that observed with the wild-type protein E2 and the truncated protein E2TR, respectively.
  • FIG. 5B shows that the loss of the DNA binding activity of the modified protein E2K344 was confirmed by its inability to activate transcription from TKE2-CAT under conditions in which the wild-type E2 protein activated transcription up to 70 times more.
  • FIG. 5C shows that the synergistic activation of PG13-CAT by E2K344 and E2TR has been correlated with an increase in the level of the p53 protein.
  • FIG. 6 shows that the 2n (sub-2n) subpopulation of cells which express E2 is three times larger than that of cells transfected with a negative control plasmid E1TTL or a vector which expresses E2TR (FIG. 6A).
  • the proportion of sub-2n DNA is shown on the left in Figure 6A.
  • Figure 6B shows photographs of cells expressing E2TR (section 1), E2K344 (section 2), or E2 (sections 3-6). The nuclei were stained with propidium iodide (sections 1-3). H2Kd-positive cells were stained green with an anti-H2Kd antibody coupled to FITC (sections 1-3).
  • Sections 4 and 5 represent the same section of cells stained either with an antibody coupled with a Texas red which detects the E2 protein (section 4) or with DAPI (section 5).
  • An example of TUNEL-positive nuclei is shown in section 6.
  • the arrows indicate the transfected cells which show abnormal appearances.
  • Part of the transfected cells expressing all of the E2 protein (section 3) or the modified E2K344 protein (section 2) shows a marked reduction in the size of their cytoplasm and of their nucleus. These abnormal appearances were not observed in cells transfected with E2TR (section 1).
  • FIG. 7 shows that the HeLa cells were transfected with 5 ⁇ g of PG13-CAT and 0.5 ⁇ g of the vector which codes for H2Kd, 1.5 ⁇ g of the vector which expresses E1TTL, E2 from HPV18, or E2 of BPV-1, with 1.5 ⁇ g of a plasmid which codes for c-p53 (hatched part of FIG. 7) or for the vector alone (white part of FIG. 7).
  • the percentage of cells in phase G1 has been marked diagrammatically in FIG. 7A.
  • FIG. 7C represents the proportion of cells having the DNA content of less than 2n.
  • FIG. 8 represents the restriction map of the plasmid pCG (ATG-). The construction of this plasmid has been described by Tanaka et al., Cell, 1990, 60, 375- 386.
  • the plasmid pCG (ATG-) makes it possible to obtain the plasmid pCGE2TR and the plasmid pCGE2.18VoNCO.
  • the plasmid pCGE2TR is a eukaryotic expression vector containing a DNA fragment of 891 bp corresponding to the sequence of the E2 protein of the papillomavirus BPV-1 truncated by 2/3 of its N-terminal domain.
  • the fragment was prepared from the plasmid pC59 (Spalholz et al, Cell, 42, 183-191, 1985), which expresses all of the E2 protein of BPV-1. It is cloned between the Xba ⁇ and SamHI sites of the vector.
  • the plasmid pCGE2.18VoNCO is a eukaryotic expression vector containing the entire sequence of the E2 protein of the HPV-18 papillomavirus.
  • the DNA fragment was prepared from the viral genome isolated by Boshart et al, EMBO J., 3, 1151-1157, 1984 and sequenced by Cole and Danos, J. Mol. Biol., 193, 599-608, 1987).
  • the sequence between nucleotides 2817 and 3450 of the genome has been cloned between the Xba ⁇ and BamHI sites of the polylinker of the pCG vector.
  • the ATG codon initiating translation of the E2 protein was modified during cloning by insertion of an NCO restriction site.
  • Figure 9 shows the restriction map of the E2TR insert of BPV-1 (SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 10 represents the protein sequence of E2TR which corresponds to the second line of amino acids (2nd reading phase) (SEQ ID NO: 2).
  • Figure 11 shows the restriction map of the insert of the plasmid pCGE2.18VoNCO.
  • the ATG codon for initiating translation of the E2 protein was modified during cloning by insertion of an NCO restriction site.
  • the wild protein carries a residue Q at position 2, the modified protein which forms the insert carries a residue E at this position (SEQ ID NO: 3).
  • FIG. 12 shows the modified E2 protein sequence which is expressed by the plasmid pCGE2.18VoNCO. This sequence is located on the third line of amino acids (3rd reading phase) (SEQ ID NO: 4).
  • FIG. 13 (FIGS. 13A to 13Q) represents an alignment of the protein sequences of various E2 of HPV.
  • FIG. 14 shows the expression of the genes injected into tumors of human origin.
  • DNA preparations were directly injected into the tumors, induced in nude mice by subcutaneous inoculation of one million HeLa cells. Approximately 200 ⁇ g of different plasmids, in 50 ⁇ l of TE buffer were used for the injections. The animals were sacrificed and the tumors were dissected 48 hours after the injection. The tumors were prepared and crude extracts were tested to determine the CAT activity as described in the Materials and Methods section.
  • A) characteristic CAT test a) RSV-CAT plasmid expressing CAT; b) RSV- ⁇ -gal plasmid expressing ⁇ -galactosidase; c) TE solution.
  • Figure 15 shows histochemical detection of ⁇ -galactosidase activity in sections of tumors
  • the sections of injected tumors were obtained and prepared according to the technique described in material and method. ⁇ -galactosidase activity was detected using X-gal staining, resulting in a blue-indigo color. After staining, the tissue sections were counterstained with eosin and hematoxylin. The photos representing the results are given in parts A, B and C, 40X, C, D and E, 60X.
  • Figure 16 shows the expression over time of the injected genes.
  • the tumors of each group of animals were injected with equivalent amounts of DNA and resected 24, 48, 72 and 192 hours later.
  • the conversion percentages of chloranphenicol were used to calculate the relative activities.
  • the ordinate represents the relative activity in CAT.
  • Figure 17 shows the growth of tumors injected with different DNA preparations.
  • the tumor volumes were calculated from values obtained according to the description given in "Materials and methods". In each case, the average values of different experiments (+/- standard error) are shown. The dots indicate the days of the injections. Samples B and C correspond to the results obtained from the double-blind experiments.
  • FIG. 18 shows that repeated injections of plasmids expressing E2 reduce the tumor growth of the human cell line expressing the oncogenes E6 and E7.HPV18
  • the values obtained from the various experiments were used to calculate the T / C values, according to the description made in Materials and Methods.
  • I and II four doses of 100 ⁇ g of pC59 each; III, five doses (100 ⁇ g of pC59 each); IV, two doses (200 ⁇ g pC59 each); V, five doses (200 ⁇ g of pC59 each); VI, two doses of 200 ⁇ g of pCGE2; VII, multiple doses of pC59.
  • the plasmid p18-4325 containing the CAT marker and the P 105 promoter has been described by Thierry et al. (New Biol., 1991, 3, 90-100).
  • This plasmid contains the sequences of the long control region (LCR) of HPV18 located between nucleotides 6930 and 120 (Gold et al., Cancer Cells, 1987, 5, 23-32).
  • TKE2-CAT previously referred to as TK-E2BS, contains six E2 binding sites before the thymidine kinase promoter of the herpes simplex virus (Thierry et al, Mol. Cell Biol., 1990, 10, 4431-4437).
  • PG13-CAT contains 13 binding sites for p53 before the polyomavirus promoter, while in MG13-CAT the binding sites for p53 have been modified (Kern et al., Science, 1992, 256, 827-830). O 98 32861
  • MDM2-CAT contains the p53 mdm2 promoter (Moshe Oren).
  • the plasmid pC53-SN3 expresses human wild-type p53 (Baker et al., Science, 1990, 249, 912-915)
  • the vectors pCGE2 (Ustav et al., EMBO J., 1991, 10, 449-457) and pCGE2TR (Demeret et al, J. Viral., 1994, 68, 7075-7082) express the E2 protein of BPV-1.
  • the plasmid pCGE2K344 expresses a modified protein coming from the protein E2 of BPV-1 which contains a lysine instead of an arginine at position 344.
  • the complete genome of the human papillomavirus type 18 (HPV 18) has been described by Cole et al. (J. Mol. Biol., 1987, 193, 599-608). The nucleotide sequence of the E2 protein is fully described there.
  • the plasmid pCGE2K344 was constructed by subcloning a BamHI fragment containing the modified ORF of C59 kz E2 K344, which has been described by Dowhanik et al., (J. Virol., 1995, 69, 7791-7799) in a BamHI restricted pCG vector (Tanaka et al., Cell, 1990, 60, 375-386).
  • the E2 protein of HPV18 was expressed from the vector pCGE2.18 which was described by Demeret et al. (J. Virol., 1994, 68, 7075-7082).
  • the plasmid pCGE2.18VoNCO is a eukaryotic expression vector containing the entire sequence of the E2 protein of the HPV18 papillomavirus.
  • the DNA fragment was prepared from the viral genome isolated by Boshart et al, EMBO J., 3, 1151-1157, 1984 and sequenced by Cole and Danos, J. Mol. Biol., 193, 599-608, 1987).
  • the sequence between nucleotides 2817 and 3450 of the genome has been cloned between the Xba ⁇ and BamHI sites of the polylinker of the pCG vector.
  • the ATG codon initiating translation of the E2 protein was modified during cloning by insertion of an NCO restriction site.
  • Bovine papillomavirus type 1 (BPV-1) codes for two forms of E2 proteins, one of 28 and the other of 31 kDa (Lambert et al., Cell, 1989, 50, 69-
  • the 31 kDa protein i.e. the E2TR protein, does not contain most of the N-terminal transactivation domain.
  • the E2TR protein was expressed from the plasmid pCGE2.DBD. This plasmid was constructed in subcloning the E2 fragment of BPV-1 (between nucleotides 3023 and 3882) from the plasmid pC59 (Spalholz et al., 1985, 42, 183-191).
  • the plasmid pGGE1.18 TTL was constructed by introducing the sequence TTAGTTAACTAA (SEQ ID NO: 5) which is a translation termination binding agent, into the Fspl site of the 2160 bp Taq-BstNI fragment of the open reading phase (ORF) of the E1 protein of HPV 18, which was previously cloned into the plasmid pCG.
  • the plasmid pPKC.Kd.wt supplied by Abastado, expresses the H2Kd molecule of MHC class 1 which is a surface antigen, from the early promoter of SV40.
  • the plasmid CMVgfp expresses a green fluorescent protein from the cytomegalovirus promoter.
  • All cells were cultured in Eagle medium modified by Dulbecco (DMEM, Gibco) and additionally containing 7% fetal calf serum, penicillin (500 IU / ml) and streptomycin (125 ⁇ g / ml) .
  • DMEM Dulbecco
  • the transfections were carried out according to the calcium phosphate co-precipitation method described by Desaintes et al. (Oncogene, 1995, 10, 2155-2161).
  • the DNA was prepared according to the QIAGEN method. 6 ⁇ g were used for the 6 cm Petri dishes and 12 ⁇ g for the 10 cm Petri dishes by transfection with the BLUE SCRIBE plasmid (from Stratagene).
  • the HeLa cells as obtained above in the 10 cm petri dishes were harvested 40 to 44 hours after transfection and suspended in 200 ⁇ l of Laemmii buffer. 15 ⁇ l of this suspension were placed on a 10% SDS-polyacrylamide gel (SDS: sodium dodecyl sulfate). After transfer, the nitrocellulose membranes were incubated with antibodies conjugated to primary and secondary horseradish peroxidase, using the ECL detection kit (Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's recommendations.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the monoclonal antibody Ab1801 of p53 which was used was supplied by the company Santa Cruz Biotechnology.
  • the HeLa cells as obtained above in the 10 cm petri dishes were covered with phosphate buffer (PBS) and 0.1% EDTA and then incubated for 10 minutes to detach the cells from the agar. the petri dish. The supernatant cells were harvested to measure the number of dead cells. The cells were incubated for 45 minutes at 4 ° C. in the presence of PBS buffer, 10 "4 % azide and 2% fetal calf serum (SVF) with 1/500 of the specific monoclonal antibody of H2Kd, l 'SF111 antibody (Pharmingen).
  • PBS phosphate buffer
  • SSF fetal calf serum
  • the cells were incubated with an anti-mouse antibody coupled to FITC 1/500 (Amersham) for 45 minutes, then fixed with 80% ethanol.
  • the cells were rehydrated in PBS buffer and incubated for 30 minutes at 37 ° C in the presence of propidium iodide (PI) (10 ⁇ g / ml) and RNAse (10 ⁇ g / ml).
  • PI propidium iodide
  • RNAse 10 ⁇ g / ml
  • the positive cells were kept for analysis of their DNA content after exclusion of the doublets.
  • the cell cycle was analyzed with the MultiCycle Software device from Phoenix Flow Systems, Inc.
  • HeLa cells were rinsed with PBS buffer 24 to 75 hours after transfection. Then, they are incubated in the presence of the antibody SF111
  • the cells were stained with propidium iodide or incubated with a polyclonal rabbit antibody directed against E2 of
  • BPV-1 described by Dostatni et al. (Genes Dev., 1991, 5, 1657-1671), then with an anti-rabbit antibody coupled to Texas red (Amersham) and DAPI (Sigma
  • the TUNEL reaction is carried out using the in situ dead cell detection kit (Boehringer Mannheim) following the manufacturer's recommendations.
  • RNA extraction The HeLa cells were transfected into 10 cm petri dishes with 1 ⁇ g of the vector expressing H2Kd and 1 ⁇ g of one of the following plasmids pCGE2 (18), pCGE2, pCGE2TR or pCGEITTL
  • the transfected cell population was enriched by removing the cells recognized by the anti-H2Kd antibody using the FACS Star Plus flow cytometer (Becton-Dickinson) according to the manufacturer's recommendations.
  • Total RNA was prepared using the Qiagen RNeasy kit following the manufacturer's recommendations.
  • RNA underwent hybridization with primers labeled with P 32 for 10 minutes at 68 ° C. and then were slowly cooled to room temperature. Two specific primers were used:
  • oligonucleotide complementary to the open reading phase of the E6 protein (part 5 ′) of the HPV18 papillomavirus, this nucleotide having the following sequence:
  • CTGTAAGTTCCAATACTGTCTTGC (SEQ ID NO: 6) -a 25-base oligonucleotide complementary to human ⁇ -actin RNA, this oligonucleotide having the following sequence: ATCCATGGTGAGCTGGCGGCGGGTG (SEQ ID NO: 7)
  • This primer hybridizes with the 3 ′ termination of the open reading phase of p53.
  • the E2 proteins of the HPV18 and BPV-1 papillomaviruses repress the endogenous transcription of the E6 and E7 genes in HeLa cells.
  • HPV18 and BPV-1 repress the activity of a reporter gene transcribed from the P 105 promoter of the human papillomavirus HPV18 (Gold et al., EMBO J.,
  • HPV18 DNA Several copies of HPV18 DNA have been introduced into the genome in HeLa cells.
  • the HeLa cells are transfected into the 10 cm petri dishes with 1 ⁇ g of the plasmid expressing H2Kd and 1 ⁇ g of one of the vectors coding either for the protein ⁇ 2 of BPV-1 (lane 3), either for the E2TR protein of BPV-1 (lane 2), or for the E2 protein of HPV18 (lane 5) or for a negative control E1TTL (lanes 1 and 4).
  • Total RNA was extracted from the transfected cells and underwent reverse transcription with a primer which hybridizes upstream of the splicing site in the open reading phase of the E6 protein.
  • the upper arrow indicates the specific product E6 / E7 of 129 nucleotides of the primer extension.
  • the cells did not express the endogenous protein E2 following the interruption of the open reading phases of the proteins E1-E2 (Schwarz et al., Nature, 1985, 314, 111-114).
  • the regulatory domain of the HPV16 papillomavirus integrated into genomic DNA could have a chromatic structure different from that adopted on a transiently transfected plasmid, leading to modified access of E2 by its DNA sequences of the same origin.
  • the cells actually transfected were selected according to their immunological reaction with respect to the surface antigen, the H2Kd molecule of MHC class 1, which is expressed at the same time as the protein E2.
  • the E2 protein increases the transcription activity of p53 in HeLa cells 32861
  • HeLa cells contain two wild-type p53 alleles. However, despite the abundance of p53 transcripts in cells, the encoded protein is not detectable, because it is degraded during the reaction using
  • Endogenous p53 active on transcription can be activated when these cells are exposed to genotoxic agents (Butz et al., Oncogene, 1995, 10, 927-936).
  • the E2 protein can suppress the expression of the E6 protein. It was investigated whether this repression led to stabilization of p53.
  • the activity of p53 was tested using plasmids carrying a marker.
  • BPV-1 throughout its length resulted in an increase in CAT activity from plasmids directed by the MDM2 promoter responding to p53 naturally, or a synthetic promoter containing 13 p53 binding sites (PG13-CAT).
  • a plasmid coding for a 17 kDa product corresponding to the carboxy-terminal part of p53 was co-transfected .
  • This truncated p53 protein was detected by immunology using the p4 specific monoclonal antibody Ab421 (Oncogene Science), which also recognizes the p53 protein over its entire length in cells transfected with a vector expressing p53. This is illustrated in Figure 2B.
  • Short truncated forms act as trans-dominant-negative mutants by forming oligomers with the wild-type protein and therefore inactivate the transactivation and tumor suppressing functions of p53 (Shaulian et al, Mol. Cell Biol., 1992, 12, 5581-5592).
  • FIG. 2C illustrates tests carried out with extracts of HeLa cells transfected with 2 ⁇ g of plasmids carrying the CAT marker and containing the MDM2 promoter or the early polyomavirus promoter flanked by 13 p53 binding sites (PG13-CAT), and 0, 2 ⁇ g of plasmids expressing the E2 protein of BPV-1.
  • FIG. 2B illustrates the results of the Western Blot.
  • the HeLa cells were co-transfected with 1 ⁇ g of the expression vectors for p53, a carboxy-terminal fragment of p53 (c-p53) or a vector alone (-). Total cellular proteins have been demonstrated with the p42-specific monoclonal antibody Ab42. The arrows indicate the protein p53 along its entire length and c-p53.
  • FIG. 2C illustrates the test with the CAT marker.
  • the HeLa cells were co-transfected with 2 ⁇ g of PG13-CAT, 0.5 ⁇ g of the expression vectors for the E2 protein of BPV-1 (lanes 3 and 4) or E1TTL (lanes 1 and 2) with 1 ⁇ g a plasmid encoding trans-dominant-negative c-p53 (lanes 2 and 4) or a vector alone (lanes 1 and 3).
  • the CAT marker tests were carried out with 1/5 of the cell extracts for 1 hour.
  • Proteins E2 and E2TR differ in their ability to induce p53
  • FIG. 1 shows that the protein E2 and the truncated protein E2TR both repress the expression of E6 with comparable efficiencies.
  • FIG. 3 The results illustrated in FIG. 3 were obtained following tests which were carried out with increasing quantities of plasmids expressing the complete E2 protein (black symbols in FIG. 3) of HPV18 or BPV-1 or truncated forms (white symbols in Figure 3) of this protein. These plasmids were transfected into HeLa cells with 2 ⁇ g of PG13-CAT (top curves) or P 105 -CAT (bottom curves). The values which represent the average of at least 3 to 8 independent transfections were calculated relative to the activities of the CAT marker in the presence of the plasmid pCGEITTL as a negative control.
  • the repression depended specifically on the interaction between E2 and its target DNA sequence, as shown in the following two tests.
  • the HeLa cells were transfected with 0.5 ⁇ g of a plasmid expressing H2Kd and 1.5 ⁇ g of the vectors coding for E1TTL (-), E2 of BPV-1 or E2TR of BPV-1.
  • the population of transfected cells was enriched by selecting H2Kd-positive cells.
  • Half of the cells were suspended in Laemmii buffer for protein analysis, the other half was used to extract RNA.
  • FIG. 4A illustrates the results of analysis of the Western Blot. The membranes were incubated with an antiserum specific for E2 (upper section) or an antibody Ab1801 for p53 (lower section).
  • Figure 4B illustrates the Northern Blot analysis results.
  • RNA 5 ⁇ g of RNA were deposited on a 1% MOPS-agarose gel. After transfer, the membrane was incubated with a probe specific for p53 and labeled with P 32 .
  • the arrow indicates the transcripts of p53.
