FR2894584A1 - Nouveaux peptides et leurs applications biologiques - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet des peptides possédant notamment des propriétés de liaison à la protéine Nef, caractérisés en ce qu'ils renferment une séquence en acides aminés répondant à SEQ ID N°1 .W-P-a-W-L-Pdans laquellea est choisi parmi W, A, S ou D.
Description
Nouveaux peptides et leurs applications biologiques L'invention a pour
objet de nouveaux peptides liant en particulier la protéine Nef de VIH-1. Elle vise également leurs applications comme inhibiteurs des interactions de Nef avec ses partenaires dans les cellules infectées et, à ce titre, comme médicaments anti-rétroviraux.
La virulence du VIH résulte de son importante capacité IO réplicative ainsi que de son caractère pathogène mis en évidence dans des modèles animaux non permissifs à la réplication virale. Plusieurs produits de gènes viraux contribuent directement et indirectement à la pathogénicité, et sont impliqués dans le développement d'un syndrome 15 d' immunodéficience acquise (SIDA).
Parmi ces protéines, Nef constitue une cible d'intérêt. De nombreux partenaires cellulaires de Nef ont été identifiés dont les protéines cellulaires à domaine SH3. L'implication de 20 Nef dans le cycle viral et son rôle important en font donc une cible de choix contre laquelle il n'existe aujourd'hui aucun inhibiteur connu. L'ensemble de ces arguments a conduit les inventeurs à proposer la protéine Nef comme une cible virale d'importance majeure, et à développer des inhibiteurs 25 susceptibles d'interférer avec ses fonctions biologiques, et par extension, avec la réplication et la pathogénicité du virus VIH-1, d'une part, et avec l' immunogénicité des cellules infectées, d'autre part.
30 En particulier, la mise en évidence d'une séquence consensus chez des peptides obtenus par la technique de phage-display et caractérisés, permet de disposer de composés inhibiteurs de Nef de grande valeur et fournit les moyens pour développer une approche de modélisation de drogues ciblant les surfaces 20 25 30 moléculaires complémentaires entre la protéine Nef et les peptides.
L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux peptides capables de cibler spécifiquement des régions de Nef impliquées dans l'infection par VIH-1.
Elle vise également à fournir des moyens permettant d'obtenir de tels peptides. L'invention a également pour but la mise à profit des propriétés inhibitrices de Nef de ces peptides et vise leurs applications thérapeutiques.
15 Les peptides de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils renferment une séquence en acides aminés répondant à SEQ ID N 1 . W-P-a-W-L-P dans laquelle
a est choisi parmi W, A, S ou D.
Des peptides de l'invention présentant cette séquence répondent à l'enchaînement en acides aminés SEQ ID N 2 :
b - W - P - a - W - L -P -c - d -f dans lequel
b = R/T ou est absent a est tel que défini ci-dessus c = Q , T, L, G, H ou est absent d = L, W, A ou est absent 10 2894584 f = P ou est absent. Des peptides de ce groupe sont des peptides décamériques et répondent aux séquences SEQ ID N 3. A SEQ ID N 7 suivantes : SEQ ID N 3 N T W P W W L P T L SEQ ID N 4 : Y R W P A W L P L W SEQ ID N 5 : N W R W P W W I P G SEQ ID N 6 T W P W 'W L P H A P ]0 SEQ ID N 7 W P S W L P Q L P F De manière avantageuse, ces peptides se lient à Nef avec une affinité de l'ordre du micromolaire. 15 D'autres peptides répondent aux séquences SEQ ID N 8 à SEQ ID N 13 suivantes : SEQ ID N 8 : W P S W L P Q SEQ ID N 9 W P S W L P 20 SEQ ID N 10 : W P W W L P SEQ ID N 11 : W P A W L P SEQ ID N 12 : W P D W L P SEQ ID N 13 : W P S W L P Q L P 25 Les peptides de l'invention sont aisément obtenus en mettant en oeuvre les techniques classiques de synthèse peptidique.
Les peptides de l'invention se fixent sur une surface moléculaire de Nef impliquée dans l'interaction de cette 30 dernière avec le domaine SH3 de Hck et la kinase PAK, et requise pour les fonctions de modulation de l'expression de surface des molécules du CMH de classe I et l'augmentation de l'infectivité virale par Nef.
