CN108129319A - 一种Isoforrensin A衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/62—Halogen-containing esters
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
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Abstract

一种Isoforrensin A衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，Isoforrensin A衍生物的结构如式(I)所示。式(I)所述Isoforrensin A衍生物的制备方法，包括1)将Isoforretin A，DMAP溶于二氯甲烷，加入三乙胺，保温0℃～5℃下滴加3‑氯丙酰氯，滴毕后将反应液升温至20℃～25℃并搅拌反应；2)至TLC检测反应完全后，向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取水层三次，合并有机层，有机层用稀盐酸洗涤三次，饱和食盐水洗涤三层。收集有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后得粗品。粗品经快速硅胶柱色谱纯化得纯品目标产物式(I)化合物。

Description

一种Isoforrensin A衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域：
本发明涉及一种新型二萜类化合及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
中国专利申请CN106631804A公开了一种提取自香茶菜属植物的化合物如下式(Isoforresin A，简称Iso A)，该化合物为一种对应-贝壳杉烷二萜衍生物，该申请中指出IsoA是硫氧还蛋白-1抑制剂((thioredoxin-1，简称Trx-1)，先期的研究表明，Trx-1在许多肿瘤细胞和肿瘤组织中异常高表达，因此，筛选新的Trx1选择性抑制剂是医药研发的重要需求，它们可能是极为有效的治疗肿瘤及其他Trx1介导的疾病的药物。实验结果表面IsoA对部分肿瘤细胞具有一定抑制效果，且能够延长肝癌荷瘤小鼠的生存期，但IsoA的抗癌谱较窄，仅对肝癌等少数几种肿瘤治疗效果明显。因此在IsoA基础上进行结构改性提供一种对不同肿瘤具有抑制效果的对应-贝壳杉烷二萜衍生物成为现有技术中亟待解决的问题。
发明内容
我们在现有的Iso A基础上通过化学改性得到一种新的化合物，并惊奇的发现可以明显提高其抗癌效果。
为解决前述技术问题本发明采用的技术方案是，提供一种Isoforrensin A衍生物，其特征在于所述一种Isoforrensin A衍生物的结构如式(I)所示
本发明还提供了式(I)所述Isoforrensin A衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤，
1)将Isoforretin A，DMAP溶于二氯甲烷，加入三乙胺，保温0℃～5℃下滴加3-氯丙酰氯，滴毕后将反应液升温至20℃～25℃并搅拌反应。
2)至TLC检测反应完全后，向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取水层三次，合并有机层，有机层用稀盐酸洗涤三次，饱和食盐水洗涤三层。收集有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后得粗品。粗品经快速硅胶柱色谱纯化得纯品目标产物式(I)化合物；
所述Isoforretin A、DMAP、三乙胺和3-氯丙酰氯的摩尔比为1:0.15～0.25：2～4：2～4。
本发明还提供了如式(I)所示Isoforrensin A衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了如式(I)所示Isoforrensin A衍生物在制备抗胃癌药物中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，其特征是所述药物组合物包括式(I)所示Isoforrensin A衍生物。
本发明还提供了一种药物制剂，包含治疗有效量的式(I)所示Isoforrensin A衍生物以及药学上可接受的赋形剂。
在研究中我们发现，将Iso A进行氯丙酰化后的得到的式(I)化合物，能够显著提高对Trx1的体外抑制活性，在对肿瘤细胞的体外抑制实验中，对胃癌细胞等表现出了更好的抑瘤效果，基于体外抑制实验的结果，在对胃癌荷瘤小鼠的抑瘤实验中，采用式(I)化合物给药的实验小鼠与采用同样剂量Iso A的实验小鼠相比，表现出了更好的抑瘤效果，说明式(I)所示化合物在经过化学改性后，显著提高了对胃癌的抑制效果，具有制成新的胃癌治疗药物的潜力。。
具体实施方式
实施例1式(I)化合物的合成
1)将Isoforretin A，DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶于二氯甲烷，加入三乙胺，保温0℃～5℃下滴加相应的3-氯丙酰氯，滴毕后将反应液升温至20℃～25℃并搅拌反应。
2)至TLC检测反应完全后，向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取水层三次，合并有机层，有机层用稀盐酸洗涤三次，饱和食盐水洗涤三层。收集有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后得粗品。粗品经快速硅胶柱色谱纯化得纯品目标产物式(I)化合物；
Isoforretin A、DMAP、三乙胺和3-氯丙酰氯的摩尔比为1:0.2：2。
对产物进行元素分析的结果为：C，59.56；H，6.61；O，28.15。
产物的化学式为C31H41ClO11
13C-NMR(CDCl3)结果如下表
C的位置 1 2 3 4 5 6 7 8 9
13C-NMR 77.7 38.4 48.4 40.1 40.3 69.4 69.1 38.4 49.6
C的位置 10 11 12 13 14 15 16 17 18
13C-NMR 43.3 30.5 33.7 79.4 76.7 152.1 208.8 116.4 19.7
C的位置 19 20 21 22 23 24 25 26 27
13C-NMR 23.6 23.6 170.2 21.0 170.2 21.0 170.2 21.0 170.2