  • the positions of the RNA molecular weight markers are shown on the left of Figure 4.
  • the gel photograph on the right section of Figure 4 shows that equivalent amounts of 18S and 28S RNAs were present in all three pathways .
  • E2 protein Two regions of the E2 protein are complementary in terms of their function to activate p53-directed transcription.
  • the DNA binding domain of E2 alone is not capable of fully activating the transcription activity of p53.
  • the sequence of the E2 protein of BPV-1 was modified by a conventional mutation process.
  • the arginine at position 344 has been replaced by a lysine.
  • This modified protein was named E2K344.
  • the mutation carried out is located in the ⁇ helix for recognition of the carboxy-terminal region (Hegde et al., Nature, 1992, 359, 505-512). This mutation results in the disappearance of the DNA bond without modifying the dimerization of the protein (Dowhanick et al., J. Virol., 1995, 69, 7791-7799).
  • the fact that this modified protein normally accumulates in the nucleus has been verified by immunofluorescence.
  • the activation obtained with the combination of the two modified proteins required a greater quantity of the expression plasmids. Activation has reached levels equivalent to concentrations greater than 0.5 ⁇ g.
  • the loss of DNA binding activity of the modified protein E2K344 was confirmed by its inability to activate the transcription from TKE2-CAT under conditions in which wild-type E2 protein has activated transcription by up to 70 times. This is illustrated in Figure 5B.
  • TKE2-CAT is a plasmid containing a CAT marker and six E2 protein binding sites upstream of the herpes simplex virus thymidine kinase promoter.
  • E2TR and E2K344 did not activate TKE2-CAT, this indicates that the two proteins do not dimerically heterologously to reconstitute an active transactivator specific for the sequence.
  • Synergistic activation of PG13-CAT by E2K344 and E2TR has been correlated with an increase in the level of the p53 protein. This is illustrated in Figure 5C.
  • the level of p53 was actually higher in cells expressing the two proteins E2TR and E2K344 together, compared with cells transfected with the negative control vector or one of the two expression plasmids alone.
  • the amount of p53 protein in cells transfected with E2 is lower than that accumulating in cells transfected with a plasmid that codes for a wild-type p53 protein (SN3).
  • FIG. 5 illustrates that the E2 transactivation domain and DNA binding regions contribute synergistically to the activation of p53.
  • the HeLa cells were transfected with increasing doses of vectors expressing E2 (black diamond in FIG. 5), E2TR (white diamond), E2K344 alone (white circle) or in combination with 0.2 ⁇ g of E2TR (white triangle), with 2 ⁇ g of reporter plasmids PG13-CAT (FIG. 5A) or TKE2-CAT (FIG. 5B). Plasmid pCGEITTL was used as a negative control.
  • the tests with the CAT reporter were carried out with cellular extracts from the cells harvested 44 hours after the transfection.
  • Figure 5 Figure 5 ( Figures 5A and 5B), the values are expressed in comparison to E1TTL
  • Figure 5C illustrates the analysis Western Blot carried out with 1/5 of the cell extracts transfected with 0.2 ⁇ g of the vectors which code for E1TTL, E2, E2TR, human p53 (SN3), or 0.8 ⁇ g of pCGE2K344 either alone or in combination with 0, 2 ⁇ g of pCGE2TR.
  • the p53 protein was detected with the antibody Ab1801 (Santa Cruz Company).
  • the molecular weight markers are indicated on the left of Figure 5C in kDa.
  • Table 1 shows the moderate improvement in p53 activity by the E2 protein in HPV-negative cell lines.
  • the HeLa, HepG2 and NIH3T3 cells contain wild type p53 alleles, the C33, SW13 and HaCaT cells express a mutated form of p53, and the SAOS cells do not express p53 (ATCC No. HTB85).
  • MG13-CAT is identical to PG13-CAT except that the binding sequences of p53 have been modified (mutated).
  • E2 did not induce activation of PG13-CAT in p53-negative cells.
  • exogenous p53 induced a weak PG13-CAT activation in SW13 cells, medium in C33 cells and strong in HaCaT and SAOS cells.
  • E2 multiplied the transcription activity of PG13-CAT by 2.2 to 4.5 times in the four different cell lines.
  • the expression of E2 induced at least a 50-fold increase in activation of the plasmid TKE2-CAT carrying E2.
  • the cells were transfected with MG13-CAT or PG13-CAT together with plasmids which code for the human wild-type E1TTL, E2 or p53 negative control.
  • the level of endogenous p53 transcription activity was determined by comparing the activities of the CAT reporter in cells transfected with PG13-CAT or MG13-CAT.
  • the activation of PG13-CAT by E2 or p53 was calculated in comparison with the negative control E1TTL.
  • the average values of the activities or the level of activation were indicated in Table 1.
  • a means that in the HPV-negative cell lines, the plasmid expressing human p53 was co-transfected with PG13-CAT and pCGE2 or pCGEITTL; and n represents the number of independent transfection tests performed.
  • the HeLa cells were cultured in 10 cm Petri dishes and then were transfected with 1.5 ⁇ g of pCGEITTL, pCGE2 or pCGE2TR, and 0.5 ⁇ g of the plasmid expressing H2Kd.
  • FIG. 6A shows that the subpopulation whose DNA content is less than 2n (sub-2n) of cells which express E2 is three times greater than that of cells transfected with a negative control plasmid E1TTL or a vector which expresses E2TR .
  • the proportion of sub-2n DNA is shown on the left in Figure 6A.
  • the sub-2n subpopulation corresponds to cells which have lost their genomic material following cell death.
  • the effect of E2 on cells and the morphology of the nucleus was examined by immunofluorescence. This is illustrated in Figure 6B.
  • FIG. 6B shows photographs of cells expressing E2TR (section 1), E2K344 (section 2), or E2 (sections 3-6).
  • the nuclei were stained with propidium iodide (sections 1-3).
  • H2Kd-positive cells were stained green with an anti-H2Kd antibody coupled to FITC (sections 1-3).
  • Sections 4 and 5 represent the same section of cells stained either with an antibody coupled with a Texas red which detects the E2 protein (section 4) or with DAPI (section 5).
  • An example of TUNEL-positive nuclei is shown in section 6.
  • the arrows indicate the transfected cells which show an abnormal appearance.
  • Section 3 Part of the transfected cells expressing all of the protein E2 (section 3) or the modified protein E2K344 (section 2) shows a marked reduction in the size of their cytoplasm and of their nucleus. These abnormal appearances were not observed in cells transfected with E2TR (section 1). The expression of E2 was also visualized by directly staining the cells with an anti-E2 antibody coupled to Texas red (section 4). The same cells were stained with 4,6-diaminodino-2-phenylindole (DAPI), this shows two E2-positive cells with condensed chromatin (arrows in section 5). In addition, the cells transfected with the vectors which express E2 contained DNA clippings which were revealed during the TUNEL assay (section 6).
  • DAPI 4,6-diaminodino-2-phenylindole
  • TUNEL-positive cells represented 7.5, 12 and 50% of the proportion of H2Kd-positive cells which express E1TTL, E2TR and E2 respectively. Expression of the E2 protein from HPV18 also led to apoptosis, as shown by the condensation of chromatin, the DNA content of the sub-2n subpopulation and the results of the TUNEL reaction.
  • the transcription activity of p53 is necessary for the arrest of growth in phase G1 induced by E2, but it can be done without for the apoptosis caused by E2 61
  • the increase in p53 increases or blocks the progression in the G1 phase or induces apoptosis (ElDeiry et al., Cell, 1993, 75, 817-825; Xiong et al., Nature, 1993, 366, 701- 704; Harper et al., Mol. Biol. Cell, 1995, 6, 387-400) or induces apoptosis (Diller et al., Mol. Cell Biol., 1990, 10, 5772-5781 and Yonish-Rouach et al., Nature, 1991, 352, 345-347).
  • the HeLa cells were transfected with 5 ⁇ g of PG13-CAT and 0.5 ⁇ g of the vector which codes for H2Kd, 1.5 ⁇ g of the vector which expresses E1TTL, E2 of HPV18, or E2 of BPV-1, with 1.5 ⁇ g of a plasmid which codes for c-p53 (hatched part of FIG. 7) or for the vector alone (white part of FIG. 7).
  • the H2Kd-positive cells were labeled with propidium iodide and analyzed by flow cytometry to determine their DNA content.
  • the cells were placed in the presence of an antibody coupled with FITC specific for the surface marker H2Kd coded by a co-transfected piasmide.
  • FIG. 7A The percentage of cells in phase G1 has been marked diagrammatically in FIG. 7A.
  • FIG. 7C represents the proportion of cells having the DNA content of less than 2n.
  • CAT activity was tested on one tenth of the cell population, the multiplication of activity was noted in Figure 7B.
  • FIG. 7 the transient expression of the E2 proteins of
  • HVP18 and BPV-1 increased the proportion of cells blocked in G1 phase (70 and 73.5% for HVP18 and BPV-1 respectively, compared with 55.1% for cells transfected with the control plasmid
  • the co-expression of dominant-negative c-p53 (hatched part of FIG. 7) almost completely released the blocking of G1 induced by E2, in conditions such that it completely eliminated the transcription activity of p53 (FIG. 7B).
  • E2-induced apoptosis was controlled by the proportion of cells with a DNA content of less than 2n.
  • Cells expressing E2 from HPV18 and BPV-1 represented a sub-2n subpopulation of 15.8% and 19.4% respectively, compared with 7% for cells belonging to the negative control ( Figure 7C).
  • apoptosis was determined by counting the number of dead green cells.
  • Table 2 shows that E2 does not induce apoptosis in p53-negative cell lines.
  • E2 did not increase the percentage of dead cells compared to the E1TTL control, in the three cell lines, while p53 significantly increased the level of apoptosis in SAOS and HaCaT cells, and to a lesser extent in C33 cells.
  • This example reports the expression in tumors of human origin produced in nude mice, of genes injected directly into these tumors in the form of DNA preparations carried by plasmids.
  • Several DNA constructs containing reporter genes, under the control of different viral or cellular promoters, have been injected into human tumors produced by nude mice. Expression was measured by in situ differential staining of ⁇ -galactosidase in sections of the tumors, or by performing tests involving chloramphenycol acetyl transferase
  • CAT CAT expression has been shown to be highly specific and dependent on the strength of the promoter directing expression of the reporter gene. Furthermore, the levels of expression obtained with the DNA preparations were compared, when these preparations were either directly injected or administered to using liposomes; no significant difference was observed between these modes of administration.
  • DNA preparations containing the papillomavirus E2 gene was evaluated with a view to reducing the tumor growth of human cell lines expressing the oncogenes E6 and E7.
  • Multiple injections of plasmids containing the E2 gene have made it possible to significantly reduce the tumor growth of HeLa cells, these cells constituting a line derived from the cells of the cervix known for their capacity to express the viral oncogenes E6 and E7.
  • the HeLa cell line is undoubtedly the best known uterine cell line, this line originally originating from an adenocarcinoma of the cervix and containing integrated sequences of HPV18.
  • HeLa cells containing plasmids expressing the E6 and E7 antisense RNAs showed lower tumor growth and reduced ability to form colonies in soft agar, as well as an increased need for serum, confirming the importance of expression of viral oncogenes to maintain their immortalization phenotype (Steele et al., Cancer Res. 52, 4706-4711, Von Knebel Doeberitz et al., Cancer Res. 48, 3780-3786).
  • Plasmids The plasmids used contained either the reporter genes, lacZ or CAT, or the bovine papillomavirus type 1 (BPV-1) E2 gene, in mutated form or O 98/32861 PC /
  • promoters normal, under the control of various promoters including: the early promoter SV40 (SVE), the LTR sequence of Rous sarcoma virus (RSV), the upstream regulatory region (URR) of human papillomavirus type 18 (HPV18), and the immediate early promoter of cytomegalovirus (CMV).
  • SVE early promoter SV40
  • RSV Rous sarcoma virus
  • UTR upstream regulatory region
  • HPV18 human papillomavirus type 18
  • CMV immediate early promoter of cytomegalovirus
  • the plasmids containing the E2 gene were prepared by conventional methods and extracted either using a phenol / chloroform mixture or purified in CsCL gradients, as described by Maniatis et al, 1987.
  • the plasmids containing the E2 gene contained either the SVE promoter (pC59 and pC9) or the CMV promoter (pCGE2).
  • HeLa cells were grown in Eagle medium modified by
  • Dulbecco Dulbecco (DMEM; GIBCO) supplemented with 10% fetal bovine serum in an atmosphere comprising 5% C0 2 . 1 x 10 6 cells were injected into a medium devoid of serum in 200 ⁇ l; viability was measured by exclusion from Bleu Trypan; in principle it exceeded 95%.
  • the frozen sections (10 mm) were air dried, washed in PBS-MgCI2 containing 0.02% Nonidet P40 (NP-40), 0.01% sodium desoxycholate and reattached for 5 minutes with a fixing solution.
  • the sections were covered with a solution containing 1 mg / ml of X-Gal (5-bromo-4chloro-3indolyl- ⁇ -D-glalactopyranoside; SIGMA); 5 mM potassium ferricyanide; 2 mM MgCI2; 0.01% sodium desoxycholate and 0.02% NP-40. Incubation was carried out at 37 ° C for 12 to 16 hours.
  • the tumors (approximately 0.1-0.3 mm 3 ) were homogenized with a Polytron in 300 ml of TGD solution (Tris [pH: 8]; 15% glycerol; 5 mM TT), then subjected to 6 freeze-melt cycles, then centrifuged for 10 minutes at 4 ° C. The supernatants were heated for 10 minutes at 65 ° C to inactivate the acetylases and centrifuged again for 5 minutes at 4 ° C. The resulting supernatants were the crude extracts used later to determine protein concentration and CAT activity.
  • TGD solution Tris [pH: 8]; 15% glycerol; 5 mM TT
  • the total protein was normalized and each extract made up to 300 ⁇ l with a Tris solution (250 mM Tris [pH 8]). Then, 8 ml of 20 mM acetyl coenzyme A and 0.06 mCi of chloramphenicol C 14 (Amersham, UK) were added and the reaction medium was incubated for 1 hour at 37 ° C. Acetyl coenzyme A was then added and the incubation was continued for an additional hour. The samples were chromatographed on thin-layer silica gel plates, in a medium containing chloroform and methanol (19: 1), then the samples were exposed to X-ray film.
  • the length (L: the longest dimension) and the thickness (W: the distance perpendicular to the length and in the same plane as the length) of each tumor have were measured with Verniers every 2 or 3 days as described by Tomayko & Reynolds, (1989, Cancer Chemotherapy and Pharmacology 24: 148).
  • Tumors produced by subcutaneous injections of highly tumorigenic HeLa cells were further injected with various preparations of plasmids containing the reporter genes. Plasmids containing the lacZ gene, under the transcriptional control of the Rous Sarcoma Virus (RSV) sequence (LTR), or under the control of the ⁇ -actin promoter, or the upstream regulatory region (URR) of HPV18 have been used.
  • RSV Rous Sarcoma Virus
  • UTR upstream regulatory region
  • the level of expression obtained was compared by injecting the DNA preparations obtained according to different methods. Direct injection has been compared to administering DNA via liposomes.
  • the animals were injected with human cells as described above and when the tumors were formed, equal amounts of DNA were injected either directly or in the form of liposome particles or phosphate precipitates of calcium. Three days later, the tumors were resected and the CAT activity was tested in crude extracts.
  • Equal quantities (200 ⁇ g) of pRSV-CAT plasmids expressing CAT were either untreated or used to prepare liposomes and calcium phosphate precipitates and then subsequently injected into the tumors.
  • A DNA injected alone
  • L preparation of liposomes
  • P precipitates of calcium phosphate.
  • mice Young mice (4 to 8 weeks old) without thymus (Swiss nu / nu) were inoculated subcutaneously with one million HeLa cells (derived from a cervical adenocarcinoma); these mice were randomly assigned to different groups and subjected to different protocols. The tumors (three animals per group) were injected with different amounts of plasmids or with a buffer alone, at different intervals.
  • the growth of tumors injected with 200 ⁇ g of plasmid containing the CAT gene under the transcriptional control of the RSV LTR sequence was compared with the growth of tumors injected with the same quantity of plasmid expressing the E2 gene (pC59).
  • the tumors injected with pC59 show lower growth than those injected with pRSV-CAT.
  • the tumors of the animals of each group were injected either with the wild-type E2 gene (pC59) or with a plasmid expressing an E2 mutant (pC9).
  • the sequence of a translation termination linker (TTL) was inserted into the E2 gene, so as to obtain a truncated and non-functional E2 protein (Spalholz et al., 1985, Cell 42: 183).
  • TTL translation termination linker
  • tumors injected with the mutant E2 gene had greater growth than those injected with the wild-type E2 gene.
  • the frequency of injections was increased so that the animals received a total of 7 injections during the experiment. It is important to mention that these series of experiments were conducted double-blind.
  • the oncogenes E6 and E7 are capable of immortalizing human primary cells.
  • the majority of cell lines derived from tumors of the genital region contain and express these viral oncoproteins. Their continuous expression is responsible for the phenomenon of immortalization and transformation observed.
  • Antisense RNAs specific for E6 and E7 are capable of altering the growth properties of several cell lines expressing the oncogenes E6 and E7 of HPV18.
  • a plasmid expressing the viral E2 gene was injected into tumors of human origin, produced in nude mice, to reduce their growth.
  • HeLa cells were inoculated into nude animals and the tumors were injected with different preparations of E2 expressing plasmids.
  • the inhibition of tumor growth was observed when the plasmids expressing the intact E2 gene were used.
  • Inhibition of expression of E6 and E7 has been shown when E2 was expressed concomitantly.
  • the introduction of the E2 gene leads to the arrest of the growth of cells which continuously express these oncogenes.
  • E2 Continuous expression of E2 appeared to be incompatible with the concomitant expression of viral oncogenes. Since the expression of E6 and E7 is necessary for the maintenance of the immortalized phenotype of tumor cells, E2 could be very useful for the implementation of gene therapy for tumors of the cervix which affect a large number of women in many countries.

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Abstract

L'invention concerne une composition comprenant une protéine E2 de papillomavirus ou une séquence de nucléotides codant pour une protéine E2 de papillomavirus. L'invention concerne également l'utilisation de cette composition comme médicament. L'invention concerne l'utilisation de cette composition pour le traitement d'une infection à papillomavirus, et notamment pour le traitement d'un cancer associé à une infection à papillomavirus.

Description

COMPOSITION COMPRENANT UNE PROTEINE E2 DE PAPILLOMAVIRUS OU UNE SEQUENCE DE NUCLEOTIDES CODANT POUR UNE PROTEINE E2 DE PAPILLOMAVIRUS
L'invention concerne une composition comprenant au moins une protéine
E2, sauvage ou modifiée, de papillomavirus ou une séquence de nucléotides codant pour une protéine E2, sauvage ou modifiée, de papillomavirus, et un véhicule physiologiquement acceptable. L'invention concerne également leur utilisation comme médicament, et notamment pour le traitement d'une infection à papillomavirus et également pour le traitement d'un cancer associé à une infection à papillomavirus.
Les papillomavirus sont des virus à ADN identifiés chez l'homme et chez l'animal, qui induisent des lésions de la peau et les muqueuses, ces lésions pouvant évoluer vers la formation de carcinomes ou cancer, notamment du col de l'utérus.
Chez l'homme, plus de 70 types de papillomavirus (HPV) ont été identifiés, un tiers infectant l'appareil génital (de Villiers, E.M. et al. (1994), Curr. Top. Microbiol. Immunol., 186, 1-12). Les papillomavirus qui infectent l'appareil génital peuvent être classés en deux catégories : les types qui sont associés à des carcinomes à haut risque tels que HPV 16, 18, 31 et 33, les types à faible risque qui sont associés à la formation de verrues banales (condylomes), tels que HPV 6, 11 et 13.