Ces peptides sont alors des outils de choix pour être utilisés soit directement comme inhibiteurs soit pour développer des molécules chimiques à partir de leurs séquences en acides aminés et/ou de leurs données structurales.
Ils permettent en effet d'élaborer des molécules (peptides modifiés ou molécules chimiques) inhibant l'interaction de Nef avec certains de ses partenaires cellulaires, dont les protéines à domaine SH3, et ayant donc des effets sur les fonctions cellulaires et virales modulées par Nef via ces interactions, en particulier la propagation du virus VIH-1 chez l'hôte infecté.
Compte tenu de leurs propriétés, les peptides de l'invention 15 sont particulièrement appropriés pour constituer des principes actifs de médicaments anti-viraux.
L'invention vise donc également des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent une 20 quantité thérapeutiquement efficace de peptides tels que définis ci-dessus associés à des vecteurs pharmacologiquement acceptables. Ces compositions se présentent avantageusement sous des formes 25 appropriées pour une administration par exemple par voie orale ou injectable. On aura avantageusement recours pour l'administration par voie orale à des comprimés, cachets, gélules et pour 30 l'administration par voie injectable à des solutions stériles ou stérilisables, renfermant les quantités appropriées de peptides pour le traitement d'un patient donné.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent qui comportent des références aux figures 1 à 7, représentant, respectivement : la figure 1 : l'alignement des peptides liant Nefp1_57, la figure 2 : la réalisation de tests ELISA pour mesurer l'interaction entre Nef et les différents partenaires phage- SH3Hck ou les phages-peptide issus d'une banque de peptides, 10 - la figure 3 le déplacement des phages-peptides par Nefp1_57 et GST-SH3, la figure 4 : le déplacement des phages par des peptides de synthèse, la figure 5 l'activité cellulaire des peptides, 15 - la figure 6 le spectre 1H-15N HSQC, et la figure 7 : les spectres HSQC de Nef.
- La protéine Nef
20 La protéine Nef (Nef HIV-1 LAI) utilisée est une protéine recombinante purifiée à partir d'une protéine de fusion GSTNefp1_57 après clivage par la thrombine (Arold et al., 1997). La protéine Nefp1_57 a été délétée des résidus 1 à 57 car cette région n'est pas structurée en solution et a dû être clivée 25 pour permettre l'obtention de cristaux afin de résoudre la structure de la protéine.
Afin de réaliser les expériences de RMN hétéronucléaire, la protéine Nef est enrichie en 15N en la produisant dans E. coli 30 cultivée sur milieu minimum M9 où le chlorure d'ammonium est substitué par du 15NH4C1 (Eurisotop). 1. Construction d'un phage contrôle exprimant à sa surface la région RT du domaine SH3 de Hck
La région d'ADN codant pour les résidus 62 à 118 du domaine SH3 de Hck a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pBindHckSH3 et clonée dans le vecteur phagemidique pHenl (Hoogenboom et al., 1991) entre les sites des enzymes de restriction PstI et EagI. Ce phagemide permet, en présence d'un phage helper, d'exprimer le domaine SH3 fusionné en N- terminal de la protéine 3 (p3) à la tête du phage M13. Séquences SEQ ID N 14 et 15 des oligonucléotides utilisés : 5' SH3/Pstl SEQ ID N 14 : AATGCAAAACTGCAGGTGGTTGCCCTGTATG 15 3' SH3/EagI SEQ ID N 15 : TTTGTTCTGCGGCCGCGTCAACGCGGGCGAC Conditions de PCR1 . Le fragment codant pour le domaine SH3 de Hck a été amplifié 20 par PCR en utilisant 0,1 pl du plasmide pBindHckSH3, avec 0,5 U de Dynazyme Extend DNA polymerase (Finnzymes), 10 pmoles de l'amorce 5' SH3/Pstl et 10 pmoles de l'amorce 3' SH3/EagI, dans un volume de 50 p1 (94 C, 3 min; 94 C, 1 min; 60 C, 1 min ; 72 C, 1min ; 37 cycles puis 72 C, 10 min). Le fragment 25 de 196 pb a été purifié sur gel d'agarose 2% ( kit Qiaquick gel extraction , Qiagen), puis coupé dans un volume de 30 pl avec 5U de Pstl et 5U de EagI en présence de BSA, 16 h à 37 C. Les enzymes sont détruites 15 min à 65 C et le fragment d'ADN coupé (168 pb) est extrait au phénol/chloroforme puis 30 précipité à l'éthanol. Le fragment d'ADN est repris avec 10 pl d'H20 ultrapure puis contrôlé sur gel d'agarose 2%.
