CN104869991B - 防风草酸的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

用于哺乳动物的抗病毒癌症治疗的药物组合物，包括治疗有效剂量的防风草酸或其盐。所述药物组合物可包括水包油乳液形式的防风草酸或其盐，例如，至少一种油或至少一种表面活性剂的各向同性混合物，或者，在亲水溶剂和共溶剂或表面活性剂或其组合物中。本发明还提供了一种哺乳动物中的癌症的治疗或预防方法，其中，p53通路由病毒肿瘤蛋白解除管制。

Description

防风草酸的药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种化合物防风草酸(Anisomelic acid，AA)的新用途，所述防风草酸从Anisomeles malabarica分离得到。特别是，本发明涉及防风草酸的药物组合物。本发明还公开了防风草酸及其组合物在抗病毒癌症治疗中的用途。
背景技术
宫颈癌是第二常见的影响全世界妇女的恶性肿瘤，每年诊断出约500,000例新病例，以及280,000例死亡。虽然外科手术和化学-放射疗法能治愈80-95％的早期癌症妇女以及60％和60％的局部晚期癌症，疾病的复发和转移仍然是癌症死亡的主要原因。目前的用于晚期和转移性癌症的细胞毒素治疗的可选方案显示出了一般程度的结果，即最大30％的响应速率以及小于10个月的总体存活数。在传统疗法的成功率有限的情况下，对于宫颈癌的其他治疗可选方案的兴趣已增加。
大多数宫颈癌由一系列高风险的“瘤原性的”人类乳头瘤病毒(HPV)类型感染引起，目前公认超过99％的宫颈癌起始于HPV的感染。持续性HPV感染导致后续的不同等级的宫颈非典型增生和宫颈癌。与宫颈癌相关的主要高危基因型是HPV16和HPV18，这两个共同导致约70％的宫颈癌。
HPV病毒基因组的整合以及E6和E7病毒蛋白的表达是这种癌症发展的关键步骤。E6蛋白对营养防御应答的消除通过几种重要的机制发生。最好地被描述的机制涉及肿瘤抑制物p53的失活和降解。E6通过与称为E6相关蛋白(E6-AP)的细胞蛋白形成复合物来破坏p53的肿瘤抑制物功能。结果，失去了G1/S和G2/M的细胞周期检查点，并且细胞容易会基因组不稳定，这可能导致瘤的发展。
高危E6也激活端粒酶，所述端粒酶阻止端粒侵蚀并允许宿主细胞继续通过多轮分裂而不破坏DNA。也有报道称在HPV16E6永久人口腔黏膜角质细胞和初级人气道上皮细胞中，E6激活细胞核因子κB(NF-κB)而导致凋亡抑制蛋白2(IAP2)的表达加强。还发现c-IAP2的消耗导致细胞死亡，这暗示HPV 16诱导的c-IAP2表达对于永久表型维持是必要的。
在HPV感染中表达非常早的第二个基因是E7。E7蛋白是进入宿主细胞后维持病毒基因组的关键蛋白，最重要的功能之一是它与细胞蛋白中的视网膜母细胞瘤肿瘤抑制物(Rb)家族结合的能力。E7通过结合以及瞄向用于降解的蛋白体来刺激pRb的磷酸化和失活。然后E2F转录因子被释放以携带肿瘤细胞进入S期。E7与p21Cip和p27Kip相互作用，这样来干扰其抑制细胞周期蛋白-周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-cdk)的活性以及接下来的细胞周期的能力。因此，E7蛋白在适于病毒复制的细胞环境的维持中起着非常重要的作用。
对于可以治疗或改善癌症的痛苦的药剂的持续寻找过程中，天然产品提供了源源不断的活性化合物的供应，其越来越多地被利用。几种来源于植物的化合物目前已成功的用于癌症的治疗中。
防风草酸是从Anisomeles malabarica(L.)R.Br分离的双萜类化合物，所述Anisomeles malabarica(L.)R.Br是一种属于唇形科(Labiatae)的草本植物。这种植物通常叫做Malabar catmint，其在古代医学中被推荐用于黏膜炎、间歇热、肠道疾病和癌症。植物的含水醇类(50％)提取物已经显示出具有抗癌活性。
到目前为止，防风草酸本身没有被暗示或用于抗病毒癌症的治疗。
发明内容
本发明是基于AA在HPV16阳性的宫颈癌细胞中显示出诱导细胞凋亡的良好效果的发现。其在非宫颈癌细胞和非癌的MEF细胞中不能有效地诱导细胞凋亡。
出乎意料的是，发现AA抑制E6和E7的蛋白表达水平，因此其能够作为抗HPV剂起作用。
发明人还发现AA诱导p53非依赖性的细胞凋亡，其主要是通过细胞凋亡抑制蛋白2(cIAP2)的下调，从而引起细胞凋亡半胱天冬酶的内在激活。
与本发明相关的获得的结果揭示了AA为具有新的作用机制的化合物，其在宫颈癌细胞中，修复p53介导的生长抑制以及诱导细胞凋亡。
在发明人的知识范围内，这是第一次公开AA作为病毒肿瘤蛋白表达的抑制剂以及作为用于人类乳头瘤病毒(HPV)诱导的瘤的化疗剂。由于癌症中的E6/E7肿瘤蛋白和cIAP2蛋白作用的普遍重要性，所述化合物及其衍生物能被更广泛地用于抗癌和抗病毒的疗法中。
基于这些发现，本发明提供了防风草酸及其盐的药物组合物用于哺乳动物(包括人类和动物)的抗癌治疗中，特别是宫颈癌中。
进一步地，本发明提供了防风草酸及其盐以乳液或其前体的形式，特别是以基于水包油的微乳剂或其前体的形式的改进的组合物。