La protéine E2 de Papillomavirus joue un rôle important dans le cycle de vie du virus en régulant la transcription et la réplication du génome viral. La protéine E2 régule la transcription virale lorsqu'elle est liée à une séquence d'ADN palindromique présente en plusieurs copies dans la région de régulation de tous les papillomavirus. La protéine E2, avec la protéine E1 et les facteurs de réplication cellulaire, agit également au niveau de l'initiation de la réplication d'ADN viral (Ustav, M. et al. (1991 ), EMBO J., 10, 449-457; Chiang, CM. et al. (1992), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89, 5799-5803; Del Vecchio, A.M. et al. (1992), J. Virol., 66, 5949-5958; Le Moal et al., 1996, J. Virol., 68, 1085-1093). La protéine E2 contient deux régions relativement bien conservées chez tous les papillomavirus; ces deux régions sont séparées par une région non conservée et de longueur variable, selon les types de papillomavirus, (région appelée "charnière" , Giri, 1. et al. (1988), EMBO J., 10, 2931-2940). La partie amino-terminale de la protéine E2 est nécessaire pour la transactivation; la réplication et l'association avec la protéine E1 (Benson, J.D. et al. (1995), J. Virol., 69, 4364-4372). La partie carboxy-terminale de la protéine E2 est responsable de la dimérisation de la protéine et de sa liaison spécifique avec l'ADN (Androphy, E.J. et al. (1987), Nature, 325, 70-73; Dostatni, N. et al. (1988), EMBO J., 7, 3807-3816; McBride, A.A. et al. (1989), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 510-514).
Le papillomavirus bovin de type 1 (BPV-1 ) a été étudié de façon approfondie comme un modèle pour la réplication, la transcription et la transformation cellulaire des papillomavirus. L'expression des gènes viraux est contrôlée par sept promoteurs, quatre de ceux-ci sont activés par une protéine E2 de 48 kDa complète. BPV-1 code également pour deux formes tronquées de E2, l'une de 28 kDa et l'autre de 31 kDa (Lambert, P.F. et al. (1989), J. Virol., 63, 3151-3154). La forme de 31 kDa (E2TR) est obtenue par transcription initiée en amont d'un codon ATG interne, et est dépourvue de la région de transactivation N-terminale. Cela va à rencontre de la transcription activée par E2 par une liaison compétitive de son élément de reconnaissance et/ou par hétérodimérisation (Lambert, P.F. et al. (1987), Ce/7, 50, 69-78; Ham, J. et al. (1991 b), Trends Biochem. Sci., 16, 440-444). "
Au stade actuel des traitements des carcinomes génitaux dus à une infection par un papillomavirus, seule la chirurgie clasiique ou par laser présente une certaine efficacité si la maladie est détectée assez tôt. Cependant, le taux de mortalité reste particulièrement élevé, surtout dans les pays ne pratiquant pas un dépistage systématique et régulier. Le cancer du col de l'utérus, provoqué par une infection à papillomavirus, est presque aussi fréquent que le cancer du sein chez la femme. Il est donc apparu nécessaire de rechercher des voies de traitement alternatives ou complémentaires, pouvant notamment inclure des protocoles de traitement locaux et le cas échéant systématiques, non chirurgicaux.
Dans ce cadre, le transfert du gène p53 sauvage à des tumeurs cancéreuses a été proposé par Roth et al., Nature Medicine, 1996, 2 (9), 985- 991. L'injection d'un vecteur rétroviral contenant le gène sauvage p53 a permis d'observer une régression de la tumeur cancéreuse chez trois patients et une stabilisation de la croissance de la tumeur chez trois autres patients. Une telle thérapie par transfert du gène p53 n'est pas envisageable dans le cas de cellules infectées par un papillomavirus, car la protéine p53 est inactivée dans ce type de cellules.
Une autre approche, choisie dans le cadre de l'invention, a consisté à définir des moyens capables de freiner le développement viral de papillomavirus et/ou susceptibles d'empêcher la formation ou l'évolution des lésions cellulaires causées par l'infection et notamment d'arrêter la prolifération cellulaire des tumeurs cancéreuses ou de tuer les cellules de ces tumeurs.
A cet effet, la présente invention concerne une composition comprenant une protéine E2, sauvage ou modifiée, de papillomavirus ou une séquence de nucléotides codant pour une protéine E2, sauvage ou modifiée, de papillomavirus, et un véhicule physiologiquement acceptable.
Une telle composition est susceptible d'avoir des effets in vitro et/ou in vivo sur des cellules infectées par papillomavirus.
Par séquence de nucléotides, on entend un polynucléotide; et notamment un ADN, en particulier un ADNc, un ARN, un fragment d'acide nucléique ou une séquence synthétique. De préférence, on entend un ADN.
La protéine E2 de papillomavirus a été décrite pour les différents types d'isolats viraux identifiés, dans plusieurs publications.
La séquence de l'ADN E2 du génome viral isolé d'un carcinome du col de l'utérus provoqué par une infection par un papillomavirus humain de type 18 (HPV18) a été décrite par Cole et al., J. Mol. Biol., 1987, 193, 599-608. La séquence de l'ADN de la protéine E2 d'un papillomavirus humain de type 16 (HPV16) a été décrite par Seedorf et al., Virology, 1985, 145, 181-185; Kennedy et al., J. Virol., 1991 , 65, 2093-2097.
La séquence de l'ADN de la protéine E2 d'un papillomavirus humain de type 31 (HPV31 ) a été décrite par Goldsborough et al., Virology., 1989, 171 , 306- 311.
La séquence de l'ADN de la protéine E2 d' un papillomavirus humain de type 33 (HPV33) a été décrite par Cole et al., J. Virol., 1986, 58, 991-995.
La séquence de l'ADN de la protéine E2 d' un papillomavirus bovin de 1 (BPV-1 ) a été décrite par Chen et al., Nature, 1982, 299, 529-534 et par Danos et al., J. Virology, 1983, 46, 557-566.
Les séquences de nucléotides, et notamment de l'ADN, codant pour la protéine E2 d'autres papillomavirus ont été publiées et sont notamment accessibles via les références de la banque de données GENBANK. Selon l'invention, on met habituellement en oeuvre une protéine ou une séquence de nucléotides isolée; de préférence, au moins partiellement purifiée; et, de manière particulièrement préférée, pure.
De façon préférée, la composition selon l'invention est dépourvue de la protéine E1 de papillomavirus. Par véhicule physiologiquement acceptable, on entend toute substance ou composition compatible avec l'administration in vivo.
La composition selon l'invention comprend avantageusement une protéine E2 qui est une protéine dont la séquence d'acides aminés est modifiée par rapport à celle de la protéine E2 sauvage, ou une séquence de nucléotides codant pour une protéine E2, séquence qui est modifiée par rapport à la séquence sauvage, de telle sorte que la protéine E2 résultante a substantiellement l'activité biologique de la protéine E2 sauvage sur la protéine cellulaire p53.
Par protéine sauvage, on entend une protéine naturelle, retrouvée dans les isolats cliniques viraux, isolée de son environnement naturel dans le papillomavirus, c'est-à-dire identifiée, isolée et purifiée à partir d'un papillomavirus. C'est une protéine qui est codée par un gène de papillomavirus.
Par protéine modifiée, on entend une protéine dont la séquence d'acides aminés est différente de la séquence de la protéine sauvage par au moins un acide aminé, notamment après mutation. La séquence modifiée vise à rendre la synthèse de la protéine plus efficace et à conférer à la protéine une stabilité intracellaire accrue. Généralement, elle est différente par 1 à 20 acides aminés, habituellement par 1 à 15 acides aminés, de préférence par 1 à 10 acides aminés et de manière particulièrement préférée par 1 à 5 acides aminés. L'invention vise par exemple une protéine E2 ayant subi une mutation ponctuelle par substitution d'un acide aminé.
Par séquence de nucléotides modifiée, on entend une séquence de nucléotides différente de la séquence de nucléotides qui code pour la protéine sauvage par au moins un nucléotide. Généralement, elle est différente par 1 à 60 nucléotides, habituellement par 1 à 30 nucléotides, de préférence par 1 à 20 nucléotides et de manière particulièrement préférée par 1 à 6 nucléotides. En particulier, l'invention se rapporte à une séquence de nucléotides différente par un codon de la séquence sauvage codant pour la protéine E2.
La séquence peut être modifiée par voie chimique ou par une technique de génie génétique (séquence mutée). Des procédés de modification de séquences sont connus.
La séquence modifiée de la protéine E2 ou de la séquence de nucléotides, notamment l'ADN, codant pour la protéine E2 peut être modifiée en étant tronquée à son extrémité N- et/ou C-terminale, ou tronquée dans sa partie interne, ou en partie substituée. Dans ces conditions, il conviendra de vérifier, par exemple sur la base des tests proposés dans la partie expérimentale qui suit, que la forme modifiée est active pour les propriétés recherchées vis-à-vis d'une infection à papillomavirus.
La protéine cellulaire p53 est une phosphoprotéine nucléaire de 53 kDa. Elle a été décrite dans Pathologie Biologie, Mars 1995, Vol. 43 (3), 166-173; et par Linda J. Ko et al., Gènes & Development, 1996, 10, 1054-1072. La protéine p53 est un facteur de transcription qui lie des séquences d'ADN spécifiquement (Farmer et al; Nature, 1992, 358, 83-86; Funk et al., Mol. Cell Biol., 1992, 12, 2866-2871 et Kastan et al., Cell, 1992, 71 , 587-597).
Par protéine résultante, on entend la protéine obtenue après la modification de la séquence d'acides aminés ou de la séquence de nucléotides qui code pour la protéine.
L'invention concerne également une composition comprenant une protéine
E2 dont la séquence est modifiée par rapport à celle de la protéine E2 sauvage, ou une séquence de nucléotides modifiée par rapport à la séquence sauvage, de telle sorte que la protéine E2 résultante participe à une activité biologique d'apoptose de cellules infectées par un virus de type papillomavirus.
Par apoptose, on entend mort des cellules infectées par le virus ou des cellules dérivées ou descendantes de ces dernières.
L'invention concerne également une composition comprenant une protéine E2 modifiée dont la séquence est modifiée dans la région régulant la réplication virale, de telle sorte que la protéine E2 résultante est défective pour la réplication virale de papillomavirus.
L'invention concerne également une composition comprenant une séquence de nucléotides codant pour une protéine E2 modifiée, dont la séquence est modifiée dans la région responsable de la réplication virale, de telle sorte que la protéine E2 résultante est défective pour la réplication virale de papillomavirus.
Une procédure pour mettre en évidence une telle protéine défective pour la réplication virale a notamment été décrite par Demeret et al., Nucleic Acids Research, 1995, 23 (23), 4777-4784. Pour que la protéine E2 soit défective pour la réplication virale, la séquence est, de préférence, modifiée, notamment mutée par délétion, substitution, addition, dans la région N-terminale de la protéine E2. De telles protéines, sont notamment décrites par Sakai et al., J. Virology, 1996, 70 (3), 1602-1611 , par Brokaw et al., J. Virology, 1996, 70 (1 ), 23-29, et par Ferguson et al., J. Virology, 1996, 70 (7), 4193-4199; le procédé d'obtention de telles protéines y est également décrit. La protéine E39A a donné de bons résultats, le résidu situé à la position 39 dans la séquence de la protéine sauvage est substitué par une alanine dans la séquence modifiée.
La présente invention s'applique aux protéines E2 et aux séquences de nucléotides codant pour une protéine E2 de tous les papillomavirus. Habituellement, elle s'applique aux papillomavirus humains. De préférence, elle s'applique à un papillomavirus du groupe comprenant HPV16, HPV18, HPV31 et HPV33. Elle s'applique également aux papillomavirus bovins. De préférence, elle s'applique à un papillomavirus bovin BPV-1.
La présente invention concerne par ailleurs une séquence de nucléotides codant pour une protéine dérivée de la protéine E2 de papillomavirus HPV18, le résidu situé à la position 2 dans la séquence de la protéine dérivée de E2 étant un résidu acide glutamique. Cette séquence de nucléotides résulte du fait que le codon qui suit le codon ATG d'initiation de la traduction de la protéine E2 a été modifié au cours du clonage par insertion d'un site de restriction NCOI. En d'autres termes, dans la séquence de nucléotides ATGC.AG .le Q a été remplacé par un G.
La séquence de la protéine E2 est particulièrement bien conservée dans tous les types de papillomavirus. L'alignement des séquences des protéines E2 de divers papillomavirus est illustré dans la figure 13. Le domaine d'interaction à l'ADN de la protéine E2 de divers papillomavirus contient deux hélices α dont la plus grande est située entre les résidus d'acides aminés aux positions 288 à 305 de la séquence du papillomavirus humain HPV18. La séquence de cette hélice α est presque totalement conservée chez tous les papillomavirus humains et bovins. Différents résidus sont conservés dans les séquences des protéines E2 de la plupart des papillomavirus; par exemple la séquence de la protéine E2 du papillomavirus bovin BPV-1 comprend un résidu arginine à la position 344 qui correspond selon l'alignement des séquences à la position 305 dans la séquence de la protéine E2 du papillomavirus humain HPV18. L'invention concerne à cet égard une protéine E2 modifiée ou une séquence de nucléotides qui code pour une protéine E2 modifiée dans la zone de l'hélice α telle que définie ci-dessus. La présente invention concerne également une séquence de nucléotides codant pour une protéine dérivée d'une protéine E2 de papillomavirus humain, ladite protéine comprenant une séquence d'acides aminés dont au moins un résidu choisi parmi les suivants est modifié par exemple par substitution: - le résidu praline en position 288,
- le résidu glycine en position 294,
- le résidu asparagine en position 297,
- le résidu lysine en position 300,
- le résidu cystéine en position 301 , - le résidu leucine en position 302,
- le résidu arginine en position 305.
La mutation peut être une substitution par un résidu tel que un résidu alanine ou leucine.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence modifiée de la protéine E2 ou de la séquence de nucléotides, notamment l'ADN, codant pour la protéine E2 modifiée est tronquée à son extrémité N- et/ou C-terminale, ou tronquée dans sa partie interne, ou en partie substituée. Dans ces conditions, il conviendra de vérifier, par exemple sur la base des tests proposés dans la partie expérimentale qui suit, que la forme modifiée est active pour les propriétés recherchées vis-à-vis d'une infection à papillomavirus ou d'une transformation cellulaire associée à un papillomavirus. D'une manière générale, les protéines utilisées dans la présente invention conservent avantageusement la capacité de liaison à l'ADN de la protéine E2 sauvage.
L'invention concerne aussi un vecteur comprenant une séquence de nucléotides telle que définie ci-dessus. Habituellement ce vecteur est choisi parmi le groupe des vecteurs formé par les plasmides, virus, rétrovirus, ou les vecteurs synthétiques ou les vecteurs inertes. De préférence, le vecteur est un virus, tel que un adénovirus, un parvovirus ou un AAV notamment. De manière particulièrement préféré, ce vecteur est un adénovirus. Un vecteur de type adénovirus pouvant être utilisé pour réaliser l'invention est notamment décrit par Qing Wang et al. (Nature Medicine, 1996, 2 (6), 714- 716). Le choix du vecteur tiendra compte des objectifs recherchés, selon par exemple qu'il s'agit de définir des moyens de traitement, par exemple par thérapie génique de l'infection par un papillomavirus chez un hôte ou d'une transformation maligne chez un hôte. Un exemple de construction d'un vecteur recombinant, d'origine virale, est notamment décrit dans la demande de brevet internationale WO 93/06223.
Le vecteur de l'invention est avantageusement choisi parmi les vecteurs ayant un titre infectieux élevé et présentant les garanties de sécurité appropriées pour le cas échéant l'administration in vivo chez un patient infecté par un papillomavirus.
Par vecteur synthétique, on entend tout système de transfert de gène non- viral. Par exemples, un vecteur synthétique peut comprendre un ADN nu, un liposome, un complexe ADN-protéine, un complexe ADN-polymère cationique. D'autres exemples sont décrits par Yang (Critical rev. Biotech., 1992, 12, 335- 356).
D'autres vecteurs utilisables dans le cadre de l'invention sont les vecteurs inertes comme par exemple les liposomes (FR 9402070).
L'invention concerne également le plasmide pCGE2.18VoNCO déposé à la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue de Docteur Roux, Paris, France) le 29 janvier 1997 sous le numéro 1-1839.
L'invention concerne également le plasmide pCGE2TR déposé à la C.N.C.M. le 29 janvier 1997 sous le numéro 1-1838.
L'invention concerne également une protéine dérivée de la protéine E2 de papillomavirus HPV18, ladite protéine comprenant une séquence d'acides aminés dont au moins le résidu situé à la position 2 est un résidu acide glutamique.
L'invention concerne une protéine E2 de papillomavirus, qui comprend une séquence d'acides aminés dont au moins un résidu choisi parmi les suivants est modifiée par exemple par substitution:
- le résidu praline en position 288, - le résidu glycine en position 294,
- le résidu asparagine en position 297,
- le résidu lysine en position 300,
- le résidu cystéine en position 301 , - le résidu leucine en position 302,
- le résidu arginine en position 305.
L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une séquence de nucléotides ou un vecteur tels que définis ci-dessus et un véhicule physioiogiquement acceptable. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une protéine, telle que définie ci-dessus, et par exemple E2TR et un véhicule physioiogiquement acceptable.
La protéine E2TR est une forme de protéine E2 de BPV-1. Elle ne contient pas la majeure partie du domaine de transactivation N-terminale. Elle a un poids moléculaire de 31 kDa (Lambert et al., Cell, 1989, 50, 69-78). Le terme "composition pharmaceutique" désigne toute composition compatible avec un usage dans le domaine de la pharmacie, qu'il s'agisse d'un usage thérapeutique curatif ou prophylactique, ou d'un usage en traitement de maintien ou complémentaire d'un traitement thérapeutique. Plus généralement, il s'agit d'une composition compatible avec un usage chez l'homme. Ainsi, les moyens de l'invention définis dans les pages précédentes, à savoir les séquences de nucléotides codant pour une protéine E2 ou pour une protéine E2 modifiée, les vecteurs les contenant, les protéines E2 ou protéines E2 modifiées sont les principes actifs d'une composition susceptible de constituer un médicament ou d'entrer dans la composition d'un médicament. Dans le cadre de l'invention, la composition définie ci-dessus ainsi que les séquences de nucléotides codant pour une protéine E2 ou pour une protéine E2 modifiée, les vecteurs les contenant, les protéines E2 ou protéines E2 modifiées sont utilisables pour le traitement d'une infection à papillomavirus, et notamment pour le traitement d'un cancer associé à une infection à papillomavirus ou à une transformation cellulaire associée à un papillomavirus. Avantageusement, l'invention concerne également le plasmide pCGE2.18VoNCO déposé à la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue de Docteur Roux, Paris, France) le 29 janvier 1997 sous le numéro 1-1839 pour l'utilisation comme médicament. En particulier, il s'applique pour le traitement d'une infection à papillomavirus, et notamment pour le traitement d'un cancer associé à une infection à papillomavirus ou à une transformation cellulaire associée à un papillomavirus.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne également le plasmide pCGE2TR déposé à la C.N.C.M. le 29 janvier 1997 sous le numéro 1-1838 pour l'utilisation comme médicament. En particulier, il s'applique pour le traitement d'une infection à papillomavirus, et notamment pour le traitement d'un cancer associé à une infection à papillomavirus ou à une transformation cellulaire associée à un papillomavirus.
L'invention concerne également une utilisation d'une composition selon l'invention ainsi que les séquences de nucléotides codant pour une protéine E2 ou pour une protéine E2 modifiée, les vecteurs les contenant, les protéines E2 ou protéines E2 modifiées pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation thérapeutique contre une infection à papillomavirus, et notamment contre un cancer associé à une infection à papillomavirus ou à une transformation cellulaire associée à un papillomavirus.
L'invention concerne en particulier l'utilisation d'un vecteur contenant une séquence de nucléotides codant pour la protéine E2 de papillomavirus modifiée ou sauvage, ou d'un vecteur tel que défini ci-dessus, ou du plasmide pCGE2.18VoNCO, ou du plasmide pCGE2TR pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation thérapeutique contre une infection à papillomavirus, et notamment contre un cancer associé à une infection à papillomavirus.
