CA2632708A1

CA2632708A1 - Peptides qui peuvent se lier a la proteine nef et leurs applications pharmaceutiques

Info

Publication number: CA2632708A1
Application number: CA002632708A
Authority: CA
Inventors: Daniel Baty; Yves Collette; Francoise Guerlesquin; Xavier Morelli; Isabelle Parrot; Stephan Arold; Serge Benichou
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2006-12-11
Publication date: 2007-06-14
Also published as: FR2894584A1; WO2007066018A3; US20090163410A1; EP1976862A2; WO2007066018A2

Abstract

L'invention a pour objet de nouveaux peptides isolés, purifiés, possédant notamment des propriétés de liaison à la protéine Nef, caractérisés en ce qu'ils renferment une séquence en acides aminés répondant à SEQ ID N~1 : W-P -a- W-L-P dans laquelle a est choisi parmi W, A, S ou D.

Description

DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX

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NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:

Nouveaux peptides et leurs applications biologiques L'invention a pour objet de nouveaux peptides isolés, purifiés, liant en particulier la protéine Nef de VIH-1. Elle vise également leurs applications comme inhibiteurs des interactions de Nef avec ses partenaires dans les cellules infectées et, à ce titrë, comme médicaments anti-rétroviraux.
La virulence du VIH résulte de son importante capacité
réplicative ainsi que de son caractère pathogène mis en évidence dans des modèles animaux non permissifs à la réplication virale. Plusieurs produits de gènes viraux contribuent directement et indirectement à la pathogénicité, et sont impliqués dans le développement d'un syndrome d' imm.unodéficience acquise (SIDA).
Parmi ces protéines, Nef constitue une cible d'intérêt. De nombreux partenaires cellulaires de Nef ont été identifiés dont les protéines cellulaires à domaine SH3. L'implication de Nef dans le cycle viral et son rôle important en font donc une cible de choix contre laquelle il n'existe aujourd'hui aucun inhibiteur connu. L'ensemble de ces arguments a conduit les inventeurs à proposer la protéine Nef comme une cible virale d'importance majeure, et à développer des inhibiteurs susceptibles d'interférer avec ses fonctions biologiques, et par extension, avec la réplication et la pathogénicité du virus VIH-1, d'une part, et avec l'immunogénicité des cellules infectées, d'autre part.
En particulier, la mise en évidence d'une séquence consensus chez des peptides obtenus par la technique de phage-display et caractérisés, permet de disposer de composés inhibiteurs de Nef de grande valeur et fournit les moyens pour développer une approche de modélisation de drogues ciblant les surfaces moléculaires complémentaires entre la protéine Nef et les peptides.

L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux peptides capables de cibler spécifiquement des régions de Nef impliquées dans l'infection par le VIH-1.
Elle vise également à fournir des moyens permettant d'obtenir de tels peptides.
L'invention à également pour but la mise à profit des propriétés inhibitrices de Nef de ces peptides et vise leurs applications thérapeutiques, plus spécialement pour le traitement d'infections par le VIH-1.

Les peptides isolés, purifiés, de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils renferment une séquence en acides aminés répondant à SEQ ID N 1 :
W-P-a-W-L-P
dans laquelle a est choisi parmi W, A, S ou D.
Des peptides de l'invention présentant cette séquence répondent à l'enchaînement en acides aminés SEQ ID N 2 b - W - P - a - W - L -P -c - d -f dans lequel b = R/T ou est absent a est tel que défini ci-dessus c= Q , T, L, G, H ou est absent d = L, W, A ou ést absent f = P ou est absent.
Des peptides de ce groupe sont des peptides décamériques et répondent aux séquences SEQ ID N 3 à SEQ ID N 7 suivantes SEQ ID N 6 : T W P W W L P H A P

SEQ ID N 7 : W P S W L P Q L P F
De manière avantageuse, ces peptides se lient à Nef avec une affinité de l'ordre du micromolaire.

2 D'autres peptides répondent aux séquences SEQ ID N 8 à SEQ
ID N 13 suivantes SEQ ID N 8 : W P S W L P Q
SEQ ID N 9 : W P S W L P

SEQ ID N 10 : W P W W L P
SEQ ID N 11 : W P A W L P
SEQ ID N 12 : W P D W L P

SEQ ID N 13 : W P S W L P Q L P

Selon un mode de réalisation de l'invention, les peptides définis ci-dessus peuvent renfermer une séquence d'acides aminés, comportant, le cas échéant, des dérivés d'acides aminés facilitant leur pénétration dans les cellule.s.

Des peptides dérivés de ce type contiennent par exemple, à
l'une de leurs extrémités, une séquence choisie parmi (R) n avec n= 6 à 8; R (A R R) õï, avec nl= 1 à 3 ;R(Ahx R) n2r avec n2=
1 à 6; SEQ ID N 14 :K K R R Q R R R ; et SEQ ID N 15 : R Q I K I W
F Q N R Nle K W K K.
Dans ces séquences,"Ahx" représente un motif acide amino-hexanoïque et Nle , la nor-leucine.

