KR20140044545A - 구연산, 아연 및 ｌ-아르기닌을 포함하는 항 바이러스제 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 활성성분으로서 구연산, 아연 및 Ｌ-아르기닌을 치료학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 항 바이러스제 조성물에 관한 것이다.

Description

구연산, 아연 및 Ｌ-아르기닌을 포함하는 항 바이러스제 조성물{Antiviral Composition comprising Citric acid, Zinc andL-Arginine}
본 발명은 항 바이러스제 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 활성성분 으로서 구연산, 아연 및 L-아르기닌을 치료학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 항 바이러스제 조성물에 관한 것이다.
파필로마 바이러스는 동물의 여러 조직의 상피세포에 감염하여 손, 발, 피부, 후두 등에 흔히 사마귀로 불리우는 양성 종양을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이들 파필로마 바이러스는 현재 인간에 있어서 100여 종류 정도의 유전자형이 밝혀져 있는데, 여러 유전자형이 그 감염조직에 대해 특이성을 나타내고 다양한 질병을 유발하는 것으로 보고된 바있다(Broker et al. Cold Spraing Harbor Laboratory, 1989, p17.).
이러한 여러 유전자형의 파필로마 바이러스 대부분은 치료가 잘 이루어지지 않아서 감염 환자에게서 심한 통증 등을 유발시키지만 치명적인 질병을 유발하지 않았기 때문에 주목되지 않았다.
그러나, 최근 들어 이 바이러스의 특정형, 특히 사람 파필로마 바이러스 16형과 18형은 남녀 생식기, 구강, 피부 등에서의 악성 종양과 관련되며 여성 자궁암의 90% 이상을 차지하는 자궁경부암을 일으키는 주요 인자로 작용할 뿐 아니라, 6b형과 11형은 곤지름(또는 성기 사마귀, condyloma acuminata)으로 명명된 남녀 생식기의 양성 종양을 유발하는 것으로 밝혀졌다.
또한 역학조사 결과, 자궁암이 주로 성적접촉에 의해 전파되는 인자에 의해 발생된다는 것이 제시되었으며(Durst et al. Natl. Acad. Sci., 1983, Vol. 80, p3812.), 자궁내막상피이상증(cervical intraepithelial neoplasm, CIN)으로 명명된 전구암 병소의 85 내지 100%가 파필로마 바이러스에 의한감염으로 유발되었다는 점 등, 파필로마 바이러스에 의한 감염으로 자궁암이 유발된다는 많은 증거들이 제시되어 있다(Hansen, H., Science, 1991, Vol. 254, p1173.).
또한, 자궁암 환자에서 사람 파필로마바이러스 16형과 18형의 감염율은 일반적으로 16형이 50 내지 70% 정도에 이르고 18형은 15 내지 25%에 이르는 것으로 보고되어 있다. 그러나 전이암의 경우에는 16형에 감염된 암환자의 25%,그리고 18형에 감염된 암환자의 50% 이상이 전이암 환자인 것으로 조사되었다(Lorincz et al. Obstetrics and Gynecology, 1992, Vol. 79, p328.).
따라서, 파필로마 바이러스로 발생하는 여러 질병 대한 예방 및 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 구연산, 아연 및 L-아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 두 가지 이상을 활성성분으로 포함하는 조성물이 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도하여 암세포를 사멸시키는 활성을 나타낸다는 것을 발견하였
다 (대한민국 특허출원 제 2002-0067291호, 제 2002-0067293호 및 제 2002-0081951호 참조). 이를 토대로 하여 본 발명자들은 상기 조성물의 항암 효과에 대한 연구를 거듭한 결과 구연산, 아연 및 L-아르기닌을 동시에 포함하는 조성물이 파필로마 바이러스에 의한 감염으로 자궁암이 유발된 세포에서 발현되는 파필로마 바이러스의 단백질을 감소시킨다는 사실을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서, 본 발명은 활성성분으로서 구연산, 아연 및 L-아르기닌을 치료학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유함을 특징으로 하는 항 바이러스제 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 구연산, 아연 및 L-아르기닌을 활성성분으로 포함하는 항 바이러스제 조성물은 파필로마 바이러스의 단백질 발현을 억제시키는 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 항 바이러스제 조성물은 파필로마 바이러스에 의한 질병을 치료하는데 유용될 수 있다.
