WO2021234299A1 - Composition comprenant un compose ascorbo-camphorate metallique pour son utilisation dans le traitement des infections causees par papillomavirus - Google Patents

Composition comprenant un compose ascorbo-camphorate metallique pour son utilisation dans le traitement des infections causees par papillomavirus Download PDF

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WO2021234299A1
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camphorate
compound
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preventive
papillomavirus
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Aurèle Henri Mannarini
Bernard Gombert
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M.G.B. Pharma
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Definitions

  • composition comprising a metal ascorbocamphorate compound for its use in the treatment of infections caused by papillomavirus
  • the present invention relates to a medicament for use in the treatment of an infection caused by at least one virus of the Papillomaviridae family, in particular human papillomaviruses (HPV),
  • HPV human papillomaviruses
  • the invention relates more particularly to a use in the preventive or curative treatments of viral infections involving the human papillomaviruses known as high carcinogenic risk (HR-HPV) such as the HPV-18 or HPV-1S genotypes which are the main papillomaviruses involved in the human papillomavirus. development of malignant tumors.
  • HR-HPV high carcinogenic risk
  • HPV Human papillomaviruses
  • Papillomaviruses are extensively studied and described in the scientific literature. These are all epitheliotropic viruses that are clinically responsible for benign or malignant lesions or tumors.
  • papillomaviruses are small, non-enveloped viruses whose capsid consists of 72 capsomers comprising the major protein L1 and the protein L2.
  • HPVs infect stem cells of the multi-layered epithelium of cutaneous-mucous keratinocytes (such as the basal lamina of the ectocervix). The complete multiplication cycle of HPV involves several phases that take place during epithelial differentiation and desquamation.
  • the viral DNA After infection of cells with the virus, the viral DNA remains in latent form for several years in episomal (circular) form in the nucleus of the host cell.
  • Endogenous and exogenous cofactors cause activation of viral DNA, which splits and integrates into the genome of the host cell. There is then sequential expression of the viral genes, which allows the replication of the viral DNA and then the production of new infectious virions. This event leads to the overexpression of the two viral oncoproteins, E6 and E7, the combined action of which is necessary for the immortalization, then for the transformation of the cell. Cancer cells lead to dysplasias which in the worst case can progress to cancer.
  • Papillomaviruses have a genome made up of double-stranded, circular DNA of about 8,000 base pairs.
  • HPV DNA has two open reading frames (POL) encoding the L1 and L2 proteins of the capsomers.
  • POL L1 When POL L1 is expressed in vitro, alone or in association with L2, the corresponding proteins self-assemble into viral pseudo-particles, commonly referred to by the English acronym VLP (Virus Like Particles), also called pseudovirions or pseudovirus ( denoted PsV), whose morphology and antigenic properties are similar to those of native virions.
  • VLP Virus Like Particles
  • the means for treating a viral infection by HPV are based on surgical treatments of the body part infected following a diagnosis of the cancer risk or of an invasive cancer, or on prophylactic vaccines.
  • the invention provides a composition for its use in the preventive and / or curative treatment of an infection involving at least one papillomavirus, in particular at least one human papillomavirus (HPV), said composition comprising at least one ascorbic compound. metallic camphorate.
  • at least one papillomavirus in particular at least one human papillomavirus (HPV)
  • HPV human papillomavirus
  • the invention provides a composition for use in the preventive and / or curative treatment of an infection involving at least one oncogenic papillomavirus, comprising a said metal ascorbo-camphorate compound.
  • said infection involves at least one oncogenic papillomavirus of the HPV-18 genotype and / or of the HPV-18 genotype.
  • said metal ascorbo-camphorate compound is soluble in an aqueous solvent.
  • said metal ascorbo-camphorate compound is a metal tetra-ascorbo-camphorate compound.
  • said metal ascorbo-camphorate compound comprises a metal ion selected from those of the metals of the group comprising the zinc, copper and magnesium. More preferably, said ion is a zinc ion.
  • said compound is zinc tetraascorbo-camphorate.
  • This zinc tetra-ascorbo-camphorate compound derived from a modified terpene, is preferably formed by zinc campborate and ascorbic acid, in a molar ratio of ascorbic acid / zinc camphorate equal to 4.
  • the compound thus obtained has the advantage of being stable and of being able to be completely dissolved in aqueous medium.
  • the active part of said compound is based on the basic terpene derivative that is campborate, but the part of the compound originating from ascorbic acid can promote the transfer of said compound through the virus itself to reach a specific target, for example its genetic material, where the active element can cause its destruction.
  • the metal ion in particular in the case of zinc, can also contribute to promoting the anti-viral action of said compound of terpene derivative.
  • said composition comprises a physiologically acceptable aqueous solvent.
  • said solvent consists of water or of a water-alcohol mixture (physiologically acceptable), so that said metal ascorbocamphorate compound is in dissolved form in said composition.
  • said alcohol is ethanol.
  • a mixture of water and another polar solvent in which said metal ascorbocamphorate compound is in dissolved form in said composition can be used.
  • said composition is packaged in a galenic form suitable for application to the skin and / or the mucous membranes.
  • said composition comprises a physiologically acceptable excipient for packaging it in a galenic form of gel or ointment type, for application to the skin and / or the mucous membranes.
  • said composition is packaged in a solid dosage form.
  • the composition may comprise only said metal ascorbocamphorate compound.
  • This solid dosage form can be dissolved in water or ingested, for example with an aqueous liquid.
  • Said galenic form can thus be tablets, capsules or sachets containing a powdered metal ascorbocamphorate compound. The powder will then be swallowed with a large glass of water, or will be added to drinking water to be dissolved before the patient absorbs it orally, or will be dissolved in water for use by external application.
  • said composition comprises at least one physiologically acceptable excipient suitable for packaging in a dosage form for use by the vaginal route, in particular in an ovum or a capsule.
  • This packaging is particularly suitable for curative treatment or preventive of infections caused by HPVs, in particular those of the very common HPV-16 or HPV-18 genotype, mainly involved in sexually transmitted infections which can lead to cancers, in particular of the cervix.
  • said composition for use in the preventive and / or curative treatment of an infection involving at least one papillomavirus is proposed for administration in a dosage of approximately 3 grams of said metallic ascorbocamphorate per day, by fractional doses. possibly in an adult human being.
  • said composition for use in the preventive and / or curative treatment of an infection involving at least one papillomavirus comprises zinc tetra-ascorbocamphorate which has been obtained by a preparation process in which ascorbic acid is mixed with zinc camphorate by adding zinc camphorate in powder form to an aqueous solution of ascorbic acid in a molar ratio of ascorbic acid / zinc camphorate equal to 4, the mixing being carried out in diluted medium corresponding to a quantity of water between 20 and 40 mL / mmol equivalents, in particular between 20 and 30 mL / mmol equivalents, relative to zinc camphorate, the mixture being kept under stirring, and preferably under an inert atmosphere and protected from light, until complete dissolution zinc camphorate.
  • Said zinc tetraascorbo-camphorate compound can then be recovered in solid form by extracting the aqueous part, preferably cold and under vacuum.
  • the ascorbic acid is preferably L-ascorbic acid.
  • the zinc tetraascorbo-camphorate thus obtained was then collected by lyophilization.
  • zinc camphorate is prepared in a preliminary step from camphoric acid dissolved in a polar solvent based on ethanol or alcohol at 90 °, added with a little water, and this camphoric solution is added to a milky aqueous solution of zinc oxide in a camphoric acid / zinc oxide molar ratio equal to 1/1, and the zinc camphorate precipitate is recovered by extraction of the solvent.
  • the invention also relates to a medicament comprising a metallic ascorbo-camphorate compound as described above for its use in preventive and / or curative treatments for viral infections involving at least one papillomavirus, in particular a human papillomavirus (HPV), and more particularly a human papillomavirus (HPV).
  • papillomavirus in particular a human papillomavirus (HPV), and more particularly a human papillomavirus (HPV).
  • HPV human papillomavirus
  • HPV human papillomavirus
  • HPV human papillomavirus
  • HPV human papillomavirus
  • HPV human papillomavirus
  • HPV human papillomavirus
  • HPV human papillomavirus
  • HPV human papillomavirus
  • HPV human papillomavirus
  • HPV human papillomavirus
  • HPV
  • the invention also relates to a method of preventive and / or curative treatment of viral infections involving at least one papillomavirus, in particular a human papillomavirus (HPV), and more particularly an oncogenic papillomavirus, in particular of the HPV-16 genotype or of the HPV- genotype. 18, in which a composition comprising a metal ascorbocamphorate compound, as described above, is administered.
  • HPV human papillomavirus
  • a composition comprising a metal ascorbocamphorate compound, as described above is administered.
  • the invention relates to a method of preventive and / or curative treatment of said viral infections comprising the administration, advantageously by topical application, to a subject in need thereof, of a preventively or curatively effective amount of a compound.
  • metal ascorbo-camphorate as described or of a composition comprising a said metal ascorbo-camphorate compound as described previously.