L'invention vise en particulier des peptides dérivés de la séquence ID N 11, répondant aux séquences SEQ ID N 16 à SEQ ID
N 21 suivantes :

SEQ ID N 16 : R R R R R R W P A W L P
SEQ ID N 17 : R R R R R R R R W P A W L P

SEQ ID N 19 : R Ahx R Ahx R Ahx R Ahx R Ahx R Ahx R W P A W L P
SEQ ID N 20 : K K R R Q R R R W P A W L P
SEQ ID N 21 : R Q I K I W F Q N R Nle K W K K W P A W L P
Les peptides de l'invention qui lient la protéine Nef sont aisément obtenus en mettant en ceuvre les techniques classiques de synthèse peptidique et constituent des produits purs.

Les peptides de l'invention se fixent sur une surface moléculaire de Nef impliquée dans l'interaction de cette dernière avec le domaine SH3 de Hck et la kinase PAK, et requise pour les fonctions de modulation de l'expression de

3 surface des molécules du CMH de classe I et l'augmentation de l'infectivité virale par Nef.
Ces peptides sont alors des outils de choix pour être utilisés comme inhibiteurs de l'interaction entre Nef et certains de ses partenaires cellulaires, dont les protéines à
domaine SH3. Ils sont également utilisables pour développer des molécules chimiques à partir de leurs séquences en acides aminés et/ou de leurs données structurales et, dans cette application, lesdits peptides sont utilisés directement ou fusionnés à des éléments facilitant leur pénétration dans les cellules.
Ils permettent en effet d'élaborer des molécules (peptides modifiés ou molécules chimiques) inhibant l'interaction de Nef avec certains de ses partenaires cellulaires, dont les protéines à domaine SH3, et ayant donc des effets sur les fonctions cellulaires et virales modulées par Nef via ces interactions, en particulier la propagation du virus VIH-1 chez l'hôte infecté.
Compte tenu de leurs propriétés, les peptides de l'invention sont particulièrement appropriés pour constituer des principes actifs de médicaments anti-viraux.
L'invention vise donc également des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un peptide tel que défini ci-dessus, associé à des excipients pharmacologiquement acceptables.
Ces compositions se présentent sous des formes appropriées pour leur administration en vue d'un traitement anti-HIV. Il s'agit avantageusement de compositions injectables renfermant lesdits peptides en solution ou en suspension. De telles compositions- renferment par exemple de 10}1g à 50 mg de peptide.

4 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent qui comportent des références aux figures 1 à 7, représentant, respectivement - la figure 1 l'alignement des peptides liant Nefo1_.57, - la figure 2 la réalisation de tests ELISA pour mesurer l'interaction entre Nef et les différents partenaires, le phage-SH3Hck ou les phages-peptide issus d'une banque de peptides, - la figure 3 : le déplacement des phages-peptide par Nefo1-57 et GST-SH3, - la figure 4 le déplacement des phages par des peptides de synthèse, - la figure 5 l'activité cellulaire des peptides, - la figure 6 le spectre 1H-15N HSQC, et - la figure 7 les spectres HSQC de Nef.
La protéine Nef La protéine Nef (Nef HIV-1 LAI) utilisée est une protéine recombinante purifiée à partir d'une protéine de fusion GST-Nefol-57 après clivage par la thrombine (Arold et al., 1997). La protéine Nefol-57 a été délétée des résidus 1 à 57 car cette région n'est pas structurée en solution et a dû être clivée pour permettre 1'obtention de cristaux afin de résoudre la structure de la protéine.

Afin de réaliser les expériences de RMN hétéronucléaire, la protéine Nef est enrichie en 15N en la produisant dans E.
coli cultivée sur milieu minimum M9 où le chlorure d'ammonium est substitué par du 15NH4C1 (Eurisotop).
1. Construction d'un phage contrôle exprimant à sa surface la région RT du domaine SH3 de Hck La région d'ADN codant pour les résidus 62 à 118 du domaine SH3 de Hck a été amplifiée, par PCR à partir du plasmide pBindHckSH3 et clonée dans le vecteur phagemidique pHenl (Hoogenboom et al., 1991) entre les sites des enzymes de restriction PstI et EagI. Ce phagemide permet, en présence

5 d'un phage helper, d'exprimer le domaine SH3 fusionné en N-.terminal de la protéine 3 (p3) à la tête du phage M13.
Séquences SEQ ID N 22 et 23 des oligonucléotides utilisés 5' SH3/PstI
SEQ ID N 22: AATGCAAAACTGCAGGTGGTTGCCCTGTATG
3' SH3/EagI
SEQ ID N 23 : TTTGTTCTGCGGCCGCGTCAACGCGGGCGAC
Conditions de PCR1 Le fragment codant pour le domaine SH3 de Hck a été
amplifié par PCR en utilisant 0,1 ul du plasmide pBindHckSH3, avec 0,5 U de Dynazyme Extend DNA polymerase (Finnzymes), 10 pmoles de l'amorce 5' SH3/PstI et 10 pmoles de l'amorce 3' SH3/EagI, dans un volume de 50 ul (94 C, 3 min; 94 C, 1 min;
60 C, 1 min ; 72 C, lmin ; 37 cycles puis 72 C, 10 min). Le fragment de 196 pb a été purifié sur gel d'agarose 2% ( kit Qiaquick gel extraction , Qiagen), puis coupé dans un volume de 30 pl avec 5U de PstI et 5U de EagI en présence de BSA, 16 h à 37 C. Les enzymes sont détruites 15 min à 65 C et le fragment d'ADN coupé (168 pb) est extrait au phénol/chloroforme puis précipité à l'éthanol. Le fragment d'ADN est repris avec 10 ul d' H20 ultrapure, puis contrôlé sur gel d'agarose 2%.
Préparation du vecteur :