本发明还提供了防风草酸和其盐以乳液形式(任选地为体内形成的)在抗病毒癌症治疗中的应用和用于抗病毒癌症治疗的改进的方法中的应用，包括向哺乳动物施用有效剂量的防风草酸或其盐的步骤。
更具体地说，用于根据本发明的抗病毒的癌症治疗的药物组合物的主要特点是在权利要求1中的特征部分所述的那些。
根据本发明的一个优选的实施例的组合物的特点是权利要求9中的特征部分所述的那些，治疗哺乳动物主体的方法的特点是权利要求15中的特征部分所述的那些。
通过本研究的方法获得了很多优点。
本发明公开了防风草酸本身是在宫颈癌中表达的HPV16-E6和E7肿瘤蛋白的有效抑制剂。在宫颈癌细胞中，防风草酸诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡两者，这使得其能用作药物阻止癌细胞增殖以及杀死癌细胞。非依赖于p53的防风草酸诱导细胞凋亡的能力在用其治疗p53突变或p53缺失的癌症类型中提供了优势。防风草酸的商业应用能进一步拓宽以治疗其他的HPV相关感染，例如皮肤赘生物和尖锐湿疣。
在一个优选的实施方式中，防风草酸以乳液的形式使用。获得的与本发明相关的结果显示了可以通过以乳液的形式或混合物的形式制备药物组合物来改善防风草酸的溶解度和可施性，所述乳液在给药时或在体内形成乳液，以此来增加化合物的治疗方式。
因此，如以下以更多的细节讨论的，乳液形式的防风草酸被测试其在SiHa细胞中24和48小时的诱导细胞凋亡的效果。观察到相对于仅用防风草酸，乳液形式的防风草酸诱导细胞凋亡非常有效。在24小时和48小时，由防风草酸乳液诱导的细胞凋亡高于防风草酸。由防风草酸乳液诱导的细胞凋亡在24小时本身获得最大的细胞凋亡百分比，而防风草酸需要花48小时。这清楚地显示出防风草酸乳液改进了药物的生物可利用率和药物到细胞中的有效转移，这使得其在24小时本身较高的细胞凋亡百分率。所述乳液自身对细胞没有毒性。
CAM接种的肿瘤仅用乳液或防风草酸乳液治疗，以不同浓度局部治疗5天。结果显示防风草酸乳液治疗并不允许肿瘤的发展并抑制肿瘤。这提供了防风草酸乳液在体内CAM模型中的替代物的功效的良好的证据。
接下来，新技术将在随附的附图和具体实施方式的帮助下更详细地说明。
附图说明
图1A显示了用0和40μM的防风草酸(AA)处理的细胞在48小时的时间点的代表性的相差显微镜图像。图1B显示了通过递增剂量范围的AA，半胱天冬酶-3的激活。图1C显示了AA在高剂量下并不造成对坏死性细胞死亡。图1D显示了AA在HPV阳性的HeLa和Caski细胞(p53+)中诱导细胞凋亡，在HPV阴性的c33a细胞(p53-)细胞凋亡几乎没有被诱导的效果。图1E显示了在乳腺癌细胞MCF7细胞(p53+)和MDA-MB-231(p53-)中，AA诱导有效的细胞凋亡失败。图1F显示了AA在40μM下，在非癌的MEF细胞中诱导细胞死亡失败。
图2A显示AA诱导了半胱天冬酶原8、9、3(pro-caspase 8,9,3)和多聚ADP核糖聚合酶(PARP)的剪切，其是半胱天冬酶-3的底物。图2B表明了在应答20–40μM的AA时，线粒体膜去极化以依赖时间的方式发生。
图3A显示在应答AA处理时，p53以依赖剂量和依赖时间的方式显著地稳定化。同时，E6病毒蛋白被下调。以相似的方式，在AA处理12小时(h)后，E7蛋白的表达也被下调了，但是p21蛋白的诱导在用20μM的AA处理24h后才被清楚地看到。另一方面，40μM的AA没有诱导p21的表达。图3B显示了使用和不使用AA处理的同步细胞的细胞周期分析。处理24h后，AA导致细胞在G2/M期积累。在20μM AA的剂量下G2/M阻滞会更有效的发生，这与观察到的p21的诱导一致。
图4A显示p53在AA诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞中的重要性，使用p53-shRNA，p53的表达被下调。p53和p21的Western印迹分析揭示了用20μM的AA处理，这些蛋白的诱导在p53被下调的细胞中被消除了。图4B证实了p53的缺失导致了AA诱导的细胞周期阻滞的逆转，因为在处理起始24小时后，所述细胞不再在G2/M期积累。图4C显示被shRNA抑制的p53蛋白的抑制并没有抑制AA诱导的细胞凋亡，因为即使在没有p53表达的情况下，40μM的AA处理也会导致半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3和PARP的剪切。图4D显示在没有p53的情况下，凋亡细胞的百分比没有显著的减少。图4F显示了被AA处理的cIAP2蛋白水平的下调。图4F显示了E6和cIAP2蛋白的被AA介导的下调被蛋白酶体通路介导，其中，当用蛋白酶体抑制剂MG132处理时，细胞抑制了E6和cIAP2蛋白的降解。
图6概述了AA的作用机理的拟建的模型。
图7显示40μM的AA和AA乳液在24和48小时时的半胱天冬酶-3的激活。
图8显示在植入到CAM的SiHa肿瘤中的AA乳液的效果。
具体实施方式
如上面所讨论的，本发明是基于如下发现：防风草酸及其盐对病毒肿瘤蛋白E6和E7的下调有效，特别是它们通过cIAP2的下调也诱导p53依赖性的细胞周期阻滞和p53非依赖性的细胞凋亡。
