JP2000000097A - Ｎｅｆ結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ並びに該蛋白質に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
Ｎｅｆ結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ並びに該蛋白質に対するモノクローナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＨＩＶの発症等に深く関与するＮｅｆを認識・
結合するＣＤ４+ Ｔ細胞膜上の結合蛋白質（Ｎａｐ）及
びそれをコードする遺伝子並びに該蛋白質に対するモノ
クローナル抗体を提供する。 【解決手段】Ｎｅｆとの結合性の高い細胞種の粗膜画分
を抗原としてＮａｐに対する特異的なモノクローナル抗
体を作製し、この抗体を利用して同細胞のｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングして、Ｎａｐをコードするｃ
ＤＮＡを得た。このｃＤＮＡの塩基配列を決定すること
により、ヒトＮａｐの全アミノ酸配を解明し同定した。
結合するＣＤ４+ Ｔ細胞膜上の結合蛋白質（Ｎａｐ）及
びそれをコードする遺伝子並びに該蛋白質に対するモノ
クローナル抗体を提供する。 【解決手段】Ｎｅｆとの結合性の高い細胞種の粗膜画分
を抗原としてＮａｐに対する特異的なモノクローナル抗
体を作製し、この抗体を利用して同細胞のｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングして、Ｎａｐをコードするｃ
ＤＮＡを得た。このｃＤＮＡの塩基配列を決定すること
により、ヒトＮａｐの全アミノ酸配を解明し同定した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エイズの診断、治
療並びに新規なエイズ治療薬の開発に有用なＮｅｆ結合
蛋白質及びそれをコードする遺伝子並びに該蛋白に対す
るモノクローナル抗体に関する。
療並びに新規なエイズ治療薬の開発に有用なＮｅｆ結合
蛋白質及びそれをコードする遺伝子並びに該蛋白に対す
るモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】レトロウイルスは一般に構造蛋白質（Ｇ
ａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）を共通の骨格としているが、こ
れに加え調節蛋白質やアクセサリー蛋白質を種特異的な
蛋白質としてもつ複雑なウイルスがヒト免疫不全ウイル
ス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）である。Ｎｅｆはアクセサリー蛋
白質の一つで、ウイルス複製サイクル初期に合成され、
ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ（サル免疫不全ウイ
ルス）に特異的な蛋白質である。Ｎｅｆは発見当初はウ
イルス複製効率を低下させるネガティブ因子（ｎｅｇａ
ｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）であるとみなされＮｅｆと命
名されたが、その後Ｎｅｆ欠損人工変異ＳＩＶのアカゲ
ザルへの感染実験の研究結果などから、ＨＩＶ複製の正
の調節因子として働くことが示唆され、エイズ発症の鍵
を握る重要な因子として再認識されている〔細胞工学、
第１６巻、第１号、９４−９９頁（１９９７年）〕。
ａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）を共通の骨格としているが、こ
れに加え調節蛋白質やアクセサリー蛋白質を種特異的な
蛋白質としてもつ複雑なウイルスがヒト免疫不全ウイル
ス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）である。Ｎｅｆはアクセサリー蛋
白質の一つで、ウイルス複製サイクル初期に合成され、
ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ（サル免疫不全ウイ
ルス）に特異的な蛋白質である。Ｎｅｆは発見当初はウ
イルス複製効率を低下させるネガティブ因子（ｎｅｇａ
ｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）であるとみなされＮｅｆと命
名されたが、その後Ｎｅｆ欠損人工変異ＳＩＶのアカゲ
ザルへの感染実験の研究結果などから、ＨＩＶ複製の正
の調節因子として働くことが示唆され、エイズ発症の鍵
を握る重要な因子として再認識されている〔細胞工学、
第１６巻、第１号、９４−９９頁（１９９７年）〕。
【０００３】上記の藤井らの論文に詳細に述べられてい
るが、生体内におけるＮｅｆの主な機能は、ウイルス
複製の増強、ＣＤ４ダウンレギュレーション、および
Ｔ細胞傷害能である。ウイルス感染に関しては、Ｎｅ
ｆは細胞膜結合性を有しウイルスの細胞への吸着・進入
に必要であり、ウイルスＤＮＡ合成に関与することなど
の知見が得られている。またＴ細胞傷害性については、
末梢血および大腸リンパ節ＣＤ４+ Ｔ細胞の表面に結合
したＮｅｆを抗Ｎｅｆ抗体によりクロスリンクするとア
ポトーシスが起こることなどから、ＨＩＶ患者における
ＣＤ４+ Ｔ細胞の消失へのＮｅｆの関与、即ちエイズ発
症にはＮｅｆとＣＤ４+ Ｔ細胞上のＮｅｆ受容体との結
合が深く関与していることが強く示唆されている。さら
にＮｅｆがサイトカインの産生に影響を及ぼし免疫を抑
制していることを示唆する報告もある。
るが、生体内におけるＮｅｆの主な機能は、ウイルス
複製の増強、ＣＤ４ダウンレギュレーション、および
Ｔ細胞傷害能である。ウイルス感染に関しては、Ｎｅ
ｆは細胞膜結合性を有しウイルスの細胞への吸着・進入
に必要であり、ウイルスＤＮＡ合成に関与することなど
の知見が得られている。またＴ細胞傷害性については、
末梢血および大腸リンパ節ＣＤ４+ Ｔ細胞の表面に結合
したＮｅｆを抗Ｎｅｆ抗体によりクロスリンクするとア
ポトーシスが起こることなどから、ＨＩＶ患者における
ＣＤ４+ Ｔ細胞の消失へのＮｅｆの関与、即ちエイズ発
症にはＮｅｆとＣＤ４+ Ｔ細胞上のＮｅｆ受容体との結
合が深く関与していることが強く示唆されている。さら
にＮｅｆがサイトカインの産生に影響を及ぼし免疫を抑
制していることを示唆する報告もある。
【０００４】現在使用・開発中のエイズ治療薬は、アジ
ドチミジン、ｄｄＩ等の逆転写酵素阻害薬とプロテアー
ゼ阻害薬が主であり、これらはウイルスそのものの増殖
を阻止する薬剤である。その他には、エイズにより低下
した免疫機能を増加させる免疫増強剤やエイズに随伴す
る日和見感染症や悪性腫瘍に対する対症療法を目的とし
た化学療法剤がある。上述したＮｅｆに関する知見をも
とに、Ｎｅｆ誘導によるＴ細胞死を阻止しエイズ発症を
抑制する薬剤が、上記逆転写酵素阻害薬やプロテアーゼ
阻害薬とは異なった作用機序による別種の新規なエイズ
発症抑制薬として注目を集め始めている。
ドチミジン、ｄｄＩ等の逆転写酵素阻害薬とプロテアー
ゼ阻害薬が主であり、これらはウイルスそのものの増殖
を阻止する薬剤である。その他には、エイズにより低下
した免疫機能を増加させる免疫増強剤やエイズに随伴す
る日和見感染症や悪性腫瘍に対する対症療法を目的とし
た化学療法剤がある。上述したＮｅｆに関する知見をも
とに、Ｎｅｆ誘導によるＴ細胞死を阻止しエイズ発症を
抑制する薬剤が、上記逆転写酵素阻害薬やプロテアーゼ
阻害薬とは異なった作用機序による別種の新規なエイズ
発症抑制薬として注目を集め始めている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】抗エイズ戦略として、
各種の逆転写酵素阻害薬やプロテアーゼ阻害薬が開発さ
れており、ＨＩＶの変異に対応するためそれらを複数組
み合わせたカクテル療法も推進されているが、これらウ
イルスそのものの増殖阻止薬に加え新しい作用機序によ
る薬剤が切望されている。Ｎｅｆはウイルスの細胞侵入
に関与し、さらにＣＤ４+ Ｔ細胞のアポトーシスを誘導
してＨＩＶ患者におけるＣＤ４+ Ｔ細胞の消失に深く関
与していることが最近明らかにされつつあるが、これら
Ｎｅｆの作用は細胞膜上のＮｅｆ結合蛋白質（以下、Ｎ
ａｐと略記する）と結合することによって発現するもの
である。Ｎａｐの存在はＮｅｆとＣＤ４+ Ｔ細胞との結
合実験等によって示唆されていたが、具体的にはまだ特
定されるに至っていなかった。本発明者らは、Ｎｅｆと
の結合性の高い細胞種の粗膜画分を抗原として用いてＮ
ａｐに対する特異的なモノクローナル抗体を作製し、本
抗体を利用してＮａｐ遺伝子を単離し塩基配列の解析を
行い、最終的にＮａｐのアミノ酸配列を同定することに
成功した。
各種の逆転写酵素阻害薬やプロテアーゼ阻害薬が開発さ
れており、ＨＩＶの変異に対応するためそれらを複数組
み合わせたカクテル療法も推進されているが、これらウ
イルスそのものの増殖阻止薬に加え新しい作用機序によ
る薬剤が切望されている。Ｎｅｆはウイルスの細胞侵入
に関与し、さらにＣＤ４+ Ｔ細胞のアポトーシスを誘導
してＨＩＶ患者におけるＣＤ４+ Ｔ細胞の消失に深く関
与していることが最近明らかにされつつあるが、これら
Ｎｅｆの作用は細胞膜上のＮｅｆ結合蛋白質（以下、Ｎ
ａｐと略記する）と結合することによって発現するもの
である。Ｎａｐの存在はＮｅｆとＣＤ４+ Ｔ細胞との結
合実験等によって示唆されていたが、具体的にはまだ特
定されるに至っていなかった。本発明者らは、Ｎｅｆと
の結合性の高い細胞種の粗膜画分を抗原として用いてＮ
ａｐに対する特異的なモノクローナル抗体を作製し、本
抗体を利用してＮａｐ遺伝子を単離し塩基配列の解析を
行い、最終的にＮａｐのアミノ酸配列を同定することに
