JP2001506494A

JP2001506494A - 特にワクチンの製造に用いることができるヒトｃｍｖのタンパク質ｐｐ６５の総てまたは一部を含んでなる融合タンパク質

Info

Publication number: JP2001506494A
Application number: JP52631998A
Authority: JP
Inventors: エリック、プリウール; ジャクリーヌ、リュール; ジャン−リュック、ダビニョン; クリスチャン、ダブラーンシュ
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2001-05-22
Also published as: WO1998026074A1; EP0951554A1; AU5489298A; FR2757169A1; FR2757169B1; US20020156251A1; US6605467B2; CA2275340A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、サイトメガロウイルス（またはＣＭＶ）のｐｐ６５タンパク質、またはｐｐ６５タンパク質と少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質、の少なくとも一部を、ＣＭＶ由来の少なくとも１種類の第二のペプチド断片と組合わせて含んでなることを特徴とする融合タンパク質に関する。本発明は、このようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそれらを含む医薬組成物にも関する。本発明は、医薬としてのその使用、およびタンパク質の製造法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】特にワクチンの製造に用いることができるヒトＣＭＶのタンパク質ＰＰ６５の総てまたは一部を含んでなる融合タンパク質本発明は、タンパク質の新規な組合わせ、およびそれらの医薬としての使用に関する。さらに詳しくは、ＣＭＶに対するワクチンの製造に関する。２３０ｋｂｐのＤＮＡ二本鎖を有するエンベロープ付きウイルスであるヒトサイトメガロウイルス(cytomegalovirus)（ＣＭＶ）は、ヘルペスウイルス科の最大のウイルスである。この科の他のウイルスと同様に、これは潜伏型で存在し、最初の感染後数年はウイルス血症を生じる反復再活性化段階を行うことができる。ＣＭＶは世界中に広く分布しており、健康人は十分な耐性を有するが、胎児や免疫が低下した患者（移植、ＡＩＤＳおよび癌患者）については、これは病変と結び付いて、激烈な結果を生じることが多いのである（総説(1)参照）。妊娠時の一次感染の後、ウイルスの胎盤を介する胎児への垂直伝播により、新生児に合併症が起こる。これらは、特に、感覚器障害（視力、聴覚）および小児の生涯の最初の数年間に起こる著しい精神的退化である。ＣＭＶによる感染は、臓器移植患者（骨髄、腎臓、心臓、肝臓の異種移植）における移植片の拒絶反応を伴う。これは、ＨＩＶ陽性患者での最も激烈な日和見感染の一つであり、抗ウイルス性の化学療法を行っても、（致命的な）疾患の犠牲になることが多い。これら総ての理由は、ＣＭＶ感染症は、実質的な公衆衛生の問題を引起していることを意味している。ガンシクロビル(Ganciclovir)^*やホスカネット(Foscarnet)^*のような非特異的抗ウイルス薬を臓器移植の際に使用すると、細胞毒性の問題を生じる。二次的な効果により、用量を減少しまたは治療を停止する必要があり、従ってウイルス感染症の再発を伴う障害の危険を引起すことが多い。場合によっては、高投与量の免疫グロブリンを静脈内注射により、呼吸障害(pneumopathies)や拒絶反応の頻度が減少した。養子免疫療法の試みは、ＣＭＶに特異的な細胞毒性を有するＴ細胞のクローンの骨髄を患者に注射することによって発展してきた(2)。サブユニットワクチンの開発は、将来の母体にとって極めて重要である。実際に、受胎前に獲得された母体免疫は先天的感染症の損傷から新生児を保護することができることが示されている(3)。移植患者における抗ＣＭＶ免疫の開発は、感染症に関連した疾患の発生に対する重要な因子である。Towne株の弱毒化ウイルスによるワクチン接種試験が行われ、またセロネガティブ志願者およびセロポジティブドナーから移植片を受けとったセロネガティブ移植患者について行われている(4)。大半の場合に、ワクチン接種により、ウイルス複製を伴う疾患の重篤度が減少した。このようなワクチンの病理活性は明確に除外されていないので、また生ワクチンが免疫不全患者に重篤な副作用を引起すことがある場合には、アジュバントの存在下での組換えウイルスタンパク質を用いる新規な方法が開発されている。ＣＭＶに対するワクチン開発の公衆衛生上の重要性は、先天性感染症によって提起された問題の結果として最早説明を要しないが、これはこれまでは医学界によって軽視されてきたものである。危険患者におけるＣＭＶ感染症に関連した疾患の予防法を開発することによってなされる節約は、かなりなものとなる。実際に、個人のワクチン接種およびその取得に関する費用の概算は、先天性感染症に罹っている新生児に提供される看護の約５０分の１となることを示している。ＣＭＶ感染症は、腎臓移植患者の２／３に見られ、他の移植患者では一層多い。この感染症は患者の約１／３に合併症を伴うことを考慮すれば、移植費用の他の年間費用はかなりの金額である。ガンシクロビル＊のような薬剤、γ−グロブリンの注射、または抗ＣＭＶＴ−クローンの輸送の疾患に対する効果にも拘らず、一次感染症の予防およびこれらの患者における再活性化を優先すべきである。免疫感作の利点は、臨床的にも、経済的レベルでも明白である。本発明者は、ＣＭＶタンパク質ｐｐ６５またはその断片と、ＣＭＶの他のハプテンまたは抗原との組合わせが、特にウイルスに対してコンパートメントＴＣＤ４＋およびＣＤ８＋を刺激することによって、このウイルスに対する免疫反応の効果を高めることができることを見出だした。