Selon la présente demande, l'expression "traitement d'une infection due à un papillomavirus" s'applique aux activités biologiques développées in vitro ou jn vivo au niveau des cellules infectées par un papillomavirus ou des cellules dérivées de ces dernières, notamment par prolifération, activités résultant directement ou indirectement de la mise en contact desdites cellules avec les compositions, séquences de nucléotides ou protéines décrites ci-dessus. Ces activités comprennent les effets observés sur le virus, en particulier sur la réplication virale, après mise en contact des cellules avec les moyens de l'invention, ainsi que les effets observés sur le métabolisme ou la croissance des cellules infectées ou des cellules dérivées de ces dernières, notamment par prolifération.
Le traitement de l'infection inclut la thérapie, incluant le contrôle de l'évolution de l'infection y compris la prévention ou l'inhibition chez un hôte infecté, du développement de lésions ou de tumeurs liées à l'infection et susceptibles de progresser vers la phase clinique du cancer (stade de l'infection succédant à la phase asymptomatique chez le patient) ou vers le développement de métastases ou le stade fatal de la maladie. Avantageusement, cette expression englobe la capacité de faire diminuer la charge virale chez l'hôte y compris jusqu'à l'élimination ou la mise en latence du virus chez le patient infecté et/ou de préférence cette expression englobe l'arrêt de la croissance des lésions ou des tumeurs développées à la suite de l'infection par papillomavirus.
De façon préférée, l'invention a pour objet l'utilisation des moyens décrits ci-dessus, pour provoquer l'apoptose des cellules infectées par des papillomavirus ou des cellules dérivées de ces dernières, notamment par prolifération, en particulier des cellules cancéreuses.
Le traitement de l'infection par papillomavirus concerne donc dans le cadre ci-dessus défini, le traitement de la cause de l'infection ou des effets observés ou latents chez un patient infecté par un papillomavirus, que ces effets soient liés à la réplication virale dans différents types cellulaires au cours du développement de l'infection et en particulier dans les cellules cibles du papillomavirus au niveau du col de l'utérus ou le cas échéant dans les cellules participant à l'immunité de l'hôte, ou qu'il s'agisse des effets observés chez le patient corrélativement à l'évolution de l'infection, tels que le développement des lésions et tumeurs précancéreuses ou cancéreuses. L'invention a également pour objet une cellule procaryote ou eucaryote recombinée, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de nucléotides telle que décrite précédemment ou un vecteur selon l'invention, dans des conditions permettant l'expression in vitro ou in vivo de ladite séquence.
Des cellules eucaryotes intéressantes sont des cellules humaines ou animales. Entrent dans le cadre de l'invention des cellules recombinantes contenant une séquence d'ADN codant pour une protéine E2 ou pour une protéine E2 modifiée selon l'invention, cette séquence étant placée sous le contrôle d'un promoteur d'expression.
Les cellules recombinantes peuvent être des lignées transitoires ou permanentes, par exemple des lignées HeLa.
Elles peuvent être également utilisées pour tester voire quantifier les effets de molécules choisies notamment de molécules dérivées des protéines E2 ou des ADN codant pour une protéine E2, dans des cellules infectées par un papillomavirus. Entre également dans le cadre de l'invention une composition à usage thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un principe actif choisi parmi une protéine E2 de papillomavirus ou une protéine modifiée selon l'invention ou un ADN codant pour une protéine E2 de papillomavirus ou codant pour une protéine modifiée selon l'invention, un vecteur selon l'invention, ou encore une cellule recombinante telle que définie précédemment. Le cas échéant, cette composition à usage thérapeutique peut présenter en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable approprié, notamment un véhicule aqueux ou un véhicule sous forme de liposomes.
La formulation de la composition peut varier selon que l'on recherche chez le patient un effet transitoire ou un effet retard du principe actif.
La protéine E2 ou la protéine E2 modifiée selon l'invention ou l'ADN qui code pour la protéine E2 ou pour une protéine E2 modifiée selon l'invention, ainsi que les compositions, vecteurs et/ou cellules les comprenant peuvent être utilisés seuls ou en association ou en combinaison, pour l'administration séparée ou simultanée avec d'autres molécules actives pour le traitement de l'infection par un papillomavirus. A titre d'exemple, un agent actif dans le traitement d'une infection due à un papillomavirus choisi parmi les composés ayant une activité d'inhibiteur ou de régulateur de cycle cellulaire viral, ou un composé actif en immunothérapie, peut être associé aux réactifs de l'invention.
Selon l'invention, l'expression transitoire de la protéine E2 de papillomavirus humain ou bovin, ou d'une protéine E2 dont la séquence a été modifiée, dans des cellules tumorales infectées par un papillomavirus induit un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et/ou conduit à l'apoptose cellulaire.
L'arrêt du cycle cellulaire par la protéine est dû à une activation post- tarnscriptionnelle de la protéine p53, soit par régulation négative de l'expression du gène E6, qui est connu pour réguler négativement la stabilité de la protéine p53, soit par une voie indépendante de l'expression du gène E6.
La présente invention a montré l'effet inducteur de l'apoptose de la protéine E2 d'un papillomavirus, ou d'une protéine E2 dont la séquence a été modifiée. La présente invention concerne l'utilisation de la protéine E2 en tant que composé antitumoral dans le cas d'infections par des papillomavirus conduisant à un développement de cancer.
La présente invention a également montré l'action synergique de la protéine E2TR et de la protéine E2K344 dans l'activation post-transcriptionnelle du gène p53. L'invention a montré que la protéine E2K344 est capable d'induire une apoptose dans les cellules tumorales infectées par un papillomavirus.
Les approches de thérapie génique du cancer peuvent être réalisées selon deux axes : dans le contexte de la phase tumorale d'une tumeur solide ou dans le contexte postchirurgical micrométastatique. Un effet de proximité ("by-stander") a été observé, c'est à dire que les cellules tumorales n'ayant pas fait l'objet d'un traitement ont été détruites par effet de continuité.
La présente invention montre que l'injection d'un plasmide contenant le gène E2 sous contrôle du promoteur CMV provoque une diminution des tumeurs de cellules HeLa greffées chez la souris nude. Cela démontre l'activité anti- tumorale in vivo de l'expression du gène E2 dans des cellules tumorales initialement infectées par un papillomavirus.
La composition, la protéine; le vecteur, la séquence de nucléotides, telle que l'ADN contenant le gène E2, selon l'invention peuvent être injectés au malade après avoir été couplés à des composés qui favorisent la pénétration de ceux-ci, notamment de l'ADN à l'intérieur de la cellules ou son transport jusqu'au noyau cellulaire. Les conjugués résultants peuvent être encapsulés dans des microparticules de polymères, comme décrit dans la demande de brevet internationale WO 94/27238. La séquence de nucléotides selon l'invention peut être complexée avec du
DEAE-dextran (comme cela est décrit par Pagano et al., J. Virol., 1967, 1 , 891), ou avec des protéines nucléaires (comme cela est décrit par Kaneda et al., Science, 1989, 243, 375), avec des lipides (comme cela est décrit par Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1987, 84, 7413), ou encapsulées dans des liposomes (comme cela est décrit par Fralkey et al. J.Biol. Chem., 1980, 255, 10431).
La séquence de nucléotides selon l'invention, telle que l'ADN qui code pour la protéine E2, peut être introduite sous la forme d'un gel facilitant sa transfection dans les cellules. Une telle composition sous forme de gel peut être un complexe de poly-L-lysine et de lactose, comme décrit par Midoux et al. (Nucieic Acids Research, 1993, 21 , 871-878), ou avec un polymère de marque POLOXAMER 407, comme décrit par Pastore (Circulation, 1994, 90, I, 517).
La séquence de nucléotides selon l'invention peut également être en suspension dans une solution tampon pour être appliquée au patient.
La séquence de nucléotides selon l'invention, telle que l'ADN qui code pour la protéine E2, peut également être associée à des liposomes. Par exemple, avec les liposomes, l'ADN peut être encapsulé dans une bicouche lipidique, comme décrit dans la demande de brevet internationale WO 95/22961.
Une autre technique d'application comprend un bombardement des cellules tumorales avec des microbilles recouvertes d'ADN (procédé de biolistique). Il est également possible d'utiliser l'ADN avec un agent complexant d'ADN, tel que les polymères cationiques et les lipides cationiques. Les polymères cationiques pouvant être utilisés sont notamment la poiylysine, la protamine, et la spermine. Les lipides pouvant être utilisés sont notamment le DOTMA 1 ,2- dioléyloxypropyl-3-triméthyl bromide d'ammonium. Certains lipides polycationiques peuvent également être utilisés.
La présente invention concerne également un mélange contenant la protéine E2, une protéine E2 dont la séquence a été modifiée, la séquence de nucléotides qui code pour la protéine E2 ou pour une protéine E2 dont la séquence a été modifiée, et un additif qui favorise leur effet.
Par additif qui favorise leur effet, on entend un inhibiteur ou un régulateur de cycle cellulaire, un agent qui favorise l'augmentation de la synthèse de la protéine p53 induite, une substance chimiothérapeutique, telle que notamment le taxol, le cisplatin. La protéine E2 ou la séquence de nucléotides codant pour la protéine E2 ou la composition selon l'invention peuvent être délivrées directement dans l'espace interstitiel des tissus infectés ou à l'intérieur des cellules infectées par un papillomavirus et/ou des cellules portant des lésions pré-cancéreuses et/ou des cellules cancéreuses. Une telle méthode appliquée à un ADN nu est notamment décrite dans la demande de brevet internationale WO 90/11092.
La présente invention concerne également une formulation locale ou topique comprenant une protéine E2 sauvage ou modifiée ou une séquence de nucléotides codant pour une protéine E2 sauvage ou modifiée, une composition telle que décrite ci-dessus ou un vecteur tel que décrit ci-dessus. La protéine E2 sauvage ou modifiée, ou la séquence de nucléotides codant pour une protéine E2 peuvent être mise en oeuvre à diverses doses selon l'étendue de la surface à traiter et l'importance des lésions associées à l'infection. On met en oeuvre une composition contenant une dose qui comprend habituellement de 1 à 1000 μg de séquence de nucléotides, et de préférence de 10 à 500 μg de séquence de nucléotides. On met en oeuvre une composition contenant une dose qui comprend habituellement de 0,05 à 10 μg de protéine, et de préférence de 0,1 à 1 μg de protéine. Avantageusement, le traitement est local, la composition étant directement appliquée au niveau de la lésion, soit une seule fois, soit plusieurs fois à intervalles réguliers de plusieurs jours, par exemple 5 à 10 jours. Habituellement, lorsque la composition comprend une protéine E2, la composition comprend, de plus, un agent complexant qui facilite l'internalisation de la protéine dans les cellules infectées.
La présente invention concerne également un procédé permettant de sélectionner des dérivés de la protéine E2 capables d'induire l'apoptose de cellules infectées par un virus de type papillomavirus. Un tel procédé comprendra avantageusement la mise en oeuvre d'une cellule hôte en culture contenant la partie du génome d'un papillomavirus humain ou bovin correspondant aux gènes E6 et E7, cette partie du génome comprenant également la région promotrice P105, placée en amont des séquences codant pour les gènes E6 et E7. La partie du génome de papillomavirus contenu dans la cellule hôte en culture sera indifféremment intégrée dans le génome de ladite cellule hôte ou sous la forme d'un vecteur contenant ladite partie du génome d'un papillomavirus. Avantageusement la partie du génome d'un papillomavirus contenant les gènrs E6 et E7, ainsi que leur région promotrice sera intégrée dans le génome de ladite celule hôte eucaryote, qui sera de préférence une cellule de mammifère et de façon encore plus préférée une cellule humaine, avantageusement une cellule humaine immortalisée.
La cellule hôte mise en oeuvre dans le "procédé de sélection de dérivés de E2 biologiquement actifs selon l'invention est est transfectée avec un vecteur, en particulier un adénovirus recombinant ou un plasmide, contenant une séquence nucléique codant pour un candidat dérivé de la protéine E2 à tester placée sous le contrôle d'éléments permettant son expression dans la cellule hôte.
L'activité des dérivés de la protéine E2 selon l 'invention est ensuite évaluée en mettant en oeuvre le test d'apoptose décrit à l'exemple 12 ou à l'exemple 13, par exemple en mesurant le degré de mortalité dans la culture de cellules hôtes transfectées. 9 1
Dans un mode de réalisation particulier du procédé de criblage de l'invention, les cellules hôtes contenant la partie du génome d'un papillomavirus comprenant E6 et E7 et P105 sont cotransfectées respectivement par un premier vecteur (plasmide par exemple) contenant un gène marqueur exprimable dans lesdites cellules hôtes et un second vecteur contenant une séquence nucléique codant pour un candidat dérivé de la protéine E2 à tester placée sous le cotrôle d'éléments permettant son expression dans cette cellule hôte. Le gène marqueur est avantageusement un gène codant pour une protéine faclilement détectée dans la culture cellulaire, avantageusement une protéine fluorescente, et plus particulièrement une protéine GFP.
L'évolution de la mortalité cellulaire est alors suivie par l'observation de la fluorescence de la culture des cellules hôtes transfecrées à l'aide d'un microscope à fluorescence.
La présente invention a montré que l'inactivation de la protéine E2 virale joue un rôle essentiel dans le développement du cancer du col de l'utérus. La progression de la dysplasie associée au papillomavirus HPV18 vers un stade malin est en relation avec la rupture de la phase ouverte de lecture de E2 ou de son défaut d'expression qui est une conséquence de l'intégration de l'ADN viral dans le génome cellulaire (Berumen, J. et al., 1994, Int. J. Cancer, 56, 640-645). Un tel cas a eu lieu dans les cellules HeLa venant d'un carcinome du col de l'utérus due à un papillomavirus humain HPV18 (Schwarz, E. et al., 1985, Nature, 314, 111-114).
Le phénotype transformé est dépendant de l'expression continue des protéines E6 et E7 virales (Bosch, F.X. et al., 1990, J. Virol., 64, 4743-4754). Ces gènes ont été transcrits à partir du promoteur p105 qui contient les sites de liaison pour la protéine E2 (Thierry, F. et al., 1987b, J. Virol., 61 , 134-142). Il a été montré dans des essais de co-transfection que E2 réprime le promoteur P105 en liant spécifiquement ses séquences d'ADN situées près de la boîte TATA (Thierry, F. et al., 1991 , New Biol., 3, 90-100; et Demeret, C. et al., 1994, J. Virol., 68, 7075-7082). O 98 61
Dans la présente invention, il a été montré que la réintroduction de la protéine E2 de HPV18 et BPV-1 dans des cellules HeLa a réprimé la transcription des gènes E6/E7 endogènes, dont les produits inactivent les gènes de suppression tumorale celullaires p53 et Rb, respectivement (Dyson, N. et al., 1989, Science, 243, 934-937; Scheffner, M. et al., 1990, Cell, 63, 1129-1136).
Il a été montré que la protéine E2 de BPV-1 est capable d'augmenter le taux de la protéine p53 dans les cellules HeLa de 8 à 20 fois (Hwang, E.-S. et al., 1993, J. Virol., 67, 3720-3729 et 1996, Oncogene, 12, 795-803; et Dowhanick, J.J. et al., 1995, J. Virol., 69, 7791-7799). Il a été supposé que cette augmentation du taux de p53 provoquée par E2 pourrait être due à une régulation inverse de l'expression de E6 au travers d'un répression transcriptionnelle du promoteur P105. Cependant, les résultats de la présente invention ont montré que la régulation inverse de la transcription de E6 n'était pas le seul mécanisme cellulaire conduisant à l'activation post-transcriptionnelle pour activer p53, puisque E2TR (forme modifiée de E2 qui est dénuée de la majeure partie de la région d'activation) ne provoque pas l'augmentation du taux de la protéine p53 dans les conditions sous lesquelles elle réprime la transcription de E6/E7 endogène.
La présente invention a montré que les protéines E2 de HPV18 et BPV-1 exprimées dans les cellules HeLa peuvent activer les deux plasmides reporteurs (PG13-CAT et MDM2-CAT) portant les sites d'interaction de la protéine p53. Au contraire, les versions tronquées de E2 (protéines modifiées) ont induit de façon modérée l'activation de l'activité de transcription de p53 (moins de 10 % de celle obtenue avec la protéine E2 complète). Ces essais ont montré un écart clair entre les capacités des deux formes de E2 pour activer p53, alors que les deux ont réprimé la transcription de E6/E7 endogène. Cependant, des variations fines dans les taux de répression de la transcription de E6 pourraient exister entre les protéines de E2 complète et modifiée. Les cellules exprimant E2TR pourraient continuer à produire assez de protéine E6 pour dégrader p53. L'existence d'une voie alternative d'activation de p53 indépendante de la répression de E6 a été confirmée par la capacité de la protéine E2K344 à induire l'activité de p53, bien qu'elle soit défective pour la liaison de l'ADN, la répression de la transcription de HPV et l'activation des plasmides reporteurs portant les sites d'interaction de la protéine E2. Ces observations indiquent que E2 active p53 indépendamment de la répression de la transcription de E6. L'activation induite par E2 de l'activité de transcription de p53 apparaît être dirigée par deux voies indépendantes qui coopèrent. La co-expression de E2TR et E2K344 a entraîné un niveau d'activation proche de celui observé avec la protéine complète E2.
Les essais de la présente invention ont montré que l'activation de la transcription induite par E2 et l'activation de p53 sont des événements indépendants.
D'une part, E2 pourrait interagir avec p53, conduisant à la stabilisation de la protéine. Un facteur auxiliaire serait alors en jeu. D'autre part, E2 pourrait interférer avec des facteurs qui augmentent l'activité de liaison de l'ADN de p53, telle que la caséine kinase II (Hupp, T.R. et al., 1992, Cell, 71 , 875-886), la protéine kinase C (Hupp, T.R. et al., 1994, Curr. Biol., 4, 865-875); Takenaka, I. et al., 1995, J. Biol. Chem., 270, 5405-5411 ) ou les kinases cyclines dépendantes (Wang, Y. et al., 1995, Nature, 376, 88-91 ). Alternativement, E2 pourrait interagir avec un facteur qui inhibe l'activité de transcription de p53, par exemple MDM2 (Momand, J. et al., 1992, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 91 , 1998- 2002).
Si E2 active p53 indépendamment de la répression de la transcription de E6, E2 devrait activer l'activité de transcription de p53 dans des lignées cellulaires HPV-négatives. En fait, il a été observé que E2 a induit une activation modérée mais régulière du plasmide reporteur PG13-CAT dans des cellules HPV-négatives contenant p53 de type sauvage, telles que HepG2 ou NIH3T3. Dans les cellules SAOS p53-null ou les cellules contenant des mutations ponctuelles dans le gène de p53 (SW13, C33 ou HaCaT), E2 était capable d'augmenter l'activation de PG13-CAT quand elle était co-exprimée avec la protéine p53 exogène. Cependant, le niveau de l'activation induite par E2 dans les cellules HPV-négatives est resté 10 fois plus faible que celui obtenu dans les cellules HeLa. Ces observations montrent que l'activation de p53 pourrait être amplifiée dans les cellules exprimant les protéines virales.
Des essais ont montré que E2 n'a pas protégé p53 de la dégradation induite par E6 in vitro. L'expression d'un mutant dominant-négatif de E6 dans les cellules HeLa n'a pas interféré avec l'activation de p53 induite par E2; ceci montre que E2 et E6 n' interagissent pas in vivo.
La protéine E2 de BPV-1 induit l'arrêt de croissance en phase G1 dans les cellules HeLa, par une augmentation du niveau de p53 (Hwang, E.-S. et al., 1993, J. Virol., 67, 795-803; Dowhanick, J.J. et al., 1995, J. Virol., 69, 7791- 7799). La présente invention a confirmé ces observations pour la protéine E2 de BPV-1 et a montré que la protéine E2 de HPV18 homologue se comportait de façon similaire.
La présente invention a montré que l'expression de c-p53 (mutant transdominant négatif) a surmonté le bloquage du cycle cellulaire induite par E2, prouvant de façon claire que la fonction de transactivation spécifique de séquence de p53 était responsable de cet effet.
La présente invention a montré que les protéines E2 de BPV-1 et de HPV18 provoquent la mort cellulaire quand elles sont exprimées de façon transitoire dans les cellules HeLa. La mort cellulaire induite par E2 montre les caractéristiques de l'apoptose, telles que la condensation de la chromatine, le contenu de l'ADN inférieur à 2n et les coupures de l'ADN double-brin. La procédure conduisant à la mort cellulaire induite par E2 semble diverger, au moins partiellement, de celle impliquée dans l'arrêt de la croissance en phase G1 induit par E2, puique cela n'exige pas l'activité de transcription de p53. Cependant, le rôle de p53 comme régulateur de transcription ne peut pas être totalement écarté.