Deux }ig de phagemide pHenl sont coupés dans un volume de 30 }il avec 5U de PstI et 5U de EagI en présence de BSA, 16 h à
37 C. Le phagemide coupé est purifié sur gel d'agarose 0,7%
(kit Qiaquick gel extraction , Qiagen). Les enzymes sont détruites 15 min à 65 C et l'ADN est extrait au phénol/chloroforme, puis précipité à l'éthanol. Le pHenl coupé

est contrôlé sur gel d'agarose 0,7%, quantifié et repris dans 10 pl d' HZ0 ultrapure.

6 Ligature Un pl de pHen1 coupé par PstI et EagI est ligaturé avec 1 }zl de fragment coupé par PstI et EagI dans un volume de 10 pl avec 200U de T4 DNA ligase (Biolabs) à 16 C, 17 h. La ligase est inactivée à 65 C, 15 min, et le produit de ligature est coupé par 5U de XhoI à 37 C pendant 4 h pour éliminer le vecteur résiduel non ligaturé, puis extrait au phénol/chloroforme, précipité en présence de 1}.zg de glycogène et repris dans 10 ul d'H20 ultrapure. Un ul est utilisé pour transformer des cellules d'E. coli TG1 rendues compétentes par la technique au CaCl2.
:
Vérification des clones exprimant le domaine SH3 La présence du fragment inséré dans le plasmide pHen1 est vérifiée à partir des colonies isolées après transformation des cellules TG1 en réalisant des minipréparations d'ADN. Le plasmide recombinant pHenlSH3Hck est coupé par PstI et Eagl pour vérifier la taille du fragment inséré. Quelques clones possédant le fragment inséré sont séquencés sur séquenceur ABI
310 en utilisant l'oligonucléotide Fuse3p de séquence SEQ ID

N 24 (5' CCCTCATAGTTAGCGTAACG) hybridant dans la région codant pour la protéine p3. Un clone possédant la bonne séquence est sélectionné pour vérifier la production de la protéine fusion SH3-p3. Pour cela, une colonie isolée est inoculée dans 3 ml de 2YT / ampicilline 100 }ig/ml / 2% glucose' et incubée à 30 C

avec agitation. Lorsque la culture atteint une D0600nm de 0,5, les cellules sont induites avec 0,1uM final d'IPTG (isopropyl-a-D-thiogalactopyranoside) et la culture est poursuivie à 30 C
pendant 16 h. Un aliquot de la culture est prélevé et déposé
sur un gel SDS/PAGE 10%. La présence de la protéine fusion SH3-p3 est révélée par Western blot avec l'anticorps monoclonal 9E10 reconnaissant l'étiquette c-myc localisée entre le domaine SH3 et la protéine p3.

7

8 PCT/FR2006/002697 Ce phage contrôle, appelé phage-SH3, est utilisé comme témoin positif dans des ELISA où la protéine GST-Nefo1_57 ou Nefo1_57 biotinylée est adsorbée dans des puits de micoplaques.
2. Construction d'une banque de peptides décamériques Une banque décamérique d'une diversité de 108 clones a été
construite par insertion d'oligonucléotides dégénérés dans un vecteur phagique. A cette fin, le vecteur fd-tet-dogl (Hoogenboom et al., 1991) a été utilisé, ce vecteur présentant une résistance à la tétracycline et comportant tout le support génétique nécessaire à la synthèse de bactériophages. Des inserts dégénérés codant pour 10 acides aminés ont été
introduits en amont de la séquence codant pour la protéine mineure de la capside du phage, la protéine p3.
Le site de clonage est situé entre la séquence signal de la protéine p3 et la protéine p3 du phage. L'insert a été
choisi de manière à conserver les séquences nucléotidiques codant pour les acides aminés situés en aval de la séquence signal afin d'optimiser le clivage enzymatique par la peptidase endogène. La partie randomisée (NNK)10 a été choisie de manière à limiter la présence de codons STOP.