これが、本発明が、サイトメガロウイルス（またはＣＭＶ）タンパク質ｐｐ６５またはタンパク質ｐｐ６５と少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質の少なくとも一部を、ＣＭＶ由来の少なくとも第二のペプチド断片と組合わせて含んでなることを特徴とする、融合タンパク質に関する理由である。タンパク質ｐｐ６５は、細胞にインターナリゼーションされかつ感染後極めて短時間にビリオンと同時にサイトゾルに送達されるＣＭＶマトリックスタンパク質である。これは、全体または１個以上の断片の形態で用いることができ、キメラタンパク質を構成するペプチド断片は、好ましくは９アミノ酸より大きいかまたはそれに等しい長さを有し、かつ異なるＨＬＡクラスＩ制限をカバーしている。本発明者は、長さが９アミノ酸を上回るタンパク質ｐｐ６５のペプチドを、プレゼンティング細胞(presenting cell)によってインターナリゼーションし、クラスＩＭＨＣ分子によってＣＤ８＋に特異的なＴ系に向けることができることを示した。これらのペプチドとワクチン接種のためのタンパク質ＩＥ１を包含する構築物の重要性は、現れる細胞に独特なエンドサイトーシス経路によって入り、同時にそれを誘導してＴＣＤ４＋およびＴＣＤ８＋反応を起こさせることができる抗原の使用に関連している。融合タンパク質に存在する第二のペプチド断片は、好ましくはタンパク質ＩＥ１またはそのエピトープの一つ、または少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質からなっている。実際に、ウイルスサイクルの主要な調節タンパク質であるＩＥ１のポリペプチド配列は、異なるウイルス株間で高度に保存されている。このタンパク質をサブユニットワクチンに導入することにより、記憶ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が誘導され、これがｐｐ６５に対する細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導およびエンベロープタンパク質ｇＢに対する抗体の産生と共同して、可変性（クロスヘルプ）を大きくすることができる。実際に、感染したヒトの血清に含まれる中和抗体の多くは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質ｇＢ（ＵＬ５５）に向けられていることが示されている。これが、タンパク質ｇＢがワクチン接種に最も重要なウイルス抗原の一つであると考えられる理由である。組換えウイルス（アデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリーポックス(canarypox)）を用いる多くのプロトコールが開発されている(5，6，7)。これらのワクチンによって生じる問題点は、生ウイルスの病原性、またはウイルスの抗体力価が低すぎるという事実に関連している。代替法は、アジュバントと組合わせた組換え抗原の使用である。糖タンパク質ｇＢとキメラタンパク質ＩＥ１−ＰＰ６５とを組合わせて一構造とするにより、その免疫原性に欠くことができない配置を保持することができ、抗ウイルス反応のＴおよびＢコンパートメントを刺激する手段を提供する。更に、認識されているクラスII ＭＨＣ分子と組合わせたＩＥ１ペプチドによって媒介されるＩＥ１に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化により、制御を行うＴＮＦγおよびＴＮＦα(8)の効果を受けている隣接細胞でウイルスが複製される。当然のことながら、これらの家庭は、本発明の範囲を制限しようとするものではない。特に、ＣＭＶタンパク質ＩＥ１の断片ｅ４、またはこの断片ｅ４と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド断片を用いることができる。ｅ４、または４０６個のアミノ酸を含んでなるエキソン４は、４９１個のアミノ酸からなるタンパク質ＩＥ１の断片である。本発明のもう一つの有利な態様によれば、融合タンパク質は、下記a)またはb) を含んでなる。 a) タンパク質ＩＥ１の配列のアミノ酸残基１６２および１７５によって限界設定された断片、または b) 上記a)に記載の断片と少なくとも９０％の相同性を有するペプチド断片。他のエピトープ、例えばDavignon et al．(8)によって報告されているものも本発明を行うのに適当である。本発明による融合タンパク質は、更にＣＭＶ以外の微生物由来のペプチド断片、および／またはＴａｇ型配列から更に精製することができるポリペプチド断片を含むこともでき、目的とするタンパク質の上流または下流に位置するこれらの配列は精製または標識することができ、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ヒスチジン六量体（Ｈｉｓ６）またはＧＳＴを用いることができる。好ましい態様によれば、融合タンパク質はグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（またはＧＳＴ）活性を有する酵素由来のペプチド断片を含んでなる。ＧＳＴタンパク質により、特に複雑な培地から融合タンパク質を精製することが一層容易になる。従って、本発明は、E．coliで製造することができる１４５ｋｄのキメラタンパク質ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５に関する。その免疫原性は、ＩＥ１に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの増殖によって、またｐｐ６５に特異的なＣＤ８＋Ｔ系の存在下でインキュベーションした標的細胞のリーシスによってイン・ビトロで示した。本発明者は、可溶型タンパク質およびその断片が、特異的細胞反応のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔコンパートメントをイン・ビトロで刺激することができることを示した。