CN104725291B - Xpo1蛋白抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开一类XPO1蛋白抑制剂，具有通式F的结构。本发明所述的XPO1蛋白抑制剂在水中的溶解度非常好，以莱菔素为代表，该类化合物对XPO1蛋白的抑制活性极高，并且副作用极小，生物安全度和生物利用度好，非常适合于临床应用，因此具有巨大的潜在的市场空间和经济效益。

Description

XPO1蛋白抑制剂

技术领域

本发明涉及一类XPO1蛋白抑制剂，是一类异硫氰酸酯类化合物，还涉及该类化合物在新领域的应用。

背景技术

生物体的一些特异性蛋白通过特定的转运蛋白运入或运出细胞核，这些转运蛋白分为输入蛋白和输出蛋白(将分子运出细胞核外)。被运入或运出核的蛋白包含允许它们与特定转运蛋白相互作用的核输入定位序列(NLS)或核输出定位(NES)序列。XPO1(也被称作CRM1蛋白)，是一种最主要的细胞核输出蛋白。

XPO1的货物蛋白包括一些特异性的肿瘤抑制蛋白如P53、P21、BRCA1、FOXOs、BCR-Abl以及NPM等。有大量研究表明，XPO1蛋白在多种肿瘤类型如卵巢癌、宫颈癌、骨肉瘤、肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、淋巴癌、白血病中均呈高表达，而且这种高表达与这些肿瘤的不良预后结果相关。XPO1的过表达使得肿瘤抑制蛋白被运送到细胞质并降解，失去了肿瘤抑制功能，被认为是肿瘤细胞逃避凋亡的一种机制。(Semin Cancer Biol.2014,27:74-86；Biochem Pharmacol.2012,83(8):1021-32.)

肿瘤的转移是恶性肿瘤难以治疗并具有高死亡率的主要原因,也是恶性肿瘤对化疗、放疗产生抗性的原因之一。另据文献报道，具有抗肿瘤作用的化合物大多数对于肿瘤的转移、对于抗放疗及化疗的肿瘤是无效的(Methods Mol Med.2005；111:127-48)。抗肿瘤转移作用的活性物质具有极高的临床价值，但现有技术中鲜有记载。上皮细胞向间充质细胞的转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是指上皮细胞在形态学上向成纤维细胞或间充质细胞表型的转变并获得迁移的能力，在肿瘤细胞的转移过程中起枢纽作用。近年来，EMT途径已成为肿瘤迁移相关研究的热点。E-cadherin是重要的细胞黏附分子,与肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。Snail蛋白是一种转录因子,可以直接抑制E-cadherin的转录，具有促进细胞迁移的作用。已有大量证据表明,在恶性肿瘤细胞发生转移前，Snail蛋白表达上调，而E-cadherin表达水平下调，从而使得肿瘤细胞转移潜能增强。因此，能够抑制Snail蛋白表达的化合物具有抗肿瘤细胞转移的潜力。

除肿瘤抑制蛋白之外，XPO1的货物蛋白也包括与炎症及免疫过程相关的若干关键蛋白，如IкB、Cox-2、RXRα、Commd1、HIF1等。IкB是NF-кB的蛋白抑制剂，在细胞核中结合NF-кB使得其转录功能失活，从而调节NF-кB这一与炎症及免疫过程密切相关的信号通路。在炎症或免疫失调过程中，XPO1的过量表达使得IкB在细胞质中被降解而失去了对NF-кB的调节作用。(Shock.2008,29(2):160-6；J Biol Chem.1999,274(13):9108-15]。

XPO1蛋白也负责类视黄醇受体(RXRα)的细胞核输出。RXRα在肝脏中呈现高表达，在胆汁酸、胆固醇、脂肪酸、类固醇等的代谢调控中起着核心作用。在肝脏炎症的病理过程中，XPO1蛋白呈现高表达，使得细胞核中的视黄醇受体水平显著下降。因此，在炎症或免疫失调等相关病理过程中，抑制过量表达的XPO1蛋白是潜在有益的。(J Biol Chem.2006,281(22):15434-40)。

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)在世界范围内的发病率较高，在美国每年的患病人数就达二百万。在中国，炎症性肠病的病例也逐年增多，已成为消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要原因，并且患者多为儿童及青壮年。炎症性肠病泛指各种肠道炎性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis)及克罗恩病(Crohn's disease)等。炎症性肠病的发病机理并不清楚,通常被认为是一种免疫系统疾病。有研究表明,炎症性肠病的病理过程存在炎症反应失控，一些细胞因子如肿瘤坏死因子TNF-α、白介素分子IL-6等过量表达，并对正常组织器官造成损害。因此，治疗炎症性肠病往往需要调控上述细胞因子的过表达(J Clin Invest.2007；117(3):514-21)。临床上，炎症性肠病的治疗可以利用氨基水杨酸制剂如5-氨基水杨酸(5-ASA)、柳氮磺吡啶等。但此类药物仅对轻度患者有一定疗效，对重度患者往往没有疗效并容易产生耐药性。另外，临床上还可能选用环磷酰胺、甲氨喋呤等免疫抑制剂来抑制针对自身机体的免疫反应。遗憾的是,这些临床治疗方案对于炎症性肠病的缓解程度往往很有限，并且可能产生较为明显的毒副作用，包括肝脏毒性以及骨髓抑制毒性等。寻找更为安全、更为有效的炎症性肠病药物具有十分重要的意义。

