JP2002502354A

JP2002502354A - 分子を同定又は単離する方法及びそれによって同定された分子

Info

Publication number: JP2002502354A
Application number: JP50197297A
Authority: JP
Inventors: プフロイントシュー，ミヒャエル; ランメンゼー，ハンス−ゲオルク
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2002-01-22
Also published as: CA2223566A1; US5698396A; ATE222116T1; ES2180782T3; DE69627056D1; DK0831879T3; CA2223566C; DE69623014D1; CN1190894A; WO1996040209A1; PT831879E; AU6165296A; ATE235248T1; CN1136914C; EP0831879B1; US5798264A; DE69627056T2; EP0831879A4; AU704109B2; EP0831879A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、標的分子と、それをコードする核酸分子、及びそれに対する結合パートナーを同定する方法を記載したものである。ｃＤＮＡライブラリーが前記標的分子を発現する細胞から作成され、宿主細胞中で発現される。前記宿主細胞の溶解物が、障害となる結合パートナーを除去するべく処理されたサンプルで、スクリーニングされる。この処理は、前記サンプルを、トランスフェクションされていない宿主細胞、及びｃＤＮＡラインブラリーを作るために使用したものと同一のベクターでトランスフェクション又はトランスフォーメーションされた宿主細胞と接触させることからなる。この方法を使用して同定された抗原とｃＤＮＡも、本発明の一部を構成する。

Description

【発明の詳細な説明】分子を同定又は単離する方法及びそれによって同定された分子関連出願本出願は、共に係属中であり、かつここに参考文献としてその内容が合体される、１９９５年６月７日出願の第０８／４７９，３２８号の一部継続出願である、１９９６年１月３日出願の第０８／５８０，９８０号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、標的分子を同定する方法に関する。特に好適な実施例に於いて、本発明は、ガン（メラノーマ又は腎ガン等）、ホジキン病、自己免疫疾患、等の病理的状態に関連する分子の同定に関する。この本発明の方法の結果発見された、提示ペプチド等の、単離分子、も本発明の一部を構成する。これらの分子は、特に、タンパク質含有分子、これらをコードする単離核酸分子、及び、前記タンパク質含有分子に特異的に結合する抗体を含む。便宜上、ここに記載する方法を、以後、「血清学的フィッシング（serological fishing）」と称する。背景及び従来技術感染症、ガン、自己免疫疾患、等の多くの病理的状態は、ある種の分子の不適切な発現によって特徴付けられるということがかなり確立されている。これらの分子は、従って、或る特定の病理的又は異常状態に対する「マーカー」として役立つ。これらの異常状態を診断するための、診断用「標的」、即ち、同定すべき物質、としてのそれらの利用に加えて、これらの分子は、診断及び／又は治療剤を作るのに利用可能な試薬としても、役立つ。この非限定的な具体例は、特定のマーカーに対して特異的な抗体を作り出すためのガンのマーカーの利用である。更に別の非限定的な具体例は、異常細胞に対する細胞溶解性Ｔ細胞を作り出すための、ＭＨＣ分子と複合体を形成するペプチドの利用である。もちろん、このような物質の調製は、これらを作り出すのに使用される試薬の供給源の存在を前提としている。細胞からの精製は、それを行うのに、確実な方法がなく、手間のかかるものである。別の好適な方法は、特定のマーカーをコードする核酸分子を単離して、その後、この単離されたコード分子を使用して所望の分子を発現させる方法である。今日まで、このような抗原、たとえば、ヒトの腫瘍における抗原、の検出に、二つの方法が採用されてきた。これらを、以後、遺伝子学的アプローチと生化学的アプローチ、と称する。遺伝子学的アプローチは、たとえば、ここに参考文献としてその内容を合体させる、デ・プレーン（ＤｅＰｌａｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２２７５（１９８８）によって例示される。このアブローチでは、腫瘍から得られたｃＤＮＡライブラリーのプラスミドの数百のプールが、ＣＯＳ細胞等の受容細胞、又は、特異的抗原の発現についてテストされる腫瘍細胞ラインの抗原−陰性バリアント、にトランスフェクションされる。たとえば、共に参考文献として本出願にその内容が合体される、フォーク（Ｆａｌｋ）他，Ｎａｔｕｒｅ３５１：２９０（１９９１）及びカワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）他，Ｎａｔｕｒｅ３６９：６９（１９９４）によって例示される、生化学的アプローチは、腫瘍細胞のＭＨＣ−Ｉ分子に結合したペプチドを酸によって溶離し、その後、逆相高性能液体クロマトグラフィー（Ｒ−ＨＰＬＣ）を行うことに基づくものである。抗原性ペプチドは、それら（抗原性ペプチド）が抗原プロセッシングを行うことができない突然変異細胞ラインの空のＭＨＣ−Ｉ分子に結合し、細胞溶解性Ｔ−リンパ球に於ける特異的反応を誘発した後に、同定される。これらの反応は、ＣＴＬ増殖、ＴＮＦ放出、及び、ＭＴＴアッセイ又は、⁵¹Ｃｒ放出アッセイに於いて測定可能な、標的細胞の溶解を含む。抗原の分子決定に対するこれら二つのアプローチには、以下の欠点がある。第１に、それらは、非常にわずらわしく、時間がかかり、かつコスト高であり、第２に、それらは、予め決定された特異性を有する細胞溶解性Ｔ細胞ライン（ＣＴＬ）の確立に依存し、第３に、それぞれのＣＴＬは、それぞれの病気をわずらう患者からだけでなく、そのＴ細胞レパトアに依っては健康な個人からも入手可能であるため、問題となる疾患又は病気の経過に対するそれらイン・ヴィヴォでの関連性はまだ証明されていない。抗原の同定と分子決定とに対する前記二つの公知のアプローチに固有の問題は、これまで、両方の方法が、ヒトの腫瘍において非常に少数の抗原しか特定することに成功していないという事実によってもっとも良く示されている。ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３−１６４７（１９９１）；ブリチャード（Ｂｒｉｃｈａｒｄ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−４９５（１９９３）；クーリ（Ｃｏｕｌｉｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５−４２（１９９４），カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３５１５−３５１９（１９９４）参照。腫瘍関連抗原の検出のためだけでなく、すべての異常又は病理的状態に関連する分子を特定するのにも使用可能な方法が得られることが望まれている。このような方法に依れば、又、そのような分子の同定が容易となり、これによって、たとえば、抗体、細胞溶解性Ｔ細胞等の作成に於けるそれらの利用が可能となる。従って、本発明の目的は、疾病の分子診断および／又は、感染性、自己免疫疾患及び悪性疾患の免疫療法及び遺伝子療法とに有用な、ヒトの組織、特に、腫瘍細胞中に於ける抗原の簡便な検出と分子キャラクタリゼーションとのための、方法と試薬とを開発することにある。本発明は、以下の開示において詳細に説明される。図面の簡単な説明図１は、本発明のアプローチの原理を示す、図２は、患者の血清の１：１００倍希釈物と反応する、腎臓明細胞ガン（rena l cell clear carcinoma）のｃＤＮＡに由来する陽性クローンを有するニトロセルロース膜を示している、図３は、腎細胞ガン、正常腎臓、及びその他のヒトの組織でのクローンＨＯＭ −ＲＣＣ−３１３のノザンブロット分析を棒グラフとして示している、図４は、ＨＯＭ−ＲＣＣ−３１３をコードする遺伝子の翻訳される領域を示している。好適実施例の詳細説明以下の開示は、血清学的フィッシングと称される方法を記載するものである。この方法に於いて、病理的状態を患う患者から細胞サンプルが採取される。細胞は、前記疾患に典型的なものが好ましい。たとえば、もしも患者がメラノーマを有する場合には、好適な細胞はメラノーマ細胞である。もしも患者が神経疾患を患っている場合には、たとえば、好適な細胞は、疾患細胞のサンプルである。このアプローチは、疾患細胞が、恐らく、問題のタンパク質含有分子、即ち、問題の病理的状態に特異的に関連する分子、の最良の供給源であるために、確実な（保証された）ものである。尚、病理的状態を表わす細胞のみが、本発明の方法に於いて使用可能な細胞ではないということに注目すべきである。たとえば、細胞の分化と成長とに関連する細胞「マーカー」を同定することが非常に重要である。例として造血幹細胞が銘記される。同様に、本発明は、たとえば特異的リガンドに対する受容体分子の単離を課題とする。要するに、この方法を使用して、すべての標的分子の存在をアッセイすることができる。次に、選択された細胞を使用して、相補的ＤＮＡ（即ち、ｃＤＮＡ）のライブラリーを作成する。この方法は、当業者にとって周知であり、ここで繰り返す必要はない。これは、もちろん、もしもタンパク質が細胞によって発現されていれば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が存在するはずである、という既に確立されている事実に基づくものである。これらのｍＲＮＡ分子は、寿命が長くはなく、不安定であるため、これらを用いて研究することは実用的ではない。ｃＤＮＡを使用した場合に分子に対してもたらされる安定性が、この方法にとって非常に役立つ。