これらの結果により、このタンパク質がサブユニットワクチンのデザインに選択した試薬となる。上記に定義した融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列も、本発明の範囲内にある。融合タンパク質および相当するヌクレオチド配列は、医薬品として、特にＣＭＶによって引起される感染症を予防するためのワクチンの製造に用いることができる。このようなワクチンは、ウイルスが積極的に複製を行う前に一次感染に対して効率的な反応を誘発するのに適する。もう一つの態様によれば、本発明は、下記a)またはb)を含むことを特徴とする医薬組成物、に関する。 a) ＣＭＶタンパク質ｐｐ６５、またはタンパク質ｐｐ６５と少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質の少なくとも一部を、ＣＭＶ由来の少なくとも１種類の第二のペプチド断片と組合わせたもの、または b) a)に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列。投与経路、特に注射に適する安定剤、防腐剤、酸化防止剤のような当業者に知られている処方物賦形剤の他に、組成物は、免疫アジュバントを含むことができる。それらは、他のＣＭＶエピトープを含むこともできる。最後に、それらは、この分子を標的細胞への輸送および提供を改良する系を用いて処方することができる。タンパク質は、組成物では様々な異なるタンパク質の形態であることができ、それらは上記の融合タンパク質の形態であることもでき、同じことは、相当するヌクレオチド配列にも当てはまる。また、組成物は、他のエピトープ、特にＣＭＶエンベロープ抗原、例えばタンパク質ｇＢを含むことができる。更にもう一つの態様によれば、本発明は、下記工程a)〜d)を行うことを特徴とする、融合タンパク質の製造法に関する。 a) ＣＭＶタンパク質ｐｐ６５の少なくとも一部をコードする第一のＤＮＡ配列を、ＣＭＶ由来のもう一つのポリペプチドまたはタンパク質をコードする第二のＤＮＡ配列と結合させ、融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列を得て、 b) 組換えＤＮＡ配列を、その発現に必要な要素と、適当な場合には、他のポリペプチドをコードする配列を含む構築物に導入し、 c) b)で得た構築物を宿主細胞に導入した後、融合ＤＮＡの発現系が機能的である条件下で培養し、融合タンパク質を宿主細胞中に産生させ、 d) 宿主細胞中に産生された融合タンパク質を回収して、精製する。上記の方法で得ることができる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞も、本発明の範囲内にある。この宿主細胞は、細菌、ウイルス、酵母、および真核細胞、特に高等真核細胞、からなる群から選択することができる。本発明の他の特徴および利点は、下記の諸例から明らかになるであろう。これらの例では、下記の図を参考とする。第１図：タンパク質ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５の発現のウェスタン・ブロット分析。プラスミドｐＧＥＸ２ＴＫ(1)およびｐＧＥＸ２ＴＫ／ＩＥ１−ｐｐ６５( 2，2')で形質転換した細菌の溶解生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した後、ウェスタン・ブロット法を行い、ＧＳＴ(A)、ＩＥ１(B)およびｐｐ６５(C)に対する抗体によって可視化する。予備染色した分子量マーカー(Gibco)を用いた。第２図：タンパク質ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５が誘発するＰＢＭＣの存在下でＣＤ４＋ＴクローンＢｅＡ３Ｇ９の特異的増殖。クローンＢｅＡ３Ｇ９の細胞を、表現型ＨＬＡ−ＤＲＡ８およびＧＳＴまたはＧＳＴ−ＩＥＩ−ｐｐ６５−抗原の放射線照射したＰＢＭＣの存在下でインキュベーションした。クローンの細胞増殖を、ｃｐｍで測定した［３Ｈ］−チミジンの取り込みによって測定した。第３図：ＣＭＶＴｏｗｎｅに感染したＵ３７３ＭＧ星状細胞腫の抗−ｐｐ６５ＣＤ８＋Ｔ系「Ｖａｌ」リーシスｐｐ６５ペプチドＮ９Ｖで生じたＣＤ８＋Ｔ系「Ｖａｌ」を、ペプチドＮ９Ｖまたはペプチド１９ＹでインキュベーションしまたはＣＭＶＴｏｗｎｅ（５ｍｏｉ）に４時間感染させた後、ペプチド１９ＹとインキュベーションしたＵ３７３ＭＧ細胞の存在下にて⁵¹Ｃｒ拡大試験に用いた。特異的リーシス（溶菌）の比率を、材料および方法に示すようにして計算した。第４図：E．coliで産生した組換えタンパク質の模式的表現ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ３５によって表されるエピトープに相当するペプチド配列、およびそれらの位置を示す。第５図：トリプシンで前処理したタンパク質ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５の存在下でインキュベーションしたＢ／ＥＢＶ細胞の抗−ｐｐ６５ＣＤ８＋Ｔ系「Ｖａｌ」リーシス系「Ｖａｌ」の細胞を、未処理またはクロロキン（材料および方法）および図示したペプチドおよびタンパク質で前処理した自己Ｂ／ＥＢＶリンパ球の存在下で⁵¹Ｃｒ拡大試験に用いた。第６図：組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞によるタンパク質Ｈｉｓ− ＩＥ１−ｐｐ６５の産生の分析Ｓｆ９昆虫細胞を、組換えＩＥ１−ｐｐ６５バキュロウイルスに４８時間感染させた。細胞溶解生成物(1)を遠心分離し、上清(2)をＮｉ−アガロースカラムを通過させ、溶出物を回収した(3，4)。様々な画分にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシー・ブルー(Coomassie blue)で染色した。