  • the invention also relates to a method of preparing a pharmaceutical composition for its use in a method of preventive and / or curative treatment of viral infections involving at least one papillomavirus, in particular a human papillomavirus (HPV), said method being as described. previously.
  • a metal ascorbocamphorate compound for more details on the manufacture of a metal ascorbocamphorate compound, reference can also be made to patent application FR2908660.
  • compositions of terpene derivatives, in particular of metallic ascorbo-camphorate compounds, which can be used as an anti-microorganism agent have been described, but no use intended for the treatment of infections involving papiliomaviruses, non-enveloped viruses, n ' has been described.
  • FIG. 1 represents a molecule of L-ascorbic acid and a molecule of camphoric acid, and of which the respective carbon atoms in particular carrying F1 protons are numbered with reference to the 1 H NMR analysis of said compound described below.
  • FIG. 2 is a vertical bar graph grouping the results of neutralization of the VLP-16 pseudo-virions (also noted PsV-16) by the compound “AC” tested on Cos-7 cells, the Cos-7 cells having been pre- treated with said compound "AC” 3 hours before inoculation of VLP-16; and by comparison with controls on control T cells, by measuring of the optical density OD on the pseudo-virions expressing luciferase, and as a function of the dilution of said compound “AC”.
  • FIG. 3 is a vertical bar graph grouping the results of neutralization of VLP-16 pseudo-virions (also noted PsV-16) by the compound “AC” tested on Cos-7 cells, inoculation of Cos-7 cells with the VLP-16 being carried out contemporaneously with the addition of said compound “AC”, and by comparison with controls on control T cells, by measurement of the optical density OD on PsV-16 expressing luciferase, and as a function of the dilution of said compound “AC [Fig. 4] represents a possible spatial structure of zinc tetra-ascorbocamphorate in an aqueous medium.
  • Example of preparation of a zinc tetra-ascorbo-campborate compound A preparation based on ascorbic acid, camphoric acid and zinc was carried out under ambient conditions of temperature and pressure, i.e. substantially 298.15 ° K and 10 5 Pa. However, in some phases the mixtures are slightly heated and stirred.
  • Camphor is generally obtained from the alpha-pinene contained in the spirit of turpentine, which is obtained from the resinous juice which flows from maritime pine.
  • turpentine which is obtained from the resinous juice which flows from maritime pine.
  • the aipha-pinene is converted into camphor by passing through various intermediates, and in particular bornyi chloride, camphene and the organic ester of isoborneol.
  • Camphoric acid corresponding to the following chemical formula is prepared by oxidation of camphor: [Chem 1]
  • Zinc camphorate is prepared as follows. Thus, 200 mg of camphoric acid are dissolved in 1 g of ethanol at 90 °. Next, a quantity of 0.5 g of ultra pure water is added to the mixture. Then, the mixture of camphoric acid is combined with a zinc oxide in solution. For this, 81.3 mg of zinc oxide are mixed with 1 g of ultra pure water which, after stirring, forms a milky solution. The above mixture of camphoric acid is slowly poured into the milky solution. The whole is stirred moderately and intermittently. In addition, between each stirring phase, it is slightly heated, for example in an oven, in order to accelerate the reaction, a precipitate then forms, zinc camphorate, which is recovered by extraction of the solvent, i.e. by heating or by freeze-drying.
  • the zinc tetraascorbo-camphorate compound is then prepared as follows. 288 mg (1.09 mMol, 1 eq.) Of zinc camphorate obtained above are mixed with a solution of 22 ml (20 eq) of pure water containing 770 mg (4.38 mMoi, 4 eq.) Of L-ascorbic acid having the following chemical formula:
  • the mixing is carried out at a temperature below 298.15 ° K (i.e. 25 ° C), and moderately stirred, under an inert atmosphere (under argon gas) and protected from light in order to avoid oxidation of ascorbic acid.
  • 10 ml (10 eq.) Of water are added to complete the dissolution of the zinc camphorate, leaving the mixture under moderate stirring for a further 2 hours.
  • all of the zinc camphorate dissolves and reacts with dissolved ascorbic acid to then form a zinc tetra-ascorbo-camphorate compound in solution.
  • Said dissolved zinc tetra-ascorbo-camphorate compound is recovered in powder form by cold lyophilization, that is to say by extracting the solvent (water) under vacuum and cold.
  • the molecular proportion of the portion of the compound derived from ascorbic acid compared to that from the camphorate can be determined for example by NMR analyzes of the proton 1 H.
  • the NMR analyzes of the proton 1H recovered powder shows that four moles of ascorbic acid for one mole of zinc camphorate lead to a stable compound exhibiting a signal at around 4.6 Sppm which is typical for it.
  • Fig. 1 represents a molecule of L-ascorbic acid and a molecule of camphoric acid, and of which the respective carbon atoms in particular carrying H protons are numbered with reference to the 1 H NMR analysis of said compound described below.
  • the NMR spectra were carried out on a BRUCKER Avance DPX-300 spectrometer (7.05 Tesia magnet) equipped with a QNP 1 H / 13C / 31 measuring probe of 5 mm in diameter, with Z gradient and 2 H iock.
  • the 1 H proton NMR analysis was carried out on a solution of 15 mg of product in 500 ⁇ L of D 2 0 (99.8% deuterated water).
  • Table 1 lists the chemical shifts of the 1 H protons (in ppm) for samples of camphoric acid and L-ascorbic acid alone, and of the compound zinc tetra-ascorbo-camphorate obtained, studied by NMR of the proton 1 H at 27 ° C, atom numbers indicated in the first column of the table corresponding respectively to a carbon atom bound to the proton considered, according to the numbering given on the structures of the respective molecules of ascorbic acid (displacements in the second column of the table) and camphoric acid (displacements in the third column of the table) represented in FIG.
  • the signal around 4.65ppm is typical of the “AC” compound.
  • Zinc tetra-ascorbo-camphorate has an empirical formula 4 (C 6 H 6 O 6 ) Zn (C 10 H 14 O 4 ). The compound can nevertheless form a number of hydrates.
  • FIG. 4 represents a possible spatial structure of zinc tetra-ascorbocamphorate in an aqueous medium.
  • Cytotoxicity of the Zinc Tetra-Ascorbo-Camphorate Compound Obtained The cytotoxicity of said zinc ascorbo-camphorate compound is checked using the MTT test from the company Sigma. The cytotoxicity study is carried out on three types of cells on Vero cells, on human diploid MRC5 cells (of the human embryonic fibroblast type), and moreover on Cos-7 cells. Cultures of these cells are treated with compositions containing said ascorbocamphorate in solution in water, at different dilution rates, and the MTT reagent is then added to each of the solutions. The latter forms crystals with living highly metabolic cells. The absorbance at 490 nm of the dissolved crystals corresponds to the number of living cells. By comparison with cells of the same line, cultured but not treated, a percentage of survival is obtained which reveals the toxicity of said ascorbocamphorate compound. For this, a stock solution is produced having a molarity of
  • Said stock solution is diluted at different rates, from one tenth to one billionth so that a series of dilute solutions having respective molarities of between 5.15.10 -5 ⁇ M and 5155 ⁇ M is obtained.
  • the solutions tolerable by the Vero cells are therefore those having a dilution rate of between one fiftieth and one billionth (value included), or in other words the solutions having a molarity of said ascorbo-camphorate of between 5.15.10 -5 ⁇ M (value included) and 1031 ⁇ M (value excluded).
  • the solutions tolerable by the MRC5 cells are therefore those having a dilution rate of between one tenth and 100 millionths (value included), or in other words the solutions having a molarity of said ascorbo-camphorate of between 5.15.10 -4 ⁇ M (value included) and 5155 ⁇ M (value excluded).
  • the cytotoxicity of said ascorbocamphorate is verified on Cos-7 cells.
  • High concentrations of said ascorbocamphorate may be necessary to produce an effective formulation. Therefore, the intrinsic toxicity of concentrations of said ascorbocamphorate up to 5000 ⁇ g / mL was evaluated using a colorimetric cell viability test.
  • COS-7 cells were exposed to serial dilutions of the stock solution of said ascorbo-camphorate for 24 hours. The viability index, or the fraction of viable cells after the microbicidal treatment relative to the fraction of viable cells exposed as a control, was calculated. Cells treated with 0.1% PBS-azide solution were used as a positive control for toxicity.
  • the viability index or the fraction of viable cells after treatment with the compound "AC" relative to the fraction of viable cells exposed in the natural state, was calculated.
  • Said zinc tetra-ascorbocamphorate exhibited viability indices of 0.8 to 1.1 at all concentrations tested, indicating that it is largely non-toxic.
  • the 50% cytotoxic concentration (CC50) of said ascorbocamphorate was calculated using a dose-response-inhibition analysis on the software GraphPad Prism v5.04 (from the company GraphPad Software). It is estimated to be greater than 0.00515 M.