도 1은 자궁암 세포주인 Ca Ski, HeLa 및 C-33 A에 본 발명의 항 바이러스제 조성물을 처리하여 사람 파필로마 바이러스 16형 또는 18형의 E6 단백질 발현이 감소되는 것을 관찰한 것이다.
도 2는 자궁암 세포주인 Ca Ski, HeLa 및 C-33 A에 본 발명의 항 바이러스제 조성물을 처리하여 사람 파필로마 바이러스 16형 또는 18형의 E7 단백질 발현이 감소되는 것을 관찰한 것이다.
도 3은 본 발명의 항 바이러스제 조성물이 자궁암 세포주인 Ca Ski(■), HeLa(◆) 및 C-33 A(▲)에 미치는 영향을 MTT 검정을 통한 세포 생존율로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 항 바이러스제 조성물을 곤지름이 유발된 여성 환자의 외음부에 도포하여 곤지름의 치료를 관찰한 것이다.
본 발명은 활성성분으로서 구연산, 아연 및 L-아르기닌을 치료학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유함을 특징으로 하는 항 바이러스제 조성물을 제공함을 특징으로 한다.
상기 항 바이러스제 조성물은 활성성분으로서 구연산을 조성물 전체 중량당 0.001 내지 10중량%, 바람직하게는 0.01 내지 5중량%로 함유하고, 아연을 조성물 전체 중량당 0.0001 내지 5중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1중량%로 함유하고, L-아르기닌은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 5중량%로 함유하며, 이에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 한다. 상기 항 바이러스제 조성물에 사용되는 담체는 제약 분야에서 통상적으로 사용하는 담체, 보조제 또는 비이클을 포함한다.
본 발명에 따른 항 바이러스제 조성물의 활성성분으로서 사용되는 구연산, 아연 및 L-아르기닌은 하기와 같은 형태로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 구연산은 다양한 식물의 씨 또는 과즙 속에 유리 상태로 존재하는 구연산을 추출하여 사용할 수 있다. 또한 구연산은 곰팡이인 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)를 이용한 표면 발효 방식(surface fermentation process) 또는 액내 발효 방식(submerged fermentation process)에 의해서도 제조되는데 이 또한 본 발명의 조성물에 이용할 수 있다.
상기 구연산의 생산공정에는 당밀이 당함유 원료원으로 이용되고 노즐형 원심분리기, 자동배출형 원심분리기, 데칸타와 같은 다양한 원심분리기가 활용된다.
본 발명에서 사용되는 아연은 굴, 갑각류, 생선, 붉은 고기 같은 동물성 식품 및 알곡과 콩류, 견과류, 씨앗류 같은 다양한 식물성 식품에 충분한 농도로 함유되어 있는 것을 추출하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 아연의 형태는 매우 다양한데 대부분의 임상 연구들에서는 황산염 아연을 사용해 왔지만, 인체는 여타의 형태들도 잘 흡수하고 이용한다. 그러한 예에는 피콜리네이트(picolinate)와 아세테이트, 구연산염, 글리세린산염 또는 모노메티오닌과 아연과의 결합 형태 등이 있다.
본 발명에서 사용되는 L-아르기닌은 발효 또는 단백질로부터의 추출에 의해 제조된 것을 사용할 수 있으나 바람직하게는 발효방법을 이용하여 제조된 것을 사용한다. 발효에 의한 L-아르기닌의 제조방법은 아르기닌 유사체에 대한 내성을 갖는 균주를 사용하는 제조방법 (Agricultural Biological Chemistry, 1972, Vol. 36, p1675; Journal of General Applied Microbiology, 1973, Vol. 19, p339; 일본특허공고 제3391/1973호 및 미합중국특허 제3723249호), 탄소원, 질소원으로부터 직접 L-아르기닌을 생산하는 방법으로서 글루탐산 생산균주인 브레비박테리움 혹은 코리네박테리움속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법 (일본특허공개 소57-163487호, 일본특허공개 소60-83593호 및 일본특허공개 소62-265988호), 세포융합으로 생육 개선된 아미노산 생산균주를 이용하는 방법(일본특허공개소58-158185호) 및 L-아르기닌 생합성 경로에 속하는 유전자 및 벡터 DNA를 함유하는 제조합 DNA를 보유하는 균주를 사용하는 제조방법(일본특허공개 소63-79597호, 일본특허공개 제66989/1985호 및 미합중국특허 제4,775,623호)등이 사용될 수 있다.