成功した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、ＨＩＶ
の発症等に深く関与するＮｅｆを認識・結合するＣＤ４
+ Ｔ細胞膜上の結合蛋白質（Ｎａｐ）及びそれをコード
する遺伝子並びに該蛋白質に対するモノクローナル抗体
を提供することにある。
の発症等に深く関与するＮｅｆを認識・結合するＣＤ４
+ Ｔ細胞膜上の結合蛋白質（Ｎａｐ）及びそれをコード
する遺伝子並びに該蛋白質に対するモノクローナル抗体
を提供することにある。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明者らは、Ｎｅｆとの結合性
の高い細胞種の粗膜画分を抗原としてＮａｐに対する特
異的なモノクローナル抗体を作製し、この抗体を利用し
て同細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
て、ＮａｐをコードするｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡ
の塩基配列を決定することにより、ヒトＮａｐの全アミ
ノ酸配列を解明し同定することにより本発明を完成し
た。
の高い細胞種の粗膜画分を抗原としてＮａｐに対する特
異的なモノクローナル抗体を作製し、この抗体を利用し
て同細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
て、ＮａｐをコードするｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡ
の塩基配列を決定することにより、ヒトＮａｐの全アミ
ノ酸配列を解明し同定することにより本発明を完成し
た。
【０００８】Ｎａｐに対するモノクローナル抗体の抗原
としては、Ｎｅｆとの結合性が高い細胞を免疫原とする
ことで、抗Ｎａｐ特異的モノクローナル抗体をスクリー
ニングできる可能性がより高くなる。即ち、Ｎｅｆとの
結合性が高いということは、Ｎａｐを細胞表面に数多く
発現していることを示唆し、そのような細胞は抗原とし
てのＮａｐを多量に含んでいるからであり、本発明抗Ｎ
ａｐモノクローナル抗体の調製用の抗原として好まし
い。例えば、Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞（ヒト
ＣＤ４+ Ｔ細胞）、Ｕ９３７細胞（ヒトマクロファージ
細胞）等はＮｅｆとの高い結合性が報告されており好ま
しい細胞種として挙げられるが、その他Ｎａｐ発現細胞
も利用可能である。
としては、Ｎｅｆとの結合性が高い細胞を免疫原とする
ことで、抗Ｎａｐ特異的モノクローナル抗体をスクリー
ニングできる可能性がより高くなる。即ち、Ｎｅｆとの
結合性が高いということは、Ｎａｐを細胞表面に数多く
発現していることを示唆し、そのような細胞は抗原とし
てのＮａｐを多量に含んでいるからであり、本発明抗Ｎ
ａｐモノクローナル抗体の調製用の抗原として好まし
い。例えば、Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞（ヒト
ＣＤ４+ Ｔ細胞）、Ｕ９３７細胞（ヒトマクロファージ
細胞）等はＮｅｆとの高い結合性が報告されており好ま
しい細胞種として挙げられるが、その他Ｎａｐ発現細胞
も利用可能である。
【０００９】上記細胞の膜画分を免疫原として用いる
が、Ｎａｐの含有量の高い膜成分を分画して抗原として
用いるのが好ましいため、Ｎｅｆを固相化したアフィニ
ティ・カラムを利用することができる。本発明において
は、Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の膜成分をリコ
ンビナントＮｅｆ不溶化担体を用いて粗分画を行い、抗
Ｎａｐモノクローナル抗体調製用の抗原として用いた。
が、Ｎａｐの含有量の高い膜成分を分画して抗原として
用いるのが好ましいため、Ｎｅｆを固相化したアフィニ
ティ・カラムを利用することができる。本発明において
は、Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の膜成分をリコ
ンビナントＮｅｆ不溶化担体を用いて粗分画を行い、抗
Ｎａｐモノクローナル抗体調製用の抗原として用いた。
【００１０】モノクローナル抗体の作製は常法に従って
行うことができ、例えば上記粗膜画分を抗原として感作
を行い、抗体産生を誘導した動物の脾臓細胞を採取し、
ハイブリドーマを形成させ、これを用いてクローン化を
行う。目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマを選択するために、本発明においては抗原とし
て用いたＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の粗膜画分
を用いたＥＬＩＳＡ法によって第一段階の選択を行い絞
り込み、次いでＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞を用
いたフロー・サイトメトリーを行って、該細胞表面との
高い結合性を有するクーロンを選別した。このような選
別により３種のクローンが得られ、最終的には種々の細
胞を用いたフロー・サイトメトリーを行い、各細胞種と
の結合性を調べて本発明抗Ｎａｐモノクローナル抗体を
産生するクローンを決定した。さらに得られた各モノク
ローナル抗体を用いたイムノ・ブロット法等を行い、抗
Ｎａｐモノクローナル抗体であることの確証を得た。
行うことができ、例えば上記粗膜画分を抗原として感作
を行い、抗体産生を誘導した動物の脾臓細胞を採取し、
ハイブリドーマを形成させ、これを用いてクローン化を
行う。目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマを選択するために、本発明においては抗原とし
て用いたＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の粗膜画分
を用いたＥＬＩＳＡ法によって第一段階の選択を行い絞
り込み、次いでＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞を用
いたフロー・サイトメトリーを行って、該細胞表面との
高い結合性を有するクーロンを選別した。このような選
別により３種のクローンが得られ、最終的には種々の細
胞を用いたフロー・サイトメトリーを行い、各細胞種と
の結合性を調べて本発明抗Ｎａｐモノクローナル抗体を
産生するクローンを決定した。さらに得られた各モノク
ローナル抗体を用いたイムノ・ブロット法等を行い、抗
Ｎａｐモノクローナル抗体であることの確証を得た。
【００１１】本発明Ｎａｐ（Ｎｅｆ結合蛋白質）遺伝子
の精製・同定は、基本的には前述の如く得られた抗Ｎａ
ｐモノクローナル抗体を用いたパンニング法等によって
実施できる。即ち、本発明においては上記抗Ｎａｐ抗体
の調製用免疫原として用いたＭｏｌｔ−４クローンｎ
ｏ．８細胞のｍＲＮＡを分離し、これに対するｃＤＮＡ
ライブラリーを調製しプラスミドに組み込んだ後、Ｃｏ
ｓ７細胞等の培養細胞にトランスフェクトさせてクロー
ニングを行った。細胞からのｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡ
の作製、プラスミドへの組み込み、培養細胞へのトラン
スフェクション等の手法は、遺伝子工学分野の常法とし
てよく知られており、適宜条件を設定して実施すればよ
い。上記パンニング法を数回繰り返して選別されたプラ
スミドをＣｏｓ７細胞にトランスフェクトし、その細胞
表面上におけるＮａｐ発現を上記抗Ｎａｐモノクローナ
ル抗体を用いたフロー・サイトメトリーで確認すること
ができる。
の精製・同定は、基本的には前述の如く得られた抗Ｎａ
ｐモノクローナル抗体を用いたパンニング法等によって
実施できる。即ち、本発明においては上記抗Ｎａｐ抗体
の調製用免疫原として用いたＭｏｌｔ−４クローンｎ
ｏ．８細胞のｍＲＮＡを分離し、これに対するｃＤＮＡ
ライブラリーを調製しプラスミドに組み込んだ後、Ｃｏ
ｓ７細胞等の培養細胞にトランスフェクトさせてクロー
ニングを行った。細胞からのｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡ
の作製、プラスミドへの組み込み、培養細胞へのトラン
スフェクション等の手法は、遺伝子工学分野の常法とし
てよく知られており、適宜条件を設定して実施すればよ
い。上記パンニング法を数回繰り返して選別されたプラ
スミドをＣｏｓ７細胞にトランスフェクトし、その細胞
表面上におけるＮａｐ発現を上記抗Ｎａｐモノクローナ
ル抗体を用いたフロー・サイトメトリーで確認すること
ができる。
【００１２】ＮｅｆはＨＩＶウイルスの細胞侵入に関与
し、ＣＤ４+ Ｔ細胞のアポトーシスを誘導してＨＩＶ患
者におけるＣＤ４+ Ｔ細胞の消失に深く関与していると
考えられており、これらＮｅｆの作用は細胞膜上のＮａ
ｐと結合することによって発現するものである。従っ
て、ＮａｐとＮｅｆとの結合を阻害することによってエ
イズ発症を抑制することが示唆されている。本発明抗Ｎ
ａｐモノクローナル抗体はＮｅｆとＮａｐとの結合を阻
害するため、新しいエイズ治療剤としての有用性も高
い。抗Ｎａｐモノクローナル抗体として以下の実施例で
はマウス抗体について具体的に記載した。しかしマウス
の抗体は、医薬としてそのままヒトに投与すると、生体
内半減期が短いだけでなく、ヒトの生体内ではマウス抗
体が異種抗原として認識され、これを排除する免疫機構
が惹起される恐れがある。この場合、ヒトの生体内に抗
マウス抗体が作られてしまい、その後に投与されるマウ
ス抗体が排除されるのみならず、アナフィラキシー・シ
ョック等の危険な免疫反応を誘導しかねない。
し、ＣＤ４+ Ｔ細胞のアポトーシスを誘導してＨＩＶ患
者におけるＣＤ４+ Ｔ細胞の消失に深く関与していると
考えられており、これらＮｅｆの作用は細胞膜上のＮａ
