WO2012076822A1 - Peptides et medicament antiviral - Google Patents

Peptides et medicament antiviral Download PDF

Info

Publication number
WO2012076822A1
WO2012076822A1 PCT/FR2011/052909 FR2011052909W WO2012076822A1 WO 2012076822 A1 WO2012076822 A1 WO 2012076822A1 FR 2011052909 W FR2011052909 W FR 2011052909W WO 2012076822 A1 WO2012076822 A1 WO 2012076822A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
peptide
group
peptides
ctar
Prior art date
Application number
PCT/FR2011/052909
Other languages
English (en)
Inventor
Yves Mely
Johannes Langedijk
Volodymyr Shvadchak
Jean-Luc Darlix
Original Assignee
Universite De Strasbourg
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -
Ecole Normale Superieure De Lyon
Pepscan Systems B.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite De Strasbourg, Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -, Ecole Normale Superieure De Lyon, Pepscan Systems B.V. filed Critical Universite De Strasbourg
Publication of WO2012076822A1 publication Critical patent/WO2012076822A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/536—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV

Definitions

  • the present invention relates to peptides for combating the replication of the HIV virus and to their use as a medicament.
  • the pandemic caused by the HIV-1 virus (Human Immunodeficiency Virus Type 1) is one of the major public health problems in the world. This pandemic is especially dramatic in developing countries, where treatment costs prevent the control of this pandemic. In some parts of Africa, infection rates of up to 50% are observed, completely disrupting the socio-economic life of these regions.
  • HIV treatment takes stock of current therapies (http://www.aidsmeds.com/list.shtml [1]). HIV treatment currently relies on a combination of molecules targeting the three enzymes of the virus: reverse transcriptase (RT), protease (PR) and integrase (IN). There is also an inhibitor of the fusion of the virus to the target cells, but very limited use. There is no vaccine solution against this virus to date, despite the many trials, including that of Merck (Bradac K, Dieffenbach CW.) HIV vaccine development: Lessons from the past, informing the future IDrugs, 2009 Jul; ): 435-9 [2]).
  • RT reverse transcriptase
  • PR protease
  • integrase integrase
  • NCp7 inhibitors target to eject the zinc atoms (Rice et al, 1993 [3], Rice et al, 1995 [4]).
  • Recent reviews (de Rocquigny et al, 2008 [5] and Goldchmidt et al., HIV therapy 2010 [6]) provide a detailed description of the approaches developed to date against the protein of the nucleocapsid, and describe the principles and limits these approaches, in particular the lack of specificity, which have not yet made it possible to use these molecules in therapy.
  • the major problem of the AIDS virus is its great genetic variability. Mutations of the virus occur at a very high frequency, especially at the level of the enzymes of the virus, generating resistance to antivirals. To limit the appearance of resistance, antivirals are used in combination so-called tritherapies, targeting several enzymes by different mechanisms. Nevertheless, resistances are more and more frequently observed, forcing the clinician to change treatments.
  • the current means of fighting the HIV-1 virus have many other disadvantages such as the toxicity of drugs targeting RT, RA and ⁇ , a largely incomplete specificity, the cost and difficulty of production of drugs etc.
  • the present invention specifically addresses the aforementioned problems of the prior art by providing peptides for effectively controlling replication of the HIV virus.
  • the subject of the present invention is in particular a peptide comprising the sequence X a X b X c X d X e , in which:
  • X a is selected from the group consisting of KKVKF (SEQ ID NO: 317), KKVKW (SEQ ID NO: 318), KKVKY (SEQ ID NO: 319), KVKW (SEQ ID NO: 320), KVKY (SEQ ID NO. 321), KVKF (SEQ ID NO: 322), KKF, KKW and KKY;
  • X b is selected from the group consisting of T, R, TR, RR, ARR, TAR,
  • TARR SEQ ID NO: 323
  • TAAR SEQ ID NO: 324
  • TARA SEQ ID NO: 325)
  • TARRA SEQ ID NO: 326
  • TAARR SEQ ID NO: 327
  • TARAR SEQ ID NO. 328
  • TAAARR SEQ ID NO: 329
  • TARAAR SEQ ID NO: 330
  • TARRAA SEQ ID NO: 331
  • AATARR SEQ ID NO: 332
  • AATAAR SEQ ID NO: 333
  • X e is selected from the group consisting of GW, GW D , W, AW and AW D ;
  • - X d is nothing or selected from the group consisting of GR, AR, A, R and G;
  • X e is selected from the group consisting of MK, QMK, QMKK (SEQ ID NO: 334), NMK and NMKK (SEQ ID NO: 335).
  • W D is D-tryptophan.
  • X may for example be selected from the group consisting KKF, KKVKF (SEQ ID NO. 317),
  • KKVKW (SEQ ID NO: 318), KVKW (SEQ ID NO: 320) and KVKF (SEQ ID NO. 322), for example in the group comprising KKVKF (SEQ ID NO: 317), KKVKW (SEQ ID NO: 318), KVKW (SEQ ID NO: 320) and KVKF (SEQ ID NO: 322).
  • X b may for example be selected from the group consisting of RR, ARR, TARR (SEQ ID NO: 323), TARRA (SEQ ID NO: 326), TAARR (SEQ ID NO: 327), TARAR (SEQ ID NO: 328), TAAARR (SEQ ID NO: 329), TARRAA (SEQ ID NO: 331), and AATARR (SEQ ID NO: 333).
  • X b may be selected from the group consisting of TARR (SEQ ID NO: 323) and AATARR (SEQ ID NO: 333).
  • X e may for example be chosen from the group comprising GW and W.
  • X d may for example be nothing or GR.
  • X e may for example be selected from the group consisting of QMK, QMKK (SEQ ID NO: 334) and MK.
  • K may be replaced by R.
  • V may be replaced by M, L or I.
  • amino acids of the peptide sequence according to the invention are generally of L form, but may for example be in the D form.
  • amino acids of the peptide sequence according to the invention can be methylated.
  • the peptide according to the present invention may further comprise 1 or 2 Cysteine residues (C). These cysteine residues can be integrated at any point in the sequence.
  • KKC YTAARG WG RQ M
  • KKC 191 KVKFCTARAARG WCG RQMK
  • the peptide according to the invention may be linear or cyclic.
  • cysteine residues may be protected by any means known to those skilled in the art.
  • cysteine residues may be protected by methylation, acylation or disulfide bond formation. Examples of linear peptides are shown in Table 1 above.
  • cysteine residues may optionally be integrated in said sequence.
  • the cysteine residues may be integrated in a peptide according to the invention during the synthesis of said peptide.
  • the peptide according to the invention may for example be chosen from SEQ ID NO. 1 to 306. These may be for example the peptides shown in Tables 2 and 6 to 9 below. Preferred peptides according to the invention are those having a relative inhibitory activity greater than 1.5, preferably greater than 2.5, preferably greater than 3.5.
  • the cyclization can, for example, be carried out by a bond between the C-terminal and N-terminal ends of the peptide as presented by Tulla-Puche and Barany (Judith Tulla-Puche and George Barany "On-Resin Native Chemical Ligation for Cyclic Peptide Synthesis", J. Org Chem., Vol 69, pp 4101-4107, 2004 [8]).
  • Tulla-Puche and Barany Judith Tulla-Puche and George Barany "On-Resin Native Chemical Ligation for Cyclic Peptide Synthesis", J. Org Chem., Vol 69, pp 4101-4107, 2004 [8].
  • all the sequences shown in Table 1 above can be cyclized via cysteine residues present or added in a peptide according to the invention.
  • cysteine residues When two cysteine residues are present or integrated in the sequence of the peptide according to the invention, they are preferably at a distance allowing cyclization of the peptide, said cysteine residues being connected to one another via their free -SH group, that is to say say by means of an intramolecular disulfide bridge, or a spacer arm.
  • cysteine residues being connected to one another via their free -SH group, that is to say say by means of an intramolecular disulfide bridge, or a spacer arm.
  • the two cysteine residues can be integrated at 4 amino acids apart, for example 5 amino acids apart, for example 6 amino acids apart, for example 7 amino acids apart, for example to 8 amino acids apart, for example 9 amino acids apart, for example 10 amino acids apart, for example 1 1 amino acids apart, for example 12 amino acids apart, for example example at 13 amino acids apart, for example 14 amino acids apart, for example 15 amino acids apart, for example 16 amino acids apart, for example 17 amino acids apart, for example at 18 amino acids apart, for example 19 amino acids apart.
  • the two cysteine residues may, for example, be present or integrated in the N- or C-terminal ends of the peptide according to the invention.
  • the cysteine residues can also be integrated between X a and X b , X b and X e , X e and X d , X d and X e or X e and X e , or in X a or X b .
  • disulfide bridge means a covalent bond which, by oxidation, combines the thiol functions of two cysteines.
  • disulfide bridge is made from two cysteines of the same amino acid sequence, it is called "intramolecular disulfide bridge”. Examples of cyclic peptides whose ring is formed via an intramolecular disulfide bridge according to the present invention are shown in Table 9 below.
  • spacer arm means any molecule for connecting two amino acids of the peptide sequence according to the invention.
  • the spacer arm makes it possible to connect two cysteine residues of the peptide sequence according to the invention.
  • the spacer arm can also be called "LINKER” or "li”.
  • the spacer arm may, for example, be chosen from the group comprising a C1-C6 alkyl and a compound chosen from compounds of formula:
  • n is an integer from 0 to 10
  • m is an integer from 0 to 10
  • X is selected from the group consisting of oxygen, sulfur, CH 2 , NH and an NCH group 3 .
  • the "open" end for example the groups CH 2 - or -S-, are related to the sulfur atom of the cysteine residues of the peptide according to the invention.
  • the spacer arm can connect two amino acids of the peptide sequence according to the invention by any means known to those skilled in the art. For example, the protocol described in Balraju et al. (2005) [9] and in Litovchick et al. (2008) [10].
  • the peptide according to the invention may be associated with any substance that allows or facilitates its penetration into a cell.
  • the peptide according to the invention may comprise, at its carboxy-terminal end, a signal peptide. It can be any signal peptide well known to those skilled in the art (Von Heijne G. et al., "Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP, and related tools", Nature Protocols, vol 2, pages 3569 -3571, 2007 [11]).
  • the signal peptide may be selected from the sequences comprising SQPKRRKK (SEQ ID NO: 307), SKL, KDEL (SEQ ID NO: 308), PPKKKRV (SEQ ID NO: 309), MMSFVALLLVGILFWAWEAEQLTKCEVFQ (SEQ ID NO: 310). , MLSLRQSIRFFKCSSRYLL (SEQ ID NO: 31 1) and ALWRALWFRLWRLAWFRLWR (SEQ ID NO.312).
  • the peptide according to the invention may for example also be associated with a cell penetration peptide (CPP).
  • CPP cell penetration peptide
  • the peptide according to the invention is associated with the CPP at its carboxy terminus. terminal.
  • the CPP may be a sequence selected from the group consisting of Ac-ALW RALW RLW RLAW F RLW R-Cya (NanoVepep, SEQ ID NO: 312), Ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-Cya (Pep-1, SEQ ID NO.
  • the CPP is SEQ ID NO.312.
  • the signal peptide or the CCP can be attached to any peptide according to the invention. Experiments showing the efficacy of these peptides are shown in Table 7.
  • the signal peptide or the CPP can be synthesized chemically, for example by solid-state chemical synthesis. It may be for example a synthetic method in Fmoc chemistry, such as that described in "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach Series) WC Chan (Editor), Peter D. White (Editor) "Oxford Univ Press 2000” [13].
  • the signal peptide or the CPP peptide may be combined with the peptide according to the invention by any means known to those skilled in the art.
  • a signal peptide may be associated with a peptide according to the invention by synthesis of an amino acid sequence corresponding to the succession of the sequence of a signal peptide and the sequence of a peptide according to the invention.
  • a CPP peptide may be associated with a peptide according to the invention by synthesis of an amino acid sequence corresponding to the CPP peptide and combination thereof with the sequence of a peptide according to the invention.
  • NCp7 nucleocapsid protein
  • NCp7 protein NCp7 protein
  • NCp7 nucleocapsid protein
  • NCp7 of HIV-1 is formed of two highly conserved zinc fingers. This protein plays a crucial role in several key stages of the HIV virus cycle, especially during the two strand breaks during reverse transcription.
  • the functions of the nucleocapsid rely largely on its chaperone properties which appear highly dynamic (Darlix JL et al., J. Mol Biol, 254, 523, 1995 [14], Levin et al., 2005 [15]).
  • NCp7 protein The importance of the NCp7 protein is illustrated by the total loss of infectivity following point mutations altering the globular structure of zinc fingers (Demene et al., Biochemistry, vol 33 pages 1,1707, 1994 [16]; al., J. Virol, vol 67, page 6159, 1993 [17], Gorelick et al., J. Virol, vol 73, page 8185, 1999 [18], Gorelick et al., J. Virol, vol 64, page 3207, 1990 [19] and Tanchou et al [20]).
  • This basic protein plays a critical role in the viral cycle, mainly by chaperoning transconformations of the viral genome required during the replication of the virus, especially during retrotranscription.
  • Reverse transcription is a key step in the replicative cycle of HIV-1, in which single-stranded genomic RNA is converted to double-stranded proviral DNA. This step is catalyzed by the reverse transcriptase (or reverse transcriptase) and its effectiveness and especially its specificity increase under the action of the nucleocapsid protein p7 (NC or NCp7).
  • the inventors are the first to have developed effective NCp7 competitors that can inhibit viral replication. These competitors are the peptides of the present invention.
  • the peptides according to the invention have made it possible to inhibit the production of the virus by T1 lymphocytes at doses up to a few nanomolar while AZT, one of the reference compounds, directed against the reverse transcriptase is only active at micromolar doses in the same test.
  • the present invention also relates to a peptide according to the invention for use as a medicament.
  • the drug is an anti-retroviral.
  • the drug is an anti-HIV
  • the drug is an anti-HIV-1.
  • the peptide of the present invention can be used as a medicine for the treatment of AIDS.
  • the peptide of the present invention can be used as a drug for the treatment of AIDS resulting from HIV infection, for example HIV-1.
  • the peptide alone or a mixture of peptides according to the invention can be used.
  • the peptide mixture may comprise 2 peptides according to the invention, for example 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more than 9 peptides according to the invention.
  • a combination of the peptides according to the invention can indeed make it possible to further increase the anti-retroviral action.
  • the peptide according to the invention may be used as a medicament alone, that is to say in mono-therapy, or in the context of a bi-therapy, a tri-therapy or a quadri-therapy, that is, associated with other treatments, with other active molecules.
  • the peptide according to the present invention can be used alone or in combination with any known treatment for controlling HIV.
  • the term "used in combination" a use of the peptide according to the invention jointly or simultaneously, concomitantly or sequentially, with any known treatment for the fight against HIV.
  • the mode of administration may be identical or different depending on the co-administered molecules.
  • peptide means the separate use of the peptide according to the invention and any known treatment for combating HIV, by the same or different routes of administration during the same period of administration.
  • uccessive means the separate use of the peptide according to the invention and any known treatment for the control of HIV, by identical or different administration routes during different periods of administration.
  • administration period refers to the time during which a treatment is administered. It may, for example, be several days, for example two days, three days, four days, etc., for example one or more weeks, for example a week, two weeks, three weeks, etc., for example a or several months, for example one month, two months, three months, etc., for example one or more years, for example one year, two years, three years, etc.
  • the peptide according to the invention may be used in combination with at least one antiretroviral.
  • the peptide according to the invention can be used as a medicament, said medicament further comprising at least one antiretroviral.
  • the antiretroviral may be for example chosen from the group comprising: AZT, lamivudine, emtricitabine, didanosine, stavudine, abacavir, zalcitabine, tenofovir, racivir, amdoxovir, apricitabine, elvucitabine, efavirenz, nevirapine, etravirine, delavirdine, rilpivrin, tenofovir, fosalvudine, amprenavir, tipranavir, idinavir, saquinavir, fosamprenavir, ritonavir, darunavir, atazanavir, nelfinavir, kaletra, raltegravir, elvitegravir, MK-2048, enfuvirtide, vicriviroc, TNX-355 and bevirimat.
  • the peptide according to the invention may be used in combination with a combination of antiretrovirals selected from the group comprising: zidovudine + lamivudine; abacavir + lamivudine; tenofovir + emtricitabine; abacavir + lamivudine; abacavir + lamivudine + zidovudine; tenofovir + emtricitabine + efavirenz.
  • the peptide according to the invention used as a medicament may be in any form of appropriate administration.
  • the peptide according to the present invention may, for example, be intended for oral administration or injection.
  • the peptide according to the invention may be in injectable form.
  • the peptide according to the invention can be packaged in any form known to those skilled in the art to be administered by injection. It can be for example a bottle or a bulb.
  • the injection may be an intramuscular, intravenous or intraperitoneal injection.
  • the peptide may be in the form of capsules, loose powder, lyophilisates, granules, minigranules, microgranules, soft-shell capsules, hard-shell capsules, uncoated tablet, coated tablet, effervescent tablet, soluble tablet, dispersible tablet, orodispersible tablet, solution, emulsion or suspension.
  • the peptide according to the invention may be combined with a pharmaceutically acceptable excipient, adjuvant or carrier.
  • excipient, adjuvant or pharmaceutically acceptable carrier means any substance for diluting or transporting the peptide according to the invention.
  • the pharmaceutically acceptable excipient does not affect the effectiveness of the peptide.
  • the pharmaceutically acceptable excipient or adjuvant may be any substance known to those skilled in the art for administering a small peptide.
  • the excipient is an aqueous solution this may be, for example, any of the solutions presented in Heitz et al., 2009 (Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics, Heitz F, Morris TM, Divita G. Br J Pharmacol 2009 May; 157 (2): 195-206 [23]) or in Wehrle P. (Wehrle P., Galenic Pharmacy, Pharmaceutical Formulation and Technology, 2007 [24]).
  • the excipient when it is an emulsion, it can be a water-in-oil emulsion, oil in water, water-in-oil in water (Wehrle P. [24]).
  • the excipient is an excipient allowing the formation of a capsule, a free powder, a lyophilisate, a granule, a minigranule, a microgranule, a soft-shelled capsule, d a hard shell capsule, an uncoated tablet, a coated tablet, an effervescent tablet, a soluble tablet, a dispersible tablet, an orodispersible tablet, a solution, a an emulsion or a suspension. It may be for example any excipient known to those skilled in the art to manufacture these formulations. It may be for example an excipient presented in Wehrle P. [24].
  • the peptide of the present invention may be administered as a drug, preferably in an amount sufficient to combat HIV.
  • the synthesis of the peptide according to the present invention can be carried out by any method known to those skilled in the art. This may be for example a chemical synthesis or genetic engineering.
  • the peptides can be synthesized chemically, for example by chemical synthesis on a solid support. It may be for example a synthesis process in Boc and / or Fmoc chemistry.
  • the present invention also relates to a method for synthesizing a peptide according to the invention, said method comprising a synthesis step in Boc chemistry and / or Fmoc chemistry.
  • a method for synthesizing a peptide according to the invention comprising a synthesis step in Boc chemistry and / or Fmoc chemistry.
  • the synthesis of the peptide according to the invention is carried out by genetic engineering, it is possible, for example, to construct a large peptide comprising the peptide of the present invention and to digest it with restriction enzymes in order to collect the peptide of the invention.
  • a large peptide comprising the peptide of the present invention
  • restriction enzymes for example, the protocol described in F. Cordier-Ochsenbein et al. J. Mol. Biol. 279, 1177-1185 [25].
  • the peptide according to the invention is of small size, ranging from 8 to 21 amino acids. It therefore advantageously has excellent stability over time and excellent accessibility to the interaction sites.
  • Figure 1 shows the primary structure of NCp7 nucleocapsid protein.
  • FIG. 2 represents the tertiary structure of NCp7 nucleocapsid protein.
  • FIG. 3 is a schematic representation of the destabilizing activity of NCp7 on cTAR.
  • D and Q respectively represent a fluorophore and a fluorescence inhibitor.
  • FIG. 4 represents a diagram respectively showing the fluorescence, expressed in arbitrary units, (a) cTAR, (b) cTAR in the presence of NCp7, and (c) cTAR in the presence of NCp7 and a peptide according to FIG. invention ("inh”).
  • FIG. 5 represents the titration of fluorescein-labeled cTAR ("cTAR-FI") at a concentration of 50 nanomolar (nM), in the presence of the peptides pA, pB, pC, pD or pE.