상기 열거한 활성성분을 함유하는 본 발명의 항 바이러스제 조성물은 바이러스에 의한 감염으로 유발되는 여러 질병을 예방 또는 치료 할 수 있으며, 바람직하게는 파필로마 바이러스에 의한 감염으로 유발되는 사마귀, 곤지름 또는 자궁암 등을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 항 바이러스제 조성물의 활성은 자궁암 세포주에서 발현되는 파필로마 바이러스의 단백질을 분석하여 증명할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물을 자궁암 세포주에 처리한 후, 상기 암세포에 발현된 단백질을 추출하여 당업계에서 통상적으로 잘 알려진 분자생물학적 방법으로 분석할 수 있다. 본 발명에서 분석하고자 하는 파필로마 바이러스의 단백질은 사람 파필로마 바이러스 16형 또는 18형의 E6 및 E7으로서 자궁암을 유발시키는 항원단백질로 잘 알려져있다.
이에, 본 발명자들은 상기 단백질이 자궁암 세포주에서 감소되는 기전이 본 발명에 따른 항 바이러스제 조성물의 처리에 따른 것임을 증명할 수 있었다.(도 1 및 2 참조).
또한, 본 발명의 항 바이러스제 조성물의 활성은 파필로마 바이러스에 의해 감염되어 성기 주변에 곤지름이 유발된여성 환자에 본 발명의 조성물을 처리하여 곤지름이 치료됨으로 증명할 수 있다(도 4 참조).
따라서, 본 발명의 조성물이 치료 또는 예방할 수 있는 질병은 하기 열거되는 것으로 한정되는 것은 아니지만, 파필로마 바이러스에 의해 감염된 표피가 국부적으로 증식하여 각질이 비후하는 종양인 사마귀; 파필로마 바이러스에 의해 감염된 성기나 항문주위에서 유발되는 곤지름; 및 파필로마 바이러스에 의해 감염된 자궁상피세포에서 유발되는 자궁암인 자궁경부암, 자궁내막암 또는 자궁체부암 등을 예방 또는 치료하는데 유용하다.
본 발명의 항 바이러스제 조성물은 상기 활성성분을 치료학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제조할 수 있다.
본 발명에 함유되는 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로“약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 항 바이러스제 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.
본 발명의 항 바이러스제 조성물은 목적하는 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수있다. 따라서, 본 발명의 항 바이러스제 조성물은 국부, 경구, 비경구, 경피, 직장 또는 장관 등으로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 비내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 심장내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
한편, 본 발명의 항 바이러스제 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 연고 또는 크림으로서 제형화 될 수 있다. 한 양태로서, 본 발명의 항 바이러스제 조성물을 경구용 고형제로 제형화하는 경우, 활성성분과 함께 희석제(예를 들면, 락토즈, 덱스트로, 자당, 셀룰로즈, 옥수수 전분 또는 감자 전분), 활탁제(예를 들면, 실리카, 탈크, 스테아린산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜), 결합제(예를 들면, 전분, 아라빅검, 젤라틴 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐 피롤리돈), 붕해제(예를 들면, 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 나트륨 전분글리콜레이트), 포르말 혼합물, 염료, 감미제, 습윤제(예를 들면, 레시틴, 폴리솔베이트, 라우릴설페이트) 및 일반적으로 약제에 사용되는 약물학적 불활성 물질을 함유할 수 있다. 이들 약제는 공지된 방법, 예를 들면 혼합, 과립화, 타정, 당의 또는 필름-피복 공정의 수단에 의해 제조할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명의 항 바이러스제 조성물은 용액, 유탁액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르 등의 경구 투여용 액상 조성물로 제형화하는 경우, 통상적으로 사용되는 불활성 희석제(예, 정제수, 에탄올)를 포함할 수 있다. 필요할 경우, 액상 조성물은 이외에 보조제, 예를 들면, 습윤제 및 현탁제, 감미제, 향료 방향제 및 방부제를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명의 항 바이러스제 조성물은 비경구적 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액(oily injection suspension)으로 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수 양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.
