JP2003505696A

JP2003505696A - 癌患者におけるｎｙ−ｅｓｏ−１に対する抗体の決定

Info

Publication number: JP2003505696A
Application number: JP2001512294A
Authority: JP
Inventors: エルケイヤガー; エリザベスストッカート; ロイドジェイオールド; アレキザンダークヌス; ヤオ−ツェングチェン
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2003-02-12
Also published as: EP1196779A1; WO2001007917A1; US6251603B1; AU6098600A

Abstract

(57)【要約】本発明は、患者試料中のNY-ESO-1に特異的な抗体を決定することによって腫瘍状態を決定する方法に関する。患者試料中のNY-ESO-1に対する抗体を決定し、得られた値を以前の値と比較することにより、癌状態が進行しているか、退行しているか、または安定状態にあるかを決定することができる。問題の腫瘍がNY-ESO-1を発現させる場合、この値の変化は、その癌状態の状態の変化を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本願は、米国特許出願第08/725,182号（出願日1996年10月3 日、現在は米国特
許第5,804,381 号）の一部継続出願である米国特許出願第08/937,263号（出願日
1997年9 月15日）の一部継続出願である米国特許出願第09/062,422号（出願日19
98年4 月17日）の一部継続出願である米国特許出願第09/165,546号（出願日1998
年10月2 日）の一部継続出願である。これらの特許出願および特許は全て参照に
よって本明細書に組み込まれるものとする。

【０００２】（発明の分野）本発明は、患者から採取した検体中のNY-ESO-1特異抗体を決定することにより
、癌状態の状況を決定する方法に関する。

【０００３】（背景および先行技術）感染症、癌、自己免疫疾患などの多くの病的状態が特定分子の不適切な発現を
特徴とすることは、かなり確立された事実である。したがってこれらの分子は特
定の病的状態または異常状態に関する「マーカー」として役立つ。これらの分子
は、診断上の「ターゲット」（すなわちこれらの異常状態を診断するために同定
すべき物質）として使用される他、診断薬および/ または治療薬の創出に利用で
きる試薬としても役立つ。癌マーカーを使って特定のマーカーに特異的な抗体を
産生させることはその一例であるが、決してこれに限るわけではない。また、MH
C 分子と複合体を形成するペプチドを使った異常細胞に対する細胞溶解性T 細胞
の生成も、その一例である。

【０００４】このような物質の製造は、もちろん、それらの製造に使用される試薬類の供給
源を前提としている。細胞からの精製は、困難であり確実というには程遠い方法
である。もう一つの好ましい方法は、特定のマーカーをコードする核酸分子を単
離し、単離されたコード分子を使って所望の分子を発現させることである。

【０００５】今まで、上述のような例えばヒト腫瘍中の抗原の検出には、2 つの戦略が使用
されてきた。以下、これらを遺伝子的方法および生化学的方法と呼ぶことにする
。遺伝子的方法は、例えば参照によって本明細書に組み込まれるdePlaen ら，Pr
oc. Natl. Sci. USA 85:2275（1988）などに、その例を見ることができる。この
方法では、腫瘍から得たcDNAライブラリーのプラスミド数百プールをCOS 細胞な
どの受容細胞または腫瘍細胞系の抗原陰性変異株にトランスフェクトし、特異的
抗原の発現について調べる。生物学的方法は、例えば参照によって本明細書に組
み込まれるMandelboimら，Nature 369:69 （1994）などにその例を見ることがで
きるが、これは、腫瘍細胞のMHC クラスI 分子に結合しているペプチドの酸溶出
と、それに続く逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に基づいている。抗原
ペプチドは、抗原処理欠損性の突然変異型細胞株の空のMHC クラスI 分子にそれ
ら抗原ペプチドが結合し、細胞傷害性T リンパ球との特異的反応を誘発すること
によって同定される。これらの反応には、CTL 増殖、TNF 放出、およびMTT アッ
セイまたは⁵¹Cr放出アッセイで測定することができるターゲット細胞の溶解など
がある。

【０００６】抗原の分子的定義を行うためのこれら2 つの方法には以下の欠点がある。第1
に、これらの方法は非常に煩雑であり、時間と費用を必要とする。第2 に、これ
らの方法は、所定の特異性を持つ細胞傷害性T 細胞株（CTL ）の樹立に依存して
いる。

【０００７】抗原の同定および分子的定義を行うための既知の二方法に固有の上記の課題は
、どちらの方法でもヒト腫瘍中の新規抗原を今までにごく少数しか定義づけるこ
とに成功していないという事実が如実に物語っている。例えばvan der Bruggen
ら，Science 254:1643-1647 （1991）、Brichardら，J. Exp. Med. 178:489-495
（1993）、Coulieら，J. Exp. Med. 180:35-42（1994）、Kawakamiら，Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 91:3515-3519 （1994）などを参照されたい。

【０００８】また、上述の方法論は、問題にしている癌タイプの樹立永久細胞株が入手でき
ることを前提としている。一定の癌タイプから細胞株を樹立するのが極めて難し
いことは、例えばOettgen ら，Immunol. Allerg. Clin. North. Am. 10:607-637
（1990）などに示されているとおりである。また、一部の上皮細胞タイプの癌は
インビトロでCTL に対する感受性に乏しいため、定型的な分析は不可能である。
これらの課題は、癌関連抗原を同定するためのさらなる方法論の開発を刺激する
ことになった。

【０００９】一つの重要な方法論が、参照によって本明細書に組み込まれるSahin ら，Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 92:11810-11913 （1995）に記載されている。米国特許
第5,698,396 号および米国特許出願第08/479,328号（出願日1996年1 月3 日）も
参照されたい。これら3 つの参考文献は全て参照によって本明細書に組み込まれ
るものとする。要約すると、この方法論ではcDNAライブラリーを原核宿主中で発
現させる。（ライブラリーは腫瘍試料から獲得される）。次に、高力価の体液性
応答を惹起する抗原を検出するために、発現させたライブラリーを吸収および希
釈血清によるイムノスクリーニングにかける。この方法論は、SEREX 法（「Sero
logical identification of antigens by Recombinant Expression Cloning（組
換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定）」) と呼ばれている。この方
法論は、新しい腫瘍関連抗原の検出に使用されていると共に、先に同定された腫
瘍関連抗原の発現を確認するためにも使用されている。上記特許出願およびSahi
n ら（前掲）ならびにCrewら，EMBO J 144:2333-2340（1995）を参照されたい。

【００１０】 SEREX 法は食道癌試料に応用されて一つの抗原が同定されており、それをコー
ドする核酸分子が単離されクローニングされている。これはいくつかの特許出願
の主題になっており、その一部は参照によって本明細書に組み込まれる。この抗
原とその切断型は癌患者の血清中の抗体と反応することが見出されている。また
、この分子に由来するペプチドはMHC 分子と結合して、細胞溶解性T 細胞応答と
ヘルパーT 細胞応答の両方を惹起することも見出されている。また、ここでは、
患者試料中のNY-ESO-1に対する抗体をアッセイすることによって腫瘍状況を決定
できることが見出された。本発明のこれらの特徴を以下に説明する。

【００１１】（好ましい態様の詳細な説明）実施例1 食道の高〜中分化扁平上皮癌の急速冷凍標本から周知の方法を用いて全RNA を
抽出した。そのような方法の一つとして、例えばChomzynski，J. Analyt. Bioch
em. 162:156-159 （1987）を参照されたい。このRNA を使ってcDNAライブラリー
を作製し、次にそのcDNAライブラリーをλZAP ファージベクターに製造者の指示
に従ってトランスフェクトした。次に、そのλZAP ライブラリーを大腸菌にトラ
ンスフェクトして、1.6 ×10⁶ 個の一次単離物を得た。

【００１２】次に、参照によって本明細書に組み込まれるSahin ら，Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 92:11810-11813 （1995）のSEREX 法を使用した。簡単に述べると、血清
を、食道癌細胞由来のcDNAクローンを含有しないファージλZAP をトランスフェ
クトした大腸菌の溶解液と混合することにより、自己血清から大腸菌に内在する
分子に対する抗体を枯渇させた。

【００１３】次に、上記枯渇血清を希釈し、ファージプラークを含んでいるニトロセルロー
ス膜と混合した。プラークを室温で終夜インキュベートした。次に洗浄を行った
後、フィルターをアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトFCγ二次抗体と共にイ
ンキュベートし、5-ブロモ-4- クロロ- インドリルリン酸およびニトロブルーテ
トラゾリウムと共にインキュベートすることにより、反応性ファージプラークを
可視化した。合計13個の陽性クローンが見つかった。