除了上述病理过程外，XPO1介导的细胞核输出也与许多病毒颗粒的包被、完整、成熟的过程密切相关。例如：人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒(H1N1菌株以及禽鸟类的H5N1菌株)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、登革热病毒(Dungee)、重度急性呼吸器官综合症冠状病毒、西尼罗河病毒、单纯性疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、以及默克尔细胞多瘤病毒(MCV)等。(Proc Natl Acad SciU S A.2002,99(22):14440-5；J Virol.2008,82(21):10946-52；J Biol Chem.2009,284(23):15589-97；J Virol.2009；83(11):5353-62)。因此，抑制XPO1蛋白的表达对切断病毒转运也是潜在有益的。

莱菔子是一味古老的中草药，别名萝卜子、萝白子、菜头子，拉丁文名：SemenRaphani，是十字花科植物萝卜的成熟种子。常用于缓解食积气滞、脘腹胀满、嗳气、下痢后重、咳嗽痰多、喘促胸满等症状。现代生药学研究结果发现，其主要有效成分为莱菔素(Sulforaphene,简写为SFE，分子式:C₆H₉NOS₂)，是一类异硫氰酸酯类化合物，结构如下式。

发明内容

在我们的研究中，我们意外发现，莱菔素及其一系列未曾被报道过的衍生物是良好的XPO1蛋白抑制剂，具有极好的临床应用潜在价值。

本发明的目的，首先在于提供一类XPO1蛋白抑制剂，具有通式F的结构：

通式F中：

所述的R选自C₁-C₁₀烃基；

R由基团G任意取代，所述的基团G选自：H，卤素，或者含有0-3个各自独立选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元的单环基团；

n选自0、1或2。

本发明另一方面的目的在于提供上述XPO1蛋白抑制剂的制备方法，包括如下步骤：

1.其中，n＝1化合物的制备方法包括如下步骤：

(1)式i的化合物与甲基甲磺酸磷酸二乙酯在碳酸钾存在条件下反应12h制备式ii的化合物，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；

(2)式ii的化合物在氯仿溶液中与间氯过氧化苯甲酸(m-CPBA)反应生成式iii的化合物；

(3)式iii的化合物在氯化锂存在的条件下，与丁基-4-氨基甲酸丁酯醛在三乙基胺/四氢呋喃(TEA/THF)溶液中反应制备式iv的化合物；

(4)式iv的化合物首先与三氟乙酸在二氯甲烷(DCM)中反应，然后在TEA存在的条件下，与硫光气(CS2)在DCM中反应生成式F的化合物。

2.其中，n＝2化合物的制备方法包括如下步骤：

(1)式i的化合物与甲基甲磺酸磷酸二乙酯在碳酸钾存在条件下反应12h制备式ii的化合物，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；

(2)式ii的化合物在氯仿溶液中与二个当量的间氯过氧化苯甲酸(m-CPBA)反应生成式v的化合物；

(3)式v的化合物在氯化锂存在的条件下，与丁基-4-氨基甲酸丁酯醛在三乙基胺/四氢呋喃(TEA/THF)溶液中反应制备式vi的化合物；

(4)式vi的化合物首先与三氟乙酸在二氯甲烷(DCM)中反应，然后在TEA存在的条件下，与硫光气(CS2)在DCM中反应生成式F的化合物。

3.其中，n＝0化合物的制备方法包括如下步骤

(1)式i的化合物与甲基甲磺酸磷酸二乙酯在碳酸钾存在条件下反应12h制备式ii的化合物，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；

(2)式ii的化合物在氯化锂存在的条件下，与丁基-4-氨基甲酸丁酯醛在三乙基胺/四氢呋喃(TEA/THF)溶液中反应制备式vii的化合物；

(3)式vii的化合物首先与三氟乙酸在二氯甲烷(DCM)中反应，然后在TEA存在的条件下，与硫光气(CS2)在DCM中反应生成式F的化合物。

本发明再一方面的目的，在于提供上述XPO1蛋白抑制剂在制备XPO1蛋白抑制剂类药物中的应用。

本发明所述的XPO1蛋白抑制剂在水中的溶解度非常好，以莱菔素为代表，该类化合物对XPO1蛋白的抑制活性极高，并且副作用极小，生物安全度和生物利用度好，非常适合于临床应用，因此具有巨大的潜在的市场空间和经济效益。

附图说明

本发明附图2幅，其中：

图1是代表化合物I-01靶向结合XPO1蛋白从而抑制细胞核输出的激光共聚焦效果图。

图2是通过活体成像仪观测的代表化合物莱菔素(SFE)对卵巢癌腹腔转移模型的治疗效果图，其中：(a)对照组(未给药)；(b)化合物SFE给药三周后(80mg/kg)。

具体实施方式

如无特殊说明，本发明中所使用的术语具有以下普遍含义：

术语“卤素”表示卤素取代基，指代氟基(-F)、氯基(-Cl)、溴基(-Br)或碘基(-I)；术语“卤代”表示以上述卤素取代基取代。

术语“烃基”是指由碳、氢两种原子的官能团，包括但不限于烷基、烯基。其中，“烷基”按照惯常理解，包括直链烷基、支链烷基或环烷基。当概述性地述及“C_1-4烷基”时，既包括单端游离键的烷基，举例但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、伯/仲/叔丁基、环丙基、甲基环丙基、环丁基；也包括满足键价理论的具有两个或两个以上游离键的烷基，举例但不限于：-CH₂-、-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-(CH₂)₄-或-C(CH₃)(CH₂)₂-。