또 다른 한 양태로서, 본 발명의 항 바이러스제 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 비휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제 제에 유용하다. 앞서 제조된 액상 조성물은 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해, 살균제 또는 방사를 혼입시켜 대개 살균된다.
살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형 조성물을 수득하여 고형화시킬 수 있으며, 사용시에 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.
다른 관점으로서, 본 발명의 항 바이러스제 조성물은 상기 활성성분을 치료학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 경피 투여용으로 제형화 될 수 있다. 용어 "경피 투여"는 약제학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약제학적 조성물에 함유된 치료학적으로 유효한 양의 활성성분이 피부내로 전달되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 경피 제제는 크림제, 연고제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 외용산제, 에어롤제 및 경피흡수제 등을 포함한다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.
대표적으로, 본 발명의 크림제는 콜드 크림, 에몰리엔트 크림, 쉐이빙 크림, 바니싱 크림 및 핸드 크림 등을 포함하며, 일반적으로 스테아르산과 물을 함유하는 수중유형기제(o/w)계로서 도포한 후 물은 증발하고 스테아르산의 엷은 막을 남기는 바니싱 크림이 바람직하게 사용된다. 또한, 콜드 크림이 적합하게 사용될 수 있는 데 이 제제는 세틸, 알코올, 밀납, 백납, 유통 파라핀, 붕산나트륨 및 정제수로 조제된 반고형 백색의 유중수형기제(w/o)형의 제제이다. 본 발명의 연고제는 이에 사용되는 기제의 종류에 따라 탄화수소기제, 흡수기제, 수세가 가능한 기제 및 수용성 기제로 분류될 수 있으나 이들 모두는 제형 분야의 전문가에게 잘 알려져 있는 것으로 본 발명에 포함된다. 본 발명의 로숀제는 현탁성과 유탁성으로 분류되는데 보통 유화제 또는 다른 적절한 안정제를 사용하여 제조한다. 이들 모두는 제형 분야의 전문가에게 잘 알려져 있는 것으로 본 발명에 포함된다.
전술한 내용을 참고하여 본 발명에 따른 경피제의 제조방법을 크림제, 연고제, 겔제 및 파스타제로 예시하여 설명하면 다음과 같다.
경피제로 사용되는 대표적인 것으로 크림제가 있는데, 이 크림제는 알코올류, 밀랍, 솔비탄 모노올레이트 등의 유상(油相)과 솔비톨 용액, 폴리솔베이트, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 글리세린, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 수산화칼륨 및 정제수 등의 혼합용액으로 구성된 수상(水相)을 별도로 65 내지 75℃로 가열하고, 유상을 수상에 서서히 가하면서 교반시켜 조 에멀젼을 형성한다. 이렇게 형성된 에멀젼을 휘발 및 분해가 일어나지 않는 온도로 냉각시켜 균질화한 후 응고할 때까지 일정속도로 교반하면서 수득할 수 있다.
연고제는 대규모 또는 소규모로 제조할 수 있으며 특수한 조제법을 취하는 경우는 그 성분의 성상에 크게 의존하게 된다. 연고제의 소규모 제조시에는 균일한 제제가 얻어질 때가지 연고성분을 여러 가지 방법을 사용하여 혼합하는 연화법(incorporation)이 사용될 수 있으며, 대규모 제조시에는 연고의 전부 또는 일부의 성분을 용융시킨 후 응고할 때까지 일정속도로 교반하면서 냉각시켜 혼합하는 용융법이 사용될 수 있다. 이때, 융해하지 않는 성분은 보통 냉각하면서 혼합하는 과정을 필요로 하게 된다. 일반적으로 열에 불안정한 물질이나 휘발성 물질은 혼합물의 온도가 성분의분해나 휘발시키지 않는 낮은 온도범위에서 연고제를 제조하게 된다.