【００１４】実施例2 同定の後、反応性クローンを、希釈クローニングおよびヒト血清を用いる試験
により、単クローン性が得られるまでサブクローニングした。次に、製造者の指
示に従って、これらのクローンを精製し、インビトロで切り出し、pBK-CMV プラ
スミド型に変換した。次に、EcoRI-XbaI制限酵素マッピングを使って挿入された
DNA を調べることにより、異なるインサートを決定した。サイズが約500 〜約1.
3 キロ塩基対の8 種類のインサートが同定された。これらのクローンをABI PRIS
M 自動シーケンサーを使って配列決定した。

【００１５】表1 に結果を要約する。ある遺伝子は4 つのオーバーラップクローンによって
表され、もう一つの遺伝子は3 つのオーバーラップクローンによって表された。
残りの6 遺伝子は単一のクローンによって表された。

【００１６】ホモロジー検索により、NY-ESO-2、3 、6 、7 と呼ぶクローンは既知であるこ
とがわかった。Eliseiら，J. Endocrin. Invest. 16:533-540 （1993）、Spritz
ら，Nucl. Acids Res. 15:10373-10391 （1987）、Rabbits ら，Nature Genetic
s 4:175-180 （1993）、Crozatら，Nature 363:640-644（1993）、GenBank H183
68およびD25606を参照されたい。これらのクローンのうちの2 つ（NY-ESO-3およ
びNY-ESO-6）は、様々な正常ヒト組織で発現することが、既に明らかにされてい
る。系統拘束性（lineage restriction ）を示す証拠は見つかっていない。NY-E
SO-6（cDNA）はFUS/TLS 遺伝子の3'- 非翻訳部分であると思われる。ここには報
告しない実験でNY-ESO-6の配列決定およびサザンブロット解析を行ったが、癌に
おいて転座または点突然変異を示す証拠は見つからなかった。上記クローンのう
ちの4 つ、すなわちNY-ESO-1、4 、5 および8 は、調べたデータベース中の配列
と強い相同性を示さず、これらをさらに詳しく研究した。

【００１７】

【表１】実施例3 NY-ESO-1、4 、5 および8 クローンのmRNA発現を評価するための研究を行った
。これを行うために、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、各配列について
、300 〜400 塩基対のcDNAセグメントが増幅されるように、またプライマー融解
温度が65〜75℃の範囲になるように設計した。次に、市販の材料と標準的プロト
コールを使って逆転写PCR を行った。様々な正常および腫瘍細胞タイプを調べた
。クローンNY-ESO-4およびNY-ESO-8は遍在性であり、これ以上調べなかった。NY
-ESO-5は元の腫瘍および正常食道組織で高レベル発現を示したことから、これは
分化マーカーであることが示唆された。

【００１８】 NY-ESO-1は腫瘍mRNAと精巣で発現しているが、正常な結腸、腎臓、肝臓または
脳組織では発現しないことが見出された。この発現パターンは他の腫瘍拒絶抗原
前駆体と一致する。

【００１９】実施例4 NY-ESO-1に関し、上記のRT-PCRアッセイを、はるかに多くの多様な正常組織お
よび腫瘍組織に対して行った。結果を表2 、3 および4 に示す。簡単に述べると
、NY-ESO-1は、正常な精巣および卵巣細胞で大量に発現することがわかった。正
常な子宮、子宮筋層には少量のRT-PCR産物が認められ、子宮内膜には認められな
かったが、陽性の表示には一貫性がなかった。様々な細胞タイプの扁平上皮も、
正常な食道および皮膚を含めて、陰性だった。

【００２０】無関係な細胞系統の腫瘍を調べたところ、11株のメラノーマ細胞株中2 株が強
い発現を示し、67個のメラノーマ標本中16個、33個の乳癌標本中6 個、4 個の膀
胱癌標本中4 個も同様に強い発現を示した。他の腫瘍タイプでは散発的な発現が
あった。

【００２１】

【表２】

【表３】

【表４】癌患者血清中の抗NY-ESO-1抗体の存在をELISA によって決定することができる
かどうかを確かめるために、さらにもう一組の実験を行った。

【００２２】詳しく述べると、コーティング緩衝液（15mM Na₂CO₃ 、30mM NaHCO₃ 、pH9.6
、0.02％ NaN₃ ）に溶解した組換えNY-ESO-1（濃度1 μg/ml）をマイクロウェル
プレート（1 ウェルあたり溶液10μl ）に吸着させ、終夜4 ℃に保った。そのプ
レートをリン酸緩衝食塩水で洗浄し、10μl/ウェルの2 ％ウシ血清アルブミン/
リン酸緩衝食塩水により、終夜4 ℃でブロックした。洗浄後、2 ％ウシ血清アル
ブミン中の希釈血清10μl/ウェルをウェルに加えた。室温で2 時間インキュベー
トした後、プレートを洗浄し、10μl/ウェルのヤギ抗ヒトIgG アルカリホスファ
ターゼコンジュゲートを1 ：1500の希釈率で加えた。この溶液を室温で1 時間イ
ンキュベートした後、洗浄し、アルカリホスファターゼ基質の溶液（10μl/ウェ
ル）を加えた。室温で25分後に、ウェルを蛍光プレートリーダーで読み取った。
結果を以下の表に示す。

【００２３】 ESO-1陽性検体数/ 総検体数 % 癌患者：メラノーマ 12/127 9.4 卵巣癌 4/32 12.5 肺癌 1/24 4.0 乳癌 2/26 7.7 献血者 0/70 0 腫瘍におけるNY-ESO-1 mRNA の発現と、NY-ESO-1タンパク質に対する抗体応答
との間に関係があるかどうかを決定するために、62人のメラノーマ患者から得た
データを比較した。血清がNY-ESO-1タンパク質と反応する（すなわちNY-ESO-1に
対する抗体を含有する）患者は全員、NY-ESO-1陽性腫瘍も持ち、NY-ESO-1陰性腫
瘍を持つ患者はいずれもNY-ESO-1に対する抗体をその血清中に示さなかった。NY
-ESO-1陽性患者の一部は、抗体を持たなかった。メラノーマの約20〜40％がNY-E
SO-1を発現させ、NY-ESO-1陽性腫瘍を持つ患者だけが抗体を持つことから、この
データは、NY-ESO-1陽性腫瘍を持つ患者の多くがこのタンパク質に対する抗体を
生成させることを示唆しており、したがって診断に役立つ広スケールアッセイと
、処置に対する応答性とが示唆される。

【００２４】実施例5 次に、NY-ESO-1転写物のサイズを調べ、組織発現パターンを確認するために、
ノーザンブロット解析を行った。Ausubel ら，Current Protocols In Molecular
Biology（John Wiley & Sons ，1995）の方法論を使用した。詳述すると、1 レ
ーンあたり20μg の全RNA をホルムアミドおよびホルムアルデヒド含有緩衝液に
溶解し、65℃に加熱した後、3 ％ホルムアルデヒドを含む1.2 ％アガロースゲル
で分離し、次いでニトロセルロース紙に転写した。次に³²P 標識プローブを使っ
てハイブリダイゼーションを行い、続いて高ストリンジェンシー洗浄を行った。
最終洗浄は0.1 ×SSC 、0.1 ％SDS 、60℃で15分間行った。

【００２５】先のアッセイでNY-ESO-1について陽性だった精巣およびメラノーマ細胞株（SK
-MEL-19 ）由来のRNA は、約0.8 〜0.9kb のRNA 転写物を示した。食道癌標本は
、0.4 〜0.9kb の範囲に部分的な分解を反映するスミアを示した。試験した他の
組織または細胞株に由来するRNA には、転写物は認められなかった。

【００２６】完全な転写物をコードするcDNAを得るために、ハイブリダイゼーションプロー
ブとして元のcDNAクローンを使用し、プラークハイブリダイゼーション法によっ
て、食道cDNAライブラリーを再スクリーニングした。3 ×10⁵ 個のクローンをス
クリーニングしたところ、6 個の陽性クローンが見つかった。最も長い3 つのク
ローンを配列決定した。オープンリーディングフレームの解析により、これら3
つのクローンは全て、コード領域全体と様々なサイズの5'非翻訳領域を含むこと
が明らかになった。最も長い755 塩基長（ポリA を除く）のクローンは543 塩基
対のコード領域を含有すると共に、5'末端に53個の非翻訳塩基および3'末端に15
1 個の非翻訳塩基対を含有する。配列番号1 参照（図3 も参照されたい）。

【００２７】長いORF により、NY-ESO-1タンパク質の推定配列は180 アミノ酸であることが
示された。一つの免疫陽性クローンはこのうちの173 残基をコードする配列を含
んでいた。推定分子量は17,995ダルトンである。