Les résultats obtenus confirment que l'apoptose induite par p53 est indépendante de l'activité de transcription de p53 (Caelles, C. et al., 1994, Nature, 370, 220-223; Wagner, A.J. et al., 1994, Gènes Dev., 8, 2817-2830; Haupt, Y. et al., 1995, Gènes Dev., 9, 2170-2183 et 1996, EMBO J., 15, 1596- 1606; Rowan, S. et al., 1996, EMBO J., 15, 827-838). La mort cellulaire induite par E2 apparaît être, au moins en partie, indépendante de la répression de la transcription de E6/E7, puisque E2TR a été incapable d'induire un phénotype cellulaire anormal, alors que E2K344 a pu occasionner la mort cellulaire dans certains cas. Le manque d'effet observé avec E2TR peut être expliqué de deux façons. D'une part, E2TR ne réprime pas que la synthèse de E6, mais aussi celle de E7. La modulation inverse de E7 active la protéine rétinoblastome, qui protège les cellules de l'apoptose (Almasan, A. et al., 1995, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92, 5436-5440; Haas-Kogan, D.A. et ai., 1995, EMBO J., 14, 461-472). D'autre part, le niveau de p53 généré par E2TR pourrait ne pas être suffisant pour provoquer la mort cellulaire. Alternativement, une modification additionnelle de p53 induite par la région de transactivation de E2 pourrait être nécessaire.
Dans la présente invention il est montré que E2 induit p53 dans les cellules HeLa par au moins deux voies. L'une est réalisée par la voie de la répression de la transcription de E6/E7 endogène. Dans l'autre voie, E2 active p53 soit à travers une interaction directe, soit à travers un facteur auxiliaire.
La figurel représente l'analyse de l'extension d'amorce réalisée avec la sonde spécifique de la protéine E6, sur l'ARN total extrait à partir des cellules transfectées exprimant le marqueur membranaire H2Kd. Les deux protéines E2 de HPV18 (voie 5) et BPV-1 (voie 3) ont réduit le niveau de l'ARN spécifique de E6 initié par le promoteur P105 (flèches supérieures de la figure 1 ). Un niveau comparable de répression a été obtenu avec la forme tronquée de la protéine E2 de BPV-1 , la protéine E2TR, dans laquelle la majeure partie de la région d'activation amino-terminale manque (voie 2). les cellules HeLa sont transfectées dans les boîtes de Pétri de 10 cm avec 1μg du plasmide exprimant H2Kd et 1μg de l'un des vecteurs codant soit pour la protéine E2 de BPV-1 (voie 3), soit pour la protéine E2TR de BPV-1 (voie 2), soit pour la protéine E2 de HPV18 (voie 5) ou pour un contrôle négatif E1TTL (voies 1 et 4). β-act. représente la β-actine. La figure 2 (figures 2A, 2B, 2C) montre que E2 active les promoteurs contenant les sites de liaison de p53. L'expression de la protéine E2 complète de BPV-1 dans toute sa longueur a entraîné une augmentation de l'activité de CAT à partir des plasmides dirigés par le promoteur MDM2 répondant à la p53 naturellement, ou un promoteur synthétique contenant 13 sites de liaison pour p53 (PG13-CAT). La figure 2A montre que l'expression de la protéine E2 de BPV-1 dans toute sa longueur a entraîné une augmentation de l'activité de CAT à partir des plasmides dirigés par le promoteur MDM2 répondant à la p53 naturellement, ou un promoteur synthétique encadré par 13 sites de liaison pour p53 (PG13-CAT).
La figure 2B montre que la protéine tronquée de p53 a été détectée par immunologie à l'aide de l'anticorps monoclonal Ab421.
La figure 2C montre que l'expression de c-p53 a complètement fait disparaître l'activité transcriptionnelle de p53 induite par E2.
La figure 3 montre que E2 n'active pas p53 seulement en réprimant la transcription endogène de E6, car les deux formes tronquées et délétées de E2 ne sont pas capables d'induire l'activation de la transcription dépendante de p53 à des niveaux élevés.
La figure 4 représente des analyses par Western Blot (figure 4A). La figure 4 montre que les quantités d'ARN de p53 n'ont pas varié dans les cellules exprimant les deux protéines E2, en comparaison avec les cellules transfectées avec le vecteur de contrôle négatif (Figure 4B). L'action concomitante des deux formes de E2 (E2TR et E2K344) entraîne une activation de p53 aussi bonne que la protéine E2 complète.
La figure 5 montre qu'aux concentrations optimales, la protéine E2K344 a induit PG13-CAT 20 fois plus (figure 5A). Cette activation a été 3 fois plus basse et 7 fois plus haute que celle observée avec la protéine sauvage E2 et la protéine tronquée E2TR, respectivement.
La figure 5B montre que la perte de l'activité de liaison de l'ADN de la protéine modifiée E2K344 a été confirmée par son incapacité à activer la transcription à partir de TKE2-CAT dans des conditions dans lesquelles la protéine E2 sauvage a activé la transcription jusqu'à 70 fois plus. La figure 5C montre que l'activation synergique de PG13-CAT par E2K344 et E2TR a été mise en corrélation avec une augmentation du niveau de la protéine p53.
La figure 6 montre que la sous-population 2n (sub-2n) des cellules qui expriment E2 est trois fois plus grande que celle des cellules transfectées avec un plasmide contrôle négatif E1TTL ou un vecteur qui exprime E2TR (figure 6A). La proportion d'ADN sub-2n est indiquée sur la gauche de la figure 6A. La figure 6B représente les photographies de cellules exprimant E2TR (section 1 ), E2K344 (section 2), ou E2 (sections 3-6). Les noyaux ont été colorés avec de l'iodure de propidium (sections 1-3). Les cellules H2Kd-positives ont été colorées en vert par un anticorps anti-H2Kd couplé à FITC (sections 1-3). Les sections 4 et 5 représentent la même section de cellules colorées soit avec un anticorps couplé avec un rouge Texas qui détecte la protéine E2 (section 4) ou avec DAPI (section 5). Un exemple de noyaux TUNEL-positifs est montré sur la section 6. Les flèches indiquent les cellules transfectées qui montrent des apparences anormales. Une partie des cellules transfectées exprimant la totalité de la protéine E2 (section 3) ou la protéine modifiée E2K344 (section 2) montre une nette réduction de la taille de leur cytoplasme et de leur noyau. Ces apparences anormales n'ont pas été observées dans les cellules transfectées avec E2TR (section 1 ).
La figure 7 (figures 7A, 7B, 7C) montre que les cellules HeLa ont été transfectées avec 5 μg de PG13-CAT et 0,5 μg du vecteur qui code pour H2Kd, 1 ,5 μg du vecteur qui exprime E1TTL, E2 de HPV18, ou E2 de BPV-1 , avec 1 ,5 μg d'un plasmide qui code pour c-p53 (partie hachurée de la figure 7) ou pour le vecteur seul (partie blanche de la figure 7). Le pourcentage de cellules en phase G1 a été marqué schématiquement sur la figure 7A. La figure 7C représente la proportion de cellules ayant le contenu en ADN inférieur à 2n. L'activité CAT a été testée sur le dixième de la population cellulaire, la multiplication de l'activité a été relevée sur la figure 7B. La figure 8 représente la carte de restriction du plasmide pCG(ATG-). La construction de ce plasmide a été décrite par Tanaka et al., Cell, 1990, 60, 375- 386. Le plasmide pCG(ATG-) permet d'obtenir le plasmide pCGE2TR et le plasmide pCGE2.18VoNCO.
Le plasmide pCGE2TR est un vecteur d'expression eucaryote contenant un fragment d'ADN de 891 pb correspondant à la séquence de la protéine E2 du papillomavirus BPV-1 tronquée des 2/3 de son domaine N-terminal. Le fragment a été préparé à partir du plasmide pC59 (Spalholz et al, Cell, 42, 183-191 , 1985), qui exprime la totalité de la protéine E2 de BPV-1. Il est clone entre les sites Xba\ et SamHI du vecteur.
Le plasmide pCGE2.18VoNCO est un vecteur d'expression eucaryote contenant la totalité de la séquence de la protéine E2 du papillomavirus HPV-18. Le fragment d'ADN a été préparé à partir du génome viral isolé par Boshart et al, EMBO J., 3, 1151-1157, 1984 et séquence par Cole et Danos, J. Mol. Biol., 193, 599-608, 1987). La séquence entre les nucléotides 2817 et 3450 du génome a été clonée entre les sites Xba\ et BamHI du polylinker du vecteur pCG. Le codon ATG d'initiation de la traduction de la protéine E2 a été modifié au cours du clonage par insertion d'un site de restriction NCO.
La figure 9 (figures 9A et 9B) représente la carte de restriction de l'insert E2TR de BPV-1 (SEQ ID NO: 1 ).
La figure 10 représente la séquence protéique de E2TR qui correspond à la deuxième ligne d'acides aminés (2ème phase de lecture) (SEQ ID NO: 2).
La figure 11 (figures 11A et 11 B) représente la carte de restriction de l'insert du plasmide pCGE2.18VoNCO. Dans cet insert, le codon ATG d'initiation de la traduction de la protéine E2 a été modifiée au cours du clonage par insertion d'un site de restriction NCO. La protéine sauvage porte un résidu Q à la position 2, la protéine modifiée qui forme l'insert, porte un résidu E à cette position (SEQ ID NO: 3).
La figure 12 représente la séquence protéique de E2 modifiée qui est exprimée par le plasmide pCGE2.18VoNCO. Cette séquence est située sur la troisième ligne d'acides aminés (3ème phase de lecture) (SEQ ID NO: 4). La figure 13 (figures 13A à 13Q) représente un alignement des séquences protéiques de divers E2 de HPV. La figure 14 montre l'expression des gènes injectés dans des tumeurs d'origine humaine.
Des préparations d'ADN ont été directement injectées dans les tumeurs, induites chez les souris nude par l'inoculation sous cutanée d'un million de cellules HeLa. Approximativement 200μg de plasmides différents, dans 50 μl de tampon TE ont été utilisés pour les injections. Les animaux ont été sacrifiés et les tumeurs ont été disséquées 48 heures après l'injection. Les tumeurs ont été préparées et des extraits bruts ont été testés pour déterminer l'activité CAT selon la description donnée dans la partie Matériel et méthodes. A) Test CAT caractéristique, a) plasmide RSV-CAT exprimant CAT ; b) plasmide RSV-β-gal exprimant la β-galactosidase ; c) solution TE. B) Données moyennes de différents essais CAT. Les valeurs relatives ont été calculées en utilisant le pourcentage de conversion du chloranphénicol obtenu dans au moins trois expériences. L'ordonnée représente l'activité relative en CAT. La figure 15 montre la détection histochimique de l'activité β-galactosidase dans des sections de tumeurs
Les sections de tumeurs injectées ont été obtenues et préparées selon la technique décrite dans matériel et méthode. L'activité β-galactosidase a été détectée en utilisant la coloration X-gal, résultant en une couleur bleu-indigo. Après coloration, les sections de tissus ont été contre-colorées avec de l'éosine et de l'hématoxyline. Les photos représentant les résultats sont données dans les parties A, B et C, 40X, C, D et E, 60X.
La figure 16 montre l'expression au cours du temps des gènes injectés.
Les tumeurs de chaque groupe d'animaux ont été injectées avec des quantités équivalentes d'ADN et resectionnées 24, 48, 72 et 192 heures plus tard. Les pourcentages de conversion du chloranphénicol ont été utilisés pour calculer les activités relatives. L'ordonnée représente l'activité relative en CAT.
La figure 17 montre la croissance des tumeurs injectées avec différentes préparations d'ADN. Les volumes de tumeurs ont été calculés à partir de valeurs obtenues selon la description faite dans "Matériel et méthodes". Dans chaque cas, les valeurs moyennes de différentes expériences (+/- erreur standard) sont montrées. Les points indiquent les jours des injections. Les échantillons B et C correspondent aux résultats obtenus à partir des expériences réalisées en double-aveugle.
La figure 18 montre que des injections répétées de plasmides exprimant E2 réduisent la croissance tumorale de la lignée cellulaire humaine exprimant les oncogènes E6 et E7.HPV18 Les valeurs obtenues à partir des différentes expériences ont été utilisées pour calculer les valeurs T/C, selon la description faite dans Matériel et Méthodes.
I et II, quatre doses de 100 μg de pC59 chaque ; III, cinq doses (100 μg de pC59 chaque) ; IV, deux doses (200 μg de pC59 chaque) ; V, cinq doses (200 μg de pC59 chaque) ; VI, deux doses de 200μg de pCGE2; VII, doses multiples de pC59.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants.
EXEMPLE 1
Constructions des plasmides portant le gène reporteur CAT
Le plasmide p18-4325 contenant le marqueur CAT et le promoteur P105 a été décrit par Thierry et al. (New Biol., 1991 , 3, 90-100). Ce plasmide contient les séquences de la longue région de contrôle (LCR) du HPV18 située entre les nucléotides 6930 et 120 (Thierry et al., Cancer Cells, 1987, 5, 23-32).
TKE2-CAT, référencé précédemment comme TK-E2BS, contient six sites de liaison E2 avant le promoteur de la thymidine kinase du virus herpès simplex (Thierry et al, Mol. Cell Biol., 1990, 10, 4431-4437).
PG13-CAT contient 13 sites de liaison pour p53 avant le promoteur du polyomavirus, alors que dans MG13-CAT les sites de liaison de p53 ont été modifiés (Kern et al., Science, 1992, 256, 827-830). O 98 32861
MDM2-CAT contient le promoteur p53 mdm2 (Moshe Oren).
Le plasmide pC53-SN3 exprime p53 type-sauvage humain (Baker et al., Science, 1990, 249, 912-915)
Les vecteurs pCGE2 (Ustav et al., EMBO J.,1991 , 10, 449-457) et pCGE2TR (Demeret et al, J. Viral., 1994, 68, 7075-7082) expriment la protéine E2 de BPV-1.
Le plasmide pCGE2K344 exprime une protéine modifiée venant de la protéine E2 de BPV-1 qui contient une lysine à la place d'une arginine à la position 344. Le génome complet du papillomavirus humain de type 18 (HPV 18) a été décrit par Cole et al. (J. Mol. Biol., 1987, 193, 599-608). La séquence nuciéotidiques de la protéine E2 y est totalement décrite.
Le plasmide pCGE2K344 a été construit en sous-clonant un fragment BamHI contenant l'ORF modifié de C59 kz E2 K344, qui a été décrit par Dowhanik et al., (J. Virol. ,1995, 69, 7791-7799) dans un vecteur pCG ayant subi une restriction BamHI (Tanaka et al., Cell, 1990, 60, 375-386) .
La protéine E2 de HPV18 a été exprimée à partir du vecteur pCGE2.18 qui a été décrit par Demeret et al. (J. Virol., 1994, 68, 7075-7082).
Le plasmide pCGE2.18VoNCO est un vecteur d'expression eucaryote contenant la totalité de la séquence de la protéine E2 du papillomavirus HPV18. Le fragment d'ADN a été préparé à partir du génome viral isolé par Boshart et al, EMBO J., 3, 1151-1157, 1984 et séquence par Cole et Danos, J. Mol. Biol., 193, 599-608, 1987). La séquence entre les nucléotides 2817 et 3450 du génome a été clonée entre les sites Xba\ et BamHI du polylinker du vecteur pCG. Le codon ATG d'initiation de la traduction de la protéine E2 a été modifié au cours du clonage par insertion d'un site de restriction NCO.
Le papillomavirus bovin de type 1 (BPV-1) code pour deux formes de protéines E2, une de 28 et l'autre de 31 kDa (Lambert et al., Cell, 1989, 50, 69-
78). La protéine de 31 kDa, c'est à dire la protéine E2TR, ne contient pas la majeure partie du domaine de transactivation N-terminale. La protéine E2TR a été exprimée à partir du plasmide pCGE2.DBD. Ce plasmide a été construit en sous-clonant le fragment de E2 de BPV-1 (entre les nucléotides 3023 et 3882) à partir du plasmide pC59 (Spalholz et al., 1985, 42, 183-191 ).
Comme contrôles négatifs, ont été utilisés le plasmide pCGEI .B TTL décrit par Le Moal et al. (J. Virai. ,1994, 68, 3151-3154) ou le plasmide pGGE1.18 TTL. Le plasmide pGGE1.18 TTL a été construit en introduisant la séquence TTAGTTAACTAA (SEQ ID NO: 5) qui est un agent de liaison de terminaison de traduction, dans le site Fspl du fragment Taq-BstNI de 2160 pb de la phase ouverte de lecture (ORF) de la protéine E1 de HPV 18, qui a été précédemment clone dans le plasmide pCG. Le plasmide pPKC.Kd.wt, fourni par Abastado, exprime la molécule H2Kd de MHC classe 1 qui est un antigène de surface, à partir du promoteur précoce de SV40.
Le plasmide CMVgfp exprime une protéine fluorescente verte à partir du promoteur de cytomegalovirus.
EXEMPLE 2
Culture de cellules
Toutes les cellules ont été cultivées dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, Gibco) et contenant de plus 7 % de sérum de veau foetal, de la pénicilline (500 Ul/ml) et de la streptomycine (125 μg/ml).
24 heures avant la transfection, 2. 105 et 5.105 cellules HeLa ont été étalées dans des boîtes de Pétri de 6 et 10 cm de diamètre respectivement. De même, 5. 105 cellules NIH3T3 ont été étalées' dans des boîtes de Pétri de 6 cm, de même pour les cellules SAOS-2, HaCaT et SW13. 7,5. 105 cellules C33 ont été étalées dans des boîtes de Pétri de 6 cm de diamètre, et 7,5. 105 cellules HepG2 ont été étalées dans des boîtes de Pétri de 6 cm de diamètre.
Les transfections ont été réalisées selon la méthode de coprécipitation au phosphate-calcium décrite par Desaintes et al. (Oncogene, 1995, 10, 2155- 2161 ). L'ADN a été préparé selon la méthode de QIAGEN. 6 μg ont été mis en oeuvre pour les boîtes de Pétri de 6 cm et 12 μg pour les boîtes de Pétri de 10 cm par transfection avec le plasmide BLUE SCRIBE (de Stratagene).
Les essais CAT ont été réalisés avec 1/10 à 1/2 de l'extrait cellulaire total selon la méthode décrite par Desaintes et al. ( J. Viral., 1992, 66, 325-333).
La quantification du chloramphenicol marqué C14 acétylé a été déterminée avec l'appareil Phosphorimager (Molecular Dynamics).
EXEMPLE 3 Western blots
Les cellules HeLa telles qu'obtenues ci-dessus dans les boîtes de Pétri de 10 cm ont été récoltées 40 à 44 heures après la transfection et mises en suspension dans 200 μl de tampon Laemmii. 15 μl de cette suspension ont été placés sur un gel SDS-polyacrylamide 10 % (SDS : sodium dodécyl sulfate). Après le transfert, les membranes de nitrocellulose ont été incubées avec des anticorps conjugués à la peroxidase de raifort primaire et secondaire, en utilisant le kit de détection ECL (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant.
L'antisérum spécifique de la protéine E2 de BPV-1 qui a été décrit par Dostatni et al. (Gènes Dev., 1991 , 5, 1657-1671 ) a été utilisé.
L'anticorps monoclonal Ab1801 de p53 qui a été mis en oeuvre a été fourni par la société Santa Cruz Biotechnology.
EXEMPLE 4 Cytométrie de flux
Les cellules HeLa telles qu'obtenues ci-dessus dans les boîtes de Pétri de 10 cm, ont été recouvertes avec un tampon phosphate (PBS) et 0,1 % d'EDTA puis incubées durant 10 minutes pour détacher les cellules de la gélose de la boîte de Pétri. Les cellules surnageantes ont été récoltées en vue de mesurer le nombre de cellules mortes. Les cellules ont été incubées pendant 45 minutes à 4°C en présence de tampon PBS, 10"4 % d'azide et 2 % de sérum de veau foetal (SVF) avec 1/500 de l'anticorps monoclonal spécifique de H2Kd, l'anticorps SF111 (Pharmingen).