术语“苯基”是指苯环芳基，包括取代或未取代的-C₆H₅；而提及“-C₆H₅”时，仅指未取代苯基。

术语“芳基”是指从简单芳香环衍生出的官能团或取代基；未做其它限定的前提下，既可以是碳环芳基，也可以是杂环芳基；既可以是单环芳基，也可以是稠环芳基，或者是芳基环与非芳基环稠合的多环取代基。

术语“杂芳基”是指从含有杂原子的芳香环衍生出的官能团或取代基。

术语“卤代烷基”是指被卤素取代基取代的烷基。

本发明所述的XPO1蛋白抑制剂，具有通式F的结构：

通式F中：

所述的R选自C₁-C₁₀烃基；

R由基团G任意取代，所述的基团G选自：H，卤素，或者含有0-3个各自独立选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元的单环基团；

n选自0、1或2。

具体实施方式之一，R为未取代的C₁-C₁₀烃基，优选C₁-C₁₀烷基，更优选C₂-C₆烷基，尤其优选丙基、异丙基、仲丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环己基。

另一具体实施方式，所述的R是由基团G取代的C₁-C₁₀烃基，优选G取代的C₁-C₁₀烷基，更优选G取代的C₂-C₆烷基，所述基团G选自卤素，以及含有0-3个各自独立选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元的单环基团；优选F、Cl、Br、苯基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、恶唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基。

本发明所述的XPO1蛋白抑制剂中，所述的n选自0、1或2，优选n＝1或2，最优选n＝1。

上述本发明的XPO1蛋白抑制剂的技术方案中，各种具体实施方案可任意组合，以获得关于本发明的XPO1蛋白抑制剂的优选的技术方案。

进一步具体的实施方式中，本发明所述的XPO1蛋白抑制剂，选自化合物F-01～F-11。

本发明所述的XPO1蛋白抑制剂还应当包括由通式F所表达的所有同分异构体结构的化合物。包括但不限于每一种结构式的对映异构体、非对映异构体；以及针对每一个不对称中心的R与S构型的化合物，Z与E双键异构体以及Z与E构象异构体的化合物。

此外，本发明所述及的XPO1蛋白抑制剂还包括所述通式F化合物所成的可要用盐，包括医药上可接受的对人体无毒的盐。此类无毒盐优选地包括碱金属盐或碱土金属盐如钠盐、钾盐和钙盐；氢卤酸盐如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐；无机酸盐如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；有机酸盐如甲磺酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐和马来酸盐；氨基酸盐如谷氨酸盐和天冬氨酸盐。

本申请发明人在研究中意外发现，以莱菔素(SFE)为代表的异硫氰酸酯类化合物具有优异的XPO1蛋白抑制活性，因此，本发明另一方面提供上述XPO1蛋白抑制剂在制备XPO1蛋白抑制剂类药物中的应用。

具体实施方式中，所述的XPO1蛋白抑制剂是XPO1蛋白抑制剂类抗炎药物、XPO1蛋白抑制剂类抗肿瘤药物或XPO1蛋白抑制剂类抗病毒药物。

其中，所述的XPO1蛋白抑制剂类抗炎药物是用于治疗炎症性肠病的药物。

所述的所述的XPO1蛋白抑制剂类抗肿瘤药物是抗肿瘤转移药物。所述选自：肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、骨肉瘤、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、头颈癌、多发性骨髓瘤、脑肿瘤、前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、肝癌、神经胶质瘤、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、垂体瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌、睾丸癌、胆囊癌、唾液腺癌、尿道癌、子宫肉瘤、白血病、淋巴癌。

在应用XPO1蛋白抑制剂制备XPO1蛋白抑制剂类药物的应用中，所制备得的含有本发明的XPO1蛋白抑制剂的XPO1蛋白抑制剂类药物也是本发明内容之一，所述药物可以据其应用制备为任意一种剂型，包括但不限于经口剂如片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、细粒剂、锭剂、糖浆剂和乳剂；注射剂如静脉内的和肌内的注射剂；直肠施用剂、油脂性栓剂、水溶性栓剂、软膏等来制备。这些制剂可以通过可药用载体如赋形剂、充填剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、pH调节剂、保存剂、螯合剂、溶解助剂、防腐剂、矫味矫臭剂、无痛化剂、稳定剂等的常规方法来制备。所述药物可以单独使用或与其它抗癌治疗手段联合地施用。所述的联合使用选自：与外科手术联合使用、与一种或多种西药联合使用、与中草药联合使用、与放射性治疗联合使用、与基因治疗联合使用或与生物调节剂联合使用。

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1.化合物F-01的制备

步骤1.(2-乙基)-1-丙基硫酚-甲基磷酸乙酯的制备

将0.76克的1-丙基硫酚与1.38克的碳酸钾溶于50ml的DMF溶液中,室温下缓慢滴加1.50克的甲基甲磺酸磷酸二乙酯,室温搅拌，TLC检测，2小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到0.71克的黄色油状液体(产率为72％)，化合物的质谱MS：[M+H]⁺226.1。

步骤2.(2-乙基)-1-丙基硫酚亚磺酰-甲基磷酸乙酯的制备

将2.26克的步骤1的产物溶于15ml氯仿溶液中,随后缓慢滴加0.25克的m-CPBA溶液。室温搅拌，TLC检测，1小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.92克的油状液体(产率为81％)，化合物的质谱MS:[M+H]+242.3。

步骤3.