第７図：処方物ＳＭＢＶ／ＩＥ１−ｐｐ６５を用いるＣＭＶ＋ドナーでの抗−ＩＥ１ＣＤ４＋Ｔ−エフェクターの誘発ＣＭＶ＋ドナーのＰＢＭＣを、可溶型またはＳＭＢＶ（ＡＧ型）で処方したまたは抗原の非存在下（模造品）でタンパク質ＩＥ１−ｐｐ６５で刺激した。３５日目に、細胞を、タンパク質ＩＥ１（ｃｏｌ）を含むまたは含まないタンパク質溶液の存在下でインキュベーションする。特異的腔−ＩＥ１Ｔ細胞の増殖を、トリチル化したチミジンの取り込みを測定することによって決定した。例１：ＤＨ５α細菌での融合タンパク質の産生材料および方法ＩｐＧＥＸ２ＴＫにおけるＩＥ１とｐｐ６５ｃＤＮＡのクローニングＩ−１ＩＥ１およびｐｐ６５ｃＤＮＡの調製Ｉ−１−１ＩＥ１−ｃＤＮＡＣＭＶ株ＴｏｗｎｅのＨｉｎｄIII Ｃ断片に位置するタンパク質ＩＥ１をコードする配列を含むウイルスゲノムの領域を、ｐＲＬ１０３と呼ばれるプラスミドにクローニングした。このプラスミドを用いて、星状細胞系Ｕ３７３ＭＧの細胞をトランスフェクションした（Ａ２と命名（R．Lafemina，Merck Sharp and D ohme，ウェストポイント，ペンシルバニア，米国より供給）。これらの細胞を、ＲＰＭＩ−ＦＣＳ（FPMI 1640 Glutamax，１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２００ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％補体除去ウシ血清）中でコンフルエントになるまで培養した。３日培養の全ＲＮＡを、Chom zynski and Sacchi(14)の方法に従って調製した。ＩＥ１ｃＤＮＡは、ＲＴ− ＰＣＲ（Kit Super Script，GIBCO BRL）により、全ＲＮＡの５μｇ分量を用い、を用いて製造業者の指示に従って生成させた。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏｒＩ部位を、それぞれプライマーＣ１（ＩＥ１の５’末端）およびＣ２（ＩＥ１の３’末端）に導入した。このようにして得たＰＣＲ生成物（１４８０ｂｐ）を、Ｓ４００−ＨＲカラム(PHARMACIA)上で精製した。Ｉ−１−２ｐｐ６５−ｃＤＮＡ１０％ウシ胎児血清を補足したＢＭＥ（ＢＭＥ／ＦＣＳ）で成育したヒト線維細胞変性効果を観察した後、ウイルスを含む上清を回収し、熱不活性化した（６０℃，３０分）。ウイルス粒子を遠心分離（３１，０００ｇ，４℃，９０分）によって集め、キャプシドを２５０μlリーシス緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓＣｌｐＨ７．５，１ｍＭＥＤＴＡ，２％サルコシル）中プロテイナーゼＫ(BOEHR INGER)（１５０μｇ）で周囲温度で３０分間処理することによって分解した。ウイルスＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出した後、無水エタノールで沈澱させた。ＤＮＡペレットを乾燥して、水２０μｌ中で可溶化した。ｐｐ６５ｃＤＮＡに相当する断片を、ｐｐ６５遺伝子の５’および３’末端に相補的でありかつそれぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を含むプライマーＣ３：を用い、ウイルスＤＮＡ２μｌ分量を用いるＰＣＲによって得た。ＰＣＲ生成物（１６７０ｂｐ）をＳ４００−ＨＲカラム(PHARMACIA)上で精製した。Ｉ−２プラスミドｐＧＥＸ２ＴＫ−ＩＥ１−ｐｐ６５の構築Ｉ−２−１ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した断片ＩＥ１およびｐｐ６５の精製ＩＥ１およびｐｐ６５ｃＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位に予めクローニングした。コンピテントＤＨ５α細菌(GIB CO)を、連結反応生成物ＩＥ１／ｐＵＣ１８またはｐｐ６５／ｐＵＣ１８５〜１０ｎｇで形質転換した。組換えプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。消化生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、「JetSorb/15 0」キット(GENOMED)を用いてゲルから抽出した。Ｉ−２−２ＩＥ１−ｐｐ６５断片の精製ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した断片ＩＥ１およびｐｐ６５の同僚をＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベーションした。反応混合物をＢａｍＨＩで消化した。得られた断片ｐｐ６５−ｐｐ６５（３３４０ｂｐ）、ＩＥ１−ｐｐ６５（３１５０ｂｐ）、ＩＥ１−ＩＥ１（２９６０ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動によって分離した。断片ＩＥ１−ｐｐ６５を、「JetSorb/150」キット(GENO MED)を用いてゲルから抽出した。Ｉ−２−３ＩＥ１−ｐｐ６５のｐＧＥＸ２ＴＫへのクローニング断片ＩＥ１−ｐｐ６５を、プラスミドｐＧＥＸ２ＴＫ(PHARMACIA)のＢａｍＨＩ部位に挿入した。組換え細菌のクローンを、タンパク質精製に使用するまで、ＰＢＳ中３．５％ＤＭＳＯに−８０℃で保管した。ＩＩ融合タンパク質ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５の産生 −８０℃で冷凍した細菌の分量をアンピシリン（Ａｐ，５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地５ｍｌに再懸濁し、３７℃で８時間培養した。同じ培地４５ｍｌで希釈した培養を１５時間継続し、ＬＢ＋Ａｐ５００ｍｌに光学濃度（λ＝６００ｎｍ）が１になるまで吸収した。培地にＩＰＴＧ（１００μＭ）を加えることによって、ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５の産生を誘発した。