  • aqueous solutions of said ascorbo-camphorate compound which have been described above, exhibiting tolerable cytotoxicity, having a dilution rate of between 1/10 2 (one hundredth) and 1/10 8 (100 millionths), that is - i.e. having a molarity of said ascorbo-camphorate included between 5.15.10 -4 ⁇ M (value included) and 515.5 ⁇ M (value included), are used for this evaluation.
  • HPV-16 viruses are not cultured, it is known to use pseudovirions to test potential anti-viral agents.
  • the methodology for producing these vectors is known per se, and is not the subject of the present invention.
  • VLPs can for example be carried out as described in the prior art [see for example Buck CB, Thompson CD. Production of papillomavirus-based gene transfer vectors. Curr Protocol Celi Biol. 2007 Dec; Chapter 26: Unit 26.1.] Using the protocol for the production of vectors (pseudovirions) based on papillomavirus, published by the Cellular Oncology Laboratory of the Cancer Research Center (National Cancer Institute, National Institute of Health, Rockville Pike , Bethesda, Maryland, USA), (see for example the website: https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/LCOTF/PseudovirusProductio n).
  • 293TT cells are transfected with each of the plasmid vectors that form the L1 / L2 structural proteins, and incubated for 72 hours at + 37 ° C.
  • the cells are then lysed in buffer (0.5% Nonidet TM P 40 Substitute / 1X PBS, Sigma-Aidrich, St. Louis, Missouri, USA) before being sonicated three times for 15 second cycles to disrupt the cell. nuclear membrane and thus release the VLPs.
  • the nuclear extracts obtained are urified by ultracentrifugation at 30,500 rpm (rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket, Beckman Couiter, Inc., Brea, CA, USA) for 28 hours at + 4 ° C in a cesium chloride gradient ( CICs).
  • the fraction containing the VLPs is collected and diluted in 300 ⁇ L of phosphate buffered saline (DPBS) from Dulbecco (Thermo Fisher Scientific, Waitham, MA, USA) and stored at + 4 ° C before being used for serological analyzes.
  • DPBS phosphate buffered saline
  • Pseudovirions can also be purchased directly from laboratories known in the art.
  • the pseudovirions were produced at the Institut Rabelais University in Tours (France), under the supervision of Professor A. Touzet.
  • the VLP-16 viral pseudo-particles were produced by transfection of purified plasmids containing the L1 and L2 structural proteins of the HPV-16 capsomeres, and carrying a gene encoding luciferase, a marker gene, in cell culture of the cell line 293.
  • the VLP-16 were collected by lysis of the nuclei, their purification being carried out by ultracentrifugation in a CeCl 2 gradient.
  • the positive control of the neutralization test uses a purified VLP-16 inoculum, pre-incubated with purified antibodies against HPV (incubation for 1 hour of said nuclear lysate of VLPs in a solution of anti-HPV antibodies in DMED culture medium ). These anti-HPV antibodies serve as a positive control in the plaque neutralization assay for infection of Cos-7 cells with VLP-16.
  • the culture of the cells of the Cos-7 cell line is carried out on a 96-well microplate, 5% CO 2 and 98% H 2 O, at 37 ° C.
  • the inoculation of the Cos-7 cells is carried out as follows: the mixture forming the inoculum is added to the wells containing the confluent layers of Cos-7, with incubation for 72 hours at 37 ° C,
  • the Cos-7 cells which have optionally internalized the VLPs expressing luciferase are recovered.
  • the Cos-7 cells are then lysed; then the substrate (luciferin) of the reporter gene (luciferase) is added with incubation in the dark, for reading using a luminometer.
  • the effectiveness of the treatment is thus revealed by luminometry (measurement of the optical density, due to the bioluminescence reaction due to luciferase, this method being known per se).
  • the absorbance (optical density) decreases in proportion to the efficiency of the neutralization by the ascorbo-camphorate compound.
  • the positive controls consist of i) wells provided with Cos-7 which will be exposed to VLP-16 without pre-incubation with the active principle to be tested “AC”; and ii) a lectin-like laboratory molecule known to inhibit infection of Cos-7 cells by VLPs. [Fig.
  • VLP-16 pseudo-virions also noted PsV-16
  • the compound “AC” tested on Cos-7 cells the Cos-7 cells having been pre- treated with said compound "AC” 3 hours before inoculation of VLP-16; and by comparison with controls on control T cells, by measuring the optical density OD on the pseudo-virions expressing luciferase, and as a function of the dilution of said “AC” compound.
  • the dilutions of the compound “AC” are written with the inverse of the date of the dilution rate, for example a dilution to the hundredth is written 10 2 .
  • the dilution rates of the solution of the compound “AC” range from 1/10 8 to 1/10 2 .
  • the inhibition of the internalization of VLP-16 by the ascorbocamphorate compound comprises a plateau phase characterized by a fairly weak but constant neutralizing effect, with the increase in the concentration of the ascorbocamphorate compound in the medium, then one observed a total inhibition of the internalization of VLP-16 at the dilution of the ascorbo-camphorate compound of 1/10 2 (ie a molarity of 515.5 ⁇ M in compound “AC”).
  • VLP-16 pseudo-virions also noted PsV-16
  • inoculation of the cells Cos-7 by VLP-16 being carried out contemporaneously with the addition of said compound "AC”
  • controls on control T cells by measurement of the optical density OD on PsV-16 expressing luciferase, and depending on the dilution of said compound "AC”.
  • the dilutions of the compound “AC” are written with the inverse of the date of the dilution rate, for example a dilution to the hundredth is written 10 2 .
  • COS-7 cells were cultured (104 cells / well) in supplemented DMEM in 96-well plates ( Thermo Fisher Scientific) in 5% CQ2 at + 37 ° C until the confluence of the cells is 40-50%.
  • the cells were transduced by replacing the culture medium with fresh unsupplemented DMEM containing serial dilutions of the PsVs stock solutions produced previously and incubated at + 37 ° C.
  • 100 ⁇ l of growth medium was added to each well and the transduced COS-7 cells were incubated for 48 hours at + 37 ° C in 5% CO2. Then, the growth medium was removed and the transduced COS-7 cells were washed with DPBS and incubated in the dark for 15 minutes in 100 ⁇ L of Pierce TM Firefly Luciferase One-Step Glow Assay (Thermo Fisher Scientific).
  • the cell lysates obtained were harvested and transferred to white 96-well microplates and the enzymatic activity of luciferase was measured using the Luminoskan Ascent brand luminometer (from Thermo Fisher Scientific) after adding 50 ⁇ L. of luciferin substrate in each well. Dilutions of pseudovirions which gave at least 80% of the luminescence of the positive control, after adjustment for background luminescence, were selected as suitable and therefore chosen as working dilutions for the neutralization experiments.
  • COS-7 cells were preincubated for 3 hours in the dilution series of compound "AC” ("AC" diluted in unsupplemented DMEM). After the preincubation time, the dilutions of "AC” were removed and replaced with VLP-16 pseudovirions diluted in unsupplemented DMEM.
  • the inhibitory concentration 50 corresponding to the concentration of the compound “AC” which induces a 50% inhibition of the activity of the VLP-16 pseudovirions on the COS-7 cells was calculated using of a dose-response-inhibition analysis on the software GraphPad Prism v5.04 (from the company GraphPad Software).
  • the inhibitory concentration 50 was estimated at 2.8 ⁇ g / mL (2.9 ⁇ M) of “AC”.
  • the therapeutic indices Tl vary from> 960 to> 3330.
  • the estimated inhibitory concentration 50 is 8.1 ⁇ g / mL (8.3 ⁇ M) of “AC” and the therapeutic indices T! vary from> 410 to> 820.
  • the spatial configuration of the compound “AC” (see FIG. 4) is capable of modifying the specific recognition of the virus with its host cell during the first stage of the infection.
  • the aqueous composition of the compound "AC” could interact with the L1 and L2 proteins of the HPV-16 pseudovirions and influence their ability to bind to Cos cells. 7, because the four groups from high polarity ascorbic acid probably allow the molecule to be solubilized in aqueous or physiological environments, providing Zn2 + -camphorate or hydrated zinc-camphorate species, which are very reactive with proteins.
  • the invention thus meets the long-standing need to have a composition other than vaccines for preventive and / or curative treatments for infections by papillomaviruses.
  • the invention has characteristics with reference to those cited previously in the description and claims, to any one of the embodiments, variants, advantages, preferences, or examples of the invention, taken alone or according to any one. of their combinations.

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Abstract

L'invention concerne une composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus, notamment au moins un papillomavirus humain, comprenant au moins un composé ascorbo-camphorate métallique.

Description

Description
Titre de l'invention : Composition comprenant un composé ascorbo- camphorate métallique pour son utilisation dans le traitement des infections causées par papillomavirus
La présente invention se rapporte à un médicament pour utilisation dans le traitement d'une infection causée par au moins un virus de la famille des Papillomaviridae, en particulier les papillomavirus humains (HPV),
L'invention concerne plus particulièrement une utilisation dans les traitements préventifs ou curatifs des infections virales impliquant les papillomavirus humains dits à haut risque cancérigène (HR-HPV) tels que les génotypes HPV-18 ou HPV-1S qui sont les principaux papillomavirus impliqués dans le développement de tumeurs malignes.
