EP0951554A1 - Proteine de fusion comportant tout ou partie de la proteine pp65 de cmv humain, utile notamment dans la preparation d'un vaccin - Google Patents
Proteine de fusion comportant tout ou partie de la proteine pp65 de cmv humain, utile notamment dans la preparation d'un vaccinInfo
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- EP0951554A1 EP0951554A1 EP97951322A EP97951322A EP0951554A1 EP 0951554 A1 EP0951554 A1 EP 0951554A1 EP 97951322 A EP97951322 A EP 97951322A EP 97951322 A EP97951322 A EP 97951322A EP 0951554 A1 EP0951554 A1 EP 0951554A1
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Definitions
- CMV human cytomegalovirus
- Herpes virus family a 230 kbp double-stranded DNA enveloped virus
- CMV is the largest of the Herpes virus family. Like the other members of this virus family, it is present in latent form and can undergo repeated reactivations leading to viremia several years after the initial infection.
- CMV is widespread throughout the world and if it is well tolerated by healthy individuals, it is associated with pathologies with often dramatic consequences for the fetus and the immunocompromised (transplant recipients, AIDS, cancer) (for review see (1 )).
- CMV infection is associated with graft rejection in transplant recipients (allografts of marrow, kidney, heart, liver). It represents one of the most dramatic opportunistic infections in HIV + individuals who, despite chemotherapy with antivirals, are victims of often fatal pathologies. For all these reasons, CMV infection raises an important public health problem.
- the subject of the present invention is a fusion protein, characterized in that it comprises at least a part of the pp65 protein of the cytomegalovirus (or CMV), or of a protein having at least 80% homology. with the pp65 protein, in combination with at least one second peptide fragment derived from CMV.
- CMV cytomegalovirus
- the pp65 protein is a CMV matrix protein, which is internalized in cells and delivered to the cytosol at the same time as the virion, very soon after infection.
- the peptide fragments entering the chimeric protein preferably have a length greater than or equal to 9 amino acids, and cover different HLA class I restrictions.
- the Applicant has shown that a peptide of the pp65 protein of a length greater than 9 amino acids can be internalized by a presenting cell and presented by a MHC class I molecule to a specific TCD8 + line.
- the advantage of constructs including these peptides and the IE 1 protein in vaccination would be linked to the use of antigens capable of entering the presenting cell by a unique endocytosis pathway and of inducing both a TCD4 + response and TCD8 +.
- the second peptide fragment present in the fusion protein consists of the protein IE 1 or one of its epitopes, or by a protein having at least 80% homology.
- the polypeptide sequence of IE 1 a major regulatory protein of the viral cycle is very conserved between the different viral strains.
- the introduction of this protein into a unitary vaccine would allow the induction of memory auxiliary TCD4 + cells capable of cooperating in the induction of anti-pp65 cytotoxic TCD8 + cells and in the production of antibodies against the envelope protein gB, subject greater variability ("cross help").
- cross help the majority of neutralizing antibodies present in the serum of infected individuals are directed against the viral envelope glycoprotein gB (UL55).
- the gB protein has been considered one of the most important viral antigens for vaccination.
- Many protocols using recombinant viruses (Adenovirus, Vaccine, Canaripox ). have been developed (5, 6, 7).
- e4 or exon 4 which comprises 406 amino acids, is a fragment of the protein IE 1, which contains 491 amino acids.
- the fusion protein comprises a) the fragment delimited by the amino acid residues 162 and 175 of the sequence of the protein IE 1 or, b) a peptide fragment having at least 90 % homology with said fragment mentioned in a).
- epitopes are suitable for implementing the invention, such as those mentioned by Davignon et al (8).
- the fusion protein according to the invention may also contain a peptide fragment derived from a microorganism different from CMV, and / or any polypeptide fragment allowing its subsequent purification of the type of “Tag” sequences; these sequences placed upstream or downstream of the protein of interest make it possible to purify or mark it; by way of example, mention may be made of the use of ⁇ -galactosidase, of histidine hexamers (His ⁇ , etc.), or of GST.
- the fusion protein comprises a peptide fragment derived from an enzyme with glutathione-S-transferase (or GST) activity.
- the GST protein will in particular facilitate the purification of the fusion protein from a complex culture medium.
- the subject of the invention is therefore a chimeric protein GST-IE l-pp65 of 145 kDa, which can be produced in E. coli. Its immunogenicity has been demonstrated in vitro, by the proliferation of cell clones
- TCD4 + specific for IE 1 TCD4 + specific for IE 1 and by the lysis of target cells incubated in presence of a TCD8 + line specific for pp65.
- the Applicant has shown that the protein in soluble form and its fragments make it possible to stimulate the TCD4 + and TCD8 + compartments of the specific cellular response in vitro. These results make this protein a reagent of choice for the design of a unitary vaccine.
- the subject of the invention is a pharmaceutical composition, characterized in that it contains a) at least part of the pp65 protein of CMV, or of a protein having at least 80% homology with the pp65 protein, in association with at least one second peptide fragment derived from CMV, or b) nucleotide sequences coding for the peptides mentioned in a).
- the subject of the invention is a process for the preparation of a fusion protein, characterized in that the following steps are carried out: a) a first DNA sequence coding for at least part is linked of the pp65 protein of CMV with a second DNA sequence coding for another polypeptide or protein derived from CMV so as to obtain a recombinant DNA sequence coding for a fusion protein, b) the recombinant DNA sequence is introduced in a construct containing the elements necessary for its expression, and possibly sequences coding for other polypeptides, c) the construct obtained in b) is introduced into host cells which are then cultured under conditions in which the system d the expression of the fusion DNA is functional, so that the fusion protein is produced in the host cell, d) the fusion protein produced in the cell is recovered host and we purify it.
- Figure 2 The protein GST-IEl-pp65 induces a specific proliferation of the clone TCD4 + BeA3G9 in the presence of PBMC.
- the line TCD8 + ⁇ Val>> generated with the peptide N9V of pp65 was used in a release test of 51 Cr in the presence of U373MG cells either incubated with the peptide N9V, or with the peptide I9Y, or infected with CMV Towne ( 5 months) for 4 hours then incubation with the peptide I9Y.
- the percentage of specific lysis was calculated as indicated in Materials and Methods.
- the cells of the ⁇ Val>> line were used in a 51 Cr release test in the presence of autologous B / EBV lymphocytes pretreated or not with chloroquine (Materials and Methods) and the peptides and proteins as indicated.
- Figure 6 Analysis of the production of the His6-IEl-pp65 protein by insect cells infected with a recombinant Baculovirus.
- Sf9 insect cells were infected with recombinant Baclovirus IEl-pp65 for 48 h.