  • cTAR-FI fluorescein-labeled cTAR
  • nM nanomolar
  • [Pep] represents the concentration of peptides, expressed in micromolar ( ⁇ ).
  • A represents anisotropy.
  • FIG. 6 represents the destabilizing activity of the peptides according to the invention (pA, pB, pC, pD and pE) on cTAR doubly labeled with Rhodamine 6G and Dabcyl.
  • inh / cTAR represents the ratio of peptides on cTAR.
  • l / lo represents the ratio of the fluorescence intensity in the presence of peptide according to the invention to that in its absence.
  • FIG. 7 represents the evolution of the binding of a peptide according to the invention ("INH") with cTAR or the cTAR * NCp7 complex when the INH ratio on cTAR increases.
  • INH ratio on cTAR increases.
  • INH ratio on cTAR increases.
  • A represents anisotropy.
  • FIG. 8 represents a diagram of the interaction mechanisms between NCp7 (“NC”) and the peptides according to the invention ("INH”) with cTAR.
  • NC NC
  • IH peptides according to the invention
  • FIG. 9 represents the comparison of the inhibitory activity of five peptides according to the invention (pA, pB, pC, pD, pE) on the destabilization of the cTAR / NCp7 complex.
  • the abscissa represents the concentration of peptides ("[inh]”) expressed in nanomolar (nM).
  • the ordinate represents the residual destabilizing activity of NCp7 as measured by the cTAR opening (cTAR melt).
  • FIG. 10 represents the percentage of binding of a peptide according to the invention to cTAR ("(a)”) and to the cTAR-NCp7 complex ("(b)"), and the percentage of inhibition of the destabilization of cTAR by NCp7 ("(c)”).
  • - Figure 1 1 shows a diagram of the competition between NCp7 and peptides according to the invention on the cTAR binding.
  • the stars " * " indicate the connections between these different entities.
  • FIG. 12 represents the correlation between the cTAR binding and the inhibitory activity on the destabilization of cTAR of five peptides according to the invention
  • the binding is expressed according to the logarithm of K / KpE where K is the affinity of a given peptide for cTAR (Table 3) and K PE is the affinity of peptide E for cTAR.
  • the inhibitory activity is expressed by the ratio [NCp7] / IC50 where [NCp7] denotes the concentration of NCp7 and IC50, the concentration of peptide which inhibits at 50% the destabilization of cTAR, induced by NCp7. "Bind” means binding and "inh” means inhibition.
  • FIG. 13 shows three examples of cyclic peptides according to the invention, (a) represents an intramolecular cyclization via a disulfide bridge. (b) and (c) represent two examples of cyclic peptides via a linker.
  • FIGS. 14A, 14B, 14C and 14D show the inhibition of the destabilizing activity of NCp7 by peptides (pm) according to the invention.
  • the abscissa represents the ratio of peptide concentrations ("[inh]") to that of NCp7.
  • the ordinate represents the ratio of the fluorescence intensity of the cTAR / NC complex in the presence of peptide to that of the complex in the absence of inhibitor.
  • 30mM NaCl buffer; 0.2mM MgC; "tris" 25mM; pH 7.4.
  • the concentration of cTAR is 0.02 ⁇ and that of NCp7 is 0.2 ⁇ .
  • Excitation wavelength 520 nm.
  • FIG. 15 represents the effect of the peptides (p2, p10, p23) formulated with the Nanovepep vector peptide on HIV-1 lentivectors transduced in HeLa cells, in comparison with the effect of AZT.
  • the abscissa represents the concentration of peptides in nanomolar (nM) or the concentration of AZT in micromolar ( ⁇ ).
  • the ordinate represents the percent GFP expression (GFP exp,%).
  • FIG. 16 represents the inhibition of the production of HIV-1 in SupT1 cells by peptides according to the invention (p2, p10, p23) complexed with Nanovepep, or by a control (AZT).
  • the abscissa represents the concentration in peptides in nanomolar (nM) or the concentration of AZT in micromolar ( ⁇ ).
  • the ordinate represents the percent GFP expression (GFP exp,%).
  • the process used in this experiment is a solid support chemical process.
  • the solid phase chemical synthesis begins with the fixing on the solid support, an HMP resin ("4-Hydroxymethylphenoxyacetyl-4'-ethylbenzyhydrylamine resin"), of the first amino acid whose amine function has been previously protected with a Fmoc group ("9 - fluorenylmethyloxycarbonyl ").
  • HMP resin 4-Hydroxymethylphenoxyacetyl-4'-ethylbenzyhydrylamine resin
  • Fmoc group 9 - fluorenylmethyloxycarbonyl
  • a second step the amine function is deprotected using piperidine in NMP ("N-methyl-2-pyrrolidinone”), then the second amino acid whose carboxyl group was activated with a HBTU / HOBt mixture (" 2- (1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate / 1-hydroxy-benzotriazole ”) is attached to the first amino acid by an amidation reaction.
  • This step is repeated as many times as necessary until the desired sequence is obtained.
  • the synthesized peptides are then filtered and precipitated with diethyl ether ("Et 2 O").
  • the cTAR sequences were obtained by synthesis and purification at 0.02 mmol by HPLC (IBA GmbH Nucleic Acids Product Supply, Goettingen, Germany).
  • the cTAR sequences were respectively labeled in 5 'with rhodamine 6G (Rh6G) via an amino-alkyl with six carbon atoms and at 3' with a fluorescent quencher: Dabcyl (or 4 '- (dimethylamino-phenylazo) - benzene) according to the protocol presented in particular in Li et al. (Li, JJ, X. Fang, SM Schuster, and W. Tan, 2000a, Molecular Beacons: A Novel Approach to Detect Protein - DNA Interactions, Angew Chem Int Ed Engl 39: 1049-1052 [26], Li, JJ, R Geyer and W.
  • the oligonucleotide was then purified by RF HPLC followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The purity of the labeled oligonucleotides was verified by electrospray mass spectrometry and was thus determined to be greater than 93%.
  • NCp7 nucleocapsid protein was obtained according to the following protocol, described in Cornille et al. (Cornille F., Mely Y., Ficheux D., Salvignol I., Gerard D., Darlix J.-L., Fournié-Zaluski M.-C. and Roque B (1990) Solid phase synthesis of the retroviral nucleocapsid NCp10 of murine Moloney leukemia virus and related zinc-fingers in free SH forms: Influence of zinc chelation on structural and biochemical properties, Int.JP Pept.Protein Res., 36, 551-558 [31]).
  • NC peptide (1-1.5) was synthesized by solid phase peptide synthesis on a 433A synthesizer (ABI, Foster City, Canada). The synthesis was carried out at a scale of 0.1 mmol using the standard fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) / amino acid coupling protocol from 0.54 mmol / g of HMP resin having preloaded asparagine (ABI).
  • Fmoc deprotected peptidylserine 100 mg were isolated and washed twice with NMP. Cleavage of peptidylserine and deprotection were performed for two hours using 10 mL of a solution of trifluoroacetic acid ("TFA") containing water (5%, v / v), phenol (2, 5%, v / v), thioanisole (5%, v / v) and ethanedithiol (2.5%, v / v).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the solution was concentrated by vacuum and the peptide was precipitated using ice-cold diethyl ether and then pelleted by centrifugation. The pellet has then washed with diethyl ether and stained prior to solubilization with aqueous TFA (0.05%, v / v).
  • the purification by HPLC was carried out on a C8 column (uni-sphere 300A, 5 mm, 250x10, Interchim, France) in a water / acetonitrile mixture containing 0.06% of TFA with a linear gradient of 10-70% of acetonithy during 30 minutes, and was followed by absorption at 220 nm.
  • test medium was made by mixing in distilled water:
  • the fluorophore and the fluorescence inhibitor are close, so that only very weak fluorescence is observed.
  • test medium identical to that of Example 4 was prepared. 1 ⁇ l of NCp7 was then added to the medium.
  • test medium 126 tests were carried out so that each of the 63 peptides was added to test medium at a concentration of 1 ⁇ or 10 ⁇ .
  • the percentage inhibition of the formation of the cTAR-NCp7 complex was measured by fluorescence measurement at ten minutes and one hour after the addition of the peptides according to the same principle as that presented in Example 4.
  • Inhibition (%) (1 - (If -lf 0 ) / (lfmax-lfo)) * 1 00
  • NC 'Add 1 where I is the fluorescence intensity cTAR doubly labeled in the presence of NCp7 and tested peptide, Royalty is cTAR fluorescence intensity doubly labeled in free form and N c is the fluorescence intensity cTAR doubled in the presence of NCp7 alone.
  • the relative inhibitory activity ("R" in Table 2 below) of the peptides was obtained by summing the results of the four independent measurements obtained with 1 ⁇ and 10 ⁇ of each peptide.
  • KKVKFTARRGWGRQMKKx 83 1 .00 1 .00 1 .00 1 .00 4.00
  • KVKWTARRGWGRQMKx 290 1 .00 1 .00 0.65 0.73 3.38 xKVKFTAARRGWGRQMKx 213 0.96 0.77 0.68 0.81 3.22 xKVKFTARARGWGRQMKx 223 0.61 0.93 0.74 0.76 3.04 xKVKFTARRAGWGRQMKx 232 1 .00 0.93 0.50 0.54 2.97
  • KVKFTARRWGRQMKx 247 1 .00 0.99 0.41 0.48 2.88
  • KVKFTARRGWGRQMKx 240 1 .00 1 .00 0.27 0.32 2.59
  • KVKFRRGWGRQMKx 204 0.99 0.95 0.17 0.20 2.31
  • KVKFTAAARRGWGRQMKx 206 0.85 0.59 0.12 0.16 1 .72
  • KVKFTARRGWMKx 244 0.55 0.25 0.31 0.38 1 .49
  • KVKFTARRAAGWGRQMKx 230 1 .00 0.17 0.16 0.14 1 .47
  • KVKFRGWGRQMKx 200 0.71 0.42 0.1 1 0.08 1 .32
  • KVKFTARRGWMKx 241 0.80 0.19 0.09 0.10 1 .18 xKVKWTARRGWQMKx 291 0.48 0.49 0.10 0.09 1 .16
  • KVKFAATARRGWQMKx 192 0.45 0.00 0.28 0.32 1 .05 xKVKFTARARGWQMKx 215 0.27 0.37 0.18 0.18 1 .00 xKVKFTAARRGWQMKx 213 0.33 0.55 0.05 0.05 0.98
  • KVKFTARAARGWQMKx 202 0.45 0.09 0.15 0.18 0.87
  • KVKFTARRAGWQMKx 243 0.56 0.07 0.09 0.10 0.82
  • KVKFTARRAAGWQMKx 231 0.35 0.22 0.1 1 0.10 0.78
  • KVKFTGWGRQMKx 249 0.28 0.00 0.21 0.21 0.70
  • KVKFARRGWQMKx 210 0.57 0.00 0.03 0.05 0.65
  • KVKFTARARGWQMKx 226 0.40 0.00 0.12 0.10 0.62
  • KVKFTARRGWQMKx 246 0.40 0.02 0.1 1 0.08 0.61
  • KVKFTARRAAGWQMKx 258 0.44 0.00 0.08 0.08 0.60
  • KVKFTAAARRGWQMKx 207 0.34 0.25 0.00 0.00 0.59
  • KVKFTARRWQMKx 248 0.55 0.02 0.00 0.00 0.57
  • KVKFTRGWQMKx 252 0.41 0.00 0.10 0.02 0.53 xKVKWTARRGWQMKx 253 0.26 0.18 0.06 0.02 0.52
  • KVKFRGWQMKx 201 0.35 0.00 0.06 0.1 1 0.52
  • KVKFTARGWQMKx 21 1 0.33 0.00 0.04 0.09 0.46 xKVKFTARGWQMKx 228 0.29 0.03 0.05 0.03 0.40
  • KVKFTAARGWQMKx 196 0.22 0.00 0.10 0.07 0.39 xKVKWTARAGWQMKx 281 0.13 0.12 0.06 0.02 0.33
  • KVKFTARAGWQMKx 222 0.33 0.00 0.00 0.00 0.33
  • KVKFTAARGWQMKx 212 0.28 0.00 0.00 0.04 0.32
  • KVKFTGWQMKx 236 0.24 0.00 0.00 0.03 0.27 xKVKFTGWQMKx 250 0.26 0.00 0.00 0.00 0.26
  • KVKFRGWQMKx 220 0.18 0.00 0.04 0.02 0.24 xKVKFTRGWQMKx 245 0.10 0.00 0.01 0.00 0.1 1
  • Al 1 ⁇ and Al 10 ⁇ correspond to the inhibitory activity of peptides at concentrations of 1 ⁇ and 10 ⁇ .
  • the "x” in the peptide sequences respectively represent the amidation and acylation of the C- and N-terminal residues.
  • KVKFTARRWGRQMKx (SEQ ID No. 247), referred to as "pB"
  • test medium was made by mixing in distilled water: 30mM NaCl, 0.2mM MgCl 2 and 25mM, Tris and 50nM fluorescein-labeled cTAR. Then the pH was stabilized at 7.4 by addition of HCl,
  • NCp7 the number of binding sites of the aforementioned peptides on cTAR is 1 1.
  • the measured binding constants of the five peptides tested (pA, pB, pC, pD and pE) are shown in Table 3 below.
  • test medium was made by mixing in distilled water: 30mM NaCl, 0.2mM MgCl 2 and 25mM, Tris and 100nM labeled cTAR obtained in Example 2. Then the pH was stabilized at 7.4 by addition of HCl,
  • the destabilization of cTAR by the peptides was measured at different peptide concentrations by fluorescence spectroscopy (FIG. 6). Destabilization was described by the change in fluorescence intensity, compared with unlabeled cTARs. When cTAR is not destabilized, that is to say in the absence of peptide, the measured intensity (l / lo) is 1.
  • test medium was made by mixing in distilled water: 30mM NaCl, 0.2mM MgCl 2 and 25mM, Tris and 50nM labeled cTAR obtained in Example 2. Then the pH was stabilized at 7
  • the fluorescence measurements were carried out using an SLM 8000 spectrofluorometer (Aminco, Urbana, IL) at increasing concentrations of peptide (pE), in the presence or absence of NCp7 at 1. , 5 ⁇ , according to the same principle as that presented in Example 4.
  • the anisotropy values of the labeled cTAR bound NCp7 are slightly higher than the marked cTAR bound pE anisotropy because the molecular weight of NCp7 is greater than that of pE ( Figure 4).
  • test medium was made by mixing in distilled water: 30mM NaCl, 0.2mM MgCl 2 and 25mM Tris, 33nM labeled cTAR obtained in Example 2 and 660nM NCp7. Then the pH was stabilized at 7.4 by addition of HCl,
  • the fluorescence measurement was carried out by the fluorescence measurement was carried out using a spectrofluorometer (FluoroLog Horiba, Jobin Yvon, Longjumeau) with increasing concentrations of peptides (pA, pB, pC, pD and pE) according to the same principle as that presented in example 4.
  • a spectrofluorometer FluoroLog Horiba, Jobin Yvon, Longjumeau
  • FIG. 9 A decrease in fluorescence was observed (FIG. 9) indicating that the peptides according to the invention effectively inhibit the destabilization of cTAR induced by NCp7.
  • the ratio IC 5 o / [NCp7] is about 0.7 to 1, indicating that the destabilization induced by NCp7 is reduced by a factor of two when 0.7 to 1 pE is added by cTAR. . Since eleven NCp7 molecules bind to cTAR, it has been deduced that a very small amount of pE can greatly reduce the activity of NCp7 ( Figure 10).
  • IC 5 o / [NCp7] ratio values of five tested peptides are shown in Table 5 below.
  • FIG. EXAMPLE 10 Test of the Efficacy of Linear and Cyclic Peptides According to the Present Invention on the Inhibition of the Destabilization of cTAR by NCp7
  • test medium was made by mixing in distilled water: 30mM NaCl, 0.2mM MgCl 2 and 25mM Tris, 0.02 ⁇ of labeled cTAR obtained in Example 2 and 0.2 ⁇ of NCp7. Then the pH was stabilized at 7.4 by addition of HCl,
  • the peptides shown in Table 5 are linear peptides.
  • the peptides shown in Table 7 are cyclic peptides whose ring was formed using a spacer arm: CH 2 -C 6 H 4 -CH 2 .
  • the peptides shown in Table 8 are cyclic peptides whose ring was formed by intramolecular cyclization due to the presence of two cysteine residues in the peptide sequence.
  • Cyclization was performed by oxidation of the C- and N-terminal cysteines to 0.1 mg / ml in 0.1% ammonium carbonate solution at 4 ° C for 16h. The oxidation reaction was followed by HPLC / mass spectrometry analysis. After cyclization was complete, TFA (10% in water) was added until a pH of less than 4. The peptides were then lyophilized with acetonitrile (50%, v / v). v in water) and stored at -20 ° C. The experimental results were obtained by measuring the fluorescence in the same manner as in Example 7 and are illustrated by FIGS. 14A, 14B, 14C and 14D.
  • R1 and R2 correspond to the relative fluorescence intensity of the labeled NC / cTAR complexes. These are two measures independent of each other.
  • R m is the average of the values R1 and R2.
  • the peptides whose cydization has been carried out by an intramolecular disulfide bridge are more effective than the peptides whose cydization has been carried out via the spacer arm.
  • the HIV-1 pNL4-3 DNA corresponding to the infectious molecular clone, was provided by the National Institute of Health, USA.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the detection of fluorescence emitted by infected cells was carried out at 504 nm (with excitation at 395 nm) using a Zeiss epifluorescence microscope or a cell sorter (FACS, Excalibur). This allowed to determine the level of infection of these cells.
  • Plasmid pcDNA3.1 (Clontech, USA) was used as a control DNA vector.
  • the 293T human cell line, the HeLa P4 cells expressing the CD4 receptor, the LacZ gene under the control of HIV-1 LTR and the HeLa cells used in this protocol were cultured in Dulbecco medium. minimum essential (DMEM), supplemented with 10% fetal calf serum and 10U penicillin and 10g / ml streptomycin.
  • DMEM minimum essential
  • the 293T cells were transfected, using the calcium phosphate method (Mangeot PE, Duperrier K, Negro D, Boson B, Rigal D, Cosset FL, Darlix JL, Mol Ther., 2002; 5: 283-90 [34] ).
  • HeLa cells were transfected with the DNA using the Fugene (trademark) transfection method (Invitrogen, USA) to allow immunofluorescence staining. To analyze the virus production, the cells were washed with PBS and the medium was changed 5h after transfection.
  • the virions thus obtained were then purified from the filtered culture supernatants through a pad of 20% sucrose in TNE (100mM NaCl, 10mM Tris HCl, pH 7.4 and 1mM EDTA), obtained after centrifugation at room temperature. 35000 rpm for 1 hour in a Beckman centrifuge and SW41 rotor.
  • TNE 100mM NaCl, 10mM Tris HCl, pH 7.4 and 1mM EDTA
  • HeLa cells were placed at 8.10 4 cells in DMEM medium, supplemented with 10% fetal calf serum and 10U penicillin and 10 g / ml streptomycin in an atmosphere containing 5% CO 2 at 310.15. K (37 ° C).
  • the antiviral activity was determined by measuring the percentage of expression of GFP by HeLa cells.
  • the p23 cyclic peptide exhibited the most effective inhibitory activity. In particular, at a concentration of 100 nM, the p23 peptide was more effective than the reference compound AZT at a concentration of 25 ⁇ M. In addition, maximal antiviral activity, i.e., 100% inhibition of GFP production was observed for this p23 peptide when used at a concentration of 500 nM.
  • Example 12 Cellular Tests of the Peptides According to the Invention on a Virulent Virus of HIV-1
  • the NL4-3 infectious strain was used on SUPT1 lymphocytes, natural targets of the virus.
  • the SUPT1 lymphocytes were infected in the presence of the peptides p2, p10 and p23, under the same conditions and concentrations as those presented in Example 11.
  • the antiviral activity was determined by measuring the percentage of expression of GFP by the SUPT1 lymphocytes.
  • the release of the viruses was evaluated by measuring the activity of the reverse transcriptase in the medium according to the protocol put in place by Tanchou et al. [20] and Berthoux et al. [36].
  • the "peptide-AcGFP" fusion is then amplified by PCR and again cloned into a pQCXIP retroviral vector (Clontech, USA) between the Agel and EcoRI restriction sites according to the same standard methods.
  • 10 ⁇ g of the resulting pQCXIP-pept-AcGFP vector are cotransfected in 293T cells using the calcium phosphate method (Mangeot et al., [34]) and the Clontech mammalian cell transfection kit (Cat No.
  • the cells are washed with PBS and incubated an additional two days in complete DMEM culture medium at 37 ° C.
  • the cell culture supernatants containing virus particles were harvested and clarified by centrifugation (600g, Heraus), and 500 ⁇ of vector containing the supernatant were transduced into Hel_aP4 cells obtained from the NIH AIDS REAGENT PROGRAM, to allow stable expression of the "peptide-AcGFP" molecule.
  • the cells are cultured in 1 g / ml puromycin to select stable cell lines.
  • the viral infectivity is evaluated on these Hel_aP4 cells expressing the "peptide-AcGFP" molecules.
  • approximately 10 5 cells are placed on a 24-well plate and are infected with different concentrations of the HIV-1 IIIB virus (Pannecouque C, Daelemans D, De Clercq E., Tetrazolium-based colorimetric assay for the detection of HIV replication inhibitors: revisited 20 years later, Nat Protoc 2008; 3 (3): 427-34 [44]) for 3 hours.
  • the cells are then thoroughly washed with PBS to remove the residual viruses.
  • the virus production in the cell supernatant is measured with an ELISA test for HIV-1 antigen core p24 (PekinElmer) according to (Daelemans D, Pauwels R, De Clercq E, Pannecouque C. "A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds" Nat Protoc 201 1 6 (6): 925-33).
  • the inventors have defined different groups of peptides according to the invention with respect to the observed activity.
  • Group 1 According to the test values at the peptide concentration of 1 ⁇ and 10 minutes. Considering as positive the peptides retaining at least 50% of activity of the best peptide (83).
  • Group 2 According to the peptide concentration test values of 1 ⁇ and 10 minutes. Considering as positive peptides retaining at least 30% of activity of the best peptide (83).
  • Group 3 According to the peptide concentration test values of 1 ⁇ and 1 hour. Considering as positive the peptides retaining at least 50% of activity of the best peptide (83).
  • Group 4 According to the test values at the peptide concentration of 1 ⁇ and 1 hour. Considering as positive peptides retaining at least 30% of activity of the best peptide (83).
  • Reason 2 TARR (9), TAARR (1), TARAR (1), TARRA (1), TAAR (1), ARR (1), RR (1), Reason 3: GW (14), W (1)
  • Possibility 1 All the motifs present in the group of active peptides (based on group 5) are repeated.
  • Possibility 3 Highly different patterns are considered in the active peptides compared to the general population. In this case, it is necessary to define spacing sizes between the remaining patterns.
  • RNA is a structural element in retrovirus particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001; 98: 5246-5251.
  • Grigorov B Arcanger F, Roingeard P, Darlix JL, Muriaux D. Assembly of infectious HIV-1 in human epithelial and T-lymphoblastic cell lines. Journal of molecular biology. 2006; 359: 848-862.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La présente invention se rapporte à des peptides permettant d'inhiber la réplication du virus VIH et comprenant la séquence XaXbXcXdXe dans laquelle : Xa est choisi dans le groupe comprenant KKVKF, KKVKW, KKVKY, KVKW, KVKY, KVKF, KKF, KKW et KKY; Xb est choisi dans le groupe comprenant T, R, TR, TR, RR, ARR, TAR, TARR, TAAR, TARA, TARRA, TAARR, TARAR, TAAARR, TARAAR, TARRAA, AATARR et AATAAR; Xe est choisi dans le groupe comprenant GW, GWD, W, AW et AWD; Xd est rien ou choisi dans le groupe comprenant GR, AR, A, R et G; Xe est choisi dans le groupe comprenant MK, QMK, QMKK, NMK et NMKK; des résidus cystéines pouvant éventuellement être insérés dans ladite séquence pour sa cyclisation. La présente invention se rapporte également à l'utilisation de ces peptides comme médicament. La présente invention trouve des applications dans le traitement du SIDA et dans la recherche et le diagnostique du VIH.