Les papillomavirus humains (HPV) sont des virus qui appartiennent à la famille des Papillomaviridae. Plus d'une centaine sont aujourd'hui identifiés. On distingue les HPV dits à bas risque qui sont à l'origine de condylomes externes, et les HPV dits à haut risque (en particulier HPV16 ou HPV18) qui sont impliqués notamment dans les lésions précancéreuses et des cancers cutaneo-muqueux, et en particulier du col de l'utérus, ou plus généralement de la région ano-génitale.
Les papillomavirus sont abondamment étudiés et décrits dans la littérature scientifique. Ce sont tous des virus épithéliotropes qui sont responsables, sur le plan clinique, de lésions ou tumeurs bénignes ou malignes.
Structurellement, les papillomavirus sont de petits virus, non enveloppés, dont la capside est constituée de 72 capsomères comprenant la protéine majeure L1 et la protéine L2. Les HPV infectent les cellules souches de l'épithélium pluristratifié des kératinocytes cutanéo-muqueux (comme la lame basale de l'exocol). Le cycle de multiplication complet des HPV comporte plusieurs phases qui prennent place au cours de la différenciation et la desquamation épithéliale.
Après l'infection des cellules par le virus, l'ADN virai demeure sous forme latente pendant plusieurs années sous forme épisomale (circulaire) dans le noyau de la cellule hôte.
Des cofacteurs endogènes et exogènes entraînent l'activation de l'ADN viral, qui se scinde et s'intégre au génome de la cellule hôte. Il y a alors expression séquentielle des gènes viraux, ce qui permet la réplication de l'ADN viral puis la production de nouveaux virions infectieux. Cet évènement conduit à la surexpression des deux oncoprotéines virales, E6 et E7, dont l'action combinée est nécessaire à l'immortalisation, puis à la transformation de la cellule. Les cellules cancéreuses entraînent des dysplasies qui peuvent évoluer dans le pire des cas jusqu'au cancer. Les papillomavirus possèdent un génome constitué d'un ADN bicaténaire, circulaire d'environ 8000 paires de bases.
L'ADN des HPV comporte deux phases ouvertes de lectures (POL) codant les protéines L1 et L2 des capsomères. Lorsque la POL L1 est exprimée in vitro , seule ou en association avec L2, les protéines correspondantes s'auto-assemblent en pseudo-particules virales, désignées couramment sous l'acronyme anglais VLP ( Virus Like Particles) , dites aussi pseudovirions ou pseudovirus (notés PsV), dont la morphologie et les propriétés antigéniques sont similaires à celles des virions natifs. Les pseudo-particules virales (VLP) sont à la base des vaccins prophylactiques actuels contre les papillomavirus. On peut par exemple se reporter à la demande internationale de brevet W01999/015630A1 ayant pour objet des pseudo-virus dérivés de papillomavirus utilisables dans le cadre d'une thérapie génique ou d'une immunisation génique. Les vaccins prophylactiques développés à partir de VLP assurent une protection excellente contre les lésions induites par les deux génotypes HPV-16 et HPV-18 impliqués dans 70% des cancers du col utérin. Toutefois la fabrication de ces vaccins est assez complexe.
Actuellement les moyens pour traiter une infection virale par HPV reposent sur des traitements d'ordre chirurgical de la partie corporelle infectée suite à un diagnostic du risque cancéreux ou d'un cancer invasif, ou sur des vaccins prophylactiques.
Il n'existe pas donc pas de médicaments hors vaccins, disponibles sur le marché, pour des traitements préventifs ou curatifs des infections par les papillomavirus. II subsiste donc un besoin de pouvoir disposer de médicaments utilisables dans les traitements préventifs ou curatifs des infections par un virus de la famille des papillomavirus, en particulier des HPV, et notamment ceux oncogènes, dits aussi à haut risque (notamment HPV-16 ou HPV-18). L'invention a pour but de répondre à ce besoin.
A cet effet, l'invention propose une composition pour son utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus, notamment au moins un papillomavirus humain (HPV), Ladite composition comprenant au moins un composé ascorbo- camphorate métallique.
Plus particulièrement l'invention propose une composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus oncogène, comprenant undit composé ascorbo-camphorate métallique. En particulier ladite infection implique au moins un papillomavirus oncogène du génotype HPV-18 et/ou du génotype HPV-18.
Avantageusement ledit composé ascorbo-camphorate métallique est soluble dans un solvant aqueux.
De préférence selon l'invention, undit composé ascorbo-camphorate métallique est un composé tetra-ascorbo-camphorate métallique.
De préférence undit composé ascorbo-camphorate métallique comprend un ion métallique choisi parmi ceux des métaux du groupe comprenant le zinc, le cuivre et le magnésium. De préférence encore ledit ion est un ion du zinc.
De préférence selon l'invention, undit composé est le tetra-ascorbo- camphorate de zinc. Ce composé tetra-ascorbo-camphorate de zinc, dérivé d'un terpène modifié, est de préférence formé par le campborate de zinc et de l'acide ascorbique, dans un rapport molaire acide ascorbique/camphorate de zinc égal à 4. Le composé ainsi obtenu présente l'avantage d'être stable et de pouvoir être totalement dissous en milieu aqueux. La partie active dudit composé repose sur le dérivé terpénique de base qu'est le campborate, mais la partie du composé provenant de l'acide ascorbique peut favoriser le transfert dudit composé à travers le virus lui-même pour atteindre une cible déterminée, par exemple son matériel génétique, où l'élément actif peut provoquer sa destruction. De plus l'ion métallique, notamment dans le cas du zinc, peut aussi contribuer à promouvoir l'action anti-virale dudit composé de dérivé terpénique.
Dans un mode préféré de l'invention, ladite composition comprend un solvant aqueux physiologiquement acceptable. Plus particulièrement ledit solvant est constitué par de l'eau ou par un mélange eau-alcool (physiologiquement acceptables), de sorte que ledit composé ascorbo- camphorate métallique est sous forme dissoute dans ladite composition. En particulier ledit alcool est de l'éthanol. Un mélange d'eau et d'un autre solvant polaire dans lequel ledit composé ascorbo-camphorate métallique est sous forme dissoute dans ladite composition peut être utilisé. Dans un mode particulier de l'invention, ladite composition est conditionnée dans une forme galénique apte à une application sur la peau et/ou les muqueuses.
En particulier, ladite composition comprend un excipient physiologiquement acceptable pour la conditionner sous une forme galénique de type gel ou pommade, pour une application sur la peau et/ou les muqueuses. Dans un autre mode particulier de l'invention, ladite composition est conditionnée sous une forme galénique solide. La composition peut comprendre seulement ledit composé ascorbo-camphorate métallique. Cette forme galénique solide peut être à dissoudre dans l'eau ou à ingérer, par exemple avec un liquide aqueux. Ladite forme galénique peut être ainsi des comprimés, des gélules ou des sachets contenant undlt composé ascorbo-camphorate métallique en poudre. La poudre sera alors à avaler avec un grand verre d'eau, ou sera ajoutée à de l'eau potable pour être dissoute avant que le patient l'absorbe oralement, ou encore sera mise en solution dans de l'eau pour un usage par application externe.
Dans un autre mode avantageux de l'invention, ladite composition comprend au moins un excipient physiologiquement acceptable adapté à un conditionnement dans une forme galénique pour un usage par voie vaginale, en particulier en un ovule ou une capsule Ce conditionnement convient particulièrement au traitement curatif ou préventif des infections causées par les HPV, notamment ceux du génotype HPV-16 ou HPV-18 très fréquents, impliqués principalement dans les infections transmises par voie sexuelle pouvant conduire aux cancers notamment du col utérin.
En thérapeutique humaine, ladite composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus, est proposée pour une administration selon une posologie d'environ 3 grammes dudit ascorbo-camphorate métallique par jour, par prises fractionnaires éventuellement, chez un être humain adulte.
Selon un autre aspect préféré de l'invention, ladite composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus comprend du tetra-ascorbo- camphorate de zinc qui a été obtenu par un procédé de préparation dans lequel on mélange de l'acide ascorbique à du camphorate de zinc par ajout du camphorate de zinc sous forme de poudre à une solution aqueuse d'acide ascorbique dans un rapport molaire acide ascorbique/camphorate de zinc égal à 4, le mélange étant effectué en milieu dilué correspondant à une quantité d'eau comprise entre 20 et 40 équivalents mL/mmol, en particulier entre 20 et 30 équivalents mL/mmoî, par rapport au camphorate de zinc, le mélange étant maintenu sous agitation, et de préférence sous atmosphère inerte et à l'abri de la lumière, jusqu'à dissolution totale du camphorate de zinc. On peut ensuite récupérer ledit composé tetra-ascorbo-camphorate de zinc sous forme solide en extrayant la partie aqueuse de préférence à froid et sous vide. L'acide ascorbique est de préférence l'acide L-ascorbique. Avantageusement selon l'Invention, le tetra-ascorbo-camphorate de zinc ainsi obtenu, a ensuite été recueilli par lyophilisation. Optionnellement mais préférentiellement, on prépare dans une étape préalable le camphorate de zinc à partir de l'acide camphorîque solubilisé dans un solvant polaire à base d'éthanol ou de l'alcool à 90°, additionné d'un peu d'eau, et on ajoute cette solution camphorîque à une solution aqueuse laiteuse d'oxyde de zinc dans un rapport molaire acide camphorîque /oxyde de zinc égal à 1/1, et on récupère le précipité de camphorate de zinc par extraction du solvant.
