JP2002531088A - 主要拒絶抗原 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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-
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-
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Abstract
(57)【要約】
主要組織適合遺伝子複合体分子型ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１と複合体を形成可能な配列番号１または２に由来するアミノ酸の未破壊配列を含むポリペプチド。当該ポリペプチドまたはタンパクをコードするヌクレオチド配列または相補的ヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が配列番号３、４、５、６または７のいずれかに記載された配列ではない、単離された核酸分子。さらには、主要組織適合分子、ＨＬＡと複合体形成し、ＡＰＣ、好ましくは樹状細胞の表面に提示された、当該ポリペプチドまたはタンパクを含む、腫瘍の予防、治療または診断用の薬学的組成物であって、前記複合体が、前記ＡＰＣをポリペプチドまたはタンパクを用いてパルスすることによって形成される薬学的組成物。
Description
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞において発現されたポリペプチドおよびタンパク、並びに
、かかるポリペプチドおよびタンパクをコードする核酸分子に関する。また、本
発明は、かかるポリペプチドおよびタンパクを発現するための発現ベクターと宿
主細胞、並びに、かかるポリペプチドまたはタンパクに選択的に結合する、また
は、特異的なポリペプチド結合剤にも関する。さらに、本発明は、疾患、好まし
くはガンを、かかるポリペプチド、タンパク、核酸、ポリペプチド結合剤、発現
ベクターまたはトランスフォームされた宿主細胞を用いて、処置および診断する
方法にも関する。
、かかるポリペプチドおよびタンパクをコードする核酸分子に関する。また、本
発明は、かかるポリペプチドおよびタンパクを発現するための発現ベクターと宿
主細胞、並びに、かかるポリペプチドまたはタンパクに選択的に結合する、また
は、特異的なポリペプチド結合剤にも関する。さらに、本発明は、疾患、好まし
くはガンを、かかるポリペプチド、タンパク、核酸、ポリペプチド結合剤、発現
ベクターまたはトランスフォームされた宿主細胞を用いて、処置および診断する
方法にも関する。
【０００２】
腫瘍細胞をその正常な細胞から区別する表現型の変化は、多くの場合、細胞の
ゲノムに対する一以上の変化の結果である。腫瘍細胞で発現されるが、その正常
な細胞では発現されない遺伝子は、“腫瘍特異的”または“腫瘍関連”遺伝子と
呼ばれる。これらの腫瘍特異的または関連遺伝子は、腫瘍表現型のマーカーとな
りうる。
ゲノムに対する一以上の変化の結果である。腫瘍細胞で発現されるが、その正常
な細胞では発現されない遺伝子は、“腫瘍特異的”または“腫瘍関連”遺伝子と
呼ばれる。これらの腫瘍特異的または関連遺伝子は、腫瘍表現型のマーカーとな
りうる。
【０００３】 哺乳動物の免疫システムが、外因性または異質物質を認識し、反応する工程は
、複雑である。このシステムの重要な一面は、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
またはＴ細胞の反応である。ＣＴＬは、ヒトリンパ球抗原（“ＨＬＡ”）または
主要組織適合遺伝子複合体分子（“ＭＨＣ”分子）と称される、細胞表面分子の
複合体、および、このＨＬＡ／ＭＨＣ複合体を有する細胞内に由来するより大き
な分子から誘導された他のペプチドを認識して相互作用する。これについては、
Maleら,Advanced Immunology (J.P.Lipincott Company, 1987)、特に６−１０章
およびC.A.Janewayら,Immuno Biology third ed.(Current Biology Ltd.1997)を
参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との相互作用は制限されており、ＨＬＡ
分子とペプチドの特別な組合せに特異的なＴ細胞を必要とする。特異的ＣＴＬが
存在しない場合には、そのパートナーの複合体が存在してもＴ細胞反応は起こら
ない。同様に、特異的複合体が存在しなければ、ＣＴＬが存在しても、反応は起
こらない。このメカニズムは、外因性物質に対する免疫システムの反応、自己免
疫疾患、および、細胞異常に対する応答に関与する。タンパクがＨＬＡ結合ペプ
チドへと処理されるメカニズムに、多くの研究が集中した。これについては、Ba
rinaga,Sciece 257:880,1992; Fremontら,Science 257:919, 1992; Matsumuraら
,Science 257:927,1992; Latronら,Science 257:964,1992を参照。
、複雑である。このシステムの重要な一面は、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
またはＴ細胞の反応である。ＣＴＬは、ヒトリンパ球抗原（“ＨＬＡ”）または
主要組織適合遺伝子複合体分子（“ＭＨＣ”分子）と称される、細胞表面分子の
複合体、および、このＨＬＡ／ＭＨＣ複合体を有する細胞内に由来するより大き
な分子から誘導された他のペプチドを認識して相互作用する。これについては、
Maleら,Advanced Immunology (J.P.Lipincott Company, 1987)、特に６−１０章
およびC.A.Janewayら,Immuno Biology third ed.(Current Biology Ltd.1997)を
参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との相互作用は制限されており、ＨＬＡ
分子とペプチドの特別な組合せに特異的なＴ細胞を必要とする。特異的ＣＴＬが
存在しない場合には、そのパートナーの複合体が存在してもＴ細胞反応は起こら
ない。同様に、特異的複合体が存在しなければ、ＣＴＬが存在しても、反応は起
こらない。このメカニズムは、外因性物質に対する免疫システムの反応、自己免
疫疾患、および、細胞異常に対する応答に関与する。タンパクがＨＬＡ結合ペプ
チドへと処理されるメカニズムに、多くの研究が集中した。これについては、Ba
rinaga,Sciece 257:880,1992; Fremontら,Science 257:919, 1992; Matsumuraら
,Science 257:927,1992; Latronら,Science 257:964,1992を参照。
【０００４】 Ｔ細胞が細胞以上を認識するメカニズムは、ガンにも関与する。腫瘍細胞の表
面におけるＨＬＡ／ペプチド複合体として提示されるペプチドへと処理される遺
伝子の多数のファミリーは、その結果、細胞が特異的ＣＴＬにより溶解され、見
出された。これらの遺伝子は、“腫瘍拒絶抗原前駆体(tumour rejection antige
n precursors)”または“ＴＲＡＰ”分子をコードすると言われ、ＨＬＡと複合
体形成する、これから誘導されたペプチドは、“腫瘍拒絶抗原(tumour rejectio
n antigens)”または“ＴＲＡ”と称される。この分野に多くの努力がなされ、
Ｔ細胞に認識される多くのヒト腫瘍拒絶抗原（ＴＲＡＰとＴＲＡの両方）が同定
された（Van den Eynde, B.J.およびP.van der Bruggen, 1997, Curr.Opin.Immu
nol.9:684）。中でも、遺伝子ＭＡＧＥ−１にコードされたＴＲＡＰは、患者Ｍ
Ｚ２から誘導されたメラノーマ細胞の存在下で、同じ患者の血液リンパ球を培養
することによって最初に定義された。ＣＴＬクローンのパネルを混合リンパ球腫
瘍細胞培養（ＭＬＴＣ）技術によって作製し、これらのクローンの一つが、ＨＬ
Ａ−Ａ１に提示されたＭＡＧＥ−１ ＴＲＡＰから誘導されたノナペプチドＴＲ
Ａを認識した（van der Bruggen, P.,C.ら,1991,Science(Wash.DC).254:1643-16
47; Traversari, C.,ら,1992, J.Exp.Med.176:1453-1457およびWO92/20356）。
後に、ＭＡＧＥ−１が、少なくとも１７の関連遺伝子のファミリー、すなわちＭ
ＡＧＥ−１から−１２（現在、ＭＡＧＥ−Ａ１ないし−Ａ１２と呼ばれる）（De
Plaen,E.,ら1994,Immunogenetics,40:360-369）、ＭＡＧＥ−ＢＩから−Ｂ４（
Muscatelli,F.,ら,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:4987-4991; Dabovic,B.,ら
,1995,Mammalian Genome,6:571-580;およびLurquin, C.,ら,1997,Genomics.46:3
97-408）、およびＭＡＧＥ−Ｃ１（Lucas,S.,ら,1998,Cancer Res.58:743-752）
に属することが見出された。
面におけるＨＬＡ／ペプチド複合体として提示されるペプチドへと処理される遺
伝子の多数のファミリーは、その結果、細胞が特異的ＣＴＬにより溶解され、見
出された。これらの遺伝子は、“腫瘍拒絶抗原前駆体(tumour rejection antige
n precursors)”または“ＴＲＡＰ”分子をコードすると言われ、ＨＬＡと複合
体形成する、これから誘導されたペプチドは、“腫瘍拒絶抗原(tumour rejectio
n antigens)”または“ＴＲＡ”と称される。この分野に多くの努力がなされ、
Ｔ細胞に認識される多くのヒト腫瘍拒絶抗原（ＴＲＡＰとＴＲＡの両方）が同定
された（Van den Eynde, B.J.およびP.van der Bruggen, 1997, Curr.Opin.Immu
nol.9:684）。中でも、遺伝子ＭＡＧＥ−１にコードされたＴＲＡＰは、患者Ｍ
Ｚ２から誘導されたメラノーマ細胞の存在下で、同じ患者の血液リンパ球を培養
することによって最初に定義された。ＣＴＬクローンのパネルを混合リンパ球腫
瘍細胞培養（ＭＬＴＣ）技術によって作製し、これらのクローンの一つが、ＨＬ
Ａ−Ａ１に提示されたＭＡＧＥ−１ ＴＲＡＰから誘導されたノナペプチドＴＲ
Ａを認識した（van der Bruggen, P.,C.ら,1991,Science(Wash.DC).254:1643-16
47; Traversari, C.,ら,1992, J.Exp.Med.176:1453-1457およびWO92/20356）。
後に、ＭＡＧＥ−１が、少なくとも１７の関連遺伝子のファミリー、すなわちＭ
ＡＧＥ−１から−１２（現在、ＭＡＧＥ−Ａ１ないし−Ａ１２と呼ばれる）（De
Plaen,E.,ら1994,Immunogenetics,40:360-369）、ＭＡＧＥ−ＢＩから−Ｂ４（
Muscatelli,F.,ら,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:4987-4991; Dabovic,B.,ら
,1995,Mammalian Genome,6:571-580;およびLurquin, C.,ら,1997,Genomics.46:3
97-408）、およびＭＡＧＥ−Ｃ１（Lucas,S.,ら,1998,Cancer Res.58:743-752）
に属することが見出された。
【０００５】 このファミリーの遺伝子は、異なる組織学的タイプの種々の腫瘍において発現
されるが、精巣および胎盤を除いて正常組織では完全にサイレントである（De P
laen,E.,ら,1994,Immunogenetics.40:360-369;Dabovic,B.,ら,1995, Mammalian
Genome.6:571-580;Lurquin,C.,ら1997,Genomics.46:397-408;およびLucas,S.,ら
,1998,Cancer Res.58:743-752）。しかしながら、精巣の生殖細胞と胎盤の栄養
芽層は、ＭＨＣクラス１分子を発現せず（Haas,G.G.Jr.,ら,1988,Am.J.Reprod.I
mmunol.Microbiol.18:47-51）、これらの組織における遺伝子発現は、抗原発現
を誘導しない。確かに、オスのマウスをマウスＰ１Ａ遺伝子によってコードされ
る抗原（ヒトのＭＡＧＥ遺伝子と同じ発現パターンを有する、すなわち、腫瘍、
精巣および胎盤において発現されるが、別の正常な組織ではサイレントである）
で免疫化すると、精巣炎症または生殖能力の変更を引き起こさない、強いＰ１Ａ
−特異的ＣＴＬ反応がもたらされた（Uyttenhoveら,C.,C.ら,1997,Int.J.Cancer
.70:349-356）。それゆえ、ＭＡＧＥ遺伝子によってコードされた抗原は、ガン
のワクチンベース免疫療法の適切な候補であり、かつ、ある細胞をそのように処
置可能な腫瘍細胞として同定するための手段を提供するマーカーとして適切な候
補である。
されるが、精巣および胎盤を除いて正常組織では完全にサイレントである（De P
laen,E.,ら,1994,Immunogenetics.40:360-369;Dabovic,B.,ら,1995, Mammalian
Genome.6:571-580;Lurquin,C.,ら1997,Genomics.46:397-408;およびLucas,S.,ら
,1998,Cancer Res.58:743-752）。しかしながら、精巣の生殖細胞と胎盤の栄養
芽層は、ＭＨＣクラス１分子を発現せず（Haas,G.G.Jr.,ら,1988,Am.J.Reprod.I
mmunol.Microbiol.18:47-51）、これらの組織における遺伝子発現は、抗原発現
を誘導しない。確かに、オスのマウスをマウスＰ１Ａ遺伝子によってコードされ
る抗原（ヒトのＭＡＧＥ遺伝子と同じ発現パターンを有する、すなわち、腫瘍、
精巣および胎盤において発現されるが、別の正常な組織ではサイレントである）
で免疫化すると、精巣炎症または生殖能力の変更を引き起こさない、強いＰ１Ａ
−特異的ＣＴＬ反応がもたらされた（Uyttenhoveら,C.,C.ら,1997,Int.J.Cancer
.70:349-356）。それゆえ、ＭＡＧＥ遺伝子によってコードされた抗原は、ガン
のワクチンベース免疫療法の適切な候補であり、かつ、ある細胞をそのように処
置可能な腫瘍細胞として同定するための手段を提供するマーカーとして適切な候
補である。
【０００６】 しかしながら、今のところ、混合されたリンパ球腫瘍細胞培養（ＭＬＴＣ）か
ら誘導された自己ＣＴＬを使用することにより、ＭＡＧＥ−Ａ１、−Ａ３および
−Ａ６によってコードされたＴＲＡを同定可能であることしか証明されておらず
、また、先の遺伝子発現アッセイは、ＣＴＬ認識にはあまりに低いレベルでＭＡ
ＧＥ−Ａ１０が腫瘍に発現されることを示唆した。これら全てのＣＴＬは、一人
の患者、ＭＺ２のみから得られた（Traversari,C.,ら,1992,J.Exp.Med.176:1453
-1457; van der Bruggen,P.,ら,1994,Eur.J.Immunol.24:2134-2140; Gaugler,B.
,ら,1994,Exp.Med.179:921-930;De Plaen,E.,ら,1994, Immunogenetics.40:360-
369;およびP.van der Bruggen,unpublished data）。しかしながら、本発明者等
は、別のメラノーマ患者から自己ＣＴＬクローンを得ることができた（ＬＢ１７
５１）。これは、従来未知であった、ＭＡＧＥ−Ａ１０およびＭＡＧＥ−Ａ８に
よってコードされたＴＲＡを提示したＨＬＡ−Ａ２．１を認識し、同定を可能に
する。
ら誘導された自己ＣＴＬを使用することにより、ＭＡＧＥ−Ａ１、−Ａ３および
−Ａ６によってコードされたＴＲＡを同定可能であることしか証明されておらず
、また、先の遺伝子発現アッセイは、ＣＴＬ認識にはあまりに低いレベルでＭＡ
ＧＥ−Ａ１０が腫瘍に発現されることを示唆した。これら全てのＣＴＬは、一人
の患者、ＭＺ２のみから得られた（Traversari,C.,ら,1992,J.Exp.Med.176:1453
-1457; van der Bruggen,P.,ら,1994,Eur.J.Immunol.24:2134-2140; Gaugler,B.