ｃＤＮＡが作成されると、これを使用して、ベクターライブラリーを構築する。要約すると、キャリアベクターを、ｃＤＮＡ分子を受取らせるために、たとえば、切断、スプライシング、等によって処理する。ベクターの選択は、当業者にとってはそのような多数の具体例が周知であるように、様々なものとすることができる。特に好適であるのは、ウィルスをベースとするベクターである。真核細胞の場合、レトロウィルス又はアデノウィルスをベースとするウィルスが好適である。このようなベクターは、長い末端反復配列（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｒｅｐｅａｔｓ”ＬＴＲｓ”）、プロモーター（たとえば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター）、エンハンサー、等のウイルスゲノムの全部又は一部を含む。宿主細胞が原核細胞である場合には、バクテリアウィルス、即ち、０ファージ、が好適である。このようなベクターの具体例としては、たとえば、ラムダファージ、をベースとするベクターがある。いずれの場合にも、ベクターは、複数のウィルスの要素を有することが可能である。その結果得られたベクターを、真核細胞又は原核細胞とすることができる宿主細胞に、トランスフェクション又はトランスフォーメーションする。このプロトコールに於いて、トランスフェクション又はトランスフォーメーションに通常使用されるすべての細胞を使用することができる。好適な材料として、大腸菌（E.coli）の菌株、ＣＨＯ−１等のＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７等のＣＯＳ細胞、等、が挙げられる。同様に、たとえば、サッカロマイセス（Saccharomyce s）の菌株、シュードモナス-アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）等のシュードモナスの（Pseudomonas）菌株、といった酵母細胞、バチルスバクテリア（Bacillus bacteria）、周知の昆虫宿主細胞スポドプテラ−フルギペルダ（Spo doptera frugiperda）、等のすべてを使用することができる。受容細胞が前記ベクターを受容すると、これらを培養して、外来のタンパク質含有分子を発現させる。ここで「タンパク質含有」という表現を使用する理由は、原核細胞はタンパク質のみを発現するのに対して、真核細胞は、周知のように、タンパク質を翻訳後修飾して、糖タンパク質、リポタンパク質等を産生する能力がある為である。又、ここで使用する「タンパク質含有」は、更に、ＭＨＣ分子によって提示されるペプチド等の、ペプチドをも含むものであると銘記されなければならない。次に記載するプロセスは、上述したプロセスとは独立して行うものであり、本発明のこれら二つの局面間に於いてなんら時系列的関係は意図されていない。ガン及び例えば自己免疫疾患等の疾病状態に於いて、その疾病に関連する分子に対ずるなんらかの免疫反応が存在する。この反応は、抗体応答、Ｂ細胞増殖、特定のＴ細胞亜細胞（subpopulations）の増殖、サイトカイン産生の増加、等を含む。前記応答に関連する分子および細胞は、血清等の患者の体液中に見出すことができる。免疫応答物質は、それが組換えによって産生されたものであれ、あるいは自己によって産生されたものであれ、いずれの場合にも、標的分子と反応する。問題は、それらを見つけることである。下記の諸例が示すように、これは、ユニークな方法で行われる。先ず、体液又は問題となるその他のサンプルを、トランフェクション又はトランスフォーメーションに使用されるものと同じ宿主細胞のサンプルと反応させる。この第１工程に於いて、前記宿主細胞は、トランスフェクション又はトランスフォーションされていないものである。この工程の効果は、標的分子以外の、前記宿主細胞に対して特異的なすべての免疫性結合パートナーを取り除くことである。この工程が必要である理由は、前述したように、宿主細胞が、なんらかの時点に於いて患者がそれ（宿主細胞）に対して免疫応答を起こしたものであるかもしれないからである。この第１除去工程によって、これらの免疫性要素が取り除かれる。次に、第２の除去工程を行う。この工程に於いて、前に第１除去処理を施したサンプルを、次に前述したように、同じ宿主細胞のサンプルと反応させるが、今回に於いては、宿主細胞は、患者からのｃＤＮＡを担持しないキャリアベクターで、トランスフェクション又はトランスフォーメーションされている。この第２除去工程を行う理由は、本発明者等の一人によって行われ、過去に於いて文献にはまだ報告されていない観察に依るものである。ファージ、ウィルス、等のベクターとして使用される物質は、これらが自然に細胞に感染するものである為に有用である。従って、ヒトの腸管下部に生息する大腸菌（E.coli）はラムダファージによって感染される。これまで、大腸菌に対する免疫応答は、これらの感染物質に対する応答を含むものとは考えられていなかった。従って、本出願人等が、前記二つの除去工程を行うことによって、前例の無い程度にまで障害となる免疫成分を除去する可能性を達成したことは驚くべきことである。前述したように、第１の工程は、トランスフェクションされていない、又はトランスフォーメーションされていない宿主細胞に対するものである。第２の工程は、ｃＤＮＡを担持しないベクターによってトランスフェクション又はトランスフォーメーションされた宿主細胞に対するものであり、ここで、このベクターは、前述の前記ｃＤＮＡを運ぶのに利用されるベクターと免疫学的に等価なものである。これらの除去工程のそれぞれを、複数の類似の、ただし、互いに異なった手順を使用して、行うことが特に好ましい。たとえば、下記の実験例は、固相カラムによる吸収と、その後の、ニトロセルロースペーパーによる吸収を示している。本出願人等は、なぜ二つの類似はするが互いに異なったプロトコールの使用によって、ここに記載する結果が得られるのかという理由についてどのような理論にも拘束されることを望むものではない。以後、ここで「サンプルを接触させる」という表現を使用する場合は、いつでも、それは一つの接触工程のみに限定されるものではなく、むしろ、検査対象のサンプルから障害となる結合パートナーを除去するように構成された１つ以上の、好ましくは互いに異なる接触プロトコールを指すものであってよいということが明記されるべきである。これらの除去工程は、前記ｃＤＮＡライブラリの作成に使用される前述した諸工程とは完全に独立して行われるものとすることができると銘記されるべきである。たとえば、抗原に対するテストを「０」日に行ったとすれば、サンプルの除去工程は、その前日、前の週、等に行うことができる。又、将来に於ける利用のために、ドナー又は患者から得た除去処理を施したサンプルを「保存」しておくことができる。使用するサンプルは好ましくは血清であるが、必ずしもそうである必要はない。免疫結合パートナーを含むどのようなサンプルも使用可能である。本発明の次の工程に於いて、前記ｃＤＮＡを坦持し、異種タンパク質を発現する、トランスフェクションされた細胞を溶解したものを、前述の二度の除去処理を施したサンプルと接触させる。このサンプルは、前記異種タンパク質に対して特異的な免疫成分のみを含有しているはずであり、それ（異種タンパク質）に対して結合するはずである。この結合は、前記細胞溶解物を、予め、たとえば、活性化フィルターペーパー、固相カラム、等に接触させることよって固定しておくと、より容易になるが、当業者は、かならず、標的分子の同定のために利用可能な多種多様なアッセイの形態を知っていることから、この固相結合は必ずしも必要なものではない。サンプル中の免疫成分が標的分子に結合すると、更に別の工程を行うことが望ましいが、この工程は必ずしも行わなくてもよい。この追加工程は、固定可能な標識を担持する、抗−ＩｇＧなどの、第１の免疫成分に対するなんらかの結合パートナーを使用するものである。この標識は、色素、酵素、金粒子、放射性同位元素標識、あるいはイムノアッセイに於いて使用されるすべての標準的な標識とすることができる。同定が行われた後は、前記標的分子を残して、免疫成分を除去する。次に、この標的分子について、本技術分野に於いて使用されるなんらかの標準方法を使用して研究する。当業者は、前記方法の結果として、更に、標的分子に結合する免疫成分が単離されるということを認識されるであろう。従って、本発明の別の態様に於いて、たとえば、標的分子に対して特定的な結合パートナーである、抗体を単離することができる。本発明によって同定、単離可能な更に別の免疫成分は、同定された分子に由来するペプチドと、これらペプチドと結合して複合体を形成するＭＨＣ分子とからなる複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞（以後、”ＣＴＬ”と称する）である。ＣＴＬ応答は、循環するＴ細胞の表面上に存在する、Ｔ細胞レセプター（ ”ＴＣＲ”）に依る、ＭＨＣ分子と、一般に約８−１２アミノ酸長、しかし最も好ましくは９又は１０アミノ酸長のペプチドとからなる複合体の認識を含む、ということが広く受け入れられている。ＴＣＲは、これら複合体に結合し、これら複合体に対して特異的なＣＴＬの増殖を含む一連の反応を、いわば、「引き起こす」はたらきを有する。本発明の方法と、更に別の工程とを使用することによって、このようなＣＴＬを産生および／又は単離することができる。後述する諸例および本開示一般に於いて示されるように、問題（標的）の抗原をコードするｃＤＮＡを容易に同定することができる。ｃＤＮＡが同定されると、これを利用して、その表面上に所望のＭＨＣ分子を既に提示しているか、もしくは、これらＭＨＣ分子をコードするＤＮＡでトランスフェクションされている宿主細胞をトランスフェクションする。問題の分子に対するｃＤＮＡが発現され、その分子がプロセッシングされて、ＨＬＡ分子等のＭＨＣ分子によって提示される抗原性ペプチドが生じる。前記複合体に対するＣＴＬは、自己リンパ球等の、リンパ球から得られる。