ｐと結合することによって発現するものである。従っ
て、ＮａｐとＮｅｆとの結合を阻害することによってエ
イズ発症を抑制することが示唆されている。本発明抗Ｎ
ａｐモノクローナル抗体はＮｅｆとＮａｐとの結合を阻
害するため、新しいエイズ治療剤としての有用性も高
い。抗Ｎａｐモノクローナル抗体として以下の実施例で
はマウス抗体について具体的に記載した。しかしマウス
の抗体は、医薬としてそのままヒトに投与すると、生体
内半減期が短いだけでなく、ヒトの生体内ではマウス抗
体が異種抗原として認識され、これを排除する免疫機構
が惹起される恐れがある。この場合、ヒトの生体内に抗
マウス抗体が作られてしまい、その後に投与されるマウ
ス抗体が排除されるのみならず、アナフィラキシー・シ
ョック等の危険な免疫反応を誘導しかねない。
【００１３】従って、ヒト用の医薬に本発明抗Ｎａｐモ
ノクローナル抗体を使用する場合は、マウス抗体の有用
性を損なわず、且つヒトには上記のような免疫反応を惹
起しないキメラ抗体やヒト型化抗体に変換して実施する
ことができる。例えば、抗原を認識する部位（可変領
域）をマウスのアミノ酸配列とし、その他の定常領域を
ヒトのアミノ酸配列とするキメラ抗体の作製方法につい
てはこれまでにも数多く報告されており、これら公知の
方法に従って本発明抗モノクローナル抗体からヒトに投
与可能なキメラ抗体の製造を行うことができる（欧州特
許第１２０６９４号公報、欧州特許第１２５０２３号公
報、国際出願公開ＷＯ８６／１１５３３号公報など）。
ノクローナル抗体を使用する場合は、マウス抗体の有用
性を損なわず、且つヒトには上記のような免疫反応を惹
起しないキメラ抗体やヒト型化抗体に変換して実施する
ことができる。例えば、抗原を認識する部位（可変領
域）をマウスのアミノ酸配列とし、その他の定常領域を
ヒトのアミノ酸配列とするキメラ抗体の作製方法につい
てはこれまでにも数多く報告されており、これら公知の
方法に従って本発明抗モノクローナル抗体からヒトに投
与可能なキメラ抗体の製造を行うことができる（欧州特
許第１２０６９４号公報、欧州特許第１２５０２３号公
報、国際出願公開ＷＯ８６／１１５３３号公報など）。
【００１４】また上記キメラ抗体を改良したヒト型化抗
体の作製方法についても公知技術となっている（欧州特
許公開第２３９４００号公報など）。ヒト型化抗体は、
抗原と直接的に結合する領域（超可変領域、相補性決定
領域、ＣＤＲ等という）のみがマウス抗体由来のアミノ
酸配列からなり、残りの抗体としての構造を保つために
必要な領域はヒト由来のアミノ酸配列より成るものであ
る。従って、含有される非ヒトアミノ酸配列の割合がさ
らに低くなっており、その結果、ヒトの生体内において
ヒト抗体と同様の半減期を示すと共に、抗マウス抗体の
産生がほとんど起きない。本発明抗Ｎａｐモノクローナ
ル抗体はこのようなキメラ抗体やヒト型化抗体も包含す
るものである。
体の作製方法についても公知技術となっている（欧州特
許公開第２３９４００号公報など）。ヒト型化抗体は、
抗原と直接的に結合する領域（超可変領域、相補性決定
領域、ＣＤＲ等という）のみがマウス抗体由来のアミノ
酸配列からなり、残りの抗体としての構造を保つために
必要な領域はヒト由来のアミノ酸配列より成るものであ
る。従って、含有される非ヒトアミノ酸配列の割合がさ
らに低くなっており、その結果、ヒトの生体内において
ヒト抗体と同様の半減期を示すと共に、抗マウス抗体の
産生がほとんど起きない。本発明抗Ｎａｐモノクローナ
ル抗体はこのようなキメラ抗体やヒト型化抗体も包含す
るものである。
【００１５】上記キメラ抗体やヒト型化抗体を含む本発
明Ｎａｐモノクローナル抗体はその特異性に基づいて特
定でき、例えば、Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞
（ヒトＣＤ４+ Ｔ細胞）及びＵ９３７細胞（ヒトマクロ
ファージ細胞）と強い結合性を示し、Ｒａｊｉ細胞（ヒ
トＢ細胞）、ＢＴ−２細胞（ヒトグリア細胞）及びＧｉ
ｎ−１細胞（ヒト繊維芽細胞）とは結合しないという抗
原反応性による特異性で明確にすることもできる。
明Ｎａｐモノクローナル抗体はその特異性に基づいて特
定でき、例えば、Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞
（ヒトＣＤ４+ Ｔ細胞）及びＵ９３７細胞（ヒトマクロ
ファージ細胞）と強い結合性を示し、Ｒａｊｉ細胞（ヒ
トＢ細胞）、ＢＴ−２細胞（ヒトグリア細胞）及びＧｉ
ｎ−１細胞（ヒト繊維芽細胞）とは結合しないという抗
原反応性による特異性で明確にすることもできる。
【００１６】本発明におけるＮａｐは具体的には配列番
号１に記載のアミノ酸配列を有するものであるが、並び
に配列番号１で表されるアミノ酸配列の１つ又はそれ以
上のアミノ酸残基が削除、追加若くは置換されたアミノ
酸配列を有する蛋白質も包含する。本発明において「ア
ミノ酸配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が削除、
追加若くは置換された」蛋白質とは、本発明ヒトＮａｐ
の機能を損なわずに変異したポリペプチド（蛋白質）を
意味し、自然界に発現される変異ポリペプチド又は人為
的に改変した変異ポリペプチドを含む。即ち、Ｎａｐの
特異的な機能としてはＮｅｆとの結合性が挙げられ、変
異ペプチドを用いてＮｅｆとの結合試験を行うことによ
り確認することができる。
号１に記載のアミノ酸配列を有するものであるが、並び
に配列番号１で表されるアミノ酸配列の１つ又はそれ以
上のアミノ酸残基が削除、追加若くは置換されたアミノ
酸配列を有する蛋白質も包含する。本発明において「ア
ミノ酸配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が削除、
追加若くは置換された」蛋白質とは、本発明ヒトＮａｐ
の機能を損なわずに変異したポリペプチド（蛋白質）を
意味し、自然界に発現される変異ポリペプチド又は人為
的に改変した変異ポリペプチドを含む。即ち、Ｎａｐの
特異的な機能としてはＮｅｆとの結合性が挙げられ、変
異ペプチドを用いてＮｅｆとの結合試験を行うことによ
り確認することができる。
【００１７】以下の実施例において本発明をさらに詳細
に説明する。実施例は本発明の一態様を具体的に説明し
たものであり、されによって本発明は限定されるもので
はない。
に説明する。実施例は本発明の一態様を具体的に説明し
たものであり、されによって本発明は限定されるもので
はない。
【００１８】
【実施例】（１）抗Ｎａｐモノクローナル抗体の作製 （１−１）抗原（粗膜画分）の調製 Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞 (１×１０9)を、１
ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と５０ｍＭ
のフッ化フェニルメチルスルホン酸（ＰＭＳＦ）を含む
１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）中で超音波処理し
て溶解した。８００×ｇで１０分間遠心した後、上清を
更に６０，０００×ｇで３０分間遠心した。沈殿物を
０．０５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０（ＮＰ−４０）、１
５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１ｍＭＰＭＳＦ、１００
ｍＭトリス塩酸からなる溶解用緩衝液に加え、氷冷下で
３０分間インキュベートした。これを遠心して上清を得
た後、大竹らの方法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５３
巻、５８２６−５８３７頁（１９９４）〕に従ってＡｆ
ｆｉ−Ｇｅｌ１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にカップリン
グさせたＮ末端欠損Ｎｅｆバキュロリコンビナント精製
蛋白質と氷冷下で２時間インキュベートした。５０ｍＭ
の塩化ナトリウムと０．５％のＮＰ−４０を含む０．１
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６）でゲルを３回洗浄した後、
ゲルをカラムに充填し、５０ｍＭ塩化ナトリウムと３Ｍ
シアン化チオカリウムを含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ
６．０）により溶出を行った。溶出された蛋白質を含む
画分を透析して濃縮した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
析した。これらの画分をマウスへの免疫感作時に粗膜画
分として利用した。
ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と５０ｍＭ
のフッ化フェニルメチルスルホン酸（ＰＭＳＦ）を含む
１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）中で超音波処理し
て溶解した。８００×ｇで１０分間遠心した後、上清を
更に６０，０００×ｇで３０分間遠心した。沈殿物を
０．０５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０（ＮＰ−４０）、１
５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１ｍＭＰＭＳＦ、１００
ｍＭトリス塩酸からなる溶解用緩衝液に加え、氷冷下で
３０分間インキュベートした。これを遠心して上清を得
た後、大竹らの方法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５３
巻、５８２６−５８３７頁（１９９４）〕に従ってＡｆ