将2.42克的步骤2得到的产物以及0.20克的氯化锂粉末溶解于25ml的TEA-THF溶液中,随后向溶液中缓慢加入1.21克的丁基-4-氨基甲酸丁酯醛。室温搅拌，TLC检测，半小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过制备液相色谱MPLC(eluent:PE:EtOAc＝1:1)分离得到油状液体。随后将此油状液体溶解于10ml的三氟乙酸溶液并加入2ml的DCM,室温下反应1小时。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到0.95克的白色固体。向此固体中缓慢滴加25ml含有硫光气(CS₂)的DCM溶液。室温搅拌，TLC检测，半小时后原料不再减少，加入TEA水溶液终止反应。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.63克的黄色油状液体(产率为82％)为化合物F-01，质谱MS:[M+H]+203.3。核磁共振氢谱(¹H-NMR:DMSO):δ6.37(1H,m),δ6.31(1H,d),δ3.63(2H,m),δ2.57(2H,m),δ2.20(2H,m),δ1.67(2H,m),δ0.96(3H,m)。

实施例2.化合物F-03的制备

步骤1.(2-乙基)-1-环丙基硫酚-甲基磷酸乙酯的制备

将0.74克的1-环丙基硫酚与1.38克的碳酸钾溶于50ml的DMF溶液中,室温下缓慢滴加1.50克的甲基甲磺酸磷酸二乙酯,室温搅拌，TLC检测，2小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.81克的黄色油状液体(产率为85％),化合物的质谱MS:[M+H]⁺224.2。

步骤2.(2-乙基)-1-丙基硫酚亚磺酰-甲基磷酸乙酯的制备

将2.24克的步骤1的产物溶于20ml氯仿溶液中,随后缓慢滴加0.25克的m-CPBA溶液。室温搅拌，TLC检测，1小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.92克的油状液体(产率为81％),化合物的质谱MS:[M+H]+240.3。

步骤3.

将2.35克的步骤2得到的产物以及0.25克的氯化锂粉末溶解于25ml的TEA-THF溶液中,随后向溶液中缓慢加入1.20克的丁基-4-氨基甲酸丁酯醛。室温搅拌，TLC检测，半小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过制备液相色谱MPLC(eluent:PE:EtOAc＝1:1)分离得到油状液体。随后将此油状液体溶解于10ml的三氟乙酸溶液并加入2ml的DCM,室温下反应1小时。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.21克的白色固体。向此固体中缓慢滴加25ml的含有硫光气(CS₂)的DCM溶液。室温搅拌，TLC检测，半小时后原料不再减少，加入TEA水溶液终止反应。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.50克的黄色油状液体(产率为77％)为化合物F-03,质谱MS:[M+H]+201.3。核磁共振氢谱(¹H-NMR:DMSO):δ6.37(1H,m),δ6.30(1H,d),δ3.64(2H,m),δ2.57(2H,m),δ2.05(2H,m),δ1.27(1H,m),δ0.65(2H,m),δ0.40(2H,m)。

实施例3.化合物F-05的制备

步骤1.(2-乙基)-甲基硫酚-甲基磷酸乙酯的制备

将0.50克的甲基硫酚与1.38克的碳酸钾溶于50ml的DMF溶液中,室温下缓慢滴加1.50克的甲基甲磺酸磷酸二乙酯,室温搅拌，TLC检测，2小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.32克的黄色油状液体(产率为72％),化合物的质谱MS:[M+H]⁺198.2。

步骤2.(2-乙基)-1-甲基硫酚亚磺酰-甲基磷酸乙酯的制备

将1.99克的步骤1的产物溶于25ml氯仿溶液中,随后缓慢滴加0.80克的m-CPBA溶液。室温搅拌，TLC检测，2小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.41克的油状液体(产率为70％),化合物的质谱MS:[M+H]+231.0。

步骤3.

将2.10克的步骤2得到的产物以及0.30克的氯化锂粉末溶解于25ml的TEA的THF溶液中,随后向溶液中缓慢加入1.17克的丁基-4-氨基甲酸丁酯醛。室温搅拌，TLC检测，半小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过制备液相色谱MPLC(eluent:PE:EtOAc＝1:1)分离得到油状液体。随后溶解于20ml的三氟乙酸溶液并加入2ml的DCM,室温下反应1小时。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.85克的白色固体。向此固体中缓慢滴加25ml的含有硫光气(CS₂)的DCM溶液。室温搅拌，TLC检测，半小时后原料不再减少，加入TEA水溶液终止反应。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.53克的黄色油状液体(产率为82％)为化合物F-05,质谱MS:[M+H]+191.3。核磁共振氢谱(¹H-NMR:DMSO):δ6.86(1H,m),δ6.57(1H,d),δ3.64(2H,m),δ2.84(3H,s),δ2.25(2H,m)。

实施例4.化合物F-06的制备

步骤1.(2-乙基)-甲基硫酚-甲基磷酸乙酯的制备，参照化合物F-03的制备实施例的步骤1。

步骤2.