Description

PEPTIDES ET MEDICAMENT ANTIVIRAL
Domaine technique
La présente invention se rapporte à des peptides permettant de lutter contre la réplication du virus VIH et à leur utilisation comme médicament.
La présente invention trouve des applications dans le traitement du SIDA et dans la recherche et le diagnostique du VIH. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin des exemples.
Etat de la technique
La pandémie causée par le virus VIH-1 (Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 ) est un des problèmes majeurs de Santé publique dans le monde. Cette pandémie est surtout dramatique dans les pays en développement, où les coûts des traitements empêchent le contrôle de cette pandémie. Dans certaines régions d'Afrique, des taux d'infection allant jusqu'à 50% sont observés, désorganisant complètement la vie socio-économique de ces régions.
De Clercq fait le point sur les thérapies actuelles (http://www.aidsmeds.com/list.shtml [1]). Le traitement anti-VIH repose actuellement sur une combinaison de molécules ciblant les trois enzymes du virus : la transcriptase inverse (RT), la protéase (PR) et l'intégrase (IN). II existe également un inhibiteur de la fusion du virus aux cellules cibles, mais d'emploi très limité. Il n'existe aucune solution vaccinale contre ce virus à ce jour, malgré les nombreux essais, dont celui de Merck (Bradac K, Dieffenbach CW. HIV vaccine development: Lessons from past, informing the future. IDrugs. 2009 Jul;12(4):435-9 [2]).
Par ailleurs, plusieurs classes de molécules ciblant la protéine NCp7 ont également été développées. Les inhibiteurs de la NCp7 actuels visent à éjecter les atomes de zinc (Rice et al, 1993 [3]; Rice et al, 1995 [4]). Des revues récentes (de Rocquigny et al, 2008 [5] ; Goldchmidt et al., HIV therapy 2010 [6]) fournissent une description détaillée des approches développées à ce jour contre la protéine de la nucléocapside, et décrivent les principes et les limites de ces approches, notamment le manque de spécificité, qui n'ont pas permis à ce jour d'utiliser ces molécules en thérapie.
Le problème majeur du virus du SIDA est sa très grande variabilité génétique. Des mutations du virus se produisent à une très haute fréquence, notamment au niveau des enzymes du virus, générant des résistances aux antiviraux. Pour limiter l'apparition de résistances, les antiviraux sont utilisés en combinaison dites trithérapies, en ciblant plusieurs enzymes par des mécanismes différents. Néanmoins, des résistances sont de plus en plus fréquemment observées, obligeant le clinicien à changer les traitements.
De plus, il n'existe pas à ce jour de traitement pouvant être administré à faible dose, comme décrit sur http://www.aidsmeds.com/list.shtml [1]. En outre, les médicaments utilisés entraînent fréquemment des effets secondaires importants.
Les moyens actuels de lutte contre le virus VIH-1 présentent de nombreux autres inconvénients tels que la toxicité des médicaments ciblant la RT, la PR et ΙΊΝ, une spécificité largement incomplète, le coût et la difficulté de production des médicaments etc.
Il existe donc un réel besoin de développer de nouveaux moyens de lutte contre le virus VIH-1 palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur. En particulier, il convient de mettre au point des composés efficaces, non cytotoxiques, utilisables à faible concentration, ne nécessitant pas de coûts de production élevés, pouvant être utilisés seuls ou en complément des thérapies existantes.
Description de l'invention La présente invention répond précisément aux problèmes précités de l'art antérieur en fournissant des peptides permettant de lutter efficacement contre la réplication du virus VIH.
Ainsi, la présente invention a notamment pour objet un peptide comprenant la séquence XaXbXcXdXe, dans laquelle :
- Xa est choisi dans le groupe comprenant KKVKF (SEQ ID NO. 317), KKVKW (SEQ ID NO. 318), KKVKY (SEQ ID NO. 319), KVKW (SEQ ID NO. 320), KVKY (SEQ ID NO. 321 ), KVKF (SEQ ID NO. 322), KKF, KKW et KKY ;
- Xb est choisi dans le groupe comprenant T, R, TR, RR, ARR, TAR,
TARR (SEQ ID NO. 323), TAAR (SEQ ID NO. 324), TARA (SEQ ID NO. 325), TARRA (SEQ ID NO. 326), TAARR (SEQ ID NO. 327), TARAR (SEQ ID NO. 328), TAAARR (SEQ ID NO. 329), TARAAR (SEQ ID NO. 330), TARRAA (SEQ ID NO. 331 ), AATARR (SEQ ID NO. 332) et AATAAR (SEQ ID NO. 333);
- Xe est choisi dans le groupe comprenant GW, GWD, W, AW et AWD ;
- Xd est rien ou choisi dans le groupe comprenant GR, AR, A, R et G ; et
- Xe est choisi dans le groupe comprenant MK, QMK, QMKK (SEQ ID NO. 334), NMK et NMKK (SEQ ID NO. 335).
L'homme du métier comprend que le terme « comprenant » inclut « consistant » dans la mesure où les séquences en tant que telles présentent l'effet technique allégué comme montré dans les exemples.
Dans cette séquence, sauf indication contraire, les lettres déterminant la séquence du peptide selon l'invention correspondent à l'abréviation à une lettre proposée par Leder (Leder et al. Introduction to molecular medicine, Ed Scientific American, 1994 [7]).
WD signifie D-tryptophane.
Dans le peptide selon la présente invention, Xa peut par exemple être choisi dans le groupe comprenant KKF, KKVKF (SEQ ID NO. 317),
KKVKW (SEQ ID NO. 318), KVKW (SEQ ID NO. 320) et KVKF (SEQ ID NO. 322), par exemple dans le groupe comprenant KKVKF (SEQ ID NO. 317), KKVKW (SEQ ID NO. 318), KVKW (SEQ ID NO. 320) et KVKF (SEQ ID NO. 322).
Dans le peptide selon la présente invention, Xb peut par exemple être choisi dans le groupe comprenant RR, ARR, TARR (SEQ ID NO. 323), TARRA (SEQ ID NO. 326), TAARR (SEQ ID NO. 327), TARAR (SEQ ID NO. 328), TAAARR (SEQ ID NO. 329), TARRAA (SEQ ID NO. 331 ) et AATARR (SEQ ID NO. 333). Par exemple, Xb peut être choisi dans le groupe comprenant TARR (SEQ ID NO. 323) et AATARR (SEQ ID NO. 333).
Dans le peptide selon la présente invention, Xe peut par exemple être choisi dans le groupe comprenant GW et W.
Dans le peptide selon la présente invention, Xd peut par exemple être rien ou GR.
Dans le peptide selon la présente invention, Xe peut par exemple être choisi dans le groupe comprenant QMK, QMKK (SEQ ID NO. 334) et MK.
Les exemples particuliers présentés ci-dessus pour XaXbXcXdXe peuvent être combinés entre eux en choisissant parmi ces exemples, 1 , 2, 3, 4 ou 5 de ces exemples pour définir le peptide XaXbXcXdXe de la présente invention dans sa définition la plus large ci-dessus. Par exemple, selon l'invention, l'homme du métier peut choisir de préciser l'un de Xa, Xb, Xe, Xd ou Xe tels qu'exemplifiés ci-dessus ou une combinaison de 2, 3, 4 ou 5 de ces exemples particuliers de Xa, Xb, Xe, Xd et Xe. Ainsi, 31 combinaisons sont possibles parmi les exemples précités pour définir les peptides XaXbXcXdXe selon l'invention.
Dans la séquence du peptide selon la présente invention, K peut être remplacée par R. Indépendamment, V peut être remplacée par M, L ou I.
Les acides aminées de la séquence du peptide selon l'invention sont généralement de forme L, mais peuvent être par exemple sous forme D.
En outre, les acides aminés de la séquence du peptide selon l'invention peuvent être méthylés. Le peptide selon la présente invention peut comprendre en outre 1 ou 2 résidus Cystéine (C). Ces résidus cystéines peuvent être intégrés à n'importe quel endroit dans la séquence.
Des exemples de peptides selon l'invention sont présentés dans le tableau suivant :
Tableau 1 : Exemples de peptides selon la présente invention
SEQ SEQ ID Séquences d'acides aminés ID Séquences d'acides aminés NO. NO.
1 CKKFAATAARG WQM KC 154 KKYCRRGWGRNMKC
2 CKKVFTARRGWQMKKC 155 KKYCTAAARRGWGRQMKC
3 CKKVFTGWGRQMKC 156 KKYCTAAAR R WQ M KKC
4 CKKVFTRGWQMKC 157 KKYCTARRAAGWG RCQMKK
5 CKKVKFTARRGWGRQMKKC 158 KKYFCTARG WG RQM KC
6 CKKVKFTARRGWQMKKC 159 KKYFTARGWGRQMK
7 CKKVKYTARRAGWQMKKC 160 KKYFTARGWQMK
8 CKKVKYTARRGWQM KC 161 KKYRGWGRQMK
9 CKKVKYTARRWGRQMKC 162 KKYRRGWGRNMK
10 CKKVKYTRGWGRCQMK 163 KKYTAAARRGWGRQMK
1 1 CKKWAATAARGWGRCQMK 164 KKYTAAARRWQMKK
12 CKKWFTARG WG RQM KC 165 KKYTAARGWGRQMK
13 CKKWRGWG RCQMKK 166 KKYTAARGWGRQMKK
14 CKKYFTARWG RQM KC 167 KKYTAARGwG RQM KK
15 CKKYRGWGRQMKC 168 KKYTARRAAGwGRQMK
16 CKKYRRGWGRQMKKC 169 KKYTARRAAGWGRQMKK
17 CKKYRRWQMKC 170 KKYTARRAWGRQMKK
18 CKVKFTARARGWQM KC 171 KKYTARRGWGRQMKK
19 CKVKFTARRAAG WQM KC 172 KKYTARRGWQMK
20 CKVKFTARRAGWGRQMKC 173 KKYTGWARQMK
21 CKVKFTARRAGWQMKC 174 KKYTRGWQMK
22 CKVKFTARRAGWQMKC 175 KVCKFRGWQMKC
23 CKVKFTARRGWCQMK 176 KVCKFTARAGWCQMK
24 CKVKFTARRGWGRMKC 177 KVCKWFCTARGWCQMKKC
25 CKVKFTARRGWMKC 178 KVCKWTAARWRCQMKK
26 CKVKYTGWQMKKC 179 KVCKYTRGWQMKC
27 KCKVKFTARRGWQMKKC 180 KVKCFARRGWCQMK
28 KCKYTARRGWCGRQMKK 181 KVKC WAATAARG WQM KC
29 KKCFTAAARRG WG RCQMK 182 KVKCWTARAGWCQMK
30 KKCFTAAARRG WG RQM KC 183 KVKFAATARRGWGRQMK
31 KKCVKFTARRGWG RCQMKK 184 KVKFAATARRGWQMK
32 KKCKFTARRGWCGRQMKK 185 KVKFARRGWGRQMK
33 KKCVKWTAAARRWARCQMK 186 KVKFARRGWQMK
34 KKCVKWTARAARWG RQM KC 187 KVKFCAATARRGWQMKC
35 KKCVKYARRG WG RCQMK 188 KVKFCTAARGWQMKC KKCWTAARGwG RQ M KKC 189 KVKFCTAARRG WCG RQMK
KKCYAATAARGwCG RQMK 190 KVKFCTAARRGWQMKC
KKC YTAARG WG RQ M KKC 191 KVKFCTARAARG WCG RQMK
KKFAATAARG WG RQM K 192 KVKFAATARRGWQMK
KKFAATAARGWQMK 193 KVKFARRGWQMK
KKFARRG WG RQM KK 194 KVKFCTARAARG WCQMK
KKFARRGWQMK 195 KVKFCTARRGWG RCQMK
KKFARRWARQMK 196 KVKFTAARGWQMK
KKFCRGWQMKC 197 KVKFCTARRWGRCQMK
KKVKFTARRGWGRQMKK 198 KVKFCTARRWQMKC
KKCKFTARRGWGCRQMKK 199 KVKFCAATARRGWQMKC
KKFFTARGWGRQMK 200 KVKFRGWGRQMK
KKFFTARGWQMK 201 KVKFRGWQMK
KKFFTARWGRQMK 202 KVKFTARAARGWQMK
KKFTAAARRG WG RQMK 203 KVKFTAAARRGWQMK
KKFTAAARRWG RQM KK 204 KVKFRRGWGRQMK
KKFTARRAWARQMKK 205 KVKFRRGWQMK
KKFTARRAwGRQMK 206 KVKFTAAARRGWGRQMK
KKFCTARRGWGRCQMK 207 KVKFTAAARRGWQMK
KKFTARRGWG RQM K 208 KVKFTAARCGWGRQMKC
KKFTARRGWQMKK 209 KVKFTAARGWGRQMK
KKFTCARRAG WG RCQMK 210 KVKFARRGWQMK
KKFTGWGRQMK 21 1 KVKFTARGWQMK
KKFTRGWQMKK 212 KVKFTAARGWQMK
KKVCKWRGWGRCQMK 213 KVKFTAARRGWGRQMK
KKVCKWRRWARQMKKC 214 KVKFTAARRGWQMK
KKVCKWTARRAGWGRCQMK 215 KVKFTARARGWQMK
KKVFAATAARG WG RQM K 216 KVCKFRGWQMKC
KKVFAATARRAwRQM K 217 KVKFRRGWQMK
KKVFARRGWQMKK 218 KVKFTARAARGWGRQMK
KKVFARRWGRQMKK 219 KVKFTARAARGWQMK
KKVFCARRAwGRCQMK 220 KVKFRGWQMK
KKVKFCARRGWCRQMKK 221 KVKFTARAGWGRQMK
KKVKFCARRGWGCRQMKK 222 KVKFTARAGWQMK
KKVFRGWGRQMK 223 KVKFTARARGWGRQMK
KKVFRGWGRQMKK 224 KVKCFTAAARRGWCG RQMK
KKVFRRGWGRNMKK 225 KVKFARRGWQMK
KKVFTARRAGWGRQMKK 226 KVKFTARARGWQMK
KKVFTARRGWGRQMK 227 KVKFTARGWGRQMK
KKVFTARRGWQMKK 228 KVKFTARGWQMK
KKVFTGWGRQMK 229 KVKFTAARRGWQMK
KKVFTRGWQMK 230 KVKFTARRAAGWGRQMK
KKVKCFTARRGWGCRQMKK 231 KVKFTARRAAGWQMK
KKVKCFTARRGWGRQMKKC 232 KVKFTARRAGWGRQMK
KKVKCFTARRGWQCMKK 233 KVKFTARRAGWQMK
KKVKFCTARRGWCRQMKK 234 KVKFTARRWQMK
KKVKFCTARRGWGRQMKKC 235 KVKFTARRGKGwGRQMKK
KKVKFTARRGWGRQMKK 236 KVKFTGWQMK KKVKFTARRGWQMKK 237 KVKFTARRGKWGRQMKK
KKVKWAATAARG WG RQM K 238 KVKFTARRGWGGRQMKK
KKVKWAATAARGWQM K 239 KVKFTARRGWGRMK
KKVKWAATARRG WM K 240 KVKFTARRGWGRQMK
KKVKWAATARRWG RQM K 241 KVKFTARRGWMK
KKVKWARRG WG RQM K 242 KVKWCTARRGWQMKC
KKVKWARRGWQMK 243 KVKFTARRAGWQMK
KKVKWARRGwRQMK 244 KVKFTARRGWMK
KKVKWCAATAARGWGRQMKC 245 KVKFTRGWQMK
KKVKWCTAARGWGRCQMKK 246 KVKFTARRGWQMK
KKVKWFTARG WG RQMKK 247 KVKFTARRWGRQMK
KKVKWFTARGWRQMK 248 KVKFTARRWQMK
KKVKWFTARWQMK 249 KVKFTGWGRQMK
KKVKWRGWGRQMK 250 KVKFTGWQMK
KKVKWTARAAR WG RQMK 251 KVKFTRGWGRQMK
KKVKWTARARGWGRQMK 252 KVKFTRGWQMK
KKVKWTARRAAGWG RQMKK 253 KVKWTARRGWQMK
KKVKWTARRAAGWQMK 254 KVKWAATAARG WG RQMK
KKVKYAATARRGwQM K 255 KVKWAATAARG WQM K
KKVKYARRGWGRQMK 256 KVKWAATARRGWGRQMK
KKVKYARRGWGRQMK 257 KVKWAATARRGWQMKK
KKVKYTAAARRG WG RQMK 258 KVKFTARRAAGWQMK
KKVKYTARRAGWGRQMKK 259 KVKFTARRGKGWGRQMKK
KKVKYTARRAGWQMK 260 KVKFTARRGWQMK
KKVKFTARRGWQMKK 261 KVKWARRGWGRQMK
KKVKYTARRGWGRQMK 262 KVKWARRGWQMK
KKVKYTARRGWQMK 263 KVKWARRWARQMK
KKWAATARRGWQMK 264 KVKWARRWGRQMKK
KKWAATARRWGRQMK 265 KVKWCTARARGWCGRQMK
KKWARRGWGRQMKK 266 KVKWCTARARGWCQMKK
KKWARRGWQMKK 267 KVKWCTARRGWCGRQMK
KKWARRWAQMK 268 KVKWCTARRGWQMKC
KKWCAATARRGWGRCQMKK 269 KVKWFTARAwG RQMK
KKWCAATARRWGRCQMK 270 KVKWFTARGWGRQMK
KKWCARRGWCQMKK 271 KVKWFTARGWQMKK
KKWCARRGWGRQMKKC 272 KVKWRGWAQMKK
KKWCRRGwGRQMKC 273 KVKWRGWGRQMK
KKWCRRGWQMKC 274 KVKWRRAwGRQMK
KKWCTAAARRAwG RCQMK 275 KVKWTAAARRGWQMKK
KKWFTARAWGRQMK 276 KVKWTAARGWGRQMK
KKWFTARGWGRQMK 277 KVKWTAARRGwQMK
KKWFTARGWQMK 278 KVKWTAARWRQMKK
KKWRGWGRQMKK 279 KVKWTARAARGWGRQMK
KKWRGWQMK 280 KVKWTARAARGWQM K
KKWRRGWQMK 281 KVKWTARAG WQM K
KKWTAAARRAwG RQM K 282 KVKWTARARGWGRQMK
KKWTAAARRGWGRQMK 283 KVKYARRGwQMK
KKWTAAARRGWQMK 284 KVKWTARARGWQMKK 132 KKWTAARCG WG RQ M KKC 285 KVKWTARRAAG WG RQM KK
133 KKWTAARG WG RQM K 286 KVKWTARRAAGWQM K
134 KKWTAARGwG RQM KK 287 KVKWTARRAAwG RQMKK
135 KKWTAARRGWQMK 288 KVKWTARRAG WG RQM K
136 KKWTARAARGWQM K 289 KVKWTARRAG WG RQM KK
137 KKWTARARG WG RQM K 290 KVKWTARRG WG RQM K
138 KKWTARARGWQMK 291 KVKWTARRGWQMK
139 KKWTARARGWQMK 292 KVKWTARRWQMK
140 KKWTARARWGRQMK 293 KVKWTCAARRG WCQM KK
141 KKWTARRAAG WG RQM KK 294 KVKWTGWGRQMK
142 KKWTARRAAWG RQM K 295 KVKYAATAARWQMK
143 KKWTARRG WG RQM K 296 KVKYARRGwQMK
144 KKWTARRGWG RQM KK 297 KVKYARRGWQMK
145 KKYAATAARGWQMK 298 KVKYCRRWGRQMKC
146 KKYARRGWGRNMKK 299 KVKYFTARG WG RQM K
147 KKYARRGWGRQMK 300 KVKYFTARGWQMKK
148 KKYARRGWQMK 301 KVKYRGWGRQMK
149 KKYARRGWQMKK 302 KVKYRGWQMKK
150 KKYARRWARQMK 303 KVKYRRGWGRNMK
151 KVKFTARRGKwGRQMKK 304 KVKYRRWGRQMK
152 KVKFTARRGwGRQMKK 305 KVKYTAARWARQM KK
153 KVKFTARRGWGRQMKK 306 KVKYTARAARG WG RQM K
La présente invention n'est bien entendu pas limitée aux séquences présentées dans le tableau 1 ci-dessus.
Le peptide selon l'invention peut être linéaire ou cyclique.
Lorsque le peptide selon l'invention est linéaire et qu'il comprend un ou deux résidus cystéines, les résidus cystéines peuvent être protégés par tout moyen connu de l'homme du métier. Par exemple, les résidus cystéines peuvent être protégés par méthylation, acylation ou formation de ponts disulfure. Des exemples de peptides linéaires sont présentés dans le tableau 1 ci-dessus.
Selon l'invention, des résidus cystéines peuvent éventuellement être intégrés dans ladite séquence. De préférence, les résidus cystéines peuvent être intégrés dans un peptide selon l'invention durant la synthèse dudit peptide.
Le peptide selon l'invention peut par exemple être choisi parmi les SEQ ID NO. 1 à 306. Il peut s'agir par exemple des peptides présentés dans les tableaux 2 et 6 à 9 ci-dessous. Les peptides préférés selon l'invention sont ceux ayant une activité inhibitrice relative supérieure à 1 ,5, de préférence supérieure à 2,5, de préférence supérieure à 3,5.
Lorsque le peptide selon l'invention est cyclique, la cyclisation peut, par exemple, être réalisée par une liaison entre les extrémités C-terminale et N-terminale du peptide comme présenté par Tulla-Puche et Barany (Judith Tulla-Puche et George Barany, « On-Resin Native Chemical Ligation for Cyclic Peptide Synthesis », J. Org. Chem., vol 69, pages 4101 - 4107 ; 2004 [8]). Par exemple, toutes les séquences présentées dans le tableau 1 ci-dessus peuvent être cyclisées via des résidus cystéines présents ou ajoutés dans un peptide selon l'invention.
Lorsque deux résidus cystéines sont présents ou intégrés dans la séquence du peptide selon l'invention, ils sont de préférence à une distance permettant la cyclisation du peptide, lesdits résidus cystéines étant reliés entre eux via leur groupement -SH libre, c'est-à-dire au moyen d'un pont disulfure intramoléculaire, ou d'un bras espaceur. Parmi ceux-ci, des expérimentations ont été conduites sur des peptides cyclisés via un pont disulfure intramoléculaire et sur des peptides cyclisés via un bras espaceur présentés respectivement dans les tableaux 8 et 9 ci-dessous. Par exemple, les deux résidus cystéines peuvent être intégrés à 4 acides aminés d'écart, par exemple à 5 acides aminés d'écart, par exemple à 6 acides aminés d'écart, par exemple à 7 acides aminés d'écart, par exemple à 8 acides aminés d'écart, par exemple à 9 acides aminés d'écart, par exemple à 10 acides aminés d'écart, par exemple à 1 1 acides aminés d'écart, par exemple à 12 acides aminés d'écart, par exemple à 13 acides aminés d'écart, par exemple à 14 acides aminés d'écart, par exemple à 15 acides aminés d'écart, par exemple à 16 acides aminés d'écart, par exemple à 17 acides aminés d'écart, par exemple à 18 acides aminés d'écart, par exemple à 19 acides aminés d'écart.
Les deux résidus cystéines peuvent, par exemple, être présents ou intégrés aux extrémités N- ou C-terminales du peptide selon l'invention. Les résidus cystéines peuvent aussi être intégrés entre Xa et Xb, Xb et Xe, Xe et Xd, Xd et Xe ou Xe et Xe, ou dans Xa ou Xb. De préférence, lorsque deux résidus cystéines sont intégrés dans la séquence d'un peptide selon l'invention, l'un est intégré entre Xa et Xb et l'autre est intégré entre Xe et Xd ou Xd et Xe.
On entend par « pont disulfure », un lien covalent qui, par oxydation, réunit les fonctions thiols de deux cystéines. Lorsque le pont disulfure est réalisé à partir de deux cystéines d'une même séquence d'acides aminés, on parle de « pont disulfure intramoléculaire ». Des exemples de peptides cycliques dont le cycle est formé via un pont disulfure intramoléculaire, conformes à la présente invention, sont présentés dans le tableau 9 ci- dessous.