【００２８】解析すると、N 末端部分にグリシン残基が豊富であることがわかる（最初の80
残基中に30残基、残りの100 残基中に4 残基）。親水性解析により、この分子の
N 末端側の半分には親水性抗原配列が存在し、疎水性配列と親水性配列とが交互
に現れて長いC 末端疎水性テール（アミノ酸152 〜172 ）で終わった後に、短い
親水性テールが続いていることがわかった。このパターンは膜貫通ドメインを示
唆している。いくつかのN-ミリストリル化可能部位、3 つのリン酸化部位があり
、N-グリコシル化部位を示す証拠は認められない。

【００２９】実施例6 メラノーマ細胞株「NW-MEL-38 」は悪性メラノーマを患う患者から1995年に樹
立された。その患者からは血清試料、末梢血リンパ球および腫瘍試料が採取され
、本明細書に記載する研究が行われるまで凍結保存された。この患者における抗
腫瘍T 細胞応答を評価することを予想して、この患者のHLA 型はHLA-A1およびHL
A-A2と判定された。

【００３０】この患者から得たメラノーマがNY-ESO-1を発現するかどうかを決定するために
、腫瘍試料と細胞株NW-MEL-38 の両方から標準的方法で全RNA を単離した。次に
、各試料から得た2 μg の全RNA を、やはり標準的方法によるcDNA合成にかけた
。

【００３１】次にそのcDNAを、プライマー5'-CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G-3'（配
列番号2 ）およびCACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG-3'（配列番号3 ）を使
ったRT-PCR実験に使用した。これらのプライマーは配列番号1 のヌクレオチド27
1 〜599 にまたがるセグメントを増幅するはずである。

【００３２】増幅は60℃のアニーリング温度を使用して35サイクルにわたって行った。PCR
産物を臭化エチジウム染色法により1.5 ％アガロースゲル上で可視化した。

【００３３】その結果、上記腫瘍および細胞株はどちらも配列番号1 を発現することがわか
った。上記の細胞株および腫瘍試料を以下の実験に使用した。

【００３４】実施例7 次に、上述の単離されたcDNA分子を使って組換えタンパク質を作った。具体的
には、前記cDNAを標準的技術でPCR 増幅した後、His タグを含有する市販のプラ
スミドベクター、すなわちpQE9にクローニングした。ここでは詳述しないが、も
う一つのベクターpQE9K を使った実験も行った。これは、pQE9K がアンピシリン
耐性ではなくカナマイシン耐性を付与する点で、pQE9とは異なる。

【００３５】プラスミドベクターを大腸菌XL1-Blue株に形質転換し、陽性形質転換体を制限
酵素マッピングおよびDNA 配列決定によって同定した。イソプロピルβ-D- チオ
ガラクトシドを使って組換えタンパク質の生産を誘導し、周知の方法に従って、
タンパク質をNi²⁺イオンクロマトグラフィーカラムで精製した。15％SDS-PAGEと
銀染色によって分析したところ、本タンパク質は分子量約22キロダルトンのタン
パク質であることが確認された。これはその配列から予想されるタンパク質のサ
イズと一致する。他に2 つの形態の組換えタンパク質も確認された。これらは配
列番号1 に記載のアミノ酸配列のアミノ酸10〜180 およびアミノ酸10〜121 から
なっていた。これらの分子量は上述のように行ったSDS-PAGEでそれぞれ約14kDお
よび20kDa である。

【００３６】 NY-ESO-1をバキュロウイルスで発現させるために、さらに一組の実験を行った
。詳細には、BamHI およびHindIII を用いる切断によってpQE9ベクターからNY-E
SO-1 cDNA インサートを放出させた。次にこのインサートを、同じ酵素で切断し
ておいた市販のバキュロウイルスベクターにサブクローニングした。陽性クロー
ンを標準的な方法で決定し、受容Sf9 細胞にトランスフェクトした。次に、10％
ウシ胎仔血清を添加した標準培地（IPL-41）を使って、昆虫細胞を組換えウイル
スに感染させた。この実験に関する感染の多重度は20とした。組換えタンパク質
の発現は上述のように決定した。このベクターで産生された組換えタンパク質は
His タグを持つので、Ni²⁺アフィニティーカラムでやはり上述したように精製し
た。このタンパク質はアミノ酸10〜180 からなり、SDS-PAGEで20kDの分子量を持
つ。

【００３７】次に、さらなる真核細胞トランスフェクタントを作出した。これを行うために
、NY-ESO-1コード配列を上述のpQE9ベクターから単離し、次に真核細胞用発現ベ
クターpcDNA3.1のBamHI-HindIII 部位にクローニングした。次に、細胞試料を上
記プラスミド150ng およびHLA-A2.1のcDNAまたはHLA-A1のcDNAのいずれかを含有
するプラスミドpcDNA1Amp 150ng と接触させることにより、COS-7 細胞に上記の
ベクターをトランスフェクトした。周知のDEAE- デキストラン・クロロキン法を
使用した。次に、細胞を37℃で48時間インキュベートした後、それらの細胞をCT
L 刺激アッセイで試験した。具体的には、参照によって本明細書に組み込まれる
Traversariら，Immunogenetics 35:145-148 （1992）に従ってアッセイを行った
。簡単に述べると、100 ％ヒト血清と25U/mlの組換えIL-2とを補足したRPMI 100
μl 中のCTL （NW38-IVS-1、下記実施例9 参照）2500個を、COS-7 トランスフェ
クタント（20,000細胞/ ウェル）を含有するマイクロウェルに加えた。24時間後
に、上清50μl を各ウェルから集め、TNF-αレベルを標準的アッセイ（すなわち
、WEHI164 クローン13細胞に対する細胞傷害性をMTT を使って調べるアッセイ）
で決定した。陽性クローンを以下の実施例で述べるウェスタンブロット解析に使
用した。

【００３８】使用したCTL は、参照によって本明細書に組み込まれるKnuth ら，Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 81:3511-3515 （1984）に従って調製したCTL NW38-IVS-1であ
る。具体的には、患者から採取した10⁵ 個の自己NW38 MEL-1腫瘍細胞と10⁶ 末梢
血リンパ球とを混合することによって、混合リンパ球T 細胞培養物を用意した。
サイトカインIL-2を加え、その混合培養物を37℃で1 週間培養した。腫瘍細胞を
除去し、新しい5 ×10⁴ 個の腫瘍細胞をIL-2と共に加えた。⁵¹Cr標識NW-MEL-38
細胞に対して試験したときに強い応答が見られるようになるまで、この操作を毎
週繰り返した。レスポンダーT 細胞を集め、以降の実験に使用するまで凍結保存
した。

【００３９】実施例8 次に、上記血清試料ならびに上記細胞株NW-MEL-38 と上記COS-7 トランスフェ
クタントから調製した細胞溶解液および上記精製組換えタンパク質を使って、ウ
ェスタンブロット解析を行った。血清試料は患者の治療の様々な時点で採取した
。結果に相違はなかった。

【００４０】これらのアッセイでは、組換えNY-ESO-1タンパク質1 μg またはいずれかのタ
イプの細胞溶解液5 μl をSDS に希釈し、5 分間煮沸した後、15％SDS ゲルで電
気泳動した。ニトロセルロース（0.45μm ）に終夜ブロットし、3 ％BSA でブロ
ッキングした後、得られたブロットを1:1000、1:10,000および 1：100,000 に希
釈した血清と共に、または陽性対照として1:50に希釈したNY-ESO-1に対するモノ
クローナル抗体と共にインキュベートした。このモノクローナル抗体は、参照に
よって本明細書に組み込まれるChenら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5915-5919
（1996）により、以下に詳述するように作製された。組換えNY-ESO-1タンパク質
を2 〜3 週間おきに5 回皮下注射することにより、BALB/cマウスを免疫した。ア
ジュバント中に50μg の組換えタンパク質を含む免疫剤を使用した。1 回目の注
射には完全フロイントアジュバントを使用し、その後は不完全フロイントアジュ
バントを使用した。免疫したマウスから脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞株SP
2/0 と融合してハイブリドーマを生成させた。代表的ハイブリドーマE978をmAb
の生成に使用した。

【００４１】ハイブリドーマを生成させたら、それらをクローン化し、マイクロタイタープ
レートでの標準的固相ELISA を用いて、その上清を組換えタンパク質に対してス
クリーニングした。アッセイは、参照によって本明細書に組み込まれるDippold
ら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6114-6118 （1980）に従って行った。組換
えNY-ESO-1を使って、一連の陰性対照実験も行った。大腸菌により上述のように
生産された組換えタンパク質に結合した血清抗体の可視化にはアルカリホスファ
ターゼで標識したヤギ抗ヒトIgG （希釈率1 ：10,000）を使用し、NBT-ホスフェ
ートを使って可視化した。非トランスフェクトCOS-7 細胞も対照として使用した
。健常者から得た血清も対照として使用した。

【００４２】組換えタンパク質に対する強い反応性が1 ：100,000 の希釈率の血清まで認め
られ、NW-MEL-38 の溶解液に対する反応性もあった。非トランスフェクトCOS-7
細胞に対する反応性は認められず、健常者から得た血清も反応性を示さなかった
。