- the cell lysates (1) were centrifuged, the supernatant (2) passed through a Ni-Agarose column and the eluates recovered (3,4).
- the different fractions were subjected to a
- FIG. 7 Induction of anti-IEl TCD4 + effectors in a CMV + donor with the BVSM / IEl-pp65 formulation. CMMC + donor PBMCs were stimulated with the protein
- IE l-pp65 either soluble, or formulated with BVSM (AG form) or in the absence of antigen (Mock).
- the cells are incubated in the presence of protein solutions containing the IE1 protein or not (col).
- the proliferation of anti-IE 1 specific T cells was determined by measuring the incorporation of tritiated thymidine.
- the region of the viral genome containing the sequence coding for the protein IEI located in the C-Hind III fragment of the strain CMV-Towne was cloned in a plasmid named pRL103.
- This plasmid was used to transfect cells of the U373 MG astrocyte line (designated A2 (gift from R. Lafemina, Merck Sharp and Dohme, WestPoint, PA, USA). These cells were cultured in RPMI-SVF (RPMI 1640 Glutamax, 1 mM sodium pyruvate, 200 u / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 10% calf serum decomplemented) until confluence.
- RPMI-SVF RPMI 1640 Glutamax, 1 mM sodium pyruvate, 200 u / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 10% calf serum decomplemented
- the viral particles were collected by centrifugation (31000g, 4 ° C, 90 min) and the capsids were degraded by treatment with proteinase K (BOEHRINGER) (150 ⁇ g) in 250 ⁇ l of lysis buffer (10 mM TrisCl pH 7.5, ImM EDTA, 2% sarcosyl) for 30 min at room temperature.
- the viral DNA was extracted with phenol / chloroform and then precipitated with absolute ethanol.
- the DNA pellet was dried and dissolved in 20 ⁇ l of water.
- a fragment corresponding to the pp65 cDNA was obtained by PCR on an aliquot of 2 ⁇ l of viral DNA using the primers C3: CCCGGGGAGATCTCGGATATCCGTACTGGGTCCC and C4: GAATTCGGATCCTCAACCTCGGTGCTrmGG complementary to the 5 ′ and 3 ′ ends of the pp65 gene and containing respectively EcoRI and BamHI sites.
- the PCR product (1670 bp) was purified on an S400-HR column (PHARMACIA).
- the degree of purity of the protein was checked on SDS-PAGE followed by staining with Coomassie blue.
- the antigenicity of GST-IE1- pp65 was analyzed in western blot using goat antibodies directed against GST (PHARMACIA, dilution 1/400), and mouse antibodies directed against IE I (supernatant E 13 diluted 1 / 10, gift from Dr. Mazeron, H al Lariboisière, Paris) and pp65 (NEA 20 diluted 1/250, DUPONT). Secondary antibodies coupled to the peroxidase RAG / PO, RAM / PO (Nordic) were used at 1/500. Proteins have been measured according to the Bradford method with the "Bio-Rad Protein Assay" kit (BIORAD). The recombinant protein GST was produced and purified.
- I-Lymphoproliferation test Cells (2 x 10 4 ) of a CD4 + T clone (BeA3G9) restricted by HLA DR8 and specific for an epitope located at position 162-175 of the protein IE I were incubated in 100 ⁇ l of RPMI medium.
- 1 ⁇ Ci of [ 3 H] -thymidine (AMERSHAM) per well was added to the culture.
- the stimulator cells (10 x 10 6 cells / ml) were incubated in RPMI in the presence of 30 ⁇ g of a peptide presented by HLA-A2 (peptide N9V, Figure 5, Neosystem, France) for 1 hour at 37 ° C. and were irradiated (2500 rads). The effector cells were restimulated under the same conditions every 7 days. The cytotoxicity of the “Val” line thus obtained was tested on day 14. The CD8 + phenotype of the line was determined by cytofluorimetry with the mouse monoclonal antibody OKT8.
- III-Cytotoxicity test III- 1 In the context of CMV infection
- U373MG astrocytoma cells of HLA-A2 haplotype (2 x 10 5 ) at 80% confluence in RPMI / SVF were infected with CMV-Towne virus at a rate of 5 pfu / cell in 6-well plates (10 cm2). After 4 hours of infection, the cells were marked with 100 ⁇ Ci of Na 2 51 Cr0 4 (ICN, France) and washed in RPMI.
- the autologous effector cells of the TCD8 + line were incubated with 10 4 target cells in RPMI / 10% FCS (500 ⁇ l) for 4 hours at 37 ° C. Varying amounts of effector cells were added to the targets to obtain different effector / target ratios.
- the cells were preincubated overnight at 37 ° C. with either the N9V peptide or a peptide recognized by HLA-B35 (peptide 19 Y, FIG. 4, Neosystem, France) at a final concentration of 100 nM.
- the spontaneous release rate was determined by measuring the radioactivity released by target cells maintained in culture for 4 hours. The percentage of specific lysis was calculated using the following formula ([measured radioactivity - spontaneous release / total radioactivity - spontaneous release] x 100). Radioactivity is measured on a ⁇ Cobra counter (PACKARD). Each measurement is performed in duplicate.
- the cells (50,000 / ml) were labeled with 100 ⁇ Ci of Na 2 51 Cr0 4 and washed in RPMI.
- the effector cells of the TCD8 + line were added under the same conditions as for the astrocytoma cells.
- FIG. 2 shows the results of the proliferation of the anti-IE l clone BeA3G9 in the presence of PBMCs incubated with the purified recombinant antigen GST-IE l-pp65.
- the clone proliferated specifically since in the presence of the GST protein no incorporation of thymidine was observed.
- This proliferation was of the same order as that obtained with the fusion protein GST-e4 (80% C-terminal of IE 1) or GST-IE 1.
- These results show that the protein GST-IE 1- pp65 has been properly primed by the HLA-DR8 antigen presenting cells so as to present an IE I epitope recognized by the cells of the clone BeA3G9.
- II-TCD8 + anti-pp65 cells of the “Val” line lyse targets incubated in the presence of the protein GST-IE1-pp65 directed by trypsin
- FIG. 6 shows the SDS-PAGE analysis of the HiscIE l-pp65 protein produced by cells infected with recombinant Baculoviruses and purified by Ni chromatography. These results show that the protein represents an important part of the total cellular proteins and is obtained with a high degree of purity after chromatography.
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Abstract
Protéine de fusion, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une partie de la protéine pp65 du cytomégalovirus (ou CMV), ou d'une protéine présentant au moins 80 % d'homologie avec la protéine pp65, en association avec au moins un second fragment peptidique dérivé du CMV. L'invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une telle protéine, ou une composition pharmaceutique les contenant. Elle se rapporte aussi à l'utilisation à titre de médicament et à un procédé de préparation de la protéine.