尤其是，在40μM时，AA对HPV16阳性的宫颈癌中诱导细胞凋亡显示出了良好的效率，但其在非宫颈癌细胞和非癌MEF细胞中没有有效地诱导细胞凋亡。
当制备成乳液时，防风草酸(和其盐)甚至更加有效。在体外和体内两者中获得的结果支持了这一结论。
在本发明的范围内，缩写“AA”代表防风草酸。防风草酸具有通式I：
其化学文摘社(CAS)号是59632-76-7。
也包括在缩写“AA”的概念中并且当任何时候适用时包括在缩写“AA”中的是防风草酸和所述酸的有相似活性的任何衍生物的药学上可接受的盐。AA的消旋体和光学异构体和其衍生物也包括在其中。
本文使用的术语“药学上接受的盐”是指防风草酸的盐或两性离子形式。防风草酸的盐能例如在该酸的分离和纯化的过程中制备，或独立地通过酸与有合适阳离子的化合物反应制备，合适的药学上可接受的阳离子包括碱金属(例如钠或钾)和碱土金属(例如钙或镁)的阳离子。
出于本发明的目的，防风草酸基本上以纯的形式使用，例如以(以药物组合物的活性成分的)重量计，纯度至少70％，优选至少75％，更优选至少85％，有利地为至少95％，合适地为至少98％以及特别是至少99.5％，或者甚至是99.95％。AA能由包含所述化合物的天然原材料的提取获得，或其能用作合成化合物，后者是特别优选。提供的AA的一些可选择的方法将在下面讨论。
AA可由方法本身获得，例如从A.malabarica、A.indica或A.ovata中分离。因此，在一个实施方式中，可以使用1986年Arisawa等描述的方法：整个植株阴干、成粉并在索氏提取器中用90％的甲醇提取，然后真空干燥。甲醇粗提物在氯仿和水之间分开。氯仿层被浓缩并被90％的甲醇和石油醚分开。90％的醇类提取物被浓缩并进行硅胶柱层析，这样会收集到不同的化合物，并且其中之一是防风草酸。其以无色棱镜形晶体获得，熔点约148–150℃，分子式为C20H26O4。
dl-防风草酸的马歇尔的合成(Marshall & DeHoff 1987；Marshall & DeHoff1986)利用了关键环化步骤中的2-选择性的霍纳尔－埃蒙斯缩合反应(Horner-Emmonscondensation)。
Tius 1988
用(1,2-二甲基丙基)硼烷(disiamylborane)选择性地硼氢化116中的端烯键，然后使用碱性过氧化物在咪唑存在的情况下，提供乙醇(其与碘反应转化成相应的碘化物)和三苯基膦。用甲基(二甲基-1-膦酰)醋酸酯的钠盐取代碘化物，产生118的产率为85％。118的甲硅烷基醚裂解在甲醇吡啶甲苯磺酸盐在回流中完成。斯文氧化反应(Swernoxidation)提供119的醛。反应初始，在18-冠-6-醚存在的情况下，发生于分子内的霍纳尔－埃蒙斯反应(Horner-Emmons reaction)在DME中与氰化钠反应完成。研究发现该反应的成功高度依赖于条件。71％的产率(Z/E＝95/51)通过使用Masamune-Roush条件实现。周期化的乙缩醛与吡啶对甲苯磺酸盐(PPTS)水溶液水解后与PCC发生氧化反应以提供120中的产率为70％的内酯。该化合物被转化为dl-防风草酸。有趣的是，获得的120是两个几何异构体。与对115、112和110观察到的相反，该选择性的原因并没有被讨论。值得注意的是，研究发现溶剂效应对于稳定Wittig剂与醛的反应的产物的E/Z比有强烈的影响。
在HPV阳性宫颈癌细胞中，AA治疗通过病毒肿瘤蛋白和细胞凋亡抑制蛋白2(cIAP2)的下调导致有效的细胞凋亡。这些事件发生在线粒体膜去极化，半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3和PARP的剪切(这些都是凋亡性细胞死亡的所有的典型特征)之前。
根据发明人所有已有的知识，这是提供在SiHa宫颈癌细胞中，AA诱导细胞凋亡后的分子机制的直接实验证据的第一次报道。因此，该结果提供了对防风草酸可能的分子机制的新认识，此外还有其作为抗肿瘤剂的新用途。
在一个实施方式中，由导向抗病毒蛋白E6和E7的疗法导致的细胞周期阻滞的恢复表现为一种有效和实用的方法。细胞分裂被阻止了。这也导致了AA的诱导p53非依赖性的细胞凋亡的能力的感知，其可在p53突变或p53缺失的抗肿瘤治疗中提供优势。从本质上说，所述结果对防风草酸作为抗宫颈癌和抗HPV化合物的应用提供了依据。
本发明提供了包括AA，特别是分离的AA，或分离和纯化形式的AA用于治疗癌症的治疗应用。
防风草酸是一种疏水化合物，其溶解于DMSO和热乙醇中，并主要不溶于水或其他含水溶剂。药物的低水溶性是一系列的问题，因为这导致低的生物可利用率、高的主体内/主体间的可变性以及缺乏剂量均衡性。因此，为了用于通过口服和通过其他方式两者成功地输送药物，提高可溶性是必要的。
本发明提供了用于此目的的多种方法，如固体分散系、抗溶剂、与环糊精络合以及基于脂质的制剂。存在多种基于脂质的乳液传递系统，其中之一是自微乳化药物传递系统(SMEDDS)。SMEDDS被定义为天然或合成油、固体或液体表面活性剂，或者可选择地，一种或多种亲水溶剂和共溶剂/表面活性剂的各向同性混合物，其在轻微振荡时，有形成细小的水包油(o/w)微乳液的独特的能力，然后用含水介质(例如胃肠道(GI)液)稀释。
SMEDDS容易地分布于胃肠道中，胃以及肠的消化运动为自乳化提供了必要的蠕动。