,ら,1994,Exp.Med.179:921-930;De Plaen,E.,ら,1994, Immunogenetics.40:360-
369;およびP.van der Bruggen,unpublished data）。しかしながら、本発明者等
は、別のメラノーマ患者から自己ＣＴＬクローンを得ることができた（ＬＢ１７
５１）。これは、従来未知であった、ＭＡＧＥ−Ａ１０およびＭＡＧＥ−Ａ８に
よってコードされたＴＲＡを提示したＨＬＡ−Ａ２．１を認識し、同定を可能に
する。
【０００７】
従って、本発明は、ＭＨＣ分子型ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１
と複合体を形成可能な配列番号１（図７）または配列番号２（図８）に由来する
アミノ酸の未破壊配列を含むポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチ
ドは、ヒトのリンパ球から免疫応答を引き出すことができる、配列番号１または
２のアミノ酸の未破壊配列を含む。
と複合体を形成可能な配列番号１（図７）または配列番号２（図８）に由来する
アミノ酸の未破壊配列を含むポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチ
ドは、ヒトのリンパ球から免疫応答を引き出すことができる、配列番号１または
２のアミノ酸の未破壊配列を含む。
【０００８】 本発明に係るポリペプチドは、配列番号１または２からのアミノ酸配列の未破
壊配列を有するノナペプチドを含むことができ、ここで、Ｎ末端アミノ酸に隣接
するアミノ酸はＬまたはＭ、好ましくはＬであり、かつ、Ｃ末端アミノ酸はＬ、
ＶまたはＩ、好ましくはＬである。好ましくは、３位のアミノ酸がＹであり、か
つ／または４位のアミノ酸がＤであり、かつ／または５位のアミノ酸がＧであり
、かつ／または、７位のアミノ酸がＥであり、かつ／または、８位のアミノ酸が
Ｈである。アミノ酸の位置は、Ｎ末端からＣ末端へと番号が付され、Ｎ末端アミ
ノ酸が１位である。上記ポリペプチドは好ましくは、ＭＨＣ分子型ＨＬＡ−Ａ２
、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１と複合体を形成可能である。
壊配列を有するノナペプチドを含むことができ、ここで、Ｎ末端アミノ酸に隣接
するアミノ酸はＬまたはＭ、好ましくはＬであり、かつ、Ｃ末端アミノ酸はＬ、
ＶまたはＩ、好ましくはＬである。好ましくは、３位のアミノ酸がＹであり、か
つ／または４位のアミノ酸がＤであり、かつ／または５位のアミノ酸がＧであり
、かつ／または、７位のアミノ酸がＥであり、かつ／または、８位のアミノ酸が
Ｈである。アミノ酸の位置は、Ｎ末端からＣ末端へと番号が付され、Ｎ末端アミ
ノ酸が１位である。上記ポリペプチドは好ましくは、ＭＨＣ分子型ＨＬＡ−Ａ２
、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１と複合体を形成可能である。
【０００９】 本発明は、好ましくは、アミノ酸配列ＦＬＬＦＫＹＱＭＫ（配列番号４８）、
ＦＩＥＧＹＣＴＰＥ（配列番号４９）およびＧＬＥＬＡＱＡＰＬ（配列番号５０
）を有するノナペプチドを含まない。
ＦＩＥＧＹＣＴＰＥ（配列番号４９）およびＧＬＥＬＡＱＡＰＬ（配列番号５０
）を有するノナペプチドを含まない。
【００１０】 本発明のポリペプチドは、選択的に、上記ノナペプチド、そして好ましくは、
配列番号１または２からのアミノ酸の未破壊配列を含むデカペプチドであっても
よい。好ましい実施態様において、ノナペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＭ
ＥＨＬ（配列番号４２）またはＧＬＹＤＧＲＥＨＳ（配列番号４３）を有し、好
ましくはＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号４２）を有する。具体的に、デカペプチ
ドは、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩ（配列番号４４）またはＧＬＹＤＧＲ
ＥＨＳＶ（配列番号４５）とすることができ、好ましくはＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩ
（配列番号４４）とすることができる。
配列番号１または２からのアミノ酸の未破壊配列を含むデカペプチドであっても
よい。好ましい実施態様において、ノナペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＭ
ＥＨＬ（配列番号４２）またはＧＬＹＤＧＲＥＨＳ（配列番号４３）を有し、好
ましくはＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号４２）を有する。具体的に、デカペプチ
ドは、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩ（配列番号４４）またはＧＬＹＤＧＲ
ＥＨＳＶ（配列番号４５）とすることができ、好ましくはＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩ
（配列番号４４）とすることができる。
【００１１】 さらなる態様において、本発明は、上記ノナペプチドまたはデカペプチドを含
む約９３アミノ酸までの長さのポリペプチドまたはタンパクを含む。かかるポリ
ペプチドまたはタンパクは、配列番号１または２、好ましくは配列番号１からの
アミノ酸の未破壊配列を含む、もしくは当該配列からなることができる。
む約９３アミノ酸までの長さのポリペプチドまたはタンパクを含む。かかるポリ
ペプチドまたはタンパクは、配列番号１または２、好ましくは配列番号１からの
アミノ酸の未破壊配列を含む、もしくは当該配列からなることができる。
【００１２】 本発明にかかるポリペプチドは、好ましくは、ＭＨＣ分子型ＨＬＡ−Ａ２、好
ましくはＨＬＡ−Ａ２．１と複合体形成した際に、ヒトリンパ球から免疫応答を
引き出せることが好ましい。この免疫応答は、好ましくは、ヒトＴリンパ球、好
ましくはＣＤ８Ｔ細胞からの細胞溶解反応である。
ましくはＨＬＡ−Ａ２．１と複合体形成した際に、ヒトリンパ球から免疫応答を
引き出せることが好ましい。この免疫応答は、好ましくは、ヒトＴリンパ球、好
ましくはＣＤ８Ｔ細胞からの細胞溶解反応である。
【００１３】 さらなる態様において、本発明は、上記ポリペプチドを含むポリペプチドまた
はタンパクを提供し、前記ポリペプチドまたはタンパクのアミノ酸配列は、配列
番号１および２に記載された完全配列、または配列番号７（図１３）のヌクレオ
チド３３４−９１８にコードされた完全配列のいずれでもない。
はタンパクを提供し、前記ポリペプチドまたはタンパクのアミノ酸配列は、配列
番号１および２に記載された完全配列、または配列番号７（図１３）のヌクレオ
チド３３４−９１８にコードされた完全配列のいずれでもない。
【００１４】 また、本発明は、上記ポリペプチドまたはタンパクのいずれかに対して機能的
に等価な相同物であるポリペプチドまたはタンパクにまで拡大されるが、前記ポ
リペプチドまたはタンパクのアミノ酸配列が、配列番号１および２のいずれかに
記載された完全配列、または配列番号７のヌクレオチド３３４−９１８にコード
された完全配列ではないことを条件とする。本発明の実施態様において、ポリペ
プチドは、ＭＨＣ分子型 ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１と複合体
形成され得る。
に等価な相同物であるポリペプチドまたはタンパクにまで拡大されるが、前記ポ
リペプチドまたはタンパクのアミノ酸配列が、配列番号１および２のいずれかに
記載された完全配列、または配列番号７のヌクレオチド３３４−９１８にコード
された完全配列ではないことを条件とする。本発明の実施態様において、ポリペ
プチドは、ＭＨＣ分子型 ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１と複合体
形成され得る。
【００１５】 別の態様において、本発明は、本発明の上記態様にかかるポリペプチドまたは
タンパクをコードするヌクレオチド配列または相補的ヌクレオチド配列を含む核
酸分子を提供し、ここで前記ヌクレオチド配列は、配列番号３（図９）、配列番
号４（図１０ａおよび１０ｂ）、配列番号５（図１１ａおよび１１ｂ）、配列番
号６（図１２）および配列番号７（図１３）のいずれかに記載されるような完全
配列ではない。かかる核酸分子は、配列番号３、４または５からのヌクレオチド
の未破壊配列または相補配列、もしくは前記核酸分子のＲＮＡ転写物を含むこと
ができる。
タンパクをコードするヌクレオチド配列または相補的ヌクレオチド配列を含む核
酸分子を提供し、ここで前記ヌクレオチド配列は、配列番号３（図９）、配列番
号４（図１０ａおよび１０ｂ）、配列番号５（図１１ａおよび１１ｂ）、配列番
号６（図１２）および配列番号７（図１３）のいずれかに記載されるような完全
配列ではない。かかる核酸分子は、配列番号３、４または５からのヌクレオチド
の未破壊配列または相補配列、もしくは前記核酸分子のＲＮＡ転写物を含むこと
ができる。
【００１６】 好ましい実施態様においては、かかる核酸分子は、複数のエピトープまたはポ
リトープ(polytope)をコードすることができる。
リトープ(polytope)をコードすることができる。
【００１７】 さらなる態様において、本発明は、プロモーターに機能的に連結された上記核
酸分子を含む発現ベクターを提供する。本発明にかかる発現ベクターは、ＭＨＣ
分子型 ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１、サイトカインまたは共刺
激分子をコードするヌクレオチド配列、または、細菌性またはウイルス性ゲノム
もしくはその一部を含むことができる。
酸分子を含む発現ベクターを提供する。本発明にかかる発現ベクターは、ＭＨＣ
分子型 ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１、サイトカインまたは共刺
激分子をコードするヌクレオチド配列、または、細菌性またはウイルス性ゲノム
もしくはその一部を含むことができる。
【００１８】 さらなる態様において、本発明は、本発明にかかる発現ベクターを用いてトラ
ンスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞に関する。かかる宿主細胞
は、ＭＨＣ分子型 ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１、および／また
は、サイトカインまたは共刺激分子をコードする発現ベクターでトランスフォー
ムまたはトランスフェクトされてもよい。
ンスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞に関する。かかる宿主細胞
は、ＭＨＣ分子型 ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１、および／また
は、サイトカインまたは共刺激分子をコードする発現ベクターでトランスフォー
ムまたはトランスフェクトされてもよい。
【００１９】 さらに別の態様において、本発明は、本発明にかかる単離されたポリペプチド
またはタンパクに選択的に結合できる、または特異的な、ポリペプチド結合剤を
提供する。本発明にかかるポリペプチド結合剤は、本発明にかかる単離されたポ
リペプチドに特異的な、抗体、好ましくはモノクローナル抗体または抗体フラグ
メントを含むことができる。好ましくは、かかるポリペプチド結合剤は、本発明
にかかるポリペプチドと、ＭＨＣ分子型 ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ
２．１との複合体には選択的に結合できる、または特異的であるが、主要組織適
合分子のみには結合しないものとすることができる。さらに、本発明にかかるポ
リペプチド結合剤は、ＭＨＣ分子型 ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．
１と複合体形成した本発明にかかるポリペプチドを有する細胞を認識して選択的
に溶解するＣＴＬとＣＴＬクローンを含む。
またはタンパクに選択的に結合できる、または特異的な、ポリペプチド結合剤を
提供する。本発明にかかるポリペプチド結合剤は、本発明にかかる単離されたポ
リペプチドに特異的な、抗体、好ましくはモノクローナル抗体または抗体フラグ
メントを含むことができる。好ましくは、かかるポリペプチド結合剤は、本発明
にかかるポリペプチドと、ＭＨＣ分子型 ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ
２．１との複合体には選択的に結合できる、または特異的であるが、主要組織適
合分子のみには結合しないものとすることができる。さらに、本発明にかかるポ
リペプチド結合剤は、ＭＨＣ分子型 ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．
１と複合体形成した本発明にかかるポリペプチドを有する細胞を認識して選択的
に溶解するＣＴＬとＣＴＬクローンを含む。
【００２０】 別の態様において、本発明は、疾患、好ましくは腫瘍の治療、予防または診断
における、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパク、単離された核酸分子、
発現ベクター、宿主細胞、またはポリペプチド結合剤の使用に関する。かくして
、本発明は、任意に薬学的に許容できるキャリアーとの混合物形態で、本発明に
かかるポリペプチドまたはタンパク、核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、また
はポリペプチド結合剤を含み、任意に腫瘍組織適合分子の分子型 ＨＬＡ−Ａ２
、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１をさらに含む、疾患、好ましくは腫瘍の予防、治
療または診断用の薬学的組成物にも関する。かかる薬学的組成物は、抗腫瘍ワク
チンとして用いることができる。任意に、本発明にかかる薬学的組成物は、別の
ＴＲＡまたはＴＲＡＰ、別のＴＲＡまたはＴＲＡＰを発現する発現ベクターまた
は宿主細胞、もしくは別のＴＲＡまたはＴＲＡＰに特異的なポリペプチド結合剤
を含むことができる。別の実施態様では、本発明にかかる薬学的組成物は、さら
に共刺激分子を含むことができる。
における、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパク、単離された核酸分子、
発現ベクター、宿主細胞、またはポリペプチド結合剤の使用に関する。かくして
、本発明は、任意に薬学的に許容できるキャリアーとの混合物形態で、本発明に
かかるポリペプチドまたはタンパク、核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、また
はポリペプチド結合剤を含み、任意に腫瘍組織適合分子の分子型 ＨＬＡ−Ａ２
、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１をさらに含む、疾患、好ましくは腫瘍の予防、治
療または診断用の薬学的組成物にも関する。かかる薬学的組成物は、抗腫瘍ワク
チンとして用いることができる。任意に、本発明にかかる薬学的組成物は、別の
ＴＲＡまたはＴＲＡＰ、別のＴＲＡまたはＴＲＡＰを発現する発現ベクターまた
は宿主細胞、もしくは別のＴＲＡまたはＴＲＡＰに特異的なポリペプチド結合剤
を含むことができる。別の実施態様では、本発明にかかる薬学的組成物は、さら
に共刺激分子を含むことができる。
【００２１】 好ましい実施態様では、本発明にかかる薬学的組成物は、本発明にかかるポリ
ペプチドでパルスされて、腫瘍組織適合分子、ＨＬＡとの複合体として前記ペプ
チドをその表面に提示した抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは樹状細胞を含む
。
ペプチドでパルスされて、腫瘍組織適合分子、ＨＬＡとの複合体として前記ペプ
チドをその表面に提示した抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは樹状細胞を含む
。
【００２２】 別の態様では、本発明は、ペプチド-パルス化抗原提示細胞を提供する。
【００２３】 さらなる態様においては、本発明は、疾患、好ましくはガンの診断方法に関し
、患者から単離された生物学的サンプルを、本発明にかかるポリペプチドまたは
タンパク、もしくは本発明にかかる核酸分子に特異的な薬剤と接触させること、
および、疾患の測定として、サンプル中のあらゆるポリペプチド、タンパクまた
は核酸分子と前記試薬との間の相互作用をアッセイすることを含む。本発明のか
かる態様において用いられるこのポリペプチド結合剤は、本発明の上記態様にか
かるポリペプチド結合剤とすることができる。
、患者から単離された生物学的サンプルを、本発明にかかるポリペプチドまたは
タンパク、もしくは本発明にかかる核酸分子に特異的な薬剤と接触させること、
および、疾患の測定として、サンプル中のあらゆるポリペプチド、タンパクまた
は核酸分子と前記試薬との間の相互作用をアッセイすることを含む。本発明のか
かる態様において用いられるこのポリペプチド結合剤は、本発明の上記態様にか
かるポリペプチド結合剤とすることができる。
【００２４】 また、本発明は、腫瘍細胞に対して反応性の細胞溶解性Ｔ細胞培養反応を生じ
る方法にも関する。かかる方法は、個人からリンパ球サンプルを取り出す工程、
次いで、このリンパ球サンプルを本発明にかかるポリペプチドまたはタンパク、
本発明にかかる発現ベクター、または本発明にかかる宿主細胞と培養する工程を
含むことができる。本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクを含む抗原を発
現する腫瘍細胞に対して反応性の細胞溶解性Ｔ細胞を含む生成物は、疾患、好ま