ｆｉ−Ｇｅｌ１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にカップリン
グさせたＮ末端欠損Ｎｅｆバキュロリコンビナント精製
蛋白質と氷冷下で２時間インキュベートした。５０ｍＭ
の塩化ナトリウムと０．５％のＮＰ−４０を含む０．１
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６）でゲルを３回洗浄した後、
ゲルをカラムに充填し、５０ｍＭ塩化ナトリウムと３Ｍ
シアン化チオカリウムを含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ
６．０）により溶出を行った。溶出された蛋白質を含む
画分を透析して濃縮した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
析した。これらの画分をマウスへの免疫感作時に粗膜画
分として利用した。
【００１９】（１−２）モノクローナル抗体の作製 抗Ｎａｐモノクローナル抗体（ＭＡｂ）をＢＡＬＢ／ｃ
マウスに上記粗膜画分（Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８
細胞の膜画分）を免疫感作させて調製した。細胞の粗膜
画分（蛋白量５０μｇ相当）を等量のフロイント完全ア
ジュバントと混合し、マウスに皮下注射した。一ヵ月
後、同じサンプルをアジュバントなしで、更に一週間お
きに４回皮下注射した。最後の投与から１７日後、脾臓
を摘出しハイブリッド細胞形成に用いた。ハイブリッド
細胞形成の手法は藤井らにより詳細に報告されている
〔Ｖａｃｃｉｎｅ、１１巻、１２４０−１２４６頁（１
９９３）〕。ＭＡｂの産生は抗マウスイムノグロブリン
を用いたＥＬＩＳＡ法により初期スクリーニングを行っ
た。ハイブリドーマが腹水中に産生したＭＡｂをセファ
デックスＧ−２００クロマトグラフィーによる精製後、
フローサイトメトリー等の全ての実験に用いた。
マウスに上記粗膜画分（Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８
細胞の膜画分）を免疫感作させて調製した。細胞の粗膜
画分（蛋白量５０μｇ相当）を等量のフロイント完全ア
ジュバントと混合し、マウスに皮下注射した。一ヵ月
後、同じサンプルをアジュバントなしで、更に一週間お
きに４回皮下注射した。最後の投与から１７日後、脾臓
を摘出しハイブリッド細胞形成に用いた。ハイブリッド
細胞形成の手法は藤井らにより詳細に報告されている
〔Ｖａｃｃｉｎｅ、１１巻、１２４０−１２４６頁（１
９９３）〕。ＭＡｂの産生は抗マウスイムノグロブリン
を用いたＥＬＩＳＡ法により初期スクリーニングを行っ
た。ハイブリドーマが腹水中に産生したＭＡｂをセファ
デックスＧ−２００クロマトグラフィーによる精製後、
フローサイトメトリー等の全ての実験に用いた。
【００２０】（１−３）モノクローナル抗体の選択 Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の粗膜画分を抗原と
して用い、マウスのハイブリドーマのクローン化を行っ
た。最初に２０１４クローンより出発し、ＥＬＩＳＡ法
によって１５６クローンを選択した。次いでＭｏｌｔ−
４クローンｎｏ．８細胞を用いたフローサイトメトリー
等の実験を行い、Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の
細胞表面に強く結合する３種のクローン（ＭＡｂ３０
５、ＭＡｂ６２２及びＭＡｂ１１１０）を選別した。さ
らに種々のヒト由来細胞の細胞表面との結合性を調べた
結果を表１に示す。表中の値は、フローサイトメトリー
を用いたヒストグラムの結果より算出した陽性細胞の割
合（％）である。非感作マウスのＩｇＭ抗体を陰性対照
とし、その値をゼロ点に合わせた。全ての結果は３試料
による試験の平均値として示した。
して用い、マウスのハイブリドーマのクローン化を行っ
た。最初に２０１４クローンより出発し、ＥＬＩＳＡ法
によって１５６クローンを選択した。次いでＭｏｌｔ−
４クローンｎｏ．８細胞を用いたフローサイトメトリー
等の実験を行い、Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の
細胞表面に強く結合する３種のクローン（ＭＡｂ３０
５、ＭＡｂ６２２及びＭＡｂ１１１０）を選別した。さ
らに種々のヒト由来細胞の細胞表面との結合性を調べた
結果を表１に示す。表中の値は、フローサイトメトリー
を用いたヒストグラムの結果より算出した陽性細胞の割
合（％）である。非感作マウスのＩｇＭ抗体を陰性対照
とし、その値をゼロ点に合わせた。全ての結果は３試料
による試験の平均値として示した。
【００２１】
【表１】
【００２２】表１に示したとおり、最終的に選別した３
種のモノクローナル抗体のうち、ＭＡｂ３０５はＭｏｌ
ｔ−４クローンｎｏ．８細胞だけでなくＵ９３７細胞
（ＨＩＶ感染性の高い代表的なヒトマクロファージ細
胞）と強い結合性を示し、ヒトのＢ細胞（Ｒａｊｉ）、
グリア細胞（ＢＴ−２）及び繊維芽細胞（Ｇｉｎ−１）
とは結合しないことより、ＣＤ４+ Ｔ細胞を標的とし、
Ｂ細胞を含む他組織細胞とは反応しないＮｅｆ蛋白結合
特異性に合致することが明らかになった。また上記大竹
らの１９９４年論文に従ってビオチン標識Ｎｅｆ蛋白と
Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞及びＵ９３７細胞と
の結合実験を行い、ＭＡｂ３０５を共存させてその影響
を調べた結果、ＭＡｂ３０５は両細胞とＮｅｆ蛋白との
結合を用量依存的に阻害することを確認した。このこと
から、ＭＡｂ３０５はＮａｐ特異的なモノクローナル抗
体であることが明らかになった。
種のモノクローナル抗体のうち、ＭＡｂ３０５はＭｏｌ
ｔ−４クローンｎｏ．８細胞だけでなくＵ９３７細胞
（ＨＩＶ感染性の高い代表的なヒトマクロファージ細
胞）と強い結合性を示し、ヒトのＢ細胞（Ｒａｊｉ）、
グリア細胞（ＢＴ−２）及び繊維芽細胞（Ｇｉｎ−１）
とは結合しないことより、ＣＤ４+ Ｔ細胞を標的とし、
Ｂ細胞を含む他組織細胞とは反応しないＮｅｆ蛋白結合
特異性に合致することが明らかになった。また上記大竹
らの１９９４年論文に従ってビオチン標識Ｎｅｆ蛋白と
Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞及びＵ９３７細胞と
の結合実験を行い、ＭＡｂ３０５を共存させてその影響
を調べた結果、ＭＡｂ３０５は両細胞とＮｅｆ蛋白との
結合を用量依存的に阻害することを確認した。このこと
から、ＭＡｂ３０５はＮａｐ特異的なモノクローナル抗
体であることが明らかになった。
【００２３】（１−４）モノクローナル抗体を用いたＮ
ａｐ候補蛋白質の検討 （Ａ）Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞から調製した
膜画分と、Ｎ末端欠損Ｎｅｆ蛋白質（ＮＬ４３、アミノ
酸３４〜２０６番目）を結合させたＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１
０と反応させ、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ銀染色
法によりバンドを検出した。またＭｏｌｔ−４クローン
ｎｏ．８細胞、Ｕ９３７細胞及びＨｅＬａ細胞の溶解物
をＭＡｂ３０５、６２２、１１１０を用いたイムノ・ブ
ロット法で分析した。対照としては非感作マウスのＩｇ
Ｍ抗体を用いた。図１に示したとおり、Ｎｅｆ抗原結合
ビーズに結合したＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の
膜画分では、約１８、３５、４０、５０、６０、６４ｋ
Ｄａの分子量のバンドが検出されたが、対照のビーズで
はバンドは何も観察されなかった。ＭＡｂ３０５を用い
たイムノ・ブロット法では、Ｍｏｌｔ−４クローンｎ
ｏ．８細胞及びＵ９３７細胞の溶解物の約３５ｋＤａの
バンドがＭＡｂ３０５と強く反応し、９６ｋＤａのバン
ドと弱く反応したが、ＨｅＬａ細胞溶解物では反応する
バンドが検出されなかった。ＭＡｂ６２２とＭＡｂ１１
１０の両者は、Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞及び
ＨｅＬａ細胞の溶解物の約５２ｋＤａ及び１４ｋＤａの
バンドと反応し、Ｕ９３７細胞とは弱く反応したのみで
あった。対照のマウスＩｇＭ抗体は３種の細胞と全く反
応しなかった。
ａｐ候補蛋白質の検討 （Ａ）Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞から調製した
膜画分と、Ｎ末端欠損Ｎｅｆ蛋白質（ＮＬ４３、アミノ
酸３４〜２０６番目）を結合させたＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１
０と反応させ、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ銀染色
法によりバンドを検出した。またＭｏｌｔ−４クローン
ｎｏ．８細胞、Ｕ９３７細胞及びＨｅＬａ細胞の溶解物
をＭＡｂ３０５、６２２、１１１０を用いたイムノ・ブ
ロット法で分析した。対照としては非感作マウスのＩｇ
Ｍ抗体を用いた。図１に示したとおり、Ｎｅｆ抗原結合
ビーズに結合したＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の
膜画分では、約１８、３５、４０、５０、６０、６４ｋ
Ｄａの分子量のバンドが検出されたが、対照のビーズで
はバンドは何も観察されなかった。ＭＡｂ３０５を用い
たイムノ・ブロット法では、Ｍｏｌｔ−４クローンｎ
ｏ．８細胞及びＵ９３７細胞の溶解物の約３５ｋＤａの
バンドがＭＡｂ３０５と強く反応し、９６ｋＤａのバン