将0.98克的步骤1得到的产物以及0.11克的氯化锂粉末溶解于25ml的TEA的THF溶液中,随后向溶液中缓慢加入1.17克的丁基-4-氨基甲酸丁酯醛。室温搅拌，TLC检测，半小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过制备液相色谱MPLC(eluent:PE:EtOAc＝1:1)分离得到油状液体。随后溶解于10ml的三氟乙酸溶液并加入2ml的DCM,室温下反应1小时。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.61克的白色固体。向此固体中缓慢滴加25ml的含有硫光气(CS₂)的DCM溶液。室温搅拌，TLC检测，半小时后原料不再减少，加入TEA水溶液终止反应。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到1.10克的黄色油状液体(产率为71％)为化合物F-06,质谱MS:[M+H]+159.2。核磁共振氢谱(¹H-NMR:DMSO):δ6.14(1H,m),δ5.30(1H,d),δ3.64(2H,m),δ2.25(3H,s),δ2.05(2H,m)。

实施例5.化合物F-10的制备

步骤1.(2-乙基)-噻吩乙基-2-甲硫酚-甲基磷酸乙酯的制备

将1.30克的噻吩乙基硫酚与1.38克的碳酸钾溶于25ml的DMF溶液中,室温下缓慢滴加1.50克的苯基甲磺酸磷酸二乙酯,室温搅拌，TLC检测，2小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到2.06克的黄色油状液体(产率为75％),化合物的质谱MS:[M+H]⁺281.1。

步骤2.(2-乙基)-1-苯基亚磺酰-甲基磷酸乙酯的制备

将2.71克的步骤1的产物溶于25ml氯仿溶液中,随后缓慢滴加0.25克的m-CPBA溶液。室温搅拌，TLC检测，2小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到2.26克的油状液体(产率为77％),化合物的质谱MS:[M+H]+296.3。

步骤3.

将2.80克的步骤2得到的产物以及0.15克的氯化锂粉末溶解于25ml的TEA/THF溶液中,随后向溶液中缓慢加入1.17克的丁基-4-氨基甲酸丁酯醛。室温搅拌，TLC检测，半小时后原料不再减少，反应完毕。萃取合并有机层并干燥，通过制备液相色谱MPLC(eluent:PE:EtOAc＝1:1)分离得到油状液体。随后溶解于10ml的三氟乙酸溶液并加入3ml的DCM,室温下反应1小时。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到2.82克的白色固体。向此固体中缓慢滴加25ml的溶有硫光气(CS₂)的DCM溶液。室温搅拌，TLC检测，半小时后原料不再减少，加入TEA溶液终止反应。萃取合并有机层并干燥，通过柱层析得到2.07克的黄色油状液体(产率为80％)为代表化合物I-22,质谱MS:[M+H]+258.3。核磁共振氢谱(¹H-NMR:DMSO):δ6.91(1H,d),δ6.72(1H,m),δ6.60(1H,d),δ6.37(1H,m),δ6.30(1H,d),δ3.83(2H,m),δ3.64(2H,m),δ2.25(2H,m)。

实施例6.代表化合物对XPO1蛋白的抑制活性的测定

NES(nuclear export signal)是XPO1蛋白识别的细胞核输出信号肽。XPO1通过与生物大分子的NES序列肽段识别,将生物大分子带出细胞核。NES-GFP蛋白是用真核表达质粒将绿色荧光蛋白GFP与NES序列肽段耦合。通过检测化合物对NES-GFP细胞定位的影响,可以判定代表化合物对XPO1蛋白的抑制活性。

将细胞胰酶消化、计数，按每孔1.5×10⁴/个接种在96孔板。16小时后，用脂质体转染NES-GFP质粒。24小时后，分别加入各个代表化合物溶液、SFN分子溶液、PEITC分子溶液作用2小时，后加入100μl Hochest33258(1mg/ml)将细胞核染色。用激光共聚焦显微镜(Olympus-IX71)观察NES-GFP核输出的抑制效果并用百分率统计。其中,化合物SFE的抑制XPO1的激光共聚焦效果图具体见图1。从图1可见，能发出绿色荧光的NES-GFP蛋白大部分被聚集在细胞核内。证明SFE具有很好的对XPO1蛋白的抑制活性。

SFE为莱菔素，SFN为萝卜硫素(C₆H₁₁NOS₂)，PEITC为苯乙基异硫氰酸酯(C₉H₉NS)，这些分子都是天然的异硫氰酸酯类化合物。实验结果表明，以SFE为代表的本发明的化合物均具有较好的对XPO1蛋白的抑制活性，它们对XPO1蛋白的抑制活性优于两种天然化合物SFN及PEITC数倍至数百倍。具体结果见表1。

表1.本发明的化合物对XPO1蛋白的抑制活性(完全抑制浓度)

化合物	活性(μM)	化合物	活性(μM)	化合物	活性(μM)
						SFN	35	PEITC	30	SFE	10-15
F-01	10-15	F-02	5-10	F-03	5-10
						F-04	10-15	F-05	10-15	F-06	15-20
F-07	5-10	F-08	5-10	F-09	1-5
						F-10	1-5	F-11	1-5

实施例7.代表化合物治疗IBD动物模型引起宏观病理变化的评价

将8周龄雄性SD大鼠(每组10只)绝食24小时后,用二乙醚麻醉。将50％乙醇与TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)混合配制成溶液。在IBD模型组中,将乙烯树脂制造的导管从肛门插入5cm,用100mg/kg剂量的TNBS溶液灌肠。灌肠后30秒钟反吊,使TNBS溶液不泄漏。在对照组中，用生理食盐水取代TNBS并灌肠。在灌肠TNBS或生理食盐水7天后，处死动物并解剖。给药组中每组在TNBS灌肠前一日起，将本发明的化合物、SFN分子、PEITC分子每天用灌胃的方式以80mg/kg的剂量给药。给药治疗2周后，处死动物并解剖，摘出动物大肠并在4％的福尔马林溶液中固定30分钟。将动物大肠从肠系膜侧纵切开用于为直肠部分拍照并测量直肠重量。以宏观观察判断评分(表2-1)为基础，根据宏观观察得分的基准对直肠部分的溃疡及出血状态进行评分。