しくは腫瘍の予防、治療または診断に使用することができ、これも、特に上記方
法により得られた、または得られる場合に、本発明に含まれる。
る方法にも関する。かかる方法は、個人からリンパ球サンプルを取り出す工程、
次いで、このリンパ球サンプルを本発明にかかるポリペプチドまたはタンパク、
本発明にかかる発現ベクター、または本発明にかかる宿主細胞と培養する工程を
含むことができる。本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクを含む抗原を発
現する腫瘍細胞に対して反応性の細胞溶解性Ｔ細胞を含む生成物は、疾患、好ま
しくは腫瘍の予防、治療または診断に使用することができ、これも、特に上記方
法により得られた、または得られる場合に、本発明に含まれる。
【００２５】 上述したように、本発明は、発現ベクターを使用して、宿主細胞および細胞系
統をトランスフォームまたはトランスフェクトすることを含むことができる。か
くして、本発明にかかるコードＤＮＡ配列を、宿主細胞において本発明にかかる
ポリペプチドまたはタンパク（ＤＮＡ配列によりコードされたもの）の発現に適
した発現ベクターに導入することができる。適切なベクターは、細菌性プラスミ
ド、ファージＤＮＡ、コスミド、酵母プラスミドおよびウイルスＤＮＡ、例えば
ポックスウイルス（例：ワクシニア）、レトロウイルス、バキュロウイルスおよ
びアデノウイルスＤＮＡを含む。この方法は、一般に、発現されるＤＮＡ配列を
、ｍＲＮＡ合成用のプロモーターに機能的に連結されるように適切な制限エンド
ヌクレアーゼ部位に挿入することを含む。コード配列および制御配列、例えばプ
ロモーター配列は、制御配列の影響下または制御下にコード配列の発現または転
写をおくように共有結合された場合に、“機能的に”連結されると考えられる。
得られたベクターを、適切な宿主細胞をトランスフォームまたはトランスフェク
トするために用いて、その宿主細胞に必要なポリペプチドまたはタンパクを発現
させることができる。適切な宿主細胞は、より高度な真核細胞、例えば、哺乳動
物細胞および昆虫細胞とすることができ、また、より低級の真核細胞、例えば酵
母細胞、もしくは細菌細胞のような原核細胞とすることができる。例としては、
大腸菌(E.coli)、ボウズ(Bowes)メラノーマ、ＣＨＯおよびＣＯＳ細胞を含む。
適切な宿主の選択と、その宿主細胞にベクターを導入する方法は、当業者の知識
の範囲内の事項である。しかしながら、適切な技術、原核および真核宿主と共に
用いるためのクローニングおよび発現ベクターについては、Sambrookら,Molecul
ar Cloning, A Laboratory Manual, Second edition, Coldspring Harbour, NY,
1989に記載されている。
統をトランスフォームまたはトランスフェクトすることを含むことができる。か
くして、本発明にかかるコードＤＮＡ配列を、宿主細胞において本発明にかかる
ポリペプチドまたはタンパク（ＤＮＡ配列によりコードされたもの）の発現に適
した発現ベクターに導入することができる。適切なベクターは、細菌性プラスミ
ド、ファージＤＮＡ、コスミド、酵母プラスミドおよびウイルスＤＮＡ、例えば
ポックスウイルス（例：ワクシニア）、レトロウイルス、バキュロウイルスおよ
びアデノウイルスＤＮＡを含む。この方法は、一般に、発現されるＤＮＡ配列を
、ｍＲＮＡ合成用のプロモーターに機能的に連結されるように適切な制限エンド
ヌクレアーゼ部位に挿入することを含む。コード配列および制御配列、例えばプ
ロモーター配列は、制御配列の影響下または制御下にコード配列の発現または転
写をおくように共有結合された場合に、“機能的に”連結されると考えられる。
得られたベクターを、適切な宿主細胞をトランスフォームまたはトランスフェク
トするために用いて、その宿主細胞に必要なポリペプチドまたはタンパクを発現
させることができる。適切な宿主細胞は、より高度な真核細胞、例えば、哺乳動
物細胞および昆虫細胞とすることができ、また、より低級の真核細胞、例えば酵
母細胞、もしくは細菌細胞のような原核細胞とすることができる。例としては、
大腸菌(E.coli)、ボウズ(Bowes)メラノーマ、ＣＨＯおよびＣＯＳ細胞を含む。
適切な宿主の選択と、その宿主細胞にベクターを導入する方法は、当業者の知識
の範囲内の事項である。しかしながら、適切な技術、原核および真核宿主と共に
用いるためのクローニングおよび発現ベクターについては、Sambrookら,Molecul
ar Cloning, A Laboratory Manual, Second edition, Coldspring Harbour, NY,
1989に記載されている。
【００２６】 本発明にかかる発現ベクターは、本発明にかかる特定のポリペプチドを提示す
るＨＬＡ分子をコードする核酸配列を含むことができる。あるいは、ＨＬＡ分子
をコードする核酸配列は、本発明にかかる宿主細胞内の別個の発現ベクター内に
含まれてもよい。ベクターが両方のコード配列を含む場合、いずれかを正常に発
現しない細胞をトランスフェクトするために単一のベクターを用いることができ
る。本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクと、これを提示するＨＬＡ分子
とに対するコード配列が別個の発現ベクターに含まれる場合には、発現ベクター
を共トランスフェクトすることができる。例えば、宿主細胞が、ＴＲＡを提示す
るＨＬＡ分子を既に発現する場合に、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパ
クをコードする配列を、単独で用いることができる。
るＨＬＡ分子をコードする核酸配列を含むことができる。あるいは、ＨＬＡ分子
をコードする核酸配列は、本発明にかかる宿主細胞内の別個の発現ベクター内に
含まれてもよい。ベクターが両方のコード配列を含む場合、いずれかを正常に発
現しない細胞をトランスフェクトするために単一のベクターを用いることができ
る。本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクと、これを提示するＨＬＡ分子
とに対するコード配列が別個の発現ベクターに含まれる場合には、発現ベクター
を共トランスフェクトすることができる。例えば、宿主細胞が、ＴＲＡを提示す
るＨＬＡ分子を既に発現する場合に、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパ
クをコードする配列を、単独で用いることができる。
【００２７】 哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡ発現のための好ましいシステムは、Ｇ４１８耐
性を与える遺伝子（安定にトランスフェクトした細胞系統の選択を容易にする）
およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列の
ような選択可能マーカーを含む、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen, Carlsbad, CA,
USAから入手可能）システムを含む。さらに、霊長類またはイヌの細胞系統にお
ける発現に適しているものはｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen）であり、これは
、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）複製起点を含み、マルチコピー染色体外
成分としてプラスミドの維持を容易にする。別の発現ベクターは、ポリペプチド
伸張因子１αのプロモーターを含むｐＥＦ-ＢＯＳプラスミドであり、これは、i
n vitroで効率的な転写を刺激する。このプラスミドは、MishizumaとNagata(Nuc
.Acids Res.18:5322,1990)により記載され、トランスフェクションにおけるその
使用については、例えばDemoulin(Mol.Cell.Biol.16:4710-4716, 1996)により開
示されている。別の好ましい発現ベクタは、Stratford-Perricaudet二より記載
されたアデノウイルスであり、これはＥ１およびＥ３タンパクに欠陥がある（J.
Clin.Invest.90:626-630,1992）。アデノ-Ｐ１Ａ組み換え体としてのアデノウイ
ルスの使用については、Warnierらによる、Ｐ１Ａに対する免疫化のためのマウ
スにおける皮内注射(Int.J.Cancer, 67:303-310,1996)に開示されている。
性を与える遺伝子（安定にトランスフェクトした細胞系統の選択を容易にする）
およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列の
ような選択可能マーカーを含む、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen, Carlsbad, CA,
USAから入手可能）システムを含む。さらに、霊長類またはイヌの細胞系統にお
ける発現に適しているものはｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen）であり、これは
、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）複製起点を含み、マルチコピー染色体外
成分としてプラスミドの維持を容易にする。別の発現ベクターは、ポリペプチド
伸張因子１αのプロモーターを含むｐＥＦ-ＢＯＳプラスミドであり、これは、i
n vitroで効率的な転写を刺激する。このプラスミドは、MishizumaとNagata(Nuc
.Acids Res.18:5322,1990)により記載され、トランスフェクションにおけるその
使用については、例えばDemoulin(Mol.Cell.Biol.16:4710-4716, 1996)により開
示されている。別の好ましい発現ベクタは、Stratford-Perricaudet二より記載
されたアデノウイルスであり、これはＥ１およびＥ３タンパクに欠陥がある（J.
Clin.Invest.90:626-630,1992）。アデノ-Ｐ１Ａ組み換え体としてのアデノウイ
ルスの使用については、Warnierらによる、Ｐ１Ａに対する免疫化のためのマウ
スにおける皮内注射(Int.J.Cancer, 67:303-310,1996)に開示されている。
【００２８】 上述したように、本発明は、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクに特
異的または選択的なポリペプチド結合剤を含むことができる。薬剤は、それが用
いられる状況において、別の分子との相互作用とは区別できるように、特定のポ
リペプチドまたはタンパクと相互作用できる場合に、その特定のポリペプチドま
たはタンパクに“特異的”であると考えられる。例えば、かかる薬剤は、特定の
アッセイにおいて一般に行われている条件下で、関連するポリペプチドまたはタ
ンパクに選択的に結合できる。用語“接触”は、生物学的サンプルを、特異的な
ポリペプチドまたはタンパクと薬剤とが特異的に相互作用するように、薬剤に十
分近くに、そして、適した条件下、例えば、濃度、温度、時間の下に配置するこ
とを意味する。薬剤と生物学的サンプルとを接触させるための適切な条件につい
ては、当業者に周知であり、特定のターゲット分子と特異的薬剤との間の特異的
相互作用を容易にするように選択される。ポリペプチド結合剤は、本発明にかか
るタンパクまたはポリペプチドの存在または不在を検出するためのスクリーニン
グアッセイにおいて、並びに、かかるタンパクおよびポリペプチドを単離するた
めの精製プロトコールにおいて、このように使用することができる。本発明にか
かるポリペプチド結合剤は、基質に付着させられた固定化抗体の形態であっても
よく、また、疾患を診断する本発明の方法は、患者から誘導されたタンパク含有
生物学的サンプルについて行われる通常の酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を含む
ことができる。あるいは、この方法は、薬剤がラベル化抗体であり、生物学的サ
ンプルが患者から誘導され、かつ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動す
ることによって分離されたタンパクを含むウエスタンブロットを含むことができ
る。ポリペプチド結合剤は、本発明にかかるポリペプチドを提示するガン細胞に
試薬、トキシン、または他の分子を選択的に仕向けるために使用することができ
る。このようにして、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクを発現する腫
瘍に存在する細胞を、細胞傷害性化合物で処理することができる。
異的または選択的なポリペプチド結合剤を含むことができる。薬剤は、それが用
いられる状況において、別の分子との相互作用とは区別できるように、特定のポ
リペプチドまたはタンパクと相互作用できる場合に、その特定のポリペプチドま
たはタンパクに“特異的”であると考えられる。例えば、かかる薬剤は、特定の
アッセイにおいて一般に行われている条件下で、関連するポリペプチドまたはタ
ンパクに選択的に結合できる。用語“接触”は、生物学的サンプルを、特異的な
ポリペプチドまたはタンパクと薬剤とが特異的に相互作用するように、薬剤に十
分近くに、そして、適した条件下、例えば、濃度、温度、時間の下に配置するこ
とを意味する。薬剤と生物学的サンプルとを接触させるための適切な条件につい
ては、当業者に周知であり、特定のターゲット分子と特異的薬剤との間の特異的
相互作用を容易にするように選択される。ポリペプチド結合剤は、本発明にかか
るタンパクまたはポリペプチドの存在または不在を検出するためのスクリーニン
グアッセイにおいて、並びに、かかるタンパクおよびポリペプチドを単離するた
めの精製プロトコールにおいて、このように使用することができる。本発明にか
かるポリペプチド結合剤は、基質に付着させられた固定化抗体の形態であっても
よく、また、疾患を診断する本発明の方法は、患者から誘導されたタンパク含有
生物学的サンプルについて行われる通常の酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を含む
ことができる。あるいは、この方法は、薬剤がラベル化抗体であり、生物学的サ
ンプルが患者から誘導され、かつ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動す
ることによって分離されたタンパクを含むウエスタンブロットを含むことができ
る。ポリペプチド結合剤は、本発明にかかるポリペプチドを提示するガン細胞に
試薬、トキシン、または他の分子を選択的に仕向けるために使用することができ
る。このようにして、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクを発現する腫
瘍に存在する細胞を、細胞傷害性化合物で処理することができる。
【００２９】 上述したように、本発明は、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクに選
択的に結合する能力を備えた抗体または抗体のフラグメントを含むことができる
。かかる抗体は、通常の手法に従って調製されたポリクローナルおよびモノクロ
ーナル抗体を含む。
択的に結合する能力を備えた抗体または抗体のフラグメントを含むことができる
。かかる抗体は、通常の手法に従って調製されたポリクローナルおよびモノクロ
ーナル抗体を含む。
【００３０】 本発明の抗体は、タンパク、タンパクのフラグメント、かかるタンパクまたは
そのフラグメントを提示する細胞等を動物に投与してポリクローナル抗体を誘導
することを含む、種々の方法のいずれかによって調製することができる。モノク
ローナル抗体の産生は、当該技術分野において周知の技術に従う。かかる抗体は
、例えば、タンパクを発現している組織を同定するため、あるいはタンパクを精
製するために用いられる。また、抗体は、視覚化のために特異的なラベリング剤
に結合されてもよく、また、これらに限定されないが、メトトレキサート、放射
性ヨウ素化化合物、リシンのような毒素、他の細胞増殖または細胞溶解剤等を含
む抗腫瘍剤に結合されてもよい。また、本発明に従って調製された抗体は、好ま
しくは、上記ＴＲＡ／ＨＬＡ複合体に特異的である。
そのフラグメントを提示する細胞等を動物に投与してポリクローナル抗体を誘導
することを含む、種々の方法のいずれかによって調製することができる。モノク
ローナル抗体の産生は、当該技術分野において周知の技術に従う。かかる抗体は
、例えば、タンパクを発現している組織を同定するため、あるいはタンパクを精
製するために用いられる。また、抗体は、視覚化のために特異的なラベリング剤
に結合されてもよく、また、これらに限定されないが、メトトレキサート、放射
性ヨウ素化化合物、リシンのような毒素、他の細胞増殖または細胞溶解剤等を含
む抗腫瘍剤に結合されてもよい。また、本発明に従って調製された抗体は、好ま
しくは、上記ＴＲＡ／ＨＬＡ複合体に特異的である。
【００３１】 顕著に、当該技術分野において周知であるように、抗体分子の小さい部分、パ
ラトープ(paratope)のみが、そのエピトープに対する抗体の結合に関与する（一
般的に、Clark W.R.(1986) The Experimental Foundations of Modern Immunolo
gy Wiley & Sons, Inc.,New York; Roitt, I(1991) Essential Immunology, 7th
Ed.,Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。例えば、ｐＦｃ'
およびＦｃ領域は、相補的カスケードのエフェクターであるが、抗原結合とは無
関係である。ｐＦｃ'領域が酵素的に切り出された抗体、あるいは、ｐＦｃ'領域