On entend par « bras espaceur » toute molécule permettant de relier deux acides aminés de la séquence du peptide selon l'invention. Par exemple le bras espaceur permet de relier deux résidus cystéines de la séquence du peptide selon l'invention. Dans la présente, le bras espaceur peut également être appelé « LINKER » ou « li ».
Le bras espaceur peut, par exemple, être choisi dans le groupe comprenant un alkyl en Ci à C6 et un composé choisi parmi les composés de formule :
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
dans lequel n est un nombre entier allant de 0 à 10, m est un nombre entier allant de 0 à 10 et X est choisi dans le groupe comprenant un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe CH2, un groupe NH et un groupe NCH3.
Dans les formules des bras espaceurs précités, les extrémités « libres », par exemple les groupements CH2- ou S-, sont liées avec l'atome de soufre des résidus cystéines du peptide selon l'invention.
Le bras espaceur peut relier deux acides aminés de la séquence du peptide selon l'invention par tout moyen connu de l'homme du métier. On peut par exemple utiliser le protocole décrit dans Balraju et al. (2005) [9] et dans Litovchick et al. (2008) [10].
Le peptide selon l'invention peut être associé à toute substance permettant ou facilitant sa pénétration à l'intérieur d'une cellule. Par exemple, le peptide selon l'invention peut comprendre, à son extrémité carboxy-terminale, un peptide signal. Il peut s'agir de tout peptide signal bien connu de l'homme du métier (Von Heijne G. et al., « Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP, and related tools », Nature Protocols, vol 2, pages 3569-3571 , 2007 [11]). Par exemple, le peptide signal peut être choisi dans les séquences comprenant SQPKRRKK (SEQ ID NO. 307), SKL, KDEL (SEQ ID NO. 308), PPKKKRV (SEQ ID NO. 309), MMSFVALLLVGILFWAWEAEQLTKCEVFQ (SEQ ID NO. 310), MLSLRQSIRFFKCSSRYLL (SEQ ID NO. 31 1 ) et ALWRALWFRLWRLAWFRLWR (SEQ ID NO.312).
Le peptide selon l'invention peut par exemple également être associé à un peptide de pénétration dans les cellules (CPP). Par exemple, le peptide selon l'invention est associé au CPP à son extrémité carboxy- terminale. Par exemple, le CPP peut être une séquence choisie dans le groupe comprenant Ac-ALW RALW F RLW RLAW F RLW R-Cya (NanoVepep, SEQ ID NO. 312), Ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-Cya (Pep-1 , SEQ ID NO. 336), Ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-Cya (Pep-2, SEQ ID NO. 313) et Ac-KWFETWFTEWPKKRKV-Cya (Pep-3, SEQ ID NO. 314) (Morris MC, Deshayes S, Heitz F, Divita G, Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics, Biol. Cell (2008) 100, 201-217
[12]). De préférence, le CPP est SEQ ID NO.312.
Le peptide signal ou le CCP peut être rattaché à n'importe quel peptide selon l'invention. Des expérimentations montrant l'efficacité de ces peptides sont présentées dans le tableau 7.
Le peptide signal ou le CPP peut par exemple être synthétisé chimiquement, par exemple par synthèse chimique sur support solide. Il peut s'agir par exemple d'un procédé de synthèse en chimie Fmoc, tel que celui décrit dans « Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach Séries) W. C. Chan (Editor), Peter D. White (Editor)", Oxford Univ Press 2000 » [13].
Le peptide signal ou le peptide CPP peut être associé au peptide selon l'invention par tout moyen connu de l'homme du métier. Par exemple, un peptide signal peut être associé à un peptide selon l'invention par synthèse d'une séquence d'acide aminé correspondant à la succession de la séquence d'un peptide signal et la séquence d'un peptide selon l'invention. Par exemple, un peptide CPP peut être associé à un peptide selon l'invention par synthèse d'une séquence d'acide aminé correspondant au peptide CPP et combinaison de ce dernier avec la séquence d'un peptide selon l'invention.
Le peptide selon la présente invention est dirigé contre une protéine de VIH-1 qui n'est pas ciblée dans les thérapies actuelles. Il s'agit de la nucléocapside NCp7. Dans la présente, la nucléocapside NCp7 est également appelée « protéine NCp7 », « NCp7 » ou « NC ». La protéine de la nucléocapside NCp7 de VIH-1 est formée de deux doigts à zinc hautement conservés. Cette protéine joue un rôle capital dans plusieurs étapes clés du cycle du virus VIH, notamment lors des deux sauts de brin durant la transcription inverse. Les fonctions de la nucléocapside reposent en grande partie sur ses propriétés chaperonnes qui apparaissent hautement dynamiques (Darlix J. L. et al., J. Mol Biol, 254.523, 1995 [14] ; Levin et al., 2005 [15]). L'importance de la protéine NCp7 est illustrée par la perte totale d'infectivité suite à des mutations ponctuelles modifiant la structure globulaire des doigts de zinc (Demene et al., Biochemistry, vol 33 pages 1 1707, 1994 [16] ; Dorfman et al., J virol, vol 67, page 6159, 1993 [17] ; Gorelick et al., J Virol, vol 73, page 8185, 1999 [18] ; Gorelick et al., J Virol, vol 64, page 3207, 1990 [19] ; Tanchou et al. [20]). Cette protéine basique joue un rôle critique dans le cycle viral, principalement en chaperonnant les transconformations du génome viral requises lors de la réplication du virus, notamment lors de la rétrotranscription.
La rétrotranscription est une étape clé du cycle réplicatif du VIH-1 , au cours de laquelle l'ARN génomique simple brin est converti en un ADN proviral double brin. Cette étape est catalysée par la rétrotranscriptase (ou transcriptase inverse) et son efficacité et surtout sa spécificité augmentent sous l'action de la protéine de nucléocapside p7 (NC ou NCp7).
Les inventeurs sont les tout premiers à avoir mis au point des compétiteurs efficaces de la NCp7 qui permettent d'inhiber la réplication virale. Ces compétiteurs sont les peptides de la présente invention.
Les peptides selon l'invention ont permis d'inhiber la production du virus par des lymphocytes T1 à des doses allant jusqu'à quelques nanomolaires alors que l'AZT, un des composés de référence, dirigé contre la réverse transcriptase n'est actif qu'à des doses micromolaires dans le même essai.
La présente invention a également pour objet un peptide selon l'invention pour une utilisation comme médicament. De préférence, le médicament est un anti-rétroviral.
De préférence encore, le médicament est un anti-VIH
De préférence encore, le médicament est un anti-VIH-1 .
Par exemple, le peptide selon la présente invention peut être utilisé comme médicament pour le traitement du SIDA. Par exemple, le peptide selon la présente invention peut être utilisé comme médicament pour le traitement du SIDA résultant d'une infection du VIH, par exemple du VIH-1 .
On peut utiliser le peptide seul ou un mélange de peptides selon l'invention.
Par exemple, le mélange de peptides peut comprendre 2 peptides selon l'invention, par exemple 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 voir plus de 9 peptides selon l'invention.
Une combinaison des peptides selon l'invention peut en effet permettre d'augmenter encore l'action anti-rétrovirale.
Le peptide selon l'invention peut être utilisé comme médicament seul, c'est-à-dire en mono-thérapie, ou dans le cadre d'une bi-thérapie, d'une tri- thérapie ou d'une quadri-thérapie, c'est-à-dire associé à d'autres traitements, avec d'autres molécules actives.
En d'autres termes, le peptide selon la présente invention peut être utilisé seul ou en combinaison avec tout traitement connu permettant de lutter contre le VIH.
Selon l'invention, on entend par « utilisé en combinaison », une utilisation du peptide selon l'invention de façon conjointe ou simultanée, concomitante, ou successive, avec tout traitement connu permettant de lutter contre le VIH. Le mode d'administration peut être identique ou différent suivant les molécules co-administrées.
On entend par « conjointe ou simultanée », l'utilisation du peptide selon l'invention avec tout traitement connu permettant de lutter contre le VIH dans une seule composition les contenant.
On entend par « concomitante », l'utilisation séparée du peptide selon l'invention et de tout traitement connu permettant de lutter contre le VIH, par des voies d'administration identiques ou différentes durant la même période d'administration.
On entend par « successive », l'utilisation séparée du peptide selon l'invention et de tout traitement connu permettant de lutter contre le VIH, par des voies d'administration identiques ou différentes durant des périodes d'administration différentes.
On entend par « période d'administration », la durée pendant laquelle un traitement est administré. Il peut, par exemple s'agir de plusieurs jours, par exemple deux jours, trois jours, quatre jours, etc., par exemple une ou plusieurs semaines, par exemple une semaine, deux semaines, trois semaines, etc., par exemple un ou plusieurs mois, par exemple un mois, deux mois, trois mois, etc., par exemple une ou plusieurs années, par exemple un an, deux ans, trois ans, etc..
Par exemple, le peptide selon l'invention peut être utilisé en combinaison avec au moins un antirétroviral. En d'autres termes, le peptide selon l'invention, peut être utilisé comme médicament, ledit médicament comprenant en outre au moins un antirétroviral.
Selon l'invention, l'antirétroviral peut être par exemple choisi dans le groupe comprenant : AZT, lamivudine, émtricitabine, didanosine, stavudine, abacavir, zalcitabine, tenofovir, racivir, amdoxovir, apricitabine, elvucitabine, efavirenz, nevirapine, étravirine, delavirdine, rilpivrine, tenofovir, fosalvudine, amprenavir, tipranavir, idinavir, saquinavir, fosamprenavir, ritonavir, darunavir, atazanavir, nelfinavir, kaletra, raltegravir, elvitégravir, MK-2048, enfuvirtide, vicriviroc, TNX-355 et bevirimat.
Par exemple, le peptide selon l'invention peut être utilisé en combinaison avec une association d'antirétroviraux choisie dans le groupe comprenant : zidovudine + lamivudine ; abacavir + lamivudine ; ténofovir + émtricitabine ; abacavir + lamivudine ; abacavir + lamivudine + zidovudine ; ténofovir + émtricitabine + efavirenz. Le peptide selon l'invention utilisé comme médicament peut être sous toute forme d'administration appropriée. Il peut s'agir d'une des formes connues par l'homme du métier pour administrer une molécule active qui est un peptide (Peppas NA, Carr DA, Chemical engineering Science, 64, 4553-4565 (2009) [21] ; Morishita M, Peppas NA, Drug Discovery Today, 1 1 , 905-910 (2006) [22]).
Le peptide selon la présente invention peut, par exemple, être destiné à une administration orale ou à une injection.
De préférence, le peptide selon l'invention peut se présenter sous une forme injectable.
Dans ce cas, le peptide selon l'invention peut être conditionné sous toute forme connue de l'homme du métier en vue d'être administrée par injection. Il peut s'agir par exemple d'un flacon ou d'une ampoule.
Par exemple, l'injection peut être une injection intramusculaire, intraveineuse ou intrapéritonéale.
Lorsqu'il s'agit d'une administration orale, le peptide peut être sous forme de gélule, de poudre libre, de lyophilisât, de granulé, de minigranule, de microgranule, de capsule à enveloppe molle, de capsule à enveloppe dure, de comprimé non enrobé, de comprimé enrobé, de comprimé effervescent, de comprimé soluble, de comprimé dispersible, de comprimé orodispersible, de solution, d'émulsion ou de suspension.
Le peptide selon l'invention peut être associé à un excipient, un adjuvant ou un support pharmaceutiquement acceptable. On entend par « excipient, adjuvant ou support pharmaceutiquement acceptable » toute substance permettant de diluer ou transporter le peptide selon l'invention.
De préférence, l'excipient pharmaceutiquement acceptable n'affecte pas l'efficacité du peptide.
L'excipient ou l'adjuvant pharmaceutiquement acceptable peut être toute substance connue de l'homme du métier pour l'administration d'un peptide de petite taille. Lorsque l'excipient est une solution aqueuse cela peut être, par exemple, une quelconque des solutions présentées dans le document Heitz et al., 2009 (Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Heitz F, Morris MC, Divita G. Br J Pharmacol. 2009 May;157(2): 195-206 [23]) ou dans le document Wehrlé P. (Wehrlé P., Pharmacie galénique, Formulation et technologie pharmaceutiques, 2007 [24]).
Lorsque l'excipient est une émulsion, cela peut être une émulsion eau dans l'huile, huile dans l'eau, eau dans l'huile dans l'eau (Wehrlé P. [24]).
Lorsque l'excipient est un excipient permettant la formation d'une gélule, d'une poudre libre, d'un lyophilisât, d'un granulé, d'une minigranule, d'une microgranule, d'une capsule à enveloppe molle, d'une capsule à enveloppe dure, d'un comprimé non enrobé, d'un comprimé enrobé, d'un comprimé effervescent, d'un comprimé soluble, d'un comprimé dispersible, d'un comprimé orodispersible, d'une solution, d'une émulsion ou d'une suspension. Il peut s'agir par exemple de tout excipient connu de l'homme du métier pour fabriquer ces formulations. Il peut s'agir par exemple d'un excipient présenté dans le document Wehrlé P. [24].
Le peptide de la présente invention peut être administré comme médicament, de préférence en quantité suffisante pour combattre le VIH.
La synthèse du peptide selon la présente invention peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une synthèse chimique ou par génie génétique.
De préférence, compte tenu de la petite taille des séquences des peptides selon l'invention, les peptides peuvent être synthétisés chimiquement, par exemple par synthèse chimique sur support solide. Il peut s'agir par exemple d'un procédé de synthèse en chimie Boc et/ou Fmoc.
Ainsi, la présente invention a également pour objet un procédé de synthèse d'un peptide selon l'invention, ledit procédé comprenant une étape de synthèse en chimie Boc et/ou en chimie Fmoc. On peut, par exemple utiliser le procédé décrit dans « Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach Séries) W. C. Chan (Editor), Peter D. White (Editor)", Oxford Univ Press 2000 » [13].
Lorsque la synthèse du peptide selon l'invention est réalisée par génie génétique, on peut par exemple construire un peptide de grande taille comprenant le peptide de la présente invention et le digérer avec des enzymes de restriction afin de recueillir le peptide de l'invention. On peut par exemple utiliser le protocole décrit dans F. Cordier-Ochsenbein et al. J. Mol. Biol. 279, 1 177-1 185 [25] .
Le peptide selon l'invention est de petite taille, allant de 8 à 21 acides aminés. Il présente donc avantageusement une excellente stabilité dans le temps et une excellente accessibilité vers les sites d'interaction.
En outre, les procédés de synthèse du peptide sont faciles à mettre en œuvre et peu coûteux.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, données à titre illustratif. Brève description des figures
- La figure 1 représente la structure primaire de la protéine de nucléocapside NCp7.
- La figure 2 représente la structure tertiaire de la protéine de nucléocapside NCp7.
- La figure 3 est une représentation schématique de l'activité déstabilisatrice de la NCp7 sur cTAR. « D » et « Q » représentent respectivement un fluorophore et un inhibiteur de fluorescence.
- La figure 4 représente un diagramme présentant respectivement la fluorescence, exprimé en unités arbitraires, (a) du cTAR, (b) du cTAR en présence de NCp7, et (c) du cTAR en présence de NCp7 et d'un peptide selon l'invention (« inh »). - La figure 5 représente la titration de cTAR marqué à la fluorescéine (« cTAR-FI ») à une concentration de 50 nanomolaires (nM), en présence des peptides pA, pB, pC, pD ou pE. En abscisse, « [Pep] » représente la concentration en peptides, exprimée en micromolaires (μΜ). En ordonnées, « A » représente l'anisotropie.
- La figure 6 représente l'activité déstabilisatrice des peptides selon l'invention (pA, pB, pC, pD et pE) sur cTAR doublement marqué à la Rhodamine 6G et au Dabcyl. En abscisse, « inh/cTAR » représente le ratio de peptides sur cTAR. En ordonnées, « l/lo » représente le rapport de l'intensité de fluorescence en présence de peptide selon l'invention sur celle en son absence.
- La figure 7 représente l'évolution de la liaison d'un peptide selon l'invention (« INH ») avec cTAR ou le complexe cTAR*NCp7 lorsque le ratio INH sur cTAR augmente. En abscisse, « INH/cTAR » représente le ratio du peptide pE sur cTAR. En ordonnées, « A » représente l'anisotropie.
- La figure 8 représente un schéma des mécanismes d'interaction entre NCp7 (« NC ») et les peptides selon l'invention (« INH ») avec cTAR. « D » et « Q » représentent respectivement un fluorophore et un inhibiteur de fluorescence.
- La figure 9 représente la comparaison de l'activité inhibitrice de cinq peptides selon l'invention (pA, pB, pC, pD, pE) sur la déstabilisation du complexe cTAR/NCp7. L'abscisse représente la concentration en peptides (« [inh] ») exprimée en nanomolaires (nM). L'ordonnée représente l'activité déstabilisatrice résiduelle de NCp7, mesurée par l'ouverture de cTAR (cTAR melt).
- La figure 10 représente le pourcentage de liaison d'un peptide selon l'invention à cTAR (« (a) ») et au complexe cTAR-NCp7 (« (b) »), et le pourcentage d'inhibition de la déstabilisation de cTAR par NCp7 (« (c) »). - La figure 1 1 représente un schéma de la compétition entre la NCp7 et des peptides selon l'invention sur la fixation de cTAR. Les étoiles « * » indique les liaisons entre ces différentes entités.