L'invention concerne aussi un médicament comprenant un composé ascorbo-camphorate métallique tel que décrit précédemment pour son utilisation dans les traitements préventifs et/ou curatifs des infections virales impliquant au moins un papillomavirus, notamment un papillomavirus humains (HPV), et plus particulièrement un papillomavirus oncogènes, en particulier du génotype HPV-18 ou du génotype HPV-18.
L'invention concerne aussi une méthode de traitement préventif et/ou curatif des infections virales impliquant au moins un papillomavirus, notamment un papillomavirus humains (HPV), et plus particulièrement un papillomavirus oncogènes, en particulier du génotype HPV-16 ou du génotype HPV-18, dans laquelle on administre une composition comprenant un composé ascorbo-camphorate métallique, telle que décrite précédemment. L'invention concerne une méthode de traitement préventif et/ou curatif desdites infections virales comprenant l'administration, avantageusement par application topique, à un sujet en ayant besoin, d'une quantité efficace préventivement ou curativement d'un composé ascorbo-camphorate métallique tel que décrit ou d'une composition comprenant undit composé ascorbo-camphorate métallique telle que décrite précédemment.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique pour son utilisation dans une méthode de traitement préventif et/ou curatif des infections virales impliquant au moins un papillomavirus, notamment un papillomavirus humains (HPV), ledit procédé étant tel que décrit précédemment. Pour plus de détails sur la fabrication d'undit composé ascorbo-camphorate métallique, on peut aussi se référer à la demande de brevet FR2908660. Dans cette demande de brevet, on a décrit des préparations de compositions de dérivés terpéniques, notamment de composés ascorbo-camphorate métalliques, utilisables comme agent anti-microorganisme, mais aucune utilisation destinée aux traitements des infections impliquant les papiliomavirus, virus non enveloppés, n'a été décrite.
D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après d'un exemple particulier selon l'invention comprenant la synthèse d'un composé tetra-ascorbo- camphorate de zinc formé par du camphorate de zinc en mélange avec de l'acide ascorbique, et des tests de cytotoxicité et des résultats expérimentaux pré-cliniques avec le composé obtenu, donnés à titre indicatif mais non limitatif, et à l'aide des figures 1 à 4 annexées décrites plus loin.
[Fig. 1] représente une molécule d'acide L-ascorbique et une molécule d'acide camphorique, et dont les atomes respectifs notamment de carbone porteurs de protons Fl sont numérotés en référence à l'analyse RMN 1H dudit composé décrite plus loin.
[Fig. 2] est un diagramme à barres verticales regroupant les résultats de neutralisation des pseudo-virions VLP-16 (notés aussi PsV-16) par le composé « AC » testé sur des cellules Cos-7, les cellules Cos-7 ayant été pré-traitées par ledit composé « AC » 3 heures avant inoculation des VLP- 16; et par comparaison à des contrôles sur cellules témoins T, par mesure de la densité optique DO sur les pseudo-virions exprimant la luciférase, et en fonction de la dilution dudit composé « AC ».
[Fig. 3] est un diagramme à barres verticales regroupant les résultats de neutralisation des pseudo-virions VLP-16 (notés aussi PsV-16) par le composé « AC » testé sur des cellules Cos-7, l'inoculation des cellules Cos-7 par les VLP-16 étant réalisée de façon contemporaine à l'ajout dudit composé « AC », et par comparaison à des contrôles sur cellules témoins T, par mesure de la densité optique DO sur les PsV-16 exprimant la luciférase, et en fonction de la dilution dudit composé « AC [Fig. 4] représente une structure spatiale possible du tetra-ascorbo- camphorate de zinc en milieu aqueux.
Exemple de préparation d'un composé tetra-ascorbo-campborate de zinc : Une préparation à base d'acide ascorbique, d'acide camphorique et de zinc a été réalisée dans des conditions ambiantes de température et de pression, soit sensiblement 298,15 °K et 105 Pa. Néanmoins, dans certaines phases les mélanges sont légèrement chauffés et agités.
Dans le procédé on part du camphre. Le camphre est généralement obtenu à partir de l'alpha-pinène contenu dans l'essence de térébenthine, laquelle est obtenue à partir du suc résineux qui s'écoule du pin maritime. Ainsi, on transforme l'aipha-pinène en camphre en passant par différents intermédiaires, et notamment, le chlorure de bornyi, le camphène et l'ester organique de l'isobornéol.
On prépare, par oxydation du camphre, l'acide camphorique répondant à la formule chimique suivante : [Chem 1]
Figure imgf000009_0001
On prépare le camphorate de zinc de la manière qui suit. Ainsi, 200 mg d'acide camphorique sont solubilisés dans 1 g d'éthanol à 90°. Ensuite, une quantité de 0,5 g d'eau ultra pure est additionnée au mélange. Puis, ie mélange d'acide camphorique est associé à un oxyde de zinc en solution. Pour cela, 81,3 mg d'oxyde de zinc sont mélangés à 1 g d'eau ultra pure qui, après agitation, forment une solution laiteuse. Le mélange d'acide camphorique précité est lentement versé dans la solution laiteuse. L'ensemble est agité modérément et par intermittence. En outre, entre chaque phase d'agitation, il est légèrement chauffé, par exemple à l'étuve, afin d'accélérer la réaction, il se forme alors un précipité, le camphorate de zinc, qui est récupéré par extraction du solvant, soit par chauffage soit par lyophilisation.
On prépare ensuite le composé tetra-ascorbo-camphorate de zinc de la manière qui suit. On méiange 288 mg (1,09 mMol, 1 éq.) de camphorate de zinc précédemment obtenu, à une solution de 22 mL (20 éq) d'eau pure contenant 770 mg (4,38 mMoi, 4 eq.) d'acide L-ascorbique répondant à la formule chimique suivante :
[Chem 2]
Figure imgf000010_0001
De préférence, le mélange s'effectue à une température inférieure à 298,15 °K (soit 25°C), et modérément agité, sous atmosphère inerte (sous gaz argon) et à l'abri de la lumière afin d'éviter l'oxydation de l'acide ascorbique. Au bout d'une heure on ajoute 10 mL (10 éq.) d'eau pour achever la dissolution du camphorate de zinc en laissant le mélange sous agitation modérée encore pendant 2 heures. Les quantités exprimées en « éq. » correspondent aux équivalents molaires ou rrsL/mmol par rapport au camphorate de zinc. Durant l'agitation, soit au total pendant 3 heures, la totalité du camphorate de zinc se dissout et réagit avec l'acide ascorbique dissout pour former alors un composé tetra-ascorbo-camphorate de zinc en solution.
Ledit composé tetra-ascorbo-camphorate de zinc dissout est récupéré sous forme de poudre par lyophilisation à froid, c'est-à-dire en extrayant le solvant (eau) sous vide et à froid.
Une récupération par chauffage et évaporation du solvant est à proscrire pour éviter l'oxydation de l'acide ascorbique.
Le composé obtenu est à conserver à l'abri de la lumière. Ledit composé tetra-ascorbo-camphorate de zinc sera mentionné simplement sous le terme « ascorbo-camphorate» ou sous l'abréviation « AC » dans la suite de la description de l'exemple.
La proportion moléculaire de la partie du composé provenant de l'acide ascorbique par rapport à celle provenant du camphorate peut être déterminée par exemple par des analyses RMN du proton 1H. Ces analyses par RMN du proton 1H de la poudre récupérée montrent que quatre moles d'acide ascorbique pour une mole de camphorate de zinc conduisent à un composé stable présentant un signai vers 4,6Sppm qui lui est typique. [Fig. 1] représente une molécule d'acide L-ascorbique et une molécule d'acide camphorique, et dont les atomes respectifs notamment de carbone porteurs de protons H sont numérotés en référence à l'analyse RMN 1H dudit composé décrite ci-après.
Les spectres RMN ont été réalisés sur un spectromètre BRUCKER Avance DPX-300 (aimant de 7,05 Tesia) équipé d'une sonde de mesure QNP 1 H/13C/31 de 5 mm de diamètre, avec gradient Z et iock 2H. L'analyse RMN du proton 1H a été conduite sur une solution de 15 mg de produit dans 500 μL de D20 (eau deutérée à 99,8%).