なしで生成された抗体、Ｆ（ａｂ'）2フラグメントと称される、は、完全な抗体
の抗原結合部位の両方を維持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された抗体
、またはＦｃ領域なしで生成された抗体、Ｆａｂフラグメントと称される、は、
完全な抗体分子の一つの抗原結合部位を維持する。Ｆａｂフラグメントは、Ｆｄ
と呼ばれる抗体重鎖の一部と、共有結合した抗体軽鎖とからなる。Ｆｄフラグメ
ントは、抗体特異性の主要な決定因子であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体
特異性を変更することなく、１０までの異なる軽鎖と結合することができる）、
Ｆｄフラグメントは、単離状態でエピトープ結合能力を維持する。
ラトープ(paratope)のみが、そのエピトープに対する抗体の結合に関与する（一
般的に、Clark W.R.(1986) The Experimental Foundations of Modern Immunolo
gy Wiley & Sons, Inc.,New York; Roitt, I(1991) Essential Immunology, 7th
Ed.,Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。例えば、ｐＦｃ'
およびＦｃ領域は、相補的カスケードのエフェクターであるが、抗原結合とは無
関係である。ｐＦｃ'領域が酵素的に切り出された抗体、あるいは、ｐＦｃ'領域
なしで生成された抗体、Ｆ（ａｂ'）2フラグメントと称される、は、完全な抗体
の抗原結合部位の両方を維持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された抗体
、またはＦｃ領域なしで生成された抗体、Ｆａｂフラグメントと称される、は、
完全な抗体分子の一つの抗原結合部位を維持する。Ｆａｂフラグメントは、Ｆｄ
と呼ばれる抗体重鎖の一部と、共有結合した抗体軽鎖とからなる。Ｆｄフラグメ
ントは、抗体特異性の主要な決定因子であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体
特異性を変更することなく、１０までの異なる軽鎖と結合することができる）、
Ｆｄフラグメントは、単離状態でエピトープ結合能力を維持する。
【００３２】 抗体の抗原結合部位において、当該技術分野において周知であるように、抗原
のエピトープと直接的に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープ
の三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般に、Clark,
1986; Roitt,1991を参照）。ＩｇＧイムノグロブリンの重鎖Ｆｄフラグメントと
軽鎖の両方には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によってそれ
ぞれ分断された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）が存在する。Ｃ
ＤＲ、特にＣＤＲ３領域、さらには重鎖ＣＤＲ３は、抗体特異性に極めて重要で
ある。
のエピトープと直接的に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープ
の三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般に、Clark,
1986; Roitt,1991を参照）。ＩｇＧイムノグロブリンの重鎖Ｆｄフラグメントと
軽鎖の両方には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によってそれ
ぞれ分断された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）が存在する。Ｃ
ＤＲ、特にＣＤＲ３領域、さらには重鎖ＣＤＲ３は、抗体特異性に極めて重要で
ある。
【００３３】 哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域が、元の抗体のエピトープ特異性を維持しながら
、非特異的または異種特異的な抗体の類似領域で置換できることが、当該技術分
野で確立された。これは、ヒトＦＲおよび／またはＦｃ／Ｆｃ'領域に非ヒトＣ
ＤＲが共有的に結合されて、機能的な抗体を生成する“ヒト化”抗体の展開と使
用において最も明確に現れる。かくして、例えば、ＰＣＴ国際公開公報WO92/043
81は、少なくとも一部のマウスＦＲ領域が、ヒト由来のＦＲ領域で置換されたヒ
ト化マウスＲＳＶ抗体の産生および使用を教示する。かかる抗体（抗原結合能力
を備えた完全な抗体のフラグメントを含む）は、しばしば、“キメラ”抗体と呼
ばれる。
、非特異的または異種特異的な抗体の類似領域で置換できることが、当該技術分
野で確立された。これは、ヒトＦＲおよび／またはＦｃ／Ｆｃ'領域に非ヒトＣ
ＤＲが共有的に結合されて、機能的な抗体を生成する“ヒト化”抗体の展開と使
用において最も明確に現れる。かくして、例えば、ＰＣＴ国際公開公報WO92/043
81は、少なくとも一部のマウスＦＲ領域が、ヒト由来のＦＲ領域で置換されたヒ
ト化マウスＲＳＶ抗体の産生および使用を教示する。かかる抗体（抗原結合能力
を備えた完全な抗体のフラグメントを含む）は、しばしば、“キメラ”抗体と呼
ばれる。
【００３４】 かくして、当業者であれば明らかなように、本発明は、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆａｂ
、ＦｖおよびＦｄフラグメント；ＦｃおよびまたはＦＲおよび／またはＣＤＲ１
および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非
ヒト配列によって置換されたキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／
またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非ヒト配列
によって置換されたキメラＦ（ａｂ'）2フラグメント抗体；ＦＲおよび／または
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同のヒト
または非ヒト配列によって置換されたキメラＦａｂフラグメント抗体；およびＦ
Ｒおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同のヒトまたは非ヒ
ト配列によって置換されたキメラＦｄフラグメント抗体をも提供する。また、本
発明は、いわゆる一本鎖抗体を含む。かくして、本発明は、本発明にかかるポリ
ペプチドおよびタンパクに特異的または選択的に結合する、多数の大きさおよび
タイプのポリペプチドを含むことができる。これらのポリペプチドは、抗体技術
以外のソースからも誘導することができる。例えば、かかるポリペプチド結合剤
は、溶液、固定化形態またはファージディスプレーライブラリーとして容易に調
製することができる変質ペプチドライブラリーによって提供されうる。コンビナ
トリアルライブラリーも、一以上のアミノ酸を含むペプチドから合成できる。ラ
イブラリーは、ペプチドおよび非ペプチド合成分子から合成することができる。
、ＦｖおよびＦｄフラグメント；ＦｃおよびまたはＦＲおよび／またはＣＤＲ１
および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非
ヒト配列によって置換されたキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／
またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非ヒト配列
によって置換されたキメラＦ（ａｂ'）2フラグメント抗体；ＦＲおよび／または
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同のヒト
または非ヒト配列によって置換されたキメラＦａｂフラグメント抗体；およびＦ
Ｒおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同のヒトまたは非ヒ
ト配列によって置換されたキメラＦｄフラグメント抗体をも提供する。また、本
発明は、いわゆる一本鎖抗体を含む。かくして、本発明は、本発明にかかるポリ
ペプチドおよびタンパクに特異的または選択的に結合する、多数の大きさおよび
タイプのポリペプチドを含むことができる。これらのポリペプチドは、抗体技術
以外のソースからも誘導することができる。例えば、かかるポリペプチド結合剤
は、溶液、固定化形態またはファージディスプレーライブラリーとして容易に調
製することができる変質ペプチドライブラリーによって提供されうる。コンビナ
トリアルライブラリーも、一以上のアミノ酸を含むペプチドから合成できる。ラ
イブラリーは、ペプチドおよび非ペプチド合成分子から合成することができる。
【００３５】 ファージディスプレーは、本発明に従って使用できる結合ペプチドを同定する
のに特に有効である。概して、通常の方法を用いて、４ないし約８０のアミノ酸
残基の挿入物を示す、ファージライブラリーを調製する（例えば、ｍ１３、ｆｄ
またはラムダファージを使用）。この挿入物は、完全な変質または偏ったアレー
を示してもよい。次いで、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクに結合す
る挿入物を有するファージを選別する。この方法は、本発明にかかるポリペプチ
ドまたはタンパクに結合するファージを数回再選択することによって繰り返され
る。繰り返すことにより、特定の配列を有するファージが豊富になる。ＤＮＡ配
列分析を行って、発現されたポリペプチドの配列を同定することができる。本発
明にかかるポリペプチドまたはタンパクに結合する配列の最小線形部位を調べる
ことができる。一部または全ての最小線形部位＋その上流または下流に一以上の
付加的な変質残基を含む挿入物を含む偏ったライブラリーを用いる方法を繰り返
すことができる。かくして、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクは、フ
ァージディスプレーライブラリーを含むペプチドライブラリーをスクリーニング
するため、本発明のポリペプチドのペプチド結合パートナーを同定および選別す
るために使用することができる。かかる分子は、上述したように、スクリーニン
グアッセイ、診断アッセイ、精製プロトコール、または薬剤、毒素および／また
はラベル化試薬（例えば、ラジオアイソトープ、蛍光分子等）を、細胞表面に本
発明にかかるポリペプチドまたはタンパクを発現する細胞に仕向けるために用い
ることができる。かかる結合剤分子は、本発明にかかるポリペプチドまたはタン
パクとＨＬＡ分子との複合体を結合するように、かかる複合体を用いて結合剤を
選別することによって調製することができる。かかる複合体を発現する腫瘍細胞
を無能にするか、破壊する薬剤分子は、当業者に公知であり、商業的に入手可能
である。例えば、イムノトキシン技術は、抗体またはそのフラグメントにより細
胞へと誘導される場合に、有効な毒素の例を提供する。毒素の例は、植物から誘
導されたリボソーム損傷毒素または細菌毒素、例えば、リシン、アブリン、サポ
リン、シュードモナスエンドトキシン、ジフテリア毒素、Ａ鎖毒素、ブロック化
リシン等を含む。
のに特に有効である。概して、通常の方法を用いて、４ないし約８０のアミノ酸
残基の挿入物を示す、ファージライブラリーを調製する（例えば、ｍ１３、ｆｄ
またはラムダファージを使用）。この挿入物は、完全な変質または偏ったアレー
を示してもよい。次いで、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクに結合す
る挿入物を有するファージを選別する。この方法は、本発明にかかるポリペプチ
ドまたはタンパクに結合するファージを数回再選択することによって繰り返され
る。繰り返すことにより、特定の配列を有するファージが豊富になる。ＤＮＡ配
列分析を行って、発現されたポリペプチドの配列を同定することができる。本発
明にかかるポリペプチドまたはタンパクに結合する配列の最小線形部位を調べる
ことができる。一部または全ての最小線形部位＋その上流または下流に一以上の
付加的な変質残基を含む挿入物を含む偏ったライブラリーを用いる方法を繰り返
すことができる。かくして、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクは、フ
ァージディスプレーライブラリーを含むペプチドライブラリーをスクリーニング
するため、本発明のポリペプチドのペプチド結合パートナーを同定および選別す
るために使用することができる。かかる分子は、上述したように、スクリーニン
グアッセイ、診断アッセイ、精製プロトコール、または薬剤、毒素および／また
はラベル化試薬（例えば、ラジオアイソトープ、蛍光分子等）を、細胞表面に本
発明にかかるポリペプチドまたはタンパクを発現する細胞に仕向けるために用い
ることができる。かかる結合剤分子は、本発明にかかるポリペプチドまたはタン
パクとＨＬＡ分子との複合体を結合するように、かかる複合体を用いて結合剤を
選別することによって調製することができる。かかる複合体を発現する腫瘍細胞
を無能にするか、破壊する薬剤分子は、当業者に公知であり、商業的に入手可能
である。例えば、イムノトキシン技術は、抗体またはそのフラグメントにより細
胞へと誘導される場合に、有効な毒素の例を提供する。毒素の例は、植物から誘
導されたリボソーム損傷毒素または細菌毒素、例えば、リシン、アブリン、サポ
リン、シュードモナスエンドトキシン、ジフテリア毒素、Ａ鎖毒素、ブロック化
リシン等を含む。
【００３６】 ここに記載した発明は、多数の使用を備えるが、その一部を以下に記載する。
第一に、本発明は、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクの発現により特
徴付けられる疾患の診断を可能にする。この方法は、本発明にかかるポリペプチ
ドまたはタンパクをコードする遺伝子の発現を調べることを含む。前者の場合に
は、かかる測定は、ポリメラーゼ連鎖反応またはラベルされたハイブリダイゼー
ションプローブを用いたアッセイを含む、標準的な核酸測定アッセイによって実
施することができる。一方、後者の場合には、抗体のような、本発明にかかるポ
リペプチド結合剤を用いてアッセイすることが好ましい。測定の別の方法は、Ｃ
ＴＬ活性についてアッセイすることにより、ペプチド特異的ＣＴＬによるＴＲＡ
／ＨＬＡ複合体の認識についてアッセイすることである。かかるアッセイは、以
下に記載したタイプの、ＴＮＦ放出アッセイ、クロム放出アッセイ、または、Ｅ
ＬＩＳＰＯＴと呼ばれる技術（ＣＴＬ活性が、ＩＦＮ-γまたはＴＮＦα放出の
抗体検出を介して検出される）を含む（Schimittelら(1997).J.Immunol.Methods
210:167-174およびLalvaniら J.Exp.Med.186:859-865(1997)）。
第一に、本発明は、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクの発現により特
徴付けられる疾患の診断を可能にする。この方法は、本発明にかかるポリペプチ
ドまたはタンパクをコードする遺伝子の発現を調べることを含む。前者の場合に
は、かかる測定は、ポリメラーゼ連鎖反応またはラベルされたハイブリダイゼー
ションプローブを用いたアッセイを含む、標準的な核酸測定アッセイによって実
施することができる。一方、後者の場合には、抗体のような、本発明にかかるポ
リペプチド結合剤を用いてアッセイすることが好ましい。測定の別の方法は、Ｃ
ＴＬ活性についてアッセイすることにより、ペプチド特異的ＣＴＬによるＴＲＡ
／ＨＬＡ複合体の認識についてアッセイすることである。かかるアッセイは、以
下に記載したタイプの、ＴＮＦ放出アッセイ、クロム放出アッセイ、または、Ｅ
ＬＩＳＰＯＴと呼ばれる技術（ＣＴＬ活性が、ＩＦＮ-γまたはＴＮＦα放出の
抗体検出を介して検出される）を含む（Schimittelら(1997).J.Immunol.Methods
210:167-174およびLalvaniら J.Exp.Med.186:859-865(1997)）。
【００３７】 ここに記載したＣＴＬクローンによって認識される他のＴＲＡＰまたはＴＲＡ
は、ここに詳細に記載する方法で単離することができる。
は、ここに詳細に記載する方法で単離することができる。
【００３８】 当業者に周知の種々の方法を、本発明の主題のような単離されたＴＲＡおよび
ＴＲＡＰ分子を得るために利用することができる。このタンパクは、このタンパ
クを自然に産生する細胞から精製することができる。あるいは、このタンパクを
産生するように、発現ベクターを細胞に導入してもよい。別の方法では、ｍＲＮ
Ａ転写物を細胞にマイクロインジェクションまたは導入して、コードされたタン
パクの産生を引き起こしてもよい。網状赤血球溶解システムのような細胞を含ま
ない抽出物におけるｍＲＮＡの翻訳も、タンパクを産生するために使用すること
ができる。また、本発明のＴＲＡを含むペプチドは、in vitroで合成できる。当
業者であれば、それらから誘導された単離されたＴＲＡＰおよび／またはＴＲＡ
を得るために、タンパクを単離する周知の方法を容易に実施することもできる。
これらは、イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲルろ過クロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティークロマトグラフィ
ーを含むが、これらに限定されない。
ＴＲＡＰ分子を得るために利用することができる。このタンパクは、このタンパ
クを自然に産生する細胞から精製することができる。あるいは、このタンパクを
産生するように、発現ベクターを細胞に導入してもよい。別の方法では、ｍＲＮ
Ａ転写物を細胞にマイクロインジェクションまたは導入して、コードされたタン