겔제는 80 내지 90℃로 가열된 정제수에 메토셀을 분산시킨 후 12시간 정도 정치시키고, 정치된 정제수에 겔제 조성물을 분산시켜 분산액을 제조한다. 그런 다음, 수산화나트륨 용액을 분산액에 첨가하여 중성 pH로 조절한다. 이렇게 조성된 분산액에 메틸파라벤, 메토셀, 카르보콜 및 프로필렌 글리콜 등을 혼합하여 겔을 수득하게 된다.
파스타제는 파스타제의 조성물을 막자사발 등 소정 용기에 혼입시켜 분말화한 후 바셀린 등에 균일하게 혼합시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 경피 제형에서 활성 성분인 구연산, 아연 및 L-아르기닌은 공지된 물리적 방법 및 화학적 방법에 의해 피부 내로의 흡수를 촉진할 수 있다. 주로 열, 전기 및 초음파 에너지를 이용하는 물리적 방법이 적합할 수 있으나, 바람직하게는 화학적 방법을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 화학적 방법에서 사용될 수 있는 경피 흡수 촉진제로는 하기 표 1에 수록된 것이 포함된다.
화학적 흡수촉진제 사용 실 예

계면활성
제류

 비이온성 트윈류, 브리이, 스판류, 트리톤 엑스-100, 폴로자이드
음이온성 소듐 라우릴 설파이드
양이온성 N, N-비스(2-하이드록시에틸) 올레일아민
설폭사이드 DMSO, 도데실메틸 설폭사이드(DCMS), DMF
에속시레이트 도데카솔, 헥산소실레이트

용매류
 알콜류 에탄올
폴리올리스 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린
피롤리돈류 PVP, 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈

지방류
 지방산류 올레인산, 리놀렌산, 라우린산, 미리스틴산,
스테아린산, IPM, IPP, 카르린산, 카프린산
지방알콜류 울릴, 라우릴, 스테아릴
지위터리오닉 도데실디메틸아미노프로판 설페이트
아미드 n,n-디에틸-m-타울아미드(DEET)
요소류 요소, 1-도데실우레아, 1,3-디도데실우레아,
1,3-디페닐우레아
데르펜 유칼립톨, 멘톨, 리모네옥사이드
락탐류 라우로카프람(아존)
체라토스 다소듐 EDTA
담즙염 글리코콜레이트, 칼슘-티오글리콜레이트
마크로살리시닉 마크로실라시닉 케톤/락톤
본 발명에 따른 항 바이러스제 조성물과 관련하여 사용되는 용어 “치료학적 유효량”은 본 발명의 항 바이러스제 조성물이 적용되는 질환에 대해 예방 또는 치료 효과를 나타내는 활성성분의 양을 의미한다. 그러므로, 본 발명에 따른 항 바이러스제 조성물의 치료학적 유효량은 환자의 연령, 성별, 적용부위, 투여회수, 투여시간, 제형, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있지만, 일반적으로 주사제의 경우 50 내지 5000㎎, 바람직하게는 100 내지 3000㎎을 1일 1 내지 5회 투여할 수 있으며, 경구 투여제의 경우 일반적으로 1 내지 2,000㎎, 바람직하게는 250 내지 1,000㎎, 가장 바람직하게는 300 내지 500㎎을 1일 1 내지 5회 투여할 수 있다. 또한, 경피제의 경우 일반적으로 약 2 내지 3주 동안 1일 1회 또는 2회 환부에 500 내지 2000㎎을 도포함으로써 예방 또는 치료의 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
<실시예>
실시예 1
주사제
구연산(Sigma, U.S.A.) 2중량%
아연(Sigma, U.S.A.) 0.1중량%
L-아르기닌(Sigma, U.S.A.) 5중량%
멸균수 100% 조성량
적절한 용기에 상기 기재된 함량의 구연산, 아연 및 L-아르기닌(pH 완충작용)과 멸균수 100% 조성량을 배합한 다음 이를 바이알(1000㎎)에 충진하여 본 발명의 항 바이러스제 조성물을 제조하였다.