SMEDDS混合物可以填装在软或硬的明胶凝胶胶囊中。根据本发明的SMEDDS制剂包括油、表面活性剂以及(如果需要的话)抗氧化剂。能加入复合表面活性剂和共溶剂来改善制剂的特性。制备防风草酸乳液并测试它的诱导细胞凋亡的效力。
因此，在一个实施方式中，防风草酸溶解在热乙醇中以形成混合物，并溶解在表面活性剂或表面活性剂、聚乙二醇和油的混合物中。液体组分间的比例可以为在1重量份的乙醇比100重量份的混合物之间，至100重量份乙醇比1重量份的混合物之间，所述混合物由表面活性剂、PEG和油形成。优选比例为约1重量份乙醇比5重量份的混合物-5重量份的乙醇至1重量份的混合物，例如在之前显示的顺序中，约1-2重量份比0.5-1重量份的组合物。
在化合物的化学特性方面，AA是双萜类，如紫杉醇(一种著名的抗肿瘤剂)，AA能局部给药、非肠道给药、腹膜腔内给药或静脉注射给药。AA乳液能口服给药。
活性组分以有效的剂量使用。给药路径、剂量以及以及确切的配方依据主体的病症来选择。因此，分别来调节间隔以提供活性化合物在血浆中的水平，所述水平足以维持并获得理想的治疗效果。然而，一般来说，用于人的剂量通常每天在0.001mg/kg到约1000mg/kg的范围中，优选每剂抑制剂在约0.1mg/kg到约500mg/kg中。通常来说，AA以0.001至100mg/kg的体重的剂量施用，例如，以0.1到50mg/kg体重的剂量施用。在一些实施例中，AA能以约0.1到约50mg/kg，约0.5到约40mg/kg或约0.7到约30mg/kg范围内的剂量下使用。预期的具体剂量包括以0.1mg/kg增长的上述范围的任意子范围。
药物组合物将包括AA，所述AA可以作为主要的或唯一的有治疗有效组分(或药剂)。因此，在本技术的范围内，也提供了组合物，其中有效药剂由防风草酸和其盐构成或主要由防风草酸和其盐构成。自然，将AA与其他抗癌化合物结合是可能的，例如酪氨酸激酶抑制剂，例如帕唑帕尼(Pazopanib)，以及血管生成剂，例如血管内皮生长因子抑制剂，如贝伐单抗(Bevacizumab)。
药物组合物可以是任何合适的形式。典型的药物形式包括含水、油性悬浮物、分散系以及无菌粉末，其可以用于临时制备可注射溶液或分散系。其可以用于局部(例如鞘膜内)应用，举例来说，以鞘膜内软膏的形式或延长释放的固体制剂的应用，例如持续释放的药物膏药。组合物也可以是在无毒性的稀释剂或溶剂中的溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。或者，它们也可以制备成微乳液并例如口服地给药。
载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、多羟基化合物(例如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等等)、乙醇和所指出的组分的混合物、多种植物油、林格氏液和等渗氯化钠溶液。此外，固定油也能用作溶剂或悬浮介质。能被使用的固定油包括合成的单-或二甘油酯。进一步地，发现脂肪酸例如油酸用于制备可注射制剂的应用。
传统上，药物组合物可以包括用作修饰、维持或保存例如组合物的pH、同渗容摩、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放率，吸附或渗透性的制剂材料。
药物组合物也可以选作用于吸入剂或用于通过消化道(例如通过口服)的传递剂。如此药学上可接受的组合物的制备是本领域的常规技术。AA可以存在于相同的药物组合物中。它们也可以包括不同的药物组合物，所述不同的药物组合物例如在同一个包装中提供。
虽然上述描述主要涉及人类主体，药物组合物用于兽医的应用也包括在本发明中。
下面非限制性的实施例描述了本发明的具体实施方式。
实施例
下面呈现的实验结果显示AA耗尽了病毒肿瘤蛋白E6/E7和细胞凋亡抑制蛋白2(cIAP2)，因此，包括在SiHa HPV16阳性的宫颈癌细胞的细胞凋亡。AA也激活导致G2/M细胞周期阻滞的p53-p21通路。
结果显示，与单独的AA相比，AA乳液在较早的时间点能更有效地诱导细胞凋亡。AA乳液也有效地抑制CAM模型中的肿瘤的生长。
经常使用哺乳动物模型来用于新药物释放系统(DDS)的临床前评估。然而，有效的哺乳动物模型是昂贵的、耗时的，并且不容易建立和评估。此外，在伦理和法律方面，它们常涉及行政负担。因此，我们用尿囊绒膜(CAM)作为评估DDS的哺乳动物模型的替代物。研究CAM的特征、胚胎的解剖结构和血液，以评估药物载体的特性，例如药物的毒性和生物相容性，以及活性、毒力、生物分布性和药代动力学。能用鸡胚完成的不同实验的简单、快速和低成本增加了在制药技术研究中惯常使用该模型的兴趣。
尿囊绒膜为所有类型的肿瘤细胞提供了非常好的天然基质。在药物传递系统的研发过程中，能用鸡胚来评价药物对CAM和CAM移植肿瘤两者的活性或毒力。对人的给药途径——局部给药、静脉注射(IV)给药和腹膜腔内(IP)给药都能用于鸡胚。因为用鸡胚实验成本低并且简单，该模型提供了在实验哺乳动物模型之前，实施药物传递系统的高通量筛选的可能性。由于天然的免疫缺陷，鸡胚代表了一种用于药物传递系统评价的可替代的模型系统。SiHa肿瘤细胞在CAM中的生长已经建立起来，而且测定了用AA乳液局部治疗肿瘤5天的效力。
材料和方法