Description
PROTEINE DE FUSION COMPORTANT TOUT OU PARTIE DE LA PROTEINE PP65 DE CMV HUMAIN, UTILE NOTAMMENT DANS LA PREPARATION D'UN VACCIN.
La présente invention se rapporte à de nouvelles associations de protéines, et à leur utilisation comme médicament. Plus particulièrement, elle concerne la mise au point de vaccins contre le CMV.
Le cytomegalovirus humain (CMV), un virus enveloppé à ADN double brin de 230 kpb est le plus gros de la famille des Herpès virus. Comme les autres membres de cette famille de virus, il est présent sous forme latente et peut subir des réactivations répétées conduisant à une virémie plusieurs années après l'infection initiale. Le CMV est largement répandu à travers le monde et s'il est bien toléré par les individus sains, il est associé à des pathologies aux conséquences souvent dramatiques pour le foetus et les immunodéprimés (greffés, sida, cancer) (pour revue voir ( 1)).
A la suite d'une primo-infection en cours de grossesse, la transmission verticale du virus au foetus par voie trans placentaire est source de complications chez le nouveau né. Ce sont en particulier des troubles sensoriels (vision, audition) et des retards mentaux importants survenant au cours des premières années de la vie. L'infection par le CMV est associée au rejet du greffon chez les transplantés (allogreffes de moelle, de rein, de coeur, de foie). Elle représente une des infections opportunistes les plus dramatiques chez les individus HIV+ qui, malgré une chimiothérapie par des antiviraux, sont victimes de pathologies souvent mortelles. Pour toutes ces raisons l'infection par le CMV soulève un problème de santé publique important.
L'utilisation d'antiviraux non spécifiques comme Ganciclovir* et Foscarnet* pendant la greffe pose des problèmes de cytotoxicité. Les effets secondaires imposent souvent la diminution des doses ou l'arrêt du traitement, ce qui expose au risque de reprise des troubles associés
à l'infection virale. L'injection intraveineuse à haute dose d'immunoglobulines a permis dans certains cas une réduction de la fréquence des pneumopathies et des rejets. Des tentatives d'immunothérapie adoptive ont été développées en injectant à des receveurs de moelle des clones de cellules T cytotoxiques spécifiques de CMV (2).
La mise au point d'un vaccin sous unitaire aurait une importance capitale pour les futures mères. En effet il a été montré que l'immunité maternelle acquise avant la conception pouvait protéger les nouveau- nés contre les méfaits d'une infection congénitale (3). Le développement d'une immunité anti CMV chez les transplantés serait un facteur important contre le développement des maladies associées à l'infection. Des essais de vaccination avec du virus atténué de la souche de Towne ont été effectués et sont en cours chez des volontaires séronégatifs et des greffés séronégatifs ayant reçu un greffon de donneurs séropositifs (4). Dans la majorité des cas, la vaccination a réduit la sévérité des maladies associées à la réplication du virus. Dans la mesure où l'activité pathogène de tels vaccins n'a pas été définitivement exclue, et où l'utilisation de vaccins vivants peut provoquer des réactions secondaires graves chez des individus immunodéficients, de nouvelles approches utilisant des protéines virales recombinantes en présence d'adjuvants sont en cours de développement.
L'importance pour la santé publique du développement d'un vaccin anti CMV n'est plus à démontrer devant le problème posé par l'infection congénitale jusque là sous estimée par la communauté médicale.
Les économies réalisées en élaborant une politique de prévention des maladies liées à l'infection par le CMV chez les individus à risque seraient substantielles. En effet, des estimations du coût associé à la vaccination d'un individu et à sa prise en charge (analyses sérologiques,
vaccin, traitement d'effets secondaires mineurs) montrent qu'il serait environ 50 fois inférieur à celui des soins apportés à un nouveau né victime d'une infection congénitale. L'infection à CMV est observée chez les 2/3 des transplantés rénaux et à une fréquence élevée chez les autres transplantés. Si l'on considère que l'infection est associée à des complications chez environ 1 /3 d'entre eux, le coût annuel ajouté à celui de la transplantation est considérable. Malgré l'impact de drogues comme le Ganciclovir*, l'injection de gammaglobulines ou le transfert de clones T anti CMV sur la maladie, la prévention de l'infection primaire et de la réactivation chez ces patients doit être une priorité. Les bénéfices de l'immunisation sont évidents autant sur le plan clinique qu'économique.
La Demanderesse a maintenant trouvé que l'association de la protéine pp65 du CMV, ou de l'un de ses fragments, avec un autre haptène ou antigène du CMV permet de potentialiser la réaction immunogène vis-à-vis de ce virus, notamment en stimulant les compartiments T CD4+ et CD8+ contre le virus.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet une protéine de fusion, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une partie de la protéine pp65 du cytomegalovirus (ou CMV), ou d'une protéine présentant au moins 80% d'homologie avec la protéine pp65, en association avec au moins un second fragment peptidique dérivé du CMV.
La protéine pp65 est une protéine de matrice du CMV, qui est internalisée dans les cellules et délivrée dans le cytosol en même temps que le virion, très peu de temps après l'infection.
Elle peut être utilisée entière ou sous forme d'un ou plusieurs fragments ; les fragments peptidiques entrant dans la protéine chimère ont de préférence une longueur supérieure ou égale à 9 acides aminés, et couvrent différentes restrictions HLA de classe I. La Demanderesse a montré qu'un peptide de la protéine pp65 d'une longueur supérieure à
9 acides aminés peut être internalisé par une cellule présentatrice et présenté par une molécule du CMH de classe I à une lignée TCD8+ spécifique. L'intérêt de constructions incluant ces peptides et la protéine IE 1 en vaccination serait lié à l'utilisation d'antigènes capables d'entrer dans la cellule présentatrice par une voie unique d'endocytose et d'induire à la fois une réponse TCD4+ et TCD8+.
De préférence le second fragment peptidique présent dans la protéine de fusion est constitué par la protéine IE 1 ou l'un de ses épitopes, ou par une protéine présentant au moins 80% d'homologie. En effet, la séquence polypeptidique de IE 1 , protéine de régulation majeure du cycle viral est très conservée entre les différentes souches virales. L'introduction de cette protéine dans un vaccin sous unitaire permettrait l'induction de cellules TCD4+ auxiliaires mémoires capables de coopérer à l'induction de cellules TCD8+ cytotoxiques anti-pp65 et à la production d'anticorps contre la protéine d'enveloppe gB, soumise à une plus grande variabilité ("cross help"). En effet, il a été montré que la majorité des anticorps neutralisants présents dans le sérum des individus infectés étaient dirigés contre la glycoprotéine d'enveloppe virale gB (UL55). Pour cette raison, la protéine gB a été considérée comme un des antigènes viraux les plus importants pour la vaccination. De nombreux protocoles utilisant des virus recombinants (Adénovirus, Vaccine, Canaripox...) ont été développés ( 5, 6, 7).