Le tableau 1 suivant répertorie les déplacements chimiques des protons 1H (en ppm) pour des échantillons de l'acide camphorique et de l'acide L- ascorbique seuls, et du composé tetra-ascorbo-camphorate de zinc obtenu, étudiés par RMN du proton 1H à 27°C, les numéros des atomes indiqués dans la première colonne du tableau correspondant respectivement à un atome de carbone lié au proton considéré, selon la numérotation portée sur les structures des molécules respectives de l'acide ascorbique (déplacements en deuxième colonne du tableau) et de l'acide camphorique (déplacements en troisième colonne du tableau) représentées sur la figure 1 , Les déplacements pour le composé « AC » sont mentionnés en quatrième colonne du tableau en lien avec les atomes issus des molécules d'acide ascorbique et d'acide camphorique. [Table 1]
Figure imgf000012_0001
s :singulet ; d : doublet ; dd : doublet de doublet ; ddd doublet de doublet de doublet, ; td : triplet de doublets.
Le signal vers 4,65ppm est typique du composé « AC ». On peut vérifier le nombre de molécules d'acide ascorbique ayant interagit avec une molécule de camphorate de zinc, c'est-à-dire le rapport molaire acide ascorbique/camphorate, en calculant un rapport d'intégration par comparaison de la valeur d'intégration correspondant au proton H de l'acide ascorbique donnant un signal à 3,95 ppm, intégrant pour un proton (proton unique porté par le carbone numéroté 6 de l'acide ascorbique sur la figure 1, à la valeur d'intégration du groupe méthyle donnant un signai vers 0,73 ppm du camphorate intégrant pour trois protons (protons portés par le carbone numéroté 9 de l'acide camphorique sur la figure 1 ). Ainsi compte tenu des incertitudes expérimentales, quand ie rapport molaire acide ascorbique/camphorate est déterminé par analyse RMN du proton 1H par calcul dudit rapport d'intégration (H à 3,95 ppm de l'acide ascorbique ; 3H du camphorate vers 0,73ppm) comme décrit ci-dessus, on considère que ie composé obtenu est comme présentant un rapport molaire acide ascorbique/camphorate égal à 4, et donc conforme, si ce rapport d'intégration est compris entre environ 3,5 et 4,5.
Différents essais en lien avec des analyses par RMN du proton 1H comme indiquées ci-dessus ont de plus montré que la synthèse du composé « AC » lors du mélange de l'acide ascorbique avec le camphorate de zinc est favorisée en milieu relativement dilué, soit préférentiellement pour un volume d'eau situé entre 20 et 40 équivalents mL/mmoi , en particulier entre 20 et 30 équivalents ml/mmol, par rapport au camphorate de zinc. On obtient alors directement, sans la nécessité d'une étape de purification ultérieure, un composé tetra-ascorbo- camphorate de zinc stable par réaction de quatre moles d'acide ascorbique pour 1 mole de camphorate de zinc.
La formule brute du tetra-ascorbo-camphorate de zinc est 4(C6H6O6)Zn(C10H14O4). Le composé peut néanmoins former un certain nombre d'hydrates.
[Fig. 4] représente une structure spatiale possible du tetra-ascorbo- camphorate de zinc en milieu aqueux.
Cytotoxicité du composé tetra-ascorbo-camphorate de zinc obtenu : La cytotoxicité dudit composé ascorbo-camphorate de zinc esi contrôlée grâce au test au MTT de la société Sigma. L'étude de cytotoxicité est conduite sur trois types de cellules sur des cellules Vero, sur des cellules diploïdes humaines MRC5 (de type fibroblastes embryonnaires humains), et par ailleurs sur des cellules Cos-7. Des cultures de ces cellules sont traitées avec des compositions contenant ledit ascorbo- camphorate en solution dans l'eau, à différents taux de dilution, et le réactif MTT est alors ajouté à chacune des solutions. Ce dernier forme des cristaux avec les cellules vivantes hautement métaboliques. L'absorbance à 490 nm des cristaux dissous correspond au nombre de cellules vivantes. Par comparaison avec des cellules de même lignée, cultivées mais non traitées, on obtient un pourcentage de survie révélant la toxicité dudit composé ascorbo-camphorate. Pour cela on réalise une solution mère ayant une molarité de
0,05155 M en dissolvant 0,5 g dudit ascorbo-camphorate obtenu ci- dessus dans 10ml d'eau.
On dilue ladite solution mère à différents taux, de un dixième à un milliardième de sorte qu'on obtient une série de solutions diluées ayant des molarités respectives comprise entre 5,15.10-5 μM et 5155 μM.
Dans une première série de tests, on vérifie la cytotoxicité dudit ascorbo-camphorate sur des cellules Vero avec ces solutions à des taux de dilution allant du dixième au milliardième.
Les tests sur la viabilité des cellules Vero montrent que le pourcentage de cellules vivantes restantes est supérieur ou égal à 50 % pour une dilution au cinquantième. Les solutions tolérables par les cellules Vero sont donc celles ayant un taux de dilution compris entre un cinquantième et un milliardième (valeur incluse), ou autrement dit les solutions ayant une molarité en ledit ascorbo-camphorate comprise entre 5,15.10-5 μM (valeur incluse) et 1031 μM (valeur exclue).
Dans une deuxième série de tests, on vérifie la cytotoxicité dudit ascorbo-camphorate sur des cellules MRC5 avec les solutions à des taux de dilution allant de 0 au 100 millionièmes.
Les tests sur la viabilité des cellules MRC5 montrent que le pourcentage de cellules vivantes restantes est supérieur ou égal à 50 % pour une dilution au dixième. Les solutions tolérables par les cellules MRC5 sont donc celles ayant un taux de dilution compris entre un dixième et 100 millionièmes (valeur incluse), ou autrement dit les solutions ayant une molarité en ledit ascorbo-camphorate comprise entre 5,15.10-4 μM (valeur incluse) et 5155 μM (valeur exclue).
Dans une troisième série de tests, on vérifie la cytotoxicité dudit ascorbo- camphorate sur des cellules Cos-7. Des concentrations élevées dudit ascorbo-camphorate peuvent être nécessaires pour produire une formulation efficace. Par conséquent, la toxicité intrinsèque de concentrations dudit ascorbo-camphorate allant jusqu'à 5 000 μg/mL a été évaluée en utilisant un test colorimétrique de viabilité cellulaire. Les cellules COS-7 ont été exposées à des dilutions sérielles de la solution mère dudit ascorbo-camphorate pendant 24 heures. L'indice de viabilité, ou la fraction de cellules viables après le traitement microbicide par rapport à la fraction de cellules viables exposées à l'état de témoin, a été calculé. Les cellules traitées par une solution de PBS-azide 0,1 % ont été utilisées comme contrôle positif de la toxicité. L'indice de viabilité, ou la fraction de cellules viables après le traitement avec le composé « AC » par rapport à la fraction de cellules viables exposées à l'état naturel, a été calculé. Ledit tetra-ascorbo- camphorate de zinc a présenté des indices de viabilité de 0,8 à 1,1 à toutes les concentrations testées, ce qui indique qu'il est largement non toxique. La concentration cytotoxique à 50% (CC50) dudit ascorbo- camphorate a été calculée à l'aide d'une analyse dose-réponse-inhibition sur le logiciel GraphPad Prism v5.04 (de la société GraphPad Software ). Elle est estimée supérieure à 0,00515 M. Evaluation pré-clinique de l'activité antiviraie in vitro dudit îetra-ascorbo- camphorate de zinc obtenu contre le virus HPV-16 :
L'évaluation de l'activité antivirale dudit composé de dérivé terpénique « AC » in vitro contre le virus papillomavirus HPV-16, est réalisée par des tests de neutralisation de l'entrée des pseudo-particules virales (VLP-16), du virus HPV-16 qui seront inoculées à des cellules Cos-7, prétraitées ou traitées contemporainement à l'inoculation des VLP16 par des solutions de concentrations croissantes en ledit composé ascorbo-camphorate (AC).
Les solutions aqueuses dudit composé ascorbo-camphorate qui ont été décrites ci-dessus, présentant une cytotoxicité tolérable, ayant un taux de dilution compris entre 1/102 (un centième) et 1/108 (100 millionièmes), c'est-à-dire ayant une molarité en ledit ascorbo-camphorate comprise entre 5,15.10-4 μM (valeur incluse) et 515,5 μM (valeur incluse), sont retenues pour cette évaluation.
Les virus HPV-16 ne se cultivant pas, il est connu d'utiliser des pseudovirions pour tester de potentiels agents anti-viraux. La méthodologie de production de ces vecteurs est connue en soi, et ne fait pas l'objet de la présente invention.