Préparation du vecteur : Deux pg de phagemide pHenl sont coupés dans un volume de 30 pl. avec 5U de PstI et 5U de EagI en présence de BSA, 16 h à 37 C. Le phagemide coupé est purifié sur gel d'agarose 0,7% (kit Qiaquick gel extraction , Qiagen). Les enzymes sont détruites 15 min à 65 C et l'ADN est extrait au phénol/chloroforme, puis précipité à l'éthanol. Le pHenl coupé est contrôlé sur gel d'agarose 0,7%, quantifié et repris dans 10 pl d'H20 ultrapure.
Ligature : Un pl de pHenl coupé par PstI et EagI est ligaturé avec 1 pl de fragment coupé par PstI et EagI dans un volume de 10 pl avec 200U de T4 DNA ligase (Biolabs) à 16 C, 17 h. La ligase est inactivée à 65 C, 15 min, et le produit de ligature est coupé par 5U de XhoI à 37 C pendant 4 h pour éliminer le vecteur résiduel non ligaturé, puis extrait au phénol/chloroforme, précipité en présence de 1 pg de glycogène et repris dans 10 pl d'H2O ultrapure. Un pl est utilisé pour transformer des cellules d'E. coli TG1 rendues compétentes par la technique au CaC12. Vérification des clones exprimant le domaine SH3 : La présence du fragment inséré dans le plasmide pHenl est vérifiée à partir des colonies isolées après transformation des cellules TG1 en réalisant des minipréparation d'ADN. Le plasmide recombinant pHenlSH3Hck est coupé par PstI et Eagl pour vérifier la taille du fragment inséré. Quelques clones possédant le fragment inséré sont séquencés sur séquenceur ABI 310 en utilisant l'oligonucléotide Fuse3p de séquence SEQ ID N 16 (5' CCCTCATAGTTAGCGTAACG) hybridant dans la région codant pour la protéine p3. Un clone possédant la bonne séquence est sélectionné pour vérifier la production de la protéine fusion 7 SH3-p3. Pour cela, une colonie isolée est inoculée dans 3 ml de 2YT / ampicilline 100 pg/ml / 2% glucose et incubée à 30 C avec agitation. Lorsque la culture atteint une DO600nm de 0,5, les cellules sont induites avec 0,lpM final d'IPTG (isopropyl- a-D-thiogalactopyranoside) et la culture est poursuivie à 30 C pendant 16 h. Un aliquot de la culture est prélevé et déposé sur un gel SDS/PAGE 10%. La présence de la protéine fusion SH3-p3 est révélée par Western blot avec l'anticorps monoclonal 9E10 reconnaissant l'étiquette c-myc localisée l0 entre le domaine SH3 et la protéine p3.
Ce phage contrôle, appelé phage-SH3, est utilisé comme témoin positif dans des ELISA où la protéine GST-Nefo1_57 ou Nefo1_57 biotinylée est adsorbée dans des puits de micoplaques. 2. Construction d'une banque de peptides décamèriques Une banque décamérique d'une diversité de 10$ clones a été construite par insertion d'oligonucléotides dégénérés dans un 20 vecteur phagique. A cette fin, le vecteur fd-tet-dogl (Hoogenboom et al., 1991) a été utilisé, ce vecteur présentant une résistance à la tétracycline et comportant tout le support génétique nécessaire à la synthèse de bactériophages. Des inserts dégénérés codant pour 10 acides aminés ont été 25 introduits en amont de la séquence codant pour la protéine mineure de la capside du phage, la protéine p3.