表2-1.宏观观察判断得分标准

得分(0～5分)	宏观观察标准
		0分	无炎症、无糜烂、无出血

1分	小范围形成糜烂、轻度肿胀
		2分	轻度糜烂、肿胀并变红
3分	中度糜烂、轻度出血
		4分	小范围重度糜烂、出血
5分	大范围重度糜烂、出血

本发明代表化合物治疗后的具体宏观判断得分见表2-2所示。从结果可见：与生理盐水灌肠组比较，TNBS灌肠组的结肠组织溃疡、出血并坏死的现象比较显著，宏观病理判断得分较高。5-ASA给药组、SFN给药组、PEITC给药组的结肠组织出血与溃疡的现象仅有较小程度的缓解。与之相比,本发明各代表化合物给药组的结肠组织受损害程度均较小，结肠组织出血并溃疡的现象有较大缓解，证明所测试的本发明的化合物对于IBD具有较好的保护及治疗效果。

表2-2.部分代表化合物治疗IBD动物模型后宏观观察判断得分

组别	剂量	动物个数	宏观病理得分
				生理盐水	100mg/kg	10	0
TNBS灌肠	100mg/kg	10	4.5±0.3
				5-ASA给药	80mg/kg	10	4.0±0.2
SFN给药	80mg/kg	10	4.0±0.5
				PEITC给药	80mg/kg	10	3.5±0.3
SFE给药	80mg/kg	10	3.0±0.5
				F-03给药	80mg/kg	10	2.5±0.6
F-05给药	80mg/kg	10	3.0±0.1
				F-06给药	80mg/kg	10	3.5±0.2
F-08给药	80mg/kg	10	2.5±0.3
				F-10给药	80mg/kg	10	2.5±0.3
F-11给药	80mg/kg	10	2.5±0.2

实施例8.代表化合物抑制NF-кB信号通路引起细胞因子含量变化的评价试验

炎症性肠病是一种自身免疫性疾病。在实验中发现，本发明的代表化合物通过抑制XPO1蛋白来调控NF-кB这一与免疫系统疾病及炎症直接相关的关键信号通路。通过对信号通路下游一些重要细胞因子如TNF-α、IL-6含量变化的检测,可以判断代表化合物对于免疫系统疾病或炎症的治疗效果。在实施例7中TNBS造模后的第3天(疾病高发期)分别收集空白动物组、模型动物组、给药治疗组中各3只动物的血清，提取蛋白及tRNA，用ELISA方法检测血清中细胞因子TNF-α、IL-6的含量。结果表明：经本发明的化合物处理后，与模型组对比，治疗组动物血清中的细胞因子TNF-α、IL-6的含量出现了显著的下降，表示本发明的化合物对于调控NF-кB信号通路效果明显，对炎症性肠病具有非常好的治疗效果。代表化合物治疗IBD模型后TNF-α、IL-6的含量的变化具体见表3和表4。

表3.本发明的化合物治疗IBD动物模型血清TNF-α含量(ng/ml)

组别	剂量	动物-1	动物-2	动物-3
					空白	-	0.6	0.3	0.4
IBD模型	-	2.5	2.1	2.2
					5-ASA	80mg/kg	1.7	1.8	2.0
SFN	80mg/kg	2.1	1.8	2.1
					PEITC	80mg/kg	2.0	1.9	2.0
SFE	80mg/kg	1.8	1.8	1.7
					F-01	80mg/kg	2.0	1.7	1.9
F-03	80mg/kg	1.7	1.6	1.5
					F-06	80mg/kg	2.3	2.0	2.2
F-11	80mg/kg	1.8	1.4	1.3

表4.本发明的化合物治疗IBD动物模型血清IL-6含量(ng/ml)

组别	剂量	动物-1	动物-2	动物-3
					空白	-	0.4	0.3	0.1
IBD模型	-	3.0	2.5	2.6
					5-ASA	80mg/kg	2.7	2.2	2.3
SFN	80mg/kg	2.5	2.4	2.3
					PEITC	80mg/kg	2.2	2.1	2.1
SFE	80mg/kg	2.0	1.9	1.9
					F-01	80mg/kg	1.8	1.9	2.0
F-03	80mg/kg	1.7	1.8	1.8
					F-06	80mg/kg	2.8	2.5	2.3
F-11	80mg/kg	1.6	1.4	1.5

实施例9.代表化合物经口施用的安全性测试

向6周龄雄性和雌性SD大鼠灌胃施用化合物溶液(SFE:1000mg/kg/天；F-03:500mg/kg/天；F-09:500mg/kg/天，F-11:500mg/kg/天)连续6周(每组n＝10)。结果，在任一剂量组中没有观察到动物在一般状态、体重改变、食品消耗或组织病理学上的异常。从这些结果中判断,化合物SFE的无毒剂量是1000mg/kg/天以上、化合物F-03、F-09、F-11的无毒剂量是500mg/kg/天以上。实验结果表明这些代表化合物属于微毒性的化合物。