La production des VLP peut par exemple s'effectuer comme décrit dans l'art antérieur [ voir par exemple Buck CB, Thompson CD. Production of papillomavirus-based gene transfer vectors. Curr Protocol Celi Biol. 2007 Dec; Chapter 26:Unit 26.1.] en utilisant le protocole de production de vecteurs (pseudovirions) à base de papillomavirus, édité par le Laboratoire d'oncologie cellulaire du Centre de recherche sur le cancer (National Cancer Institute, National Institute of Health, Rockville Pike, Bethesda, Maryland, USA), ( voir par exemple le site internet : https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/LCOTF/PseudovirusProductio n). En bref selon ce protocole, des cellules 293TT sont transfectées avec chacun des vecteurs plasmidiques que forment les protéines structurales L1/L2, et incubées pendant 72 heures à +37°C. Les cellules sont ensuite lysées dans un tampon (0,5% Nonidet™ P 40 Substitute/1X PBS, Sigma- Aidrich, Saint-Louis, Missouri, USA) avant d'être soniquées trois fois pendant des cycles de 15 secondes pour briser la membrane nucléaire et libérer ainsi les VLP. Les extraits nucléaires obtenus sont urifiés par ultracentrifugation à 30500 tr/min (rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket, Beckman Couiter, Inc., Brea, CA, USA) pendant 28 heures à +4°C dans un gradient de chlorure de césium (CICs). La fraction contenant les VLP est récupérée et diluée dans 300 μL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco (Thermo Fisher Scientific, Waitham, MA, USA) et stockée à +4°C avant d'être utilisée pour des analyses sérologiques. Les pseudovirions peuvent en outre s'acheter directement auprès de laboratoires connus dans le métier. Dans le cas des présents tests, les pseudovirions ont été produits à l'Université François Rabelais de Tours (France), sous la direction du Professeur A. Touzet. En résumé, les pseudo-particules virales VLP-16 ont été produites par transfection de plasmides purifiées contenant les protéines structurales L1 et L2 des capsomères du HPV-16, et transportant un gène codant pour la luciférase, gène marqueur, sur culture de cellules de la lignée cellulaire 293. Les VLP-16 ont été recueillis par lyse des noyaux, leur purification s'effectuant par ultracentrifugation en gradient de CeCl2. Le contrôle positif du test de neutralisation utilise un inoculum de VLP-16 purifié, pré-incubé avec des anticorps purifiés contre les HPV (incubation pendant 1 heure dudit lysat nucléaire des VLP dans une solution d'anticorps anti-HPV en milieu de culture DMED). Ces anticorps anti-HPV servent de contrôle positif dans le test de neutralisation en plaque de l'infection des cellules Cos-7 par des VLP-16.
La culture des cellules de la lignée cellulaire Cos-7 est réalisée sur micropiaque 96 puits, 5%C02 et 98%H20, à 37°C.
On réalise l'inoculation des cellules Cos-7 comme suit: le mélange formant l'inoculum est ajouté dans les puits contenant les nappes confluentes de Cos-7, avec mise en incubation pendant 72 heures à 37°C,
5%C02 et 98%H20, puis on lave et on élimine le surnageant de ce mélange.
On récupère les cellules Cos-7 ayant éventuellement internalisé les VLP exprimant la luciférase. Les cellules Cos-7 sont alors lysées ; puis le substrat (luciférlne) du gène rapporteur (luciférase) est ajouté avec incubation à l'obscurité, pour lecture en utilisant un luminomètre.
On révèle ainsi l'efficacité du traitement par luminométrie (mesure de la densité optique, du fait de la réaction de bioluminescence due à la luciférase, cette méthode étant connue en soi). L'absorbance (densité optique) diminue proportionnellement à l'efficacité de la neutralisation par le composé ascorbo-camphorate. Les témoins positifs consistent i) en des puits pourvus de Cos-7 qui seront exposés à des VLP-16 sans pré-incubation avec le principe actif à tester « AC » ; et ii) en une molécule du laboratoire de type lectine connue pour inhiber l'infection des cellules Cos-7 par des VLP. [Fig. 2] est un diagramme à barres verticales regroupant les résultats de neutralisation des pseudo-virions VLP-16 (notés aussi PsV-16) par le composé « AC » testé sur des cellules Cos-7, les cellules Cos-7 ayant été pré-traitées par ledit composé « AC » 3 heures avant inoculation des VLP- 16; et par comparaison à des contrôles sur cellules témoins T, par mesure de la densité optique DO sur les pseudo-virions exprimant la luciférase, et en fonction de la dilution dudit composé « AC ». A noter que pour plus de clarté de lecture sur le diagramme, les dilutions du composé « AC » sont écrites avec l'inverse du quantième du taux de dilution, par exemple une dilution au centième est écrite 102. Les taux de dilution de la solution du composé « AC » vont de 1/108 à 1/102.
L'inhibition de l'internalisation des VLP-16 par le composé ascorbo- camphorate comprend une phase de plateau caractérisée par un effet neutralisant assez faible mais constant, avec l'augmentation de la concentration du composé ascorbo-camphorate dans le milieu, puis on observe une inhibition totale de l'internalisation des VLP-16 à la dilution du composé ascorbo-camphorate de 1/102 (soit une molarité de 515,5 μM en composé « AC »).
Ces résultats montrent clairement que la neutralisation en plaque des cellules Cos-7 a très bien fonctionné (témoin lectine inhibiteur positif). Lors du prétraitement des cellules Cos-7 avec le composé « AC » avant inoculation des VLP-16, ledit composé « AC » inhibe de 30 à 40% la pénétration des VLP-16 dans les cellules Cos7 par rapport aux contrôles des cellules témoin Cos-7 infectées par des VLP-16 non traités par le composé « AC ». [Fig. 3] est un diagramme à barres verticales regroupant les résultats de neutralisation des pseudo-virions VLP-16 (notés aussi PsV-16) par le composé « AC » testé sur des cellules Cos-7, l'inoculation des cellules Cos-7 par les VLP-16 étant réalisée de façon contemporaine à l'ajout dudit composé « AC », et par comparaison à des contrôles sur cellules témoins T, par mesure de la densité optique DO sur les PsV-16 exprimant la luciférase, et en fonction de la dilution dudit composé « AC ». A noter que pour plus de clarté de lecture sur le diagramme, les dilutions du composé « AC » sont écrites avec l'inverse du quantième du taux de dilution, par exemple une dilution au centième est écrite 102. Les taux de dilution de la solution du composé « AC » vont de 1/108 à 1/102 Ces résultats montrent que l'inoculation des cellules Cos-7 par les VLP-16 de façon contemporaine à l'ajout du composé « AC » permet d'obtenir une inhibition jusqu'à 33% de la pénétration des VLP-16 dans les cellules Cos- 7, par rapport aux contrôles des cellules Cos 7 infectées par des VLP-16 non traités par le composé « AC », les 33% étant obtenus pour une concentration dudit composé ascorbo-camphorate à la dilution 1/103 (molarité de 51 ,5μM en composé). On observe une inhibition totale de l'internalisation des VLP-16 à la dilution du composé ascorbo-camphorate de 1/102 (soit une moiarité de 515,5 μM en composé « AC »).
Cette inhibition par ajout du composé « AC » de façon contemporaine à l'inocuiation paraît moins importante que lors du prétraitement des cellules Cos-7 avec le composé « AC » avant inoculation des VLP-16, ce qui suggère un mécanisme d'inhibition très précoce de la pénétration des pseudo-particules virales dans les cellules Cos-7.
D'autres essais pré-cliniques ont été menés pour confirmer l'activité antivirale in vitro dudit tetra-ascorbo-camphorate de zinc obtenu contre ie virus HPV-16. Les essais ont été conduits de manière similaire à celle qui vient d'être décrite avec des pseudivirions : une série d'essais a été réalisée en prétraitant les cellules Cos-7 avec le tetra-ascorbo-camphorate de zinc trois heures avant l'inoculation des pseudovirions VLP-16, et une autre série d'essais a été réalisée en ajoutant le tetra-ascorbo-camphorate de zinc contemporainement à l'inoculation des pseudovirions aux cellules Cos-7. Pour chaque série, les expériences ont été triplées. Pour évaluer l'infectivité des pseudovirions , l'expression linéaire du gène rapporteur et pour effectuer le titrage des solutions de pseudovirions, des cellules COS-7 ont été cultivées (104 celiuies/puits) dans du DMEM supplémenté dans des plaques de 96 puits (Thermo Fisher Scientific) dans 5% de CQ2 à +37°C jusqu'à ce que la confluence des cellules soit de 40-50%. Les cellules ont été transduites en remplaçant le milieu de culture par du DMEM frais non supplémenté contenant des dilutions sérielles des solutions mères de PsVs produites précédemment et incubées à +37°C. Un puits contenant 1 μg du vecteur pGL4.10[luc2], codant le gène rapporteur de la luciférase, a été constitué comme contrôle positif, et un autre a constitué le contrôle cellulaire pour la luminescence de fond (sans PsV ni plasmide rapporteur). Après une période d'incubation de 3 heures, 100 pi de milieu de croissance ont été ajoutés à chaque puits et les cellules COS-7 transduites ont été incubées pendant 48 heures à +37°C dans 5% de C02. Ensuite, le milieu de croissance a été retiré et les cellules COS-7 transduites ont été lavées avec du DPBS et incubées dans l'obscurité, pendant 15 minutes, dans 100 μL de la solution Pierce™ Firefly Luciferase One-Step Glow Assay (Thermo Fisher Scientific). Les lysats cellulaires obtenus ont été récoltés et transférés dans des microplaques blanches à 96 puits et l'activité enzymatique de la luciférase a été mesurée à l'aide du luminomètre de marque Luminoskan Ascent (de la société Thermo Fisher Scientific) après avoir ajouté 50 μL de substrat de luciférine dans chaque puits. Les dilutions de pseudovirions qui ont donné au moins 80 % de la luminescence du contrôle positif, après ajustement avec la luminescence de fond, ont été sélectionnées comme convenables et donc choisies comme dilutions de travail pour les expériences de neutralisation.