また、応答物である細胞集団から、限界希釈法という周知技術によって、長期ＣＴＬクローンが得られる。陽性のＣＴＬ応答が観察されると、ＣＴＬに対して提示された特異的ペプチドを、たとえば、予め同定されたＣＴＬクローンに特異的なものをスクリーニングする、等の既に確立された方法を使用して、同定する。あるいは、より最近に記載されている方法、即ち、問題の分子の配列を調べて、潜在的ＭＨＣ結合モチーフの存在を同定し、次に、先ず、これらペプチドの、関連ＭＨＣ分子に対する結合能力を分析し、次に、もしもＭＨＣ結合に対して陽性であった場合に、これらペプチドの、そのペプチドＭＨＣ複合体を認識するＣＴＬを増殖させる能力を調べる、という方法を使用してもよい。もちろん、これらペプチドは、周知の技術を使用して、細胞から溶出して配列決定することも可能である。当業者に於いては、逆に、標的分子の発現を、それを発現した特定の単数又は複数の宿主細胞に関連付けることができるということも認識されるであろう。これを行う時、標的分子を発現したｃＤＮＡを取り出し、その配列を決定する、等を行うことができる。該方法のこの態様は、本発明の別の特徴構成である。本発明の具体的実施例を下記の諸例に示す。図１は、当該方法の概要を示している。例１ヒト組織からｃＤＮＡライブラリーを作成するために、０．５ｕｇの腎臓明細胞ガンからトータルＲＮＡを得て、ここに参考文献としてその内容が合体されるチョムジンスキー（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ），Ｊ．Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）の方法に従って作成した。ｍＲＮＡを、オリゴ−ｄＴ−セルロースを用いて、トータルＲＮＡから抽出した。ファーストストランドｃＤＮＡの合成を、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼＩを使用して、ガブラー（Ｇuｂｌｅｒ）およびホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ），Ｇｅｎｅ２５：２６３（１９８３）によって記載された方法によって行った。ｃＤＮＡのＫｌｅｎｏｗ酵素への適用のために、ＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを有するアダプターを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ｃＤＮＡの末端に結合させた（フェレッティ，エル（ＦｅｒｒｅｔｔｉＬ）およびスガメッラ，ヴィ（ＳｇａｍｅｒｅｌｌａＶ），Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．９：３６９５（１９８１））。酵素ＸｈｏＩによる制限酵素切断後、異なった長さのｃＤＮＡ分子を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ４００を使用して分離し、λＺＡＰＩＩファージベクターに導入した（ショート（Ｓｈｏｒｔ）他，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：７５８３（１９８８））。この組換えファージＤＮＡをライゲーション後、パッキング抽出物（packing extracts）を用いて、ファージ中にパッキングし、大腸菌バクテリアへのトランスフェクションに使用した。ライブラリーのタイター測定により、１．８ｘ１０⁸の組み換え一次クローンが得られた。トータルｃＤＮＡライブラリーを、大腸菌にトランスフェクションし、増幅させた。増幅後のｃＤＮＡライブラリーのタイターは、１ｍｌ当たり１０¹¹プラーク形成単位であった（ｐｆｕ／ｍｌ）。これらのトランスフェクションされた細胞を以下の実験に使用した。例２上述した本発明に依って、免疫原性物質の同定は、ネイティブな大腸菌および溶菌λファージによってトランスフェクションされた大腸菌に由来する抗原に対する抗体を完全に除去したヒト血清を使用して達成された。この目的のために、前記血清は、次に記載するように、吸収によって「除去処理」された。大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅのバクテリアを、５０ｍｌのＬＢ培地中にて一晩培養した。ＯＤ₆₀₀＝１．０の吸光度を達成した後、前記バクテリアを、遠心単離によってペレットとし、５ｍｌの燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、超音波破砕して溶解物を形成させた。このバクテリア溶解物を、活性化セファロースのマトリクス上に固定させ、次に、これをカラムに充填し、ヒト血清の吸収処理に使用した。血清は、このカラムに１０回通した。対数増殖期の大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅの培養物を、遠心単離によってペレットとし、組換えインサートをもたない１０⁶のγＺＡＰIIファージで、０．０１Ｍ硫酸マグネシウム中でトランスフェクションし、４時間、５ｍｌのＬＢ培地中でインキュベートした。このトランスフェクションされたバクテリアの溶解物を、前記トランスフェクションされていないバクテリアと同様に使用して、前述のヒト血清をこのカラムに更に１０回通した。トランスフェクションされた大腸菌溶解物由来の障害となる抗体を血清から完全に除去するために、このバクテリアを、寒天プレート上で培養し（１０時間、３７℃）、そのタンパク質を、この培養工程後、ニトロセルロースメンブレン上にブロッティングした。この後、上記工程によって予め吸収処理を施された前記血清を、ブロッティングされたニトロセルロースメンブレンに写し、この吸収工程を５回繰り返した。本発明によって処理された前記血清は、大腸菌およびファージ由来の抗原に対する抗体を完全に除去された。例３これらの実験に於いて、腎臓ガン−特異的抗原が、以下の工程によって同定された。大腸菌菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅのバクテリアを、上述したｃＤＮＡライブラリー由来の組換えファージでトランスフェクションし、イソプロピルチオガラクトピラノジド（”ＩＰＴＧ”）を含む、ＬＢ−培地に、プレート当たり、４−５ｘ１０³プラーク形成単位（ｐｆｕ）の濃度で塗布した。３７℃で１２時間のインキュベーション後、ニトロセルロースメンブレンを、前記培地の表面に置き、この培養プレートを、更に４時間インキュベートした。この後、前記ニトロセルロースメンブレンを、５％ミルク粉含有のＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）中で１時間インキュベートした。前記ニトロセルロースメンブレンをＴＢＳ中で３回洗浄した後、例２に従って得られた除去処理を施されたヒト血清を、ＴＢＳ／０．５％ミルク粉（ｗ／ｖ）中で１：１０００に希釈し、穏やかにシェイクしながら一晩インキュベートした。前記ニトロセルロースメンブレンとのインキュベーション後、前記血清を取り出し、更なるテスト用に保存した。血清とのインキュベーション後、前記ニトロセルロースメンブレンを、ＴＢＳ中で３回洗浄し、ポリクローナルの、アルカリフォスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧとともに１時間インキュベートした。この後、ニトロセルロースメンブレンをＴＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｖ／Ｖ）で繰り返し洗浄した。反応をＴＢＳ中で、ニトロブルー・テトラゾリウム・クロリドとブロモクロロ・インドイル・フォスフェートを用いて行った。発現されたタンパク質に対するヒト抗体の結合が、前記ニトロセルロースメンブレンで、青色のリング状の色彩沈殿物として可視化された。前記血清の効率的な前吸収処理によって、大腸菌およびファージ抗原に対する抗体によって引き起こされるバックグランド反応による、前記テストの質の低下がおこらず、前記メンブレンを３７℃で数時間で発達（ｄｅｖｅｌｏｐ）させることが可能であった。陽性クローンを、前記寒天プレート上で位置決定し、これらをトランスフェクション緩衝液に移し、第２ラウンドのトランスフェクションとサブクローニングに使用した。全部で１．８ｘ１０⁶の組換えクローンを、スクリーニングし、５種類の陽性反応クローンが同定された。例４例３によって得られた陽性クローン、即ち、前記処理を施されたヒト血清由来の抗体と結合したもの、を、トランスフェクションと、前記処理を施されたヒト血清との反応性のテストとを繰り返し行うことによって、単一クローンとなるようにサブクローニングした。それぞれのｃＤＮＡインサートを有するＰ−ブルースクリプトファージミドを、前記γＺＡＰIIファージベクターからのイン・ヴィヴォエキシジョン（ヘイ（Ｈａｙ）およびショート（Ｓｈｏｒｔ），Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ５：１６−１９，１９９２）によってクローンニングし、大腸菌ＳＯＬＲバクテリアへのトランスフェクションに使用した。バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびドーリー（Ｄｏｌｙ），Ｊ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：１５１３（１９７９）の方法の改変方法により、ＮａＯＨでのアルカリ溶解後、前記バクテリアからプラスミドを単離した。前記組換えプラスミドＤＮＡを、Ｍ１３−ｆｏｒｗａｒｄおよびＭ１３−ｒｅｖｅｒｓｅオリゴヌクレオチドを使用して、サンガー（Ｓａｎｇａｒ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３（１９７７））の古典的方法に依って、配列決定した。