실시예 2
정제
구연산(Sigma, U.S.A.) 2중량%
아연(Sigma, U.S.A.) 0.1중량%
L-아르기닌(Ajinomoto, Japan) 5중량%
락토즈 30중량%
마그네슘 스테아레이트 5중량%
나트륨 전분 글리콜레이트 10중량%
멸균수 100% 조성량
적절한 용기에 상기 기재된 함량의 구연산, 아연 및 L-아르기닌(pH 완충작용)과 락토즈 30중량%, 마그네슘 스테아레이트 5중량%, 나트륨 전분 글리콜레이트 10중량%, 및 멸균수 100% 조성량을 혼합한 다음 이를 30 내지 60℃로 유지하면서 1시간 동안 교반하고 실온으로 냉각시킨 후 통상적인 정제의 제조 방법에 따라 타정하여 조성물 350㎎을 함유하는 정제를 제조하였다.
실시예 3
경피제의 제조
본 발명의 항 바이러스제 조성물을 경피 제형으로 제조하기 위해 구연산 2중 량%, 아연 0.1중량% 및 L-아르기닌(pH 완충작용) 5중량%을 1ℓ의 에탄올이 채워진 비이커에 용해시킨 후 -20℃에서 24시간 냉동보관하였다. 그 후 상기 비이커에서 앙금을 채취하여 이를 경피 제형의 활성성분으로 사용하였다. 상기 앙금은 10배 정도의 농축률을 갖는다.
(1) 크림제
유상
스테아르산 13중량%
스테아릴 알코올 1중량%
에틸 알코올 1중량%
실시예 3의 앙금 5중량%
수상
글리세린 10 중량%
메틸파라벤 0.1중량%
프로필파라벤 0.05중량%
수산화칼륨 0.9중량%
정제수 100% 조성량
유상과 수상을 별도로 65℃로 가열하고, 유상을 수상에 서서히 가하면서 교반시켜 조 에멀젼을 형성하였다. 형성된 에멀젼을 약 50℃로 냉각시키고 균질화하였다. 균질화물이 응결될 때까지 진탕시키면서 냉각시켜 크림을 수득하였다.
(2) 연고제
바셀린 80중량%
스테아릴 알코올 3중량%
백랍 9중량%
콜레스테롤 3중량%
실시예 3의 앙금 5중량%
스테아릴 알코올, 백랍, 콜레스테롤 및 실시예 3의 앙금을 스팀욕에서 녹이고 바셀린을 첨가한 후 액체가 형성될 때까지 계속 서서히 가열하였다. 교반 냉각시켜 응결시킴으로써 연고제를 수득하였다.
(3) 겔제
메토셀 90 H.C. 4000 0.8중량%
카르보콜 934 0.24중량%
프로필렌 글리콜 16.7중량%
메틸파라벤 0.015중량%
실시예 3의 앙금 5중량%
수산화나트륨 pH7 조정량
정제수 100% 조성량
메토셀을 뜨거운(80 ~ 90℃) 물에 분산시키고 밤새 냉장고에서 냉각시켜 용액으로 만들었다. 카르보콜 934, 실시예 3의 앙금을 물에 분산시키고 분산액에 충분한 양의 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH를 7.0으로 조절하였다. 정제수를 첨가하여 용량을 40㎖로 만들었다. 메틸파라벤을 프로필렌 글리콜 중에 용해시켰다. 메토셀, 카르보콜 934 및 프로필렌 글리콜 분획을 혼합하여 겔을 수득하였다.
(4) 파스타제
산화아연 25중량%
전분 25중량%
칼라민 5중량%
실시예 3의 앙금 5중량%
바셀린 100% 조성량
칼라민을 산화아연, 실시예 3의 앙금 및 전분으로 적정하고 막자사발에서 분말화하여 바셀린에 균일하게 혼입시켜 파스타제를 수득하였다.