Après lavage, les cellules ont été incubées avec un anticorps anti-souris couplé à FITC 1/500 (Amersham) durant 45 minutes, puis fixées avec 80 % d'éthanol.
Ensuite, les cellules ont été rehydratées dans le tampon PBS et incubées durant 30 minutes à 37 °C en présence d'iodure de propidium (PI) (10 μg/ml) et de RNAse (10 μg/ml). Les cellules ont été analysées à l'aide d'un cytomètre à flux (EPICS XL de la société Coulter) en suivant la procédure recommandée par le fabricant.
Les cellules positives ont été conservées en vue d'une analyse de leur contenu en ADN après exclusion des doublets. Le cycle des cellules a été analysé avec l'appareil MultiCycle Software de la société Phoenix Flow Systems, Inc.
EXEMPLE 5 Immunofluorescence
Les cellules HeLa ont été rincées avec le tampon PBS 24 à 75 heures après la transfection. Puis, elles sont incubées en présence de l'anticorps SF111
(1/500 dans le tampon PBS et 2 % de FCS), puis de nouveau incubées en présence de l'anticorps antisouris secondaire couplé à FITC. A ce stade, les cellules ont été fixées dans un mélange éthanol-acide acétique 95/5.
Après hydratation, les cellules ont été colorées avec de l'iodure de propidium ou incubées avec un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre E2 de
BPV-1 décrit par Dostatni et al. (Gènes Dev., 1991 , 5, 1657-1671 ), puis avec un anticorps antilapin couplé à du rouge Texas (Amersham) et DAPI (Sigma
Chemicals) 0,15 μg/ml.
EXEMPLE 6
Essai TUNEL 40 heures après la transfection, les cellules HeLa ont été fixées dans 4 % de paraformaldehyde durant 30 minutes et rendues perméables durant 2 minutes dans 0,1 % de Triton X-100 et 0,1 % de citrate de sodium.
La réaction TUNEL est réalisée en utilisant le kit de détection des cellules mortes in situ (Boehringer Mannheim) en suivant les recommandations du fabricant.
EXEMPLE 7 Extraction de l'ARN Les cellules HeLa ont été transfectées dans les boîtes de Pétri de 10 cm avec 1 μg du vecteur exprimant H2Kd et 1μg de l'un des plasmides suivants pCGE2(18), pCGE2, pCGE2TR ou pCGEITTL
La population de cellules transfectées a été enrichie en sortant les cellules reconnues par l'anticorps anti-H2Kd à l'aide du cytométre à flux FACS Star Plus (Becton-Dickinson) en suivant les recommandations du fabricant.
L'ARN total a été préparé à l'aide du kit Qiagen RNeasy en suivant les recommandations du fabricant.
5μg d'ARN ont subi une hybridation avec des amorces marquées au P32 durant 10 minutes à 68 °C et ensuite ont été refroidis lentement jusqu'à la température ambiante. Deux amorces spécifiques ont été utilisées :
- un oligonucléotide de 24 bases complémentaire de la phase ouverte de lecture de la protéine E6 (partie 5') du papillomavirus HPV18, ce nucléotide ayant la séquence suivante :
CTGTAAGTTCCAATACTGTCTTGC (SEQ ID NO: 6) -un oligonucléotide de 25 bases complémentaire de l'ARN de la β-actine humaine, cet oligonucléotide ayant la séquence suivante : ATCCATGGTGAGCTGGCGGCGGGTG (SEQ ID NO: 7)
La transcription réverse a été réalisée avec l'ARN ayant subi l'hybridation à 37 °C durant 1 heure avec la transcriptase réverse MuLV dans les conditions habituelles décrites par Ham et al. (EMBO J., 1991 , 10, 2931-2940). Les produits de la réaction ont été déterminés sur le gel dénaturé. Pour l'analyse Northern Blot, 5μg d'ARN ont été posés sur un gel MOPS- agarose 1%. Après transfert, les membranes de nitrocellulose ont été hybridees avec une sonde p53 marquée avec du P32 . La sonde a été préparée en effectuant 10 cycles de PCR réalisé sur un fragment d'ADNc de p53 humain avec une seule amorce ayant la séquence suivante : TCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG (SEQ ID NO: 8)
Cette amorce hybride avec la terminaison 3' de la phase ouverte de lecture de p53.
EXEMPLE 8
Les protéines E2 des papillomavirus HPV18 ET BPV-1 répriment la transcription endogène des gènes E6 et E7 dans les cellules HeLa.
Il a été montré dans des essais de co-transfection que les protéines E2 de
HPV18 et de BPV-1 répriment l'activité d'un gène reporteur transcrit à partir du promoteur P105 du papillomavirus humain HPV18 (Thierry et al., EMBO J.,
1987,6, 3391-3397; Thierry et al., New Biol., 1991 , 3, 90-100; et Demeret et al.,
J. Virol., 1994, 68, 7075-7082).
Plusieurs copies de l'ADN du HPV18 ont été introduites dans le génome dans les cellules HeLa. Le promoteur P105 transcrit de façon constitutionnelle les oncogènes E6 et E7, comme cela est illustré à la figure 1.
Comme illustré à la figure 1 , les cellules HeLa sont transfectées dans les boîtes de Pétri de 10 cm avec 1 μg du plasmide exprimant H2Kd et 1μg de l'un des vecteurs codant soit pour la protéine Ë2 de BPV-1 (voie 3), soit pour la protéine E2TR de BPV-1 (voie 2), soit pour la protéine E2 de HPV18 (voie 5) ou pour un contrôle négatif E1TTL (voies 1 et 4).
L'ARN total a été extrait à partir des cellules transfectées et a subi une transcription réverse avec une amorce qui hybride en amont du site d'épissage dans la phase ouverte de lecture de la protéine E6.
Dans la figure 1 , la flèche supérieure indique le produit spécifique E6/E7 de 129 nucléotides de l'extension de l'amorce. Une amorce complémentaire de la terminaison 5' de l'ARNm de la β-actine, introduite comme un contrôle interne dans chaque réaction, a révélé un produit de trasncription réverse de 93 nucléotides, montrant qu'une quantité équivalente d'ARN total a été utilisée dans chaque voie.
Les cellules n'ont pas exprimé la protéine endogène E2 suite à l'interruption des phases ouvertes de lecture des protéines E1-E2 (Schwarz et al., Nature, 1985, 314, 111-114).
Nous vérifions que la protéine E2 exprimée a été capable de réprimer la transcription de E6/E7 endogène dans les cellules HeLa. Le domaine de régulation du papillomavirus HPV16 intégré dans l'ADN génomique pourrait présenter une structure chromatique différente de celle adoptée sur un plasmide transfecté transitoirement, conduisant à un accès modifié de E2 par ses séquences d'ADN de même origine.
Les cellules réellement transfectées ont été sélectionnées suivant leur réaction immunologique vis à vis de l'antigène de surface, la molécule H2Kd de MHC classe 1 , qui est exprimé en même temps qur la protéine E2.
L'analyse de l'extension de l'amorce a été réalisée avec la sonde spécifique de la protéine E6, sur l'ARN total extrait à partir des cellules positives H2Kd, comme cela est illustré à la figure 1. Les deux protéines E2 de HPV18 (voie 5) et BPV-1 (voie 3) ont réduit le niveau de l'ARN spécifique de E6 initié par le promoteur P105 (flèches supérieures de la figure 1 ). Un niveau comparable de répression a été obtenu avec la forme tronquée de la protéine E2 de BPV-1 , la protéine E2TR, dans laquelle la majeure partie de la région d'activation amino- terminale manque (voie 2). Aucune diminution dans les niveaux d'ARN du gène de contrôle de la β-actine n'a été observée. Ces résultats montrent que la protéine E2 et la protéine E2TR peuvent toutes les deux réprimer spécifiquement la transcription des protéines E6/E7.
EXEMPLE 9
La protéine E2 augmente l'activité de transcription de p53 dans les cellules HeLa 32861
Les cellules HeLa contiennent deux allèles p53 sauvages. Cependant, malgré l'abondance des transcripts de p53 dans les cellules, la protéine codée n'est pas détectable, parce qu'elle est dégradée lors de la réaction utilisant
Pubiquitine comme intermédiaire, activée par la protéine E6 (Scheffner et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 1991 , 88, 5523-5527).
La p53 endogène active sur la transcription peut être activée quand ces cellules sont exposées à des agents gènotoxiques ( Butz et al., Oncogene, 1995, 10, 927-936). La protéine E2 peut réprimer l'expression de la protéine E6. On a recherché si cette répression conduisait à une stabilisation de p53. L'activité de p53 a été testée à l'aide de plasmides portant un marqueur
CAT.
Comme l'illustre la figure 2A, l'expression de la protéine E2 complète de
BPV-1 dans toute sa longueur a entraîné une augmentation de l'activité de CAT à partir des plasmides dirigés par le promoteur MDM2 répondant à la p53 naturellement, ou un promoteur synthétique contenant 13 sites de liaison pour p53 (PG13-CAT).
Pour confirmer que l'activation de PG13-CAT a été en fait conduite par l'intermédiaire de p53, un plasmide codant pour un produit de 17 kDa correspondant à la partie carboxy-terminale de p53 (c-p53) a été co-transfecté. Cette protéine tronquée de p53 a été détectée par immunologie à l'aide de l'anticorps monoclonal Ab421 (Oncogene Science) spécifique de p53, qui reconnaît aussi la protéine p53 sur toute sa longueur dans les cellules transfectées avec un vecteur exprimant p53. Ceci est illustré par la figure 2B.
Des formes tronquées courtes agissent comme des mutants trans- dominants-négatifs en formant des oligomères avec la protéine de type sauvage et en conséquence inactivent la transactivation et les fonctions de suppression tumorale de p53 (Shaulian et al, Mol. Cell Biol., 1992, 12, 5581-5592).
L'expression de c-p53 (figure 2C) a complètement fait disparaître l'activité transcriptionnelle de p53 induite par E2. Ceci confirme que l'effet de E2 sur PG13-CAT est permis par p53. La figure 2A illustre des essais réalisés avec des extraits de cellules HeLa transfectées avec 2 μg de plasmides portant le marqueur CAT et contenant le promoteur MDM2 ou le promoteur précoce de polyomavirus encadré par 13 sites de liaison p53 (PG13-CAT), et 0,2 μg de plasmides exprimant la protéine E2 de BPV-1.
L'essai avec MDM2-CAT a été réalisé avec 15 fois moins d'extrait que celui avec PG13-CAT.
Les activités relatives CAT ont été 34, 319, 1 et 40 pour MDM2 + E1TTL, MDM2 + E2, PG13 + E1TTL et PG13 + E2, respectivement La figure 2B illustre les résultats du Western Blot. Les cellules HeLa ont été co-transfectées avec 1 μg des vecteurs d'expression pour p53, un fragment carboxy-terminal de p53 (c-p53) ou un vecteur seul (-). Les protéines cellulaires totales ont été mises en évidence avec l'anticorps monoclonal Ab42 spécifique de p53. Les flèches indiquent la protéine p53 sur toute sa longueur et c-p53. La figure 2C illustre l'essai avec la marqueur CAT. Les cellules HeLa ont été co-transfectées avec 2 μg de PG13-CAT, 0,5 μg des vecteurs d'expression pour la protéine E2 de BPV-1 (voies 3 et 4) ou E1TTL (voies 1 et 2) avec 1 μg d'un plasmide codant pour c-p53 trans-dominant-négatif (voies 2 et 4) ou un vecteur seul (voies 1 et 3). Les essais de marqueur CAT ont été réalisés avec 1/5 des extraits cellulaires pendant 1 heure.
EXEMPLE 10
Les protéines E2 et E2TR diffèrent par leur capacité d'induire p53
La figure 1 montre que la protéine E2 et la protéine tronquée E2TR répriment toutes les deux l'expression de E6 avec des efficacités comparables.
Cet exemple, qui est illustré par la figure 3, montre que E2 n'active pas p53 seulement en réprimant la transcription endogène de E6, car les deux formes tronquées de E2 ne sont pas capables d'induire l'activation de la transcription dépendante de p53 à des niveaux élevés. La protéine E2 complète de HPV18 (courbes de gauche de la figure 3) et la protéine E2 complète de BPV-1 (courbes de droite de la figure 3) ont augmenté l'activité de PG13-CAT de 30 à 60 fois respectivement. Les formes courtes ont produit seulement une activation modérée de PG13-CAT (jusqu'à 5 à 7 fois pour HPV18 et BPV-1 respectivement). Dans ces conditions, les formes tronquées de E2 (courbes basses O), HPV18 E2DBD ou BPV-1 E2TR ont réprimé d'une manière qui dépend de la dose, aussi efficacement que leurs protéines correspondantes complètes (courbes basses O), l'activité du marqueur
CAT du plasmide reporteur P105. Les résultats illustrés par la figure 3 ont été obtenus suite à des essais qui ont été réalisés avec des quantités croissantes de plasmides exprimant la protéine E2 complète (symboles noirs sur la figure 3) de HPV18 ou BPV-1 ou des formes tronquées (symboles blancs sur la figure 3) de cette protéine. Ces plasmides ont été transfectés dans des cellules HeLa avec 2μg de PG13-CAT (courbes du haut) ou P105-CAT (courbes du bas). Les valeurs qui représentent la moyenne d'au moins 3 à 8 transfections indépendantes ont été calculées par rapport aux activités du marqueur CAT en présence du plasmide pCGEITTL comme contrôle négatif.
La répression dépendait spécifiquement de l'interaction entre E2 et sa séquence d'ADN cible, comme le montrent les deux essais suivants.
La mutation de trois sites de liaison de E2 les plus proches du promoteur P105 a fait totalement disparaître la répression par E2. Une autre mutation ponctuelle qui a détruit la capacité de liaison de l'ADN de la protéine E2 de BPV- 1a affaibli la répression de l'activité de P105 La différence entre les formes complète et tronquée de E2 dans l'activation de p53 n'est pas due à une différence dans le niveau d'expression, puisque les analyses par Western Blot ont montré (figure 4A, section haute) que les deux produits étaient présents à des concentrations similaires dans les cellules transfectées. Dans les extraits de cellules transfectées, les deux protéines E2 ont lié les séquences d'ADN cibles avec des efficacités similaires.
La différence dans l'activation de l'activité de transcription de p53 a été mise en corrélation avec le niveau d'équilibre de la protéine p53, comme le montre l'analyse par Western Blot illustrée à la figure 4A (section basse). Cette accumulation de protéine p53 n'a pas résulté d'une activation de transcription du gène, puisque les quantités d'ARN de p53 n'ont pas varié dans les cellules exprimant les deux protéines E2, en comparaison avec les cellules transfectées avec le vecteur de contrôle négatif (Figure 4B). Pour obtenir les résultats illustrés dans la figure 4, qui montrent que la protéine E2 augmente le niveau d'expression de la protéine p53 sans affecter la transcription du gène qui code pour p53, les essais suivants ont été réalisés. Les cellules HeLa ont été transfectées avec 0,5 μg d'un plasmide exprimant H2Kd et 1 ,5 μg des vecteurs codant pour E1TTL (-), E2 de BPV-1 ou E2TR de BPV-1. La population de cellules transfectées a été enrichie en sélectionnant les cellules H2Kd-positives. La moitié des cellules a été mise en suspension dans le tampon de Laemmii pour une analyse des protéines, l'autre moitié a été utilisée pour extraire l'ARN. La figure 4A illustre les résultats d'analyse du Western Blot. Les membranes ont été incubées avec un antisérum spécifique de E2 (section haute) ou un anticorps Ab1801 de p53 (section basse). La figure 4B illustre les résultats d'analyse du Northern Blot . 5 μg d'ARN ont été déposés sur un gel MOPS- agarose 1%. Après transfert, la membrane a été incubée avec une sonde spécifique pour p53 et marquée avec P32. Dans la section gauche de la figure 4 B, la flèche indique les transcripts de p53. Les positions des marqueurs de poids moléculaire de l'ARN sont indiquées sur la gauche de la figure 4. La photographie du gel sur la section droite de la figure 4 montre que des quantités équivalentes d'ARNs 18S et 28S étaient présentes dans les trois voies.
Ces résultats montrent que la protéine E2 active la protéine p53 à un niveau post-transcriptionnel et que cela n'est pas seulement dû à la diminution de l'ARNm spécifique de E6 endogène. La répression du promoteur P105 (faite pour les deux formes de E2, la forme complète et la forme ayant été tronquée dans sa partie N-terminale) n'est pas suffisante pour conférer l'activation totale de p53.
Ceci montre qu'une autre fonction de la protéine E2, qui requiert probablement la présence de la région N-terminale, est aussi impliquée dans l'induction de p53.
EXEMPLE 11
Deux régions de la protéine E2 sont complémentaires du point de vue de leur fonction pour activer la transcription dirigée par p53 Le domaine de liaison de l'ADN de E2 seule n'est pas apte pour activer totalement l'activité de transcription de p53.
La séquence de la protéine E2 de BPV-1 a été modifiée par un procédé classique de mutation. L'arginine de la position 344 a été remplacée par une lysine. Cette protéine modifiée a été nommée E2K344. La mutation effectuée se situe dans l'hélice α de reconnaissance de la région carboxy-terminale (Hegde et al., Nature, 1992, 359, 505 -512). Cette mutation entraîne la disparition de la liaison avec l'ADN sans modifier la dimérisation de la protéine (Dowhanick et al., J. Virol., 1995, 69, 7791-7799). Le fait que cette protéine modifiée s'accumule normalement dans le noyau, a été vérifié par immunofluorescence. Aux concentrations optimales, la protéine E2K344 a induit PG13-CAT
20 fois plus, comme l'illustre la figure 5A. Cette activation a été 3 fois plus basse et 7 fois plus haute que celle observée avec la protéine sauvage E2 et la protéine tronquée E2TR, respectivement.
Cependant, la co-expression de 0,2 μg de E2TR avec des doses croissantes de E2K344 a provoqué une activation synergique (jusqu'à 45 fois) de l'activité de PG13-CAT.
En comparant avec la protéine E2 sauvage, l'activation obtenue avec la combinaison des deux protéines modifiées a exigé une plus grande quantité des plasmides d'expression. L'activation a atteint des niveaux équivalents à des concentrations supérieures à 0,5 μg. La perte de l'activité de liaison de l'ADN de la protéine modifiée E2K344 a été confirmée par son incapacité à activer la transcription à partir de TKE2-CAT dans des conditions dans lesquelles la protéine E2 sauvage a activé la transcription jusqu'à 70 fois plus. Ceci est illustré par la figure 5B.
TKE2-CAT est un plasmide contenant un marqueur CAT et six sites de liaison de la protéine E2 en amont du promoteur de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex.
La co-expression de E2TR et de E2K344 n'a pas activé TKE2-CAT, ceci indique que les deux protéines ne dimérisent pas de façon hétérologue pour reconstituer un transactivateur actif spécifique de la séquence. L'activation synergique de PG13-CAT par E2K344 et E2TR a été mise en corrélation avec une augmentation du niveau de la protéine p53. Ceci est illustré par la figure 5C. Le niveau de p53 était en fait plus élevé dans les cellules exprimant les deux protéines E2TR et E2K344 ensemble, en comparaison avec les cellules transfectées avec le vecteur de contrôle négatif ou l'un des deux plasmides d'expression seul.
La quantité de protéine p53 dans les cellules transfectées par E2 est plus faible que celle s'accumulant dans les cellules transfectées avec un plasmide qui code pour une protéine p53 de type sauvage (SN3).
Ces résultats montrent que l'activation de p53 induite par E2 est gérée par deux voies indépendantes, l'une étant indépendante de la régulation négatice de la transcription de E6/E7.