- La figure 12 représente la corrélation entre la liaison à cTAR et l'activité inhibitrice sur la déstabilisation de cTAR de cinq peptides selon l'invention
(pA, pB, pC, pD et pE). La liaison est exprimée selon le logarithme de K/KpE où K est l'affinité d'un peptide donné pour cTAR (Tableau 3) et KPE est l'affinité du peptide E pour cTAR. L'activité inhibitrice est exprimée par le rapport [NCp7]/IC50 où [NCp7] désigne la concentration de NCp7 et IC50, la concentration de peptide qui inhibe à 50% la déstabilisation de cTAR, induite par NCp7. « bind » signifie liaison et « inh » signifie inhibition.
- La figure 13 représente trois exemples de peptides cycliques selon l'invention, (a) représente une cyclisation intramoléculaire via un pont disulfure. (b) et (c) représentent deux exemples de peptides cycliques via un lieur.
- Les figures 14A, 14B, 14C et 14D, représentent l'inhibition de l'activité déstabilisatrice de NCp7 par des peptides (pm) selon l'invention. L'abscisse représente le rapport des concentrations en peptides (« [inh] ») sur celle de NCp7. L'ordonnée représente le ratio de l'intensité de fluorescence du complexe cTAR/NC en présence de peptide sur celle du complexe en absence d'inhibiteur. Tampon NaCI 30mM; MgC 0.2mM; "tris" 25mM; pH=7.4. La concentration de cTAR est de 0.02 μΜ et celle de NCp7 est de 0.2 μΜ. Longueur d'onde d'excitation = 520 nm.
- La figure 15 représente l'effet des peptides (p2, p10, p23) formulés avec le peptide vecteur Nanovepep sur des lentivecteurs de HIV-1 transduits dans des cellules HeLa, en comparaison avec l'effet de l'AZT. L'abscisse représente la concentration de peptides en nanomolaires (nM) ou la concentration en AZT en micromolaires (μΜ). L'ordonnée représente l'expression de GFP en pourcentage (GFP exp, %). - La figure 16 représente l'inhibition de la production de VIH-1 dans des cellules SupT1 par des peptides selon l'invention (p2, p10, p23 ) complexé avec Nanovepep, ou par un témoin (AZT). L'abscisse représente la concentration en peptides en nanomolaires (nM) ou la concentration en AZT en micromolaires (μΜ). L'ordonnée représente l'expression de GFP en pourcentage (GFP exp, %).
EXEMPLES
Exemple 1 : Obtention des peptides selon l'invention
Le procédé utilisé dans cette expérience est un procédé en chimie sur support solide.
Dans cet exemple, on a utilisé la méthode décrite dans le document « Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach Séries) W. C. Chan (Editor), Peter D. White (Editor)", Oxford Univ Press 2000 » [13], par un synthétiseur A 433 d'Applied Biosystems au Laboratoire Biophotonique et Pharmacologie, lllkirch, France).
Le principe de cette méthode de chimie Fmoc est le suivant :
La synthèse chimique en phase solide débute avec la fixation sur le support solide, une résine HMP (« résine 4-Hydroxymethylphenoxyacetyl- 4'methylbenzyhydrylamine »), du premier acide aminé dont la fonction amine a été préalablement protégée avec un groupement Fmoc (« 9- fluorenylmethyloxycarbonyl »).
Dans une deuxième étape, la fonction amine est déprotégée en utilisant de la pipéridine dans du NMP (« N-méthyl-2-pyrrolidinone »), puis le second acide aminé dont le groupement carboxyl a été activé avec un mélange HBTU/HOBt (« 2-(1 H-Benzotriazolse-1 -yl)-1 , 1 ,3,3- tetramethyluronium hexafluorophosphate/1 -hydroxy-benzotriazole ») est fixé au premier acide aminé par une réaction d'amidation. Cette étape est répétée autant de fois que nécessaire jusqu'à obtenir la séquence souhaitée.
Enfin, l'ensemble des fonctions sont déprotégées en utilisant de la pipéridine dans du NMP, et lavées deux fois avec du NMP et du méthanol. Les peptides synthétisés sont libérés du support solide et déprotégés par ajout d'un mélange acide trifluoroacétique/eau/phénol/thioanisole/éthanedithiol (100/10/1/5/2).
Les peptides synthétisés sont ensuite filtrés et précipités par de l'éther diéthylique (« Et2O »).
La purification des peptides synthétisés a été réalisée à l'aide d'une chaîne HPLC en utilisant des colonnes en phase inverse (RF HPLC (C8
Figure imgf000024_0001
Tous les peptides présentés dans le tableau 2 ont ainsi été obtenus. Exemple 2 : Préparation des séquences cTAR marquées
Les séquences cTAR ont été obtenues par synthèse et purification à 0,02 mmol par HPLC (IBA GmbH Nucleic Acids Product Supply, Goettingen, Allemagne).
Les séquences cTAR ont été marquées respectivement en 5' par une rhodamine 6G (Rh6G) via un amino-alkyl à six atomes de carbone et en 3' par un extincteur de fluorescence : le Dabcyl (ou 4'-(diméthylamino- phenylazo)-benzène) selon le protocole présenté notamment dans Li et al. (Li, J. J., X. Fang, S. M. Schuster et W. Tan. 2000a. Molecular Beacons: A Novel Approach to Detect Protein - DNA Interactions. Angew Chem Int Ed Engl 39:1049-1052 [26] ; Li, J. J., R. Geyer et W. Tan. 2000b. Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA. Nucleic Acids Res 28:E52 [27] ; Li, Q. G., J. X. Liang, G. Y. Luan, Y. Zhang et K. Wang. 2000c. Molecular beacon-based homogeneous fluorescence PCR assay for diagnosis of infectious diseases. Analytical Sciences 16:245-248 [28] ; Sokol, D. L., X.
Zhang, P. Lu et A. M. Gewirtz. 1998. Real time détection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95:1 1538-43 [29] ; Tyagi, S. et F. R. Kramer. 1996. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14:303-308 [30]).
L'oligonucléotide a ensuite été purifié par RF HPLC suivie d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La pureté des oligonucléotides marqués a été vérifiée par spectrométrie de masse par électrospray et a ainsi été déterminée comme étant supérieure à 93%.
Exemple 3 : Obtention de la NCp7
La protéine de la nucléocapside NCp7 a été obtenue selon le protocole suivant, décrit dans Cornille et al. (Cornille F., Mely Y., Ficheux D., Salvignol I., Gérard D., Darlix J.-L., Fournié-Zaluski M.-C. et Roque B (1990). Solid phase synthesis of the retroviral nucleocapsid protein NCp10 of Moloney murine leukemia virus and related zinc-fingers in free SH forms: influence of the zinc chelation on structural and biochemical properties. Int. J. Pept. Protein Res., 36, 551 -558 [31]).
Le peptide NC (1 1 -55) a été synthétisé par synthèse de peptide en phase solide sur un synthétiseur 433A (ABI, Foster City, Canada). La synthèse a été réalisée à une échelle de 0,1 mmol en utilisant le protocole standard de couplage fluorénylméthoxycarbonyl (Fmoc)/acides aminés à partir de 0,54 mmol/g de résine HMP ayant une asparagine préchargée (ABI).
A la fin de la synthèse, 100 mg de peptidylsérine déprotégée du Fmoc ont été isolés et lavés deux fois avec du NMP. Le clivage de la peptidylsérine et la déprotection ont été réalisés pendant deux heures en utilisant 10 mL d'une solution d'acide trifluoroacétique (« TFA ») contenant de l'eau (5%, v/v), du phénol (2,5%, v/v), du thioanisole (5%, v/v) et de l'éthanedithiol (2,5%, v/v).
La solution a été concentrée par le vide puis le peptide a été précipité en utilisant du diéthyl éther glacé, puis culotté par centrifugation. Le culot a ensuite été lavé avec du diéthyl éther et coloré avant sa solubilisation avec du TFA aqueux (0,05%, v/v).
La purification par HPLC a été effectuée sur une colonne C8 (unisphère 300A, 5 mm, 250x10, Interchim, France) dans un mélange eau/acétonitrile contenant 0,06% de TFA avec un gradient linéaire de 10- 70% d'acétonithie pendant 30 minutes, et a été suivie par absorption à 220 nm.
Exemple 4 : Mesure de la déstabilisation de cTAR par la NCp7
Un milieu test a été réalisé en mélangeant dans de l'eau distillée :
30mM de NaCI, 0,2mM de MgCI2 et 25 mM, Tris (trishydroxyméthylaminométhane, ou 2-amino-2-hydroxyméthyl-1 ,3- propanediol), 0,1 μΜ de cTAR marquée obtenue dans l'exemple 2 et 1 μΜ de NCp7. Puis le pH a été stabilisé à 7,4 par ajout de HCI,
Le spectre de fluorescence a été enregistré avant et après l'ajout de NCp7 à l'aide des spectrofluorimètres FluoroMax3 et FluoroLog (Horiba, Jobin Yvon, Longjumeau), équipés de compartiments thermostatés selon le protocole décrit dans Vuillemier et al. (Vuilleumier, C, C. Maechling- Strasser, D. Gérard et Y. Mely. 1997. Evidence and prévention of HIV-1 nucleocapsid protein adsorption onto fluorescence quartz cells. Anal Biochem 244:183-5 [32]).
Lorsque la séquence cTAR est dans une conformation normale, c'est- à-dire en absence de NCp7, le fluorophore et l'inhibiteur de fluorescence sont proches, de sorte que seule une très faible fluorescence est observée.
Après l'ajout de la NCp7, la séquence cTAR est déstabilisée, induisant un éloignement du fluorophore et du Dabcyl, et causant une augmentation de la fluorescence (figure 3). Exemple 5 : Mesure de l'activité inhibitrice des peptides selon l'invention sur la formation du complexe cTAR-NCp7
L'activité inhibitrice de 63 peptides selon l'invention (Tableau 2) sur la formation du complexe cTAR-NCp7 a été testée pour chaque peptide à des concentrations de 1 μΜ et 10μΜ.
Pour cela, un milieu test identique à celui de l'exemple 4 a été préparé. 1 μΜ de NCp7 a ensuite été ajouté au milieu.
126 tests ont été réalisés de manière à ce que chacun des 63 peptides ait été ajouté à du milieu test à une concentration de 1 μΜ ou de 10 μΜ.
Le pourcentage d'inhibition de la formation du complexe cTAR-NCp7 a été mesuré par mesure de fluorescence à dix minutes et une heure après l'ajout des peptides selon le même principe que celui présenté à l'exemple 4.
La formule suivante a été utilisée pour quantifier le pourcentage d'inhibition des peptides sur la formation du complexe cTAR-NCp7 :
Inhibition (%) = (1 - (If -lf0)/(lfmax-lfo))*1 00
Dans cette formule, Ifo, lfmax et If correspondent respectivement à l'intensité de la fluorescence de cTAR seul, du complexe cTAR-NCp7 et du complexe cTAR-NCp7 en présence d'un peptide selon l'invention.
Quatre mesures indépendantes du pourcentage d'inhibition de la formation du complexe cTAR-NCp7 ont été réalisées : à 10 minutes et à 1 heure à une concentration de peptides de 1 μΜ, et à 10 minutes et à 1 heure à une concentration de 10 μΜ (valeurs « R1 » et « R2 » dans le tableau 2 ci-dessous).
Chaque peptide a été classé dans chacun des tests afin de déterminer une valeur « Ri » comprise entre 1 (efficacité maximale observée) et 0 (aucune inhibition) selon la formule suivante : I ^Libre
!NC '1 Libre où I est l'intensité de fluorescence de cTAR doublement marqué en présence de NCp7 et du peptide testé, Libre est l'intensité de fluorescence de cTAR doublement marqué sous forme libre et lNc est l'intensité de fluorescence de cTAR doublement marqué en présence de NCp7 seule.
L'activité inhibitrice relative (« R » dans le tableau 2 ci-dessous) des peptides a été obtenue en sommant les résultats des quatre mesures indépendantes obtenues avec 1 μΜ et 10 μΜ de chaque peptide.
Une valeur de « R » égale à 4 correspond donc à l'activité inhibitrice la plus efficace des peptides. Les résultats expérimentaux sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : Mesure de l'activité inhibitrice des peptides selon l'invention sur la formation du complexe cTAR-NCp7
SEQ Al 10μΜ Al 1 μΜ
Peptide ID R1 R2 R1 R2 R
N° 10min 1 h 10min 1 h
KKVKFTARRGWGRQMKKx 83 1 .00 1 .00 1 .00 1 .00 4.00
KKVKFTARRGWQMKKx 84 1 .00 0.97 0.92 1 .00 3.89
KKFTARRGWGRQMKx 55 1 .00 0.99 0.73 0.80 3.52
KVKWTARRGWGRQMKx 290 1 .00 1 .00 0.65 0.73 3.38 xKVKFTAARRGWGRQMKx 213 0.96 0.77 0.68 0.81 3.22 xKVKFTARARGWGRQMKx 223 0.61 0.93 0.74 0.76 3.04 xKVKFTARRAGWGRQMKx 232 1 .00 0.93 0.50 0.54 2.97
KVKFTARRWGRQMKx 247 1 .00 0.99 0.41 0.48 2.88
KVKFAATARRGWGRQMKx 183 1 .00 0.82 0.53 0.51 2.86
KVKFTARRGWGRQMKx 240 1 .00 1 .00 0.27 0.32 2.59
KVKFTARRGWGRMKx 239 0.98 0.99 0.18 0.18 2.33
KVKFRRGWGRQMKx 204 0.99 0.95 0.17 0.20 2.31
KKVKFTARRGWQMKKx 108 0.86 0.62 0.33 0.36 2.17
KVKFTAARGWGRQMKx 209 0.99 0.74 0.22 0.16 2.1 1
KVKFARRGWGRQMKx 185 0.97 0.43 0.36 0.34 2.10
KVKFTARAARGWGRQMKx 218 0.81 0.55 0.29 0.30 1 .95
KVKFTAAARRGWGRQMKx 206 0.85 0.59 0.12 0.16 1 .72
KVKFTRGWGRQMKx 251 0.63 0.57 0.14 0.19 1 .53
KVKFTARRGWMKx 244 0.55 0.25 0.31 0.38 1 .49
KVKFTARRAAGWGRQMKx 230 1 .00 0.17 0.16 0.14 1 .47 KVKFTARGWGRQMKx 227 0.70 0.39 0.15 0.18 1 .42
KVKFARRGWQMKx 186 0.69 0.48 0.08 0.1 1 1 .36
KVKFTARAGWGRQMKx 221 0.62 0.34 0.16 0.21 1 .33
KVKFRGWGRQMKx 200 0.71 0.42 0.1 1 0.08 1 .32
KVKFAATARRGWQMKx 184 0.97 0.26 0.04 0.04 1 .31
KVKFRRGWQMKx 217 0.75 0.40 0.05 0.00 1 .20
KVKFTARRGWMKx 241 0.80 0.19 0.09 0.10 1 .18 xKVKWTARRGWQMKx 291 0.48 0.49 0.10 0.09 1 .16
KVKFTAAARRGWQMKx 203 0.90 0.12 0.05 0.03 1 .10
KVKFAATARRGWQMKx 192 0.45 0.00 0.28 0.32 1 .05 xKVKFTARARGWQMKx 215 0.27 0.37 0.18 0.18 1 .00 xKVKFTAARRGWQMKx 213 0.33 0.55 0.05 0.05 0.98
KVKFTARAARGWQMKx 202 0.45 0.09 0.15 0.18 0.87
KVKFARRGWQMKx 225 0.42 0.13 0.16 0.15 0.86
KVKFTARRAGWQMKx 243 0.56 0.07 0.09 0.10 0.82
KVKFTARRWQMKx 234 0.42 0.33 0.04 0.00 0.79
KVKFTARRAAGWQMKx 231 0.35 0.22 0.1 1 0.10 0.78
KVKFTGWGRQMKx 249 0.28 0.00 0.21 0.21 0.70
KVKFTARRGWQMKx 260 0.54 0.00 0.04 0.08 0.66
KVKFARRGWQMKx 210 0.57 0.00 0.03 0.05 0.65
KVKFTARARGWQMKx 226 0.40 0.00 0.12 0.10 0.62
KVKFRRGWQMKx 205 0.56 0.01 0.04 0.00 0.61
KVKFTARRGWQMKx 246 0.40 0.02 0.1 1 0.08 0.61
KVKFTARRAAGWQMKx 258 0.44 0.00 0.08 0.08 0.60
KVKFTARRAGWQMKx 233 0.51 0.00 0.00 0.08 0.59
KVKFTAAARRGWQMKx 207 0.34 0.25 0.00 0.00 0.59
KVKFTARRWQMKx 248 0.55 0.02 0.00 0.00 0.57
KVKFTRGWQMKx 252 0.41 0.00 0.10 0.02 0.53 xKVKWTARRGWQMKx 253 0.26 0.18 0.06 0.02 0.52
KVKFARRGWQMKx 193 0.47 0.00 0.05 0.00 0.52
KVKFRGWQMKx 201 0.35 0.00 0.06 0.1 1 0.52
KVKFTAARRGWQMKx 229 0.44 0.00 0.02 0.01 0.47
KVKFTARGWQMKx 21 1 0.33 0.00 0.04 0.09 0.46 xKVKFTARGWQMKx 228 0.29 0.03 0.05 0.03 0.40
KVKFTARAARGWQMKx 219 0.40 0.00 0.00 0.00 0.40
KVKFTAARGWQMKx 196 0.22 0.00 0.10 0.07 0.39 xKVKWTARAGWQMKx 281 0.13 0.12 0.06 0.02 0.33
KVKFTARAGWQMKx 222 0.33 0.00 0.00 0.00 0.33
KVKFTAARGWQMKx 212 0.28 0.00 0.00 0.04 0.32
KVKFTGWQMKx 236 0.24 0.00 0.00 0.03 0.27 xKVKFTGWQMKx 250 0.26 0.00 0.00 0.00 0.26
KVKFRGWQMKx 220 0.18 0.00 0.04 0.02 0.24 xKVKFTRGWQMKx 245 0.10 0.00 0.01 0.00 0.1 1
Dans ce tableau « Al 1 μΜ » et « Al 10μΜ » correspondent à l'activité inhibitrice des peptides respectivement aux concentrations de 1 μΜ et de 10μΜ. Les « x » dans les séquences de peptides représentent respectivement l'amidation et l'acylation des résidus C- et N- terminaux.
Ces résultats montrent que tous les peptides testés, conformes à la présente invention, permettent d'inhiber la déstabilisation de cTAR par NCp7, et ce même à des concentrations de l'ordre du micromolaire.
Exemple 6 : Liaison des peptides selon l'invention à cTAR
La liaison à cTAR des cinq peptides suivants, conformes à la présente invention, a été mesurée:
- KKFTARRGWGRQMKx (SEQ ID No. 55), dénommé « pA »,
- KVKFTARRWGRQMKx (SEQ ID No. 247), dénommé « pB »,
- KVKWTARRGWGRQMKx (SEQ ID No. 290), dénommé « pC »,
- KKVKFTARRGWQMKKx (SEQ ID No. 84), dénommé « pD », et - KKVKFTARRGWGRQMKKx (SEQ ID No. 83), dénommé « pE ».
Pour cela, un milieu test a été réalisé en mélangeant dans de l'eau distillée : 30mM de NaCI, 0,2mM de MgCI2 et 25 m M, Tris et 50nM de cTAR marquée à la fluorescéine. Puis le pH a été stabilisé à 7,4 par ajout de HCI,
Cinq tests indépendants ont été réalisés de manière à ce que chacun de ces peptides ait été ajouté à des concentrations croissantes dans du milieu test.
La liaison de ces cinq peptides à cTAR a été mesurée par mesure de fluorescence à des concentrations croissantes en peptides. L'expérience a été réalisée pour chacun des peptides précités selon le même principe que celui exposé à l'exemple 4.
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 5. Plus les peptides se lient à cTAR, plus la mesure d'anisotropie est élevée.
Comme pour la NCp7, le nombre de sites de liaison des peptides précités sur cTAR est de 1 1 . Les constantes de liaison mesurées des cinq peptides testés (pA, pB, pC, pD et pE) sont présentées dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 : Constantes de liaison (K) de peptides selon l'invention à cTAR
Figure imgf000031_0001
Ces affinités mesurées sont vraisemblablement sous-estimées par rapport aux affinités réelles des peptides selon l'invention aux séquences cTAR.
Ces résultats montrent que les peptides selon l'invention se lient aux séquences cTAR.
Exemple 7 : Déstabilisation de cTAR par des peptides selon l'invention
Les propriétés déstabilisatrices des cinq peptides précités (pA, pB, pC, pD et pE) ont été testées sur des séquences cTAR obtenues à l'exemple 2.
Pour cela, un milieu test a été réalisé en mélangeant dans de l'eau distillée : 30mM de NaCI, 0,2mM de MgCI2 et 25 mM, Tris et 100nM de cTAR marquée obtenue dans l'exemple 2. Puis le pH a été stabilisé à 7,4 par ajout de HCI,
La déstabilisation de cTAR par les peptides a été mesurée à différentes concentrations de peptides par spectroscopie de fluorescence (figure 6). La déstabilisation a été décrite par le changement d'intensité de fluorescence, comparé avec les cTAR non marqués. Lorsque cTAR n'est pas déstabilisé, c'est-à-dire en absence de peptide, l'intensité mesurée (l/lo) vaut 1 .
Dans les mêmes conditions, en présence de NCp7 à un ratio NCp7/cTAR de 1 1 , l'intensité mesurée vaut 7.