Les problèmes posés par ces vaccins sont liés soit au caractère pathogène des virus vivants, soit au fait qu'ils induisent des taux d'anticorps trop faibles. Une alternative est l'utilisation d'antigènes recombinants associés à des adjuvants. L'association de la glycoprotéine gB à la protéine chimère IE l-pp65 dans une structure permettant le maintien de sa conformation, indispensable à son immunogénicité, offrirait un moyen de stimuler les compartiments T et B de la réponse anti virale. De plus, l'activation des cellules TCD4+ anti- IE 1 , médiée par la reconnaissance des peptides IE 1 associés aux
molécules du CMH de classe II, pourrait permettre de contrôler la réplication du virus dans les cellules voisines soumises à l'effet de HFNγ et du TNFα (8). Ces hypothèses ne sont bien entendu aucunement destinées à limiter la portée de l'invention. On peut notamment utiliser le fragment e4 de la protéine IE 1 du
CMV, ou un fragment peptidique présentant au moins 80% d'homologie avec ledit fragment e4. e4 ou exon 4, qui comprend 406 acides aminés est un fragment de la protéine IE 1 , qui comporte 491 acides aminés.
Selon un autre aspect avantageux de l'invention, la protéine de fusion comprend a) le fragment délimité par les résidus d'amino-acides 162 et 175 de la séquence de la protéine IE 1 ou, b) un fragment peptidique présentant au moins 90% d'homologie avec ledit fragment mentionné en a).
D'autres épitopes conviennent à la mise en oeuvre de l'invention, tels ceux mentionnés par Davignon et al (8).
La protéine de fusion selon l'invention peut contenir en outre un fragment peptidique dérivé d'un microorganisme différent du CMV, et/ou tout fragment polypeptidique permettant sa purification ultérieure du type des séquences "Tag"; ces séquences placées en amont ou en aval de la protéine d'intérêt permettent de la purifier ou de la marquer ; on peut citer à titre d'exemples l'utilisation de β- galactosidase, d'hexamères d'Histidine (Hisβ...) , ou de GST. Selon un mode de réalisation préféré, la protéine de fusion comporte un fragment peptidique dérivé d'une enzyme à activité glutathion-S-transférase (ou GST).
La protéine GST facilitera notamment la purification de la protéine de fusion à partir d'un milieu de culture complexe.
L'invention a ainsi pour objet une protéine chimère GST-IE l-pp65 de 145 kDa, qui peut être produite dans E. coli. Son immunogénicité a été mise en évidence in vitro, par la prolifération de clones de cellules
TCD4+ spécifiques de IE 1 et par la lyse de cellules cibles incubées en
présence d'une lignée TCD8+ spécifiques de pp65. La Demanderesse a montré que la protéine sous forme soluble et ses fragments, permettaient de stimuler in vitro les compartiments TCD4+ et TCD8+ de la réponse cellulaire spécifique. Ces résultats font de cette protéine un réactif de choix pour la conception d'un vaccin sous unitaire.
Les séquences nucléotidiques codant pour une protéine de fusion telle que définie ci-dessus sont également comprises dans l'invention.
Les protéines de fusion et les séquences nucléotidiques correspondantes sont utiles à titre de médicament, et peuvent plus particulièrement être utilisées pour la préparation d'un vaccin destiné à prévenir les infections provoquées par le CMV. Un tel vaccin sera susceptible d'induire une réponse efficace contre une infection primaire avant que le virus ne se soit répliqué activement.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient a) au moins une partie de la protéine pp65 du CMV, ou d'une protéine présentant au moins 80% d'homologie avec la protéine pp65, en association avec au moins un second fragment peptidique dérivé du CMV, ou b) des séquences nucléotidiques codant pour les peptides mentionnés en a).
Outre les excipients de formulation connus de l'homme du métier, tels que stabilisants, conservateurs, anti-oxydants, et adaptés à la voie d'administration, en particulier la voie injectable, les compositions pourront contenir des adjuvants d'immunité. Elles peuvent également contenir d'autres épitopes du CMV. Enfin elles peuvent être formulées avec des systèmes améliorant le transport et la présentation des molécules aux cellules cibles.
Les protéines pourront être sous forme de plusieurs protéines distinctes dans la composition ; elles pourront également être sous
forme d'une protéine de fusion telle que décrite précédemment ; il en est de même pour les séquences nucléotidiques correspondantes.
La composition peut contenir en outre d'autres épitopes en particulier des antigènes d'enveloppe du CMV, comme la protéine gB. Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'une protéine de fusion, caractérisé en ce qu'on procède aux étapes suivantes : a) on lie une première séquence d'ADN codant pour au moins une partie de la protéine pp65 du CMV avec une seconde séquence d'ADN codant pour un autre polypeptide ou protéine dérivé du CMV de manière à obtenir une séquence d'ADN recombinant codant pour une protéine de fusion, b) on introduit la séquence d'ADN recombinant dans une construction contenant les éléments nécessaires à son expression, et éventuellement des séquences codant pour d'autres polypeptides, c) on introduit la construction obtenue en b) dans des cellules hôtes qui sont ensuite mises en culture dans des conditions dans lesquelles le système d'expression de l'ADN de fusion est fonctionnel, de manière à ce que la protéine de fusion soit produite dans la cellule hôte, d) on récupère la protéine de fusion produite dans la cellule hôte et on la purifie.
La cellule hôte contenant une séquence nucléotidique codant pour une protéine de fusion, susceptible d'être obtenue dans le procédé décrit ci-dessus est également comprise dans l'invention. Cette cellule hôte peut notamment être choisie dans le groupe constitué par les bactéries, les virus, les levures et les cellules d'eucaryotes, notamment d'eucaryotes supérieurs.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Dans ces exemples on se référera aux figures qui suivent :
Figure 1 : Analyse en Western Blot de l'expression de la protéine GST-IEl-pp65.
Des lysats de bactéries transformées avec les plasmides pGEX
2TK ( 1) et pGEX 2TK/IEl-pp65 (2, 2') ont été soumis à une SDS-PAGE puis à Western Blot révélé par des anticorps anti-GST (A), anti-IE l (B) et anti-pp65 (C). Des marqueurs de masses moléculaires (M) précolorés
(Gibco) ont été utilisés.
Figure 2 : La protéine GST-IEl-pp65 induit une prolifération spécifique du clone TCD4+ BeA3G9 en présence de PBMC.
Les cellules du clone BeA3G9 ont été incubées en présence de PBMC irradiées de phénotype HLA-DR8 et d'antigène GST ou GST-IE 1- pp65. La prolifération des cellules du clone a été déterminée par l'incorporation de [3H]-thymidine, mesurée en cpm.