实施例10.代表化合物对HMLE-Snail细胞系球体形成的抑制活性的测定

HMLE-Snail细胞系是研究肿瘤细胞转移、研究EMT途径的最经典的细胞模型之一。HMLE-Snail细胞系由于Snail蛋白的高表达，其最显著的特点之一是细胞形态成球状(spheroid)。因此,通过测定代表化合物对HMLE-Snail细胞系球体生成的抑制，可以判断代表化合物抑制EMT途径从而抑制肿瘤细胞转移的能力(Cell 2008,133:704-715)。本发明的HMLE-Snail细胞系受赠于美国麻省Whitehead研究所Robert Weinberg博士。将1.0×10³个HMLE-Snail细胞/ml混悬在含有1:1比例的DMEM/F12的培养液中(添加有B-27以及N-2，购自美国Invitrogen公司)，在超低附着培养板中培养以允许球体形成。7天后,离心收集球体并计数。通过显微镜评价细胞球状体的形成，并分别评价10μg/ml的SFN分子、10μg/ml的PEITC分子、10μg/ml的多烯紫杉醇(Docetaxel)、10μg/ml的本发明各代表化合物24小时处理后，对HMLE-Snail细胞系球体形成的抑制活性测定，见表5。其中，多烯紫杉醇为一种临床常用化疗药物。

表5.代表化合物对HMLE-Snail细胞系集落生成的抑制活性

化合物	集落(％)	化合物	集落(％)	化合物	集落(％)
						对照	100	SFN	90	PEITC	85
多烯紫杉醇	81	SFE	63	F-01	60-65
						F-02	60-65	F-03	55-60	F-04	60-65
F-05	60-65	F-06	70-75	F-07	55-60
						F-08	50-55	F-09	40-45	F-10	40-45
F-11	40-45

表5注：对照为没有药物处理的细胞，表中的数据为对照的细胞集落数为100％，药物的抑制活性用药物处理组的细胞集落百分比表示为:

药物抑制集落活性＝(处理细胞组集落数/对照细胞组集落数)×100％。

结果表明,本发明各代表化合物对HMLE-Snail细胞系球体形成均具有良好的抑制效果，抑制活性强于多烯紫杉醇、SFN以及PEITC。证明各个代表化合物可以抑制EMT途径,对于抑制肿瘤细胞的转移具有潜在的良好治疗效果。

实施例11.代表化合物对高转移型肺癌细胞株的抑制活性测定

NCI-H1975、NCI-H1650是两株典型的高转移型肺癌细胞株。通过测定代表化合物对这两株细胞株的抑制活性，可以初步判断代表化合物对于转移型肺癌的治疗效果。将肺癌细胞株以每孔6000个/细胞接种在96孔细胞培养板，37℃下培养24小时。加入化合物单独处理并培养。72小时后，利用MTT或者CCK-8的方法测定化合物对于两种肺癌细胞株的抑制活性。利用上述步骤，分别测定SFN、代表化合物等对转移型肺癌细胞株的抑制活性IC₅₀值,结果见表6。

表6.部分代表化合物对两种高转移型肺癌细胞株的抑制活性[72小时，IC₅₀(μM)]。

细胞系	组织	萝卜硫素	SFE	F-01	F-03	F-06	F-11
								NCI-H1975	肺	20.3	8.8	6.9	5.8	17.2	4.5
NCI-H1650	肺	18.1	7.3	5.4	4.9	16.3	5.1

结果表明，本发明的化合物对于高转移型肺癌细胞株具有良好的抑制活性。与SFN相比，本发明的化合物对于肺癌的转移将具有更好的治疗效果。

实施例12.代表化合物对高转移型结肠癌细胞株的抑制活性测定

SW620、HCT116是两株典型的高转移型结肠癌细胞株。将结肠癌细胞株以每孔6000个/细胞接种在96孔细胞培养板，37℃下培养24小时。加入化合物单独处理并培养。72小时后，利用MTT或者CCK-8的方法测定待测化合物对于两种高转移型结肠癌细胞株的抑制活性。结果见表7。

表7.代表化合物对两种高转移型结肠癌细胞株的抑制活性[72小时，IC₅₀(μM)]

细胞系	组织	萝卜硫素	PEITC	SFE	F-03	F-06	F-09
								SW620	结肠	15.1	10.2	4.7	3.2	11.3	2.8
HCT116	结肠	13.2	8.4	3.9	2.5	10.6	3.1

结果表明，本发明的化合物对于高转移型结肠癌细胞株具有良好的抑制活性。与SFN、PEITC相比，本发明的化合物对于结肠癌的转移将具有更好的治疗效果。

实施例13.代表化合物对高转移型淋巴癌细胞株的抑制活性测定

Jeko-1、Raji、U2932、U937和Hut78是五株最为典型的高转移型淋巴癌细胞株,是用来开发抗淋巴癌转移药物的经典细胞模型。将各个淋巴癌细胞株以每孔6000个/细胞接种在96孔细胞培养板，37℃下培养24小时。加入化合物单独处理并培养。72小时后，利用MTT或者CCK-8的方法测定化合物对于两种高转移型淋巴癌细胞株的抑制活性。利用上述步骤，分别测定SFN、PEITC、本发明的化合物对五株高转移型淋巴癌细胞株的抑制活性IC₅₀值。结果见下表。

表8.本发明化合物对高转移型淋巴癌细胞株的抑制活性[72小时，IC₅₀(μM)]。

细胞系	组织	萝卜硫素	PEITC	SFE	F-01	F-03	F-06	F-11
									Jeko-1	淋巴	10.1	8.7	3.6	3.5	3.1	12.0	2.9
Raji	淋巴	11.0	9.3	4.0	3.7	3.2	13.5	3.1
									U2932	淋巴	13.4	11.7	5.9	5.2	4.9	14.7	4.4