【００４３】実施例9 上には4 種類のNY-ESO-1を記述した。すなわち配列番号1 によって大腸菌中で
産生されるものと、アミノ酸10〜180 からなるもの、アミノ酸10〜121 からなる
もの、そしてアミノ酸10〜180 からなり上述のバキュロウイルスベクター系で発
現されるものである。それぞれを上記のプロトコールに従ってELISA で使用した
。どの型のタンパク質も、様々な患者から採取した抗体および上述のマウスモノ
クローナル抗体と同等に反応することがわかった。

【００４４】実施例10 上に詳述したデータから、長期間にわたる経時的な血清抗体価の変化がNY-ESO
-1抗原を発現させる癌患者の臨床状況の変化の指標になるかもしれないことが示
唆された。以下はこの問題に向けた実験である。

【００４５】 12人の患者からなる群を研究のために選択した。選択した患者は様々な悪性腫
瘍を持ち、年齢、性別、転移部位および受けている処置のタイプが異なった。こ
の情報を本実施例に続く表に要約する。

【００４６】全ての患者は、NY-ESO-1の発現に関して陽性であることが、上記実施例6 に記
載のRT-PCRで確認された。

【００４７】組換えNY-ESO-1タンパク質に対するこれらの患者の血清抗体応答を、上記実施
例8 に記載のウェスタンブロットプロトコールに従って試験した。NY-ESO-1のア
ミノ酸10〜121 からなる組換えタンパク質を使用した。これが適切な選択である
ことは上記の実施例からわかる。NY-ESO-1に対する血清抗体は試験したどの型の
タンパク質とも同等によく反応したからである。

【００４８】患者血清試料を1:250 、1:1000、1 ：5000、1:10,000、1:50,000および1:1,00
0,000 に希釈した後、先に作製したブロットと共に、また陽性対照として上記ハ
イブリドーマ細胞株E978によって産生されるモノクローナル抗体と共にインキュ
ベートした。

【００４９】短いタンパク質（すなわちアミノ酸10〜121 からなるタンパク質）と反応する
血清抗体が自然界で発現されるタンパク質とも反応することを示すために、さら
に一組の実験を行った。これらの実験には、上述した細胞株NW-MEL-38 の溶解液
5 μl も陽性対照として使用した。血清抗体は、希釈率1:3000のヤギ抗ヒトIgG
またはヤギ抗マウスIgG とのインキュベーションによって検出した。これらの分
子はアルカリホスファターゼで標識し、市販のアルカリホスファターゼ基質を使
って可視化した。ウェスタンブロット実験で、バンドが1 ：250 の希釈率で検出
可能であれば、その試料は陽性であるとみなした。

【００５０】並行して一連のELISA を行った。これらのアッセイでは、コーティング緩衝液
（15mM Na₂CO₃ 、30mM NaHCO₃ 、pH9.6 、0.02％NaN₃）に1 μg/mlの濃度で溶解
したアミノ酸10〜121 からなるタンパク質を使用し、10μl/ウェルを4 ℃で終夜
インキュベートすることによって、前記タンパク質をマイクロウェルプレートに
吸着させた。次に、そのプレートをPBS で洗浄し、10μl/ウェルの2 ％BSA/PBS
を使って4 ℃で終夜ブロックした。ウェルを洗浄し、2 ％BSA に希釈した血清（
1 ：100 から1:100,000 までの4 倍希釈系列）10μl/ウェルを加え、室温で2 時
間インキュベートした。次に、これを洗浄し、2 ％ウシ血清アルブミン中の二次
抗体10μl/ウェルを加えた（この二次抗体もアルカリホスファターゼで標識され
たヤギ抗ヒトIgG である）。二次抗体を室温で1 時間インキュベートした後、プ
レートを洗浄し、10μl/ウェルの基質溶液と共に室温で25分間インキュベートし
、次に標準的技術を用いて試料を分析した。

【００５１】下記表5 および表6 に、患者の特徴およびその患者が患っている疾患の評価を
、NY-ESO-1抗体価の変化と関連させて要約したものを記載する。表6 の結果は両
アッセイ（ウェスタンブロットおよびELISA ）の要約である。

【００５２】

【表５】略号一覧： LI＝肝臓 P ＝腹膜 SP＝脾臓 LU＝肺 LN＝リンパ節 M1＝MAGE-1.A1 ペプチドによる免疫治療 M3＝MAGE-3.A1 ペプチドによる免疫治療 GM2 ＝合成ガングリオシドGM2 による免疫治療 WBH/DDP ＝全身温熱療法とシスプラテン（cisplaten ）の併用 WBH/Melph ＝全身温熱療法とメルファランの併用 res ＝切除 Diff.Ag's ＝ペプチド混合物（Melan-A 、チロシナーゼ、gp100 ）による免疫治
療 Vinorelb. ＝ビノレルビン M-VAC ＝メトトレキセート、ビンブラスチン、アドリアマイシン、シスプラチン
DTC ＝ダカルバジン PR＝部分寛解 NC＝変化なし PD＝進行性疾患 NEO ＝無病生存

【表６】古い試料（例えば5/93〜10/93 ）は凍結保存血清を表す。3 パターンの抗体応
答、すなわち1 ）力価増加、2 ）力価一定、3 ）力価減少が観察された。

【００５３】表6 から、抗体価の増加は4 人の患者で観察され、その4 人中2 人で疾患の進
行を伴ったことがわかるだろう。このことから、抗体価の増加は、NY-ESO-1を発
現させる腫瘍の維持を必要とすることが示唆される。したがって力価の増加は疾
患の安定化または進行を示唆する。また、力価の増加は、免疫治療を受けている
1 患者および全身温熱療法と化学療法の併用療法を受けているもう1 人の患者に
おける広範な腫瘍壊死の発生にも伴った。血清抗体価の安定な経過は1 人の患者
で観察され、その患者は40ヶ月の観察期間にわたって肝臓およびリンパ節転移巣
の緩やかな後退を示した。

【００５４】 5 人の患者は抗体価の低下を示した。これらの患者のうち4 人は腫瘍の後退も
示した。残る1 人の患者は進行性の疾患を示したが、これは腫瘍がNY-ESO-1抗原
発現を失った結果であった。これらの患者のうちの1 人（表5 および6 のNW37）
は化学療法下に鼠径リンパ節転移の切除を受けていたことに注意されたい。抗体
価は徐々に減少し、もはや検出されない。患者NW519 （非小細胞肺癌）は肝転移
巣の部分的後退を示し、現在、化学療法下に抗体価が減少している。

【００５５】膀胱癌を患っていた患者NW692 は、抗原を発現させるpT3b、N0、M0原発腫瘍の
切除を受けた後、術後補助化学療法を受けた。8 ヵ月後の抗体価は0 であり、患
者は無病状態を保っている。

【００５６】患者NW650 は膀胱癌を患っている。この患者はタキソールによる治療を受け、
抗体価の減少と共に肝転移巣と肺転移巣の部分的後退を示した。

【００５７】総合すると、これらのデータから、測定可能な血清抗体レベルと、抗原（すな
わちNY-ESO-1）を発現させる腫瘍の存在との間には関連があることが示唆される
。また、抗体レベルの変化は、抗原を発現させる腫瘍の量の変化を反映している
。

【００５８】このデータは、患者の腫瘍がNY-ESO-1抗原を発現させるのであれば、その患者
の疾患の状況は、抗体価の変化または抗体価の欠如をアッセイすることによって
監視できることを示唆している。そのようなアッセイは、それだけで有益である
と共に、他の診断法と組み合わせて使用することもできる。

【００５９】実施例11 上記COS-7 トランスフェクタントの実験および本実施例で説明するアッセイに
は、細胞傷害性T 細胞株「NW38-IVS-1」を使用した。この「CTL 」は、腫瘍細胞
株NW-MEL-38 を用いて上述した末梢血リンパ球をインビトロ刺激することによっ
て生成させた。これは標準的な技法で行った。

【００６０】本CTL を、NW-MEL-38 （HLA-A1、A2陽性かつNY-ESO-1陽性）ならびにNY-ESO-1
およびHLA-A2陽性である2 つの同種異系細胞株（SK-MEL-37 およびMZ-MEL-19 ）
、MHC クラスI 陰性である細胞株（SK-MEL-19 ）、HLA-A2陽性であるがNY-ESO-1
陰性である細胞株（NW-MEL-145）と共に、また対照細胞株K562および自己フィト
ヘマグルチニン刺激芽球と共に、細胞傷害性アッセイに使用した。様々なエフェ
クター/ ターゲット比を使用し、⁵¹Cr標識ターゲット細胞の溶解を、測定するパ
ラメーターとした。これを図5 に示す。