Préparation du vecteur de clonage :
La forme réplicative (RF) du phage fd-tet-dog a été
purifiée sur gradient de césium selon le protocole décrit dans Maniatis et al. (1982) . Cinq cents microgrammes de RF ont été
clivés avec 700U d'enzymes de restriction ApaI et NotI (NE
Biolabs, MA, USA) et purifiés par extraction au phénol puis précipitation à l'éthanol.
Préparation des fragments à insérer séquences des oligonucléotides SEQ ID N 25 et 26:
SEQ ID N 25 : 5' CGTCATACCTTCGATCAAGCACAGTGCACAG

SEQ ID N 26 .
5' CTTCAACAGTTTCTGCGGCCGCACCACC(MNN)laCTGTGCACTGTGCTTGAT

Deux cents picomoles de chacun des oligonucléotides de SEQ
ID N 25 et 26 sont hybridés dans un volume final de 100pl contenant 1 mM de dNTP et 20 U de Dynazyme (Finn-zymes, Helsinki, Finland), puis dénaturés à 95 C pendant 3 min. Une élongation est réalisée par 30 cycles successifs (48 C 1 min et 72 C 1 min). Le produit d'élongation est traité 2 fois au phénol/chloroforme précipité à l'éthanol et clivé avec les 10 U de chacune des enzymes ApaI et NotI pendant 16 h à 37 C. Les fragments d'ADN sont ensuite purifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 15%. A cette fin, la bande correspondant au poids moléculaire attendu est excisée et purifiée par diffusion dans du PBS pendant 16 h à 20 C sous agitation.

Ligature :
Cinq microgrammes de fragments sont ensuite ligaturés avec 300 microgrammes de vecteur en présence de 6 U de ligase (NE
BioLabs, MA, USA) dans un volume final de 200 ul pendant 16 h à 20 C. Le produit de ligature est extrait au phénol, précipité à l'éthanol et repris avec 300 ul de TE. Quarante p.l de cellules XL1-blue sont électroportées avec 2pl du produit de ligature en utilisant un micropulseur (Bio-Rad, CA, USA) à
1700 volts/cm, 200 ohms, 25 pF pendant 5 msec et des cuves de 0,1 cm. Les cellules sont ensuite incubées pendant 1 h à 37 C
dans 1 ml de 2YT contenant 20 p.g/ml de tetracycline, puis étalées sur des boîtes agar/2YT/tetracycline et incubées 16 h à 37 C.-Cent cinquante électroporations sont ainsi réalisées.

La diversité de la banque a été vérifiée par séquençage de l'ADN d'une centaine de clones en utilisant l'amorce oligonucléotidique Fuse-3p SEQ ID N 24 (CCCTCATAGTTAGCGTAACG) au moyen d'un séquenceur ABI Prism (Applied Biosystems, CA, USA) . La banque obtenue est d'environ 10$ clones différents.
3. Sélection de peptides liant Nefo1_57 par phage-display Les peptides liant Nefo1_57 ont été sélectionnés par la technique du phage display à partir de la banque de peptides décamérique construite comme indiqué ci-dessus.

Biotinylation de la protéine Nefal-s7.

9 Cinq cents pg de la protéine Nefo1_57 sont dialysés contre du PBS pendant 16 h à 4 C et biotinylés avec de la biotine selon les recommandations du fabricant (Biotin Protein Labeling Kit, Roche Diagnostic, Bale, Suisse). La concentration de la protéine biotinylée est mesurée par colorimétrie (Kit Biorad, CA, USA). L'efficacité de la biotinylation est vérifiée par ELISA en utilisant des microplaques adsorbées avec de la streptavidine (ThermoLabsystem, Helsinki, Finlande) et en révélant la protéine avec un anticorps monoclonal anti-NEF (MATG0020, Transgène) et un anticorps secondaire anti-anticorps de souris couplé à la phosphatase alcaline.

Production des phages peptide.

Un aliquot de la banque (cellules XL1-blue contenant les phages-peptide) est incubé 16 h à 37 C dans 500 ml de 2YT/
tetracycline 20 pg/ml avec agitation, puis centrifugé 2 fois à
6000 g pendant 10 min à 4 C. Le surnageant de culture contenant les phages-peptide est précipité avec 1,5 vol de 16,7% (poids/volume) de PEG 8000/NaCl 3,3 M pendant 16 h à
4 C, puis centrifugé à 12000 g, 20 min à 4 C et le culot est repris avec 50 ml de PBS (0,14 M NaCl ; 0,01 M tampon Phosphate, pH 7,4). Une deuxième précipitation est réalisée dans les mêmes conditions, mais pendant 1 h. Le culot est repris avec 1 ml de PBS. La solution est filtrée sur filtre 0,45 }im et conservée à 4 C. Elle contient environ 1013 phages-peptide.

Sélection des phages-peptide.

Trois ou 4 tours de sélection et d'amplification sont réalisés pour isoler les phages-peptide spécifique de Nefol-s7.
A chaque tour, 20 pg de Nefol_57 biotinylée sont incubées avec 1011 phages (10 ul) dans 500 p1 de PBS contenant 4%
(poids/volume) de poudre de lait écrémé (PBS/lait) pendant 1 h à 20 C avec agitation. Un mg de billes magnétiques recouvertes de streptavidine (Dynabeads M-280 Streptavidin ; Dynal Biotech, Oslo, Norvège) sont préalablement incubées 1 h à 20 C
avec du PBS/lait est ensuite ajouté pendant 30 min à 20 C avec agitation. Les billes sont lavées 5 fois avec du PBS/lait, 5 fois avec du PBS/0,1% Tween-20 et 5 fois avec du PBS et finalement resuspendues avec 100 ul dé PBS. Les phages-peptide sont amplifiés en infectant des cellules bactériennes TG1(,,~(lac-pro), supE, thi, hsdD5/F', traD36, proAB, laclq, lac Z~M15) dans 100 ml de 2YT/ tetracycline 20}:ig/ml pendant 16 h à
37 C. Une portion est étalée sur des boîtes agar/2YT/tetracycline pour obtenir des colonies isolées.