如之前1986年Arisawa等人描述的，几乎不对其进行改进，AA从Anisomelesmalabarica分离得到。100mM储存液在室温下在DMSO中制备。
SiHa、HeLa、Caski和c33a宫颈癌细胞以及小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在DMEM(Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国)中培养。MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞在RPMI(Sigma-Aldrich)中培养。在培养基中补加10％的胎牛血清(BioClear，威尔特郡，英国)、2mM L-谷酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich)。
细胞死亡和线粒体去极化的评价
用以10μM为间隔的0-50μM的AA或溶剂对照来处理SiHa细胞。剂量范围被限制到50μM，原因是我们的初步研究在50μM时显示出≥95％的杀死率(MTT细胞毒性实验，未发表数据)。48小时后，收集细胞并分析细胞凋亡和/或坏死。根据厂家的操作步骤(PE ActiveCaspase-3 Apoptosis Kit；BD Pharmingen,San Diego,美国加尼福尼亚州)，在细胞中被激活的半胱天冬酶-3用结合藻红蛋白的抗体标记，并用流式细胞仪(FACSCalibur flowcytometer)(FL-2,FSC,BD Pharmingen)进行分析。
SiHa细胞也用40μM的AA和AA乳液测试24和48小时。收集细胞并通过FACS采用藻红蛋白(PE)活性的半胱天冬酶-3实验以用于细胞凋亡的分析。
为了检测透性化(坏死的)细胞，将细胞进行胰蛋白酶处理并在室温下重悬于PBS中的50μg/ml的碘化丙啶(PI)(Sigma-Aldrich)中10分钟。样品用流式细胞仪分析。
四甲基罗丹明和甲酯(TMRM,Invitrogen,Cergy Pontoise,法国)以20mM的二甲亚砜储存液储存，并在使用之前用介质稀释。细胞在20nM的四甲基罗丹明中在37℃水浴下孵育10分钟。然后将细胞置于冰上并立即用流式细胞仪进行分析。
HeLa、Caski、c33a、MCF7、MDA-MB-231和MEF细胞用0和40μM的AA处理。48小时后，收集细胞并分析细胞凋亡。
细胞周期分析
通过血清饥饿(1％血清)处理48小时来使细胞同步化，然后在含有10％的胎牛血清的培养基中培养24小时。此后，细胞用0、20和40μM的AA培育24小时。选择这些剂量是因为细胞凋亡的诱导在40μM处浓度最高(在下述研究中，所述剂量限制至40μM)。收集并破坏细胞，然后通过在柠檬酸钠缓冲液(40mM柠檬酸钠、0.3％的Triton X-100、50μg/ml的PI(Sigma-Aldrich))中重悬来用PI标记细胞核中DNA的含量。在室温下培育10分钟后，立即用流式细胞仪分析样品。
RNA干扰
pSUPER载体(Oligoengine,Seattle,WA,美国)由Pia Roos-Mattjus博士慷慨提供，其用于表达人p53靶向的shRNA(5’GACUCCAGUGGUAAUCUACUUCAAGAGAGUAGAUUACCACUGGAGUCUU3’,Brummelkamp et al.,2002)。无功能对照(scramble，Scr)pSUPER载体(5’GCG CGC TTT GTA GGA TTC G3’,Ostling etal.,2007)被转染到对照细胞中。用电穿孔的方法在Opti-MEM培养基(Gibco,CA,美国)中将shRNA表达质粒转染到胰蛋白酶处理过的SiHa细胞中。转染后24小时，改变培养基，并且在细胞又培养24小时或48小时后，用AA处理细胞或者不处理。shRNA表达载体对p53的表达的效率通过用Western印迹法测定。
质粒转染
离心沉淀c33a细胞并在OPTIMEM(Gibco,Invitrogen Foundation,WashingtonDC,美国)中重悬，加入空的或组氨酸标签E6的质粒后在220V和975μF的条件下电穿孔。转染后24小时，替换培养基，并且在细胞又培养24小时或48小时后，用AA处理细胞，或者留下来不处理，以采用Western印迹以及流式细胞仪的细胞死亡测定用于进一步地分析。
Western印迹