得られたＤＮＡ配列と、得られたアミノ酸配列とを、核酸およびタンパク質データバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ，ＥＭＢＬ，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）でチェックした。前記ｃＤＮＡインサートの配列決定を、内部オリゴヌクレオチドを使用して継続した。分析は、前記データバンクに於いて供託されたどの配列ともホモロジーが無いことを示した。ＲＡＣＥ法（ＦｒｏｈｍａｎＭＡ，ＤｕｓｈＭＫ，ＭａｒｔｉｎＧＲ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８（１９８８））によってクローニングされた、ＳＫ３１３と称される全長ｃＤＮＡクローンは、５’末端にカルボニックアンヒドラーゼドメインを有していた。この分子の核酸配列を、配列番号１として示す。図２は、これらの実験からの陽性クローンを有するニトロセルロースメンブレンを示している。例５これらの実験に対する追跡試験として、チョムジンスキー（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ）およびサッキ（Ｓａｃｃｈｉ），ＡｎａｌｙｔＢｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６（１９８７）の方法に依って、悪性と正常なヒト組織の領域からＲＮＡを単離した。変性後、トータル単離ＲＮＡを、１％のフォルムアルデヒドを含有するアガロースゲル上で電気泳動によって分離し（ゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：５７９４（１９８０））、次に、公知の方法（シード（Ｓｅｅｄ），Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：１７９９（１９８２））に依って、ナイロンメンブレン上にブロッティングした。同定されたクローンの放射性同位元素標識化ｃＤＮＡインサートを、ハイブリダイゼーションに使用した。このハイブリダイゼーションは、公知の方法（ジェフリー（Ｇｅｏｆｆｒｅｙ）およびバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ），Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：４１９（１９８７））によって行った。それぞれのＲＮＡの存在が、オートラジオグラフィとＸ線フィルムを使用して示された。分析は、クローンＨＯＭ−ＲＣＣ−３１３のｍＲＮＡが、正常な腎臓と比較して、１９の腎細胞ガンの内の４つに於いて過剰発現されていることを示した。非常に弱い発現は、結腸粘膜組織と正常な腎臓とに於いてのみ見られた。その他の組織に於ける発現は示すことができなかった。例６本発明によって同定される抗原に対する抗体の発生率を測定するために、健康な個人と腫瘍患者とからの血清を、分析した。この目的のために、これら血清を、上述したように処理を施し、大腸菌とファージ由来の抗原に対する抗体を血清から除去した。抗原特異的抗体の検出のために、陽性（反応性）クローンからのファージを、同じｃＤＮＡライブラリーからの非反応性ファージと、１：１０の率で混合し、前述した要領で、ヒトテスト血清中の抗体との反応性についてテストした。前記抗原の同定に使用した血清を、ポジティブコントロールとして使用した。非反応性ファージを、ネガティブコントロールとして使用した。もしもファージプラークの予想されたパーセンテージが陽性の反応を示した場合、その血清サンプルを、抗原反応性抗体に関して陽性であるとした。クローンＨＯＭ−ＲＣＣ−３１３によって示される腎細胞ガン抗原の場合、ある範囲のヒト血清の分析は、腎細胞ガン患者からの血清のみが反応性抗体を含有していることを示した。健康なコントロールと他の腫瘍を有する患者とからの血清は、そのような抗体を含有していなかった。クローンＨＯＭ−ＲＣＣ−３１３に対するｃＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断によってプラスミドＤＮＡから切り出し、アガロースゲル電気泳動によって分離し、その後、前記ゲルから抽出した。次に、これを使用して、バクテリアタンパク質であるアントラニレートシンセターゼとの融合タンパク質を発現するベクターを作り出した。正確なオープンリーディングフレームを有する適切なフラグメントを、ｐＡＴＨプラスミドベクター（ケルナー（Ｋｏｅｒｎｅｒ）他，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：４７７（１９９１））にクローニングした。前述したように、前記プラスミドを大腸菌菌株ＢＬ２１へトランスフォーメーションした後、タンパク質発現の誘導を行った。（スピンドラー（Ｓｐｌｎｄｌｅｒ）他，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：１３２（１９８４））。発現された融合タンパク質を、ＳＤＳゲル電気泳動によって分離し、前記ゲルから切り出し、溶出し、凍結乾燥させた。ウサギを、フロイントアジュバントに溶解させた１００μ ｇの凍結乾燥物の皮下注射によって免疫化した。免疫化を、不完全フロイントアジュバントを使用して２週間間隔で３回繰り返した。前記ウサギから血液を採取し、抗血清を得た。得られた抗血清から、前述した要領で、大腸菌とファージとに対する反応性の抗体を除去し、ヒト血清に関して前述したように、腎臓ガン抗原に対する反応性をテストした。反応性は、１：＞１００，０００の希釈度で検出された。例７（１）悪性メラノーマ、（ｉｉ）アストロサイトーマ、および（ｉｉｉ）ホジキン病をわずらう患者から採取した生体採取組織を使用して、前の諸例で記載したプロトコールで実験を行った。次の表１は、前記例１−６に於いて詳細に記載した、腎臓癌研究に於いて得られたものを含む、その結果を要約している。異なるインサートの分析は、メラノーマ細胞は、公知の腫瘍拒絶抗原前駆体ＭＡＧＥ−１（参考文献として本出願にその内容を合体させるファン・デア・ブルツゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３−７（１９９１）参照）と、一つの新規な抗原とを発現したことを示した。この抗原のｃＤＮＡ配列の一部を、配列番号２に示す。アストロサイトーマの研究が完了した結果、観察されたインサートは、以前に記載されたＴｅｇｔ遺伝子（参考文献としてその内容を本出願に合体させるオールド（Ｏｌｄ），Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４１：３６１−３７５（１９８１））に対応しているようであった。ホジキン病の研究が完了した結果、これまで未知であった抗原が単離され、それをコードするｃＤＮＡが、標準方法を使用して、ライブラリー中において同定された。この抗原は、新しく観察されたものであり、レクチン様構造を有していた。そのｃＤＮＡの一部を配列番号３に示す。更に、ビルベ（Ｂｉｌｂｅ）他，ＥＭＢＯＪ１１：２１０３−１３（１９９２）によって記載されている、レスチン（restin）に対する抗体も観察された。これは、中間径フィラメント関連タンパク質であり、その発現は、ホジキンおよびリード・スターンバーグ（Reed-Sternbe rg）細胞および、培養された単球に限られることが示されている。例８例１−７に記載した抗原に対する抗体の存在に関する更なる研究を行った。表２は、これらのアッセイを要約している。これらの研究に於いて、陽性クローンからのファージを、非反応性ファージと混合し（比１：１０）、次に、これを使用してバクテリア（大腸菌）をトランスフェクションした。患者血清の希釈液（１：２００）を、前述した固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）に使用した。「ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０」とは、前記新規メラノーマ抗原を指す（配列番号２）のに対して、「ＨＯＭ−ＭＥＬ−５５」は、ＭＡＧＥ−１を指す（ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）。「ＨＯＭ−ＲＣＣ３．１．３」は、配列番号１の前記腎臓ガン抗原である。「ＨＯＭ−ＧＬＯ−３０．２．１」は、以前に同定されたアストロサイトーマ関連抗原を指し、「ＨＯＭ −ＨＤ−２１」は、配列番号３の前記新規なレクチン様抗原を指し、「ＨＯＭ− ＨＤ−３９７」は、以前に同定されたレスチン抗原を指す。唯一レスチンを除いて、前記腫瘍抗原に対する抗体が様々な率ではあるが、同じタイプの腫瘍を患う患者の血清中に於いてのみ検出されるという事実は、腫瘍の成長が、腫瘍抗原に対する体液性応答の発達にとって必須であるということを示唆している。健康者のコントロールに於いてレスチンが存在する理由は、明らかでない。問題の抗原が別の抗原に対して類似する配列を有している為、あるいは、ドナーが前がん性細胞を有している為、又は、ウィルス感染、その他の炎症性のプロセスのような非−悪性状態下で、問題の抗原が正常細胞中で活性化される為に、それぞれの抗原に対する免疫寛容が回避される（circumvent）のであるかもしれないと推測することができる。例９ここに記載した新規に同定された抗原の発現パターンを測定するために、様々なヒト組織を使用して、ノザンブロット分析を行った。前述のチョムジンスキー（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ）他の周知のグアニジニウムイソチオシアナート／フェノール／クロロフォルム法を使用して、組織サンプル（腫瘍および正常）からＲＮＡを抽出した。このＲＮＡの質を、フォルマリン／ＭＯＰＳゲル中での電気泳動によってチェックした。次に、各レーンに付き４０ｕｇのＲＮＡを含有するゲルを、ナイロンメンブレン上にブロットした。次に、これらのノザンブロットを、配列番号１，２又は３のｃＤＮＡでプロービングした。ハイブリダイゼーションは、フォルムアミドを用いて、４２℃で、³²Ｐ標識化プローブで行った。フィルターを、１ｘＳＳＣ，０．