Figure 3 : La lignée TCD8+ anti-pp65 «Val>> lyse des cellules d'astrocytome U373MG infectées par CMV Towne.
La lignée TCD8+ <<Val>> générée avec le peptide N9V de pp65 a été utilisée dans un test de relargage de 51Cr en présence de cellules U373MG soit incubées avec le peptide N9V, soit avec le peptide I9Y, soit infectées par CMV Towne (5moi) pendant 4h puis incubation avec le peptide I9Y. Le pourcentage de lyse spécifique a été calculé comme indiqué dans Matériels et Méthodes.
Figure 4 : Représentation schématique des protéines recombinantes produites dans E. coli.
Les séquences peptidiques correspondant aux épitopes présentés par HLA-DR8, HLA-A2 et HLA-B35 et leurs localisations sont représentées.
Figure 5 : La lignée TCD8+ anti-pp65 «Val» lyse des cellules B/EBV incubées en présence de la protéine GST-IEl-pp65 prétraitée à la trypsine.
Les cellules de la lignée <<Val>> ont été utilisées dans un test de relargage de 51Cr en présence de lymphocytes B/ EBV autologues prétraités ou non avec la chloroquine ( Matériels et Méthodes) et les peptides et protéines comme indiqué.
Figure 6 : Analyse de la production de la protéine His6-IEl-pp65 par des cellules d'insectes infectées par un Baculovirus recombinant.
Des cellules d'insectes Sf9 ont été infectées avec des Baculovirus recombinants IEl-pp65 pendant 48 h. Les lysats cellulaires ( 1) ont été centrifugés, le surnageant (2) passé sur une colonne Ni-Agarose et les éluats récupérés (3,4). Les différentes fractions ont été soumises à un
SDS-PAGE et colorées au bleu de Coomassie.
Figure 7 : Induction d'effecteurs TCD4+ anti-IEl chez un donneur CMV+ avec la formulation BVSM/IEl-pp65. Des PBMC d'un donneur CMV+ ont été stimulées avec la protéine
IE l-pp65 (AG) soit soluble, soit formulée avec des BVSM (AG form) ou en absence d'antigène (Mock). A J35, les cellules sont incubées en présence de solutions protéiques contenant la protéine IE1 ou non (col). La prolifération des cellules T spécifiques anti-IE l a été déterminée par la mesure de l'incorporation de thymidine tritiée.
Exemple 1: Production de la protéine de fusion dans des bactéries DH5
Matériels et Méthodes
I-Clonage des ADNc de IE1 et pρ65 dans pGEX 2TK
1-1 Préparation des ADNc IE1 et pp65
1-1-1 ADNc-IEl
La région du génome viral contenant la séquence codant pour la protéine IEI située dans le fragment C-Hind III de la souche CMV-Towne a été clone dans un plasmide nommé pRL103. Ce plasmide a été utilisé pour transfecter des cellules de la lignée astrocytaire U373 MG (désignée A2 (don de R. Lafemina, Merck Sharp and Dohme, WestPoint, PA, USA). Ces cellules ont été cultivées dans du RPMI-SVF (RPMI 1640 Glutamax, 1 mM pyruvate de sodium, 200 u/ml pénicilline, 100 μg/ml streptomycine, 10% sérum de veau décomplémenté) jusqu'à confluence. L'ARN total d'une culture de 3 jours a été préparé selon la technique de Chomzynski et Sacchi ( 14). L'ADNc de IEI a été généré par RT-PCR (Kit Super Script, GIBCO BRL) sur un aliquot de-5 μg d'ARN total selon les indications du fournisseur avec les amorces C l : GATCCGGATCCATGGAGTCCTCTGCCAAGAGA et C2 :
CCCGGGGAATTCCTGGTCAGCCTTGCTTCTAGT. Des sites BamHl et EcoRl ont été introduits dans les amorces C l (extrémité 5' de IE I) et C2 (extrémité 3' de IE I) respectivement. Le produit de PCR ainsi obtenu ( 1480 pb) a été purifié sur colonne S400-HR (PHARMACIA) .
1-1-2 ADNc-pp65 Les cellules d'une lignée fibroblastique humaine (MRC5, Mérieux) cultivées en BME supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (BME/SVF) ont été infectées par le CMV (souche Towne) . Dès l'apparition d'un effet cytopathique, le surnageant contenant le virus a été récupéré et inactivé par la chaleur (60°C, 30 mn). Les particules virales ont été récoltées par centrifugation (3 1000g, 4°C, 90 mn) et les capsides ont été dégradées par un traitement avec la protéinase K
(BOEHRINGER) ( 150 μg) dans 250 μl de tampon de lyse ( 10 mM TrisCl pH 7.5, ImM EDTA, 2% sarcosyl) pendant 30 mn à température ambiante. L'ADN viral a été extrait au phénol/chloroforme puis précipité par l'éthanol absolu. Le culot d'ADN a été séché et solubilisé dans 20 μl d'eau. Un fragment correspondant à l'ADNc de pp65 a été obtenu par PCR sur un aliquot de 2 μl d'ADN viral en utilisant les amorces C3: CCCGGGGAATTCATGGCATCCGTACTGGGTCCC et C4: GAATTCGGATCCTCAACCTCGGTGCTrmGG complémentaires des extrémités 5' et 3' du gène de pp65 et contenant respectivement les sites EcoRI et BamHI. Le produit de PCR ( 1670 pb) a été purifié sur colonne S400-HR (PHARMACIA).
1-2 Construction du plasmide pGEX 2TK-IEl-pp65
1-2-1 Purification des fragments IEI et pp65 digérés par Bam Hl et Eco RI
Les fragments d'ADNc de IEI et pp65 ont été préalablement clones dans les sites BamH I et EcoRI d'un plasmide pUC 18. Des bactéries compétentes DH5α (GIBCO) ont été tranformées par 5 à 10 ng de ligation IEI/pUC 18 ou pp65/pUC 18. Les plasmides recombinants ont été digérés par BamHI et EcoRl. Les produits de digestion ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose et extraits du gel avec le kit "JetSorb/ 150" (GENOMED).
1-2-2 Purification du fragment IEl-pp65
Une quantité identique des fragments IE I et pp65 digérés par
BamHI et EcoRl a été incubée en présence de T4 DNA Ligase. Le mélange réactionnel a été soumis à une digestion par BamHI. Les fragments obtenus pp65-pp65 (3340 pb) , IEl-pp65 (3150 pb) IE 1-IE 1 (2960 pb) ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Le
fragment IE l-pp65 a été extrait du gel avec le kit "JetSorb/ 150" (GENOMED).