Le site de clonage est situé entre la séquence signal de la protéine p3 et la protéine p3 du phage. L'insert a été choisi 30 de manière à conserver les séquences nucléotidiques codant pour les acides aminés situés en aval de la séquence signal afin d'optimiser le clivage enzymatique par la peptidase endogène. La partie randomisée (NNK)10 a été choisie de manière à limiter la présence de codons STOP. 15 Préparation du vecteur de clonage : La forme réplicative (RF) du phage fd-tet-dog a été purifiée sur gradient de césium selon le protocole décrit dans Maniatis et al. (1982). Cinq cents microgrammes de RF ont été clivés avec 700U d'enzymes de restriction ApaI et NotI (NE Biolabs, MA, USA) et purifiés par extraction au phenol puis précipitation à l'éthanol. l0 Préparation des fragments à insérer : séquences des oligonucléotides SEQ ID N 17 et 18 : 31 : 5' CGTCATACCTTCGATCAAGCACAGTGCACAG 77 : 5' CCCTTCAACAGTTTCTGCGGCCGCACCACC(MNN)10CTGTGCACTGTGCTTGAT 15 Deux cents picomoles de chacun des oligonucléotides 31 et 77 sont hybridés dans un volume final de 100pl contenant 1 MM de dNTP et 20 U de Dynazyme (Finn-zymes, Helsinki, Finland), puis dénaturés à 95 C pendant 3 min. Une élongation est réalisée par 30 cycles successifs (48 C 1 min et 72 C 1 min). Le 20 produit d'élongation est traité 2 fois au phénol/chloroforme précipité à l'éthanol et clivé avec les 10 U de chacune des enzymes Apal et NotI pendant 16 h à 37 C. Les fragments d'ADN sont ensuite purifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 15%. A cette fin, la bande correspondant au 25 poids moléculaire attendu est excisée et purifiée par diffusion dans du PBS pendant 16 h à 20 C sous agitation. Ligature Cinq microgrammes de fragments sont ensuite ligaturés avec 300 30 microgrammes de vecteur en présence de 6 U de ligase (NE BioLabs, MA, USA) dans un volume final de 200 pl pendant 16 h à 20 C. Le produit de ligature est extrait au phénol, précipité à l'éthanol et repris avec 300 pl de TE. Quarante pl5 de cellules XL1-blue sont électroportées avec 2 pl du produit de ligature en utilisant un micropulseur (Bio-Rad, CA, USA) à 1700 volts/cm, 200 ohms, 25 pF pendant 5 msec et des cuves de 0,1 cm. Les cellules sont ensuite incubées pendant 1 h à 37 C dans 1 ml de 2YT contenant 20 pg/ml de tetracycline, puis étalées sur des boîtes agar/2YT/tetracycline et incubées 16 h à 37 C. Cent cinquante électroporations sont ainsi réalisées.
La diversité de la banque a été vérifiée par séquençage de l'ADN d'une centaine de clones en utilisant l'amorce oligonucléotidique Fuse-3p SEQ ID N 16 (CCCTCATAGTTAGCGTAACG) au moyen d'un séquenceur ABI Prism (Applied Biosystems, CA, USA). La banque obtenue est d'environ 108 clones différents. 3. Sélection de peptides liant Nefo1_57 par phage-display Les peptides liant NefAl_57 ont été sélectionnés par la technique du phage display à partir de la banque de peptides.décamérique construite comme indiqué ci-dessus. Biotinylation de la protéine Nefo1_57
Cinq cents pg de la protéine Nefg1_57 sont dialysés contre du PBS pendant 16 h à 4 C et biotinylés avec de la biotine selon 25 les recommandations du fabricant (Biotin Protein Labeling Kit, Roche Diagnostic, Bale, Suisse). La concentration de la protéine biotinylée est mesurée par colorimétrie (Kit Biorad, CA, USA). L'efficacité de la biotinylation est vérifiée par ELISA en utilisant des microplaques adsorbées avec de la 30 streptavidine (ThermoLabsystem, Helsinki, Finlande) et en révélant la protéine avec un anticorps monoclonal anti- NEF (MAT00020, Transgene) et un anticorps secondaire anti-anticorps de souris couplé à la phosphatase alcaline.20 Production des phages-peptide.
Un aliquot de la banque (cellules XL1-blue contenant les phages-peptide) est incubé 16 h à 37 C dans 500 ml de 2YT/ tetracycline 20 pg/ml avec agitation, puis centrifugé 2 fois à 6000 g pendant 10 min à 4 C. Le surnageant de culture contenant les phages-peptide est précipité avec 1,5 vol de 16,7% (poids/volume) de PEG 8000/NaCl 3,3 M pendant 16 h à 4 C, puis centrifugé à 12000 g, 20 min à 4 C et le culot est repris avec 50 ml de PBS (0,14 M NaCl ; 0,01 M tampon Phosphate, pH 7,4). Une deuxième précipitation est réalisée dans les mêmes conditions, mais pendant 1 h. Le culot est repris avec 1 ml de PBS. La solution est filtrée sur filtre 0, 45 pm et conservée à 4 C. Elle contient environ 1013 phages-peptide. Sélection des phages-peptide. Trois ou 4 tours de sélection et d'amplification sont réalisés pour isoler les phages-peptide spécifique de Nefo1_57.