２％ＳＤＳで、６５℃ で洗浄し、１６時間露光させた。これらを以後、「ストリンジェントな条件」と定義する。露光後、フィルターを取り出し、ＧＡＰＤＨで再びハイブリダイゼーションした。表３にこれらの結果を要約する。表からわかるように、前記新規なメラノーマ関連抗原は、メラノーマに於いて強く発現され、その他の組織に於いては発現されない。カルボニックアンヒドラーゼ様抗原は、腎細胞ガンの約２０％に於いて強力に発現されたが、正常な腎組織に於いては弱く発現されただけであった。ｔｅｇｔは、正常脳組織と比較すると、８／１２のアストロサイトーマ組織上で過剰発現された。ホジキン病に関連する前記レクチン様分子のｍＲＮＡは、正常な扁桃腺と比較して、疾患扁挑腺に於いて約１０倍増加しており、これらのことは、過剰発現が、自己由来Ｂ細胞応答を引きおこすタンパク質によくある特徴であるかもしれないことを示唆している。例１０前記ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０配列を更に研究した。標準遺伝子分析技術を使用して、ＨＯＭ−ＭＥＬ４０のｍＲＮＡの５’領域が、チロシンキナーゼ結合ドメインを有していることが示された。これは、ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０がレセプターとして機能しているかもしれないということを示唆している。前記ＲＮＡの３’部分は、滑液（synovial）腫瘍に於けるＳＹＴ−ＳＳＸトランスロケーションに関連していることが知られている分子である、”ＳＳＸ”に対するＲＮＡ分子と同じである。例１１ＨＯＭ−ＭＥＬ４０を研究するための更に追加の実験も行った。標準的ノザンブロッティングは、精巣を例外として、ＨＯＭ−ＭＥＬ４０は、正常な組織に於いては発現されないことを示した。これに対して、それは、メラノーマの５０％、前立腺ガンの２０％、胃ガンの２０％、結腸直腸がんの２６％、肺ガンの１２％、そして乳ガン及び肝細胞ガンの２０％に於いて発現された。それは、又、１／１０の胃癌腫と、１／５の甲状腺癌腫にも見つかった。さらにウェスタンブロッティング研究を行ったところ、ＨＯＭ−ＭＥＬ４０に対する抗体は、テストされた８９名のメラノーマ患者の内の１０名に於いて存在していたのに対して、４９名の健康な男性対象者の内の３名にしか存在していないことが示された。更に別の研究に於いて、ＨＬＡ−Ａ２陽性腫瘍細胞が、ＨＯＭ−ＭＥＬ由来のノナマーを提示することが観察された。これは、ＣＴＬを誘導するのに有用なＨＯＭ−ＭＥＬ４０特異的ワクチンが可能であることを示唆している。例１２上述の諸例に記載したファージアッセイは、多数の血清サンプルのスクリーニングには不適当である。これを行うために、前記標準ウェスタンブロットの改変法が開発された。この改変法は、ここに記載されるように、Ｈｉｓ−ｔａｇを有する、組換えＨＯＭ−ＭＥＬ４０に基づいている。ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０を、メラノーマ組織から調製したプラスミドｃＤＮＡを用いて、ｐｆｕポリメラーゼを使用して、２０サイクル増幅した。使用したオリゴヌクレオチドプライマーは次の通りであった。５’−ＧＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＴＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’（配列番号４）（センス）５’−ＴＴＣＡＣＴＧＴＴＧＴＧＡＡＣＡＣＴＴＧＣＴＴＴＣＡＣ−３（配列番号５）（アンチセンス）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、９５℃／１分、６０℃／１分、７２℃／１分、で行い、その後、７２℃で１０分間の最後の伸長を行った。その増幅産物を、周知技術を使用してゲルで精製し、次に、ＳｍａＩで切断され、脱燐酸化され、ゲルで精製したｐＱＥ３２ベクターにインフレームとなるように結合させた。これによって、Ｎ−末端に６つのヒスチジン分子の「テール（tail）」を有する融合タンパク質が作り出された。次に、このコンストラクトを、大腸菌ＳＧ１３００９（ｐＲＥＰ４）菌株にトランスフォーメーションし、その後、カナマイシンとアンピシリンとを含有するプレート上で選抜した。個々のコロニーをピックアップし、これらを、２ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導することにより、スモールスケールで発現させた。これによって、タンパク質の発現をチェックすることが可能である。次に、各クローンに対して、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを通してスモールスケールの精製を行った。一つのクローンが、予想された長さのタンパク質を発現するものとして同定された。このクローンを単離し、周知技術を使用して配列決定した。それは、ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０であることが確かめられた。この同定後、組換えタンパク質のラージスケールでの誘導を行った。具体的には、細胞を、２ｍＭのＩＰＴＧで誘導をかけ、５時間後に回収した。細胞を、８Ｍの尿素と、１００ｍＭのＮａ₂ＰＯ₄と、１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８）と、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸとからなるバッファーで、一晩、処理することによって、溶解させた。すべての細胞の破片を、遠心単離除去し、上清を予め平衡化させたＮｉ−ＮＴＡ樹脂上にロードした。ｐＨ８で２倍量の上述した緩衝液によって洗浄を行い、次に、ｐＨ６．３で、少なくとも１０倍量の同緩衝液によって洗浄を行った。次に、ここに記載した緩衝液に、２５０ｍＭのイミダゾールを加えたものを使用して、タンパク質を溶出させた。１リットルのバクテリア培養液当たり、１５から４０ｍｇの範囲のＨｉｓ−ｔａｇタンバク質が産生された。次に、Ｈｉｓ−標識化タンパク質を使用して、ウェスタンブロッティングを行った。これらのアッセイに於いて、内部ネガティブコントロールとして作用する、５ｕｇの組換えＨｉｓ−ｔａｇタンパク質を、２ｘＳＤＳサンプル緩衝液（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６，８，０．２Ｍジチオトレイトール、４％ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）と混合し、次に、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、その後、半乾燥トランスファーを使用して、ナイロンメンブレンにブロッティングした。ＰＢＳ中の５％低脂肪ミルクによってすべての非特異的結合をブロッキングした後（１時間）、メンブレンを、腫瘍患者又は健康者コントロールからの１：１００希釈血清とともにインキュベートした。次に、ブロットを、アルカリフォスファターゼ結合マウス抗−ヒトＩｇＧとともに１時間インキュベートした。次に、前記メンブレンを、ウサギ抗−マウスＩｇＧ（３０分間）と、次に抗−アルカリフォスファターゼと、その後、０．２５ｍｇ／ｍｌのアルカリフォスファターゼと、順番にインキュベートした。各インキュベーション工程後、メンブレンを、ＴＢＳと０．１％Ｔｗｅｅｎとで広範囲に洗浄した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート（ＢＣＩＰ）とニトロブルーテトラゾリウムでの染色によって可視化を行った。前記血清を、観察者に対して、サンプルの状態を隠した状態で、ランダムな順序で分析した（健康／メラノーマ陽性）。すべての分析を二連で行った。前記ブロッティングは、推定アミノ酸配列に基づく、２１．６ｋＤの計算分子量と一致する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２４ｋＤの分子量の産生物を示した。上述したイムノブロッティングを、８９個のメラノーマサンプルと、６個の卵巣ガンサンプルと、１０個の腎臓ガンサンプルとについて行った。これらの内、１１個のメラノーマサンプルと、１個の卵巣ガンサンプルと、３個の腎細胞ガンサンプルとが陽性であった。結腸直腸ガン、肺ガン、乳ガン、胃ガン又は膵臓ガンの患者からの血清は陰性であった。全部で４１の健康者のコントロールも分析し、これらの内、３つが陽性であった。次に、このウェスタンブロットで反応性であったすべての血清と、２０個の陰性血清サンプルとを、上述したファージアッセイを使用して、再びアッセイした。１１名のメラノーマ患者の内の１０名と陽性の卵巣ガン患者について反応性が確認された。腎細胞ガン患者と健康者のコントロールとは、陰性であり、ウェスタンブロットに於いて陰性であった全てのサンプルも陰性であった。血清と腫瘍標本の両方を提供した１６名のメラノーマ患者がいた。腫瘍によるＨＯＭ−ＭＥＬ−４０発現は、サンプル中の抗体反応性と比較可能であることが判った。下記の表から理解されるように、前記１６名の患者の内８名が、ＨＯＭ −ＭＥＬ−４０陽性腫瘍を有していたが、３名のみがその血清中にこの抗原に対する抗体を有していた。ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０陰性腫瘍を有する患者の血清中には抗体は検出されなかった。例１３参考文献として本出願にその内容が合体されるランメンゼー（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｌｃｓ４１：１７８−２２８（１９９５）は、ＨＬＡ−２．１に結合する多数のペプチド及びＣＴＬ増殖も誘発するいくつかのペプチドを開示している。これらの内のいくつかは次の式のものである。