用Laemmli样品缓冲液(Laemmli,1970)通过裂解细胞，并煮沸样品10分钟来制备整个细胞的溶解物，之后，用12.5–15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分离蛋白质。用抗多聚(ADP-核糖)聚合酶(克隆C-2-10，Sigma-Aldrich)、Bid、Bax、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶3、SAPK/JNK、磷酸化的SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)、cIAP2(EnzoLifesciences)、Akt、磷酸化的Akt(Ser473)(Cell Signalling Technology,Davers,MA,美国))、p21、Bcl-xL(Santa Cruz Biotechnology,Inc,Santa Cruz,加尼福尼亚州)、β-肌动蛋白(克隆AC-40；Sigma-Aldrich)和p53(克隆DO-1；BD Pharmingen)的抗体来进行Western印迹。辣根过氧化物酶标记的第二抗体购自Southern Biotechnology Associates(Birmingham,AL)、Promega(Madison,威斯康辛州)和Amersham Biosciences(Freiburg,德国)。在X射线底片上的结果用ECL方法(Amersham Biosciences)形成图像。本发明的Western印迹结果代表至少三次独立的实验。
AA乳液的制备
防风草酸在热的乙醇中溶解，该混合物溶解在吐温30:聚乙二醇400:橄榄油的比例为4:1:1:1的溶液中。
在CAM肿瘤中测定AA乳液
两百万SiHa细胞用基质胶以1:1的比例混合，在胚胎发育的第八天，该混合物被植入到CAM膜上。在接种癌细胞一天后，用乙醇(对照)、有或没有AA的乳液处理带有肿瘤的CAM，连续培养五天。在药物处理五天后，给肿瘤拍照。
结果
为了检测引起以前报道的AA的细胞毒性的机制，我们调查了AA是否诱导培养的SiHa宫颈癌细胞的凋亡性死亡。典型的AA诱导的细胞死亡的相差图像显示在图1A中。然后我们用0–50μM的AA培养24和48小时，并测定含有有活性的半胱天冬酶-3的细胞百分比作为细胞凋亡的测量方法。观察在40μM的AA下培养48小时后的标记的半胱天冬酶-3的活性(图1B)。在加入逆转半胱天冬酶-3活性的40μM的AA处理和细胞凋亡形态出现之前，用40μM Z-VAD.fmk(一种宽范围的半胱天冬酶抑制剂)预培养SiHa细胞，因此，来确定半胱天冬酶在AA诱导细胞死亡中的作用(未显示数据)。有趣的是，AA给药大于40μM时，显著地减少的半胱天冬酶-3的剪切作用(图1B)。在这个更高的剂量范围内，用PI标记，我们不能检测到细胞透化作用的增加(图1C)，AA诱导坏死性细胞死亡是不可能的，但是能引发半胱天冬酶非依赖性的细胞死亡或细胞衰老。因为获得最好的细胞凋亡的诱导在40μM的AA，我们限制我们进一步地研究在0-40μM的AA。
我们还测定了在其他宫颈或乳腺癌细胞系中在0和40μM时AA的效果。如图1D所示，AA有效地诱导了HPV阳性的HeLa和Caski细胞(p53+)中的细胞凋亡，而在HPV阴性的c33a细胞(p53-)中，细胞凋亡诱导明显地较少。AA也不能诱导乳腺癌细胞MCF7细胞(p53+)和MDA-MB-231(p53-)有效的细胞凋亡(图1E)。AA还不能在40μM下诱导非癌MEF细胞的细胞死亡(图1F)。
为了研究观察到的细胞凋亡的执行路线，我们检测AA是否也促进线粒体膜去极化，线粒体膜去极化为体内细胞凋亡信号路径的一个好的活性标志物。在AA处理开始后，用标记8-48小时的四甲基罗丹明(TMRM)评价线粒体膜的极化。的确，线粒体去极化在对20–40μM的AA的应答中以时间依赖性关系发生(图2A)。AA处理后的SiHa细胞的裂解物用半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-3和PARP的酶切进行分析。在用20和40μM的AA孵育12小时后，能观察到半胱天冬酶原-9剪切成的35/37kDa的片段(Fig 2B)。半胱天冬酶原-8的剪切(受体相关的半胱天冬酶的死亡)随后发生，因为半胱天冬酶-8剪切的片段仅在AA处理24小时后才大量的被观察到(图2B)。这些结果显示AA主要激活内在的与半胱天冬酶-9活性相关的细胞凋亡的线粒体路径。用20-40μM的AA处理也能诱导半胱天冬酶-3以及多聚ADP核糖聚合酶(PARP)的酶切，其是半胱天冬酶-3的底物(图2B)。总之，这些结果显示AA，在20-40μM的剂量范围内，通过半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3的激活诱导细胞凋亡。
SiHa宫颈癌细胞已经被高危人类乳头瘤病毒(HPV)转化。因为E6和E7在SiHa细胞转化作用扮演着危险的角色，这些病毒蛋白及p53和p21的表达被进行了检测。确实，E6病毒蛋白被相关的p53蛋白的稳定性下调(图3A)。以相似的方式，E7蛋白的表达在AA处理12小时后也被下调，但是仅在加入20μM的AA的12小时后，才能看到清晰的p21蛋白的诱导(图3A)。另一方面，40μM的AA不诱导p21的表达，这显示低剂量的AA可诱导p21，其中，p21是p53应答基因中的一个。在其他的研究中也获得了相似的结果，所述结果显示p53细胞应答和靶标变化依赖于损害的剂量。这些结果显示AA能有效地诱导E6和E7病毒蛋白的降解，因此，可以分别从E6和E7的抑制中释放p53和p21。对p53的促进效果希望从细胞周期阻滞中被反映出来。实际上，处理24小时后，同步化和AA处理的细胞的细胞周期分析累积在G2/M期(图3B)。在20μM的AA剂量下，能更有效地发生G2/M阻滞，并伴有观察到的p21的诱导(图3A和3B)。