1-2-3 Clonage de IEl-pp65 dans pGEX 2TK Le fragment IE l-pp65 a été inséré dans le site BamH I du plasmide pGEX 2TK (PHARMACIA). Les clones de bactéries recombinantes ont été conservés à -80°C dans du PBS, 3.5% DMSO jusqu'à leur utilisation pour la purification de la protéine.
II-Production de la protéine de fusion GST-IEl-pp65
Un aliquot de bactéries congelées à -80°C a été remis en suspension dans 5ml de milieu LB contenant de l'ampicilline (Ap, 50 μg/ml) et mis en culture pendant 8 heures à 37°C. La culture, diluée dans 45 ml du même milieu a été poursuivie pendant 15 heures, reprise dans 500 ml de LB+Ap jusqu'à une densité optique (λ=600 nm) de 1. La production de GST-IEl-pp65 a été induite par l'ajout d'IPTG ( 100 μM) dans le milieu de culture. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation après 3 heures de culture à température ambiante et conservées à - 80°C. La lyse des bactéries et la purification de la protéine recombinante par chromatographie d'affinité sur une colonne "Sepharose 4-B" greffée avec du Glutathion (PHARMACIA) ont été effectués selon les indications du fournisseur.
Le degré de pureté de la protéine a été contrôlé en SDS-PAGE suivi d'une coloration au bleu de Coomassie. L'antigénicité de GST-IE1- pp65 a été analysée en western-blot en utilisant des anticorps de chèvre dirigés contre GST (PHARMACIA, dilution 1 /400) , et des anticorps de souris dirigés contre IE I (surnageant E 13 dilué au 1 / 10, don du Dr.Mazeron, H al Lariboisière, Paris) et pp65 (NEA 20 dilué au 1 /250, DUPONT) . Des anticorps secondaires couplés à la péroxydase RAG/PO, RAM/ PO (Nordic) ont été utilisés au 1 /500. Les protéines ont été dosées
selon la méthode de Bradford avec le kit "Bio-Rad Protein Assay" (BIORAD). La protéine recombinante GST a été produite et purifiée.
Résultats et discussion
Purification de GST-IEl-pp65
Nous avons obtenu en moyenne 1 mg de protéine GST-IE l-pp65 purifiée par chromatographie-glutathion à partir d'une culture de 500 ml de DH5 /pGEX 2TK-IE l-pp65. L'analyse en électrophorèse en conditions dénaturantes suivie d'un western blot avec les anticorps anti-GST, anti-IEl et anti-pp65 effectuée à partir de lysats de bactéries recombinantes est montrée sur la figure 1. Un produit correspondant à une masse théorique de 145 kDa était révélé par les trois anticorps dans les échantillons préparés à partir des bactéries recombinantes. Les bandes de masses moléculaires inférieures reconnues par les anticorps sont des produits de dégradation de la protéine. Ces résultats sont en accord avec la production dans ces bactéries d'une protéine résultant de la fusion GST-IE l-pp65 (Figure 4). La protéolyse de la protéine par la trypsine a été analysée en SDS-PAGE et montre la disparition de la bande de migration correspondant à la protéine entière corrélée avec l'apparition d'une bande de faible poids moléculaire correspondant à la génération de peptides. Parmi ces fragments, et d'après l'analyse de la séquence de la protéine figure un peptide de 15 aa contenant le peptide N9V (voir "Matériels et Méthodes" et Figure 4).
Exemple 2
Matériels et méthodes
I-Test de lymphoprolifération
Des cellules (2 x 104) d'un clone T CD4+ (BeA3G9) restreint par HLA DR8 et spécifique d'un épitope situé à la position 162- 175 de la protéine IE I ont été incubées dans 100 μ l de millieu RPMI-SH avec des cellules présentatrices d'antigène (lx 105 PBMC) irradiées (2500 rads) de même phénotype HLA-DR. Ces cellules ont été incubées avec une gamme de dilution de la protéine recombinante. Au jour 3, 1 μCi de [3H]-thymidine (AMERSHAM) par puits a été ajouté à la culture. Quinze heures plus tard, l'ADN cellulaire a été recueilli sur des filtres en fibre de verre (PACKARD) et l'incorporation de [3H]-thymidine mesurée dans un compteur β à gaz Matrix 9600 (PACKARD). Chaque mesure a été réalisée en triple.
II-Gênération d'une lignée T CD8+ spécifique d'un peptide de la protéine pp65 Des leucocytes du sang périphérique de donneurs séropositifs pour le CMV (2 x 106/ml) d'haplotype HLA-A2 ont été mis en culture dans des plaques 24 puits en RPMI-SH (2 ml). 100 U/ml de "Lymphocult-T-LF" (BIOTEST, France) ont été ajoutés à J+3. A J+7, les cellules vivantes ont été récupérées dans l'anneau d'un gradient de ficoll. Ces cellules (5 x 105/puits) ont été incubées en présence de cellules stimulatrices autologues ( 1.5 x 106/puits) en RPMI-SH (2 ml) supplémenté par 10% de «Lymphocult». Les cellules stimulatrices ( 10 x 106 cellules/ml) ont été incubées dans du RPMI en présence de 30 μg d'un peptide présenté par HLA-A2 (peptide N9V, Figure 5, Néosystem, France) pendant 1 heure à 37°C et ont été irradiées (2500 rads) . Les cellules effectrices ont été restimulées dans les mêmes conditions tous les 7 jours. La cytotoxicité de la lignée «Val» ainsi obtenue a été testée au jour 14. Le phénotype CD8+ de la lignée a été déterminé par cytofluorimétrie avec l'anticorps monoclonal de souris OKT8.
III-Test de cytotoxicité
III- 1 Dans le contexte de l'infection par le CMV
Des cellules d'astrocytome U373MG d'haplotype HLA-A2 (2 x 105) à 80% de confluence en RPMI/SVF ont été infectées par le virus CMV- Towne à raison de 5pfu/cellule dans des plaques à 6 puits ( 10 cm2). Après 4h d'infection les cellules ont été marquées avec 100 μCi de Na2 51Cr04 (ICN, France) et lavées en RPMI. Les cellules effectrices autologues de la lignée TCD8+ ont été incubées avec 104 cellules cibles dans du RPMI/ 10% SVF (500 μl) pendant 4 heures à 37°C. Des quantités variables de cellules effectrices ont été ajoutées aux cibles de façon à obtenir différents rapports effecteur/ cible. Alternativement, les cellules ont été préincubées toute la nuit à 37°C avec soit le peptide N9V soit un peptide reconnu par HLA-B35 (peptide 19 Y, Figure 4, Néosystem, France) à une concentration finale de lOOnM. Le taux de relarguage spontané a été déterminé par la mesure de la radioactivité libérée par des cellules cibles maintenues en culture pendant 4 heures. Le pourcentage de lyse spécifique a été calculé en utilisant la formule suivante ([radioactivité mesurée - relarguage spontané / radioactivité totale - relarguage spontané] x 100). La radioactivité est mesurée sur un compteur γ Cobra (PACKARD) . Chaque mesure est rélalisée en double.