ＸａａＬｅｕ（Ｘａａ）₆（Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ）（配列番号６）ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０の推定アミノ酸配列中の、ＨＬＡ−Ａ２．１結合物質／ＣＴＬ刺激物質として作用する可能性のある配列をスクリーニングしたところ、次のものが見つかった。ＡｒｇＬｅｕＧｌｎＧｌｙＩｌｅＳｅｒＰｒｏＬｙｓＩｌｅ（配列番号７）ＡｒｇＬｅｕＡｒｇＧｌｕＡｒｇＬｙｓＧｌｎＬｅｕＶａｌ（配列番号８）ＬｙｓＩｌｅＧｌｎＬｙｓＡｌａＰｈｅＡｓｐＡｓｐＩｌｅ（配列番号９）これらのペプチドは、周知技術とＦｍｏｃで保護したアミノ酸を使用して合成された。次に、これらのペプチドを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５を使用して、次に、逆相ＨＰＬＣで、Ｃ−１８カラムを使用して精製した。抗原提示に関連するトランスポーターを欠損しているＴ２細胞（デ・マルス（ＤｅＭａｒｓ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：８１８３−８１８７（１９８５）；スレイター（Ｓｌａｔｅｒ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ２１：２３５−２４１（１９９０））を、次に示すように、ペプチド結合アッセイに使用した。５ｘ１０⁵個のＴ２細胞サンプルを、１００ｕＭの前記ＨＯＭ−ＭＥＬ −４０ペプチドの存在下又は不在下で、３７℃で４時間インキュベートした。ポジティブコントロールは、ＥＢＶＬＭＰ２由来のペプチドである、ＣｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙＬｅｕＬｅｕＴｈｒＭｅｔＶａｌ（配列番号１０）と、ＨＩＶ逆転写酵素由来のペプチドである、ＩｌｅＬｅｕＬｙｓＧｌｕＰｒｏＶａｌＧｌｙＶａｌ（配列番号１１）とであった。Ｔ２細胞上のＨＬＡ−Ａ２．１のアップレギュレーションを、抗−ＨＬＡ−Ａ２．１特異的モノクローナル抗体（即ち、ＢＢ７．２）での標識化によって測定し、その後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗−マウス抗体とのインキュベートを行った。これらのサンプルをフローサイトメトリーによって分析した。ここで、ＨＬＡ−Ａ２．１のアップレギュレーションは以下の比率によって表わされる。前記三つのペプチドのそれぞれが、ＨＬＡ−Ａ２．１に結合するのが判り、ここで、配列番号８が、ＦＡＣＳ分析によって測定したところ、飛びぬけて最も強いＨＬＡ−Ａ２．１アップレギュレーションを示した。以上に示すように、本発明は、免疫反応性物質を判定又は単離する方法に関する。ここで「免疫反応性物質」とは、それを産生する患者に於いてなんらかの免疫応答を誘発するすべての物質を指す。この応答は、Ｂ細胞応答又はＴ細胞応答のいずれに基づくものであってもよい。このような免疫反応性物質には、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド含有複合体（たとえば、ＭＨＣ／ペプチド複合体）、抗体、等が含まれる。このような物質を判定するために、周知の標準方法を使用して、患者の細胞からｃＤＮＡライブラリーを作る。次に、ｃＤＮＡを、真核細胞特異的ウィルス又はファージ（即ち、バクテリアウィルス）等の適当なベクターに挿入し、トランスフェクション／トランスフォーメーションライブラリーを形成し、次に、これを宿主細胞に組み込む。この宿主細胞を、これらが受け取った前記ライブラリーの成分（クローニングされたｃＤＮＡ）を発現するように処理する。次に、この宿主細胞を、溶解し、その発現物質を更なる処理のために使用可能とする。この溶解された物質を、次に、この免疫反応性物質に対する免疫性結合パートナーを含有していると考えられる「除去処理を施した」サンプルに接触させる。ここで使用する「免疫性結合パートナー」とは、標的に結合するすべての免疫系関連物質、即ち、免疫反応性物質、を指す。このような結合パートナーとしては、抗体、Ｔ細胞、サイトカイン、リガンド、レセプター、等、更に、これら分子の切断された部分、相補的核酸分子、等が含まれるが、これらに限定されるものではない。尚、これらの成分の内の、たとえばＴ細胞等のいくつかの場合、ここに記載したものを含む追加工程が必要とされる。除去処理を施したサンプルは、前述したように、（ｉ）トランスフェクション又はトランスフォーメーションされていない宿主細胞と、（ｉｉ）問題のｃＤＮＡを含まないベクターでトランスフェクション又はトランスフォーメーションされた宿主細胞との両方との接触によって処理されたものである。除去処理を施したサンプルは、発現物質に対する結合パートナーの同定に有用である。なぜならば、所望の特異的免疫反応の障害となるような免疫成分の多くが、ここに記載した吸収工程によって除去されているからである。発現物質の同定の後、それをコードするｃＤＮＡの単離を行ってもよい。宿主細胞のコロニーを含むペトリ皿上に載置された、ニトロセルロースメンブレン等のメンブレンに、穴を開け、次に、前記免疫反応を使用して、その固相上の位置を特定することができる。各コロニーは、制限されたｃＤＮＡトランスフェクションに基づいており、これによって、関連ｃＤＮＡの単離と同定とが容易となる。本発明は、又、特定の状態に関連する分子をコードする配列番号１，２又は３の単離核酸分子にも関する。これらのコード物質としての役割に加えて、これらの分子は、これらｃＤＮＡ分子（配列番号１、２および３）は、抗原へと翻訳されるｍＲＮＡに基づいていることが示されていることから、その関連抗原を発現する細胞を同定するためのプローブとしても利用可能である。その相補的配列が配列番号１，２又は３のどれかにハイブリダイズし、配列番号１，２又は３によってコードされるものと均等なタンパク質をコードする単離核酸分子も本発明の一部を構成する。ここで「ストリンジェントな条件」とは、³² ｐ−標識化プローブを使用した、少なくとも、５０μｌ／ｃｍ²の３．５ｘＳＳＣ，１ｘＤｅｎｈａｒｄ溶液、２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）での、６５度で１８時間のハイブリダイゼーション、その後、４回の洗浄（各洗浄は１時間、６５℃、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、そして１．０ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳでの３０分間の最後の洗浄からなる条件程度のストリンジェントな条件を指す。最後の洗浄は、０．５ｘＳＳＣないし０．２ｘＳＳＣ、更に、０．１ｘＳＳＣに変更することが可能であり、ＳＤＳは、所望の場合には、ストリンジェンシーを高めるために、０．１％にまで低下させてもよい。本発明は、更に、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合し、これによって、細胞溶解性Ｔ細胞による溶解を誘発させる、配列番号７，８および９のもの等の、腫瘍抗原と関連するペプチドも含む。又、次の式のペプチドも本発明の一部を構成する、即ち、ＸａａＬｅｕＸａａ₇ （配列番号１２）ここで、第６番目のアミノ酸残基はＳｅｒ，Ｌｙｓ又はＰｈｅであり、第９番目のアミノ酸残基は、Ｖａｌ又はＩｌｅである。これらの分子は、又、ペプチド／ＭＣＨ複合体形成は極めて特異的であることが周知であることから、非常に簡便に、ＨＬＡ−Ａ２．１細胞に対するマーカーとしても作用することができる。本発明のその他の特徴は、当業者にとって明らかであり、ここで繰り返す必要は無いであろう。ここに使用した用語と表現は、記載のための用語として使用されたもので、限定のためのものではなく、これらの用語および表現の使用において、図示され、記載された特徴構成又はそれらの部分構成のいかなる均等物も排除することを意図しておらず、本発明の枠内において様々な改変が可能であることが認識されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年８月２８日（１９９７．８．２８）【補正内容】ナマーを提示することが観察された。これは、ＣＴＬを誘導するのに有用なＨＯＭ−ＭＥＬ４０特異的ワクチンが可能であることを示唆している。例１２上述の諸例に記載したファージアッセイは、多数の血清サンプルのスクリーニングには不適当である。これを行うために、前記標準ウェスタンブロットの改変法が開発された。この改変法は、ここに記載されるように、Ｈｉｓ−ｔａｇを有する、組換えＨＯＭ−ＭＥＬ４０に基づいている。ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０を、メラノーマ組織から調製したプラスミドｃＤＮＡを用いて、ｐｆｕポリメラーゼを使用して、２０サイクル増幅した。使用したオリゴヌクレオチドプライマーは次の通りであった。５’−ＧＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＴＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’（配列番号５）（センス）５’−ＴＴＣＡＣＴＧＴＴＧＴＧＡＡＣＡＣＴＴＧＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号６）（アンチセンス）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、９５℃／１分、６０℃／１分、７２℃／１分、で行い、その後、７２℃で１０分間の最後の伸長を行った。その増幅産物を、周知技術を使用してゲルで精製し、次に、ＳｍａＩで切断され、脱燐酸化され、ゲルで精製したｐＱＥ３２ベクターにインフレームとなるように結合させた。これによって、Ｎ−末端に６つのヒスチジン分子の「テール（tail）」を有する融合タンパク質が作り出された。次に、このコンストラクトを、大腸菌ＳＧ１３００９（ｐＲＥＰ４）菌株にトランスフォーメーションし、その後、カナマイシンとアンピシリンとを含有するプレート上で選抜した。