【００６１】その結果、CTL NW38-IVS-1は自己細胞株NW-MEL-38 と、HLA-A2およびESO-1 陽
性である同種異系細胞株の両方を溶解することがわかった。したがって本CTL は
同種異系物質と反応した。図6 参照。

【００６２】実施例12 患者NW38はHLA-A1およびHLA-A2陽性だったので、どのMHC 分子が提示分子であ
るかを決定するための実験を行った。

【００６３】 COS-7 細胞を使って上記の実験と同じ実験を行った。ただし、HLA-A1 cDNA ま
たはHLA-A2 cDNA で形質転換されているが両方では形質転換されていない同時形
質転換体群が個別に獲得されるように注意を払った。これらの結果から、CTL NW
38-IVS-1はNY-ESO-1とHLA-A2の両方を含有するCOS-7 トランスフェクタントだけ
を溶解したことがわかる。図6 参照。この実験により、本CTL の特異性も確認さ
れた。というのも、実施例9 に記載のNY-ESO-1陰性HLA-A2陽性細胞は、HLA-A2分
子によって提示されるペプチドにプロセシングされることが知られている他の分
子に関して陽性だったからである。

【００６４】実施例13 提示MHC 分子がHLA-A2であることを同定した後、参照によって本明細書に組み
込まれるD'Amaro ら，Human Immunol. 43:13-18 （1995）およびDrijfhout ら，
Human Immunol. 43:1-12（1995）に記載のモデルを使って、NY-ESO-1のアミノ酸
配列のスクリーニングを行い、このモチーフを満たす全てのペプチドを同定した
。これによって推定されたアミノ酸配列の全てに相当するペプチドを標準的方法
で合成し、参照によって本明細書に組み込まれるKnuth ら，Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:3511-3515 （1984）に従って、それらを細胞傷害性アッセイに使用
した。具体的には、細胞株CEMX721.174.T2（以下「T2」という）を使用した。な
ぜなら、この細胞株は抗原をMHC 複合体化ペプチドにプロセシングしないため、
ここに述べるタイプの実験には理想的だからである。T2細胞の試料を標準的方法
により100 μCiのNa(⁵¹Cr)O₄で標識した後、3 回洗浄し、次に10μg/mlのペプチ
ドおよび2.5 μg/mlのβ2-ミクログロブリンと共にインキュベートした。インキ
ュベーションは室温で1 時間とした。次に、90：1 のエフェクター/ ターゲット
比でレスポンダー細胞（CTL NW38-IVS-1の懸濁液100 μl ）を加え、5 ％CO₂ の
水飽和雰囲気下に37℃で4 時間インキュベートした。次に、プレートを200 ×g
で5 分間遠心分離し、上清100 μl を取り出し、放射能を測定した。⁵¹Cr放出率
を既知の方法によって決定した。ペプチドSLLMWITQCFL （配列番号4 ）、SLLMWI
TQC （配列番号5 ）、およびQLSLLMWIT （配列番号6 ）が最もよいCTL 刺激ペプ
チドであることがわかった。NW-MEL-38 ならびに細胞株SK-MEL-37 およびMZ-MEL
-19 を上記のようにターゲットとして使用した場合も同等の結果が得られた。

【００６５】実施例14 配列番号1 によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、HLA 結合モチ
ーフに相当するペプチド配列について解析した。これは、参照によって本明細書
に組み込まれるParkerら，J. Immunol. 142:163 （1994）に記載のアルゴリズム
を使って行った。以下の表に、HLA 分子がおそらく結合すると思われるアミノ酸
配列と、配列番号1 における位置を示す。結果として生じる複合体は細胞傷害性
T 細胞応答を惹起するはずである。これは、当業者であれば、例えば参照によっ
て本明細書に組み込まれるBruggen ら，J. Eur. J. Immunol. 24：3038-3043 （
1994）に記載の方法に従って決定できるだろう。

【００６６】配列 MHC/HLA分子位置 GPESRLLEF HLA-A1 82-90 LLMWITQCF HLA-A3 158-166 LMWITQCFL HLA-A3 159-167 EPTVSGNIL HLA-A24 125-133 LQLSISACL HLA-A24 145-153 GARGPESRL HLA-B7 79-87 APRGPHGGA HLA-B7 60-68 ESRLLEFYL HLA-B7 84-92 APPLPVPGV HLA-B7 113-121 FATPMEAEL HLA-B7 96-104 AADHRQLQL HLA-B7 139-147 GARGPESRL HLA-B8 79-87 ESRLLEFYL HLA-B8 84-92 VPGVLLKEF HLA-B35 118-126 ESRLLEFYL HLA-B35 84-92 GARGPESRL HLA-B35 79-87 LEFYLAMPF HLA-B44 88-96 PESRLLEFY HLA-B44 83-91 AELARRSLA HLA-B44 102-110 MEAELARRS HLA-B44 100-108 QQLSLLMWI HLA-B52 154-162 AQDAPPLPV HLA-B52 110-118 LQLSISSCL HLA-B52 145-153 ITQCFLPVF HLA-B52 162-170 LLEFYLAMPF HLA-A1 87-96 GPESRLLEFY HLA-A1 82-91 PLPVPGVLLK HLA-A3 115-124 RSLAQDAPPL HLA-A24 107-116 APPLPVPGVL HLA-B7 113-122 GARGPESRLL HLA-B7 79-88 GPHGGAASLG HLA-B7 63-72 APRGPHGGAA HLA-B7 60-69 GPRGAGAARA HLA-B7 44-53 TAADHRQLQL HLA-B8 138-147 APPLPVPGVL HLA-B52 113-122 QQLSLLMWIT HLA-B52 154-163 LQQLSLLMWI HLA-B52 153-162 KEFTVSFNIL HLA-B52 124-133

【００６７】実施例15 他の関連ペプチドを同定するために、さらなる実験を行った。これらの実験で
は、安定腫瘍細胞株、すなわちMZ-MEL-19 を使用した。この細胞株はMZ19と呼ば
れる患者から、参照によって本明細書に組み込まれるJaegerら，J. Exp. Med. 1
87:265-269（1998）に記載の方法によって樹立された細胞株である。細胞傷害性
T 細胞株、すなわちMZ2-MEL 19-IVS-1も、MZ-MEL-19 と上記実施例7 に記載の方
法および上記Jaegerらの方法を使って樹立させた。このCTL は自己腫瘍細胞株を
HLA-A2拘束的に溶解した。これは標準的な方法を使って決定された。上記D'Amar
o らのモデルを使って、HAL-A2結合モチーフを満たすESO-1 中の配列を全て同定
した。この方法で26個のペプチドが同定された。その全てを標準的な方法で合成
し、精製し、完全性を調べた。次に、ペプチドを合成し、以下の実験で試験した
。MZ19-IVS-1を実施例12に記載のT2細胞と共に使用した。配列番号4 および5 の
ペプチドはHLA-A2分子に結合し、CTL MZ19-IVS-1によって認識され、細胞はMZ19
-IVS-1によって溶解された。このCTL はHLA-A2と、配列番号1 の156 〜167 位に
見出されるデカペプチド：LLMWITQCFL（配列番号7 ）との複合体も認識した。

【００６８】実施例16 CD4+ヘルパーT 細胞がMHC クラスII分子とペプチドとの複合体を認識するかど
うかを決定するための研究をさらに行った。

【００６９】腫瘍細胞株MZ-MEL-19 はHLA-DR53陽性と型別されている。そこで、HLA-DR53の
結合モチーフが記載されているFutakiら，Immunogenetics 42:299-301 （1995）
（参照により本明細書に組み込まれるものとする）を利用して、NY-ESO-1をスク
リーニングした。理論上HLA-DR53および抗原提示細胞だけに結合するであろう合
計28個のペプチド。

【００７０】末梢血リンパ球（「PBL 」）をHLA-DR53陽性と型別された2 人の転移性メラノ
ーマ患者から単離した。

【００７１】型別は、標準的な市販の試薬を使って行った。1 人の患者はHLA-DRB1（対立遺
伝子1501-05 、1601-1603 、1605および0701）、HLA-DRB4^* （対立遺伝子0101-0
103 ）およびDRB5^* （対立遺伝子0101）に関して陽性であると型別され、もう1
人の患者はHLA-DRB1^* （対立遺伝子1401、1407、1408および0901）、HLA-DRB3^*
（対立遺伝子0201-0203 ）およびDRB4^* （対立遺伝子0101-0103 ）に関して陽性
であると型別された。参照によって本明細書に組み込まれるBodmerら，Human Im
munol. 34:4-18（1992）に従ってHLA-DRB4^* の対立遺伝子は全てHLA-DR53と呼ば
れる。