周囲温度で３時間培養した後、細菌を遠心分離によって回収し、−８０℃で保管した。細菌をリーシスし、組換えタンパク質を、グルタチオンをグラフトした「Seph arose 4-B」カラム(PHARMACIA)上で製造業者の指示に従ってアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした後、クマシー・ブルーで染色した。ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５の抗原性を、ＧＳＴ（PHARMACIA，希釈倍率１／４００）に対して指定したヤギ抗体、およびＩＥ１に対して指定しパリから提供された）、およびｐｐ６５（NEA 20，１／２５０に希釈，DUPONT）を用いてウェスタン・ブロット法によって分析した。ＲＡＧ／ＰＯ、ＲＡＭ／ＰＯペルオキシダーゼ(Nordic)にカップリングした二次抗体を１／５００で用いた。タンパク質は、「Bio-Rad Protein Assay」キット(BIORAD)を用いて、Bradfor dの方法によって分析した。組換えＧＳＴタンパク質を産生し、精製した。結果および検討ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５の精製ＤＨ５α／ｐＧＥＸ２ＴＫ−ＩＥ１−ｐｐ６６５００ｍｌの培養物から、グルタチオンクロマトグラフィーによって精製したＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５タンパク質を、平均して１ｍｇ得た。変性条件下での電気泳動の後、組換え細菌の溶解生成物を用い、抗体抗−ＧＳＴ、抗−ＩＥ１および抗−ｐｐ６５を用いるウェスタン・ブロット法による分析を、第１図に示す。生成物は理論質量１４５ｋｄに相当することが、組換え細菌から調製した試料中の３種類の抗体によって明らかになった。抗体によって認識された低分子量バンドは、タンパク質分解生成物である。これらの結果は、これらの細菌における融合ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５から生じるタンパク質の産生と一致する（第４図）。タンパク質のトリプシンタンパク質分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、総タンパク質に相当する移動バンドの消失が、ペプチドの生成に相当する低分子量のバンドの出現と相関したことを示している。これらの断片の内、タンパク質の配列の分析の後に１５ａａのペプチドが出現し、これはペプチドＮ９Ｖを含む（「材料および方法」、および第４図を参照）。例２材料および方法Ｉリンパ増殖試験ＨＬＡＤＲ８によって制限され、タンパク質他ＩＥ１の位置１６２〜１７５のエピトープに特異的なＣＤ４＋Ｔ−クローン（ＢｅＡ３Ｇ９）の細胞（２× １０４）を、同じＨＬＡ−ＤＲ表現型の放射線照射した（２５００ｒａｄｓ）抗原提供細胞（１×１０５ＰＢＭＣ）を含むＲＰＭＩ−ＳＨ培地１００μｌ中でインキュベーションした。これらの細胞を、一連の希釈倍率の組換えタンパク質と共にインキュベーションした。３日目に、［３Ｈ］−チミジン(AMERSHAM)１μＣｉを、培養物のそれぞれのウェルに加えた。１５時間後、菌体ＤＮＡをガラス繊維フィルター(PACKARD)上に集め、Matrix 9600ガスβカウンター(PACKARD)で［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定した。それぞれの測定は、３回行った。ＩＩタンパク質ｐｐ６５のペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ系の生成ハプロタイプＨＬＡ−Ａ２のＣＭＶセロポジティブドナーの末梢血白血球（２ ×１０６／ｍｌ）をＲＰＭＩ−ＳＨ（２ｍｌ）中、２４穴プレートで培養した。３日目に、「Lymphocult-T-LF」(BIOTEST，フランス)１００Ｕ／ｍｌを加えた。７日目に、生細胞をフィコールグラディエントのリングで回収した。これらの細胞（５×１０５／ウェル）を「Lymphocult」を１０％補足したＲＰＭＩ−ＳＨ（２ｍｌ）中で自己刺激細胞（１．５×１０６／ウェル）の存在下でインキュベーションした。刺激細胞（１０×１０６個／ウェル）をＨＬＡ−Ａ２（ペプチドの存在下にてＲＰＭＩ中で３７℃で１時間インキュベーションし、放射線照射した（２５００ｒａｄｓ）。エフェクター細胞を、７日毎に同じ条件下で再刺激した。生成する系「Ｖａｌ」の細胞毒性を、１４日目に試験した。この系のＣＤ８＋表現型を、モノクローナルマウス抗体ＯＫＴ８でサイトフルオリメトリーにより測定した。 III 細胞毒性試験 III −１ＣＭＶ感染に関してＲＰＭＩ／ＦＣＳ中で８０％コンフルエンスのハプロタイプＨＬＡ−Ａ２（２ ×１０５）のＵ３７３ＭＧ星状細胞腫細胞を、６穴プレート（１０ｃｍ２）で５ｐｆｕ／細胞のＴｏｗｎｅ−ＣＭＶウイルスに感染させた。４時間の感染後、細胞をＮａ２⁵¹ＣｒＯ４（ICN，フランス）１００μＣｉで標識し、ＲＰＭＩで洗浄した。ＣＤ８＋Ｔ系の自己エフェクター細胞を、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ（５００μｌ）中で１０４個の標的細胞と共に３７℃で４時間インキュベーションした。様々な量のエフェクター細胞を標的に加えて、異なるエフェクター／標的比を得た。別の処理は、この細胞を、最終濃度１００ｎＭのペプチドＮ９Ｖまて認識されたペプチドと共に３７℃で一晩予備インキュベーションすることであった。自然拡大の速度を、４時間培養した標的細胞によって放出された放射能を測定することによって決定した。特異的リーシスの割合を、下式（［測定放射能−自然拡大／総放射能−自然拡大］×１００）を用いて計算した。放射能は、Cobra −γ−カウンター(PACKARD)で測定する。それぞれの測定は、２回行う。 