Des dilutions sérielles de la solution mère du composé « AC » couvrant une plage de concentrations appropriée ont été soumises à un test d'inhibition du papillomavirus basé sur les pseudovirions VLP-16. Des cellules COS-7 ont été pré-plaquées (104 cellules/puits) dans du DMEM supplémenté dans des plaques à 96 puits et incubées pendant 24 heures dans 5% de C02 à +37°C.
Dans la première série d'essais, les cellules COS-7 ont été préincubées pendant 3 heures dans la série de dilutions du composé « AC » (« AC » dilué dans du DMEM non supplémenté). Après le temps de préincubation, les dilutions de « AC » ont été retirées et remplacées par des pseudovirions VLP-16 dilués dans du DMEM non supplémenté.
Dans ia deuxième série d'essais, la solution mère de « AC » et la solution mère de pseudovirions VLP-16 ont été mélangées ensemble, dans un même tube, avec du DMEM non supplémenté, jusqu'à atteindre ia concentration souhaitée de « AC » et de pseudovirions VLP-16 dans l'inoculum (100 μL). Les cellules infectées ont été cultivées pendant une nuit à +37°C, puis alimentées avec 100 μL de DMEM supplémenté. Après 24 heures supplémentaires de croissance à ÷37°C, le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées avec du DPBS et incubées à l'obscurité, pendant 15 minutes, dans 100 μL de ia solution « Pierce™ Firefly Luciferase One-Step Glow Assay » ( de la société Thermo Fisher Scientific). Les lysats cellulaires ont été récoltés et transférés dans une microplaque blanche à 96 puits et l'activité enzymatique de ia luciférase a été mesurée comme décrit précédemment. Un puits de contrôle négatif (pas d'inhibition du signal luminescent) contenant 1 μg de pGL4.10[luc2], et un puits contenant uniquement des cellules COS-7 (sans pseudovirions ni plasmide rapporteur) pour le contrôle de la luminescence de fond, ont été constitués. L'inhibition du signai de luminescence de plus de 80 % a été considérée comme une inhibition efficace de la transduction des pseudovirions dans les cellules COS-7.
Un pool de sérums provenant d'individus ayant reçu trois doses du vaccin contre les papillomavirus commercialisé sous le nom déposé Gardasil-9® (de ia société Merck & Co. Inc.) a constitué le contrôle positif pour le test d'inhibition basé sur les pseudovirions VLP-16 (inhibition du signal de luminescence de plus de 80 %). Pour ces essais, la concentration inhibitrice 50 (IC50), correspondant à la concentration du composé « AC » qui induit une inhibition de 50 % de l'activité des pseudovirions VLP-16 sur les cellules COS-7 a été calculée à l'aide d'une analyse dose-réponse-inhibition sur le logiciel GraphPad Prism v5.04 (de la société GraphPad Software ).
Les indices thérapeutiques (Tl = CC50/IC50) ont été calculés, la concentration cytotoxique CC50 ayant été déterminée lors des tests de cytotoxicité sur les cellules Cos-7.
Dans le cas de la série des essais avec pré-traitement des cellules Cos-7 par le composé « AC », la concentration inhibitrice 50 (IC50) a été estimée à 2,8 μg/mL (2,9 μM) de « AC », et les indices thérapeutiques Tl varient de >960 à >3330.
Dans le cas de la série des essais où les pseudovirions ont été ajoutés simultanément aux dilutions sérielles de « AC », la concentration inhibitrice 50 (IC50) estimée est de 8,1 μg/mL (8,3 μM) de « AC » et les indices thérapeutiques T! varient de >410 à >820.
Le prétraitement des cellules COS-7 par le composé « AC » avant l'ajout des peudovirions est associé à une activité anti-HPV plus puissante que l'utilisation simultanée du composé « AC » et des peudovirions, ce qui vient confirmer que le composé « AC » agirait aux premiers stades de l'infection virale en empêchant la fixation des HPV sur les sites de liaison dans les cellules cibles, plutôt qu'en agissant directement sur les événements de post adsorption virale
On peut penser que la configuration spatiale du composé « AC » (voir figure 4), est capable de modifier la reconnaissance spécifique du virus avec sa cellule hôte lors de la première étape de l'Infection. De plus , d'après les essais d'inhibition, on peut aussi penser que la composition aqueuse du composé « AC » pourrait interagir avec les protéines L1 et L2 des pseudovirions du HPV-16 et influencer leur capacité à se lier aux cellules Cos-7, du fait que les quatre groupements provenant de l'acide ascorbique à haute polarité permettent probablement à la molécule d'être solubilisée dans des environnements aqueux ou physiologiques, fournissant du Zn2+-camphorate ou des espèces hydratées de zinc- camphorate, qui sont très réactives avec les protéines.
Cette propriété de forte inhibition de l'adsorption des pseudovirions VLP- 16 lorsque le composé « AC » est appliqué en anticipation de l'exposition aux pseudovirions confirme notamment l'utilité de ce composé, notamment par application topique, pour prévenir l'acquisition du HPV chez les personnes, notamment les femmes, sexuellement exposées. Selon l'invention, la stabilité dudit composé tetra-ascorbo-camphorate de zinc permet de fournir une composition qui comprend une quantité active fiable et répétitive du principe actif, notamment du principe majeur qui repose sur le camphorate.
L'invention répond ainsi au besoin de longue date d'avoir une composition hors vaccins pour des traitements préventifs et/ou curatifs des infections par les papillomavirus. L'invention présente des caractéristiques en référence à celles citées précédemment dans la description et les revendications, à l'un quelconque des modes de réalisation, variantes, avantages, préférences, ou exemples de l'invention, prises seule ou selon l'une quelconque de leurs combinaisons.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus, notamment au moins un papillomavirus humain, comprenant au moins un composé ascorbo-camphorate métallique.
2. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite infection implique au moins un papillomavirus oncogène.
3. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit papillomavirus oncogène est du génotype HPV-16 ou du génotype HPV-18.
4. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit composé ascorbo- camphorate métallique est soluble dans un solvant aqueux.
5. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit composé ascorbo- camphorate métallique est un composé tetra-ascorbo-camphorate métallique.
6. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit composé ascorbo- camphorate métallique comprend un ion métallique choisi parmi ceux des métaux du groupe comprenant le zinc, le cuivre et le magnésium.
7. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit composé ascorbo- camphorate métallique est le tetra-ascorbo-camphorate de zinc.
8. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend un solvant aqueux physiologiquement acceptable,
9. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit solvant est constitué par de l'eau ou par un mélange eau-alcool, et dans lequel ledit composé ascorbo- camphorate métallique est sous forme dissoute.
10. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle est sous une forme galénique pour une application sur la peau et/ou les muqueuses.
11. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou 10, caractérisée en ce qu'eile est sous une forme galénique solide.
12. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un excipient physiologiquement acceptable et qu'elle est sous une forme galénique pour un usage par voie vaginale, en particulier d'un ovule ou d'une capsule.
13. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour une administration selon une posologie d'environ 3 grammes dudit ascorbo-camphorate métallique par jour, par prises fractionnaires éventuellement, chez un être humain adulte.
14. Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un papillomavirus selon la revendication 7 ou selon la revendication 7 et l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisée en ce que le tetra-ascorbo-camphorate de zinc a été obtenu en mélangeant de l'acide ascorbique à du camphorate de zinc par ajout du camphorate de zinc sous forme de poudre à une solution aqueuse d'acide ascorbique dans un rapport molaire acide ascorbique/camphorate de zinc égal à 4 , le mélange étant effectué en milieu dilué correspondant à une quantité d'eau comprise entre 20 et 40 équivalents mL/mmol par rapport au camphorate de zinc, en particulier entre 20 et 30 équivalents mL/mmol, le mélange étant maintenu sous agitation, et de préférence sous atmosphère inerte et à l'abri de la lumière, jusqu'à dissolution totale du camphorate de zinc,
15, Composition pour utilisation dans le traitement préventif et/ou curatif d'une infection impliquant au moins un paplllomavirus selon la revendication 14, caractérisée en ce que le tetra-ascorbo-camphorate de zinc ainsi obtenu, a ensuite été recueilli par lyophilisation.
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