パクの産生を引き起こしてもよい。網状赤血球溶解システムのような細胞を含ま
ない抽出物におけるｍＲＮＡの翻訳も、タンパクを産生するために使用すること
ができる。また、本発明のＴＲＡを含むペプチドは、in vitroで合成できる。当
業者であれば、それらから誘導された単離されたＴＲＡＰおよび／またはＴＲＡ
を得るために、タンパクを単離する周知の方法を容易に実施することもできる。
これらは、イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲルろ過クロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティークロマトグラフィ
ーを含むが、これらに限定されない。
【００３９】 本発明にかかるポリペプチドまたはタンパク、もしくは、本発明にかかる、こ
れらとＨＬＡとの複合体は、アジュバントのような物質と組合せられて、本発明
にかかるポリペプチドまたはタンパクの発現により特徴付けられる疾患を処置す
ることに使用できるワクチンを生成する。
れらとＨＬＡとの複合体は、アジュバントのような物質と組合せられて、本発明
にかかるポリペプチドまたはタンパクの発現により特徴付けられる疾患を処置す
ることに使用できるワクチンを生成する。
【００４０】 開示に基づく一部の治療方法は、患者の免疫システムによる応答を前提とし、
ＴＲＡ提示細胞の溶解を導く。かかるアプローチの一つは、問題の表現型の異常
細胞を備えた患者に対して、複合体に特異的な自己ＣＴＬを投与することである
。かかるＣＴＬをin vitroで生成することは当業者の技術範囲である。一般的に
、患者から得られた細胞のサンプル、例えば血液細胞は、複合体を提示し、かつ
、ＣＴＬを誘発して増殖することのできる細胞と接触させられる。ターゲット細
胞は、ＣＯＳ細胞のようなトランスフェクタントとすることができる。これらの
トランスフェクタントは、その表面に所望の複合体を提示し、問題のＣＴＬと組
み合わせられた場合にその増殖を刺激する。ＣＯＳ細胞は、広く入手でき、他の
適切な宿主細胞も入手可能である。ＣＴＬの特異的産生は、当業者に周知である
。抗原特異的ＣＴＬクローンを選別する一つの方法が最近記載され（Altmanら,S
cience 274:94-96,1996; Dunbarら,Curr.Biol.8:413-416,1998）、この方法では
、ＭＨＣクラスＩ分子／ペプチド複合体の発蛍光テトラマーが特異的ＣＴＬクロ
ーンを検出するために使用される。要するに、可溶性ＭＨＣクラスＩ分子が、β 2 -マイクログロブリンと、クラスＩ分子に結合するペプチド抗原の存在下で、in
vitroで折り畳まれる。精製後、ＭＨＣ／ペプチド複合体が精製され、ビオチン
でラベルされる。テトラマーは、ビオチニル化ペプチド-ＭＨＣ複合体と、ラベ
ル化アビジン（例えば、フィコエリトリン）を、４：１のモル比で混合すること
により形成される。次いで、テトラマーは、末梢血液またはリンパ節のようなＣ
ＴＬの源と接触させられる。このテトラマーは、ペプチド抗原／ＭＨＣクラスＩ
複合体を認識するＣＴＬと結合する。テトラマーが結合した細胞は、反応性ＣＴ
Ｌを単離するための蛍光活性化細胞選別によって選別することができる。単離さ
れたＣＴＬは、in vitroで膨張させられる。このクローン的に膨張した自己ＣＴ
Ｌを、患者に投与することができる。本発明にかかるポリペプチドまたはタンパ
クに特異的な別のＣＴＬを、同様の方法で単離および投与することができる。
ＴＲＡ提示細胞の溶解を導く。かかるアプローチの一つは、問題の表現型の異常
細胞を備えた患者に対して、複合体に特異的な自己ＣＴＬを投与することである
。かかるＣＴＬをin vitroで生成することは当業者の技術範囲である。一般的に
、患者から得られた細胞のサンプル、例えば血液細胞は、複合体を提示し、かつ
、ＣＴＬを誘発して増殖することのできる細胞と接触させられる。ターゲット細
胞は、ＣＯＳ細胞のようなトランスフェクタントとすることができる。これらの
トランスフェクタントは、その表面に所望の複合体を提示し、問題のＣＴＬと組
み合わせられた場合にその増殖を刺激する。ＣＯＳ細胞は、広く入手でき、他の
適切な宿主細胞も入手可能である。ＣＴＬの特異的産生は、当業者に周知である
。抗原特異的ＣＴＬクローンを選別する一つの方法が最近記載され（Altmanら,S
cience 274:94-96,1996; Dunbarら,Curr.Biol.8:413-416,1998）、この方法では
、ＭＨＣクラスＩ分子／ペプチド複合体の発蛍光テトラマーが特異的ＣＴＬクロ
ーンを検出するために使用される。要するに、可溶性ＭＨＣクラスＩ分子が、β 2 -マイクログロブリンと、クラスＩ分子に結合するペプチド抗原の存在下で、in
vitroで折り畳まれる。精製後、ＭＨＣ／ペプチド複合体が精製され、ビオチン
でラベルされる。テトラマーは、ビオチニル化ペプチド-ＭＨＣ複合体と、ラベ
ル化アビジン（例えば、フィコエリトリン）を、４：１のモル比で混合すること
により形成される。次いで、テトラマーは、末梢血液またはリンパ節のようなＣ
ＴＬの源と接触させられる。このテトラマーは、ペプチド抗原／ＭＨＣクラスＩ
複合体を認識するＣＴＬと結合する。テトラマーが結合した細胞は、反応性ＣＴ
Ｌを単離するための蛍光活性化細胞選別によって選別することができる。単離さ
れたＣＴＬは、in vitroで膨張させられる。このクローン的に膨張した自己ＣＴ
Ｌを、患者に投与することができる。本発明にかかるポリペプチドまたはタンパ
クに特異的な別のＣＴＬを、同様の方法で単離および投与することができる。
【００４１】 治療方法を詳説するために、養子免疫伝達（Greenberg.J.Immunol.136(5):191
7,1986; Riddelら.Science 257:238,1992; Lynchら,Eur.J.Immunol.21:1403-141
0,1991; Kastら, Cell 59:603-614,1989）を挙げることができ、所望の複合体を
提示する細胞を、ＣＴＬを含む末梢血液リンパ球と組み合わせ、それに特異的な
ＣＴＬを増殖させる。増殖したＣＴＬを、特定の複合体を提示する異常細胞の一
部によって特徴付けられる細胞性異常の患者に投与する。次いで、ＣＴＬが異常
細胞を溶解し、これによって所望の治療結果を達成する。
7,1986; Riddelら.Science 257:238,1992; Lynchら,Eur.J.Immunol.21:1403-141
0,1991; Kastら, Cell 59:603-614,1989）を挙げることができ、所望の複合体を
提示する細胞を、ＣＴＬを含む末梢血液リンパ球と組み合わせ、それに特異的な
ＣＴＬを増殖させる。増殖したＣＴＬを、特定の複合体を提示する異常細胞の一
部によって特徴付けられる細胞性異常の患者に投与する。次いで、ＣＴＬが異常
細胞を溶解し、これによって所望の治療結果を達成する。
【００４２】 上記治療は、少なくとも一部の患者の異常細胞が、関連するＨＬＡ／ＴＲＡ複
合体を提示することを仮定する。これは、この技術が、特定のＨＬＡ分子を提示
する細胞を同定する方法、並びに、直接関係のある配列のタンパクまたはＤＮＡ
を発現する細胞を同定する方法に非常に密接であることから、非常に容易に調べ
ることができる。この場合、ＭＡＧＥ−Ａ１０発現は、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１
０ ＤＮＡの独特の部分からのプライマーを用いるＰＣＲアッセイを行うことに
よって調べることができる。あるいは、他の周知の抗体をベースとする技術を、
関連するＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を提示する細胞を同定するために用いることがで
きる。関連する複合体を提示する細胞が上記スクリーニング方法により同定され
たら、これらを、ＣＴＬを含む患者由来のサンプルと組み合わせることができる
。複合体提示細胞が混合されたＣＴＬサンプルによって溶解された場合は、ＴＲ
Ａが提示されていること、および、この患者が、上記治療アプローチに適した候
補であることが推定できる。
合体を提示することを仮定する。これは、この技術が、特定のＨＬＡ分子を提示
する細胞を同定する方法、並びに、直接関係のある配列のタンパクまたはＤＮＡ
を発現する細胞を同定する方法に非常に密接であることから、非常に容易に調べ
ることができる。この場合、ＭＡＧＥ−Ａ１０発現は、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１
０ ＤＮＡの独特の部分からのプライマーを用いるＰＣＲアッセイを行うことに
よって調べることができる。あるいは、他の周知の抗体をベースとする技術を、
関連するＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を提示する細胞を同定するために用いることがで
きる。関連する複合体を提示する細胞が上記スクリーニング方法により同定され
たら、これらを、ＣＴＬを含む患者由来のサンプルと組み合わせることができる
。複合体提示細胞が混合されたＣＴＬサンプルによって溶解された場合は、ＴＲ
Ａが提示されていること、および、この患者が、上記治療アプローチに適した候
補であることが推定できる。
【００４３】 養子移入は、本発明に従って利用できる治療の形態のみではない。ＣＴＬは、
多数のアプローチを用いてin vivoにおいて誘発されうる。
多数のアプローチを用いてin vivoにおいて誘発されうる。
【００４４】 一部のアプローチは、ワクチンのような複合体を発現する非増殖性細胞を利用
するものである。かかるワクチンは、その表面にＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を提示す
る、本発明にかかる宿主細胞とすることができる細胞から調製可能である。この
アプローチで用いられる細胞は、放射線照射された非増殖性腫瘍細胞または非増
殖性トランスフェクタントのような、複合体を正常に発現するものである。Chen
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:110-114 (1991)は、このアプローチを例示し、
ＨＰＶ Ｅ７ペプチドを発現するトランスフェクションされた細胞の治療方法に
おける使用を示している。種々の細胞タイプを使用することができる。同様に、
問題の遺伝子の一方または両方を有するベクターを使用することができる。ウイ
ルス性または細菌性ベクターは、特に好ましい。例えば、本発明にかかるポリペ
プチドまたはタンパクをコードする核酸を、一部の組織または細胞タイプにおい
て、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクを発現させるプロモーターおよ
びエンハンサー配列に機能的に連結することができる。この核酸は、発現ベクタ
ーに取り込むことができる。発現ベクターは、本発明にかかるポリペプチドまた
はタンパクをコードする核酸のような、外因性核酸の挿入を可能にするように構
成または修飾された、未修飾の染色体外核酸、プラスミドまたはウイルスゲノム
とすることができる。本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクをコードする
核酸は、レトロウイルスゲノムに挿入することもできる。こうすることにより、
ターゲット組織または細胞タイプのゲノムに核酸の組み込みを容易にする。これ
らのシステムでは、問題の遺伝子は、微生物、例えばワクシニアウイルス、レト
ロウイルスまたは細菌ＢＣＧに保有され、事実上、この物質が宿主細胞に“感染
”する。その結果得られた細胞は、問題の複合体を提示し、自己ＣＴＬによって
認識され、次いで増殖する。細胞がワクチンとして用いられる全ての場合におい
て、これらは、ＣＴＬ応答を誘発するのに必要な成分の一方または両方をコード
する配列でトランスフェクションされた細胞、または、トランスフェクションの
必要性のない両方の分子を既に発現している細胞とすることができる。これらの
細胞は、本発明のＴＲＡまたはそれから誘導されたペプチドで“パルス”された
樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）であってもよい（Nestleら N
at.Med.4:328-332,1998; Mukherjiら Proc.Nat.Acad.Sci.USA.92:8078-8082,199
5; Huら Cancer Res.56:2479-2483, 1996）。
するものである。かかるワクチンは、その表面にＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を提示す
る、本発明にかかる宿主細胞とすることができる細胞から調製可能である。この
アプローチで用いられる細胞は、放射線照射された非増殖性腫瘍細胞または非増
殖性トランスフェクタントのような、複合体を正常に発現するものである。Chen
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:110-114 (1991)は、このアプローチを例示し、
ＨＰＶ Ｅ７ペプチドを発現するトランスフェクションされた細胞の治療方法に
おける使用を示している。種々の細胞タイプを使用することができる。同様に、
問題の遺伝子の一方または両方を有するベクターを使用することができる。ウイ
ルス性または細菌性ベクターは、特に好ましい。例えば、本発明にかかるポリペ
プチドまたはタンパクをコードする核酸を、一部の組織または細胞タイプにおい
て、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクを発現させるプロモーターおよ
びエンハンサー配列に機能的に連結することができる。この核酸は、発現ベクタ
ーに取り込むことができる。発現ベクターは、本発明にかかるポリペプチドまた
はタンパクをコードする核酸のような、外因性核酸の挿入を可能にするように構
成または修飾された、未修飾の染色体外核酸、プラスミドまたはウイルスゲノム
とすることができる。本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクをコードする
核酸は、レトロウイルスゲノムに挿入することもできる。こうすることにより、
ターゲット組織または細胞タイプのゲノムに核酸の組み込みを容易にする。これ
らのシステムでは、問題の遺伝子は、微生物、例えばワクシニアウイルス、レト
ロウイルスまたは細菌ＢＣＧに保有され、事実上、この物質が宿主細胞に“感染
”する。その結果得られた細胞は、問題の複合体を提示し、自己ＣＴＬによって
認識され、次いで増殖する。細胞がワクチンとして用いられる全ての場合におい
て、これらは、ＣＴＬ応答を誘発するのに必要な成分の一方または両方をコード
する配列でトランスフェクションされた細胞、または、トランスフェクションの
必要性のない両方の分子を既に発現している細胞とすることができる。これらの
細胞は、本発明のＴＲＡまたはそれから誘導されたペプチドで“パルス”された
樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）であってもよい（Nestleら N
at.Med.4:328-332,1998; Mukherjiら Proc.Nat.Acad.Sci.USA.92:8078-8082,199
5; Huら Cancer Res.56:2479-2483, 1996）。
【００４５】 また、ワクチンは、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクをコードする
裸のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。これらは、in vitroで生成され、注入、粒子ボ
ンバードメント、鼻腔吸入およびその他の方法により投与されてもよい。“裸の
核酸”タイプのワクチンは、裸の核酸によりコードされたペプチドに特異的なＣ
ＴＬの生成を含む免疫学的応答を誘発することが証明されている（Science 259:
1745-1748,1993）。ここで“疾患”を用いた場合、この用語は、腫瘍拒絶抗原前
駆体が発現されるあらゆる病理的状態を指す。かかる疾患の例は、ガン、特にメ
ラノーマである。
裸のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。これらは、in vitroで生成され、注入、粒子ボ
ンバードメント、鼻腔吸入およびその他の方法により投与されてもよい。“裸の
核酸”タイプのワクチンは、裸の核酸によりコードされたペプチドに特異的なＣ
ＴＬの生成を含む免疫学的応答を誘発することが証明されている（Science 259:
1745-1748,1993）。ここで“疾患”を用いた場合、この用語は、腫瘍拒絶抗原前
駆体が発現されるあらゆる病理的状態を指す。かかる疾患の例は、ガン、特にメ
ラノーマである。
【００４６】 同様の効果は、in vitroにおいてＨＬＡ提示細胞への取り込みを容易にするア
ジュバントと、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクとを組み合わせるこ
とにより達成できる。本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクは、さらなる
処理を必要とすることなく、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクを提示
する分子と複合体を形成する。一般的に、患者は、本発明にかかるポリペプチド
またはタンパクの有効量の皮内注射を受けることができる。当該技術分野におい
て標準的な、免疫化プロトコールに従って、初期投与の後に、追加抗原刺激を行
うことができる。
ジュバントと、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクとを組み合わせるこ