III −２クロロキンを含むまたは含まない、天然またはトリプシン消化したタンパク質ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５の存在下精製したタンパク質ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５を、「Centricon 10」フィルターユニット(FILTRON)を備えた限外濾過遠心分離機で脱塩し、水に吸収した後、この形態で用い、またはＴｒｉｓ緩衝液［１００ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０］１００μｌの容積中、トリプシン（TCPK，SIGMA，タンパク質９００μｇ当たり２００ｎｇ）で、３７０℃で２時間消化した。消化の前後に採取した分量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。予め洗浄し、放射線照射した（１０４ｒａｄｓ）自己Ｂ−ＥＢＶリンパ球（１ ×１０６）を、抗原（１μＭ）と共に４８穴プレートでＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地（０．５ｍｌ）中で３７℃で１５時間、またはＲＰＭＩ−ＦＣＳ５％／クロロキン８０μＭ(SIGMA)中で３０分間予備インキュベーションした後、抗原を添加した。別の処理としては、細胞を、ペプチドＮ９ＶまたはペプチドＩ９Ｖを最終濃度１０ｎＭと共に３７℃で一晩予備インキュベーションした。このインキュベーションが終了した後、細胞（５０，０００／ｍｌ）をＮａ２⁵¹ＣｒＯ４１００μＣｉで標識し、ＲＰＭＩで洗浄した。ＣＤ８＋Ｔ系のエフェクター細胞を、星状細胞腫細胞について記載したのと同一条件下で添加した。結果および検討ＩＧＳＴＩＥ１−ｐｐ６５の存在下でのＣＤ４＋ＴクローンＢｅＡ３Ｇ９のリンパ増殖第２図は、精製した組換え抗原ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５と共にインキュベーションしたＰＢＭＣの存在下での抗−ＩＥ１クローンＢｅＡ３Ｇ９の増殖の結果を示す。タンパク質ＧＳＴの存在下では、チミジンの取り込みは見られなかったので、クローンは特異的に増殖した。この増殖は、融合タンパク質ＧＳＴ−ｅ４（Ｃ末端ＩＥ１の８０％）またはＧＳＴ−ＩＥ１で得られた増殖と同程度であった。これらの結果は、タンパク質ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５が、クローンＢｅＡ３Ｇ９の細胞によって認識されるＩＥ１エピトープを提供するようにＨＬＡ− ＤＲ８抗原提供細胞によって正確に調製されたことを示している。ＩＩ「Ｖａｌ」系の抗−ｐｐ６５ＣＤ８＋Ｔ細胞は、トリプシンによって指定されたタンパク質ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５の存在下でインキュベーションした標的をリーシスする。ＩＩ−１系「Ｖａｌ」は、ＣＭＶに感染後に生成した天然ペプチドを認識する。第３図は、表現型ＨＬＡ−Ａ２のＵ３７３ＭＧ星状細胞腫細胞の感染に関して行った細胞毒性試験の結果を示している。ペプチドＮ９Ｖ（ＨＬＡ−Ａ２）の存在下では標的の特異的リーシスが見られたが、ペプチドＩ９Ｙ（ＨＬＡ−Ｂ３５）では、これは実質的にゼロであり、これはＵ３７３ＭＧ細胞の表面の表現型Ａ２のクラスＩＭＨＣ分子は、特異的にペプチドＮ９Ｖで満たされていることを示している。これらの細胞がＣＭＶに感染すると、ペプチドＮ９Ｖで得られたのと同等なレベルの特異的リーシスが観察された。これは、接種物によって提供されたタンパク質ｐｐ６５がサイトゾルに送達され、Ｎ９Ｖと同一または同様な構造のペプチドが生成して、系「Ｖａｌ」の細胞に特異的に提供されるような方法で調製されたことを示唆している。ＩＩ−２トリプシン消化したタンパク質ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５の存在下でインキュベーションしたＢ／ＥＢＶリンパ球は、細胞のクロロキン処理の腔かとして抗−ｐｐ６５系「Ｖａｌ」によってリーシスされる。トリプシンで予備消化した同じ画分の試料とは対照的に、タンパク質ＧＳＴ− ＩＥ１−ｐｐ６５が系「Ｖａｌ」によるリーシスに対して標的を感作しなかった実験の結果を、第５図に示す。細胞をクロロキンで前処理して、トリプシン消化タンパク質の存在下でインキュベーションしたところ、標的はリーシスされなかった。タンパク質のトリプシン消化により、１５ａａのペプチドであるＮ１５Ｋが生成し、これはペプチドＮ９Ｖを含んでいる（第４図）。この加水分解物の存在下で標的によって示されたリーシスは、ペプチドＮ１５Ｋが系「Ｖａｌ」に提供されることを示している。更に、細胞のクロロキン前処理は、このペプチドが細胞によってインターナリゼーションされ、ｐＨ増加に対して感受性であるエンド−リソソーム型コンパートメントで調製されることを示している。例３材料および方法ＩＥ１−ｐｐ６５の発現ベクター「バキュロウイルス」ｐＡｃＨＬＴ−Ｂへのクローニング。組換えプラスミドを有するＳｆ９昆虫細胞とバキュロウイルスＤＮＡの同時トランスフェクション。精製した断片ＩＥ１−ｐｐ６５（例１，Ｉ−２−２節）を、６ヒスチジン残基（Ｈｉｓ６）のペプチドをコードする配列を含むプラスミドｐＡｃＨＬＴ−Ｂ(P harmingen)のＢｇｌＩＩ部位に挿入した。組換えプラスミドを特性決定し、精製した。Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）を、Pharmingenによって提供されたプロトコールに従ってプラスミド３μｇおよびウイルスＤＮＡ０．５μ ｇを含む混合物の存在下で３７℃で４時間インキュベーションした。５に置換の培養後、タンパク質産生をＩＥ１に対するモノクローナル抗体（Ｅ１３，Argene ）およびｐｐ６５に対するモノクローナル抗体（ＮＥＡ２０，Biosoft）を用いて「ウェスタン・ブロット法」によって分析した。