Après 3 ou 4 tours de sélection/amplification les colonies isolées sont mises en culture dans des puits de microplaques (Nunclon, Milian, Genève, Suisse) pendant 16 h à 37 C. Les plaques sont ensuite centrifugées (1000 g) et les surnageants contenant les phages-peptide sont analysés par ELISA pour déterminer leur spécificité. Les régions des ADN des phages positifs en ELISA correspondant à la région codant pour les peptides ont été séquencées. Cinq séquences différentes SEQ ID
N 3 à 7 ont été obtenues et ont permis de définir une séquence consensus SEQ ID N 2 (Figure 1).
4. Synthèse des peptides Les cinq peptides décamériques SEQ ID N 3 à 7 les plus affins pour Nef sélectionnés par la technique de phage-display précédemment décrite, ont été synthétisés. Puis, d'autres peptides de tailles variées SEQ ID N 8 et 21, analogues ou homologues au motif consensus découvert, ont également été
synthétisés en utilisant la méthode générale suivante.

Des peptides de type " H2N-aan-... aal- CONH2 " ont ainsi été
préparés de manière semi-automatique sur phase solide, grâce à
un robot de synthèse en chimie parallèle ACT 400 possédant des plaques 40 et 96 puits.

Le support solide utilisé est une résine Rink-Amide 100-200 mesh permettant une synthèse automatique par une stratégie conventionnelle de type fmoc.

De manière totalement automatique, le premier fmoc-aminoacide aa1 est dans un premier temps accroché sur le support solide (100 à 200 mg de résine par puit) Pour le couplage le robot distribue dans chaque puit les solutions suivantes : (i) une solution de HBTU 0.5 M dans du DMF, (ii) une solution de N-méthylmorpholine 1M dans du DMF, et (iii) une solution de l'aa1 à 0.5M dans du NMP. Le mélange réactionnel est agité pendant 90 minutes, puis une série de lavage (DMF, MeOH, DCM, DMF) est effectuée automatiquement avant de procédé à un double couplage avec le même aminoacide.
La chaîne latérale du premier aminoacide ainsi que celle de tous les aminoacides qui seront incorporés au cours de la synthèse sont protégées par différents groupements protecteurs conventionnels acidolabiles de manière permanente, et ce jusqu'au décrochage final du peptide.

Dans un deuxième temps, et de manière toujours automatique, le premier aminoacide greffé est déprotégé en position N-terminale de sa fonction fmoc par une solution de pipéridine 20% dans le dichlorométhane. Après différents lavages successifs, le premier aminoacide est ensuite couplé à
l'aminoacide suivant dont la partie aminée terminale est protégée par un groupement fmoc. Pour le couplage, le robot distribue dans chaque puit les solutions suivantes :(i) une solution de HBTU 0.5 M dans du DMF, (ii) une solution de N-méthylmorpholine 1M dans du DMF, et (iii) une solution de l'aa2 à 0.5M dans du NMP. Le mélange réactionnel est agité pendant 90 minutes, puis une nouvelle série de lavage est effectuée avant de procéder à un double couplage avec le même aminoacide. Les cycles de déprotection du groupement fmoc, de couplage de l'aminoacide suivant sont alors répétés de manière automatique jusqu'au couplage et à la déprotection du dernier aminoacide aan.

Dans une dernière étape, le clivage s'effectue de manière semi-automatique avec une solution de TFA/H20/TIS 95/2.5/2.5 sous agitation pendant 2 heures. Les peptides sont ensuite précipités à l'éther, centrifugés, et le surnageant est ensuite éliminé. L'opération est renouvelée 3 fois, puis l'éther est évaporé. Le peptide est alors dissous dans une solution de H20/Acétonitrile 50/50 avant d'être lyophilisé.
Cette synthèse automatisée a permis de concevoir des peptides amides. Si souhaité par l'utilisation d'une résine de type PS-2-Chlorotrityle les analogues acidés sont préparés. La pureté des peptides synthétisés est évaluée par un couplage LC-MS. Si besoin les -peptides sont purifiés par HPLC
préparative.
Afin d'évaluer la pénétration cellulaire des peptides et leur localisation sub-cellulaire, des peptides biotinylés qui pourront ensuite êtres détectés par une sonde appropriée (par exemple streptavidine-FITC) ont été synthétisés. Ces peptides sont tout d'abord synthétisés de manière semi-automatique sur phase solide par la stratégie fmoc précédemment décrite.