III-2 En présence de la protéine GST-IEI-pp65 native ou digérée par la trypsine, avec ou sans chloroquine La protéine purifiée GST-IE l-pp65 a été désalée par ultrafiltration centrifuge avec des unités de filtration "Centricon 10" (FILTRON), lyophilisée et reprise dans l'eau avant d'être utilisée sous cette forme ou digérée par la trypsine (TCPK, SIGMA, 200 ng pour 900 μg de protéine) dans un volume de 100 μl de tampon Tris [ 100 mM tris-HC l pH 8.0] pendant 2 heures à 370° C. Des aliquots prélevés avant et après digestion ont été analysés en SDS-PAGE.
Des lymphocytes B-EBV autologues ( 1 x 106) préalablement lavés et irradiés ( 104 rads) ont été préincubés soit avec les antigènes ( 1 μM) pendant 15 heures à 37°C en milieu RPMI-SVF (0.5 ml) en plaque 48 puits soit dans du RPMI-SVF 5% / chloroquine 80 μM (SIGMA) pendant 30 mn avant l'ajout des antigènes. Alternativement, les cellules ont été préincubées toute la nuit à 37° C avec soit le peptide N9V soit le peptide I9Y à une concentration finale de 10 nM. Au terme de cette incubation, les cellules (50000/ ml) ont été marquées avec 100 μCi de Na2 51Cr04 et lavées en RPMI. Les cellules effectrices de la lignée TCD8+ ont été ajoutées dans les mêmes conditions que pour les cellules d'astrocytomes.
Résultats et dicusssion
I-Lymphoprolifération du clone T CD4+ BeA3G9 en présence de GSTIEl-pp65
La figure 2 montre les résultats de la prolifération du clone BeA3G9 anti-IE l en présence de PBMC incubées avec l'antigène recombinant purifié GST-IE l-pp65. Le clone proliférait spécifiquement puisque en présence de la protéine GST aucune incorporation de thymidine n'avait été observée. Cette prolifération était du même ordre que celle obtenue avec la protéine de fusion GST-e4 (80% C-terminal d'IE l) ou GST-IE 1. Ces résultats montrent que la protéine GST-IE 1- pp65 a été correctement apprêtée par les cellules présentatrices d'antigène HLA-DR8 de manière à présenter un épitope de IE I reconnu par les cellules du clone BeA3G9.
II-Les cellules TCD8+ anti-pp65 de la lignée «Val» lysent des cibles incubées en présence de la protéine GST-IEl-pp65 dirigée par la trypsine
II- 1 La lignée «Val» reconnaît un peptide naturel généré après infection par le CMV
La figure 3 montre les résultats d'un test de cytotoxicité effectué dans le contexte de l'infection de cellules d'astrocytome U373MG de phénotype HLA-A2. Une lyse spécifique des cibles a été observée en présence du peptide N9V (HLA-A2) alors qu'elle est pratiquement nulle avec le peptide I9Y (HLA-B35), ce qui montre que les molécules du CMH de classe I de phénotype A2 à la surface des cellules U373MG sont chargées spécifiquement avec le peptide N9V. Lorsque ces cellules ont été infectées par le CMV, une lyse spécifique d'un niveau équivalent à celui obtenu avec le peptide N9V était observée. Ceci suggère que la protéine pp65 apportée par l'inoculum a été délivrée dans le cytosol et apprêtée de telle sorte qu'un peptide identique ou de structure proche de N9V a été généré et présenté spécifiquement aux cellules de la lignée «Val».
II-2 Des lymphocytes B/EBV incubés en présence de la protéine GST-IEl-pp65 digérée par la trypsine sont lysês par la lignée anti- pp65 «Val» : effet du traitement des cellules à la chloroquine
Les résultats d'une expérience dans laquelle la protéine GST-IE 1- pp65 ne sensibilisait pas les cibles à la lyse par la lignée «Val» contrairement à un échantillon de cette même fraction prédigéré par la trypsine sont montré sur la figure 5. Lorsque les cellules étaient prétraitées à la chloroquine et incubées en présence de la protéine digérée par la trypsine les cibles n'étaient pas lysées. Une digestion de la protéine par la trypsine génère un peptide de 15 aa, N 15K, contenant le peptide N9V (Figure 4). La mise en évidence d'une lyse des cibles en
présence de cet hydrolysat suggère que le peptide N 15K est présenté à la lignée «Val». De plus, le prétraitement des cellules à la chloroquine montre que ce peptide a été internalisé par les cellules et apprêté dans un compartiment de type endo-lysosome sensible à une augmentation de pH.
Exemple 3
Matériels et méthodes
Clonage de IEl-pp65 dans le vecteur d'expression "Baculovirus" pAcHLT-B. Cotransfection de cellules d'insectes Sf9 avec le plasmide recombinant et l'ADN de Baculovirus:
Le fragment IE l-pp65 purifié (exemple 1 , § 1-2-2) a été inséré au site BglII du plasmide pAcHLT-B (Pharmingen) contenant une séquence codant pour un peptide de 6 résidus histidine (Hisβ) . Les plasmides recombinants ont été caractérisés et purifiés. Des cellules d'insectes Sf9 (ATCC CRL171 1) ont été incubées pendant 4h à 37° C en présence d'un mélange contenant 3 μg de plasmide et 0,5 μg d'ADN viral selon le protocole proposé par Pharmingen. Après 5 jours de culture la production de protéine a été analysée par "Western blot" avec les anticorps monoclonaux anti-IE l (E 13, Argene) et anti-pp65 (NEA20, Biosoft) .
Production et purification de la protéine His6IEl-pp65
Une cinétique de production de la protéine dans des cellules Sf9 infectées a été réalisée de 0 à 5 jours et analysée en "Western blot". Des lysats de cellules infectées (Tampon de lyse: Tris 10 mM, NaCl 130mM, Triton X- 100, NaF lOmM, NaPi lOmM, NaPPi lOmM, pH 7,5, Pharmingen) ont été déposés sur une colonne d'affinité Ni-NTA (Qiagen) et la protéine éluée avec le tampon (NaP04 50mM, NaCl 300mM,
Glycérol 10%, Imidazol 0,5M, Pharmingen). Le degré de pureté de la protéine a été contrôlé en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie.