【００７２】 CD4+およびCD8+T リンパ球を枯渇させるために、適当な抗体で被覆した磁気ビ
ーズでPBL を処理した。残った細胞を24ウェルプレートに4 ×10⁶ 細胞/ ウェル
の密度で接種し、ウェルのプラスチックに24時間付着させた。非付着細胞を除去
し、残りの細胞を抗原提示細胞として使用した。これらの細胞を、5 μg/mlの抗
γ- インターフェロン抗体により4 ℃で終夜コーティングしておいた96ウェル平
底ニトロセルロースプレートで、GM-CSF（1000U/ml）およびIL-4（1000U/ml）を
用いて5 日間刺激した。細胞は3.5 ×10⁵ 細胞/ ウェルの密度で播種した。

【００７３】次に、4 μg/ウェルの試験ペプチドまたは対照として2 μg/ウェルの完全なNY
-ESO-1タンパク質を細胞にパルスした。

【００７４】次に、10％ヒト血清、L-アスパラギン（50mg/l）、L-アルギニン（242mg/l ）
およびL-グルタミン（300mg/l ）ならびに2.5ng/mlのIL-2を補足したRPMI1640培
地中、最終液量が100 μl になるようにCD4+T 細胞（1 ×10⁵ 細胞/ ウェル）を
加えた。

【００７５】この混合物を水飽和雰囲気中37℃で48時間インキュベートした。次にプレート
を0.05％Tween20/PBS の溶液で6 回洗浄し、ビオチン化抗インターフェロンγ抗
体を0.5 μg/mlの濃度で加えた。抗体を37℃で2 時間インキュベートした後、プ
レートを標準的試薬で1 時間処理した。基質3-エチル-9- アミノカルバゾールを
加え、5 分間インキュベートした。陽性は赤いスポットで表される。1 ウェルあ
たりの赤いスポット数は、ペプチドとHLA-DR53との複合体またはHLA-DR53と組換
えNY-ESO-1からプロセシングされたペプチドとの複合体を認識するCD4+T リンパ
球の頻度を示す。対照として、試薬だけ（すなわちCD4+細胞だけおよび染色剤だ
け）を用いたアッセイを行った。

【００７６】以下のペプチドは、CD4+T リンパ球を感作してγ- インターフェロンを放出さ
せることがわかった。

【００７７】 AADHRQLQLSISSCLQQL VLLKEFTVSGNILTIRLT PLPVPGVLLKEFTVSGNI （配列番号8 〜10）

【００７８】これらの3 つのペプチドは、アンカー残基Tyr 、Phe 、Trp またはLeu と3 残
基下流のAla またはSer というFutakiらの上記文献に記載されているHLA-DR53へ
の結合モチーフを満たす。

【００７９】 HLA-DR53に結合するペプチドがさらに見つかった。これらのペプチドは、 GAASGLNGCCRCGARGPE SRLLEFYLAMPFATPMEA TVSGNILTIRLTAADHRQ （配列番号11〜13）である。

【００８０】上記の実施例では、食道癌関連抗原をコードする核酸分子の単離を説明した。
当該分子が食道癌によって発現されることは明らかであるが、メラノーマ、乳癌
、前立腺癌および肺癌などの他の癌もこの抗原を発現するので、ここでは「関連
」という用語を使用する。

【００８１】本発明は、上記の抗原をコードし、ストリンジェントな条件で基準配列である
配列番号1 にハイブリダイズする核酸分子に関する。本明細書にいう「ストリン
ジェントな条件」とは、例えば米国特許第5,342,774 号に記載されているような
条件、すなわち65℃で18時間のハイブリダイゼーションの後、2 ×SSC 、0.1 ％
SDS で1 時間の洗浄を4 回行い、0.2 ×SSC （より好ましくは0.1 ×SSC ）、0.
1 ％SDS で30分間の最終洗浄を行うような条件、ならびに同レベルのストリンジ
ェンシーを与える代替条件またはよりストリンジェントな条件を指す。

【００８２】また、プロモーターと作動的な結合関係にある（すなわち、プロモーターに作
動可能に連結されている）本発明の核酸分子を組み込んだ発現ベクターも、本発
明の一部である。かかるベクターの構築は、細胞の形質転換またはトランスフェ
クションによって興味ある分子をコードする真核細胞株または原核細胞株を作出
することと同様に、当業者の技術で十分に可能である。COS 細胞、CHO 細胞、酵
母細胞、昆虫細胞（例えばSpodoptera frugiperda ）、NIH 3T3 細胞などが、こ
の形で使用することができる宿主細胞の典型例である。大腸菌および他の細胞な
どの原核細胞も使用することができる。

【００８３】本明細書に記載する抗原（元のペプチド型と翻訳後修飾型の両方）および配列
番号1 によってコードされるタンパク質の少なくともアミノ酸10〜121 からなり
10〜180 を越えないタンパク質も、本発明の一部である。この分子は十分に大き
いので翻訳後修飾を受けずに抗原性を示すことができ、したがってアジュバント
と組み合わせると（またはアジュバントなしで）前駆体型でも翻訳後修飾型でも
免疫原として有用である。これらのタンパク質は、上記のように血清または血液
などの試料中に抗体が存在するかどうかを決定するために使用することができる
。この抗原を使って作製されるポリクローナルおよびモノクローナル抗体も、そ
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマと共に、本発明の一部である。
これらは後述するように完全な分子またはその一部分として治療的または診断的
に使用することができる。Fab 、F(ab)₂' および他の断片などの反応性断片なら
びにキメラ、ヒト化抗体、組換え生産抗体なども、本発明の一部である。相補性
決定領域「CDR 」を除く抗体全体がヒト由来であり、CDR だけはマウス由来であ
るようなキメラは特に好ましい。

【００８４】この開示から明らかなように、本発明のタンパク質および核酸分子は診断的に
使用することができる。本明細書に述べるSEREX 法は、病変関連抗原に対する免
疫応答を前提とする。したがって、例えば被検者の体液試料（血清など）を抗原
そのものとの反応性について試験することによって、当該病変に関するアッセイ
を行うことができる。反応性は病変が存在する可能性を示すと思われるので、当
技術分野でよく知られていてここに詳述する必要のない標準的核酸ハイブリダイ
ゼーションアッセイによって抗原の発現をアッセイすることもできるだろう。標
準的イムノアッセイを用いて、対象分子に対する抗体をアッセイすることもでき
るだろう。

【００８５】配列番号1 を解析すれば、5'および3'非コード領域が配列番号1 中に存在する
ことが明らかになるだろう。本発明は、配列番号1 の少なくともコード部分（す
なわちヌクレオチド54〜593 ）を含有し、配列番号1 のヌクレオチド1 〜53およ
び/ または594 〜747 の全部または一部を含有してもよい単離された核酸分子に
関する。

【００８６】上述したさらなる解析により、本分子は細胞傷害性T 細胞による溶解を惹起す
るペプチドにプロセシングされることがわかる。実施例7 にはこのタイプのモチ
ーフ解析をHLA-A2分子に関して行う方法を示した。ここに応用することができる
様々なMHC またはHLA 分子に関するモチーフの研究は非常に数多く行われている
。したがって本発明のさらなる側面は、ある患者の腫瘍細胞表面上のHLA 分子に
結合する1 または複数のペプチドを、前記ペプチドが前記MHC/HLA 分子に結合し
てT 細胞による溶解を惹起するのに十分な量で、その患者に投与する治療方法で
ある。HLA-A2分子に関して上述した実例は、決して、使用することができるこの
投与の唯一のタイプというわけではない。例えば上述した他のHLA 分子用のペプ
チドなど、どのような組み合わせのペプチドでも使用できる。単独でまたは組み
合わせて使用することができるこれらのペプチドおよび全タンパク質またはその
免疫反応性部分は、投与を必要とする対象に、例えば静脈内、皮内、皮下、経口
、直腸および経皮投与など、任意の標準的投与法によって投与することができる
。標準的な医薬担体、アジュバント、例えばサポニン、GM-CSFおよびインターロ
イキンなども使用することができる。また、これらのペプチドおよびタンパク質
は、適切なMHC/ペプチド複合体を提示する樹状細胞または他の細胞と同様、上記
の物質と共にワクチンに処方してもよい。これらのペプチドはHLA/ペプチドの多
量体型複合体（例えば4 つのペプチド/MHC/ ビオチン複合体がストレプトアビジ
ンまたはアビジン分子に結合されているDunbarら，Curr. Biol. 8:413-416 （19
98）（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載の複合体など）を
形成させるために使用することもできる。このような複合体は、T 細胞前駆体を
同定および/ または刺激するために使用することができる。

【００８７】同様に、本発明では、NY-ESO-1をコードする核酸分子をアデノウイルス系ベク
ターなどのベクターに組み込んでヒト細胞などの真核細胞にトランスフェクトで
きるようにする治療法も考えられる。同様に、1 または複数のペプチドをコード
する核酸分子をこれらのベクターに組み込んで、それらを核酸に基づく治療法の
主要構成要素とすることもできる。