A chaque tour, 20 pg de Nefo1_57 biotinylée sont incubées avec 25 1011 phages (10 pi) dans 500 pl de PBS contenant 4% (poids/volume) de poudre de lait écrémé (PBS/lait) pendant 1 h à 20 C avec agitation. Un mg de billes magnétiques recouvertes de streptavidine (Dynabeads M-280 Streptavidin ; Dynal Biotech, Oslo, Norvège) sont préalablement incubées 1 h à 20 C 30 avec du PBS/lait est ensuite ajouté pendant 30 min à 20 C avec agitation. Les billes sont lavées 5 fois avec du PBS/lait, 5 fois avec du PBS/0,1% Tween-20 et 5 fois avec du PBS et finalement resuspendues avec 100 pl de PBS. Les phages-peptide sont amplifiés en infectant des cellules bactériennes 1120 TGl(O(lac-pro), supE, thi, hsdD5/F', traD36, proAB, lacIq, lac ZLM15) dans 100 ml de 2YT/ tetracycline 20pg/ml pendant 16 h à 37 C. Une portion est étalée sur des boîtes agar/2YT/tetracycline pour obtenir des colonies isolées. 5 Après 3 ou 4 tours de sélection/amplification les colonies isolées sont mises en culture dans des puits de microplaques (Nunclon, Milian, Geneve, Suisse) pendant 16 h à 37 C. Les plaques sont ensuite centrifugées (1000 g) et les surnageants 10 contenant les phages-peptides sont analysés par ELISA pour déterminer leur spécificité. Les régions des ADN des phages positifs en ELISA correspondant à la région codant pour les peptides ont été séquencées. Cinq séquences différentes SEQ ID N 3 à 7 ont été obtenues et ont permis de définir une séquence 15 consensus SEQ ID N 2 (Figure 1). 4. Synthèse des peptides Les cinq peptides décamériques les plus affins pour Nef 20 sélectionnés par la technique de phage-display précédemment décrite, ont été synthétisés. Puis, d'autres peptides de tailles variées, analogues ou homologues au motif consensus découvert, ont également été synthétisés en utilisant la méthode générale suivante. 25 Des peptides de type H2N-aan-... aal- CONH2 " ont ainsi été préparés de manière semi-automatique sur phase solide, grâce à un robot de synthèse en chimie parallèle ACT 400 possédant des plaques 40 et 96 puits. Le support solide utilisé est une résine Rink-Amide 100-200 mesh permettant une synthèse automatique par une stratégie conventionnelle de type fmoc. 30 De manière totalement automatique, le premier fmoc-aminoacide aal est dans un premier temps accroché sur le support solide (100 à 200 mg de résine par puit). Pour le couplage le robot distribue dans chaque puit les solutions suivantes : (i) une solution de HBTU 0.5 M dans du DMF, (ii) une solution de N-méthylmorpholine 1M dans du DMF, et (iii) une solution de l'aaz à 0.5M dans du NMP. Le mélange réactionnel est agité pendant 90 minutes, puis une série de lavage (DMF, NeOH, DCM, DMF) est effectuée automatiquement avant de procédé à un double couplage avec le même aminoacide. La chaîne latérale du premier aminoacide ainsi que celle de tous les aminoacides qui seront incorporés au cours de la synthèse sont protégées par différents groupements protecteurs conventionnels acidolabiles de manière permanente, et ce jusqu'au décrochage final du peptide.
Dans un deuxième temps, et de manière toujours automatique, le premier aminoacide greffé est déprotégé en N-terminale de sa fonction fmoc par une solution de pipéridine 20% dans le dichlorométhane. Après différents lavages successifs, le premier aminoacide est ensuite couplé à l'aminoacide suivant dont la partie aminée terminale est protégée par un groupement fmoc. Pour le couplage, le robot distribue dans chaque puit les solutions suivantes : (i) une solution de HBTU 0.5 M dans du DMF, (ii) une solution de N-méthylmorpholine 1M dans du DMF, et (iii) une solution de l'aa2 à 0.5M dans du NMP. Le mélange réactionnel est agité pendant 90 minutes, puis une nouvelle série de lavage est effectuée avant de procéder à un double couplage avec le même aminoacide. Les cycles de déprotection du groupement fmoc, de couplage de l'aminoacide suivant sont alors répétés de manière automatique jusqu'à couplage et déprotection du dernier aminoacide aan.