C的位置 28 29 30 31
13C-NMR 21.0 173.1 38.0 39.0
药理实施例1式(I)化合物在体外反应中对Trx1活性抑制作用
实验材料:
Trx1蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司，Trx1活性检测试剂盒购自美国Caymen Chemical公司。
实验方法:
1)按照试剂盒提供实验方法配制Trx 1检测液；
2)分别加入系列稀释的式(I)化合物(终浓度0-100μM)；
3)37℃孵育30min；
4)每孔加入加5μL NADPH，37℃孵育10min；
5)每孔加入10μl荧光底物，37℃孵育5min；
6)酶标仪检测
7)计算相对酶活力体外条件下Trx活性检测方法:
体外条件下Trx活性检测采用Thioredoxin Activity Fluorescent Assay Kit(Caymen Chemica l)来进行。根据试剂盒说明书的要求，在0.02μM的Trx样品中加入2μL的不同浓度的式(I)化合物(0.1μM to 100μM)，随后每个样品各加入5μL的β-NADPH，37℃孵育30min.最后加入荧光底物，在反应30至60分钟时间段，通过在酶标仪(Thermo ScientificVarioskan Flash fluorescent microplate reader)记录518nm的发射波长(488nm激发)来计算Trx1活性。实验结果见下表
实验结果表明，式(I)化合物在浓度达到0.5μM时开始表现出对Trx1的明显抑制活性(相对酶活力86.5％)，且随着浓度增加对Trx1活性的抑制能力逐渐增加。与IsoA相比，对Trx1的抑制活性明显提高。
药理实施例2式(I)化合物对不同类型的实体肿瘤细胞的抑制效果
式(I)化合物(纯度＞99％)溶解于DMSO，配置100uM母液，-20℃保存。选择十种常见恶性实体肿瘤(包括肺癌，胃癌，乳腺癌，结直肠癌，肝癌，宫颈癌，食管癌，口腔癌，前列腺癌，胰腺癌)，体外培养上述十种肿瘤的肿瘤细胞系及其中五种肿瘤的对应组织正常细胞系，如下：
肺癌：人正常肺上皮细胞HBEC，人肺癌细胞A549，SK-MES-1
胃癌：人正常胃粘膜上皮细胞RGM-1，人胃癌细胞MGC-803，SGC-7901
乳腺癌：人正常乳腺上皮细胞MCF10A，人乳腺癌细胞MCF7，MDA-MB-231
结直肠癌：人正常结直肠粘膜细胞FHC，人结直肠癌细胞Caco-2，LOVO2
肝癌：人正常肝细胞LO2，人肝癌细胞HepG2，Hep3B
宫颈癌：人宫颈癌细胞Hela
食管癌：人食管癌细胞EC109
口腔癌：人舌鳞癌细胞SCC9
前列腺癌：人前列腺癌细胞PC3
胰腺癌：人胰腺癌细胞PANC-1
对于以上各种细胞系，使用不同浓度的式(I)化合物处理24h，然后通过MTT法检测它对不同细胞的抑制效果，计算IC50，结果如下表所示
细胞系 HBEC RGM-1 MCF10A FHC LO2
IC50(μM) 115.0 148.6 94.3 137.7 115.9
细胞系 A549 SK-MES-1 MGC-803 SGC-7901 MCF7
IC50(μM) 33.2 23.1 3.9 4.1 27.4
细胞系 MDA-MB-231 Caco-2 LOVO2 HepG2 Hep3B
IC50(μM) 23.1 22.9 34.2 35.2 20.4
细胞系 Hela EC109 SCC9 PC3 PANC-1
IC50(μM) 32.5 30.8 29.2 25.7 20.8
结果显示：1)式(I)化合物对多组正常细胞系的毒性较小，IC50为100-150uM；2)式(I)化合物对除胃癌细胞外的其他肿瘤细胞系抑制效果较为普通；④式(I)化合物对胃癌细胞(MGC-803，SGC-7901)的抑制效果非常突出，IC50低至4-5uM。因此，选择胃癌作为进一步的动物实验的研究对象。
药理实施例3，对荷瘤小鼠的生存期的对比试验
1.材料
a)细胞株:可稳定表达荧光素酶的胃癌细胞MGC-803，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
b)动物:BALB/c裸小鼠30只，体重(13±2g)，雄性。
c)药物:Iso A(药物1)，式(I)化合物(药物2)
2.实验方法
a)胃癌荷瘤小鼠模型的制作:取对数生长期胃癌细胞MGC-803，膜酶消化后配制成1x10 7cells/mL细胞悬液，lmL注射器接种200μL(100μl细胞+100μl基质胶)细胞悬液于裸鼠的右侧腋下(正常组只注射200μL基质胶)。
b)实验动物分组和给药:饲养两周后通过IVIS小动物成像系统观察小鼠体内荷瘤情况，取构建成功(肿瘤体积≥100mm3)的荷瘤小鼠备用，每组10只(每组平均体积一致，肿瘤体积过大或过小者剔除)。每天腹腔注射给药一次，连续三周。每三天记录一次肿瘤大小，从而确定治疗效果。实验结束处死实验动物，检测肿瘤重量并计算抑瘤率
抑瘤率＝[1-(实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)]×100％。
具体分组与给药如下表
检测各组实验动物的不同给药天数的肿瘤体积、死亡后的肿瘤重量，以及生存期数据加下表，并对结果进行t检验，实验结果见下表(means±s，n＝10)
组别 模型 实验1 实验2
0d/mm3 110±10.90 104±8.28 88±6.16
3d/mm3 130±8.67 118±11.44 93±9.01
6d/mm3 450±33.00 396±29.04 300±29.01
9d/mm3 677±63.19 589±51.05 437±36.38
12d/mm3 903±66.22 768±61.40 463±30.86
15d/mm3 1305±108.75 1031±75.60 584±52.52
18d/mm3 1571±104.73 1210±96.77 642±44.91
21d/mm3 1902±145.82 1369±109.56 690±57.53
平均瘤重/g 1.68 1.19 0.65
抑瘤率％ 29％ 61％
结果表明，式(I)化合物能够具有显著抑制胃癌荷瘤小鼠的肿瘤生长，且在同等剂量下，相对采用IsoA的实验组1，实验组2也能更显著的显著延长荷瘤小鼠的生存期。
制剂实施例
按实施例1制得式(I)化合物，再按下述方法制成片剂:每片由以下组分组成式(I)化合物100mg，淀粉适量、玉米浆适量，硬脂酸镁适量，将上述各组分按照常规片剂制作费方法制作成为片剂。