ドと弱く反応したが、ＨｅＬａ細胞溶解物では反応する
バンドが検出されなかった。ＭＡｂ６２２とＭＡｂ１１
１０の両者は、Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞及び
ＨｅＬａ細胞の溶解物の約５２ｋＤａ及び１４ｋＤａの
バンドと反応し、Ｕ９３７細胞とは弱く反応したのみで
あった。対照のマウスＩｇＭ抗体は３種の細胞と全く反
応しなかった。
【００２４】（Ｂ）ＨＩＶ−１のＮＬ４３株を感染させ
たＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の膜画分と、抗Ｎ
ｅｆモノクローナル抗体Ｅ９を結合させたＡｆｆｉ−Ｇ
ｅｌ１０とをインキュベートし、溶出液をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ銀染色法により分析した。次いで抗Ｎｅｆモ
ノクローナル抗体Ｅ９（陽性対照）及びＭＡｂ３０５を
用いてイムノ・ブロット法を行った。陰性対照としては
非感作マウスＩｇＭを用いた。
たＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の膜画分と、抗Ｎ
ｅｆモノクローナル抗体Ｅ９を結合させたＡｆｆｉ−Ｇ
ｅｌ１０とをインキュベートし、溶出液をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ銀染色法により分析した。次いで抗Ｎｅｆモ
ノクローナル抗体Ｅ９（陽性対照）及びＭＡｂ３０５を
用いてイムノ・ブロット法を行った。陰性対照としては
非感作マウスＩｇＭを用いた。
【００２５】実験結果を図１に示した。銀染色によって
多種のバンドが検出されたが、ＭＡｂ３０５を用いたイ
ムノ・ブロット法では３５ｋＤａのバンドが非常に濃く
染色された。これに対して対照のマウスＩｇＭではこの
バンドは検出されず、また陽性対照のＥ９抗体（抗Ｎｅ
ｆモノクローナル抗体）では２５ｋＤａ及び２７ｋＤａ
のＮｅｆ蛋白のバンドが検出されたのみであった。従っ
て、これらの実験結果よりＭＡｂ３０５は３５ｋＤａの
細胞蛋白と強い反応性を有することが示唆された。
多種のバンドが検出されたが、ＭＡｂ３０５を用いたイ
ムノ・ブロット法では３５ｋＤａのバンドが非常に濃く
染色された。これに対して対照のマウスＩｇＭではこの
バンドは検出されず、また陽性対照のＥ９抗体（抗Ｎｅ
ｆモノクローナル抗体）では２５ｋＤａ及び２７ｋＤａ
のＮｅｆ蛋白のバンドが検出されたのみであった。従っ
て、これらの実験結果よりＭＡｂ３０５は３５ｋＤａの
細胞蛋白と強い反応性を有することが示唆された。
【００２６】（２）Ｎａｐ（Ｎｅｆ結合蛋白質）及びそ
の遺伝子の単離・同定 上記のＮａｐ特異的抗体（ＭＡｂ３０５）の調製と同様
に、原料としてＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞を用
い、該細胞のｃＤＮＡライブラリーを調製してＮａｐ遺
伝子の選択・同定を行った。
の遺伝子の単離・同定 上記のＮａｐ特異的抗体（ＭＡｂ３０５）の調製と同様
に、原料としてＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞を用
い、該細胞のｃＤＮＡライブラリーを調製してＮａｐ遺
伝子の選択・同定を行った。
【００２７】（２−１）ｃＤＮＡライブラリーの調製 全ＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡ分離キット（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社製）によりＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．
８細胞から調製した。ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）セファロース・カラムクロマトグラフィーにより調
製した。ランダム・ヘキサマー・オリゴヌクレオチド
（ｐｄＮ６）とオリゴ（ｄＴ）によってプライムされた
ｃＤＮＡの合成はＣ−クローンIIｃＤＮＡ合成キット
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で実施した。Ｓ１ヌクレアー
ゼ処理とクレノウ・ポリメラーゼ反応の後、ＢｓｔＸＩ
非パリンドローム・アダプターを結合させ、セファデッ
クスＧ−５０によりサイズの分画を行い、次いでｃＤＮ
ＡをＢｓｔＸＩで開裂させたｐＣＤＭ８ベクター（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に結合させた。各々がオリゴ
（ｄＴ）によってプライムされた約５×１０5 のｃＤＮ
Ａライブラリーと、ランダム・ヘキサマーによってプラ
イムされた５×１０5 のｃＤＮＡライブラリーを、ＭＣ
１０６１／Ｐ３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のトラ
ンスフェクションによって得て、Ｃｏｓ７へのトランス
フェクションに供した。
ｔａｇｅｎｅ社製）によりＭｏｌｔ−４クローンｎｏ．
８細胞から調製した。ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）セファロース・カラムクロマトグラフィーにより調
製した。ランダム・ヘキサマー・オリゴヌクレオチド
（ｐｄＮ６）とオリゴ（ｄＴ）によってプライムされた
ｃＤＮＡの合成はＣ−クローンIIｃＤＮＡ合成キット
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で実施した。Ｓ１ヌクレアー
ゼ処理とクレノウ・ポリメラーゼ反応の後、ＢｓｔＸＩ
非パリンドローム・アダプターを結合させ、セファデッ
クスＧ−５０によりサイズの分画を行い、次いでｃＤＮ
ＡをＢｓｔＸＩで開裂させたｐＣＤＭ８ベクター（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に結合させた。各々がオリゴ
（ｄＴ）によってプライムされた約５×１０5 のｃＤＮ
Ａライブラリーと、ランダム・ヘキサマーによってプラ
イムされた５×１０5 のｃＤＮＡライブラリーを、ＭＣ
１０６１／Ｐ３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のトラ
ンスフェクションによって得て、Ｃｏｓ７へのトランス
フェクションに供した。
【００２８】（２−２）パンニング法によるｃＤＮＡの
単離と遺伝子配列の決定 基本的にはパンニング法を用いて、Ｎａｐをコードする
ｃＤＮＡを単離した。即ち、上記のようにして得られた
ｃＤＮＡを挿入した精製ｐＣＤＭ８プラスミドを、リポ
フェクチン（Ｇｉｂｃｏ社製）により常法に従ってＣｏ
ｓ７細胞（１×１０6)にトランスフェクトした。１０％
ＮｕｓｅｒｕｍＩＶ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（６ｃｍディッシ
ュ）で３７℃、７２時間培養し、細胞をＰＢＳ／ＥＤＴ
Ａでディッシュより剥離した。１０μｇ／ｍＬの抗Ｎａ
ｐモノクローナル抗体（ＭＡｂ３０５）を含む５ｍＬの
冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡに細胞を懸濁し、氷上に１時間放置
後、細胞を遠心して集めて１％のＦＢＳを含む５ｍＬの
冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡに再度懸濁させ、１０μｇ／ｍＬの
抗マウスＩｇＭヒツジ血清（Ｃａｐｐｅｌ社製）を固相
化した４枚の６ｃｍのパンニング・プレートにまいた。
室温で３時間処理して細胞をプレートに結合させ、１％
のＦＢＳを含むＰＢＳ／ＥＤＴＡで緩やかに３回洗うこ
とにより、接着していない細胞を除き、Ｈｉｒｔ法に従
って接着した細胞よりクロモソーム外のＤＮＡを調製し
た。
単離と遺伝子配列の決定 基本的にはパンニング法を用いて、Ｎａｐをコードする
ｃＤＮＡを単離した。即ち、上記のようにして得られた
ｃＤＮＡを挿入した精製ｐＣＤＭ８プラスミドを、リポ
フェクチン（Ｇｉｂｃｏ社製）により常法に従ってＣｏ
ｓ７細胞（１×１０6)にトランスフェクトした。１０％
ＮｕｓｅｒｕｍＩＶ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（６ｃｍディッシ
ュ）で３７℃、７２時間培養し、細胞をＰＢＳ／ＥＤＴ
Ａでディッシュより剥離した。１０μｇ／ｍＬの抗Ｎａ
ｐモノクローナル抗体（ＭＡｂ３０５）を含む５ｍＬの
冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡに細胞を懸濁し、氷上に１時間放置
後、細胞を遠心して集めて１％のＦＢＳを含む５ｍＬの
冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡに再度懸濁させ、１０μｇ／ｍＬの
抗マウスＩｇＭヒツジ血清（Ｃａｐｐｅｌ社製）を固相
化した４枚の６ｃｍのパンニング・プレートにまいた。
室温で３時間処理して細胞をプレートに結合させ、１％
のＦＢＳを含むＰＢＳ／ＥＤＴＡで緩やかに３回洗うこ
とにより、接着していない細胞を除き、Ｈｉｒｔ法に従
って接着した細胞よりクロモソーム外のＤＮＡを調製し
た。
【００２９】具体的には、プレートからＰＢＳ／ＥＤＴ
Ａを除き、０．６％のＳＤＳを含む１０ｍＭのＥＤＴＡ
を加えて室温に２０分間放置した後、接着細胞の溶解物
を集め、これにＮａＣｌを１Ｍになるように加えた。４
℃で一晩放置し、遠心して得られた上清をフェノール−
クロロフォルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿で集
めた。このＤＮＡでＭＣ１０６１／Ｐ３細胞をトランス