【００８８】これらのアッセイはいずれも進行／退行研究にも使用することができる。NY-E
SO-1の発現が関与する異常の経過は、このタンパク質のレベル、その発現などを
、上記の方法のいずれかまたは全てを用いて監視するだけで、監視することがで
きる。

【００８９】これらの方法論を使って治療計画の有効性を追跡できることも明らかなはずで
ある。基本的に、上述したアッセイのいずれかを使ってNY-ESO-1タンパク質のベ
ースライン値を測定し、所定の治療剤を投与し、その後のタンパク質レベルを監
視して、当該計画の有効性の指標としてESO-1 レベルの変化を観察する。

【００９０】腫瘍がNY-ESO-1を発現させる場合、NY-ESO-1発現腫瘍を持つ患者から試料を採
取して、この分子に対する抗体についてアッセイを行うことによって、その癌状
態の状況を監視できることは、理解できるだろう。そのアッセイで得られた値を
先に決定した値と比較することにより、その変化を決定することができ、よって
腫瘍状況の変化を決定することができる。例えば、値の増加は安定な疾患または
進行性の疾患を示し、抗体価の減少はその疾患の安定または退行を示す。

【００９１】結果が有効であるためには、患者の腫瘍がNY-ESO-1抗原を発現し続けなければ
ならないことに留意することが重要である。抗原が発現されているかどうかは、
上記実施例に記載した種類のアッセイのいずれかによって決定することができ、
酸ハイブリダイゼーションアッセイ、特にポリメラーゼ連鎖反応はとりわけ好ま
しい。PCR を使用する場合は、例えば配列番号2 および配列番号3 のオリゴヌク
レオチドまたは配列番号1 の17〜50（好ましくは17〜25）連続ヌクレオチドから
なる異なるプライマー対を使ってアッセイを実施することができる。

【００９２】 NY-ESO-1特異抗体の存在および量は、任意の標準的抗体決定法に従って決定す
ることができる。上記の説明ではウェスタンブロットおよびELISA を示したが、
例えばサンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ、比濁分析法などといった
任意のアッセイ型式を使用できることは、当業者には明らかだろう。

【００９３】 NY-ESO-1に対する抗体を結合するには、NY-ESO-1のアミノ酸10〜121 またはNY
-ESO-1分子のうち抗体に対してエピトープを提示するのに十分な数の連続アミノ
酸からなる分子など、前記実施例に記載した分子形をいずれも使用することがで
きる。これはわずかX アミノ酸であることができる。

【００９４】患者から採取する試料は様々であってよいが、好ましくは血液または血清であ
る。試料は使用前に適当なレベルに希釈してもよい。

【００９５】上述のように、この方法を使って、メラノーマ、腺癌、非小細胞肺癌、または
膀胱癌などの任意のタイプの癌状態または腫瘍を監視することができる。また、
本方法は1 または複数の治療剤による処置を受けている患者に行うことができる
。したがって本方法は、使用しているある形態の治療法がもはや有効ではないか
どうかおよび/ または新しい治療法の有効性を決定するために使用することもで
きる。

【００９６】上記のアッセイを実施するために使用することができる試験キットも本発明の
一部である。これらのキットには、NY-ESO-1が発現されているかどうかを決定す
るために使用することができる個別の試薬、例えば一対のオリゴヌクレオチドプ
ライマー（例えば配列番号2 および3 または上述のオリゴヌクレオチド分子）お
よび抗体アッセイに役立つ試薬が含まれるべきである。これは、NY-ESO-1中に見
出される連続したアミノ酸の配列であって、抗体が結合できるエピトープを構成
するのに十分な長さの配列からなるペプチドまたはタンパク質であることが好ま
しい。また本キットは、アッセイを容易にする標識抗体などのさらなる試薬を含
有することもできる。

【００９７】上記のように本発明は、なかんずく、NY-ESO分子に対する「総合的」免疫応答
の認識に関する。その副産物の1 つは、癌治療の経過を監視できることである。
本発明の一部をなすこの方法では、治療を必要とする被検者に本明細書に記載す
るタイプのワクチン接種を施す。そのようなワクチン接種は、例えば表面にHLA/
ペプチド複合体を提示する細胞に対するT 細胞応答などをもたらす。また応答に
は、おそらくはT 細胞による細胞の溶解によって抗体惹起タンパク質が放出され
た結果として起こる抗体応答も含まれる。したがって、免疫応答を監視すること
によってワクチンの効果を監視することができる。上記のように、抗体価または
T 細胞数の増加はワクチンに伴う推移の指標であると解釈することができ、逆も
またそうである。したがって本発明のさらにもう1 つの側面は、ワクチンそのも
のまたはワクチンをその一部とする大分子に特異的な抗体の被検者におけるレベ
ルを決定することによって、ワクチン投与後のワクチンの有効性を監視する方法
である。

【００９８】ワクチンの効果は、ワクチンを接種された被検者のT 細胞応答を監視すること
によって測定することもできる。これらのインビトロ刺激T 細胞の前駆体頻度の
測定には、多くのアッセイを使用することができる。それらのアッセイには、ク
ロム放出アッセイ、TNF 放出アッセイ、IFN γ放出アッセイ、ELISPOT アッセイ
などがあるが、これらに限らない。前駆体T 細胞頻度の変化を測定して、ワクチ
ンの有効性と相関させることができる。使用することができるもう1 つの方法で
は、多量体型のMHC/ペプチド複合体を使用する。そのような複合体の一例は、参
照によって本明細書に組み込まれるDunbarら，Curr. Biol. 8:413-416 （1998）
の四量体型HLA/ペプチド- ビオチン- ストレプトアビジン系である。

【００９９】 NY-ESO-1タンパク質が癌などの病的状態に関係すると同定されたことから、上
述した方法の他に、多くの治療的アプローチも示唆される。上記の実験により、
抗体は本タンパク質の発現に反応して産生されることが証明された。したがって
本発明のさらにもう1 つの態様は、抗体（例えばヒト化抗体、抗体断片など）の
投与による、NY-ESO-1タンパク質レベルの異常を特徴とする状態の処置である。
これらの抗体は適当な細胞分裂抑制剤または細胞傷害剤で標識することができる
。

【０１００】 T 細胞を投与してもよい。例えば樹状細胞、リンパ球などの免疫応答細胞を使
ってインビトロでT 細胞を誘導した後、それを処置対象である患者に再灌流でき
ることに注目すべきである。

【０１０１】 T 細胞および/ または抗体の生成は、上述したエピトープなどの適切なT 細胞
またはB 細胞エピトープを提示して応答を引き起こす細胞（好ましくは非増殖性
になるように処置された細胞）を投与することによって達成することもできるこ
とに注意されたい。

【０１０２】治療的アプローチには、アンチセンス分子（好ましくは10〜100 ヌクレオチド
長の分子）を「ニート」で、または細胞への取り込みを容易にするためにリポソ
ームなどの担体に入れて患者に投与し、よってタンパク質の発現を阻害するアン
チセンス療法も含まれる。そのようなアンチセンス配列は適当なワクチンに、例
えばウイルスベクター（ワクシニアなど）、細菌コンストラクト（既知BCG ワク
チンの変形など）などに組み込むこともできる。

【０１０３】また、コア配列：LLMWIT（配列番号14）を有し、最初のL 残基の末端に少なく
とも1 つの追加残基（好ましくはセリン）を持ち（セリンがL に結合して-SL-を
形成している3 残基を持ってもよい）かつ0 〜4 個の追加アミノ酸をC 末端に持
つと定義づけられ、上述のようにHLA-A2分子に結合してCTL 応答を惹起するナノ
マー、デカマー、ウンデカマーであることができるペプチドも、本発明の一部で
ある。これらのペプチドは、HLA-A2陽性であり疾患との関連でNY-ESO-1を発現さ
せる患者への投与によって治療的に使用することができ、また診断的に、すなわ
ちHLA-A2陽性細胞が存在するかどうか、または関連するCTL が存在するかどうか
などを決定するために使用することもできる。

【０１０４】 HLA-A2分子はMHC クラスI 分子であり、ペプチドとクラスI 分子との複合体に
応答するT 細胞は一般にCD8 ⁺ 細胞である。T 細胞のもう1 つのサブセットであ
るCD4 ⁺ 細胞は、MHC クラスII分子とペプチドとの複合体に応答する。自己培養
樹状細胞によって提示された組換えNY-ESO-1に対するMHC クラスII拘束性CD4 ⁺
T 細胞応答は、メラノーマ患者で検出されている。具体的には、本明細書には記
載していない結果として、周知の技術を使ってCD4 ⁺ 細胞がPBL または血清試料
の他の細胞から分離された。次にそれらCD4 ⁺ 細胞を、NY-ESO-1タンパク質をパ
ルスしておいた樹状細胞と混合した。CD4 ⁺ 細胞の増殖が観察されたことから、
本明細書で論じる総合的免疫応答のもう1 つの切り口が明らかになった。したが
って、本発明のもう1 つの側面は、これらのCD4 ⁺ T 細胞、MHC クラスII分子に
結合するペプチド、およびそれらの治療的使用である。