Dans une dernière étape, le clivage s'effectue de manière semi-automatique avec une solution de TFA/H20/TIS 95/2.5/2.5 sous agitation pendant 2 heures. Les peptides sont ensuite précipités à l'éther, centrifugés, et le surnageant est ensuite éliminé. L'opération est renouvelée 3 fois, puis l'éther est évaporé. Le peptide est alors dissous dans une solution de H20/Acétonitrile 50/50 avant d'être lyophilisé.
Cette synthèse automatisée a permis de concevoir des peptides amides. Si souhaité par l'utilisation d'une résine de type PS-2-Chlorotrityle les analogues acides sont préparés. La pureté des peptides synthétisés est évaluée par un couplage LC-MS. Si besoin les peptides sont purifiés par HPLC préparative.
Afin d'évaluer la pénétration cellulaire des peptides et leur localisation sub-cellulaire, des peptides biotinylés qui pourront ensuite êtres détectés par une sonde appropriée (par exemple streptavidine-FITC) ont été synthétisés. Ces peptides sont tout d'abord synthétisés de manière semi-automatique sur phase solide par la stratégie fmoc précédemment décrite. Cependant, avant clivage de la résine, la fonction aminée N-terminale est déprotégée et un couplage manuel conventionnel de type peptidique est réalisé avec la biotine (Sigma-Aldrich , ref. 86,164-2). Le clivage de la résine correspond à l'étape finale, permettant de décrocher le peptide marqué du support solide. La pureté du peptide biotinylé est analysée par HPLC, LC-MS. Une étape de purification par HPLC préparative peut être ensuite réalisée en fonction de la pureté observée. 5. Spécificité des peptides Des ELISA ont été développés selon lesquels : • soit la protéine Nefo1_57 fusionnée à la GST est directement adsorbée dans les puits de microplaques, • soit la protéine Nefo1_57 clivée de la protéine GST par la thrombine est biotinylée, puis adsorbée dans des puits de microplaques recouverts de streptavidine (Figure 2). Un premier contrôle positif a consisté à incuber le puit avec un anticorps monoclonal anti-Nef (MATG0020) et à révéler l'interaction Nefo1_57/anti-Nef avec un anticorps secondaire anti-anticorps de souris marqué à la peroxidase. Un deuxième contrôle positif utilise le phage-SH3. Après addition dans des puits adsorbés avec Nefo1_57, le phage-SH3 a été incubé avec un mAb anti-phage (protéine p8 du phage), puis l'interaction révélée avec un anticorps secondaire anti-anticorps de souris marqué à la phosphatase alcaline.
Pour les ELISA de compétition, les compétiteurs Nefo1_57, GST-15 SH3 ou les peptides de synthèse sont ajoutés à différentes concentrations aux phages. Les phages-peptide 07B2S3 (I)et 08B2S3 (•) issus de la banque décamèrique et le phage contrôle SH3-Hck (B) liés sur Nefol_57 20 sont caractérisés de la même façon par un ELISA de compétition (Figure 3). Les puits adsorbés avec NefAi_57 biotinylée (Fig. 3A) ou GST-Nefol_57 (Fig. 3B) sont incubés avec 1011 phages unitaires, puis avec différentes quantités de Nefo1_57 ou le domaine SH3 de Hck fusionné à la protéine GST, utilisés comme 25 compétiteur. De très faibles quantités de Nefo1_57 sont suffisantes pour déplacer l'interaction Nefol_57/phage-peptide et révèle des IC50 de l'ordre du micromolaire. Des résultats équivalents sont obtenus avec les autres phages-peptide.
30 L'affinité et la spécificité des phages-peptide ont aussi été déterminées par un ELISA de compétition en utilisant des peptides de synthèse (Figure 4). Le phage-peptide 08B2S3 (+) issus de la banque décamèrique et le phage contrôle SH3-Hck (•) liés sur Nefol_57 sont déplacés dans un ELISA par compétition avec le peptide 2 de synthèse. Des résultats équivalents sont obtenus avec les autres phages-peptide et les autres peptides. Les autres peptides décrits dans la figure 1 présentent une courbe tout à fait équivalente à celle obtenue avec le peptide 2. Des IC50 de l'ordre du micromolaire ont en effet été mesurées.