タンパク質Ｈｉｓ６ＩＥ１−ｐｐ６５の産生および精製感染したＳｆ９細胞におけるタンパク質の産生動態を０日目から５日目まで確立し、「ウェスタン・ブロット法」によって分析した。感染細胞の溶解生成物（リーシス緩衝液：Ｔｒｉｓ１０ｍＭ，ＮａＣｌ１３０ｍＭ，Triton X-100，ＮａＦ１０ｍＭ，ＮａＰｉ１０ｍＭ，ＮａＰＰｉ１０ｍＭ，ｐＨ７．５， Pharmingen)をNi-NTAアフィニティーカラム(Qiagen)に加え、タンパク質を緩衝液（ＮａＰＯ４５０ｍＭ，ＮａＣｌ３００ｍＭ，グリセロール１０％，イミダゾール０．５Ｍ，Pharmingen）で溶出した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックし、クマシー・ブルーで染色した。結果タンパク質ＨｉｓＩＥ１−ｐｐ６５の精製第６図は、組換えバキュロウイルスに感染した細胞によって産生され、Ｎｉクロマトグラフィーによって精製されたタンパク質Ｈｉｓ６ＩＥ１−ｐｐ６５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。これらの結果は、このタンパク質が全細胞タンパク質の実質的部分を構成し、クロマトグラフィーの後に高純度で得られることを示している。例４材料および方法ＣＭＶ＋ドナーのＰＢＭＣ由来でありかつ可溶性型またはＳＭＢＶ（超分子バイオベクター）中で処方されたキメラタンパク質ＩＥ１−ｐｐ６５の存在下でインキュベーションしたイン・ビトロでのＣＤ４＋Ｔ系の誘導ＩＥ１−ｐｐ６５処方物を、タンパク質溶液（２．５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４，６２ｍＭＮａＣｌ，０．６５ｍＭＫＣｌ＋１０％グリセロールを含むＰＢＳ中２００ｎＭ）およびＬ型ＳＭＢＶ（１ｍｇ／ｍｌ蒸留水）を、タンパク質／バイオベクター重量比７．７およびタンパク質／核重量比１０で、周囲温度で１時間同時インキュベーションすることによって得た。ＷＯ９４／２００７８号明細書に記載されているＬ型ＳＭＢＶは、ＤＰＰＣ／コレステロールからなる外部二重層を含んでなる。ハプロタイプＤＲ３，１３（「Ｖａｌ」）のＣＭＶ＋ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２４穴プレート(Falcon)でＲＰＭＩ培地／１０％ヒト血清（ＨＳ）２ｍｌ中４×１０６個の細胞の密度でインキュベーションした。可溶性または処方した抗原ＩＥ１−ｐｐ６５を加え、混合物を３７℃で３に置換インキュベーションした。３日目に、培地１ｍｌを１０％Lymphocult（１００Ｕ／ｍｌ，Biotest，フランス）を補足した新鮮な培地１ｍｌに換える。７日目に、エフェクター細胞を、可溶性抗原または処方抗原の存在下またはタンパク質の非存在下で予めインキュベーションした（１５時間）自己ＰＢＭＣ（０．５×１０６個の細胞当たり１．５×１０６個のＰＢＭＣ）と共にインキュベーションすることによって刺激する。３５日目に、例２、材料および方法の節、「リンパ増殖試験」に記載の条件下で、下記の修正を加えて増殖試験を行う。２×１０４個のエフェクター細胞を、１×１０５個の同種ＰＢＭＣ、およびＩＥ遺伝子（Ａ２と呼ばれる）でトランスフェクションしかつ抗原ＩＥ１を含む星状細胞腫細胞Ｕ３７３ＭＧの溶解生成物由来のタンパク質の溶液の存在下でインキュベーションする。トランスフェクションしなかった細胞（ＡＯと呼ばれる）の溶解生成物をネガティブコントロールとして用いた。結果ＩＥ１−ｐｐ６５処方物からＣＭＶ＋ドナーの抗−ＩＥ１ＣＤ４＋Ｔ−エフェクターの誘導第７図は、エフェクターを、処方した抗原の存在下で誘導した唯一の場合における「Ｖａｌ」ドナーのＰＢＭＣから生成した抗−ＥＩＩエフェクターの増殖を示す。この結果により、Prieur et al．(9)によって以前に示されたように、処方物の効力増強効果が強調される。これらの結果は、抗−ＩＥ１ＣＤ４＋Ｔ −前駆体の頻度が、恐らくは取り出しの時点でのドナー「Ｖａｌ」を用いる場合と同様に低い条件下で、可溶性抗原を用いるときには刺激も拡大もされない細胞を刺激し、拡大することができる。Ｔ−エフェクターをイン・ビトロで誘導するためのこれらの処方物を用いることの重要性は、例えば骨髄移植のための輸送プロトコールの開発にとって明らかである。図の凡例第２図 −■− ＧＳＴ −○− ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５第３図 □ Ｎ９Ｖ □ ＣＭＶ４ｈ □ Ｉ９Ｙ第５図 −■− Ｉ９Ｙ −□− Ｎ９Ｖ −●− Ｎ９Ｖクロロキン −○− ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５ −◆− ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５，消化 −”− ＧＳＴ−ＩＥ１−ｐｐ６５，消化，クロロキン第７図・ＩＥ１ ■ Ｃｏｌ

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１月２５日（１９９９．１．２５）【補正内容】請求の範囲１．サイトメガロウイルス（またはＣＭＶ）タンパク質ｐｐ６５、またはタンパク質ｐｐ６５と少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質の少なくとも一部を、ＣＭＶ由来の少なくとも１個の第二のペプチド断片と組合わせて含んでなり、タンパク質ｐｐ１５０を除くことを特徴とする、融合タンパク質。２．第二のペプチド断片が、タンパク質ＩＥ１またはそのエピトープの一つ、または少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。３．第二のペプチド断片が、ＣＭＶタンパク質ＩＥ１の断片ｅ４であるか、または前記断片ｅ４と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド断片である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。４．