실시예 4
자궁암 세포주의 배양
본 발명의 항 바이러스제 조성물이 자궁암 세포주에서 발현되는 파필로마 바이러스 단백질에 미치는 영향 및 상기 암세포의 성장과 생존에 미치는 영향 등을 조사하기 위해 자궁암 세포주인 Ca Ski(사람 자궁경부암 세포종, ATCC 번호: CRL-1550), HeLa(사람 자궁경부암 세포종, ATCC 번호: CCL-2) 및 C-33 A(사람 자궁경부암 세포종, ATCC번호 : HTB-31)을 배양하였다. 상기 세포주 중 Ca Ski는 사람 파필로마 바이러스 16형에 감염된 자궁암 세포주이고, HeLa는 사람 파필로마 바이러스 18형에 감염된 자궁암 세포주이며, C-33 A는 사람 파필로마 바이러스에 대해 음성인 자궁암 세포주이다.
상기 각각의 세포주를 3X103 세포/웰(well)이 되도록 96-웰 플레이트(plates)에 넣은 다음 12시간 배양하였다. 배양배지로는 열불활성화 FBS(fetal bovine serum, 소 태반 혈청) 10%(v/v), 스트렙토마이신 100㎍/㎖, 페니실린 100U/㎖ 및 L-글루타민 100㎍/㎖을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Life Technology, Inc., U.S.A.)를 사용하였다.
실시예 5
자궁암 세포에서 발현되는 파필로마 바이러스의 단백질 분석
본 발명의 항 바이러스제 조성물이 자궁암 세포주에서 발현되는 파필로마 바이러스의 단백질을 감소시키는지 조사하기 위해 발암 단백질인 사람 파필로마 바이러스 16형 또는 18형의 E6 및 E7의 발현을 분석하였다.
상기 실시예 4에서 배양한 Ca Ski, HeLa 및 C-33 A 세포주를 각각 2x106 세포/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 넣은 다음, 실시예 1에서 제조한 본 발명의 항 바이러스제 조성물인 주사제 100㎖을 처리한 후, 37℃에서 이산화탄소 5% 및 산소 95%가 공급되는 상태에서 6시간, 12시간, 24시간 및 48시간 동안 배양한 세포를 회수하였다. 경과시간에 따라 회수된 세포를 용해 완충액(Lysis buffer; 10mM Tris, 1mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, protease inhibitor)을 이용하여 세포를 분해하여 용해된 시료를 추출한 후, 시료를 SDS-전기영동 하여 ECL(Electrochemiluminescence) 니트로셀룰로오스 막(Amersham Life Science, U.K.)에 단백질을 이동시켰다. 단백질이 이동된 막에 블로킹 용액(5% skin milk in TBST 10mM Tris-HCl, pH 8.0. 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)을 처리하여 4℃로 유지하면서 하룻밤 동안 반응시켰다.
그 후, 사람 파필로마 바이러스 16형 또는 18형의 E6 및 E7 단백질의 검출을 위해 면역블로팅(Immunoblotting) 방법을 이용하였다. 즉, 사람 파필로마 바이러스 16형의 E6, E7 및 사람 파필로마 바이러스 18형의 E6, E7과 결합하는 일차 항체(Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.)들을 1:500으로 블로킹 용액에 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 막에 부착시켰고, 이차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.)를 블로킹 용액에 1:5000으로 희석하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 일차 및 이차 항체와 반응한 단백질을 15분간 3번 세척하고 ECL 하이퍼필름(Amersham Life Science, U.K.)으로 노출시켜 확인하였다. 이를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 발암 단백질인 사람 파필로마 바이러스 16형의 E6은 본 발명의 항 바이러스제 조성물을 처리한 세포주 Ca Ski 및 HeLa에서 경과시간에 따라 발현양상이 점점 감소함을 관찰할 수 있었으며, 도 2에 나타낸 바와 같이, 발암 단백질인 사람 파필로마 바이러스 18형의 E7은 본 발명의 항 바이러스제 조성물을 처리한 세포주 Ca Ski에서 경과시간에 따라 발현양상이 점점 감소함을 관찰할 수 있었다.