La spécificité des peptides peut aussi être déterminée directement à partir d'extraits cellulaires. Des lysats de 10 cellules COS-7 exprimant Nef sont incubés avec la protéine de fusion GST-SH3116: en présence de quantités croissantes du peptide. Le mélange est ensuite déposé sur une colonne d'affinité spécifique de la GST. La colonne est ensuite lavée et l'extrait élué est analysé par SDS-PAGE et immunoblotting 15 anti-Nef. On déduit ainsi une valeur d'IC50 pour les peptides inhibiteurs de l'interaction Nef-SH3 dans un contexte cellulaire de protéine Nef native.
6. Activité cellulaire des peptides : double-hybride en 20 cellules de mammifère et FACS
Un test cellulaire reposant sur le principe du double-hybride adapté aux cellules de mammifère a été développé, permettant d'évaluer l'activité cellulaire des peptides capables de 25 pénétrer la membrane plasmique. Ce test permet d'intégrer les paramètres de toxicité cellulaire et de bio-disponibilité grâce à une lecture quantitative et fonctionnelle de l'interaction entre deux partenaires protéiques.
30 Le système commercial CheckMateTM (Promega) a été adapté au couple Nef VIH-1 (Lai) / SH3-Hck en culture de cellules COS-7 (Figure 5). Ce système combine l'expression de la luciférase firefly sous la dépendance de l'interaction entre Nef et le domaine SH3 de Hck, et celle, indépendante, de la luciférase5 renilla, témoin de la viabilité cellulaire. Le ratio d'intensité de ces deux luciférases permet de quantifier l'activité d'un compétiteur de l'interaction Nef-SH3 capable de pénétrer à l'intérieur de la cellule et dont la demi-vie est suffisante dans l'intervalle de temps de l'analyse. D'autres interactions protéiques sont également reconstituées dans ce test l'une, non-SH3 (entre Id et MyoD), afin d'exclure les composés présentant une activité non-spécifique sur l'expression de la luciférase, et l'autre entre le SH3 de Hck et la protéine SAM68, afin d'identifier les composés qui interagissent via le domaine SH3 et non via Nef.
Les cellules sont transfectées en utilisant le Fugene6 (Roche), selon le protocole du distributeur. Brièvement, les plasmides PG5 (300 ng), pAct ou pActNef (400 ng), pBindHckmuté ou pBindHck (100 ng) et pbcks (200 ng) sont mélangés, puis le Fugene 6 (3 pl dilué dans 100 pl du milieu de culture DMEM) est ajouté. Le mélange plasmides/Fugene6 est laissé en réaction pour une durée de 15 min à température ambiante, puis est déposé goutte à goutte dans le puit de culture cellulaire.
Après 24H d'expression, les cellules sont récoltées par un traitement à la trypsine (Gibco, réf 25300-054), lavées puis réparties dans des plaques 96 puits (référence 353072, Beckton Dickinson) à raison de 20 puit de plaques 96 puits par puit de plaque 6 puit transfecté et de 50 pl de milieu DMEM/puit de plaque 96 puit.
L'activité d'un composé inhibiteur candidat est testée en ajoutant 25 pl de ce composé dilué dans le puit contenant déjà 50 pl de la culture cellulaire, et l'activité luciferase est déterminée 24H plus tard dans chaque puit en utilisant la trousse de dosage DualGlo selon les recommandations du fournisseur (Promega). 7. Cartographie de la zone d'interaction des peptides sur Nef S Des spectres 15N-1H HSQC de la protéine 15N-Nef ont été enregistrés sur un spectromètre RMN 500MHz (DRX 500 Bruker) à 308K. Les conditions de la préparation d'échantillon sont identiques à celles utilisées par Grzesiek et al. en 1997, l0 pour l'attribution des spectres RMN hétéronucléaires . La concentration de Nef dans les échantillons est 0,1mM (Figure 6), tris 5mM pH 8.0, 5mM DTT.