個々のコロニーをピックアップし、これらを、２ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導することにより、スモールスケールで発現させた。これによって、タンパク質の発現をチェックすることが可能０．１％Ｔｗｅｅｎとで広範囲に洗浄した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート（ＢＣＩＰ）とニトロブルーテトラゾリウムでの染色によって可視化を行った。前記血清を、観察者に対して、サンプルの状態を隠した状態で、ランダムな順序で分析した（健康／メラノーマ陽性）。すべての分析を二連で行った。前記ブロッティングは、推定アミノ酸配列に基づく、２１．６ｋＤの計算分子量と一致する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２４ｋＤの分子量の産生物を示した。上述したイムノブロッティングを、８９個のメラノーマサンプルと、６個の卵巣ガンサンプルと、１０個の腎臓ガンサンプルとについて行った。これらの内、１１個のメラノーマサンプルと、１個の卵巣ガンサンプルと、３個の腎細胞ガンサンプルとが陽性であった。結腸直腸ガン、肺ガン、乳ガン、胃ガン又は膵臓ガンの患者からの血清は陰性であった。全部で４１の健康者のコントロールも分析し、これらの内、３つが陽性であった。次に、このウェスタンブロットで反応性であったすべての血清と、２０個の陰性血清サンプルとを、上述したファージアッセイを使用して、再びアッセイした。１１名のメラノーマ患者の内の１０名と陽性の卵巣ガン患者について反応性が確認された。腎細胞ガン患者と健康者のコントロールとは、陰性であり、ウェスタンブロットに於いて陰性であった全てのサンプルも陰性であった。血清と腫瘍標本の両方を提供した１６名のメラノーマ患者がいた。腫瘍によるＨＯＭ−ＭＥＬ−４０発現は、サンプル中の抗体反応性と比較可能であることが判った。下記の表から理解されるように、前記１６名の患者の内８名が、ＨＯＭ −ＭＥＬ−４０陽性腫瘍を有していたが、３名のみがその血清中にこの抗原に対する抗体を有していた。ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０陰性腫瘍を有する患者の血清中には抗体は検出されなかった。例１３参考文献として本出願にその内容が合体されるランメンゼー（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４１：１７８−２２８（１９９５）は、ＨＬＡ＿２．１に結合する多数のペプチド及びＣＴＬ増殖も誘発するいくつかのペプチドを開示している。これらの内のいくつかは次の式のものである。ＸａａＬｅｕ（Ｘａａ）₆（Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ）（配列番号７）ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０の推定アミノ酸配列中の、ＨＬＡ−Ａ２．１結合物質／ＣＴＬ刺激物質として作用する可能性のある配列をスクリーニングしたところ、次のものが見つかった。ＡｒｇＬｅｕＧｌｎＧｌｙＩｌｅＳｅｒＰｒｏＬｙｓＩｌｅ（配列番号８）ＡｒｇＬｅｕＡｒｇＧｌｕＡｒｇＬｙｓＧｌｎＬｅｕＶａｌ（配列番号９）ＬｙｓＩｌｅＧｌｎＬｙｓＡｌａＰｈｅＡｓｐＡｓｐＩｌｅ（配列番号１０）これらのペプチドは、周知技術とＦｍｏｃで保護したアミノ酸を使用して合成された。次に、これらのペプチドを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５を使用して、次に、逆相ＨＰＬＣで、Ｃ−１８カラムを使用して精製した。抗原提示に関連するトランスポーターを欠損しているＴ２細胞（デ・マルス（ＤｅＭａｒｓ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：８１８３−８１８７（１９８５）；スレイター（Ｓｌａｔｅｒ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ２１：２３５−２４１（１９９０））を、次に示すように、ペプチド結合アッセイに使用した。５ｘ１０⁵個のＴ２細胞サンプルを、１００ｕＭの前記ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０ペプチドの存在下又は不在下で、３７℃で４時間インキュベートした。ポジティブコントロールは、ＥＢＶＬＭＰ２由来のペプチドである、ＣｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙＬｅｕＬｅｕＴｈｒＭｅｔＶａｌ（配列番号１１）と、ＨＩＶ逆転写酵素由来のペプチドである、ＩｌｅＬｅｕＬｙｓＧｌｕＰｒｏＶａｌＧｌｙＶａｌ（配列番号１２）とであった。Ｔ２細胞上のＨＬＡ−Ａ２．１のアップレギュレーションを、抗−ＨＬＡ−Ａ２．１特異的モノクローナル抗体（即ち、ＢＢ７．２）での標識化によって測定し、その後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗−マウス抗体とのインキュベートを行った。これらのサンプルをフローサイトメトリーによって分析した。ここで、ＨＬＡ−Ａ２．１のアップレギュレーションは以下の比率によって表わされる。前記三つのペプチドのそれぞれが、ＨＬＡ−Ａ２．１に結合するのが判り、ここで、配列番号８が、ＦＡＣＳ分析によって測定したところ、飛びぬけて最も強いＨＬＡ−Ａ２．１アップレギュレーションを示した。以上に示すように、本発明は、免疫反応性物質を判定又は単離する方法に関する。ここで「免疫反応性物質」とは、それを産生する患者に於いてなんらかの免疫応答を誘発するすべての物質を指す。この応答は、Ｂ細胞応答又はＴ細胞応答のいずれに基づくものであってもよい。このような免疫反応性物質には、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リボタンパク質、ペプチド含有複合体（たとえば、ＭＨＣ／ペプチド複合体）、抗体、等が含まれる。このような物質を判定するために、周知の標準方法を使用して、患者の細胞からｃＤＮＡライブラリーを作る。次に、ｃＤＮＡを、真核細胞特異的ウィルス又はファージ（即ち、バクテリアウィルス）等の適当なベクターに挿入し、トランスフェクション／トランスフォーメーションライブラリーを形成し、次に、これを宿主細胞に組み込む。この宿主細胞を、これらが受け取った前記ライブラリーの成分（クローニングされたｃＤＮＡ）を発現するように処理する。次に、この宿主細胞を、溶解し、その発現物質を更なる処理のために使用可能とする。１ｘＤｅｎｈａｒｄ溶液、２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）での、６５度で１８時間のハイブリダイゼーション、その後、４回の洗浄（各洗浄は１時間、６５℃、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、そして１．０ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳでの３０分間の最後の洗浄からなる条件程度のストリンジェントな条件を指す。最後の洗浄は、０．５ｘＳＳＣないし０．２ｘＳＳＣ、更に、０．１ｘＳＳＣに変更することが可能であり、ＳＤＳは、所望の場合には、ストリンジェンシーを高めるために、０．１％にまで低下させてもよい。本発明は、更に、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合し、これによって、細胞溶解性Ｔ細胞による溶解を誘発させる、配列番号７，８および９のもの等の、腫瘍抗原と関連するペプチドも含む。又、次の式のペプチドも本発明の一部を構成する、即ち、ＸａａＬｅｕ（Ｘａａ）₇ （配列番号１３）ここで、第６番目のアミノ酸残基はＳｅｒ，Ｌｙｓ又はＰｈｅであり、第９番目のアミノ酸残基は、Ｖａｌ又はＩｌｅである。これらの分子は、又、ペプチド／ＭＨＣ複合体形成は極めて特異的であることが周知であることから、非常に簡便に、ＨＬＡ−Ａ２．１細胞に対するマーカーとしても作用することができる。本発明のその他の特徴は、当業者にとって明らかであり、ここで繰り返す必要は無いであろう。ここに使用した用語と表現は、記載のための用語として使用されたもので、限定のためのものではなく、これらの用語および表現の使用において、図示され、記載された特徴構成又はそれらの部分構成のいかなる均等物も排除することを意図しておらず、本発明の枠内において様々な改変が可能であることが認識されるべきである。請求の範囲：１．ＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合し、次の配列、ＸａａＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａ（配列番号１３）を有する単離ノナペプチドであって、第６番目のアミノ酸残基が、Ｓｅｒ，Ｌｙｓ又はＰｈｅであり、第９番目のアミノ酸残基がＶａｌ又はＩｌｅである単離ノナペプチド。２．配列番号８、配列番号９、および配列番号１０、からなるグループから選択される請求項１の単離ノナペプチド。３．配列番号８である請求項１の単離ノナペプチド。４．配列番号９である請求項１の単離ノナペプチド。５．配列番号１０である請求項１の単離ノナペプチド。６．配列番号１の核酸分子によってコードされる単離タンパク質。７．腫瘍関連タンパク質の存在の可能性をスクリーニングする方法であって、サンプルと、配列番号５および配列番号６のうち少なくとも一つと接触させ、そして前記サンプル中における前記腫瘍関連抗原の判定として、標的に対する配列番号５又は配列番号６のハイブリダイゼーションを判定することからなる方法。８．前記サンプルと、配列番号５および配列番号６の両方とを接触させる、請求項７の方法。９．ポリメラーゼ連鎖反応工程を有する、請求項８の方法。１０．