フェクトした結果、約１×１０5 個のクローンが得られ
た。一回目のパンニングで得られたコロニーから全プラ
スミドＤＮＡを抽出・精製し、次のトランスフェクショ
ンとパンニングに供した。この方法を３回繰り返し、最
終のパンニングにより得られた４つの独立したクローン
よりプラスミドＤＮＡを得た。これらｐＣＤＭ８プラス
ミドに組込まれた各クローンをＸｈｏＩで切り出し、Ｐ
ｂｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社製）のＸｈｏＩ部位にＴ４リガーゼで再クローニング
した（ｐＢＦＯクローン）。これらクローンの遺伝子配
列の決定はＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ−Ｔ３、Ｔ７と−２１Ｍ
１３の色素プライマーサイクルシーケンスキット（Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、３７３ＤＮＡシ
ーケンスシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍ社製）で実施した。
Ａを除き、０．６％のＳＤＳを含む１０ｍＭのＥＤＴＡ
を加えて室温に２０分間放置した後、接着細胞の溶解物
を集め、これにＮａＣｌを１Ｍになるように加えた。４
℃で一晩放置し、遠心して得られた上清をフェノール−
クロロフォルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿で集
めた。このＤＮＡでＭＣ１０６１／Ｐ３細胞をトランス
フェクトした結果、約１×１０5 個のクローンが得られ
た。一回目のパンニングで得られたコロニーから全プラ
スミドＤＮＡを抽出・精製し、次のトランスフェクショ
ンとパンニングに供した。この方法を３回繰り返し、最
終のパンニングにより得られた４つの独立したクローン
よりプラスミドＤＮＡを得た。これらｐＣＤＭ８プラス
ミドに組込まれた各クローンをＸｈｏＩで切り出し、Ｐ
ｂｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社製）のＸｈｏＩ部位にＴ４リガーゼで再クローニング
した（ｐＢＦＯクローン）。これらクローンの遺伝子配
列の決定はＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ−Ｔ３、Ｔ７と−２１Ｍ
１３の色素プライマーサイクルシーケンスキット（Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、３７３ＤＮＡシ
ーケンスシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍ社製）で実施した。
【００３０】最終の上記パンニング法後に、選択したプ
ラスミドをＣｏｓ７細胞にトランスフェクトし、Ｃｏｓ
７細胞表面上のＮａｐ発現を抗Ｎａｐモノクローナル抗
体３０５（ＭＡｂ３０５）を用いたフロー・サイトメト
リーで確認した。選別されたクローンをトランスフェク
トしたＣｏｓ７細胞はＭＡｂ３０５と反応するが、無処
理のＣｏｓ７細胞とは全く反応しなかった。この選別に
より、４種のポジティブ・クローン（ＦＯ２５、３２、
５７、７５）が得られた。これらの塩基配列を調べた結
果、ＦＯ７５は後掲の配列番号２で表される塩基配列を
含み、これが完全長のオープン・リーディング・フレー
ムを持つこと、ノーザン・ブロット法でのバンドが一本
（０．９ｋｂｐ）検出されることなどから、ＦＯ７５が
Ｎａｐ遺伝子を含むクローンと同定した。実際に検出さ
れた遺伝子は、配列番号２の末尾にＴＡＡの停止コドン
を有するものであった。
ラスミドをＣｏｓ７細胞にトランスフェクトし、Ｃｏｓ
７細胞表面上のＮａｐ発現を抗Ｎａｐモノクローナル抗
体３０５（ＭＡｂ３０５）を用いたフロー・サイトメト
リーで確認した。選別されたクローンをトランスフェク
トしたＣｏｓ７細胞はＭＡｂ３０５と反応するが、無処
理のＣｏｓ７細胞とは全く反応しなかった。この選別に
より、４種のポジティブ・クローン（ＦＯ２５、３２、
５７、７５）が得られた。これらの塩基配列を調べた結
果、ＦＯ７５は後掲の配列番号２で表される塩基配列を
含み、これが完全長のオープン・リーディング・フレー
ムを持つこと、ノーザン・ブロット法でのバンドが一本
（０．９ｋｂｐ）検出されることなどから、ＦＯ７５が
Ｎａｐ遺伝子を含むクローンと同定した。実際に検出さ
れた遺伝子は、配列番号２の末尾にＴＡＡの停止コドン
を有するものであった。
【００３１】後掲の配列番号１で表されるアミノ酸配列
（２８６アミノ酸）よりなる蛋白質がＮａｐであると推
定され、ペプチド成分のみでの分子量は約３２．６ｋＤ
ａと計算された。上述したように、Ｍｏｌｔ−４クロー
ンｎｏ．８細胞等の膜画分中でＭＡｂ３０５（抗Ｎａｐ
モノクローナル抗体）が特異的に反応する細胞蛋白質は
３５ｋＤａの蛋白であることを明らかにし、Ｎａｐの候
補蛋白であることを示唆した。上記配列番号２がコード
するアミノ酸配列（上記配列番号１）の大きさが約３
２．６ｋＤａであり、Ｎａｐ候補蛋白の３５ｋＤａとい
う分子量は、３２．６ｋＤａのペプチドに糖鎖等が修飾
したときの分子量としてよく一致する大きさであった。
（２８６アミノ酸）よりなる蛋白質がＮａｐであると推
定され、ペプチド成分のみでの分子量は約３２．６ｋＤ
ａと計算された。上述したように、Ｍｏｌｔ−４クロー
ンｎｏ．８細胞等の膜画分中でＭＡｂ３０５（抗Ｎａｐ
モノクローナル抗体）が特異的に反応する細胞蛋白質は
３５ｋＤａの蛋白であることを明らかにし、Ｎａｐの候
補蛋白であることを示唆した。上記配列番号２がコード
するアミノ酸配列（上記配列番号１）の大きさが約３
２．６ｋＤａであり、Ｎａｐ候補蛋白の３５ｋＤａとい
う分子量は、３２．６ｋＤａのペプチドに糖鎖等が修飾
したときの分子量としてよく一致する大きさであった。
【００３２】（２−３）Ｎａｐ遺伝子の発現 ｐＭＡＭｎｅｏプラスミドに組み込んだ上記Ｎａｐ遺伝
子をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしＧ４１８（Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｉｎ）で選別した。遺伝子発現はフロー・サ
イトメトリーで測定した。Ｇ４１８抵抗性Ｎａｐ３２０
１Ｈｅｌａの細胞表面は、デキサメサゾン処理後にＭＡ
ｂ３０５と陽性反応した。Ｎｅｆ結合実験をＮａｐ３２
０１細胞を用いて行った。ＮＬ４３Ｎｅｆ蛋白は同様に
Ｎａｐ３２０１細胞表面に結合した。細胞ロゼットも同
様にＮａｐ３２０１細胞と、抗Ｎｅｆモノクローナル抗
体Ｅ９と陽性に反応したＬＡＶ−１感染Ｍｏｌｔ−４と
の間で形成された。Ｎａｐ３２０１と非感染Ｍｏｌｔ−
４細胞の混合物においては、細胞の密集は観察されず、
そしてこのロゼット形成はＭＡｂ３０５処理によって阻
害された。
子をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしＧ４１８（Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｉｎ）で選別した。遺伝子発現はフロー・サ
イトメトリーで測定した。Ｇ４１８抵抗性Ｎａｐ３２０
１Ｈｅｌａの細胞表面は、デキサメサゾン処理後にＭＡ
ｂ３０５と陽性反応した。Ｎｅｆ結合実験をＮａｐ３２
０１細胞を用いて行った。ＮＬ４３Ｎｅｆ蛋白は同様に
Ｎａｐ３２０１細胞表面に結合した。細胞ロゼットも同
様にＮａｐ３２０１細胞と、抗Ｎｅｆモノクローナル抗
体Ｅ９と陽性に反応したＬＡＶ−１感染Ｍｏｌｔ−４と
の間で形成された。Ｎａｐ３２０１と非感染Ｍｏｌｔ−
４細胞の混合物においては、細胞の密集は観察されず、
そしてこのロゼット形成はＭＡｂ３０５処理によって阻
害された。
【００３３】
【発明の効果】上述したように、Ｎｅｆはウイルスの細
胞侵入に関与し、ＣＤ４+ Ｔ細胞のアポトーシスを誘導
してＨＩＶ患者におけるＣＤ４+ Ｔ細胞の消失に深く関
与していると考えられており、これらＮｅｆの作用は細
胞膜上のＮｅｆ結合蛋白質（Ｎａｐ）と結合することに
よって発現するものである。従って、ＮａｐはＮｅｆを
認識するＣＤ４+ Ｔ細胞膜上の特異的蛋白質として、エ
イズの感染、発症において大きな役割を担っていると考
えられる。
胞侵入に関与し、ＣＤ４+ Ｔ細胞のアポトーシスを誘導
してＨＩＶ患者におけるＣＤ４+ Ｔ細胞の消失に深く関
与していると考えられており、これらＮｅｆの作用は細
胞膜上のＮｅｆ結合蛋白質（Ｎａｐ）と結合することに
よって発現するものである。従って、ＮａｐはＮｅｆを
認識するＣＤ４+ Ｔ細胞膜上の特異的蛋白質として、エ
イズの感染、発症において大きな役割を担っていると考
えられる。
【００３４】本発明では、エイズの感染・発症等に重要
な因子であるＮａｐを特定し、その遺伝子配列や塩基配
列を明らかにすると共に、Ｎａｐに対する特異的モノク
ローナル抗体を提供する。抗Ｎａｐモノクローナル抗体
はＮｅｆとＮａｐとの結合を阻害するため、新しいエイ
ズ治療剤としての可能性も有し、またＮａｐ発現量とエ
イズ発症の関連性を明らかにすることによって、エイズ
の診断にも応用可能である。ＮａｐはＮｅｆとの結合実
験に利用することにより、両因子の結合を阻害する作用
機序に基づく新規なエイズ治療剤の開発に有用であり、
現在使用・開発中のエイズ治療薬である逆転写酵素阻害
薬やプロテアーゼ阻害薬とは異なった作用機序による新
しいエイズ発症抑制薬の開発が期待できる。
な因子であるＮａｐを特定し、その遺伝子配列や塩基配
列を明らかにすると共に、Ｎａｐに対する特異的モノク
ローナル抗体を提供する。抗Ｎａｐモノクローナル抗体
はＮｅｆとＮａｐとの結合を阻害するため、新しいエイ
ズ治療剤としての可能性も有し、またＮａｐ発現量とエ
イズ発症の関連性を明らかにすることによって、エイズ
の診断にも応用可能である。ＮａｐはＮｅｆとの結合実