第二のペプチド断片が、下記a)またはb)である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。 a) タンパク質ＩＥ１の配列のアミノ酸残基１６２および１７５によって限界設定された断片、または b) 上記a)に記載の断片と少なくとも９０％の相同性を有するペプチド断片。５．ＣＭＶ以外の微生物由来のペプチド断片をさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。６．グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（またはＧＳＴ）活性を有する酵素由来のペプチド断片、または任意の他の「Ｔａｇ」配列を含んでなる、請求項５に記載の融合タンパク質。７．請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/045 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/00 Ａ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ジャクリーヌ、リュールフランス国プレザンス―デュ―トゥーシュ、リュ、ブレーズ、パスカル、16 (72)発明者ジャン−リュック、ダビニョンフランス国トゥルヌファーユ、リュ、デ、ビッシュ、15 (72)発明者クリスチャン、ダブラーンシュフランス国コルヌバリュー、リュ、シャルル、ド、ゴール、14

Claims

【特許請求の範囲】１．サイトメガロウイルス（またはＣＭＶ）タンパク質ｐｐ６５、またはタンパク質ｐｐ６５と少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質の少なくとも一部を、ＣＭＶ由来の少なくとも１個の第二のペプチド断片と組合わせて含んでなることを特徴とする、融合タンパク質。２．第二のペプチド断片が、タンパク質ＩＥ１またはそのエピトープの一つ、または少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。３．第二のペプチド断片が、ＣＭＶタンパク質ＩＥ１の断片ｅ４であるか、または前記断片ｅ４と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド断片である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。４．第二のペプチド断片が、下記a)またはb)である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。 a) タンパク質ＩＥ１の配列のアミノ酸残基１６２および１７５によって限界設定された断片、または b) 上記a)に記載の断片と少なくとも９０％の相同性を有するペプチド断片。５．ＣＭＶ以外の微生物由来のペプチド断片をさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。６．グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（またはＧＳＴ）活性を有する酵素由来のペプチド断片、または任意の他の「Ｔａｇ」配列を含んでなる、請求項５に記載の融合タンパク質。７．請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。８．医薬としての、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項７に記載のヌクレオチド配列。９．ＣＭＶによって引起こされる感染症を予防するワクチンを製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用、または請求項７に記載のヌクレオチド配列の使用。１０．下記a)またはb)を含むことを特徴とする、医薬組成物。 a) ＣＭＶタンパク質ｐｐ６５、またはタンパク質ｐｐ６５と少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質の少なくとも一部を、ＣＭＶ由来の少なくとも１種類の第二のペプチド断片と組合わせたもの、または b) a)に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列。１１．請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項７に記載のヌクレオチド配列を、薬学上許容可能な賦形剤と共に含んでなる、請求項１０に記載の医薬組成物。１２．ＣＭＶエンベロープ抗原をさらに含んでなる、請求項１１に記載の医薬組成物。１３．下記工程a)〜d)を行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質の製造法。 a) ＣＭＶタンパク質ｐｐ６５の少なくとも一部をコードする第一のＤＮＡ配列を、ＣＭＶ由来のもう一つのポリペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列と結合させ、融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列を得て、 b) 組換えＤＮＡ配列を、その発現に必要な要素と、適当な場合には、他のポリペプチド、特に「Ｔａｇ」をコードする配列を含む構築物に導入し、 c) b)で得た構築物を宿主細胞に導入した後、融合ＤＮＡの発現系が機能的である条件下で培養し、融合タンパク質を宿主細胞中に産生させ、 d) 宿主細胞中に産生された融合タンパク質を回収して、精製する。１４．請求項１〜６のいずれか一項に記載され、請求項１３に記載の方法で得ることができる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞。１５．細菌、ウイルス、酵母、および真核細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の宿主細胞。