とにより達成できる。本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクは、さらなる
処理を必要とすることなく、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパクを提示
する分子と複合体を形成する。一般的に、患者は、本発明にかかるポリペプチド
またはタンパクの有効量の皮内注射を受けることができる。当該技術分野におい
て標準的な、免疫化プロトコールに従って、初期投与の後に、追加抗原刺激を行
うことができる。
【００４７】 “ポリトープ”として知られる一連のエピトープをコードする核酸が特に好ま
しい。エピトープは、天然の隣接配列があってもなくてもよいが、連続的または
重複的にアレンジすることができ（例えば、Thompsonら Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 92:5845-5849,1995; Gilbertら Nature Biotechnol.15: 1280-1284,1997を参
照）、所望であれば、無関係のリンカー配列で分離されてもよい。ポリトープは
、免疫応答の生成のための免疫システムにより認識される生成された個々のエピ
トープへと処理される。
しい。エピトープは、天然の隣接配列があってもなくてもよいが、連続的または
重複的にアレンジすることができ（例えば、Thompsonら Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 92:5845-5849,1995; Gilbertら Nature Biotechnol.15: 1280-1284,1997を参
照）、所望であれば、無関係のリンカー配列で分離されてもよい。ポリトープは
、免疫応答の生成のための免疫システムにより認識される生成された個々のエピ
トープへと処理される。
【００４８】 かくして、例えば、本発明にかかり、ＭＨＣ分子により提示され、ＣＴＬまた
はＴヘルパーリンパ球によって認識されるペプチドを、別の腫瘍拒絶抗原由来の
ペプチド（例えば、ハイブリッド核酸またはポリペプチドを調製することによる
）と組み合わせて“ポリトープ”を形成することができる。免疫応答を誘導また
は増強するために投与することができる例示的な腫瘍関連ペプチド抗原は、腫瘍
関連遺伝子から誘導され、コードされたタンパクは、ＭＡＧＥ-１、ＭＡＧＥ-２
、ＭＡＧＥ-３、ＭＡＧＥ-４、ＭＡＧＥ-５、ＭＡＧＥ-６、ＭＡＧＥ-７、ＭＡ
ＧＥ-８、ＭＡＧＥ-９、ＭＡＧＥ-１０、ＭＡＧＥ-１１、ＭＡＧＥ-１２、ＭＡ
ＧＥ-１３、ＧＡＧＥ-１、ＧＡＧＥ-２、ＧＡＧＥ-３、ＧＡＧＥ-４、ＧＡＧＥ-
５、ＧＡＧＥ-６、ＧＡＧＥ-７、ＧＡＧＥ-８、ＢＡＧＥ-１、ＲＡＧＥ-１、Ｒ
ＡＧＥ-２、ＲＡＧＥ-３、ＲＡＧＥ-４、ＬＢ３３／ＭＵＭ-１、ＤＡＧＥ（ＰＲ
ＡＭＥ）、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ-Ｘｐ２（ＭＡＧＥ-Ｂ２）、ＭＡＧＥ-Ｘｐ３、（
ＭＡＧＥ-Ｂ３）、ＭＡＧＥ-Ｘｐ４（ＭＡＧＥ-Ｂ４）、チロシナーゼ、脳グリ
コーゲンホスホリラーゼ、メラン-Ａ、ＭＡＧＥ-Ｃ１、ＭＡＧＥ-Ｃ２、ＮＹ-Ｅ
ＳＯ-１、ＬＡＧＥ-１、ＳＳＸ-１、ＳＳＸ-２（ＨＯＭ-ＭＥＬ-４０）、ＳＳＸ
-４、ＳＳＸ-５、ＳＣＰ-１およびＣＴ-７を含む。例えば、腫瘍の特徴である抗
原ペプチドは、以下の表Ａに記載されたものを含む。
はＴヘルパーリンパ球によって認識されるペプチドを、別の腫瘍拒絶抗原由来の
ペプチド（例えば、ハイブリッド核酸またはポリペプチドを調製することによる
）と組み合わせて“ポリトープ”を形成することができる。免疫応答を誘導また
は増強するために投与することができる例示的な腫瘍関連ペプチド抗原は、腫瘍
関連遺伝子から誘導され、コードされたタンパクは、ＭＡＧＥ-１、ＭＡＧＥ-２
、ＭＡＧＥ-３、ＭＡＧＥ-４、ＭＡＧＥ-５、ＭＡＧＥ-６、ＭＡＧＥ-７、ＭＡ
ＧＥ-８、ＭＡＧＥ-９、ＭＡＧＥ-１０、ＭＡＧＥ-１１、ＭＡＧＥ-１２、ＭＡ
ＧＥ-１３、ＧＡＧＥ-１、ＧＡＧＥ-２、ＧＡＧＥ-３、ＧＡＧＥ-４、ＧＡＧＥ-
５、ＧＡＧＥ-６、ＧＡＧＥ-７、ＧＡＧＥ-８、ＢＡＧＥ-１、ＲＡＧＥ-１、Ｒ
ＡＧＥ-２、ＲＡＧＥ-３、ＲＡＧＥ-４、ＬＢ３３／ＭＵＭ-１、ＤＡＧＥ（ＰＲ
ＡＭＥ）、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ-Ｘｐ２（ＭＡＧＥ-Ｂ２）、ＭＡＧＥ-Ｘｐ３、（
ＭＡＧＥ-Ｂ３）、ＭＡＧＥ-Ｘｐ４（ＭＡＧＥ-Ｂ４）、チロシナーゼ、脳グリ
コーゲンホスホリラーゼ、メラン-Ａ、ＭＡＧＥ-Ｃ１、ＭＡＧＥ-Ｃ２、ＮＹ-Ｅ
ＳＯ-１、ＬＡＧＥ-１、ＳＳＸ-１、ＳＳＸ-２（ＨＯＭ-ＭＥＬ-４０）、ＳＳＸ
-４、ＳＳＸ-５、ＳＣＰ-１およびＣＴ-７を含む。例えば、腫瘍の特徴である抗
原ペプチドは、以下の表Ａに記載されたものを含む。
【００４９】 表Ａ：例示的抗原
【表Ａ】
【００５０】 別の例も、当業者に周知であり（例えば、Coulie,Stem Cells 13:393-403,199
5を参照）、ここに記載されたものと同様に本発明で用いることができる。当業
者であれば、分子生物学の標準的手法に従って、一以上のＭＡＧＥ−Ａ１０ペプ
チドと一以上の上記腫瘍拒絶ペプチドを含むポリペプチド、もしくはかかるポリ
ペプチドをコードする核酸を調製することができる。
5を参照）、ここに記載されたものと同様に本発明で用いることができる。当業
者であれば、分子生物学の標準的手法に従って、一以上のＭＡＧＥ−Ａ１０ペプ
チドと一以上の上記腫瘍拒絶ペプチドを含むポリペプチド、もしくはかかるポリ
ペプチドをコードする核酸を調製することができる。
【００５１】 かくして、ポリトープは、種々のアレンジで組み合わせられた（例えば、連結
、重複）、二つ以上の潜在的に免疫原性または免疫反応刺激性ペプチドのグルー
プである。このポリトープ（またはポリトープをコードする核酸）は、免疫反応
を刺激、増強および／または誘発することにおけるポリトープの有効性を試験す
るために、標準的な免疫化プロトコールで、例えば動物に投与することができる
。
、重複）、二つ以上の潜在的に免疫原性または免疫反応刺激性ペプチドのグルー
プである。このポリトープ（またはポリトープをコードする核酸）は、免疫反応
を刺激、増強および／または誘発することにおけるポリトープの有効性を試験す
るために、標準的な免疫化プロトコールで、例えば動物に投与することができる
。
【００５２】 ポリペプチドは、ポリトープを形成するために隣接配列の使用を介して、また
は直接的に結合され、ワクチンとしてポリトープを使用することは、当該技術分
野で周知である（例えば、Thomsonら, Proc.Acad.Sci USA 92(13):5485-5849,19
95; Gilbertら, Nature Biotechnol.15(12):1280:1284,1997; Thomsonら,J.Immu
nol.157(2):822:826,1996; Tamら,J.Exp.Med.171(1):299-306,1996参照）。例え
ば、Tamは、ＭＨＣクラスＩおよびクラスII結合エピトープの両方からなるポリ
トープが、マウスモデルにおいて、抗体および保護免疫を生成できたことを示し
ている。また、Tamは、エピトープの“つながり(string)”を有するポリトープ
が処理されて、ＭＨＣ分子により提示され、ＣＴＬにより認識される個々のエピ
トープを生じることも証明した。かくして、種々の数および組合せのエピトープ
を含むポリトープを調製することができ、ＣＴＬによる認識について、および免
疫応答の増大における効力について試験することができる。
は直接的に結合され、ワクチンとしてポリトープを使用することは、当該技術分
野で周知である（例えば、Thomsonら, Proc.Acad.Sci USA 92(13):5485-5849,19
95; Gilbertら, Nature Biotechnol.15(12):1280:1284,1997; Thomsonら,J.Immu
nol.157(2):822:826,1996; Tamら,J.Exp.Med.171(1):299-306,1996参照）。例え
ば、Tamは、ＭＨＣクラスＩおよびクラスII結合エピトープの両方からなるポリ
トープが、マウスモデルにおいて、抗体および保護免疫を生成できたことを示し
ている。また、Tamは、エピトープの“つながり(string)”を有するポリトープ
が処理されて、ＭＨＣ分子により提示され、ＣＴＬにより認識される個々のエピ
トープを生じることも証明した。かくして、種々の数および組合せのエピトープ
を含むポリトープを調製することができ、ＣＴＬによる認識について、および免
疫応答の増大における効力について試験することができる。
【００５３】 腫瘍が、一組の腫瘍抗原を発現することが知られている。その一部のサブセッ
トのみが、所定の患者の腫瘍に発現されうる。特定の患者に発現された腫瘍拒絶
抗原のサブセットを示すエピトープの異なる組合せに対応するポリトープを調製
できる。ポリトープは、腫瘍タイプによって発現されることが知られたより広い
スペクトルの腫瘍拒絶抗原を反映するように調製することができる。ポリトープ
は、ポリペプチド構造物として、あるいは、当該技術分野で公知の核酸輸送シス
テムを使用して、かかる治療を必要とする患者に導入することができる（例えば
、Allsopら,Eur.J.Immunol.26(8):1951-1959,1996を参照）。アデノウイルス、
ポックスウイルス、Ｔｙ-ウイルス様粒子、アデノ関連ウイルス、プラスミド、
細菌等をかかる輸送に使用することができる。輸送システムの効力を調べるため
に、マウスモデルにおいてポリトープ輸送システムをテストすることができる。
このシステムは、ヒトの臨床試験でもテストできる。
トのみが、所定の患者の腫瘍に発現されうる。特定の患者に発現された腫瘍拒絶
抗原のサブセットを示すエピトープの異なる組合せに対応するポリトープを調製
できる。ポリトープは、腫瘍タイプによって発現されることが知られたより広い
スペクトルの腫瘍拒絶抗原を反映するように調製することができる。ポリトープ
は、ポリペプチド構造物として、あるいは、当該技術分野で公知の核酸輸送シス
テムを使用して、かかる治療を必要とする患者に導入することができる（例えば
、Allsopら,Eur.J.Immunol.26(8):1951-1959,1996を参照）。アデノウイルス、
ポックスウイルス、Ｔｙ-ウイルス様粒子、アデノ関連ウイルス、プラスミド、
細菌等をかかる輸送に使用することができる。輸送システムの効力を調べるため
に、マウスモデルにおいてポリトープ輸送システムをテストすることができる。
このシステムは、ヒトの臨床試験でもテストできる。
【００５４】 免疫化プロトコールの一部として、免疫応答を増す物質を、本発明にかかる薬
学的組成物の核酸またはペプチド成分またはガンワクチンと共に投与することが
できる。かかる免疫応答増強化合物は、アジュバントまたはサイトカインのいず
れかに分類される。アジュバントは、抗原の保有を与えること（細胞外またはマ
クロファージ内）、マクロファージを活性化すること、並びにリンパ球の特異的
セットを刺激することによって免疫反応を増強することができる。多くの種類の
アジュバントが当該技術分野で周知であり、特別な例としては、ＭＰＬ（SmithK
line Beecham）、Salmonella minnesota Re 595リポポリサッカリドの精製およ
び酸加水分解によって得られたコンジナー、ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、
Quillja saponaria抽出物から精製された純粋なＱＡ-２１サポニン、およびスク
アレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製された種々の
油中水型エマルションが含まれる。また、サイトカインも、リンパ球刺激特性の
結果として予防接種プロトコールにおいて使用できる。かかる目的で使用できる
多くのサイトカインが、当業者に知られており、ワクチンの保護効果を増強する
ことが示されたインターロイキン１２（ＩＬ-１２）（Science 268:1432-1434,1
995）、ＧＭ-ＣＳＦおよびＩＬ-１８を含む。ここに記載したように、サイトカ
インは、それらをコードした核酸分子を発現するようにトランスフォームまたは
トランスフェクトされた細胞により、in vivoで産生することができる。
学的組成物の核酸またはペプチド成分またはガンワクチンと共に投与することが
できる。かかる免疫応答増強化合物は、アジュバントまたはサイトカインのいず
れかに分類される。アジュバントは、抗原の保有を与えること（細胞外またはマ
クロファージ内）、マクロファージを活性化すること、並びにリンパ球の特異的
セットを刺激することによって免疫反応を増強することができる。多くの種類の
アジュバントが当該技術分野で周知であり、特別な例としては、ＭＰＬ（SmithK
line Beecham）、Salmonella minnesota Re 595リポポリサッカリドの精製およ
び酸加水分解によって得られたコンジナー、ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、
Quillja saponaria抽出物から精製された純粋なＱＡ-２１サポニン、およびスク
アレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製された種々の
油中水型エマルションが含まれる。また、サイトカインも、リンパ球刺激特性の
結果として予防接種プロトコールにおいて使用できる。かかる目的で使用できる
多くのサイトカインが、当業者に知られており、ワクチンの保護効果を増強する
ことが示されたインターロイキン１２（ＩＬ-１２）（Science 268:1432-1434,1
995）、ＧＭ-ＣＳＦおよびＩＬ-１８を含む。ここに記載したように、サイトカ
インは、それらをコードした核酸分子を発現するようにトランスフォームまたは
トランスフェクトされた細胞により、in vivoで産生することができる。
【００５５】 予防接種プロトコールにおいて使用することができる多くの付加的な免疫反応
増強化合物が存在する。これらは、タンパクまたは核酸形態のいずれかで提供さ
れた共刺激分子を含む。かかる共刺激分子は、樹状細胞（ＤＣ）上に発現され、
かつ、Ｔ細胞上に発現されたＣＤ２８分子と相互作用できる、Ｂ７−１およびＢ
７−２（それぞれ、ＣＤ８０およびＣＤ８６）分子を含む。この相互作用は、共
刺激（シグナル２）を抗原／ＭＨＣ／ＴＣＲ刺激（シグナル１）Ｔ細胞に与え、
細胞増殖とエフェクター機能を増強する。また、Ｂ７は、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４
（ＣＤ１５２）と相互作用し、ＣＴＬＡ４とＢ７リガンドに関係する研究が、Ｂ
７−ＣＴＬＡ４相互作用が、抗腫瘍免疫およびＣＴＬ増殖を増強できることを示
唆した（Zhengら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6284-6289,1998）。
増強化合物が存在する。これらは、タンパクまたは核酸形態のいずれかで提供さ
れた共刺激分子を含む。かかる共刺激分子は、樹状細胞（ＤＣ）上に発現され、
かつ、Ｔ細胞上に発現されたＣＤ２８分子と相互作用できる、Ｂ７−１およびＢ
７−２（それぞれ、ＣＤ８０およびＣＤ８６）分子を含む。この相互作用は、共
刺激（シグナル２）を抗原／ＭＨＣ／ＴＣＲ刺激（シグナル１）Ｔ細胞に与え、
細胞増殖とエフェクター機能を増強する。また、Ｂ７は、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４
（ＣＤ１５２）と相互作用し、ＣＴＬＡ４とＢ７リガンドに関係する研究が、Ｂ
７−ＣＴＬＡ４相互作用が、抗腫瘍免疫およびＣＴＬ増殖を増強できることを示
唆した（Zhengら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6284-6289,1998）。
【００５６】 Ｂ７は、通常、腫瘍細胞上に発現されないので、Ｔ細胞にとって効率的な抗原
提示細胞（ＡＰＣ）ではない。Ｂ７発現の誘導は、腫瘍細胞がより効率的なＣＴ
Ｌ増殖およびエフェクター機能を刺激することを可能にする。Ｂ７／ＩＬ−６／
ＩＬ-１２の組合せによる共刺激は、Ｔ細胞集団におけるＩＦＮ−γおよびＴｈ
１サイトカインプロフィールを誘導して、さらに増加したＴ細胞活性を導くこと
が示されている（Gajewskiら,J.Immunol.154:5637-5648,1995）。Ｂ７を用いた
腫瘍細胞トランスフェクションは、Wangら、(J.Immunol.19:1-8,1986)により、
養子移植免疫治療のためのin vitroＣＴＬ膨張と関連して議論されている。Ｂ７
分子の他の輸送メカニズムは、核酸（裸のＤＮＡ）免疫化（Kimら,Nature Biote
chnol.15:7:641-646,1997）および、アデノおよびポックスのような組み換えウ
イルス（Wendtnerら,Gene Ther.4:726-735,1997）を含む。これらのシステムは
、Ｂ７と、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパク（ポリトープを含む）の
ような、他の選択分子、またはサイトカインの、共発現用の発現カセットの構築
および使用に用いることができる。これらの誘導システムは、in vitroでの予防
接種条件において、適切な分子を導入するために使用できる。in vitroおよびin
vivoにおいて直接的にＴ細胞を刺激するための抗ＣＤ２８抗体の使用も考慮で
きる。
提示細胞（ＡＰＣ）ではない。Ｂ７発現の誘導は、腫瘍細胞がより効率的なＣＴ
Ｌ増殖およびエフェクター機能を刺激することを可能にする。Ｂ７／ＩＬ−６／
ＩＬ-１２の組合せによる共刺激は、Ｔ細胞集団におけるＩＦＮ−γおよびＴｈ
１サイトカインプロフィールを誘導して、さらに増加したＴ細胞活性を導くこと