La figure 5 illustre que le domaine de transactivation de E2 et les régions de liaison de l'ADN contribuent de façon synergique à l'activation de p53. Les cellules HeLa ont été transfectées avec des doses croissantes de vecteurs exprimant E2 (losange noir sur la figure 5), E2TR (losange blanc), E2K344 seul (rond blanc) ou en combinaison avec 0, 2 μg de E2TR (triangle blanc), avec 2 μg de plasmides reporteurs PG13-CAT (figure 5A) ou TKE2-CAT (figure 5B). Le plasmide pCGEITTL a été utilisé comme contrôle négatif. Les essais avec le reporteur CAT ont été réalisés avec des extraits cellulaires à partir des cellules récoltées 44 heures après la transfection. Sur la figure 5 (figures 5A et 5B), les valeurs sont exprimées en comparaison à E1TTL La figure 5C illustre l'analyse de Western Blot réalisée avec 1/5 des extraits de cellules transfectées avec 0,2 μg des vecteurs qui codent pour E1TTL, E2, E2TR, p53 humain (SN3), ou 0,8 μg de pCGE2K344 soit seul soit en combinaison avec 0,2 μg de pCGE2TR.
La protéine p53 a été détectée avec l'anticorps Ab1801 (Société Santa Cruz). Les marqueurs de poids moléculaire sont indiqués sur la gauche de la figure 5C en kDa.
Le tableau 1 montre l'amélioration modérée de l'activité de p53 par la protéine E2 dans des lignées cellulaires HPV-négatives.
Pour cet essai, ont été utilisées 7 lignées cellulaires différentes, qui peuvent être divisées en deux catégories selon leur statut vis à vis de p53. Les cellules HeLa, HepG2 et NIH3T3 contiennent des allèles de p53 de type sauvage, les cellules C33, SW13 et HaCaT expriment une forme mutée de p53, et les cellules SAOS n'expriment pas p53 (ATCC n° HTB85).
La présence de p53 endogène actif du point de vue transcription a été confirmée en comparant l'activité de PG13-CAT avec celle de MG13-CAT. MG13-CAT est identique à PG13-CAT à l'exception que les séquences de liaison de p53 ont été modifiées (mutées).
L'expression de E2 dans les cellules HepG2 et NIH3T3 a provoqué une activation de 2 et 2,4 fois du plasmide reporteur PG13-CAT, respectivement. Au contraire, E2 n'a pas induit une activation de PG13-CAT dans les cellules p53-négatives. Dans des conditions identiques, p53 exogène a induit une activation de PG13-CAT faible dans les cellules SW13, moyenne dans les cellules C33 et forte dans les cellules HaCaT et SAOS.
En introduisant p53 exogène humain de type sauvage, E2 a multiplié l'activité de transcription de PG13-CAT par 2,2 à 4,5 fois dans les quatre différentes lignées cellulaires. L'expression de E2 a induit au moins une multiplication de l'activation par 50 du plasmide TKE2-CAT portant E2. Ces résultats montrent que la protéine E2 pourrait induire l'activité de transcription de p53 dans les lignées cellulaires HPV-négatives, bien qu'à un niveau plus faible que celui observé dans les cellules HeLa. Tableau 1
Cellules Activités relatives Multiplication de l'activation du marqueur CAT de PG13-CAT
PG13-CAT/MG13-CAT par p53 par E2
HeLa 5 100 30-60 (n=30)
HepG2 100 ; ? 2 (n=5)
NIH3T3 8 10,6 2,4 (n=6)
C33 0,3 12,4 3 (n=2) a
SW13 1 3,3 4,5 (n=7) a
HaCaT 1 50 3 (n=9) a
SAOS 1 50 2,2 (n=2) a
Pour les essais conduisant au tableau 1 , les cellules ont été transfectées avec MG13-CAT ou PG13-CAT ensemble avec des plasmides qui codent pour le contrôle négatif E1TTL, E2 ou p53 sauvage humain. Le niveau de l'activité de transcription p53 endogène a été déterminé en comparant les activités du reporteur CAT dans les cellules transfectées avec PG13-CAT ou MG13-CAT. L'activation de PG13-CAT par E2 ou p53 a été calculée en comparaison avec le contrôle négatif E1TTL. Les valeurs moyennes des activités ou le niveau de l'activation ont été indiquées dans le tableau 1. Dans le tableau 1 , a signifie que dans les lignées cellulaires HPV- négatives, le plasmide exprimant p53 humain a été co-transfecté avec PG13- CAT et pCGE2 ou pCGEITTL; et n représente le nombre d'essais de transfection indépendants réalisés.
EXEMPLE 12
E2 induit l'apoptose O 98/32861
Thierry et al. (EMBO J., 1987, 6, 3391-3397) ont décrit l'impossibilité d'obtenir des clones de cellules HeLa qui expriment E2 de façon stable. De plus, dès le début de la transfection, E2 présente un effet toxique sur les cellules. Dans certaines circonstances, il a été montré que l'activation de p53 induit l'apoptose (Diller et al., Mol. Cell Biol., 1990, 10, 5772-5781 et Yonish-Rouac et al., Nature, 1991 , 352, 345-347). On a donc recherché si l'expression de E2 entraînerait la mort cellulaire.
Les cellules HeLa ont été mises en culture dans des boîtes de Pétri de 10 cm puis ont été transfectées avec 1 ,5 μg de pCGEITTL, pCGE2 ou pCGE2TR, et 0,5 μg du plasmide exprimant H2Kd.
40 heures après la transfection, les cellules réellement transfectées ont été mises en présence d'un anticorps couplé avec de l'isothiocyanate (FITC) de fluoresceine H2Kd. Puis, leur contenu en ADN a été déterminé par cytométrie de flux. La figure 6A montre que la sous-population dont le contenu en ADN est inférieure à 2n (sub-2n) des cellules qui expriment E2 est trois fois plus grande que celle des cellules transfectées avec un plasmide contrôle négatif E1TTL ou un vecteur qui exprime E2TR. La proportion d'ADN sub-2n est indiquée sur la gauche de la figure 6A. La sous-population sub-2n correspond aux cellules qui ont perdu leur matériel génomique suite à la mort cellulaire. L'effet de E2 sur les cellules et la morphologie du noyau a été examiné par immunofluorescence. Ceci est illustré par la figure 6B. La figure 6B représente les photographies de cellules exprimant E2TR (section 1 ), E2K344 (section 2), ou E2 (sections 3-6). Les noyaux ont été colorés avec de l'iodure de propidium (sections 1-3). Les cellules H2Kd-positives ont été colorées en vert par un anticorps anti-H2Kd couplé à FITC (sections 1-3). Les sections 4 et 5 représentent la même section de cellules colorées soit avec un anticorps couplé avec un rouge Texas qui détecte la protéine E2 (section 4) ou avec DAPI (section 5). Un exemple de noyaux TUNEL-positifs est montré sur la section 6. Les flèches indiquent les cellules transfectées qui montrent une apparence anormale. Une partie des cellules transfectées exprimant la totalité de la protéine E2 (section 3) ou la protéine modifiée E2K344 (section 2) montre une nette réduction de la taille de leur cytoplasme et de leur noyau. Ces apparences anormales n'ont pas été observées dans les cellules transfectées avec E2TR (section 1 ). L'expression de E2 a aussi été visualisée en colorant directement les cellules avec un anticorps anti-E2 couplé à du rouge Texas (section 4). Les mêmes cellules ont été colorées avec le 4,6-diaminodino-2-phénylindole (DAPI), ceci montre deux cellules E2-positives ayant une chromatine condensée (flèches dans la section 5). De plus, les cellules transfectées avec les vecteurs qui expriment E2 contenaient des coupures d'ADN qui ont été mises en évidence lors de l'essai TUNEL (section 6). Les cellules TUNEL-positives ont représentées 7,5, 12 et 50 % de la proportion des cellules H2Kd-positives qui expriment E1TTL, E2TR et E2 respectivement. L'expression de la protéine E2 de HPV18 a également conduit à une apoptose, comme le montrent la condensation de la chromatine, la teneur en ADN de la sous-population sub-2n et les résultats de la réaction TUNEL.
La méthode pour réaliser la réaction de TUNEL est décrite par Wang et al. , Cancer Gène Ther., 1995, 2, 9-17. Ces résultats montrent que la protéine E2 induit la mort cellulaire par apoptose. La mort cellulaire n'est pas due de façon non-spécifique à une surproduction de protéine dans le noyau, puisque les faits caractéristiques de l'apoptose (mort cellulaire, fragmentation de l'ADN et condensation de la chromatine) n'étaient pas au dessus du niveau du bruit de fond dans les cellules exprimant E2TR.
EXEMPLE 13
L'activité de transcription de p53 est nécessaire pour l'arrêt de la croissance en phase G1 induit par E2, mais on peut s'en passer pour l'apoptose provoquée par E2 61
L'augmentation de p53 accroît ou bloque la progression au niveau de la phase G1 ou induit l'apoptose (ElDeiry et al., Cell, 1993, 75, 817-825; Xiong et al., Nature, 1993, 366, 701-704; Harper et al., Mol. Biol. Cell, 1995, 6, 387-400) ou induit l'apoptose (Diller et al., Mol. Cell Biol., 1990, 10, 5772-5781 et Yonish- Rouach et al., Nature, 1991 , 352, 345-347).
Il a déjà été montré que l'expression de E2 stoppe les cellules HeLa et HT3 en phase G1 (Hwang et al, 1993, .et Dowhanick et al, 1995) pour voir, ensuite, le rôle de p53 dans l'apoptose induite par E2 et l'arrêt de croissance en phase G1 , l'activité transcriptionnelle de p53 a été inhibée en co-exprimant c-p53 (mutant de p53 trans-dominant négatif) en présence de E2.
Les cellules HeLa ont été transfectées avec 5 μg de PG13-CAT et 0,5 μg du vecteur qui code pour H2Kd, 1 ,5 μg du vecteur qui exprime E1TTL, E2 de HPV18, ou E2 de BPV-1 , avec 1 ,5 μg d'un plasmide qui code pour c-p53 (partie hachurée de la figure 7) ou pour le vecteur seul (partie blanche de la figure 7). 40 heures après la transfection, les cellules H2Kd-positives ont été marquées avec de l'iodure de propidium et analysées par cytométrie de flux pour déterminer leur contenu en ADN.
Les cellules ont été mises en présence d'un anticorps couplé avec du FITC spécifique pour le marqueur de surface H2Kd codé par un piasmide co- transfecté.
Le pourcentage de cellules en phase G1 a été marqué schématiquement sur la figure 7A. La figure 7C représente la proportion de cellules ayant le contenu en ADN inférieur à 2n. L'activité CAT a été testée sur le dixième de la population cellulaire, la multiplication de l'activité a été relevée sur la figure 7B. Comme illustré par la figure 7, l'expression transitoire des protéines E2 de
HVP18 et de BPV-1 (figure 7A) a augmenté la proportion de cellules bloquées en phase G1 (70 et 73,5 % pour HVP18 et BPV-1 respectivement, en comparaison avec 55,1 % pour les cellules transfectées avec le plasmide contrôle négatif. La co-expression de c-p53 dominant-négatif (partie hachurée de la figure 7) a presque complètement libéré le bloquage de G1 induit par E2, dans des conditions telles qu'elle a complètement fait disparaître l'activité de transcription de p53 (figure 7B).
L'apoptose induite par E2 a été contrôlée par la proportion de cellules ayant un contenu d'ADN inférieur à 2n. Les cellules exprimant E2 de HPV18 et BPV-1 ont représenté une sous-population sub-2n de 15,8 % et 19,4 % respectivement, en comparaison avec 7 % pour les cellules faisant partie du contrôle négatif (figure 7C).
Cependant, l'augmentation de l'apoptose induite par E2 n'a pas été affectée par la co-expression de c-p53 dominant-négatif; au contraire, elle a été un peu augmentée.
Ces résultats montrent que l'apoptose et I' arrêt du cycle cellulaire en phase G1 observés dans les cellules transfectées avec E2 se déroulent par des voies différentes et que l'arrêt du cycle cellulaire implique que p53 soit actif du point de vue de la transcription. L'apoptose induite par E2 n'exige pas que p53 soit actif du point de vue de la transcription. Les cellules C33 qui ont comme origine un carcinome du col de l'utérus HPV-négatif, les cellules HaCaT ou SAOS, pour toutes lesquelles il manque p53 fonctionnel, ont été transfectées avec les vecteurs exprimant E1TTL, E2 ou p53 humain de type sauvage, en même temps que des plasmides qui codent pour une protéine de fluorescence verte et H2Kd.
20 à 40 heures après la transfection, l'apoptose a été déterminée en comptant le nombre de cellules vertes mortes.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 2. Les valeurs notées sont la moyenne de plusieurs tests de transfection indépendants, n représente le nombre de tests indépendants réalisés.
Le tableau 2 montre que E2 n'induit pas l'apoptose dans les lignées cellulaires p53-négatives.
Tableau 2 Cellules E1TTL E2 p53
HaCaT (n=3) 17 16 27
C33 (n=4) 18 17 23
SAOS (n=3) 17 17 47
E2 n'a pas augmenté le pourcentage de cellules mortes en comparaison avec le contrôle E1TTL, dans les trois lignées cellulaires, alors que p53 a augmenté de façon significative le niveau de l'apoptose dans les cellules SAOS et HaCaT, et dans une moindre mesure dans les cellules C33.
Ces résultats ont été confirmés par l'analyse FACS et l'analyse TUNEL. Ces essais montrent que la protéine E2 seule n'est pas suffisante pour déclencher la mort cellulaire, et que l'apoptose induite par E2 nécessite la présence de p53 sauvage.
EXEMPLE 14
Cet exemple rapporte l'expression dans des tumeurs d'origine humaine produites dans des souris nude, de gènes injectés directement dans ces tumeurs sous forme de préparations d'ADN porté par des plasmides. Plusieurs constructions d'ADN contenant des gènes reporteurs, sous le contrôle de différents promoteurs viraux ou cellulaires, ont été injectés dans des tumeurs humaines produites par des souris nude. L'expression a été mesurée par coloration différentielle in situ de β-galactosidase dans des sections des tumeurs, ou en réalisant des tests impliquant l'acétyl-transférase de chloramphénycol
(CAT). On a montré que l'expression était fortement spécifique et dépendait de la force du promoteur dirigeant l'expression du gène reporteur. En outre, les niveaux d'expression obtenus avec les préparations d'ADN ont été comparés, lorsque ces préparations ont été soit directement injectées, soit administrées à l'aide de liposomes ; aucune différence significative n'a été observée entre ces modes d'administration.
A la suite de ces observations, l'utilisation potentielle de préparations d'ADN contenant le gène E2 de papillomavirus, a été évaluée en vue de réduire la croissance tumorale de lignées cellulaires d'origine humaine exprimant les oncogènes E6 et E7. Des injections multiples de plasmides contenant le gène E2 ont permis de réduire significativement la croissance tumorale de cellules HeLa, ces cellules constituant une lignée dérivée des cellules du col de l'utérus connues pour leur capacité à exprimer les oncogènes viraux E6 et E7. La lignée de cellules HeLa est certainement la lignée de cellules utérine la mieux connue, cette lignée dérivant à l'origine d'un adénocarcinome du col de l'utérus et contenant des séquences intégrées de HPV18. Dans ces cellules on a observé l'expression active des oncogènes E6 et E7 alors qu'un grand segment viral incluant les gènes E1 et E2 est délété. (Schwarz et al, Nature 314:111 , 1985), Schneider Gâdicke et Schwarz, EMBO J. 5:2285, 1986).
Des observations antérieures ont montré que l'expression permanente du gène E2 est toxique pour ces cellules, (Thierry et Yaniv, EMBO J. 6:391 , 1987) et que son introduction inhibe la prolifération cellulaire probablement en bloquant la progression de la transition entre les phases G1 et S du cycle cellulaire (Hwang et al, ...).
Les cellules HeLa contenant les plasmides exprimant les ARN antisens E6 et E7 ont montré une croissance tumorale plus faible et une capacité réduite à former des colonies dans de l'agar mou, ainsi qu'un besoin accru en sérum, confirmant l'importance de l'expression des oncogènes viraux pour le maintien de leur phenotype d'immortalisafion (Steele et al., Cancer Res. 52, 4706-4711 , Von Knebel Doeberitz et al., Cancer Res. 48, 3780-3786).
METHODES
Plasmides Les plasmides utilisés contenaient soit les gènes reporteurs, lacZ ou CAT, soit le gène E2 de papillomavirus bovin de type 1 (BPV-1 ), sous forme mutée ou O 98/32861 PC /
normale, sous le contrôle de différents promoteurs incluant : le promoteur précoce SV40 (SVE), la séquence LTR du virus du Sarcome de Rous (RSV), la région de régulation amont (URR) du papillomavirus humain de type 18 (HPV18), et le promoteur précoce immédiat du cytomégalovirus (CMV). Ces promoteurs ont été décrits respectivement dans les publications suivantes, Thierry and Yaniv, (1987) EMBO J. 6:3391 , Cid et al., (1993), J. Virol. 67, 6742-6752, Ustav and Stendlund, (1991 ), EMBO J. 10,449-457, Yang et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1030-1034, Spalholz et al., (1985), Cell 42: 183.
Les plasmides contenant le gène E2 ont été préparés par des méthodes conventionnelles et extraits soit à l'aide d'un mélange phénol/chloroforme soit purifiés dans des gradients de CsCL, selon la description faite par Maniatis et al, 1987.
Les plasmides contenant le gène E2 contenaient soit le promoteur SVE (pC59 et pC9), soit le promoteur du CMV (pCGE2).
Cellules
Les cellules HeLa ont été cultivées dans un milieu Eagle modifié par
Dulbecco (DMEM; GIBCO) complété avec 10 % de sérum foetal bovin dans une atmosphère comprenant 5 % de C02. 1 x 106 cellules ont été injectées dans un milieu dépourvu de sérum dans 200 μl; la viabilité a été mesurée par l'exclusion au Bleu Trypan; elle excédait en principe 95 %.
Détection Histochimique de l' ctivité β-galactosidase dans les sections de tumeurs Les tumeurs ont été fixées pendant 60 à 90 minutes dans un tampon phosphate salin (PBS : 150 mM NaCI, 15 mM phosphate de sodium [pH 7,3]), contenant 2 mM MgCI2, 2% paraformaldehyde, et 0,2 % de glutaraldehyde.
Après lavage deux fois dans du PBS-MgCI2 (PBS contenant deux mM MgCL2) les tumeurs ont été saturées dans la même solution contenant 30 % de sucrose pendant 6 à 12 heures à 4° C puis congelées dans un milieu "Tissue-Tek"
(Milles). Les sections congelées (10 mm) ont été séchées à l'air, lavées dans du PBS-MgCI2 contenant 0,02 % de Nonidet P40 (NP-40), 0,01% de desoxycholate de sodium et refixées pendant 5 minutes avec une solution de fixation. Les sections ont été recouvertes avec une solution contenant 1 mg/ml de X-Gal (5- bromo-4chloro-3indolyl-β-D-glalactopyranoside; SIGMA); 5 mM de ferricyanure de potassium; 2 mM MgCI2; 0,01 % de desoxycholate de sodium et 0,02 % de NP-40. L'incubation a été réalisée à 37°C pendant 12 à 16 heures.
Test de l'activité CAT dans les extraits de tumeurs Les tumeurs (approximativement 0,1-0,3 mm3) ont été homogénéisées avec un Polytron dans 300 ml de solution TGD (Tris [pH:8]; 15% glycerol; 5 mM TT), puis soumises à 6 cycles de congélation-fusion, puis centrifugées pendant 10 minutes à 4°C. Les surnageants ont été chauffés pendant 10 minutes à 65°C pour inactiver les acétylases et centrifugés à nouveau pendant 5 minutes à 4°C. Les surnageants résultant constituaient les extraits bruts utilisés ultérieurement pour déterminer la concentration de protéine et l'activité CAT.
La protéine totale a été normalisée et chaque extrait complété jusqu'à 300 μl avec une solution Tris (250 mM Tris [pH 8]). Puis, 8 ml d'acétyl coenzyme A 20 mM et 0,06 mCi de chloramphénicol C14 (Amersham, UK) ont été ajoutés et le milieu de réaction a été incubé pendant 1 heure à 37°C. De l'acétyl coenzyme A a ensuite été ajouté et l'incubation a été poursuivie pendant une heure supplémentaire. Les échantillons ont été chromatographiés sur des plaques de gel de silice en couches minces, dans un milieu contenant du chloroforme et du méthanol (19:1 ), puis les échantillons ont été exposés à un film de Rayon-X.