【０１０５】配列番号7 によって定義されるペプチドは、配列番号14のコア配列によって定
義づけられるペプチドの典型例である。このペプチドは、上記のように、HLA-A2
分子に結合する。したがってこれはHLA-A2の「マーカー」であり、また上述のよ
うに、CTL の増殖を刺激するペプチド/MHC複合体の一成分である。

【０１０６】実施例からわかるように、ESO-1 はMHC クラスII分子、特にHLA-DR53と複合体
を形成するペプチドにもプロセシングされる。これらの分子は、上記Futakiらの
文献に記載のモチーフ（すなわちTyr 、Phe 、Trp またはLeu およびその3 アミ
ノ酸後にあるAla またはSer ）を満たす。このようなペプチドは少なくとも18ア
ミノ酸長でなければならず、25アミノ酸長を越えないことが好ましい。好ましく
は配列番号8 、9 、10、11、12および13などの18アミノ酸からなる。これらのペ
プチドはHLA-DR53陽性細胞の同定に役立つ。さらに、配列番号8 、9 および10な
どのペプチドの場合は、実施例に示すように、ヘルパーT 細胞の増殖を惹起する
ためにも使用できる。MHC クラスI 拘束性ペプチドに関して上述した応用例は全
て、これらのクラスII拘束性ペプチドにも適用できる。また、MHC クラスI/ペプ
チド複合体とMHC クラスII/ ペプチド複合体とを比較すると免疫応答の性質が異
なるので、両タイプのペプチドを例えば免疫組成物などに併用することにより、
複合的な免疫応答を生じさせることができる。したがって上記の応用例は全て、
クラスI 拘束性ペプチドだけを使って、またはクラスII拘束性ペプチドだけを使
って、またはそれらを併用して用いることができる。

【０１０７】本発明の他の特徴および応用例は当業者には明白であり、ここに説明する必要
はないだろう。

【０１０８】本明細書で使用した用語および表現は、説明を目的として使用されたものであ
って、限定を目的とするものではなく、これらの用語および表現の使用に、上に
示し説明した特徴またはその一部と均等なものを排除する意図はなく、様々な変
更態様が本発明の範囲内で可能であると考えられる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】様々な組織タイプにおけるNY-ESO-1抗原のRNA の発現パターンを示す図。

【図２】 NY-ESO-1 mRNA のノーザンブロット解析を示す図。NY-ESO-1 mRNA は精巣およ
び細胞株SK-MEL-19 には認められたが、他の様々な細胞および組織試料には見出
されなかった。

【図３】 NY-ESO-1の推定アミノ酸配列内で修飾を受ける可能性がある部位を示す図。

【図４】 NY-ESO-1の親水性プロット。アミノ末端の親水性ドメインおよび
カルボキシ末端近くの長い疎水性ストレッチが示されている。

【図５】 HLA-A2陽性、NY-ESO-1陽性、両方について陽性またはどちらにつ
いても陰性である様々な細胞を使ったCTL 溶解実験の結果を示す図。

【図６】 HLA-A2が配列番号1 由来ペプチドを提示する提示分子であること
を証明するデータ。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年７月１８日（２００１．７．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１０】配列番号１のヌクレオチド81〜416 によりコードされるNY-ESO
-1のアミノ酸10〜121 からなるタンパク質を使って前記抗体価を決定することを
含む請求項１に記載の方法。

【請求項１１】配列番号１のヌクレオチド81〜593 によりコードされるNY-ESO
-1のアミノ酸10〜180 からなるタンパク質を使って前記抗体価を決定することを
含む請求項１に記載の方法。

【請求項１２】前記試料が血液である請求項１に記載の方法。

【請求項１３】前記試料が血清である請求項１に記載の方法。

【請求項１４】配列番号2 および配列番号3 に記載のオリゴヌクレオチドを使
ったポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項９に記載の方法。

【請求項１５】前記ポリメラーゼ連鎖反応において、前記患者から採取した試
料を、それぞれが配列番号1 に記載の17〜50残基の連続するヌクレオチドからな
る一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることを含む請求項９に記載
に記載の方法。

【請求項１６】前記オリゴヌクレオチドのそれぞれが17〜25残基のヌクレオチ
ドからなる請求項１１に記載の方法。

【請求項１８】腫瘍の状況を決定するのに用いる試験キットであって、（i ）NY-ESO-1をコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズする一対のオリ
ゴヌクレオチド分子、および（ii）試料中のNY-ESO-1に対する抗体に結合するのに十分な、連続するNY-ESO-1
のアミノ酸配列を含むタンパク質含有分子、を個別に含む試験キット。

【請求項１９】前記（ii）に結合する抗体に特異的に結合する抗体の別個のタ
ンパク質をさらに含む請求項１８に記載の試験キット。

【請求項２０】前記一対のオリゴヌクレオチド分子が配列番号2 および配列番
号3 からなる請求項１８に記載の試験キット。

【請求項２１】前記タンパク質が配列番号１のヌクレオチド81〜416 によりコードされる NY-ESO-1の少なくともアミノ酸10〜121 を含有する請求項１８に記載
の試験キット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者イヤガーエルケドイツフランクフルトアムマイン、デー−60488、ステインバッヒャーホウル２−28 (72)発明者ストッカートエリザベスアメリカ合衆国ニューヨーク州 10021 ニューヨーク、ヨークアベニュー 1275 (72)発明者オールドロイドジェイアメリカ合衆国ニューヨーク州 10022 ニューヨーク、サードアベニュー 605 (72)発明者クヌスアレキザンダードイツフランクフルトアムマイン、デー−60488、ステインバッヒャーホウル２−28 (72)発明者チェンヤオ−ツェングアメリカ合衆国ニューヨーク州 10021 ニューヨーク、イーストシックスティーエイツストリート 525 Ｆターム(参考） 4B024 AA12 CA04 FA18 GA30 HA19 4B063 QA13 QA19 QQ42 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 NY-ESO-1を発現する腫瘍を持つ患者における癌状態の状況を
決定する方法であって、前記患者から採取した試料を、前記NY-ESO-1に特異的に
結合する抗体についてアッセイし、得られた値を、前記患者から採取した以前の
試料をアッセイすることによって得た以前の値と比較することを含み、両者間の
相違が前記癌状態の状況の変化を示す方法。
【請求項２】前記試料をウェスタンブロット法でアッセイすることを含む
請求項１に記載の方法。
【請求項３】 ELISA によってアッセイすることを含む請求項１に記載の方
法。
【請求項４】前記患者がメラノーマ、腺癌、非小細胞肺癌または膀胱癌を
患っている請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記患者が前記癌状態に関する治療的処置を受けている請求
項１に記載の方法。
【請求項６】前記状況が前記癌状態の進行である請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記状況が前記癌状態の縮小である請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記状況が前記癌状態の安定である請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記腫瘍がNY-ESO-1を発現させることをポリメラーゼ連鎖反
応によって決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】配列番号2 および配列番号3 に記載のオリゴヌクレオチド
を使ったポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記ポリメラーゼ連鎖反応において、前記患者から採取し
た試料を、それぞれが配列番号1 に記載の17〜50残基の連続するヌクレオチドか
らなる一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることを含む請求項９に
記載に記載の方法。
【請求項１２】前記オリゴヌクレオチドのそれぞれが17〜25残基のヌクレ
オチドからなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】 NY-ESO-1のアミノ酸10〜121 からなるタンパク質を使って
前記抗体価を決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】 NY-ESO-1のアミノ酸10〜180 からなるタンパク質を使って
前記抗体価を決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】前記試料が血液である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】前記試料が血清である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】腫瘍の状況を決定するのに用いる試験キットであって、（i ）NY-ESO-1をコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズする一対のオリ
ゴヌクレオチド分子、および（ii）試料中のNY-ESO-1に対する抗体に結合するのに十分な、連続するNY-ESO-1
のアミノ酸配列を含むタンパク質含有分子、を個別に含む試験キット。
【請求項１８】前記（ii）に結合する抗体に特異的に結合する抗体の別個
のタンパク質をさらに含む請求項１７に記載の試験キット。
【請求項１９】前記一対のオリゴヌクレオチド分子が配列番号2 および配
列番号3 からなる請求項１７に記載の試験キット。
【請求項２０】前記タンパク質がNY-ESO-1の少なくともアミノ酸10〜121
を含有する請求項１７に記載の試験キット。