が示されている（Gajewskiら,J.Immunol.154:5637-5648,1995）。Ｂ７を用いた
腫瘍細胞トランスフェクションは、Wangら、(J.Immunol.19:1-8,1986)により、
養子移植免疫治療のためのin vitroＣＴＬ膨張と関連して議論されている。Ｂ７
分子の他の輸送メカニズムは、核酸（裸のＤＮＡ）免疫化（Kimら,Nature Biote
chnol.15:7:641-646,1997）および、アデノおよびポックスのような組み換えウ
イルス（Wendtnerら,Gene Ther.4:726-735,1997）を含む。これらのシステムは
、Ｂ７と、本発明にかかるポリペプチドまたはタンパク（ポリトープを含む）の
ような、他の選択分子、またはサイトカインの、共発現用の発現カセットの構築
および使用に用いることができる。これらの誘導システムは、in vitroでの予防
接種条件において、適切な分子を導入するために使用できる。in vitroおよびin
vivoにおいて直接的にＴ細胞を刺激するための抗ＣＤ２８抗体の使用も考慮で
きる。
【００５７】 リンパ球機能関連抗原-３（ＬＦＡ−３）がＡＰＣおよび一部の腫瘍細胞に発
現され、Ｔ細胞上に発現されたＣＤ２と相互作用する。この相互作用は、Ｔ細胞
ＩＬ−２とＩＦＮ−γ産生を誘導し、かくして、Ｂ７／ＣＤ２８共刺激相互作用
を補足できるが置換しない（Parraら,J.Immunol.,158:637-642,1997; Fentonら,
J.Immunother.21:95-108,1998）。
現され、Ｔ細胞上に発現されたＣＤ２と相互作用する。この相互作用は、Ｔ細胞
ＩＬ−２とＩＦＮ−γ産生を誘導し、かくして、Ｂ７／ＣＤ２８共刺激相互作用
を補足できるが置換しない（Parraら,J.Immunol.,158:637-642,1997; Fentonら,
J.Immunother.21:95-108,1998）。
【００５８】 リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）は、白血球に発現され、ＡＰＣおよ
び一部の腫瘍細胞上に発現されたＩＣＡＭ−１と相互作用する。この相互作用は
、Ｔ細胞ＩＬ−２とＩＦＮ−γ産生を誘導し、かくして、Ｂ７／ＣＤ２８共刺激
相互作用を補足できるが置換しない（Fentonら,1998）。ＬＦＡ−１は、かくし
て、Ｂ７について上に記載した種々の方法の予防接種プロトコールに提供されう
る共刺激分子のさらなる例である。
び一部の腫瘍細胞上に発現されたＩＣＡＭ−１と相互作用する。この相互作用は
、Ｔ細胞ＩＬ−２とＩＦＮ−γ産生を誘導し、かくして、Ｂ７／ＣＤ２８共刺激
相互作用を補足できるが置換しない（Fentonら,1998）。ＬＦＡ−１は、かくし
て、Ｂ７について上に記載した種々の方法の予防接種プロトコールに提供されう
る共刺激分子のさらなる例である。
【００５９】 完全なＣＴＬ活性化およびエフェクター機能は、Ｔｈ細胞ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４
０リガンド）分子とＤＣに発現されたＣＤ４０分子との間の相互作用を介する、
Ｔｈ細胞の助けを必要とする（Ridgeら,Nature 393:474,1998; Bennettら,Natur
e 393:478, 1998; Schoenbergerら,Nature 393:480,1998）。この共刺激シグナ
ルのこのメカニズムは、Ｂ７のアップレギュレーションに関与すると考えられ、
ＤＣ（ＡＰＣ）によるＩＬ−６／ＩＬ−１２産生と関連する。ＣＤ４０−ＣＤ４
０Ｌ相互作用は、かくして、シグナル１（抗原／ＭＨＣ−ＴＣＲ）とシグナル２
（Ｂ７−ＣＤ２８）相互作用を補足する。
０リガンド）分子とＤＣに発現されたＣＤ４０分子との間の相互作用を介する、
Ｔｈ細胞の助けを必要とする（Ridgeら,Nature 393:474,1998; Bennettら,Natur
e 393:478, 1998; Schoenbergerら,Nature 393:480,1998）。この共刺激シグナ
ルのこのメカニズムは、Ｂ７のアップレギュレーションに関与すると考えられ、
ＤＣ（ＡＰＣ）によるＩＬ−６／ＩＬ−１２産生と関連する。ＣＤ４０−ＣＤ４
０Ｌ相互作用は、かくして、シグナル１（抗原／ＭＨＣ−ＴＣＲ）とシグナル２
（Ｂ７−ＣＤ２８）相互作用を補足する。
【００６０】 ＤＣ細胞を直接的に刺激するための抗ＣＤ４０抗体の使用は、非プロフェッシ
ョナルＡＰＣ（腫瘍細胞）により提示されるか、炎症の外側で通常遭遇する腫瘍
関連抗原に対する反応を増強することが期待される。かかる状況において、Ｔｈ
ヘルプおよびＢ７共刺激シグナルは提供されない。このメカニズムは、抗原パル
ス化ＤＣをベースとする治療、または、Ｔｈエピトープが周知の腫瘍関連抗原前
駆体内に定義されていない状況において用いることができる。
ョナルＡＰＣ（腫瘍細胞）により提示されるか、炎症の外側で通常遭遇する腫瘍
関連抗原に対する反応を増強することが期待される。かかる状況において、Ｔｈ
ヘルプおよびＢ７共刺激シグナルは提供されない。このメカニズムは、抗原パル
ス化ＤＣをベースとする治療、または、Ｔｈエピトープが周知の腫瘍関連抗原前
駆体内に定義されていない状況において用いることができる。
【００６１】 本発明にかかる薬学的組成物は、全身または局部投与に関して、通常薬学的に
許容できるキャリアーおよび賦形剤と共に製剤化することができる。かかるキャ
リアーおよび賦形剤は、当業者に困難を与えることなく選択することができ、即
時および持続放出を与えるものを含む。
許容できるキャリアーおよび賦形剤と共に製剤化することができる。かかるキャ
リアーおよび賦形剤は、当業者に困難を与えることなく選択することができ、即
時および持続放出を与えるものを含む。
【００６２】 本発明は、初めて、ＭＬＴＣにより、ＭＺ２以外の患者から、ＭＡＧＥ-特異
的ＣＴＬを生成することを含む。ＨＬＡ−Ａ２という面において、ＭＡＧＥ−Ａ
１０によりコードされたナノペプチド（ＴＲＡ）ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号
４２）を認識するＣＴＬクローン（ＣＴＬ４７７Ａ／５）が生成された。その重
複するデカペプチド（ＴＲＡ）ＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩ（配列番号４４）は、効率
は低いが、ＣＴＬにより溶解されるターゲット細胞を感作することができた。Ｃ
ＴＬ４４７Ａ／５は、自己腫瘍細胞だけでなく、別のＨＬＡ−Ａ２患者の腫瘍細
胞＋ＭＡＧＥ−Ａ１０をも認識し（図６）、これは、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列
番号４２）が、ＭＡＧＥ−Ａ１０とＨＬＡ−Ａ２を発現する腫瘍において提示さ
れた共通のＴＲＡであることを示唆する。ＭＡＧＥ−Ａ１０は、以前に予想され
たものよりも多く腫瘍に発現される。逆転写ＰＣＲにより、ＭＡＧＥ−Ａ１０遺
伝子の発現は、メラノーマ、肺ガン、頭部および首部の癌腫、膀胱の癌腫、ミエ
ローマ、前立腺の癌腫、および（以下の表２参照）を含む、種々の腫瘍において
検出されている。別のＭＡＧＥ遺伝子について観察されるように、ＭＡＧＥ−Ａ
１０を発現する正常組織は、精巣のみである。
的ＣＴＬを生成することを含む。ＨＬＡ−Ａ２という面において、ＭＡＧＥ−Ａ
１０によりコードされたナノペプチド（ＴＲＡ）ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号
４２）を認識するＣＴＬクローン（ＣＴＬ４７７Ａ／５）が生成された。その重
複するデカペプチド（ＴＲＡ）ＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩ（配列番号４４）は、効率
は低いが、ＣＴＬにより溶解されるターゲット細胞を感作することができた。Ｃ
ＴＬ４４７Ａ／５は、自己腫瘍細胞だけでなく、別のＨＬＡ−Ａ２患者の腫瘍細
胞＋ＭＡＧＥ−Ａ１０をも認識し（図６）、これは、ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列
番号４２）が、ＭＡＧＥ−Ａ１０とＨＬＡ−Ａ２を発現する腫瘍において提示さ
れた共通のＴＲＡであることを示唆する。ＭＡＧＥ−Ａ１０は、以前に予想され
たものよりも多く腫瘍に発現される。逆転写ＰＣＲにより、ＭＡＧＥ−Ａ１０遺
伝子の発現は、メラノーマ、肺ガン、頭部および首部の癌腫、膀胱の癌腫、ミエ
ローマ、前立腺の癌腫、および（以下の表２参照）を含む、種々の腫瘍において
検出されている。別のＭＡＧＥ遺伝子について観察されるように、ＭＡＧＥ−Ａ
１０を発現する正常組織は、精巣のみである。
【００６３】 臨床試験は、メラノーマ患者を、ＭＡＧＥ−Ａ１およびＭＡＧＥ−Ａ３から誘
導されたペプチドで処置する方法であった。一部の患者は、純粋なペプチドで免
疫化した後に客観的な腫瘍退行を示したが、ペプチド特異的ＣＴＬ反応は検出さ
れなかった（Marchand,M.ら,1995,Int.J.Cancer.63:883-885）。ペプチド-パル
ス化抗原提示細胞または樹状細胞で免疫化した場合、極めて少数の患者が、ペプ
チド特異的遅延型過剰感作またはＣＴＬ反応を生じた（Nestle,F.O.,ら,1998, N
at.Med.4:328-332; Mukherji,B.,Net al.,1995, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:80
78-8082;およびHu,X.ら,1996,Cancer Res.56:2479-2483）。ガン免疫治療におけ
る障害の一つは、抗原を失った腫瘍変異体の出現である。ＭＡＧＥ-Ａ１０を発
現するほとんどの腫瘍がＭＡＧＥ-Ａ１および／またはＭＡＧＥ-Ａ３を発現する
ので（F.Brasseur,未公開データ）、カクテル予防接種における本発明にかかる
ペプチドの添加が、いくつかの異なる抗原をターゲットとすることにより抗腫瘍
効果を改善することが予想される。
導されたペプチドで処置する方法であった。一部の患者は、純粋なペプチドで免
疫化した後に客観的な腫瘍退行を示したが、ペプチド特異的ＣＴＬ反応は検出さ
れなかった（Marchand,M.ら,1995,Int.J.Cancer.63:883-885）。ペプチド-パル
ス化抗原提示細胞または樹状細胞で免疫化した場合、極めて少数の患者が、ペプ
チド特異的遅延型過剰感作またはＣＴＬ反応を生じた（Nestle,F.O.,ら,1998, N
at.Med.4:328-332; Mukherji,B.,Net al.,1995, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:80
78-8082;およびHu,X.ら,1996,Cancer Res.56:2479-2483）。ガン免疫治療におけ
る障害の一つは、抗原を失った腫瘍変異体の出現である。ＭＡＧＥ-Ａ１０を発
現するほとんどの腫瘍がＭＡＧＥ-Ａ１および／またはＭＡＧＥ-Ａ３を発現する
ので（F.Brasseur,未公開データ）、カクテル予防接種における本発明にかかる
ペプチドの添加が、いくつかの異なる抗原をターゲットとすることにより抗腫瘍
効果を改善することが予想される。
【００６４】 以下の例は、ＭＬＴＣ技術を使用して、患者ＬＢ１７５１由来の細胞溶解性Ｔ
リンパ球（ＣＴＬ）を生成することを示す。これは、ＭＡＧＥ−Ａ１０を発現す
るターゲット細胞との刺激により、特異的に自己腫瘍細胞を溶解し、腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）を生じる。ＣＴＬによる認識は、ＨＬＡ−Ａ２．１により制限され
ることが示され、抗原が、ｎｔ５４７−８２５の領域においてＭＡＧＥ−Ａ１０
によりコードされることが見出された。この領域に対応するアミノ酸配列から、
ＨＬＡ−Ａ２．１に結合できる４つのペプチドを見出した。ＭＡＧＥ−Ａ１０の
発現は、種々の腫瘍において検出されたが、精巣を除く正常組織には検出されな
かった。また、同定された抗原ペプチドは、それゆえ、抗腫瘍予防接種に用いら
れる可能性を有する抗原のレパートリーに当然に加えられる。
リンパ球（ＣＴＬ）を生成することを示す。これは、ＭＡＧＥ−Ａ１０を発現す
るターゲット細胞との刺激により、特異的に自己腫瘍細胞を溶解し、腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）を生じる。ＣＴＬによる認識は、ＨＬＡ−Ａ２．１により制限され
ることが示され、抗原が、ｎｔ５４７−８２５の領域においてＭＡＧＥ−Ａ１０
によりコードされることが見出された。この領域に対応するアミノ酸配列から、
ＨＬＡ−Ａ２．１に結合できる４つのペプチドを見出した。ＭＡＧＥ−Ａ１０の
発現は、種々の腫瘍において検出されたが、精巣を除く正常組織には検出されな
かった。また、同定された抗原ペプチドは、それゆえ、抗腫瘍予防接種に用いら
れる可能性を有する抗原のレパートリーに当然に加えられる。
【００６５】 配列の簡単な説明 配列番号１は、ＭＡＧＥ−Ａ１０遺伝子によりコードされたタンパクのアミノ
酸配列である； 配列番号２は、ＭＡＧＥ−Ａ８遺伝子によりコードされたタンパクのアミノ酸
配列である； 配列番号３は、ＭＡＧＥ−Ａ１０遺伝子のヌクレオチド配列である； 配列番号４は、ＭＡＧＥ−Ａ１０ ｃＤＮＡの核酸配列である、配列番号１の
アミノ酸配列をコードする領域が塩基３５７から１４６６の間に存在する； 配列番号５は、ＭＡＧＥ−Ａ８遺伝子のぬくれおちど配列である； 配列番号６は、同定された遺伝子のコード部のコドンを伴う、WO92/20356に開
示されたＭＡＧＥ−Ａ８遺伝子の一部の配列である； 配列番号７は、同定された遺伝子のコード部のコドンを伴う、WO92/20356に開
示されたＭＡＧＥ−Ａ１０遺伝子の一部の配列である； 配列番号８−４１は、表Ａに記載されている； 配列番号４２は、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＭＥＨＬを有するナノペプチドであ
る； 配列番号４３は、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＲＥＨＳを有するナノペプチドであ
る； 配列番号４４は、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩを有するデカペプチドで
ある； 配列番号４５は、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＲＥＨＳＶを有するデカペプチドで
ある； 配列番号４６は、アミノ酸配列ＭＬＬＶＦＧＩＤＶを有するナノペプチドであ
る； 配列番号４７は、アミノ酸配列ＣＭＬＬＶＦＧＩＤＶを有するデカペプチドで
ある； 配列番号４８は、アミノ酸配列ＦＬＬＦＫＹＱＭＫを有するナノペプチドであ
る； 配列番号４９は、アミノ酸配列ＦＩＥＧＹＣＴＰＥを有するナノペプチドであ
る； 配列番号５０は、アミノ酸配列ＧＬＥＬＡＱＡＰＬを有するナノペプチドであ
る； 配列番号５１は、実施例３に記載されたセンスプライマーである； 配列番号５２は、実施例３に記載された第一のアンチセンスプライマーである
； 配列番号５３は、実施例３に記載された第二のアンチセンスプライマーである
； 配列番号５４は、実施例３に記載された第三のアンチセンスプライマーである
； 配列番号５５は、実施例６に記載されたセンスプライマーである；および 配列番号５６は、実施例６に記載されたアンチセンスプライマーである。
酸配列である； 配列番号２は、ＭＡＧＥ−Ａ８遺伝子によりコードされたタンパクのアミノ酸
配列である； 配列番号３は、ＭＡＧＥ−Ａ１０遺伝子のヌクレオチド配列である； 配列番号４は、ＭＡＧＥ−Ａ１０ ｃＤＮＡの核酸配列である、配列番号１の
アミノ酸配列をコードする領域が塩基３５７から１４６６の間に存在する； 配列番号５は、ＭＡＧＥ−Ａ８遺伝子のぬくれおちど配列である； 配列番号６は、同定された遺伝子のコード部のコドンを伴う、WO92/20356に開
示されたＭＡＧＥ−Ａ８遺伝子の一部の配列である； 配列番号７は、同定された遺伝子のコード部のコドンを伴う、WO92/20356に開
示されたＭＡＧＥ−Ａ１０遺伝子の一部の配列である； 配列番号８−４１は、表Ａに記載されている； 配列番号４２は、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＭＥＨＬを有するナノペプチドであ
る； 配列番号４３は、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＲＥＨＳを有するナノペプチドであ
る； 配列番号４４は、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩを有するデカペプチドで
ある； 配列番号４５は、アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＲＥＨＳＶを有するデカペプチドで
ある； 配列番号４６は、アミノ酸配列ＭＬＬＶＦＧＩＤＶを有するナノペプチドであ
る； 配列番号４７は、アミノ酸配列ＣＭＬＬＶＦＧＩＤＶを有するデカペプチドで
ある； 配列番号４８は、アミノ酸配列ＦＬＬＦＫＹＱＭＫを有するナノペプチドであ
る； 配列番号４９は、アミノ酸配列ＦＩＥＧＹＣＴＰＥを有するナノペプチドであ
る； 配列番号５０は、アミノ酸配列ＧＬＥＬＡＱＡＰＬを有するナノペプチドであ
る； 配列番号５１は、実施例３に記載されたセンスプライマーである； 配列番号５２は、実施例３に記載された第一のアンチセンスプライマーである
； 配列番号５３は、実施例３に記載された第二のアンチセンスプライマーである
； 配列番号５４は、実施例３に記載された第三のアンチセンスプライマーである
； 配列番号５５は、実施例６に記載されたセンスプライマーである；および 配列番号５６は、実施例６に記載されたアンチセンスプライマーである。
【００６６】
実施例１ ＬＢＩ７５１−ＭＥＬに対するＣＴＬクローンの調製および提示ＭＨＣ分子のＨ