Cependant, avant clivage de la résine, la fonction aminée N-terminale est déprotégée et un couplage manuel conventionnel de type peptidique est réalisé avec la biotine (Sigma-Aldrich , ref. 86,164-2). Le clivage de la résine correspond à l'étape finale, permettant de décrocher le peptide marqué du support solide. La pureté du peptide biotinylé est analysée par HPLC, LC-MS. Une étape de purification par HPLC préparative peut être ensuite réalisée en fonction de la pureté observée.
5. Spécificité des peptides Des ELISA ont été développés selon lesquels = soit la protéine Nefo1-57 fusionnée à la GST est directement adsorbée dans les puits de microplaques, = soit la protéine Nefo1-57 clivée de la protéine GST par la thrombine est biotinylée, puis adsorbée dans des puits de microplaques recouverts de streptavidine (Figure 2). Un premier contrôle positif a consisté à incuber le puit avec un anticorps monoclonal anti-Nef (MATG0020) et à révéler l'interaction NefA1-57/anti-Nef avec un anticorps secondaire anti-anticorps de souris marqué à la peroxydase.
Un deuxième contrôle positif utilise le phage-SH3. Après addition dans des puits adsorbés avec Nef01-57, le phage-SH3 a été incubé avec un mAb anti-phage (protéine p8 du phage), puis l'interaction révélée avec un anticorps secondaire anti-anticorps de souris marqué à la phosphatase alcaline.

Pour les ELISA de compétition, les compétiteurs Nefol_57, GST-SH3 ou les peptides de synthèse sont ajoutés à différentes concentrations aux phages.

Les phages-peptide 07B2S3 (3) et 08B2S3 (*) issus de la banque décamérique et le phage contrôle SH3-Hck (0) liés sur Nefol-57 sont caractérisés de la même façon par un ELISA de compétition (Figure 3). Les puits adsorbés avec Nefoi-57 biotinylée (Fig: 3A) ou GST-Nefol-57 (Fig. 3B) sont incubés avec 1011 phages unitaires, puis avec différentes quantités de Nefol-57 ou le domaine SH3 de Hck fusionné à la protéine GST, utilisés comme compétiteur. De très faibles quantités de Nefol_ 57 sont suffisantes pour déplacer l'interaction Nefo1-57/phage-peptide et révèle des IC50 de l'ordre du micromolaire. Des résultats équivalents sont obtenus avec les autres phages-peptide.

L'affinité et la spécificité des phages-peptide ont aussi été déterminées par un ELISA de compétition en utilisant des peptides de synthèse (Figure 4). Le phage-peptide 08B2S3 (~) issus de la banque décamérique et le phage contrôle SH3-Hck (~) liés sur Nefol-57 sont déplacés dans un ELISA par compétition avec le peptide 2 de s nthèse. Des résultats équivalents sont obtenus avec les autres phages-peptide et les autres peptides.
Les autres peptides décrits dans la figure 1 présentent une courbe tout à fait équivalente à celle obtenue avec le peptide 2. Des IC50 de l'ordre du micromolaire ont en effet été
mesurées.

La spécificité des peptides peut aussi être déterminée directement à partir d'extraits cellulaires. Des lysats de cellules COS-7 exprimant Nef sont incubés avec la protéine de fusion GST-SH3H k en présence de quantités croissantes du peptide. Le mélange est ensuite déposé sur une colonne d'affinité spécifique de la GST. La colonne est ensuite lavée et l'extrait élué est analysé par SDS-PAGE et immunoblotting anti-Nef. On déduit ainsi une valeur d'IC50 pour les peptides inhibiteurs de l'interaction Nef-SH3 dans un contexte cellulaire de protéine Nef native.
6. Activité cellulaire des peptides : double-hybride en cellules de mammifère et FACS

Un test cellulaire reposant sur le principe du double-hybride adapté aux cellules de mammifère a été développé, permettant d'évaluer l'activité cellulaire des peptides capables de pénétrer la membrane plasmique. Ce test permet d'intégrer les paramètres de toxicité cellulaire et de bio-disponibilité grâce à une lecture quantitative et fonctionnelle de l'interaction entre deux partenaires protéiques.
Le système commercial CheckMateTM (Promega) a été adapté
au couple Nef VIH-1 (Lai) / SH3-Hck en culture de cellules COS-7 (Figure 5). Ce système combine l'expression de la luciférase firefly sous la dépendance de l'interaction entre-Nef et le domaine SH3 de Hck, et celle, indépendante, de la luciférase renilla, témoin de la viabilité cellulaire. Le ratio d'intensité de ces deux luciférases permet de quantifier l'activité d'un compétiteur de l'interaction Nef-SH3 capable de pénétrer à l'intérieur de la cellule et dont la demi-vie est suffisante dans l'intervalle de temps de l'analyse. D'autres interactions protéiques sont également reconstituées dans ce test : l'une, non-SH3 (entre Id et MyoD), afin d'exclure les composés présentant une activité
non-spécifique sur l'expression de la luciférase, et l'autre entre le SH3 de Hck et la protéine SAM68, afin d'identifier les composés qui interagissent via le domaine SH3 et non via Nef.

Les cellules sont transfectées en utilisant le Fugene6 (Roche), selon le protocole du distributeur. Brièvement, les plasmides PG5 (300 ng), pAct ou pActNef (400 ng), pBindHckmuté ou pBindHck (100 ng) et pbcks (200 ng) sont mélangés, puis le Fugene 6 (3 }il dilué dans 100 pl du milieu de culture DMEM) est ajouté. Le mélange plasmides/Fugene6 est laissé' en réaction pour une durée de 15 min à température ambiante, puis est déposé goutte à goutte dans le puit de culture cellulaire.