除了它在细胞周期调节中的作用，p53通过促细胞凋亡靶标基因的转录激活促进凋亡，其是内在和外在细胞凋亡通路中的成员。为了评价p53在AA诱导的细胞凋亡诱导和细胞周期阻滞中的重要性，我们用p53-shRNA下调了p53的表达。p53和p21Western印迹分析揭示了用40μM和20μM的AA分别处理后，这些蛋白的诱导在p53被下调的细胞中消除了(图4A和4B)。因此，p53的缺失导致了AA诱导的细胞周期阻滞的逆转，因为在AA处理起始后24小时，细胞不再在G2/M期积累了(图4C)。这些观察暗示被AA处理，p53蛋白的激活直接导致了它的转录靶标、p21、以及G2/M期阻滞之一的表达。在应答AA处理中的细胞周期阻滞显然是p53的依赖过程(图4C)。有趣的是，由shRNA引起的p53蛋白抑制并不抑制AA诱导的细胞凋亡，因为40μM的AA处理，即使在缺乏p53表达的情况下，也会导致半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3和PARP的剪切(图4A)。应答AA的这些结果由半胱天冬酶-3活性的流式细胞仪分析进一步被证实。我们没有观察到在p53表达缺失的细胞中的AA诱导的细胞凋亡的百分比有任何的显著减少(图4D)。该数据清楚地表明在HPV阳性的SiHa细胞系中的AA诱导的细胞凋亡是p53非依赖性的。由于没有观察到对细胞凋亡诱导必不可少的p53的稳定性，我们推测细胞凋亡可能被IAP家族成员的影响失活所诱导。结果显示在这些病毒侵染的癌症细胞中，cIAP2，特别是在HPB16-E6侵染的细胞中过量表达，并看起来如关键的潜在抗细胞凋亡因子的功能。确实，我们观察到了在cIAP2蛋白表达中的AA诱导的下降，伴有如E6肿瘤蛋白的下调相似的动力学(图4E和3A)，这显示对AA诱导的细胞凋亡的p53非依赖性通路能通过cIAP2表达的减少被介导。
此外，为了检测AA介导的E6和cIAP2蛋白的下调是否被蛋白酶体通路介导，细胞用蛋白酶体抑制剂MG132处理并用Western印迹分析。从结果来看，在AA处理后，MG132抑制了E6和cIAP2蛋白的降解(图4F)。
为了查明E6在AA诱导细胞凋亡中的作用，我们用空的或组氨酸标签E6的质粒转染了HPV阴性的c33a细胞，用0和70μM的AA处理它们，并采用Western印迹和FACS的方法分析了用于AA诱导细胞凋亡的细胞。虽然c33a细胞在40μM下不能进行细胞凋亡(图1D)，但是它们能在更高的70μM的剂量下进行细胞凋亡。如图5所示，E6的转染从显著的细胞凋亡中营救了c33a细胞，因而证实了AA诱导的细胞凋亡依赖于E6的下调。c33a细胞有p53突变体，其不被E6的转染所影响，但是半胱天冬酶3和PARP的剪切被抑制了(图5A)。诱导的细胞凋亡的百分比也显著的减少(图5B)。
对AA分子作用的推荐机制在图6中给出。AA在12小时的时候下调病毒肿瘤蛋白E6和E7，因此在12小时的时候产生p53的稳定性以及在24小时的时候p21使细胞周期阻滞。线粒体去极化开始于24小时时，并伴有如半胱天冬酶8和3剪切，在48小时时细胞凋亡结束。半胱天冬酶9的活性发生在这些事件之前，因为其在12小时时已经被剪切了。也可能是由于cIAP2的下调，这可以如应答病毒肿瘤蛋白的下调那样发生。因此，总起来说，我们的结果提供了AA抗癌活性的可能的机制的新观点。这些结果也指出作为一种潜在的抗宫颈癌和抗HPV治疗的化合物，防风草酸的应用前景。
我们用0和40μM的AA以及AA乳液诱导SiHa细胞24和48小时，因为AA在40μM时能诱导更高百分比的细胞凋亡，并测定含有有活性的半胱天冬酶-3的细胞的百分比作为细胞凋亡的一种测量方法。与用AA处理相比，AA乳液处理在24小时时能观察到标记的半胱天冬酶-3的活性(图7)。
注射有肿瘤的CAM用含有或不含有AA的乳液处理，结果显示AA抑制SiHa肿瘤的生长。没有AA的乳液对肿瘤自身没有毒性(图8)。
总结上述结果，可以注意到由于E6和E7活性的阻断，p53或p21功能的恢复对在这些癌细胞中的令人关注的和重要的治疗靶标有用。在本发明中，天然的双萜类防风草酸(AA)和其盐的效果已经在HPV阳性宫颈癌细胞系(SiHa)中检测了。使用AA的治疗导致E6和E7蛋白的耗尽。因此，p53和p53应答基因，p21，被显著的诱导了，以上述结果为证，导致G2/M期细胞周期阻滞。当p53被p53-shRNA下调时，AA介导的细胞周期阻滞和p21的表达大量的减少了。
AA诱导p53非依赖性细胞凋亡主要是由细胞凋亡抑制蛋白2(cIAP2)的下调导致凋亡半胱天冬酶的内在激活。用AA乳液处理SiHa细胞显示在24小时时其有更高的细胞凋亡，并且AA乳液对CAM模型中的肿瘤抑制是有效的。因此，本发明提供了在宫颈癌细胞中p53介导的生长阻滞的恢复和细胞凋亡的诱导的AA的应用。因此，其能被其自身或被其分子原理的应用于发展抗宫颈癌的治疗。此外，该原则能被用于其他HPV介导的癌症中，例如外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和一些口咽癌。
AA通过一种独特的机制发挥作用，这能使特异作用于HPV阳性的宫颈癌细胞的目标。我们的结果显示当发展用于抗癌和抗HPV治疗的药物分子时，能够使用AA的分子机理。