Analyse de la croissance tumorale Pour déterminer la taille de la tumeur, la longueur (L : la dimension la plus longue) et l'épaisseur (W : la distance perpendiculaire à la longueur et dans le même plan que la longueur) de chaque tumeur ont été mesurées avec des Verniers tous les 2 ou 3 jours selon la description faite par Tomayko & Reynolds, (1989, Cancer Chemotherapy and Pharmacology 24:148). Les volumes de tumeurs (V) ont été calculés en utilisant la formule V = L x W2/2, selon la description de Osborne et de Overjera.
Dans certaines expériences, les personnes réalisant soit les injections d'ADN, soit les mesures sur les tumeurs n'ont pas été informées de l'origine des solutions employées pour chaque animal. Dans ces cas, les résultats ont été groupés après décodage de l'information à la fin de chaque expérience.
RESULTATS
Les gènes sont exprimés lorsqu'ils sont injectés dans des tumeurs d'origine humaine
Tout d'abord, l'analyse a été faite de l'expression éventuelle des gènes reporteurs, après leur injection dans des tumeurs produites par des souris nude, ces tumeurs étant obtenues à partir de lignées cellulaires d'origine humaine. Les tumeurs produites par des injections sous-cutanées de cellules HeLa fortement tumorigènes, ont en outre subi une injection avec différentes préparations de plasmides contenant les gènes reporteurs. Les plasmides contenant le gène lacZ, sous le contrôle transcriptionnel de la séquence (LTR) du Virus de Sarcome de Rous (RSV), ou sous le contrôle du promoteur de la β-actine, ou de la région régulatrice amont (URR) du HPV18 ont été utilisés. Un plasmide contenant le gène CAT, sous le contrôle de la séquence LTR du RSV a également été utilisé. Dix jours après l'injection des cellules HeLa, des tumeurs (approximativement 0,5 mm3) ont été injectées avec 200 μg de chaque plasmide, et resectionnées trois jours plus tard.
L'expression efficace des gènes lacZ et CAT a été observée dans les tumeurs ayant subi l'injection comme le montrent les figures 14 et 15. Une activité CAT significative a été observée uniquement lorsque le plasmide contenant ce gène, sous le contrôle de la séquence LTR du RSV, a été utilisé (Figure 14A). L'injection dans plusieurs tumeurs, de différents plasmides contenant le gène lacZ ou l'injection d'un tampon, a conduit à l'obtention d'un bruit de fond correspondant à celui observé lors de l'expression du gène CAT comme le montre la figure 14B. La détection histochimique de l'activité β-galactosidase a révélé que la séquence LTR du RSV et le promoteur de la β-actine étaient capables de diriger de façon significative l'expression du gène lacZ et a confirmé l'expression spécifique du gène injecté (Figure 15, comparaison des échantillons A, B et C). Il est important de noter que dans le cas antérieur, l'activité β-galactosidase était localisée principalement dans le cytoplasme conformément à ce que l'on pouvait attendre (Figures 15 A et D). Lorsqu'une construction similaire contenant le gène lacZ, contrôlée par le promoteur de la β-actine mais contenant un signal de localisation nucléaire (NLS) dans la séquence codante de la β-galactosidase était utilisée, l'activité était principalement détectée dans le noyau comme le montre la Figure 15C, E et F. Non seulement l'expression a été détectée lorsque les constructions contenant le gène lacZ étaient utilisées mais l'activité a été localisée de façon différentielle (voir les Figures 15 échantillons A et D comparées avec les échantillons C, E et F). Ces résultats permettent la conclusion selon laquelle les gènes reporteurs sont efficacement exprimés lorsqu'ils sont injectés dans des tumeurs produites par des lignées cellulaires d'origine humaine dans des souris nude.
Conditions affectant l'expression des gènes injectés Pour observer les conditions affectant l'expression des gènes injectés, des expériences ont été réalisées sur une certaine durée et l'efficacité de différentes méthodes d'administration de l'ADN dans les tumeurs a été analysée.
Le protocole suivant a été utilisé pour rechercher si l'expression observée des gènes injectés variait sur différentes périodes de temps. Douze souris ont été injectées avec des cellules HeLa puis on a laissé les tumeurs se former et ensuite 200 μg de plasmide RSV-CAT ont été injectés dans chaque tumeur. Les animaux ont été sacrifiés 1 , 2, 4 et 8 jours après l'injection du plasmide et l'activité CAT a été testée pour chaque tumeur. La figure 16 montre au fil du temps, l'émergence de l'activité CAT dans chaque groupe de trois animaux, montrant une activité maximum deux jours après l'injection d'ADN (Figure 16B); après 8 jours, une activité encore considérable était observée (Figure 16D).
Le niveau d'expression obtenu a été comparé en injectant les préparations d'ADN obtenues selon différentes méthodes. L'injection directe a été comparée à l'administration d'ADN par l'intermédiaire de liposomes. Les animaux ont été injectés avec des cellules humaines selon ce qui a été décrit précédemment et lorsque les tumeurs ont été formées, des quantités égales d'ADN ont été injectées soit directement, soit sous la forme de particules de liposomes ou de précipités de phosphate de calcium. Trois jours plus tard, les tumeurs ont été resectionnées et l'activité CAT a été testée dans des extraits bruts.
Des efficacités comparables de l'expression ont été obtenues après transfert de gènes par l'intermédiaire de liposomes ou directement dans les tumeurs.humaines
Des quantités égales (200 μg) de plasmides pRSV-CAT exprimant CAT ont été soit non traités soit utilisés pour préparer des liposomes et des précipités de phosphate de calcium puis ultérieurement injectés dans les tumeurs.
A : ADN injecté seul, L : préparation de liposomes, P : précipités de phosphate de calcium.
Des niveaux comparables d'activité ont été observés selon que les injections avaient été faites directement ou au moyen de liposomes, alors que les injections faites avec les précipités de phosphate de calcium, ont conduit à des niveaux seulement légèrement supérieurs au bruit de fond.
L'injection du gène de régulation E2 réduit la croissance des tumeurs induites par les cellules humaines exprimant les oncogènes viraux E6 et E7
Les observations rapportées précédemment suggèrent l'utilisation potentielle de plasmides exprimant E2 pour réduire la croissance tumorale de lignées cellulaires humaines exprimant les oncogènes E6 et E7 de HPV. Cette possibilité a été explorée en injectant des préparations d'ADN de différents plasmides exprimant E2, pour réprimer la transcription des oncogènes de HPV et par conséquent pour réduire la croissance de tumeurs dans des souris nude. Des jeunes souris (âgées de 4 à 8 semaines) dépourvues de thymus (Swiss nu/nu) ont été inoculées par voie sous-cutanée avec un million de cellules HeLa (dérivées d'un adénocarcinome du col) ; ces souris ont été réparties au hasard dans différents groupes et soumises à différents protocoles. Les tumeurs (trois animaux par groupe) ont été injectées avec différentes quantités de plasmides ou avec un tampon seul, à différents intervalles.
Dans le premier groupe d'expériences, la croissance des tumeurs injectées avec 200 μg de plasmide contenant le gène CAT sous le contrôle transcriptionnel de la séquence LTR du RSV (pRSV-CAT), a été comparée à la croissance des tumeurs injectées avec la même quantité de plasmide exprimant le gène E2 (pC59). Comme le montre la figure 17A, les tumeurs injectées avec pC59 (exprimant E2) présentent une croissance plus faible que celles injectées avec pRSV-CAT.
Dans la seconde série d'expériences, les tumeurs des animaux de chaque groupe ont été injectées soit avec le gène E2 sauvage (pC59) soit avec un plasmide exprimant un mutant E2 (pC9). Dans ce cas, la séquence d'un linker de terminaison de traduction (TTL) a été insérée dans le gène E2, de façon à obtenir une protéine E2 tronquée et non fonctionnelle (Spalholz et al., 1985, Cell 42:183). Comme le montre la figure 17B, les tumeurs injectées avec le gène E2 mutant avaient une croissance plus importante que celles injectées avec le gène E2 de type sauvage. Dans cette expérience, la fréquence des injections a été augmentée de telle sorte que les animaux ont reçu un total de 7 injections pendant l'expérience. Il est important de mentionner que ces séries d'expériences ont été conduites en double-aveugle. Finalement, une expérience similaire a été conduite avec des animaux d'un groupe injecté avec un tampon seul, les animaux d'un second groupe injectés avec la forme mutante de E2 et les animaux d'un troisième groupe injectés avec le plasmide contenant E2 mais sous le contrôle du promoteur du cytomegalovirus (pCGE2) et exprimant des niveaux élevés de la protéine E2 (Ustav et Stendlund, 1991 , EMBO J. 10, 449-457). Comme le montre la Figure 17C, bien que les animaux aient reçu seulement deux injections pendant la O 98/32861 P
durée totale de l'expérience, la croissance tumorale a été significativement réduite chez les animaux ayant subi une injection avec le plasmide exprimant de hauts niveaux de protéine E2. Cette dernière expérience a aussi été réalisée en double-aveugle (voir Matériel et méthodes). Dans certaines de ces expériences, l'expression de E2 dans les tumeurs a été confirmée en utilisant un anticorps polyclonal.
En conclusion, il était clair à partir de ces expériences que l'injection de préparations d'ADN obtenues à partir de plasmides exprimant E2, conduisait à une croissance réduite des tumeurs des cellules HeLa, connues pour exprimer les oncogènes E6 et E7 de HPV18.
DISCUSSION
Comitie on l'a mentionné précédemment, les oncogènes E6 et E7 sont capables d'immortaliser des cellules primaires humaines. La majorité des lignées cellulaires dérivées de tumeurs de la région génitale contient et exprime ces oncoprotéines virales. Leur expression continue est responsable du phenotype d'immortalisation et de transformation observé.
Des ARNs antisens spécifiques de E6 et E7 sont capables d'altérer les propriétés de croissance de plusieurs lignées cellulaires exprimant les oncogènes E6 et E7 de HPV18.
L'infection des cellules HeLa, de même que l'infection d'autres lignées cellulaires d'origine du col avec les virus SV40 recombinants, contenant le gène E2, a conduit à l'inhibition de leur croissance, due à un arrêt de la transition entre les phases G1 et S du cycle cellulaire, avec une augmentation concomitante de leurs niveaux de protéines p53 et Rb (protéine du rétinoblastome). L'introduction d'un gène E2 est apparemment toxique pour les cellules HeLa (Thierry et Yaniv (1987), EMBO J. 6:3391).
Ces résultats suggèrent que l'expression continue d'oncogènes E6 et E7 est incompatible avec l'expression permanente de E2. Ce fait peut facilement être relié aux nombreuses observations suggérant un avantage sélectif de la perte de E1 et E2 pendant la progression tumorale. En effet, il a été montré par les inventeurs que les tumeurs testées positives pour HPV18 avaient perdu cette région. Dans le cas des tumeurs comprenant des séquences HPV16, seulement la moitié retenait la région E1/E2.
Les expériences effectuées ont montré que les gènes injectés sont efficacement exprimés dans des tumeurs d'origine humaine. En comparant à d'autres méthodes employées actuellement pour traiter d'autres types de néoplasies humaines, telles que les méthodes recourant à la préparation de liposomes, des niveaux d'activités similaires ont été observés. Bien que l'expression des gènes injectés soit plus faible, après comparaison avec des méthodes fondées sur une approche recourant à une administration virale, il apparaît qu'il pourrait être très utile de procéder à des traitements de certaines tumeurs malignes humaines à l'aide des moyens décrits précédemment, essentiellement du fait de leur simplicité et de leur efficacité.
En utilisant ces observations, un plasmide exprimant le gène viral E2 a été injecté dans des tumeurs d'origine humaine, produites dans des souris nude, pour réduire leur croissance. Des cellules HeLa ont été inoculées à des animaux nude et les tumeurs ont été injectées avec différentes préparations de plasmides exprimant E2. L'inhibition de la croissance tumorale a été observée lorsque les plasmides exprimant le gène E2 intact étaient utilisés. L'inhibition de l'expression de E6 et E7 a été montrée lorsque E2 était exprimé de façon concomitante. L'introduction du gène E2 conduit à l'arrêt de la croissance des cellules qui expriment en continu ces oncogènes.
L'expression continue de E2 semblé incompatible avec l'expression concomitante d'oncogènes viraux. Puisque l'expression de E6 et E7 est nécessaire au maintien du phenotype immortalisé des cellules tumorales, E2 pourrait être très utile pour la mise en oeuvre d'une thérapie génique des tumeurs du col de l'utérus qui affectent un grand nombre de femmes dans beaucoup de pays.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique comprenant une protéine E2 de papillomavirus ou une séquence de nucléotides codant pour une protéine E2 de papillomavirus, et un véhicule physioiogiquement acceptable.
2. Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la protéine E2 est une protéine dont la séquence est modifiée par rapport à celle de la protéine E2 sauvage, ou en ce que la séquence de nucléotides est modifiée par rapport à la séquence sauvage, de telle sorte que la protéine E2 résultante a substantiellement l'activité biologique de la protéine E2 sauvage sur l'accumulation de la protéine cellulaire p53.
3. Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la protéine E2 est une protéine dont la séquence est modifiée par rapport à celle de la protéine E2 sauvage, ou en ce que la séquence de nucléotides est modifiée par rapport à la séquence sauvage, de telle sorte que la protéine E2 résultante participe à une activité biologique d'apoptose de cellules infectées par un virus de type papillomavirus.
4. Composition selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que la séquence de la protéine est modifiée dans la région responsable de la réplication virale, ou la séquence de nucléotides est modifiée dans la région responsable de la réplication virale, de telle sorte que la protéine E2 résultante est défective pour la réplication virale de papillomavirus.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le papillomavirus est un papillomavirus humain, notamment un papillomavirus du groupe comprenant HPV16, HPV18, HPV31 et HPV33.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le papillomavirus est un papillomavirus bovin, notamment un papillomavirus BPV-1.
7. Séquence de nucléotides codant pour une protéine E2 de papillomavirus HPV18, caractérisée en ce que le résidu situé à la position 2 dans la séquence de la protéine E2 est un résidu acide glutamique.
8. Séquence de nucléotides codant pour une protéine E2 de papillomavirus humain, ladite protéine comprenant une séquence d'acides aminés dont au moins un résidu choisi parmi les suivants a été modifié, notamment par substitution : - le résidu praline en position 288,
- le résidu glycine en position 294,
- le résidu asparagine en position 297,
- le résidu lysine en position 300,
- le résidu cystéine en position 301 , - le résidu leucine en position 302,
- le résidu arginine en position 305.
9. Vecteur comprenant une séquence de nucléotides selon l'une des revendications 7 ou 8.
10. Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe des vecteurs formé par un plasmide, un virus, et un vecteur synthétique.
11. Vecteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que le virus est un adénovirus.
12. Plasmide pCGE2.18VoNCO déposé à la C.N.C.M. le 29 janvier 1997 sous le numéro 1-1839.
13. Protéine E2 de papillomavirus HPV18, caractérisée en ce que le résidu situé à la position 2 dans la séquence de la protéine est un résidu acide glutamique.
14. Protéine E2 de papillomavirus, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'acides aminés dont au moins un résidu choisi parmi les suivants a été modifié, notamment par substitution :
- le résidu praline en position 288,
- le résidu glycine en position 294,
- le résidu asparagine en position 297, - le résidu lysine en position 300,
- le résidu cystéine en position 301 , O 98/32861 PC
- le résidu leucine en position 302,
- le résidu arginine en position 305.
15. Composition pharmaceutique comprenant une séquence de nucléotides selon l'une des revendications 7 ou 8, ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 , ou une protéine selon l'une des revendications 13 ou 14, ou une protéine E2TR et un véhicule physioiogiquement acceptable.
16. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 15 pour l'utilisation comme médicament.
17. Vecteur contenant une séquence de nucléotides codant pour la protéine E2 de papillomavirus modifiée ou sauvage, ou vecteur selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 , ou plasmide selon la revendication 12, ou plasmide pCGE2TR déposé à la C.N.C.M. le 29 .janvier 1997 sous le numéro I- 1838 pour l'utilisation comme médicament.
18. Séquence de nucléotides codant pour une protéine E2 de papillomavirus, modifiée ou sauvage, ou séquence de nucléotides codant pour une protéine E2TR ou séquence selon l'une des revendications 7 ou 8, pour l'utilisation comme médicament.
19. Protéine E2 de papillomavirus, modifiée ou sauvage, protéine E2TR ou protéine selon l'une des revendications 13 ou 14 pour l'utilisation comme médicament.
20. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 15 pour le traitement d'une infection à papillomavirus, et notamment pour le traitement d'un cancer associé à une infection à papillomavirus.
21. Vecteur contenant une séquence de nucléotides codant pour la protéine E2 de papillomavirus modifiée ou sauvage, ou vecteur selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 , ou plasmide selon la revendication 12, ou plasmide pCGE2TR déposé à la C.N.C.M. le 29 janvier 1997 sous le numéro .I- 1838 pour le traitement d'une infection à papillomavirus, et notamment pour le traitement d'un cancer associé à une infection à papillomavirus. O 98/32861
22. Séquence de nucléotides codant pour une protéine E2 de papillomavirus, modifiée ou sauvage, ou séquence de nucléotides codant pour une protéine E2TR ou séquence selon l'une des revendications 7 ou 8, pour le traitement d'une infection à papillomavirus, et notamment pour le traitement d'un cancer associé à une infection à papillomavirus.
23. Protéine E2 de papillomavirus, modifiée ou sauvage, ou protéine E2TR ou protéine selon l'une des revendications 13 ou 14 pour le traitement d'une infection à papillomavirus, et notamment pour le traitement d'un cancer associé à une infection à papillomavirus.
24. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 15 pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation thérapeutique contre une infection à papillomavirus, et notamment contre un cancer associé à une infection à papillomavirus.
25. Utilisation d'un vecteur contenant une séquence de nucléotides codant pour la protéine E2 de papillomavirus modifiée ou sauvage, ou d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 , ou du plasmide sefon la revendication 12, ou du plasmide pCGE2TR déposé à la C.N.C.M. le 29 janvier 1997 sous le numéro 1-1838 pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation thérapeutique contre une infection à papillomavirus, et notamment contre un cancer associé à une infection à papillomavirus.
26. Utilisation d'une séquence de nucléotides codant pour une protéine E2 de papillomavirus, modifiée ou sauvage, ou d'une séquence de nucléotides codant pour une protéine E2TR ou d'une séquence selon l'une des revendications 7 ou 8, pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation thérapeutique contre une infection à papillomavirus, et notamment contre un cancer associé à une infection à papillomavirus.
27. Utilisation d'une protéine E2 de papillomavirus, modifiée ou sauvage, ou d'une protéine E2TR ou d'une protéine selon l'une des revendications 13 ou 14 pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation thérapeutique contre une infection à papillomavirus, et notamment contre un cancer associé à une infection à papillomavirus.
28. Cellules transformées par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 , ou par le plasmide selon la revendication 12.
29. Procédé de criblage de candidats dérivés de la protéine E2 capables d'induire une apoptose dans des cellules contenant la partie du génome d'un virus de type papillomavirus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) transfecter une cellule hôte en culture contenant la partie du génome d'un papillomavirus humain ou bovin correspondant aux gènes E6 et E7, cette partie du génome comprenant également la région du promoteur P105 , placée en amont des séquences codant pour les gènes E6 et E7, avec un vecteur, en particulier un adénovirus recombinant ou un plasmide, contenant une séquence nucléique codant pour un candidat dérivé de la protéine E2 à tester placée sous le contrôle d'éléments permettant son expression dans la cellule hôte, et b) mesurer le degré de mortalité cellulaire dans la culture des cellules hôtes transfectées.
30. Utilisation d'une protéine E2 de papillomavirus, modifiée ou sauvage, ou d'une séquence de nucléotide codant pour une telle protéine, pour la préparation d'une composition destinée à induire l'apoptose cellulaire.
31. Utilisation d'une protéine E2 de papillomavirus, modifiée ou sauvage, ou d'une séquence de nucléotide codant pour une telle protéine, pour la préparation d'une composition destinée à augmenter l'activité de la protéine p53.
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