Après 24H d'expression, les cellules sont récoltées par un traitement à la trypsine (Gibco, réf 25300-054), lavées, puis réparties dans des plaques 96 puits (référence 353072, Beckton Dickinson) . 50 pl de milieu de culture DMEM sont ensuite rajoutés dans chaque puit.
L'activité d'un composé inhibiteur candidat est testée en ajoutant 25 pl de ce composé dilué dans le puit contenant déjà 50 pl de la culture cellulaire, et l'activité luciférase est déterminée 24H plus tard dans chaque puit en utilisant la trousse de dosage DualGlo selon les recommandations du fournisseur (Promega).

Dans ce test, le peptide de séquence ID N 11 (W P A W L
P) ne présente pas d'activité biologique notable à faible concentration par comparaison avec une molécule contrôle et ceci pour des concentrations variant de 10 à 50 pM du peptide (Figure 5B), et dans différentes conditions expérimentales alternant notamment le temps et la durée d'ajout du peptide.

Ce peptide synthétisé sous une forme biotinylée n'a pas permis de visualiser de pénétration cellulaire dans un test utilisant un marquage secondaire à l'aide d'une sonde couplée à un fluorochrome, suivi d'une analyse par microscopie confocale, suggérant que le peptide ne pénètre pas spontanément la membrane plasmique et/ou est rapidement dégradé ou exporté dans le milieu extra-cellulaire.
De nouveaux peptides ont été synthétisés en incorporant en position N-terminale de la séquence ID N 11 diverses séquences peptidiques ou séquences de dérivés d'acides aminés (SEQ ID N 14 à SEQ ID N 19) riches en résidus basiques et connues pour permettre la translocation de séquences de fusion à travers la membrane plasmique cellulaire (Figure 5B).

Plusieurs de ces séquences modifiées (SEQ ID N 15, SEQ
ID N 17 et SEQ ID N 19) répriment l'interaction Nef-SH3 telle que mesurée dans le test cellulaire, de façon dose-dépendante, montrant que ces dernières pénètrent effectivement à travers la membrane plasmique cellulaire (Figure 5B).

7. Cartographie de la zone d'interaction des peptides sur Nef Des spectres 15N-1H HSQC de la protéine 15N-Nef ont été
enregistrés sur un spectromètre RMN 500MHz (DRX 500 Bruker) à
308K. Les conditions de la préparation d'échantillon sont identiques à celles utilisées par Grzesiek et al. en 1997, pour l'attribution des spectres RMN hétéronucléaires . La concentration de Nef dans les échantillons est 0,1mM (Figure 6), tris 5mM pH 8.0, 5mM DTT.

L'attribution des corrélations correspondant au groupement de chacun des NH de la protéine est indiquée sur le spectre.
Les peptides 2, 4, 5 et 9c sont repris dans 20p1 d'éthanol deutéré à une concentration de 5mM. L'ajout de peptides est réalisé avec deux excès de peptides (10pl) par rapport à Nef (Figures 7A à 7D). Le peptide non marqué n'est pas observable dans le spectre, seuls les pics de corrélation 1H/15N des groupements amides de chacun des acides aminés de la protéine sont observables. Le spectre de référence est le spectre de Nef en présence de 10pl d'éthanol deutéré. L'ajout de peptide va entraîner une modification de la fréquence de résonance du proton et/ou 15N des groupements amides situés dans la zone d'interaction. L'attribution de ces résonances étant connue, on peut alors déduire les acides aminés impliqués dans la zone d'interaction. La nature de ces variations spectrales permet de vérifier si la zone d'interaction correspond bien à celle du domaine SH3 de Hck. L'analyse de ces données confirme que les peptides testés interagissent bien sur Nef dans la zone d'interaction de SH3, de plus les différences observées entre les spectres en présence des différents peptides indiquent des géométries de fixation légèrement différentes.
8. Etudes structurales par cristallographie.

La méthode de "trempage" est utilisée pour déterminer la structure des peptides en complexe avec Nef. Pour cela, des cristaux de Nefol-56 et Nefol-57 ont été produits comme précédemment décrit (Arold et al., 1997) . Après avoir atteint une taille suffisante pour une analyse crystallographique > 100 }.zM), ces cristaux sont trempés pendant 1-24h dans une solution contenant entre 1-5 mM de peptide. La présence de canaux de solvant ainsi que l'arrangement des molécules Nefol_56 et Nefo1-57 dans cette forme cristalline permettent en effet l'accès de petites molécules à la zone d'interaction Nef -peptide cartographiée par RMN (décrite ci-dessus). Les cri'staux ainsi préparés sont analysés par diffraction des rayons X.
9. Virologie L'étude de l'influence positive de Nef sur la réplication virale est effectuée par des techniques classiques permettant de mesurer les capacités infectieuses du VIH-1 (Craig et al., 1998; Madrid et al., 2005). Les analyses initiales sont réalisées à l'aide d'un provirus prototype de laboratoire, VIH-1 pNL4-3. Brièvement, l'effet des peptides inhibiteurs de Nef sera évalué sur les virions produits par transfection transitoire de cellules 293T par le provirus sauvage et utilisés pour infecter des cellules cibles HeLa-CD4 (clone P4) contenant une copie intégrée du gène LacZ sous la dépendance du LTR du HIV-1. 48 h après infection, le pouvoir infectieux des virus est évalué par comptage des cellules exprimant une activité P-galactosidase.