除癌症之外，尖锐湿疣是HPV表现最平常的疾病，并能导致良性以及肿瘤性生殖器HPV相关疾病。因此，这些结果指出AA和其衍生物的使用作为一种潜在的药理学策略来发展治疗宫颈癌、HPV介导的尖锐湿疣以及预防HPV介导的癌症风险。此外，HPV是其他类型湿疣的最常见的原因，AA和AA的分子机制也能用于非尖锐湿疣的治疗。
在治疗湿疣时，防风草酸和其盐能局部给药。防风草酸及其盐能在治疗主体的表面上以1-1000mgI的剂量给药，例如在侵染湿疣的皮肤上。防风草酸及其盐以上述讨论的水包油乳液的形式使用。
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Claims (27)

1.一种包括治疗有效剂量的防风草酸或其盐的药物组合物在制备用于哺乳动物中的抗病毒癌症治疗的药物中的应用，所述药物组合物还包括含水、油质悬浮液、分散系、能用于临时制备可注射溶液或分散系的无菌粉末，或在非毒性稀释剂或溶剂中的溶液或悬浮液的形式的防风草酸或其盐。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，防风草酸或其盐以乳液的形式在体内被施用或提供。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，防风草酸或其盐以微乳液的形式在体内被施用或提供。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，防风草酸或其盐以细小的水包油的微乳液的形式在体内被施用或提供。
5.根据权利要求2所述的应用，其中，防风草酸或其盐以自微乳化药物传递组合物的形式提供。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述药物组合物包括至少一种天然或合成的油与表面活性剂或者一种或多种亲水溶剂和共溶剂或能在体内形成乳液的表面活性剂联合的各向同性混合物。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的应用，所述药物用于治疗或预防癌症，其中，p53通路由病毒肿瘤蛋白解除。
8.根据权利要求1-6中任意一项所述的应用，所述药物用于治疗或预防宫颈癌。
9.根据权利要求1-6中任意一项所述的应用，所述药物用于下调肿瘤蛋白和细胞凋亡抑制蛋白2。
10.根据权利要求1-6中任意一项所述的应用，所述药物用于通过激活p53-p21通路对细胞周期阻滞进行恢复，并且还诱导p53非依赖性的细胞凋亡。
11.根据权利要求1-6中任意一项所述的应用，所述药物用于治疗人类乳头瘤病毒介导的癌症。
12.一种包括治疗有效剂量的防风草酸或其盐的药物组合物在制备用于治疗良性或肿瘤性生殖器人类乳头瘤病毒相关疾病的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其中，所述药物用于人类乳头瘤病毒介导的尖锐湿疣的治疗，以及用于非尖锐湿疣的治疗。
14.根据权利要求12所述的应用，所述药物组合物包括以水包油乳液或以其前体的形式的治疗有效剂量的防风草酸或其盐。
15.根据权利要求14所述的应用，所述药物组合物包括治疗有效剂量的防风草酸或其盐，其以至少一种油和至少一种表面活性剂的各向同性的混合物的形式存在，或者，以亲水溶剂和共溶剂或表面活性剂或其组合物的形式存在。
16.根据权利要求15所述的应用，所述药物组合物在含水介质中稀释后搅动能形成细小的水包油(o/w)的微乳液。
17.根据权利要求16所述的应用，所述药物组合物在GI流体中稀释后搅动能形成细小的水包油(o/w)的微乳液。
18.根据权利要求14-17中任意一项所述的应用，所述药物组合物进一步包括选自由抗氧化剂、复合表面活性剂和共溶剂和其组合组成的群组中的辅剂或添加剂。
19.根据权利要求14-17中任意一项所述的应用，所述药物组合物以填装有乳液的软或硬的明胶胶囊的形式提供。
20.根据权利要求14-17中任意一项所述的应用，其中，所述药物由防风草酸或其盐构成或主要由防风草酸或其盐构成。
21.根据权利要求13所述的应用，所述药物组合物包括以水包油乳液或以其前体的形式的治疗有效剂量的防风草酸或其盐。
22.根据权利要求21所述的应用，所述药物组合物包括治疗有效剂量的防风草酸或其盐，其以至少一种油和至少一种表面活性剂的各向同性的混合物的形式存在，或者，以亲水溶剂和共溶剂或表面活性剂或其组合物的形式存在。
23.根据权利要求22所述的应用，所述药物组合物在含水介质中稀释后搅动能形成细小的水包油(o/w)的微乳液。
24.根据权利要求23所述的应用，所述药物组合物在GI流体中稀释后搅动能形成细小的水包油(o/w)的微乳液。
25.根据权利要求21-24中任意一项所述的应用，所述药物组合物进一步包括选自由抗氧化剂、复合表面活性剂和共溶剂和其组合组成的群组中的辅剂或添加剂。
26.根据权利要求21-24中任意一项所述的应用，所述药物组合物以填装有乳液的软或硬的明胶胶囊的形式提供。
27.根据权利要求21-24中任意一项所述的应用，其中，所述药物由防风草酸或其盐构成或主要由防风草酸或其盐构成。
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