Ces résultats démontrent que les peptides selon l'invention ont une faible activité déstabilisatrice de cTAR comparée à celle de NCp7 (moins de 1 %). Ainsi, l'activité inhibitrice des peptides selon la présente invention ne passe pas par la déstabilisation de cTAR, mais par une compétition avec NCp7 comme présenté ci-après.
Exemple 8 : Mesure de la compétition entre des peptides selon l'invention et NCp7 pour la liaison à cTAR
Un milieu test a été réalisé en mélangeant dans de l'eau distillée : 30mM de NaCI, 0,2mM de MgCI2 et 25 mM, Tris et 50nM de cTAR marqué obtenu dans l'exemple 2. Puis le pH a été stabilisé à 7,4 par ajout de HCI, Les mesures de fluorescence ont été réalisées à l'aide d'un spectrofluorimètre SLM 8000 (Aminco, Urbana, IL) à des concentrations croissantes en peptide (pE), en présence ou en absence de NCp7 à 1 ,5 μΜ, selon le même principe que celui présenté à l'exemple 4.
Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 7.
Il a été constaté que la titration du complexe NCp7/cTAR par pE fait diminuer l'anisotropie. De plus, l'addition d'un excès de pE en présence du complexe NCp7/cTAR donne la même valeur d'anisotropie que lorsque pE est présent en excès en présence de cTAR seul.
Les valeurs d'anisotropie de la NCp7 liée à cTAR marquée sont légèrement plus élevées que l'anisotropie de pE liée à cTAR marquée car la masse moléculaire de NCp7 est supérieure à celle de pE (figure 4).
Les résultats présentés dans la figure 7 montrent que pE entre en compétition avec NCp7 pour se lier à cTAR. Cette compétition peut être modélisée comme sur la figure 8. Exemple 9 : Mesure de l'inhibition par les peptides de la déstabilisation de cTAR par NCp7
Un milieu test a été réalisé en mélangeant dans de l'eau distillée : 30mM de NaCI, 0,2mM de MgCI2 et 25 mM Tris, 33nM de cTAR marqué obtenu dans l'exemple 2 et 660nM de NCp7. Puis le pH a été stabilisé à 7,4 par ajout de HCI,
La mesure de fluorescence a été réalisée par la mesure de fluorescence a été réalisée à l'aide d'un spectrofluorimètre (FluoroLog Horiba, Jobin Yvon ; Longjumeau) avec des concentrations croissantes en peptides (pA, pB, pC, pD et pE) selon le même principe que celui présenté à l'exemple 4.
Une diminution de la fluorescence a été constatée (figure 9) indiquant que les peptides selon l'invention inhibent efficacement la déstabilisation de cTAR induit par NCp7.
A partir de la figure 9, il a été possible de déterminer les valeurs de concentration inhibitrice à 50% (IC5o).
Cette expérience à été réalisée à différentes concentration en cTAR et NCp7 vis-à-vis du peptide pE. Les résultats expérimentaux sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous :
Tableau 4 : Concentration inhibitrice à 50% de pE sur le complexe
Figure imgf000033_0001
Ces résultats montrent que l'IC5o est dépendant de la concentration en NCp7 et non de la concentration en cTAR, et prouve le mécanisme d'inhibition des peptides selon l'invention sur NCp7. Afin de comparer l'efficacité des peptides selon l'invention, sur l'inhibition de la déstabilisation induite par NCp7, le ratio IC5o/[NCp7] a été utilisé.
Pour le peptide pE, le ratio IC5o/[NCp7] est d'environ de 0,7 à 1 , indiquant que la déstabilisation induite par NCp7 est réduite d'un facteur deux lorsque 0,7 à 1 pE est ajouté par cTAR. Étant donné que onze molécules NCp7 se lient à cTAR, il a été déduit qu'une très faible quantité de pE permet de réduire fortement l'activité de NCp7 (figure 10).
Les valeurs du ratio IC5o/[NCp7] de cinq peptides testés (pA, pB, pC, pD et pE) sont présentées dans le tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5 : Ratio IC50/[NCp7] de peptides
Figure imgf000034_0001
Ces données sont représentées sur la figure 12 et sont corrélées aux constantes de liaison de ces peptides. L'inhibition est représentée par l'inverse du ratio IC5o/[NCp7] et la constante de liaison par son logarithme relatif par rapport à la constante de liaison de pE.
Cette expérience confirme qu'une éjection partielle de NCp7 de cTAR par les peptides selon l'invention est suffisante pour inhiber l'activité déstabilisatrice de NCp7 sur cTAR.
Une représentation schématique des mécanismes d'interaction entre NCp7, cTAR et les peptides selon l'invention est représentée sur la figure 8. Exemple 10 : Test de l'efficacité de peptides linéaires et cycliques selon la présente invention sur l'inhibition de la déstabilisation de cTAR par NCp7
Un milieu test a été réalisé en mélangeant dans de l'eau distillée : 30mM de NaCI, 0,2mM de MgCI2 et 25 mM Tris, 0,02μΜ de cTAR marquée obtenue dans l'exemple 2 et 0,2μΜ de NCp7. Puis le pH a été stabilisé à 7,4 par ajout de HCI,
Plusieurs tests ont été réalisés afin que chacun des peptides présentés dans les tableaux 5, 6, 7 et 8 ci-dessous ait été ajouté à du milieu à des concentrations croissantes.
Les peptides présentés dans le tableau 5 sont des peptides linéaires.
Ceux présentés dans le tableau 6 sont des peptides linéaires sur lesquels une séquence signale SQPKRRKK (SEQ ID N° 307) a été ajoutée (Morris et al. [12]).
Les peptides présentés dans le tableau 7 sont des peptides cycliques dont le cycle a été formé à l'aide d'un bras espaceur : CH2-C6H4-CH2.
La cyclisation a été réalisée selon le protocole décrit dans Jiang et al. (Jiang, sheng ; Li, Zheng ; ding, Ke ; Roller, Peter P., Current Organic Chemistry, 12(17), 1502-1542 (2008) [33]).
Les peptides présentés dans le tableau 8 sont des peptides cycliques dont le cycle a été formé par une cyclisation intramoléculaire due à la présence de deux résidus cystéines dans la séquence du peptide.
La cyclisation a été réalisée par oxydation des cystéines en C- et N- terminal à 0,1 mg/ml dans une solution de carbonate d'ammonium à 0,1 % à 4°C pendant 16h. La réaction d'oxydation a été suivie d'une analyse HPLC/spectrométrie de masse. Une fois la cyclisation terminée, le TFA (10% dans l'eau) a été ajouté jusqu'à l'obtention d'un pH inférieur à 4. Les peptides ont ensuite été lyophilisés avec de l'acétonitrile (50%, v/v dans l'eau) et conservés à une température de -20°C. Les résultats expérimentaux ont été obtenus par mesure de la fluorescence de la même manière que dans l'exemple 7 et sont illustrés par les figures 14A, 14B, 14C et 14D.
Les résultats de l'activité inhibitrice des peptides à une concentration de 1 μΜ sont présentés dans les tableaux 6 à 9 ci-dessous, dans lesquels R1 et R2 correspondent à l'intensité de fluorescence relative des complexes NC/cTAR marqués. Ce sont deux mesures indépendantes l'une de l'autre. R1 et R2 correspondent donc à l'activité inhibitrice calculée à partir de la formule R = lf/lfmax, dans laquelle lfmax correspond à la fluorescence mesurée du complexe cTAR/NCp7 et If correspond à la fluorescence mesurée en présence de 1 μΜ du peptide. Rm correspond à la moyenne des valeurs R1 et R2.
Tableau 6 : Mesure de l'activité inhibitrice des peptides linéaires selon l'invention sur la déstabilisation de cTAR par NCp7
Figure imgf000036_0001
Ces résultats confirment l'activité inhibitrice des peptides linéaires de la présente invention.
Tableau 7 : Mesure de l'activité inhibitrice des peptides linéaires selon l'invention lié à un peptide signal sur la déstabilisation de cTAR par NCp7
SEQ
Peptides ID R1 R2 Rm
N°
p1 1 KVKFTARRGWGRQMKKSQPKRRKK 315 0,13 0,27 0,20 p10 KVKFTARRWGRQMKSQPKRRKK 316 0,28 0,25 0,27 Ces résultats montrent que l'ajout des peptides signaux et SQPKRRKK (SEQ ID N° 307) à l'extrémité C-terminale ne perturbent pas l'activité inhibitrice des peptides selon l'invention.
Tableau 8 : Mesure de l'activité inhibitrice des peptides cycliques selon l'invention sur la déstabilisation de cTAR par NCp7 et dont le
cycle est formé via un bras espaceur
Figure imgf000037_0001
Ces résultats montrent que des peptides cycliques dont le cycle a été formé à l'aide d'un bras espaceur permettent également d'inhiber la déstabilisation de cTAR par NCp7.
Tableau 9 : Mesure de l'activité inhibitrice des peptides cycliques selon l'invention sur la déstabilisation de cTAR par NCp7 et dont le cycle est formé via un pont disulfure intramoléculaire
Figure imgf000037_0002
Ces résultats montrent que des peptides cycliques dont le cycle a été formé par une cydisation intramoléculaire permettent également d'inhiber la déstabilisation de cTAR par NCp7. Aucune corrélation entre la taille du cycle et l'activité du peptide n'a été observée. En outre, l'insertion de cystéine dans les peptides selon l'invention et la cydisation de ces peptides ne perturbent donc pas leur activité inhibitrice.
Ces résultats montrent que l'ensemble des peptides, linéaire ou cyclique, selon l'invention permettent d'inhiber la déstabilisation de cTAR par NCp7.
Par ailleurs, les peptides dont la cydisation a été réalisée par un pont disulfure intramoléculaire sont plus efficaces que les peptides dont la cydisation a été réalisée via le bras espaceur.
Exemple 11 : Tests cellulaires des peptides selon l'invention sur une souche de HIV-1 atténuée
Cette expérience a été réalisée en laboratoire de niveau de sécurité
L2.
L'ADN de pNL4-3 de VIH-1 , correspondant au clone moléculaire infectieux, a été fourni par l'Institut national de la santé, Etats-Unis. Lorsqu'une cellule est infectée par pNL4-3 de VIH-1 , elle exprime une protéine fluorescente verte appelée GFP (« Green Fluorescent Protein » en anglais). La détection de la fluorescence émise par des cellules infectée a été réalisée à 504 nm (avec une excitation à 395 nm) à l'aide d'un microscope à épifluorescence Zeiss ou un trieur de cellules (FACS, Excalibur). Cela a permis de déterminer le niveau d'infection de ces cellules.
Le plasmide pcDNA3.1 (Clontech, USA) a été utilisé comme un vecteur d'ADN de contrôle.
La lignée cellulaire humaine 293T, les cellules HeLa P4 exprimant le récepteur CD4, le gène LacZ sous le contrôle du VIH-1 LTR et les cellules HeLa utilisées dans ce protocole ont été cultivées en milieu Dulbecco essentiel minimum (DMEM), complété avec du sérum de veau fœtal 10% et de 10U de pénicilline et 10 g/ml de streptomycine.
Les cellules 293T ont été transfectées, en utilisant la méthode de phosphate de calcium (Mangeot PE, Duperrier K, Nègre D, Boson B, Rigal D, Cosset FL, Darlix JL, Mol Ther. 2002 ; 5:283-90 [34]).
Les cellules HeLa ont été transfectées avec l'ADN en utilisant la méthode de transfection Fugene (marque déposée) (Invitrogen, USA) pour permettre la coloration par immunofluorescence. Pour analyser la production de virus, les cellules ont été lavées avec du PBS et le milieu a été changé 5h après la transfection.
Un à deux jours après la transfection, les surnageants des cultures contenant des particules virales ont été récoltées et clarifiés par filtration (0,45 um, Nalgen). Les cellules ont ensuite été lavées et lysées avec du Triton-PBS 0,5%.
Les virions ainsi obtenus ont été ensuite purifiés à partir des surnageants de culture filtrés à travers un coussin de 20% de sucrose dans du TNE (100mM NaCI, 10mM Tris HCL, pH 7,4 and 1 m M EDTA), obtenus après centrifugation à 35000 tours par minutes pendant 1 heure dans une centrifugeuse Beckman et un rotor SW41 .
Pour mesurer la production virale, un test ELISA Cap24 a été réalisé. Des aliquotes de surnageant viral (Cap24 libre + virons associés = S) de même volume et des culots de virions obtenus par ultracentrifugation (V) ont été resuspendus dans un milieu comprenant du Triton 0,5%, et déposés sur une plaque de 96 puits recouverte de 10 μg ml d'anticorps anti-Cap24 (23A5G et 3D10G9B8, BioMérieux, France) puis bloqués avec 10% de sérum de cheval dans du PBS-0,05% Tween-20. Un anticorps secondaire anti-Cap24 biotinylé (BioMérieux, France) a été ajouté. Le test ELISA a ensuite été révélé avec de la streptavidine et de l'orthophénylène- diamine (OPD)-H2O2 (Sigma). La plaque a ensuite été lue sur un lecteur de plaque ELISA à 490 et 630 nm. L'infectiosité virale a été évaluée sur des cellules Hel_aP4 selon le protocole décrit dans Grigorov et al. (B Grigorov et al., Retrovirology 2007
[35]). Des cellules HeLa ont été placées à raison de 8.104 cellules dans un milieu DMEM, complété avec du sérum de veau fœtal 10% et de 10U de pénicilline et 10 g/ml de streptomycine dans une atmosphère contenant 5% CO2 à 310,15 K (37 °C).
Au bout de 24 heures, le milieu de culture a été renouvelé et le peptide p2 (SEQ ID NO. 153) complexé avec « NanoVepep » de séquence Ac-ALW RALW F RLW RLAW F RLW R-cystéa m ide (SEQ ID NO. 312) a été ajouté dans le milieu à des concentrations croissantes de 25 à 500 nM.
L'activité antivirale a été déterminée par mesure du pourcentage d'expression de GFP par les cellules HeLa.
Cette expérience a également été réalisée avec le peptide p10 (SEQ
ID NO. 316) complexé avec « NanoVepep » et p23 (SEQ ID NO. 81 ) complexé avec « NanoVepep » à des concentrations croissantes de 25 à 500 nM, ou en présence d'AZT, un nucléoside inhibiteur de la réverse transcriptase (NRTI), à des concentrations croissantes de 25 à 500 μΜ.
Les résultats expérimentaux sont présentés dans la figure 15.
Tous les peptides testés, conformes à la présente invention, ont démontré une activité antivirale remarquable, même à des concentrations de l'ordre du nanomolaire.
Le peptide cyclique p23 a présenté l'activité inhibitrice la plus efficace. En particulier, à une concentration de 100 nM le peptide p23 s'est montré plus efficace que l'AZT, composé de référence, à une concentration de 25 μΜ. En outre une activité antivirale maximale, c'est-à- dire une inhibition de 100% de la production de GFP a été observée pour ce peptide p23 lorsqu'il est utilisé à une concentration de 500 nM. Exemple 12 : Tests cellulaires des peptides selon l'invention sur une souche virulente du HIV-1
Ces expériences ont été réalisées en laboratoire de haute sécurité biologique de type BSL3 de l'ENS Lyon, France.
Dans cette expérience, on a utilisé la souche infectieuse NL4-3 sur des lymphocytes SUPT1 , cibles naturelles du virus.
Les lymphocytes SUPT1 ont été infectés en présence des peptides p2, p10 et p23, dans les mêmes conditions et concentrations que celles présentées dans l'exemple 1 1 .
Après une nuit de culture (12 heures environ) le milieu de culture a été remplacé pour éliminer les virus résiduels et permettre la production de nouveaux virus. Les cellules ont ensuite été maintenues pendant 4 jours.
L'activité antivirale a été déterminée par mesure du pourcentage d'expression de GFP par les lymphocytes SUPT1 .
La libération des virus a été évaluée par mesure de l'activité de la transcriptase inverse dans le milieu selon le protocole mis en place par Tanchou et al. [20] et Berthoux et al. [36].
Les résultats expérimentaux sont présentés dans la figure 16.
Cette expérience a également été réalisée en utilisant « NanoVepep » (SEQ ID NO 132) sans peptide selon l'invention. Aucune inhibition de la production de GFP n'a été observée. « NanoVepep » ne possède donc aucune activité antivirale.
Tous les peptides testés, conformes à la présente invention, présentent une activité antivirale vis-à-vis de la souche virulente NL4-3.
Ces résultats démontrent que les peptides selon l'invention permettent d'inhiber la production de VIH-1 dans les lymphocytes SUPT1 à des concentrations nanomolaires, alors que dans les mêmes conditions, des concentrations micromolaires sont requises pour le composé de référence AZT. Les inventeurs ont constaté à travers des expérimentations que l'activité antivirale du peptide p23 est supérieure à 80 % à une concentration en peptide de 5 nM. Les peptides selon la présente invention présentent donc une activité anti-VIH bien supérieure à celle de ΑΖΤ, composé de référence pour le traitement du SIDA, et cela même à des concentrations de l'ordre du nanomolaire.
Exemple 13 : Protocole de tests cellulaires des peptides selon l'invention sur une souche HIV-1
Ces expériences sont réalisées en laboratoire de niveau de sécurité L2 ou de haute sécurité biologique de type BSL3 (Institut Rega, KULeuven, Belgium) en fonction de la souche virale utilisée.
L'AcGFP (Clontech, USA) (Prasher D, Eckenrode V, Ward W, Prendergast F, Cormier M "Primary structure of the Aequorea Victoria green-fluorescent protein". Gene 1 1 1 (2): 229-33, (1992) [41] et Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward W, Prasher D "Green fluorescent protein as a marker for gene expression". Science 263 (5148): 802-5 (1994) [42]) est amplifiée par PCR et clonée dans un plasmide pcDNA3.1 (Invitrogen, USA) en utilisant les enzymes de restriction BamHI et EcoRI selon des méthodes standards. La séquence codant pour un peptide selon l'invention ayant le codon de départ (ATG) est ensuite clonée à la partie N- terminale de l'AcGFP au niveau du site de restriction BamHI.
La fusion « peptide-AcGFP » est ensuite amplifiée par PCR et à nouveau clonée dans un vecteur rétroviral pQCXIP (Clontech, USA) entre les sites de restriction Agel et EcoRI selon des même méthodes standards.
10 ig du vecteur pQCXIP-pept-AcGFP résultant sont co-transfectés dans des cellules 293T en utilisant la méthode de phosphate calcium (Mangeot et al. [34]) et le kit de transfection en cellules de mammifères de Clontech (Cat. No. 631312), avec (i) 8 pg de pCG-GagPol (Ulm JW, Perron M, Sodroski J, Mulligan RC (2007) "Complex déterminants within the Moloney murine leukemia virus capsid modulate susceptibility of the virus to Fv1 and Refl -mediated restriction". Virology 363: 245-255 [43]) encodant les gènes Gag et Pol de M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) (Progema) et (ii) 2 g de vecteur pVSV-G (plasmide du virus de la stomatite vésiculaire) (Clontech) encodant l'enveloppe de glycoprotéine du virus.