Références bibliographiques Arold S., Franken P, Strub M.P., Hoh F., Benichou, S.
Benarous, R., and Dumas, C. (1997). The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn Kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signalling. Structure 5, 1361-72.

Craig, H. M., Reddy, T. R., Riggs, N. L., Dao, P. P., and Guatelli, J. C. (2000). Interactions of HIV-1 nef with the mu subunits of adaptor protein complexes 1, 2, and 3: role of the dileucine-based sorting motif. Virology 271, 9-17.
Grzesiek, S. Bax, A., Hu, J, Kaufman, J., Palmer, I., Stah1, S., Tjandra, N. and Wingfield, P.T. (1997) Refined solution structure and backbone dynamics of HIV-1 Nef. Protein science, 6, 1248-1263.

Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res, 1991, 19 4133-4137.

Madrid, R., Janvier, K., Hitchin, D., Day, J., Coleman, S., Noviello, C., Bouchet, J., Benmerah, A., Guatelli, J. and Benichou, S. (2005) Nef-induced alteration of the early/recycling endosomal compartment correlates with enhancement of HIV-1 infectivity. J. Biol. Chem., 280: 5032-5044.

Maniastis T., Fritsch E. F., and Sambrook J. (1982 ), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

McLoughlin, P, Ehler, E., Carlile, G., Licht, J.D., and B. W.
Sch~fer. The LIM-only Protein DRAL/FHL2 Interacts with and Is a Corepressor for the Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Protein. J. Biol. Chem. 2002, 277 : 37045-53.

DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX

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Claims

1 - Peptides isolés, purifiés, possédant notamment des propriétés de liaison à la protéine Nef, caractérisés en ce qu'ils renferment une séquence en acides aminés répondant à SEQ ID N o 1 :

W-P-a-W-L-P
dans laquelle a est choisi parmi W, A, S ou D.

2 - Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils répondent à l'enchaînement en acides aminés SEQ
ID N o 2 :

b - W - P - a - W - L -P -c - d -f dans lequel b = R/T ou est absent a est tel que défini ci-dessus c = Q , T, L, G, H ou est absent d = L, W, A ou est absent f = P ou est absent.

3 - Peptides selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'il s'agit de peptides décamériques répondant aux séquences SEQ ID N o 3 à SEQ ID N o 7 suivantes SEQ ID N o 3 : N T W P W W L P T L
SEQ ID N o 4 : Y R W P A W L P L W
SEQ ID N o 5 : N W R W P W W I P G
SEQ ID N o 6 : T W P W W L P H A P
SEQ ID N o 7 : W P S W L P Q L P F

4 - Peptides selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils répondent aux séquences SEQ ID N o 8 à SEQ ID
N o 13 suivantes :
SEQ ID N o 8 : W P S W L P Q
SEQ ID N o 9 : W P S W L P

SEQ ID N o10 : W P W W L P
SEQ ID N o11 : W P A W L P
SEQ ID N o12 : W P D W L P

SEQ ID N o13 : W P S W L P Q L P

- Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à
4, caractérisés en ce qu'ils renferment une séquence d'acides aminés, comportant le cas échéant des dérivés d'acides aminés, facilitant leur pénétration dans les cellules, ladite séquence étant choisie parmi (R) n avec n= 6 à 8; R (A R R) n1, avec n1= 1 à 3 ;R (Ahx R)n2, avec n2= 1 à 6 ; SEQ ID N o 14 :K K R R Q R R R ; et SEQ ID N o 15 : R Q I K I W F Q N R Nle K W K K, Ahx"
représentant un motif acide amino-hexanoïque et Nle la nor-leucine.

6 - Peptides selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'il s'agit de dérivés de la séquence ID N o11, et qu'ils répondent aux séquences SEQ ID N o16 à SEQ ID N o21 suivantes :

SEQ ID N o16 : R R R R R R W P A W L P

SEQ ID N o17 : R R R R R R R R W P A W L P

SEQ ID N o18 : R A R R A R R A R R W P A W L P

SEQ ID N o19 : R Ahx R Ahx R Ahx R Ahx R Ahx R Ahx R W P
A W L P

SEQ ID N o20 : K K R R Q R R R W P A W L P

SEQ ID N o21 : R Q I K I W F Q N R Nle K W K K W P A W L
P

7- Utilisation des peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comme inhibiteurs de l'interaction entre Nef et certains de ses partenaires cellulaires, dont les protéines à domaine SH3.

8 - Utilisation des peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour développer des molécules chimiques à partir de leurs séquences en acides aminés et/ou de leurs données structurales.

9 - Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un peptide tel que défini ci-dessus associé à des excipients pharmacologiquement acceptables.