U937	淋巴	—	—	5.6	—	—	—	—
									Hut78	淋巴	—	—	5.9	—	—	—	—

实施例14.代表化合物对高转移型卵巢癌细胞株的抑制活性测定

HO-8910、A2780是2株具有高转移潜能的卵巢癌细胞株，是用来开发抗卵巢癌转移药物的经典细胞模型。将两株细胞以每孔6000个/细胞接种在96孔细胞培养板，37℃下培养24小时。加入代表化合物单独处理并培养。72小时后，利用MTT或者CCK-8的方法测定代表化合物对于几种高转移型卵巢癌细胞株的抑制活性。此外,利用上述相似步骤，分别测定萝卜硫素、代表化合物对高转移型卵巢癌细胞株的抑制活性IC₅₀值,结果见表9。

表9.代表化合物对两种典型卵巢癌耐药细胞株的抑制活性[72小时，IC₅₀(μM)]。

细胞系	组织	萝卜硫素	PEITC	SFE	F-01	F-03	F-10
								HO-8910	卵巢	21.3	15.5	6.4	6.2	5.3	4.7
A2780	卵巢	23.2	17.6	7.2	7.5	6.1	5.5

结果表明，与萝卜硫素或PEITC相比，本发明的化合物对高转移型的卵巢癌细胞株具有更好的抑制活性，表明代表化合物对于卵巢癌的复发及转移具有更好的潜在治疗效果。

实施例15.代表化合物对卵巢癌腹腔转移动物模型的治疗效果

卵巢癌腹腔转移动物模型是研究抗卵巢癌转移药物的最经典的动物模型之一。选择5～6周龄、体重相近的雌性裸鼠(BALB/c-nu/nu)60只。筛选SK-OV3(高转移型卵巢癌细胞株)稳定表达绿色荧光蛋白细胞株,并用无血清PRMI1640培养基配制成2×10⁶/100μl的细胞悬液,每只裸鼠腹腔注射100μl的上述肿瘤细胞悬液,并定期观察肿瘤生长情况,继续饲养。肿瘤种植5天后，将60只雌鼠随机分为10组，每组6只，选择腹腔注射给药方式,分别为：空白组(0.9％生理盐水)、治疗组(80mg/kg的代表化合物)每日一次，持续3周，定时在体视显微镜下观察肿瘤生长及转移情况。3周后，利用小动物活体成像仪(Xenogen,上海交通大学医学院)检测并照相。从代表化合物对卵巢癌在腹腔内转移情况的抑制来评价代表化合物对于卵巢癌腹腔转移动物模型的治疗效果。结果如表10所示，其中，T表示治疗组，C表示空白对照组。T/C为(化合物治疗组的V/V₀)/(空白对照组的V/V₀)，其中V表示每测定日的小鼠肿瘤体积，V₀表示给药开始日的小鼠肿瘤体积。其中，代表化合物莱菔素(SFE)对卵巢癌腹腔转移模型的治疗效果具体见图2。

表10.代表化合物对卵巢癌转移动物模型的治疗效果

化合物代号	给药量	T/C(％)	死亡数(30天内)
				对照组	N/D	100	2/6
SFN	80mg/kg	95	1/6

PEITC	80mg/kg	71	0/6
				多烯紫杉醇	20mg/kg	77	0/6
SFE	80mg/kg	42	0/6
				F-01	80mg/kg	37	0/6
F-03	80mg/kg	35	0/6
				F-06	80mg/kg	80	1/6
F-10	80mg/kg	32	0/6

结果表明，本发明的化合物对于扼制恶性卵巢癌的腹腔转移具有良好的效果，其抗恶性卵巢癌腹腔转移的能力要优于多烯紫杉醇、SFN以及PEITC。

实施例16.代表化合物对其他高转移型肿瘤细胞株的抑制活性

将其他几种具有高转移潜能的肿瘤细胞株以每孔6000个/细胞接种在96孔细胞培养板，37℃下培养24小时。加入莱菔素单独处理并培养。72小时后，利用MTT或者CCK-8的方法测定SFE对于高转移型肿瘤细胞株的抑制活性IC₅₀值,结果见表11。

表11.SFE对其他高转移型肿瘤细胞株的抑制活性[72小时，IC₅₀(μM)]。

细胞系	组织	类型	萝卜硫素	SFE
					Panc-1	胰腺	高转移型	12.1	6.7
KYSE-70	食管	高转移型	11.3	6.1
					Saos-2	骨肉	高转移型	14.5	7.8
786-O	肾	高转移型	10.2	5.4
					CaSki	宫颈	高转移型	11.0	6.4

结果表明，SFE对于各个高转移型的肿瘤细胞株具有良好的抑制活性。与SFN相比，SFE对于肿瘤的转移将具有更好的潜在治疗效果。

Claims (1)

1.具有通式F结构的化合物在制备XPO1蛋白抑制剂类药物中的应用，

通式F中：

所述的R选自C₁-C₁₀烃基；

R由基团G任意取代，所述的基团G选自：H，卤素，或者含有0-3个各自独立选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元的单环基团；

n选自0、1或2；

其中所述的XPO1蛋白抑制剂类抗炎药物是用于治疗炎症性肠病的药物。