Claims (5)

1.一种Isoforrensin A衍生物，其特征在于所述Isoforrensin A衍生物的结构如式(I)所示
2.如权利要求1中式(I)所述Isoforrensin A衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤，
1)将Isoforretin A，DMAP溶于二氯甲烷，加入三乙胺，保温0℃～5℃下滴加3-氯丙酰氯，滴毕后将反应液升温至20℃～25℃并搅拌反应；
2)至TLC检测反应完全后，向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取水层三次，合并有机层，有机层用稀盐酸洗涤三次，饱和食盐水洗涤三层。收集有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后得粗品。粗品经快速硅胶柱色谱纯化得纯品目标产物式(I)化合物；
所述Isoforretin A、DMAP、三乙胺和3-氯丙酰氯的摩尔比为1:0.15～0.25：2～4：2～4。
3.如权利要求1中式(I)所述Isoforrensin A衍生物在制备抗胃癌药物中的应用。
4.一种药物组合物，其特征是所述药物组合物包括式(I)所示Isoforrensin A衍生物。
5.一种药物制剂，其特征在于包含治疗有效量的式(I)所示Isoforrensin A衍生物以及药学上可接受的赋形剂。
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CN108047037A (zh) * 2017-12-29 2018-05-18 天津市人民医院 一种对应-贝壳杉烷二萜衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

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