즉, 상기 도 1 및 도 2의 결과는 본 발명의 항 바이러스제 조성물을 자궁암세포에 처리하였을 때, 발암 단백질인 사람 파필로마 바이러스 16형 또는 18형의 E6 및 E7의 발현을 억제시킨다는 것을 알 수 있었다.
실시예 6
본 발명의 항 바이러스제 조성물 처리에 따른 세포 생존율 분석
본 발명의 항 바이러스제 조성물이 자궁암 세포주의 성장과 생존에 미치는 영향을 조사하기 위해 자궁암 세포주에 본발명의 항 바이러스제 조성물을 처리하여 세포 생존율을 측정하였다.
상기 실시예 4에서 배양된 Ca Ski, HeLa 및 C-33 A 세포주에 실시예 1에서 제조한 본 발명의 항 바이러스제 조성물을 각각 처리한 후, 37℃에서 이산화탄소 5% 및 산소 95%가 공급되는 상태에서 6시간, 12시간, 24시간 및 48시간 동안 배양한 다음 세포 생존율을 측정하였다.
세포 생존율은 공지된 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)2,5-디페닐-2H-테트라조리움 브로미딘)검정법으로 측정하였다(Hansen et al. J. Immunol. Methods, 1989, Vol. 172, p203.). 20㎕ MTT 용액[PBS(phosphate buffered saline, 인산염 완충 염수)중 10㎎/㎖인 MTT]을 각각의 웰에 첨가하였고, 평판을 37℃에서 4시간 배양하였다. 배지를 제거한 후, DMSO(dimethyl sulfoxide, 디메틸 설폭시드) 200㎕에 포마잔(formazan) 결정을 용해시켜 각각의 웰에 첨가하였다. 이를 10분 동안 실온에서 흔들어 혼합하고, Bio-Rad 모델 3550 마이크로플레이트 리더(Microplate Re
ader, Richmond, CA.)를 사용하여 540㎚에서 측정하였다. 이때, DMEM-FBS와 MTT가 첨가되고 상기 조성물을 첨가하지 않은 웰을 대조군으로 사용하였다. 실험결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항 바이러스제 조성물을 처리한 자궁암 세포주들은 시간이 경과함에 따라 세포생존율이 현저히 감소됨을 알 수 있었다. 나타났다. 이러한 결과는 상기 항 바이러스제 조성물이 사람 파필로마 바이러스에 의해 유발된 자궁암 세포에 특이적으로 작용하여 세포를 사멸시킨다는 것을 알 수 있었다.
실시예 7
파필로마 바이러스에 의해 유발된 곤지름의 치료.
외음부에 곤지름이 유발된 6명의 여성 환자를 대상으로 하여 실시예 3의 (2)의 연고제 1g을 각각의 환부에 도포하였다. 그 결과, 이들 환자들은 1일 2회 적용으로 병변의 크기에 따라 2 내지 12주 이내에 치료되었다. 이를 도 4에 나타내었다.

Claims (7)

  1. 활성성분으로서 구연산, 아연 및 L-아르기닌을 치료학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유함을 특징으로 하는 항 바이러스제 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 활성성분으로서 조성물 전체 중량당 구연산이 0.001 내지 10 중량%, 아연이 0.0001 내지 5중량% 및 L-아르기닌이 0.001 내지 10 중량%로 함유된 것을 특징으로 하는 항 바이러스제 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물의 적용 대상이 파필로마 바이러스에 의한 질병임을 특징으로 하는 항 바이러스제 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항 바이러스제 조성물의 제형이 경구 투여용 또는 비경구 주사용 항 바이러스제인것을 특징으로 하는 항 바이러스제 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항 바이러스제 조성물의 제형이 크림제, 연고제, 겔제 또는 파스타제인 것을 특징으로 하는 항바이러스제 조성물.
  6. 제 3항에 있어서, 파필로마 바이러스에 의한 질병이 사마귀, 곤지름 또는 자궁암임을 특징으로 하는 항 바이러스제 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 자궁암이 자궁경부암, 자궁내막암 또는 자궁체부암임을 특징으로 하는 항 바이러스제 조성물.
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