験に利用することにより、両因子の結合を阻害する作用
機序に基づく新規なエイズ治療剤の開発に有用であり、
現在使用・開発中のエイズ治療薬である逆転写酵素阻害
薬やプロテアーゼ阻害薬とは異なった作用機序による新
しいエイズ発症抑制薬の開発が期待できる。
【００３５】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２８６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：ヒト 組織の種類：リンパ芽球 配列 Met Glu Lys Tyr Leu Met Tyr Ser Ala Leu Thr Arg Ala Val Thr Leu 1 5 10 15 Ser Asp Glu Trp Thr Glu His Lys Ala Phe Ser Gln Lys Ser Phe Phe 20 25 30 Gln Phe Leu Thr Glu Asp Ile Pro Phe Phe Thr Ile Ala Leu Tyr Trp 35 40 45 Leu Pro Asn Ile Thr Leu Gln Ile Pro Gln Ser Ile Leu Ser Glu Ser 50 55 60 Phe Arg Glu Thr Ala Leu Cys Ser Leu Asn Ser Ser His Gly Ile Val 65 70 75 80 Ala Phe Pro Ser Arg Ser Arg Ser Leu Arg Leu Phe Leu Trp Asn Ser 85 90 95 Gln Ile Asp Ile Trp Lys Pro Ile Glu Val Tyr Gly Ala Lys Gly Asn 100 105 110 Ile Leu Arg Glu Lys Leu Lys Arg Ile Phe Leu Gly Asn Cys Phe Val 115 120 125 Phe Cys Gly Phe Ile Ser Gln Ser Tyr Ser Phe Leu Leu Lys Lys Pro 130 135 140 Phe Ala Lys Ala Val Ser Cys Gly Ile Cys Lys Val Val Phe Gly Ser 145 150 155 160 Pro Ser Arg Ala Arg Val Lys Lys Glu Ile Ser Ser Val Lys Thr Trp 165 170 175 Lys Glu Ala Ser Glu Asn Leu Leu Cys Val Leu Leu Ile His Leu Thr 180 185 190 Glu Leu Gln Leu Ser Pro Gln Glu Ala Val Tyr Tyr Gly Cys Ser Cys 195 200 215 Gly Ile Cys Lys Val Ile Phe Gly Ser Pro Glu Arg Ala Met Val Lys 220 225 230 Lys Glu Thr Ser Tyr Asp Lys Asn Trp Lys Glu Ala Phe Cys Glu Thr 235 240 245 250 Ala Leu Cys Ser Val Asn Ser Ser His Arg Ile Thr Ala Phe Pro Ser 255 260 265 Arg Ser Leu Cys Leu Arg Leu Leu Leu Trp Asn Phe Gln Ser Asp Ile 260 265 270 Leu Lys Pro Leu Glu Ser Tyr Gly Glu Lys Gly Asn Ile Leu 275 280 285
【００３６】 配列番号：２ 配列の長さ：８５８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト 組織の種類：リンパ芽球 直接の起源 ライブラリー名：ヒト白血病リンパ芽球のｃＤＮＡライブラリー 配列 ATGGAAAAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGCTGTAACTCTGTCAGATGAATGG 60 ACAGAACACAAAGCATTTTCTCAGAAATCTTTTTTCCAGTTTTTAACTGAAGATATTCCC 120 TTTTTCACCATAGCCCTCTATTGGCTTCCAAATATCACCTTACAAATTCCACAAAGCATT 180 CTTAGCGAAAGCTTCCGAGAAACGGCATTGTGTTCTCTTAATTCATCTCACGGAATTGTA 240 GCTTTCCCCTCAAGAAGCCGATCACTAAGACTGTTCTTGTGGAATTCGCAAATTGATATT 300 TGGAAGCCCATAGAGGTCTATGGTGCAAAAGGAAATATCCTAAGAGAAAAACTGAAAAGA 360 ATCTTTCTGGGAAACTGCTTTGTGTTCTGTGGATTCATTTCACAGAGTTACAGCTTTCTC 420 CTCAAGAAGCCTTTTGCAAAGGCTGTTTCTTGTGGCATTTGCAAAGTGGTATTTGGAAGC 480 CCATCAAGGGCTAGGGTGAAAAAGGAAATATCTTCCGTTAAAACCTGGAAAGAAGCTTCT 540 GAGAACCTGCTTTGTGTTCTGTTAATTCATCTCACAGAGTTACAGCTTTCCCCTCAAGAA 600 GCCGTTTATTACGGCTGTTCTTGTGGAATTTGCAAGGTGATATTTGGAAGCCCAGAGAGG 660 GCTATGGTGAAAAAGGAAACATCCTATGATAAAAACTGGAAAGAAGCTTTCTGCGAAACT 720 GCTTTGTGTTCTGTTAATTCATCTCACAGAATTACAGCTTTCCCTTCAAGAAGCCTCTGC 780 CTAAGACTGTTGTTGTGGAATTTTCAAAGTGATATTTTAAAGCCCTTAGAGAGCTATGGT 840 GAAAAAGGAAATATCCTA 858
【図１】Ａは、Ｎｅｆ抗原不溶化ビーズに結合したＭｏ
ｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の膜画分をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ銀染色した結果、並びにＭｏｌｔ−４クロー
ンｎｏ．８細胞、Ｕ９３７細胞及びＨｅＬａ細胞の溶解
物をＭＡｂ３０５、６２２、１１１０を用いたイムノ・
ブロット法で分析した結果を示す。Ｂは、抗Ｎｅｆモノ
クローナル抗体Ｅ９不溶化ビーズに結合したＨＩＶ−１
感染Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の膜画分をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにかけ銀染色した結果、並びに抗Ｎｅｆモ
ノクローナル抗体Ｅ９（陽性対照）及びＭＡｂ３０５を
用いてイムノ・ブロット法を行った結果を示す。
ｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の膜画分をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ銀染色した結果、並びにＭｏｌｔ−４クロー
ンｎｏ．８細胞、Ｕ９３７細胞及びＨｅＬａ細胞の溶解
物をＭＡｂ３０５、６２２、１１１０を用いたイムノ・
ブロット法で分析した結果を示す。Ｂは、抗Ｎｅｆモノ
クローナル抗体Ｅ９不溶化ビーズに結合したＨＩＶ−１
感染Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞の膜画分をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにかけ銀染色した結果、並びに抗Ｎｅｆモ
ノクローナル抗体Ｅ９（陽性対照）及びＭＡｂ３０５を
用いてイムノ・ブロット法を行った結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/569 Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA14 AA15 BA44 BA63 CA04 DA02 EA04 GA05 HA15 4B064 AG20 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA91X AB05 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C085 AA08 AA16 BA69 CC02 CC03 CC05 DD33 DD62 EE01 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 EA29 EA53
Claims (13)
- 【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列を有す
る蛋白質並びに前記配列番号１で表されるアミノ酸配列
の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が削除、追加若くは
置換されたアミノ酸配列を有する蛋白質。 - 【請求項２】配列番号１で表されるアミノ酸配列を有す
る蛋白質並びに前記配列番号１で表されるアミノ酸配列
の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が削除、追加若くは
置換されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤ
ＮＡ分子。 - 【請求項３】配列番号２で表される塩基配列を有する請