L'attribution des corrélations correspondant au groupement de 15 chacun des NH de la protéine est indiquée sur le spectre. Les peptides 2, 4, 5 et 9c sont repris dans 20pl d'éthanol deutéré à une concentration de 5mM. L'ajout de peptides est réalisé avec deux excès de peptides (10pl) par rapport à Nef (Figures 7A à 7D). Le peptide non marqué n'est pas observable dans le 20 spectre, seuls les pics de corrélation 1H/15N desgroupements amides de chacun des acides aminés de la protéine sont observables. Le spectre de référence est le spectre de Nef en présence de 10pl. d'éthanol deutéré. L'ajout de peptide va entraîner une modification de la fréquence de résonance du 25 proton et/ou N des groupements amides situés dans la zone 15 d'interaction. L'attribution de ces résonances étant connue, on peut alors déduire les acides aminés impliqués dans la zone d'interaction. La nature de ces variations spectrales permet de vérifier si la zone d'interaction correspond bien à celle 30 du domaine SH3 de Hck. L'analyse de ces données confirme que les peptides testés interagissent bien sur Nef dans la zone d'interaction de SH3, de plus les différences observées entre les spectres en présence des différents peptides indiquent des géométries de fixation légèrement différentes. 8. Etudes structurales par cristallographie. La méthode de "trempage" est utilisée pour déterminer la structure des peptides en complexe avec Nef. Pour cela, des cristaux de Nef:1-56 et NefEl-57ont été produits comme précédemment décrit (Arold et a1., 1997). Après avoir atteint une taille suffisante pour une analyse crystallographique (> 100 DM), ces cristaux sont trempés pendant 1-24h dans une solution contenant entre 1-5 mM de peptide. La présence de canaux de solvant ainsi que l'arrangement des molécules NefDl- 56/ Nef:1-57 dans cette forme cristalline permettent en effet l'accès de petites molécules à la zone d'interaction Nef - peptide cartographiée par RMN (décrite ci-dessus). Les cristaux ainsi préparés sont analysés par diffraction dés rayons X.
9. Virologie L'étude de l'influence positive de Nef sur la réplication virale est effectuée par des techniques classiques permettant de mesurer les capacités infectieuses du VIH-1 (Craig et a1., 1998; Madrid et a1., 2005). Les analyses initiales sont réalisées à l'aide d'un provirus prototype de laboratoire, VIH-1 pNL4-3. Brièvement, l'effet des peptides inhibiteurs de Nef sera évalué sur les virions produits par transfection transitoire de cellules 293T par le provirus sauvage et utilisés pour infecter des cellules cibles HeLa-CD4 (clone P4) contenant une copie intégrée du gène LacZ sous la dépendance du LTR du HIV-1. 48 h après infection, le pouvoir infectieux des virus est évalué par comptage des cellules exprimant une activité R-galactosidase.
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Claims (6)
1-Peptides possédant notamment des propriétés de liaison à 5 la protéine Nef, caractérisés en ce qu'ils renferment une séquence en acides aminés répondant à SEQ ID N l : W-P-a-W-L-P 10 dans laquelle a est choisi parmi W, A, S ou D.
2-Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce 15 qu'ils répondent à l'enchaînement en acides aminés SEQ ID N 2 : b - W - P - a - W - L -P -c - d -f dans lequel b = R/T ou est absent a est tel que défini ci-dessus c = Q , T, L, G, H ou est absent d = L, W, A ou est absent f = P ou est absent.
3-Peptides selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'il s'agit de peptides décamériques répondant aux séquences SEQ ID N 3 A SEQ ID N 7 suivantes : SEQ ID N 3 : N T W P W W L P T L SEQ ID N 4 : Y R W P A W L P L W SEQ ID N 5 : N W R W P W W I P G SEQ ID N 6 : T W P W W L P H A P 20 25 JOSEQ ID N 7 : W P S W L P Q L P F
4-Peptides selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils répondent aux séquences SEQ ID N 8 à SEQ ID 5 N 13 suivantes : SEQ ID N 8 : W P S W L P Q SEQ ID N 9 WPSWLP SEQ ID N 10 WPWWLP 1 0 SEQ ID N 11 W P A W L P SEQ ID N 12 WPDWLP SEQ ID N 13 W P S W L P Q L P
5-Utilisation des peptides selon l'une quelconque des 15 revendications 1 à 4, pour développer des molécules chimiques à partir de leurs séquences en acides aminés et/ou de leurs données structurales.
6-Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce 20 qu'elles comprennent une quantité thérapeutiquement efficace de peptides tels que définis ci-dessus associés à des vecteurs pharmacologiquement acceptables.
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