患者によって生産される免疫反応性物質を判定する方法であって、以下の工程、（ａ）前記患者から得た細胞のｃＤＮＡライブラリーを作成する工程、（ｂ）前記ｃＤＮＡライブラリーをベクターに挿入する工程、（ｃ）前記ベクターを宿主細胞中にトランスフェクションして、トランスフェクションされた宿主細胞を作る工程、（ｄ）前記トランスフェクションされた宿主細胞を培養して前記免疫反応性物質を発現させる工程、（ｅ）前記トランスフェクションされた宿主細胞を溶解して溶解物を形成する工程、（ｆ）前記免疫反応性物質に対する免疫性結合パートナーを含有するサンプルを、溶解させた、トランスフェクションされていない宿主細胞のサンプルと接触させて、前記トランスフェクションされていない宿主細胞に対して特異的なすべての免疫性結合パートナーを、前記サンプルから除去して、除去処理を施したサンプルを作る工程、（ｇ）前記除去処理を施したサンプルを、前記ｃＤＮＡが挿入されたものと同じであって、かつ、いずれのｃＤＮＡも有さないベクターでトランスフェクションされた溶解させた宿主細胞のサンプルと接触させて、前記ベクターに対して特異的なすべての免疫反応性結合パートナーを除去し、これによって２回除去処理を施したサンプルを作る工程、（ｈ）前記２回除去処理を施したサンプルを、前記工程（ｆ）の溶解物と接触させ、これによって、前記免疫反応性結合パートナーに対して特異的なすべての免疫反応性結合パートナーがそれに結合する工程、そして（ｉ）前記工程（ｈ）に於ける結合を判定し、前記免疫反応性物質を判定する工程、からなる方法。１１．更に、前記免疫反応性物質を発現した前記トランスフェクションされた宿主細胞を同定し、そこに含まれる前記ｃＤＮＡを単離する工程を有する請求項１０の方法。１２．更に、すべての免疫反応性結合パートナーを除去し、前記物質に対して特異的な一つの免疫反応性結合パートナーを単離する工程を有する請求項１０の方法。１３．前記宿主細胞が大腸菌である請求項１０の方法。１４．前記ベクターが、ウィルスベクターである請求項１０の方法。１５．前記ウィルスベクターが、真核細胞性ウィルスベースのベクターである請求項１４の方法。１６．前記ウィルスベクターが、ファージベクターである請求項１４の方法。１７．前記ファージが、ラムダファージである請求項１６の方法。１８．前記宿主細胞が、原核細胞である請求項１０の方法。１９．前記宿主細胞が、真核細胞である請求項１０の方法。２０．更に、前記２回除去処理を施したサンプルとの接触の前に、前記溶解物を固相に固定化する工程を有する請求項１０の方法。２１．前記サンプルが血清である請求項１０の方法。２２．前記血清が自己由来血清である請求項２１の方法。２３．前記免疫性結合パートナーが抗体である請求項１０の方法。２４．前記免疫反応性物質がガンに関連する抗原である請求項１０の方法。２５．前記免疫反応性物質が自己免疫関連抗原である請求項１０の方法。２６．前記免疫反応性物質が病原体によって生産されたものである請求項１０の方法。２７．その相補的配列が、ストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする、腎細胞ガン−特異的抗原をコードする単離核酸分子。２８．その相補的配列が、ストリンジェントな条件下で配列番号２にハイブリダイズずる、ホジキン病−特異的抗原をコードする単離核酸分子。２９．その相補的配列が、ストリンジェントな条件下で配列番号３にハイブリダイズずる、メラノーマー特異的抗原をコードする単離核酸分子。３０．配列番号１から成る請求項２７の単離核酸分子。３１．配列番号２から成る請求項２８の単離核酸分子。３２．配列番号３から成る請求項２９の単離核酸分子。３３．プロモーターに操作可能にリンクされた請求項２７の単離核酸分子を有する発現ベクター。３４．プロモーターに操作可能にリンクされた請求項２８の単離核酸分子を有する発現ベクター。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０８／６４４，１１６ (32)優先日平成８年５月10日(1996．5．10) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，ＪＰ，ＮＯ，ＮＺ (72)発明者ランメンゼー，ハンス−ゲオルクドイツ連邦共和国デー−69120 ハイデルベルクイム・ノイエンハイマー・フェルト 242

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合し、次の配列、ＸａａＬｅｕＸａａ７を有する単離ノナペプチドであって、第６番目のアミノ酸残基が、Ｓｅｒ，Ｌｙｓ又はＰｈｅであり、第９番目のアミノ酸残基がＶａｌ又はＩｌｅである単離ノナペプチド。２．配列番号７、配列番号８、および配列番号９、からなるグループから選択される単離ノナペプチド。３．配列番号７である請求項１の単離ノナペプチド。４．配列番号８である請求項１の単離ノナペプチド。５．配列番号９である請求項１の単離ノナペプチド。６．配列番号１の核酸分子によってコードされる単離タンパク質。７．腫瘍関連タンパク質の存在の可能性をスクリーニングする方法であって、サンプルと、配列番号４および配列番号５のうち少なくとも一つと接触させ、そして前記サンプル中における前記腫瘍関連抗原の判定として、標的に対する配列番号４又は配列番号５のハイブリダイゼーションを判定することからなる方法。８．前記サンプルと、配列番号４および配列番号５の両方とを接触させる、請求項７の方法。９．ポリメラーゼ連鎖反応工程を有する、請求項８の方法。１０．患者によって生産される免疫反応性物質を判定する方法であって、以下の工程、（ａ）前記患者から得た細胞のｃＤＮＡライブラリーを作成する工程、（ｂ）前記ｃＤＮＡライブラリーをベクターに挿入する工程、（ｃ）前記ベクターを宿主細胞中にトランスフェクションして、トランスフェクションされた宿主細胞を作る工程、（ｄ）前記トランスフェクションされた宿主細胞を培養して前記免疫反応性物質を発現させる工程、（ｅ）前記トランスフェクションされた宿主細胞を溶解して溶解物を形成する工程、（ｆ）前記免疫反応性物質に対する免疫性結合パートナーを含有するサンプルを、溶解させた、トランスフェクションされていない宿主細胞のサンプルと接触させて、前記トランスフェクションされていない宿主細胞に対して特異的なすべての免疫性結合パートナーを、前記サンプルから除去して、除去処理を施したサンプルを作る工程、（ｇ）前記除去処理を施したサンプルを、前記ｃＤＮＡが挿入されたものと同じであって、かつ、いずれのｃＤＮＡも有さないベクターでトランスフェクションされた溶解させた宿主細胞のサンプルと接触させて、前記ベクターに対して特異的なすべての免疫反応性結合パートナーを除去し、これによって２回除去処理を施したサンプルを作る工程、（ｈ）前記２回除去処理を施したサンプルを、前記工程（ｆ）の溶解物と接触させ、これによって、前記免疫反応性結合パートナーに対して特異的なすべての免疫反応性結合パートナーがそれに結合する工程、そして（ｉ）前記工程（ｈ）に於ける結合を判定し、前記免疫反応性物質を判定する工程、からなる方法。１１．更に、前記免疫反応性物質を発現した前記トランスフェクションされた宿主細胞を同定し、そこに含まれる前記ｃＤＮＡを単離する工程を有する請求項１０の方法。１２．更に、すべての免疫反応性結合パートナーを除去し、前記物質に対して特異的な一つの免疫反応性結合パートナーを単離する工程を有する請求項１０の方法。１３．前記宿主細胞が大腸菌である請求項１０の方法。１４．前記ベクターが、ウィルスベクターである請求項１０の方法。１５．前記ウィルスベクターが、真核細胞性ウィルスベースのベクターである請求項１４の方法。１６．前記ウィルスベクターが、ファージベクターである請求項１４の方法。１７．前記ファージが、ラムダファージである請求項１６の方法。１８．前記宿主細胞が、原核細胞である請求項１０の方法。１９．前記宿主細胞が、真核細胞である請求項１０の方法。２０．更に、前記２回除去処理を施したサンプルとの接触の前に、前記溶解物を固相に固定化する工程を有する請求項１０の方法。２１．前記サンプルが血清である請求項１０の方法。２２．前記血清が自己由来血清である請求項２１の方法。２３．前記免疫性結合パートナーが抗体である請求項１０の方法。２４．前記免疫反応性物質がガンに関連する抗原である請求項１０の方法。２５．前記免疫反応性物質が自己免疫関連抗原である請求項１０の方法。２６．前記免疫反応性物質が病原体によって生産されたものである請求項１０の方法。２７．その相補的配列が、ストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする、腎細胞ガン−特異的抗原をコードする単離核酸分子。２８．その相補的配列が、ストリンジェントな条件下で配列番号２にハイブリダイズする、ホジキン病−特異的抗原をコードする単離核酸分子。２９．その相補的配列が、ストリンジェントな条件下で配列番号３にハイブリダイズする、メラノーマー特異的抗原をコードする単離核酸分子。３０．配列番号１から成る請求項２７の単離核酸分子。３１．配列番号２から成る請求項２８の単離核酸分子。３２．配列番号３から成る請求項２９の単離核酸分子。３３．プロモーターに操作可能にリンクされた請求項２７の単離核酸分子を有する発現ベクター。３４．プロモーターに操作可能にリンクされた請求項２８の単離核酸分子を有する発現ベクター。３５．プロモーターに操作可能にリンクされた請求項２９の単離核酸分子を有する発現ベクター。３６．請求項２７の単離核酸分子でトランスフォーメーション又はトランスフェクションされた細胞ライン。３７．請求項２８の単離核酸分子でトランスフォーメーション又はトランスフェクションされた細胞ライン。３８．請求項２９の単離核酸分子でトランスフォーメーション又はトランスフェクションされた細胞ライン。３９．請求項３３の発現ベクターでトランスフォーメーション又はトランスフェクションされた細胞ライン。４０．請求項３４の発現ベクターでトランスフォーメーション又はトランスフェクションされた細胞ライン。４１．請求項３５の発現ベクターでトランスフォーメーション又はトランスフェクションされた細胞ライン。