求項２記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項４】請求項１記載の蛋白質に対するモノクロー
ナル抗体。 - 【請求項５】Ｍｏｌｔ−４クローンｎｏ．８細胞（ヒト
ＣＤ４+ Ｔ細胞）及びＵ９３７細胞（ヒトマクロファー
ジ細胞）と強い結合性を示し、Ｒａｊｉ細胞（ヒトＢ細
胞）、ＢＴ−２細胞（ヒトグリア細胞）及びＧｉｎ−１
細胞（ヒト繊維芽細胞）とは結合しない抗Ｎｅｆ結合蛋
白質モノクローナル抗体。 - 【請求項６】マウスモノクローナル抗体である請求項４
又は請求項５記載の抗体。 - 【請求項７】請求項６記載のマウスモノクローナル抗体
の可変領域及びヒト型抗体の定常領域を有するキメラ抗
体。 - 【請求項８】請求項６記載のマウスモノクローナル抗体
の相補性決定領域を有するヒト型化抗体。 - 【請求項９】請求項７又は８記載の抗体を有効成分とし
て含有する医薬。 - 【請求項１０】エイズ治療剤である請求項９記載の医
薬。 - 【請求項１１】請求項１記載の蛋白質を指標とするエイ
ズ診断方法。 - 【請求項１２】請求項２記載のＤＮＡ分子を指標とする
エイズ診断方法。 - 【請求項１３】請求項１記載の蛋白質へのＮｅｆ結合性
に対する薬剤の作用を測定することを利用するエイズ治
療剤のスクリーニング方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10185708A JP2000000097A (ja) | 1998-06-15 | 1998-06-15 | Ｎｅｆ結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ並びに該蛋白質に対するモノクローナル抗体 |
| US09/333,521 US6277971B1 (en) | 1998-06-15 | 1999-06-15 | Nef-attachable protein, DNA encoding the protein and a monoclonal antibody against said protein |
| EP99111054A EP0965594A3 (en) | 1998-06-15 | 1999-06-15 | Nef-attachable protein, DNA encoding the protein and a monoclonal antibody against said protein |
| US09/899,863 US6803449B2 (en) | 1998-06-15 | 2001-07-05 | Nef-attachable protein |
| US10/911,073 US20050002955A1 (en) | 1998-06-15 | 2004-08-04 | Nef-attachable protein, DNA encoding the protein and a monoclonal antibody against said protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10185708A JP2000000097A (ja) | 1998-06-15 | 1998-06-15 | Ｎｅｆ結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ並びに該蛋白質に対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000000097A true JP2000000097A (ja) | 2000-01-07 |
Family
ID=16175480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10185708A Pending JP2000000097A (ja) | 1998-06-15 | 1998-06-15 | Ｎｅｆ結合蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ並びに該蛋白質に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6277971B1 (ja) |
| EP (1) | EP0965594A3 (ja) |
| JP (1) | JP2000000097A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008007648A1 (fr) * | 2006-07-10 | 2008-01-17 | Institute For Antibodies Co., Ltd. | Procédé de classification d'antigène, procédé d'identification d'antigène, procédé d'obtention d' un ensemble d'antigènes ou d'anticorps, procédés de construction d'un panel d'anticorps, anticorps et ens |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2894584A1 (fr) * | 2005-12-09 | 2007-06-15 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux peptides et leurs applications biologiques |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| JPH04360838A (ja) | 1991-06-05 | 1992-12-14 | Sanyo Kokusaku Pulp Co Ltd | 抗ウイルス剤 |
| FR2720068A1 (fr) | 1994-05-20 | 1995-11-24 | Inst Nat Sante Rech Med | Protéines d'interaction avec la protéine Nef du virus HIV1, séquences d'acides nucléiques codant pour ces protéines et leur utilisation pour le criblage d'agents anti-viraux anti-HIV. |
| AU716098B2 (en) | 1996-09-27 | 2000-02-17 | Biomolecular Research Institute Limited | Cytotoxic peptides |
-
1998
- 1998-06-15 JP JP10185708A patent/JP2000000097A/ja active Pending
-
1999
- 1999-06-15 US US09/333,521 patent/US6277971B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-15 EP EP99111054A patent/EP0965594A3/en not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-07-05 US US09/899,863 patent/US6803449B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-08-04 US US10/911,073 patent/US20050002955A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008007648A1 (fr) * | 2006-07-10 | 2008-01-17 | Institute For Antibodies Co., Ltd. | Procédé de classification d'antigène, procédé d'identification d'antigène, procédé d'obtention d' un ensemble d'antigènes ou d'anticorps, procédés de construction d'un panel d'anticorps, anticorps et ens |
| JP5382692B2 (ja) * | 2006-07-10 | 2014-01-08 | 学校法人藤田学園 | 抗体の分類法、抗原の同定法、抗体又は抗体セットの取得法、抗体パネルの作成法、並びに抗体又は抗体セット及びその用途 |
| US9388249B2 (en) | 2006-07-10 | 2016-07-12 | Amano Enzyme Inc. | Method of classifying antibody, method of identifying antigen, method of obtaining antibody or antibody set, method of constructing antibody panel and antibody or antibody set and use of the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| US6803449B2 (en) | 2004-10-12 |
| EP0965594A2 (en) | 1999-12-22 |
| US6277971B1 (en) | 2001-08-21 |
| US20020058797A1 (en) | 2002-05-16 |
| US20050002955A1 (en) | 2005-01-06 |
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