Un jour après la transfection, les cellules sont lavées au PBS et incubées deux jours supplémentaires dans un milieu de culture DMEM complet à 37°C.
Puis, les surnageants des cultures cellulaires contenant des particules virales ont été récoltés et clarifiés par centrifugation (600g, Heraus), et 500 μΙ_ de vecteur contenant le surnageant sont transduits dans des cellules Hel_aP4 obtenues auprès du NIH AIDS REAGENT PROGRAM, pour permettre l'expression stable de la molécule « peptide- AcGFP ».
Deux jours après la transduction, les cellules sont cultivées dans 1 g/mL de puromycine pour sélectionner les lignées cellulaires stables.
Ensuite, l'infectiosité virale est évaluée sur ces cellules Hel_aP4 exprimant les molécules « peptide-AcGFP ». Pour mesurer la production virale dans ces cellules, environ 105 cellules sont placées sur une plaque à 24 puits et sont infectées avec différentes concentrations du virus VIH-1 IIIB (Pannecouque C, Daelemans D, De Clercq E., "Tetrazolium-based colorimetric assay for the détection of HIV replication inhibitors: revisited 20 years later", Nat Protoc. 2008;3(3):427-34 [44]) pendant 3 heures. Les cellules sont ensuite minutieusement lavées avec du PBS pour retirer les virus résiduels. Environ 3 jours après l'infection, la production des virus dans le surnageant cellulaire est mesurée avec un test ELISA pour l'antigen core p24 du VIH-1 (PekinElmer) selon (Daelemans D, Pauwels R, De Clercq E, Pannecouque C. "A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds" Nat Protoc. 201 1 6(6):925-33).
Exemple 14 : Evaluation de motifs pour l'activité des peptides
Les inventeurs ont défini différents groupes de peptides selon l'invention par rapport à l'activité observée.
Ces groupes ont été définis dans le cadre des expérimentations réalisées dans l'exemple 5 et ne sont en aucun cas limitatifs.
Groupe 1 : Selon les valeurs du test à la concentration en peptide de 1 μΜ et 10 minutes. En considérant comme positifs les peptides conservant au moins 50% d'activité du meilleur peptide (83).
Groupe 2 : Selon les valeurs du test à la concentration en peptide de 1 μΜ et 10 minutes. En considérant comme positifs les peptides conservant au moins 30% d'activité du meilleur peptide (83).
Groupe 3 : Selon les valeurs du test à la concentration en peptide de 1 μΜ et 1 heure. En considérant comme positifs les peptides conservant au moins 50% d'activité du meilleur peptide (83).
Groupe 4 : Selon les valeurs du test à la concentration en peptide de 1 μΜ et 1 heure. En considérant comme positifs les peptides conservant au moins 30% d'activité du meilleur peptide (83).
Groupe 5 : Selon la somme des valeurs obtenues pour tous les tests
(concentration en peptide de 1 μΜ et 10μΜ et 10 ou 60 minutes d'incubation (valeur de R). En considérant comme positifs les peptides ayant un R>2 (plus de 50% du meilleur peptide). Motifs présents dans chacun des groupes (occurrence entre parenthèse) :
Groupe 1 : 8 peptides
Motif 1 : KVKF(4), KKVKF(2), KKF(1 ), KVKW(1 )
Motif 2 : TARR(4), TAARR(1), TARAR(1), TARRA(1 ), AATARR(1 )
Motif 3 : GW (8)
Motif 4 : GR(7), rien (1)
Motif 5 : QMK(6), QMKK(2)
Groupe 2 : 12 peptides
Motif 1 : KVKF(7), KKVKF(3), KKF(1 ), KVKW(1 )
Motif 2 : TARR(7), TAARR(1), TARAR(1), TARRA(1), AATARR(1), ARR(1)
Motif 3 : GW(11), W(1)
Motif 4 : GR(9), rien (3)
Motif 5 : QMK(8), QMKK(3), MK(1)
Groupe 3 : 8 peptides identiques au groupe 1
Groupe 4: 15 peptides
Motif 1 : KVKF(10), KKVKF(3), KKF(1), KVKW(1)
Motif 2 : TARR(8), AATARR(2), TAARR(1), TARAR(1 ), TARRA(1 ), TARAAR(1 ), ARR(1)
Motif 3 : GW(14), W(1)
Motif 4 : GR(11), rien (4)
Motif 5 : QMK(11), QMKK(3), MK(1)
Groupe 5: 15 peptides
Motif 1 : KVKF(10), KKVKF(3), KKF(1), KVKW(1)
Motif 2 : TARR(9), TAARR(1), TARAR(1), TARRA(1 ), TAAR (1), ARR(1), RR(1), Motif 3 : GW (14), W(1 )
Motif 4 : GR (13), rien (2)
Motif 5 : QMK(1 1 ), QMKK(3), MK(1 ) La représentation des motifs dans l'ensemble des peptides du groupe
5 (R>2) et dans la population générale (63 peptides du tableau 2) ont été comparées et présentés dans le tableau ci-dessous. Entre [crochets] sont représentés les motifs fortement augmentés dans les peptides actifs, et entre (parenthèses) les motifs fortement diminués dans les peptides actifs.
Figure imgf000046_0001
Donc trois possibilités avec différents degrés de sélection des motifs Xa, Xb, Xe , Xd et Xe : Possibilité 1 : On reprend tous les motifs présents dans le groupe des peptides actifs (en se basant sur groupe 5)
Figure imgf000047_0001
Possibilité 2 : On reprend tous les motifs FORTEMENT (N>3) représentés dans le groupe des peptides actifs (en se basant sur tous les groupes)
Figure imgf000047_0002
Possibilité 3 : On tient compte des motifs fortement différents dans les peptides actifs par rapport à la population générale. Il faut dans ce cas définir des tailles d'espacement entre les motifs restant.
Figure imgf000047_0003
Listes des références
[1] http://www.aidsmeds.com/list.shtml
[2] Bradac K, Dieffenbach CW. "HIV vaccine development: Lessons from past, informing the future". IDrugs. 2009 Jul;12(4):435-9
[3] Rice, W. G. ; Schaeffer, C. A. ; Harten, B. ; Villinger, F. ; South, T.
L. ; Summers, M. F. ; Henderson, L. E. ; Bess, J. W., Jr. ; Arthur, L. O. ; McDougal, J. S. ; et al. Nature, 1993, 361, 473.
[4] Rice, W. G. ; Supko, J. G. ; Malspeis, L. ; Buckheit, R. W., Jr. ;
Clanton, D. ; Bu, M. ; Graham, L. ; Schaeffer, C. A. ; Turpin, J. A. ; Domagala, J. ; Gogliotti, R. ; Bader, J. P. ; Halliday, S. M. ; Coren,
L. ; Sowder, R. C, 2nd ; Arthur, L. O. ; Henderson, L. E. Science, 1995, 270, p. 1 194.
[5] de Rocquigny, H., V. Shvadchak, et al. (2008). "Targeting the viral nucleocapsid protein in anti-HIV-1 therapy." Mini Rev Med Chem 8(1 ): 24-35.
[6] V. Goldschmidt, L.M Miller Jenkins, H. de Rocquigny, J.L. Darlix, Y. Mely. The nucleocapsid protein of HIV-1 as a promising therapeutic target for antiviral drugs. HIV therapy 4, 179-198, 2010
[7] Leder et al. "Introduction to molecular medicine", Ed Sientific American, 1994.
[8] Judith Tulla-Puche et George Barany, "On-Resin Native Chemical Ligation for Cyclic Peptide Synthesis", J. Org. Chem., vol 69, pages 4101 -4107 ; 2004.
[9] Balraju V.; Srinivasa Reddy D. (2005) Synthesis of small cyclic peptides constrained with 3-(3-aminomethylphenyl)priopionic acid linkers using free radical-mediated macrocyclization. Tetrahedron Lett. 46.5207-5210.
[10] Litovchick, A. and J. W. Szostak (2008). "Sélection of cyclic peptide aptamers to HCV 1RES RNA using mRNA display." Proc Natl Acad Sci U S A 105(40): 15293-8. [11] Von Heijne G. et al., « Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP, and related tools », Nature Protocols, vol 2, pages 953- 971 , 2007.
[12] Morris MC, Deshayes S, Heitz F, Divita G, Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisims to therapeutics, Biol. Cell
(2008) 100, 201 -217.
[13] « Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach Séries) W. C. Chan (Editor), Peter D. White (Editor)", Oxford Univ Press 2000 »
[14] Darlix, J. L, M. Lapadat-Tapolsky, et al. (1995). "First glimpses at structure-function relationships of the nucleocapsid protein of retroviruses." J Mol Biol 254(4): 523-37.
[15] Levin, J. G., J. Guo, et al. (2005). "Nucleic acid chaperone activity of HIV-1 nucleocapsid protein: critical rôle in reverse transcription and molecular mechanism." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 80:
217-86.
[16] Demene, H., C. Z. Dong, et al. (1994). "1 H NMR structure and biological studies of the His23->Cys mutant nucleocapsid protein of HIV-1 indicate that the conformation of the first zinc finger is critical for virus infectivity." Biochemistry 33(39): 1 1707-16.
[17] Dorfman, T., J. Luban, et al. (1993). "Mapping of functionally important residues of a cysteine-histidine box in the human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein." J Virol 67(10): 6159-69.
[18] Gorelick, R. J., W. Fu, et al. (1999). "Characterization of the block in replication of nucleocapsid protein zinc finger mutants from moloney murine leukemia virus." J Virol 73(10): 8185-95.
[19] Gorelick, R. J., S. M. Nigida, Jr., et al. (1990). "Noninfectious human immunodeficiency virus type 1 mutants déficient in genomic RNA." J Virol 64(7): 3207-1 1 . [20] Tanchou V, Decimo D, Pechoux C, Lener D, Rogemond V, Berthoux L, Ottmann M, Darlix JL. Rôle of the N-terminal zinc finger of human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein in virus structure and replication. Journal of virology. 1998;72:4442^1447.
[21] Peppas NA et Carr DA, Impact of Absorption and Transport on Intelligent Therapeutics and Nano-scale Delivery of Protein Therapeutic Agents Chennical engineering Science, 64, 4553-4565 (2009).
[22] Morishita M et Peppas NA, Is the oral route possible for peptide and protein drug delivery?Drug Discovery Today, 1 1 , 905-910 (2006).
[23] Heitz F, Morris MC, Divita G. "Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics". Br J Pharmacol. 2009 May;157(2): 195-206.
[24] Wehrlé P., Pharmacie galénique, Formulation et technologie pharmaceutiques, 2007.
[25] Cordier-Ochsenbein, F., R. Guerois, et al. (1998). "Exploring the folding pathways of annexin I, a multidomain protein. II. Hierarchy in domain folding propensities may govern the folding process." J
Mol Biol 279(5): 1 177-85.
[26] Li, J. J., X. Fang, S. M. Schuster et W. Tan. 2000a. Molecular
Beacons: A Novel Approach to Detect Protein - DNA Interactions.
Angew Chem Int Ed Engl 39:1049-1052.
[27] Li, J. J., R. Geyer et W. Tan. 2000b. Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single- stranded DNA. Nucleic Acids Res 28:E52.
[28] Li, Q. G., J. X. Liang, G. Y. Luan, Y. Zhang et K. Wang. 2000c.
Molecular beacon-based homogeneous fluorescence PCR assay for diagnosis of infectious diseases. Analytical Sciences 16:245-
248. [29] Sokol, D. L, X. Zhang, P. Lu et A. M. Gewirtz. 1998. Real time détection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95:1 1538-43.
[30] Tyagi, S. et F. R. Kramer. 1996. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14:303-308.
[31] Cornille F., Mely Y., Ficheux D., Salvignol I., Gérard D., Darlix J.- L, Fournié-Zaluski M.-C. et Roque B (1990). Solid phase synthesis of the retroviral nudeocapsid protein NCp10 of Moloney murine leukemia virus and related zinc-fingers in free SH forms : influence of the zinc chelation on structural and biochemical properties. Int.
J. Pept. Protein Res., 36, 551 -558.
[32] Vuilleumier, C, C. Maechling-Strasser, D. Gérard et Y. Mely. 1997.
Evidence and prévention of HIV-1 nudeocapsid protein adsorption onto fluorescence quartz cells. Anal Biochem 244:183-5.
[33] Jiang, sheng ; Li, Zheng ; ding, Ke ; Roller, Peter P., Récent Progress of Synthetic Studies to Peptide and Peptidomimetic Cyclization, Current Organic Chemistry, 12(17), 1502-1542 (2008).
[34] Mangeot PE, Duperrier K, Nègre D, Boson B, Rigal D, Cosset FL, Darlix JL. High levels of transduction of human dendritic cells with optimized SIV vectors. Mol Ther. 2002; 5: 283-90.
[35] Grigorov B, Décimo D, Smagulova F, Péchoux C, Mougel M, Muriaux D, Darlix JL 2007 Intracellular HIV-1 Gag localization is impaired by mutations in the nudeocapsid zinc fingers. Retrovirology 4, 54.
[36] Berthoux L, Pechoux C, Darlix JL. Multiple effects of an anti-human immunodeficiency virus nudeocapsid inhibitor on virus morphology and replication. Journal of virology. 1999;73:10000-10009.
[37] Muriaux D, Mirro J, Harvin D, Rein A. RNA is a structural élément in retrovirus particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001 ;98:5246-5251 . [38] Grigorov B, Arcanger F, Roingeard P, Darlix JL, Muriaux D. Assembly of infectious HIV-1 in human epithelial and T- lymphoblastic cell lines. Journal of molecular biology. 2006;359: 848-862.
[39] Eiriksdottir E, Konate K, Langel U, Divita G, Deshayes
S.Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochim Biophys Acta. 2010
Jun;1798(6):1 1 19-28.
[40] Thomas A, Lins L, Divita G, Brasseur R. Realistic modeling approaches of structure-function properties of CPPs in non- covalent complexes. Biochim Biophys Acta. 2010 Feb 23.
[41] Prasher D, Eckenrode V, Ward W, Prendergast F, Cormier M
"Primary structure of the Aequorea Victoria green-fluorescent protein". Gene 1 1 1 (2): 229-33 (1992).
[42] Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward W, Prasher D "Green fluorescent protein as a marker for gene expression". Science 263
(5148): 802-5 (1994).
[43] Ulm JW, Perron M, Sodroski J, Mulligan RC Complex déterminants within the Moloney murine leukemia virus capsid modulate susceptibility of the virus to Fv1 and Refl -mediated restriction.
Virology 363: 245-255 (2007).
[44] Pannecouque C, Daelemans D, De Clercq E., Tetrazolium-based colorimetric assay for the détection of HIV replication inhibitors: revisited 20 years later, Nat Protoc. 2008;3(3):427-34.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Peptide consistant en la séquence XaXbXcXdXe dans laquelle :
Xa est choisi dans le groupe comprenant KKVKF (SEQ ID NO. 317),
KKVKW (SEQ ID NO. 318), KKVKY (SEQ ID NO. 319), KVKW (SEQ ID NO. 320), KVKY (SEQ ID NO. 321 ), KVKF (SEQ ID NO. 322), KKF, KKW et KKY ;
Xb est choisi dans le groupe comprenant T, R, TR, RR, ARR, TAR, TARR (SEQ ID NO. 323), TAAR (SEQ ID NO. 324), TARA (SEQ ID NO. 325), TARRA (SEQ ID NO. 326), TAARR (SEQ ID NO. 327), TARAR (SEQ ID NO. 328), TAAARR (SEQ ID NO. 329), TARAAR (SEQ ID NO. 330), TARRAA (SEQ ID NO. 331 ), AATARR (SEQ ID NO. 332) et AATAAR(SEQ ID NO. 333) ;
Xe est choisi dans le groupe comprenant GW, GWD, W, AW et AWD ;
Xd est rien ou choisi dans le groupe comprenant GR, AR, A, R et G ; Xe est choisi dans le groupe comprenant MK, QMK, QMKK (SEQ ID NO. 334), NMK et NMKK (SEQ ID NO. 335) ;
des résidus cystéines pouvant éventuellement être insérés dans ladite séquence pour sa cyclisation.
2. Peptide selon la revendication 1 , ledit peptide étant choisi parmi les SEQ ID n°1 à 306 de la liste des séquences annexée.
3. Peptide selon la revendication 1 , comprenant en outre, à son extrémité carboxy-terminale, un peptide signal lui permettant de traverser une membrane cellulaire.
4. Peptide selon la revendication 3, dans lequel le peptide signal est choisi parmi les séquences SQPKRRKK (SEQ ID NO. 307),
SKL, KDEL (SEQ ID NO. 308), PPKKKRV (SEQ ID NO. 309), MMSFVALLLVGILFWAWEAEQLTKCEVFQ (SEQ ID NO. 310), MLSLRQSIRFFKCSSRYLL (SEQ ID NO. 31 1 ) et ALWRALWFRLWRLAWFRLWR (SEQ ID NO. 312).
5. Peptide selon la revendication 1 , ledit peptide étant linéaire ou cyclique.
6. Peptide selon la revendication 5, ledit peptide étant cyclique, et dans lequel deux résidus cystéines sont présents ou ont été intégrés à une distance permettant la cyclisation du peptide, lesdits résidus cystéines étant reliés entre eux via leur groupement -SH libre ou d'un bras espaceur choisi dans le groupe comprenant un alkyl en Ci à C6 et un composé choisi parmi les composés de formule :
Figure imgf000054_0001
- ( CH2CH20 ) n-CH2CH2- dans lequel n est un nombre entier allant de 0 à 10, m est un nombre entier allant de 0 à 10 et X est choisi dans le groupe comprenant un atome oxygène, un atome de soufre, un groupe CH2, un groupe NH et un groupe NCH3.
7. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour une utilisation comme médicament.
8. Peptide selon la revendication 7, pour une utilisation comme médicament anti-rétroviral.
9. Peptide selon la revendication 7, pour une utilisation comme médicament anti-VIH-1 .
10. Peptide selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, le médicament comprenant en outre au moins un antirétroviral.
1 1 . Peptide selon la revendication 10, dans laquelle l'au moins un antirétroviral est choisi dans le groupe comprenant AZT, lamivudine, émtricitabine, didanosine, stavudine, abacavir, zalcitabine, tenofovir, racivir, amdoxovir, apricitabine, elvucitabine, efavirenz, nevirapine, étravirine, delavirdine, rilpivrine, tenofovir, fosalvudine, amprenavir, tipranavir, idinavir, saquinavir, fosamprenavir, ritonavir, darunavir, atazanavir, nelfinavir, kaletra, raltegravir, elvitégravir, MK-2048, enfuvirtide, vicriviroc, TNX-355 et bevirimat.
12. Peptide selon la revendication 10 ou 1 1 , comprenant ledit peptide et une combinaison choisie dans le groupe comprenant : zidovudine + lamivudine ; abacavir + lamivudine ; ténofovir + émtricitabine ; abacavir + lamivudine ; abacavir + lamivudine + zidovudine ; ténofovir + émtricitabine + efavirenz.
13. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ledit peptide se présentant sous une forme injectable.
14. Procédé de synthèse du peptide défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6, ledit procédé comprenant une étape de synthèse en chimie Boc et/ou en chimie Fmoc.
PCT/FR2011/052909 2010-12-09 2011-12-08 Peptides et medicament antiviral WO2012076822A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1060294 2010-12-09
FR1060294A FR2968663A1 (fr) 2010-12-09 2010-12-09 Peptides et medicament antiviral