Résultats
Purification de la protéine His6IEl-pp65
La figure 6 montre l'analyse en SDS-PAGE de la protéine HiscIE l- pp65 produite par les cellules infectées avec des Baculovirus recombinants et purifiée par chromatographie Ni. Ces résultats montrent que la protéine représente une part importante des protéines cellulaires totales et est obtenue avec un degré de pureté élevé après chromatographie.
Exemple 4
Matériels et méthodes
Induction de lignées TCD4+ in vitro à partir de PBMC d'un donneur CMV+, incubées en présence de la protéine chimère IEl-pp65 soluble ou formulée dans des BVSM (Biovecteurs supramoléculaires) .
Les formulations IE l-pp65 ont été obtenues par coincubation pendant 1 heure à température ambiante, de la solution protéique (200nM en PBS au 2,5 mM Na2HP04/NaH2Pθ4, 62 mM NaCl, 0,65 mM KC1 + 10% glycérol) et du BVSM de type L à ( lmg/ml en eau distillée) dans un rapport massique protéine/ biovecteur de 7,7 et protéine/ noyau de 10. Le BVSM de type L, décrit dans WO 94/20078, comporte une double couche externe constituée par du DPPC/cholestérol. Des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) d'un donneur CMV + d'haplotype DR3, 13 ("Val") ont été
incubées dans des plaques 24 puits (Falcon) à raison de 4xl06 cellules dans 2 ml de milieu RPMI/ 10% sérum humain (SH). L'antigène IE1- pp65 soluble ou formulé a été ajouté et l'incubation poursuivie pendant 3 jours à 37°C. A J3 on remplace 1 ml de milieu de culture par 1 ml de milieu neuf supplémenté par 10% de Lymphocult ( 100 u/ml, Biotest, France). Au 7° jour les cellules effectrices sont stimulées par incubation avec des PBMC autologues (à raison de 1.5xl06 PBMC pour 0.5xl06 cellules) préalablement incubées ( 15h) en présence soit de l'antigène soluble soit de l'antigène formulé soit en l'absence de protéine. A J35 on réalise un test de prolifération dans les conditions décrites dans l'exemple 2, section Matériels et méthodes, "Test de lymphoprolifération", avec les modifications suivantes:
2xl04 cellules effectrices sont incubées en présence de lxlO5 PBMC allogéniques et d'une solution de protéines provenant du lysat de cellules d'astrocytomes U373MG transfectées par les gènes IE (appelées A2) et contenant l'antigène IE I . Un lysat de cellules non transfectées (appelé A0) a été utilisé comme contrôle négatif.
Résultats Induction d'effecteurs TCD4+ anti-IEl chez un donneur CMV+, à partir de formulations IEl-pp65.
La figure 7 montre la prolifération d'effecteurs anti-IE l générés à partir de PBMC du donneur "Val" dans le seul cas où les effecteurs ont été induits en présence de l'antigène formulé. Ce résultat souligne l'effet potentialisateur de la formulation comme cela avait été montré précédemment par Prieur et al (9). Ces résultats suggèrent que dans des conditions où la fréquence de précurseurs TCD4+ anti-IE l est faible comme c'est probablement le cas chez le donneur "Val" au moment du prélèvement la formulation permet de stimuler et d'expandre des cellules qui ne le sont pas lorsque l'antigène soluble est utilisé. L'intérêt de l'utilisation de ces formulations pour l'induction d'effecteurs T in
vitro est évident pour la mise au point de protocoles de transfert chez des greffés de moelle par exemple.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 2
GST
•GST-IE1-pp65
Figure 3
DN9V ϋCMV4rι D I9Y
Figure 5
-*-l9Y
-0-N9V
-•-N9V Chloroquine
→- GST- IE1-pp 65 digérée
-o— GST- IE1-pp65 digérée Chloroquine
Figure 7
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Claims
1. Protéine de fusion, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une partie de la protéine pp65 du cytomegalovirus (ou CMV), ou d'une protéine présentant au moins 80% d'homologie avec la protéine pp65, en association avec au moins un second fragment peptidique dérivé du CMV.
2. Protéine de fusion selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le second fragment peptidique est constitué par la protéine IE I ou l'un de ses épitopes, ou par une protéine présentant au moins 80% d'homologie.
3. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le second fragment peptidique est le fragment e4 de la protéine IE I du CMV, ou un fragment peptidique présentant au moins 80% d'homologie avec ledit fragment e4.
4. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le second fragment peptidique est : a) le fragment délimité par les résidus d'amino-acides 162 et 175 de la séquence de la protéine IEI ou, b) un fragment peptidique présentant au moins 90% d'homologie avec ledit fragment mentionné en a).
5. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre un fragment peptidique dérivé d'un microorganisme différent du CMV.
6. Protéine de fusion selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comporte un fragment peptidique dérivé d'une enzyme à activité glutathion-S-transférase (ou GST) ou toute autre séquence Tag".
7. Séquence nucléotidique codant pour une protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 6.
8. A titre de médicament, protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 6, ou séquence nuclétotidique selon la revendication 7.
9. Utilisation d'une protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 6 ou d'une séquence nucléotidique selon la revendication 7 pour la préparation d'un vaccin destiné à prévenir les infections provoquées par le CMV.
10. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient a) au moins une partie de la protéine pp65 du CMV, ou d'une protéine présentant au moins 80% d'homologie avec la protéine pp65, en association avec au moins un second fragment peptidique dérivé du CMV, ou b) des séquences nucléotidiques codant pour les peptides mentionnés en a).
1 1. Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle contient une protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 6 ou une séquence nucléotidique selon la revendication 7, avec des excipients pharmaceutiquement acceptables.
12. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce qu'elle contient en outre un antigène d'enveloppe du CMV.
13. Procédé de préparation d'une protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on procède aux étapes suivantes : a) on lie une première séquence d'ADN codant pour au moins une partie de la protéine pp65 du CMV avec une seconde séquence d'ADN codant pour un autre polypeptide dérivé du CMV de manière à obtenir une séquence d'ADN recombinant codant pour une protéine de fusion, b) on introduit la séquence d'ADN recombinant dans une construction contenant les éléments nécessaires à son expression, et éventuellement des séquences codant pour d'autres polypeptides, notamment "Tag", c) on introduit la construction obtenue en b) dans des cellules hôtes qui sont ensuite mises en culture dans des conditions dans lesquelles le système d'expression de l'ADN de fusion est fonctionnel, de manière à ce que la protéine de fusion soit produite dans la cellule hôte, d) on récupère la protéine de fusion produite dans la cellule hôte et on la purifie.
14. Cellule hôte contenant une séquence nucléotidique codant pour une protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 6, susceptible d'être obtenue dans le procédé selon la revendication 13.
15. Cellule hôte selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué par les bactéries, les virus, les levures et les cellules d'eucaryotes.
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