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012076822A1 true WO2012076822A1 (fr) 2012-06-14

Family

ID=44114421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2011/052909 WO2012076822A1 (fr) 2010-12-09 2011-12-08 Peptides et medicament antiviral

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2968663A1 (fr)
WO (1) WO2012076822A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107073133A (zh) * 2014-10-27 2017-08-18 吉利斯拉有限公司 关于用于在蛋白药物缀合物中使用的接头的材料和方法
EP3290412A1 (fr) 2016-08-31 2018-03-07 Università degli Studi di Siena Inhibiteurs des nucléocapsides du vih-1

Non-Patent Citations (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach Series", 2000, OXFORD UNIV PRESS
B GRIGOROV ET AL., RETROVIROLOGY, 2007
BALRAJU V.; SRINIVASA REDDY D.: "Synthesis of small cyclic peptides constrained with 3-(3-aminomethylphenyl)priopionic acid linkers using free radical-mediated macrocyclization", TETRAHEDRON LETT., vol. 46, 2005, pages 5207 - 5210, XP025385606, DOI: doi:10.1016/j.tetlet.2005.05.115
BERTHOUX L; PECHOUX C; DARLIX JL.: "Multiple effects of an anti-human immunodeficiency virus nucleocapsid inhibitor on virus morphology and replication", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 73, 1999, pages 10000 - 10009
BRADAC K; DIEFFENBACH CW.: "HIV vaccine development: Lessons from past, informing the future", IDRUGS, vol. 12, no. 4, July 2009 (2009-07-01), pages 435 - 9
CHALFIE M; TU Y; EUSKIRCHEN G; WARD W; PRASHER D: "Green fluorescent protein as a marker for gene expression", SCIENCE, vol. 263, no. 5148, 1994, pages 802 - 5
CORDIER-OCHSENBEIN, F.; R. GUEROIS ET AL.: "Exploring the folding pathways of annexin , a multidomain protein. . Hierarchy in domain folding propensities may govern the folding process", J MOL BIOL, vol. 279, no. 5, 1998, pages 1177 - 85, XP004457479, DOI: doi:10.1006/jmbi.1998.1828
CORNILLE F.; MELY Y.; FICHEUX D.; SALVIGNOL I.; GÉRARD D.; DARLIX J.-L.; FOURNIÉ-ZALUSKI M.-C.; ROQUE B: "Solid phase synthesis of the retroviral nucleocapsid protein NCp10 of Moloney murine leukemia virus and related zinc-fingers in free SH forms : influence of the zinc chelation on structural and biochemical properties", INT. J. PEPT. PROTEIN RES., vol. 36, 1990, pages 551 - 558
CORNILLE F.; MELY Y.; FICHEUX D.; SALVIGNOL I.; GÉRARD D.; DARLIX J.-L.; FOURNIÉ-ZALUSKI M.-C.; ROQUE B: "Solid phase synthesis of the retroviral nucleocapsid protein NCp10 of Moloney murine leukemia virus and related zinc-fingers in free SH forms: influence of the zinc chelation on structural and biochemical properties", INT. J. PEPT. PROTEIN RES., vol. 36, 1990, pages 551 - 558
D LENER: "Use of a constrain phage displayed-peptide library for the isolation of peptides binding to HIV-1 nucleocapsid protein (NCp7)", FEBS LETTERS, vol. 361, no. 1, 13 March 1995 (1995-03-13), pages 85 - 88, XP055000620, ISSN: 0014-5793, DOI: 10.1016/0014-5793(95)00158-6 *
DAELEMANS D; PAUWELS R; DE CLERCQ E; PANNECOUQUE C.: "A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds", NAT PROTOC., vol. 6, no. 6, 2011, pages 925 - 33
DARLIX J. L. ET AL., J. MOL BIOL, vol. 254, 1995, pages 523
DARLIX, J. L.; M. LAPADAT-TAPOLSKY ET AL.: "First glimpses at structure-function relationships of the nucleocapsid protein of retroviruses", J MOL BIOL, vol. 254, no. 4, 1995, pages 523 - 37
DATABASE UniProt [online] 1 October 2002 (2002-10-01), "Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology", XP002641884, Database accession no. O45238 *
DE ROCQUIGNY, H.; V. SHVADCHAK ET AL.: "Targeting the viral nucleocapsid protein in anti-HIV-1 therapy", MINI REV MED CHEM, vol. 8, no. 1, 2008, pages 24 - 35
DEMENE ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 33, 1994, pages 11707
DEMENE, H.; C. Z. DONG ET AL.: "1H NMR structure and biological studies of the His23-->Cys mutant nucleocapsid protein of HIV-1 indicate that the conformation of the first zinc finger is critical for virus infectivity", BIOCHEMISTRY, vol. 33, no. 39, 1994, pages 11707 - 16
DORFMAN ET AL., J VIROL, vol. 67, 1993, pages 6159
DORFMAN, T.; J. LUBAN ET AL.: "Mapping of functionally important residues of a cysteine-histidine box in the human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein", J VIROL, vol. 67, no. 10, 1993, pages 6159 - 69
DRUILLENNEC S ET AL: "A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, WASHINGTON, DC; US, vol. 96, 1 April 1999 (1999-04-01), pages 4886 - 4891, XP008112035, ISSN: 0027-8424 *
EIRIKSDÔTTIR E; KONATE K; LANGEL U; DIVITA G; DESHAYES S.: "Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1798, no. 6, June 2010 (2010-06-01), pages 1119 - 28, XP027035829
F. CORDIER-OCHSENBEIN ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 279, pages 1177 - 1185
GORELICK ET AL., J VIROL, vol. 64, 1990, pages 3207
GORELICK ET AL., J VIROL, vol. 73, 1999, pages 8185
GORELICK, R. J.; S. M. NIGIDA, JR. ET AL.: "Noninfectious human immunodeficiency virus type 1 mutants deficient in genomic RNA", J VIROL, vol. 64, no. 7, 1990, pages 3207 - 11, XP000197126
GORELICK, R. J.; W. FU ET AL.: "Characterization of the block in replication of nucleocapsid protein zinc finger mutants from moloney murine leukemia virus", J VIROL, vol. 73, no. 10, 1999, pages 8185 - 95
GRIGOROV B; ARCANGER F; ROINGEARD P; DARLIX JL; MURIAUX D.: "Assembly of infectious HIV-1 in human epithelial and T-lymphoblastic cell lines", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 359, 2006, pages 848 - 862, XP024951099, DOI: doi:10.1016/j.jmb.2006.04.017
GRIGOROV B; DÉCIMO D; SMAGULOVA F; PÉCHOUX C; MOUGEL M; MURIAUX D; DARLIX JL: "Intracellular HIV-1 Gag localization is impaired by mutations in the nucleocapsid zinc fingers", RETROVIROLOGY, vol. 4, 2007, pages 54, XP021030299, DOI: doi:10.1186/1742-4690-4-54
HEITZ F; MORRIS MC; DIVITA G.: "Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics", BR J PHARMACOL., vol. 157, no. 2, May 2009 (2009-05-01), pages 195 - 206
JIANG, SHENG; LI, ZHENG; DING, KE; ROLLER, PETER P., CURRENT ORGANIC CHEMISTRY, vol. 12, no. 17, 2008, pages 1502 - 1542
JIANG, SHENG; LI, ZHENG; DING, KE; ROLLER, PETER P.: "Recent Progress of Synthetic Studies to Peptide and Peptidomimetic Cyclization", CURRENT ORGANIC CHEMISTRY, vol. 12, no. 17, 2008, pages 1502 - 1542, XP009141931, DOI: doi:10.2174/138527208786241501
JUDITH TULLA-PUCHE; GEORGE BARANY: "On-Resin Native Chemical Ligation for Cyclic Peptide Synthesis", J. ORG. CHEM., vol. 69, 2004, pages 4101 - 4107
JULIA DIETZ ET AL: "Inhibition of HIV-1 by a Peptide Ligand of the Genomic RNA Packaging Signal [Psi]", CHEMMEDCHEM, vol. 3, no. 5, 19 May 2008 (2008-05-19), pages 749 - 755, XP055000622, ISSN: 1860-7179, DOI: 10.1002/cmdc.200700194 *
LEDER ET AL.: "Introduction to molecular medicine", 1994
LEDER ET AL.: "Introduction to molecular medicine", 1994, ED SCIENTIFIC AMERICAN
LEVIN, J. G.; J. GUO ET AL.: "Nucleic acid chaperone activity of HIV-1 nucleocapsid protein: critical role in reverse transcription and molecular mechanism", PROG NUCLEIC ACID RES MOL BIOL, vol. 80, 2005, pages 217 - 86
LI, J. J.; R. GEYER; W. TAN: "Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA", NUCLEIC ACIDS RES, vol. 28, 2000, pages E52
LI, J. J.; X. FANG; S. M. SCHUSTER; W. TAN: "Molecular Beacons: A Novel Approach to Detect Protein - DNA Interactions", ANGEW CHEM INT ED ENGL, vol. 39, 2000, pages 1049 - 1052
LI, Q. G.; J. X. LIANG; G. Y. LUAN; Y. ZHANG; K. WANG: "Molecular beacon-based homogeneous fluorescence PCR assay for diagnosis of infectious diseases", ANALYTICAL SCIENCES, vol. 16, 2000, pages 245 - 248
LITOVCHICK, A.; J. W. SZOSTAK: "Selection of cyclic peptide aptamers to HCV IRES RNA using mRNA display", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 105, no. 40, 2008, pages 15293 - 8
MANGEOT PE; DUPERRIER K; NÈGRE D; BOSON B; RIGAL D; COSSET FL; DARLIX JL., MOL THER., vol. 5, 2002, pages 283 - 90
MANGEOT PE; DUPERRIER K; NÈGRE D; BOSON B; RIGAL D; COSSET FL; DARLIX JL.: "High levels of transduction of human dendritic cells with optimized SIV vectors", MOL THER., vol. 5, 2002, pages 283 - 90, XP002313774, DOI: doi:10.1006/mthe.2002.0541
MORISHITA M; PEPPAS NA, DRUG DISCOVERY TODAY, vol. 11, 2006, pages 905 - 910
MORISHITA M; PEPPAS NA: "Is the oral route possible for peptide and protein drug delivery?", DRUG DISCOVERY TODAY, vol. 11, 2006, pages 905 - 910, XP025027147, DOI: doi:10.1016/j.drudis.2006.08.005
MORRIS MC; DESHAYES S; HEITZ F; DIVITA G: "Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics", BIOL. CELL, vol. 100, 2008, pages 201 - 217
MURIAUX D; MIRRO J; HARVIN D; REIN A.: "RNA is a structural element in retrovirus particles", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 98, 2001, pages 5246 - 5251, XP002544546, DOI: doi:10.1073/pnas.091000398
PANNECOUQUE C; DAELEMANS D; DE CLERCQ E.: "Tetrazolium-based colorimetric assay for the detection of HIV replication inhibitors: revisited 20 years later", NAT PROTOC., vol. 3, no. 3, 2008, pages 427 - 34
PARK M Y ET AL: "Selection and characterization of peptides specifically binding to HIV-1 psi (psi) RNA", VIRUS RESEARCH, AMSTERDAM, NL, vol. 106, no. 1, 1 November 2004 (2004-11-01), pages 77 - 81, XP004619859, ISSN: 0168-1702, DOI: DOI:10.1016/J.VIRUSRES.2004.05.012 *
PEPPAS NA; CARR DA: "Chemical engineering", vol. 64, 2009, SCIENCE, pages: 4553 - 4565
PEPPAS NA; CARR DA: "Impact of Absorption and Transport on Intelligent Therapeutics and Nano-scale Delivery of Protein Therapeutic Agents Chemical engineering", SCIENCE, vol. 64, 2009, pages 4553 - 4565
PRASHER D; ECKENRODE V; WARD W; PRENDERGAST F; CORMIER M: "Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein", GENE, vol. 111, no. 2, 1992, pages 229 - 33, XP023542670, DOI: doi:10.1016/0378-1119(92)90691-H
RICE, W. G.; SCHAEFFER, C. A.; HARTEN, B.; VILLINGER, F.; SOUTH, T. L.; SUMMERS, M. F.; HENDERSON, L. E.; BESS, J. W., JR.; ARTHUR, NATURE, vol. 361, 1993, pages 473
RICE, W. G.; SUPKO, J. G.; MALSPEIS, L.; BUCKHEIT, R. W., JR.; CLANTON, D.; BU, M.; GRAHAM, L.; SCHAEFFER, C. A.; TURPIN, J. A.; D, SCIENCE, vol. 270, 1995, pages 1194
SOKOL, D. L.; X. ZHANG; P. LU; A. M. GEWIRTZ.: "Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 95, 1998, pages 11538 - 43, XP002123471, DOI: doi:10.1073/pnas.95.20.11538
SOKOL, D. L.; X. ZHANG; P. LU; A. M. GEWIRTZ: "Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 95, 1998, pages 11538 - 43, XP002123471, DOI: doi:10.1073/pnas.95.20.11538
TANCHOU V; DECIMO D; PECHOUX C; LENER D; ROGEMOND V; BERTHOUX L; OTTMANN M; DARLIX JL.: "Role of the N-terminal zinc finger of human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein in virus structure and replication", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 72, 1998, pages 4442 - 4447
THOMAS A; LINS L; DIVITA G; BRASSEUR R.: "Realistic modeling approaches of structure-function properties of CPPs in non- covalent complexes", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, 23 February 2010 (2010-02-23)
TYAGI, S.; F. R. KRAMER: "Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization", NAT. BIOTECHNOL., vol. 14, 1996, pages 303 - 308, XP002914999, DOI: doi:10.1038/nbt0396-303
ULM JW; PERRON M; SODROSKI J; MULLIGAN RC: "Complex determinants within the Moloney murine leukemia virus capsid modulate susceptibility of the virus to Fv1 and Refl-mediated restriction", VIROLOGY, vol. 363, 2007, pages 245 - 255, XP022083915, DOI: doi:10.1016/j.virol.2006.09.048
V. GOLDSCHMIDT; L.M MILLER JENKINS; H. DE ROCQUIGNY; J.L. DARLIX; Y. MELY: "The nucleocapsid protein of HIV-1 as a promising therapeutic target for antiviral drugs", HIV THERAPY, vol. 4, 2010, pages 179 - 198, XP009149341, DOI: doi:10.2217/hiv.10.3
VON HEIJNE G. ET AL.: "Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP, and related tools", NATURE PROTOCOLS, vol. 2, 2007, pages 3569 - 3571
VON HEIJNE G. ET AL.: "Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP, and related tools", NATURE PROTOCOLS, vol. 2, 2007, pages 953 - 971, XP008097990, DOI: doi:10.1038/nprot.2007.131
VUILLEUMIER, C.; C. MAECHLING-STRASSER; D. GERARD; Y. MELY: "Evidence and prevention of HIV-1 nucleocapsid protein adsorption onto fluorescence quartz cells", ANAL BIOCHEM, vol. 244, 1997, pages 183 - 5
WEHRLÉ P., PHARMACIE GALÉNIQUE, FORMULATION ET TECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUES, 2007

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107073133A (zh) * 2014-10-27 2017-08-18 吉利斯拉有限公司 关于用于在蛋白药物缀合物中使用的接头的材料和方法
US11285220B2 (en) 2014-10-27 2022-03-29 Iksuda Therapeutics Limited Materials and methods relating to linkers for use in protein drug conjugates
EP3290412A1 (fr) 2016-08-31 2018-03-07 Università degli Studi di Siena Inhibiteurs des nucléocapsides du vih-1

Also Published As

Publication number Publication date
FR2968663A1 (fr) 2012-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Robins et al. HIV protease inhibitors: their anti-HIV activity and potential role in treatment
Ottmann et al. The central globular domain of the nucleocapsid protein of human immunodeficiency virus type 1 is critical for virion structure and infectivity
Waheed et al. HIV type 1 Gag as a target for antiviral therapy
CA2483327A1 (fr) Oligonucleotides issus des sequences codant pour la composante de surface des proteines d'enveloppe des ptlv et leurs utilisations
Vercruysse et al. A phenyl-thiadiazolylidene-amine derivative ejects zinc from retroviral nucleocapsid zinc fingers and inactivates HIV virions
EP0273782A1 (fr) Retrovirus recombinant défectif
US20170296601A1 (en) Compositions and Methods for Treating an Immunodeficiency Virus Infection
Maetzig et al. Retroviral protein transfer: falling apart to make an impact
EP0542630A2 (fr) Utilisation de dérivés d'amphotéricine B, comme inhibiteurs de protéases
WO2012076822A1 (fr) Peptides et medicament antiviral
CA2561163A1 (fr) Antigene tat stabilise et ses applications pour la vaccination anti-vih
CN113999284B (zh) 用于抗埃博拉病毒的环状多肽或其药用盐
CA2632708A1 (fr) Peptides qui peuvent se lier a la proteine nef et leurs applications pharmaceutiques
Balaji et al. Global protein sequence variation in HIV-1-B isolates derived from human blood and brain
EP1668037A1 (fr) Polypeptide d'interaction comprenant un motif heptapeptidique et un domaine de penetration cellulaire
WO2004041194A2 (fr) Inhibition de la replication de vih-1
CA2197861A1 (fr) Peptides phenyles, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui en renferment
Gomes Characterization of enveloped viruses inhibition by 25-hydroxycholesterol at the membrane level
Peralta Branched Peptides Targeting HIV-1 RRE RNA and Structure-Activity Relationship Studies of Spinster Homolog 2 Inhibitors
EP4153172A1 (fr) Composés pour leur utilisation pour la réactivation du vih dans des cellules latentes infectées par le vih
Anderson-Daniels Molecular Mechanisms Of HIV-1 Maturation And Host Factor Utilization
Kappes Viral protein X
EP1463819A1 (fr) MUTANTS DE LA PROTEINE TAT DU VIRUS VIH−1
US20160310567A1 (en) Compositions for inhibiting viral replication and methods of use and production thereof
Willbold Interaction of HIV-1 Nef with Human CD4 and Lck

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11811057

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11811057

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1