ＬＡ−Ａ２．１の同定 メラノーマ細胞系統ＬＢ１７５１−ＭＥＬを６７歳男性患者ＬＢ１７５１の腋
窩リンパ節の転移性メラノーマから誘導し、上記方法に従って増殖させた（Van
den Eynde,B.,ら,1989,Int.J.Cancer.44:634-640）。ＬＢ１７５１−ＭＥＬ培養
の開始から４継体目に、通常のＥＢＶトランスフォーム化リンパ芽球の凝集が上
清に現れた。これらを回収し、別個に培養して、Ｂ細胞系統ＬＢ１７５１−ＥＢ
Ｖを得た。メラノーマ培養物ＬＢ１７５１−ＭＥＬを、限界希釈クローニングに
よりＥＢＶ−トランスフォーム化Ｂ細胞を除いた。ＤＮＡフィンガープリントは
、ＬＢ１７５１−ＭＥＬおよびＬＢ１７５１−ＥＢＶが同一患者に由来すること
を確証した（データ示さず）。ＣＴＬクローンのパネルを、僅かに変更して依然
に記載したようにＭＬＴＣによって生成した（Herin,M.ら1987,Int.J.Cancer.39
:390-396）。要約すると、１０ｍＭ Hepesバッファー、Ｌ-アルギニン（１１６
μｇ／ｍｌ）、Ｌ-アスパラギン（３６μｇ／ｍｌ）、Ｌ-グルタミン（２１６ｇ
／ｍｌ）、１０％ヒト血清、および５ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ-７（ｒｈ
ＩＬ-７）を添加したIscoveの修飾ダルベッコ培地（GIBCO BRL, Gaithersburg,M
D）（Genzyme, Cambridge,MA）において、８％ＣＯ2インキュベーターにおいて
、照射したＬＢ１７５１−ＭＥＬ細胞を用いて、患者ＬＢ１７５１のＰＢＬを培
養することによってＭＬＴＣを実施した。３日目に、ｒｈＩＬ-２（Eurocetus,
Amsterdam,Netherlands）を２５Ｕ／ｍｌの終濃度となるように添加した。リン
パ球を、２５Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ-２と５ｎｇｌ／ｍｌのｒｈＩＬ-７を含む新鮮
な培地において、照射したＬＢ１７５１−ＭＥＬ細胞を用いて週毎に再刺激した
。２１日目に、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、抗ＣＤ８結合ＭＡＣＳ磁性マイクロビー
ズ（MACS,Miltenyi Biotec GmbH,Germany）を落ちいて分類し、限界希釈により
クローン化した。得られたパネルのＣＴＬクローンは、ＬＢ１７５１−ＭＥＬ細
胞を特異的に溶解したが、自己ＥＢＶ−トランスフォーム化Ｂ細胞系統ＬＢ１７
５１−ＥＢＶまたはＮＫ過敏性細胞系統Ｋ５６２は溶解しなかった。ターゲット
細胞の溶解は、先に記載（Boon,T.ら,1980,J.Exp.Med.152:1184-1193）されてい
るように、クロム放出により試験し、代表的なＣＴＬクローン４４７Ａ／５に関
するこれらのテストの結果を図１に示した。
ＬＡ−Ａ２．１の同定 メラノーマ細胞系統ＬＢ１７５１−ＭＥＬを６７歳男性患者ＬＢ１７５１の腋
窩リンパ節の転移性メラノーマから誘導し、上記方法に従って増殖させた（Van
den Eynde,B.,ら,1989,Int.J.Cancer.44:634-640）。ＬＢ１７５１−ＭＥＬ培養
の開始から４継体目に、通常のＥＢＶトランスフォーム化リンパ芽球の凝集が上
清に現れた。これらを回収し、別個に培養して、Ｂ細胞系統ＬＢ１７５１−ＥＢ
Ｖを得た。メラノーマ培養物ＬＢ１７５１−ＭＥＬを、限界希釈クローニングに
よりＥＢＶ−トランスフォーム化Ｂ細胞を除いた。ＤＮＡフィンガープリントは
、ＬＢ１７５１−ＭＥＬおよびＬＢ１７５１−ＥＢＶが同一患者に由来すること
を確証した（データ示さず）。ＣＴＬクローンのパネルを、僅かに変更して依然
に記載したようにＭＬＴＣによって生成した（Herin,M.ら1987,Int.J.Cancer.39
:390-396）。要約すると、１０ｍＭ Hepesバッファー、Ｌ-アルギニン（１１６
μｇ／ｍｌ）、Ｌ-アスパラギン（３６μｇ／ｍｌ）、Ｌ-グルタミン（２１６ｇ
／ｍｌ）、１０％ヒト血清、および５ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ-７（ｒｈ
ＩＬ-７）を添加したIscoveの修飾ダルベッコ培地（GIBCO BRL, Gaithersburg,M
D）（Genzyme, Cambridge,MA）において、８％ＣＯ2インキュベーターにおいて
、照射したＬＢ１７５１−ＭＥＬ細胞を用いて、患者ＬＢ１７５１のＰＢＬを培
養することによってＭＬＴＣを実施した。３日目に、ｒｈＩＬ-２（Eurocetus,
Amsterdam,Netherlands）を２５Ｕ／ｍｌの終濃度となるように添加した。リン
パ球を、２５Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ-２と５ｎｇｌ／ｍｌのｒｈＩＬ-７を含む新鮮
な培地において、照射したＬＢ１７５１−ＭＥＬ細胞を用いて週毎に再刺激した
。２１日目に、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、抗ＣＤ８結合ＭＡＣＳ磁性マイクロビー
ズ（MACS,Miltenyi Biotec GmbH,Germany）を落ちいて分類し、限界希釈により
クローン化した。得られたパネルのＣＴＬクローンは、ＬＢ１７５１−ＭＥＬ細
胞を特異的に溶解したが、自己ＥＢＶ−トランスフォーム化Ｂ細胞系統ＬＢ１７
５１−ＥＢＶまたはＮＫ過敏性細胞系統Ｋ５６２は溶解しなかった。ターゲット
細胞の溶解は、先に記載（Boon,T.ら,1980,J.Exp.Med.152:1184-1193）されてい
るように、クロム放出により試験し、代表的なＣＴＬクローン４４７Ａ／５に関
するこれらのテストの結果を図１に示した。
【００６７】 ＬＢ１７５１−ＭＥＬ細胞で刺激した際にＣＴＬクローン４４７Ａ／５がＴＮ
Ｆを産生する能力を、Traversari,C.,ら,1992,Immunogenetics.35:145-152に記
載した技術を用いて確認した。要約すると、２ｘ１０4腫瘍細胞を２４時間増殖
させた。この培地を捨て、３０００のＣＴＬを、１０％ヒト血清と２５Ｕ／ｍｌ
のｒｈＩＬ-２を添加した１００μｌのIscoveの修飾ダルベッコ培地のマイクロ
ウェルに添加した。２４時間後、上清を回収し、そのＴＮＦ含量を、ＷＥＨＩ１
６４クローン１３細胞に対するその細胞傷害性効果をテスト（Espevik,T.,ら198
6,J.Immunol.Methods.95:99-105）することにより、ＭＴＴ比色アッセイにおい
て調べた（Traversari,C.ら,1992,Immunogenetics.35:145-152;およびHansen,M.
B.,ら,1989,J.Immunol.Methods.119:203-210）。ｍＡｂ Ｗ６／３２（抗ＨＬＡ
クラスＩ）（Bamstable,C.J.ら,1978,Cell.14:9-20）、ＢＢ７．２（抗ＨＬＡ−
Ａ２）（Parham,P.およびF.M.Brodsky,1981,Hum.Immunol.3:277-299）、および
Ｂ１．２３．２（抗ＨＬＡ−Ｂおよび−Ｃ）（Rebai,N.およびB.Malissen,1983,
Tissue Antigens.22:107-117）により生じたＴＮＦの阻害を、このテストに１／
２０希釈の腹水を添加することによってテストし、ＴＮＦの産生が、ｍＡｂ Ｗ
６／３２（抗ＨＬＡクラスＩ）およびＢＢ７．２（抗ＨＬＡ−Ａ２）によって阻
害されるが、ｍＡｂ Ｂ１．２３．２（抗ＨＬＡ−Ｂ、−Ｃ）では阻害されず（
図２）、これは、ターゲット抗原がＨＬＡ−Ａ２によって提示されることを示し
ている。このテストの結果は、図２に記載されている。
Ｆを産生する能力を、Traversari,C.,ら,1992,Immunogenetics.35:145-152に記
載した技術を用いて確認した。要約すると、２ｘ１０4腫瘍細胞を２４時間増殖
させた。この培地を捨て、３０００のＣＴＬを、１０％ヒト血清と２５Ｕ／ｍｌ
のｒｈＩＬ-２を添加した１００μｌのIscoveの修飾ダルベッコ培地のマイクロ
ウェルに添加した。２４時間後、上清を回収し、そのＴＮＦ含量を、ＷＥＨＩ１
６４クローン１３細胞に対するその細胞傷害性効果をテスト（Espevik,T.,ら198
6,J.Immunol.Methods.95:99-105）することにより、ＭＴＴ比色アッセイにおい
て調べた（Traversari,C.ら,1992,Immunogenetics.35:145-152;およびHansen,M.
B.,ら,1989,J.Immunol.Methods.119:203-210）。ｍＡｂ Ｗ６／３２（抗ＨＬＡ
クラスＩ）（Bamstable,C.J.ら,1978,Cell.14:9-20）、ＢＢ７．２（抗ＨＬＡ−
Ａ２）（Parham,P.およびF.M.Brodsky,1981,Hum.Immunol.3:277-299）、および
Ｂ１．２３．２（抗ＨＬＡ−Ｂおよび−Ｃ）（Rebai,N.およびB.Malissen,1983,
Tissue Antigens.22:107-117）により生じたＴＮＦの阻害を、このテストに１／
２０希釈の腹水を添加することによってテストし、ＴＮＦの産生が、ｍＡｂ Ｗ
６／３２（抗ＨＬＡクラスＩ）およびＢＢ７．２（抗ＨＬＡ−Ａ２）によって阻
害されるが、ｍＡｂ Ｂ１．２３．２（抗ＨＬＡ−Ｂ、−Ｃ）では阻害されず（
図２）、これは、ターゲット抗原がＨＬＡ−Ａ２によって提示されることを示し
ている。このテストの結果は、図２に記載されている。
【００６８】 実施例２ ＣＴＬ４４７Ａ／５によって認識された抗原をコードする遺伝子の同定 メラノーマ細胞系統ＬＢ１７５１−ＭＥＬにおいてほとんど全てのＭＡＧＥ−
Ａ遺伝子が高レベルで発現するために（データ示さず）、ＣＴＬ４４７Ａ／５が
ＭＡＧＥ−Ａ遺伝子の一つによってコードされた抗原を認識する可能性をテスト
した。ＣＯＳ−７細胞を、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローン化され
たＭＡＧＥ−ＡのｃＤＮＡと、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ−Ａ２を用いてコトランス
フェクションした。この構成物はＨＬＡ−Ａ２．１をコードする。ＤＥＡＥ-デ
キストラン-クロロキン方法によってトランスフェクションを行った（Seed,B.ら
,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:3365-3369）。要約すると、２ｘ１０4のＣＯ
Ｓ−７細胞を、１００ｎｇのプラスミドｐＣＤＮＡＩ／Ａｍｐ−Ａ２、患者ＳＫ
２９のＣＴＬクローンから単離されたＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子を含む組み換えプ
ラスミド（Wolfel,T.,ら,1993,Int.J.Cancer.55:237-244）と、ｐｃＤＮＡＩ／
Ａｍｐにクローン化した１００ｎｇのＭＡＧＥ−Ａ遺伝子のＤＮＡを用いてトラ
ンスフェクトした。トランスフェクタントを４８時間増殖させ、実施例１記載の
方法でＣＴＬ４４７Ａ／５によるＴＮＦ産生を刺激する能力についてテストした
。このテストは、ＭＡＧＥ−Ａ１０ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細
胞で刺激された場合に、ＣＴＬ４４７Ａ／５により非常に多量のＴＮＦが産生さ
れることを示した。また、ＭＡＧＥ−Ａ８ ｃＤＮＡを用いたトランスフェクタ
ントも、ＣＴＬ４４７Ａ／５を刺激してＴＮＦを産生させるが、ＭＡＧＥ−Ａ１
０ ｃＤＮＡを用いた場合よりも効率が低かった。ＨＬＡ−Ａ２．１を単独で、
またはＨＬＡ−Ａ２．１と他のいずれかのＭＡＧＥ−Ａ遺伝子とを組み合わせて
、トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞では刺激が観察されなかった。これらの
テストの結果を表１に記載する。
Ａ遺伝子が高レベルで発現するために（データ示さず）、ＣＴＬ４４７Ａ／５が
ＭＡＧＥ−Ａ遺伝子の一つによってコードされた抗原を認識する可能性をテスト
した。ＣＯＳ−７細胞を、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローン化され
たＭＡＧＥ−ＡのｃＤＮＡと、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ−Ａ２を用いてコトランス
フェクションした。この構成物はＨＬＡ−Ａ２．１をコードする。ＤＥＡＥ-デ
キストラン-クロロキン方法によってトランスフェクションを行った（Seed,B.ら
,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:3365-3369）。要約すると、２ｘ１０4のＣＯ
Ｓ−７細胞を、１００ｎｇのプラスミドｐＣＤＮＡＩ／Ａｍｐ−Ａ２、患者ＳＫ
２９のＣＴＬクローンから単離されたＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子を含む組み換えプ
ラスミド（Wolfel,T.,ら,1993,Int.J.Cancer.55:237-244）と、ｐｃＤＮＡＩ／
Ａｍｐにクローン化した１００ｎｇのＭＡＧＥ−Ａ遺伝子のＤＮＡを用いてトラ
ンスフェクトした。トランスフェクタントを４８時間増殖させ、実施例１記載の
方法でＣＴＬ４４７Ａ／５によるＴＮＦ産生を刺激する能力についてテストした
。このテストは、ＭＡＧＥ−Ａ１０ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細
胞で刺激された場合に、ＣＴＬ４４７Ａ／５により非常に多量のＴＮＦが産生さ
れることを示した。また、ＭＡＧＥ−Ａ８ ｃＤＮＡを用いたトランスフェクタ
ントも、ＣＴＬ４４７Ａ／５を刺激してＴＮＦを産生させるが、ＭＡＧＥ−Ａ１
０ ｃＤＮＡを用いた場合よりも効率が低かった。ＨＬＡ−Ａ２．１を単独で、
またはＨＬＡ−Ａ２．１と他のいずれかのＭＡＧＥ−Ａ遺伝子とを組み合わせて
、トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞では刺激が観察されなかった。これらの
テストの結果を表１に記載する。
【表１】
【００６９】 実施例３ ＭＡＧＥ−Ａ１０抗原性ペプチドの同定 ＭＡＧＥ−１０の開始コドン（配列番号３のヌクレオチド１９５５）から始ま
る種々の長さのフラグメントを、ＰＣＲ増幅により生成した。ＭＡＧＥ−Ａ１０
の１．１ｋｂのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をプラスミドベクター
ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen Corporation, Oxon,UK）にクローン化した
。ＭＡＧＥ−Ａ１０オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号３のヌ
クレオチド１９５５−３０６４）の最初の２７０、５４６および８２５ヌクレオ
チドを含む三つのフラグメントを、センスプライマー５'-ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣ
ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＣ-３’（配列番号５１）と三つのアン
チセンスプライマー５’-ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＡＧＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧ
ＣＡＣＴＣＴＧ-３’（配列番号５２）、５’-ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＡＧＣ
ＡＣＴＣＧＧＡＧＧＣＴＴＣＡＣＴ-３’（配列番号５３）および５’-ＧＣＴＣ
ＴＡＧＡＧＣＴＴＡＣＣＡＡＴＣＴＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧ-３’（配列番号５
４）のそれぞれを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅のために、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE,La Jolla,CA）を用いた。最初の変性工程を
９４℃で５分間行った。増幅の最初のサイクルを、９４℃で１分間、５３℃で１
分間、７２℃で１分間で行い、次いでさらに２５サイクルを、９４℃で１分間、
６５℃で１分間、および７２℃で１分間行った。サイクルを、７２℃で１５分間
の最終的な伸張工程で終結させた。
る種々の長さのフラグメントを、ＰＣＲ増幅により生成した。ＭＡＧＥ−Ａ１０
の１．１ｋｂのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をプラスミドベクター
ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen Corporation, Oxon,UK）にクローン化した
。ＭＡＧＥ−Ａ１０オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号３のヌ
クレオチド１９５５−３０６４）の最初の２７０、５４６および８２５ヌクレオ
チドを含む三つのフラグメントを、センスプライマー５'-ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣ
ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＣ-３’（配列番号５１）と三つのアン
チセンスプライマー５’-ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＡＧＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧ
ＣＡＣＴＣＴＧ-３’（配列番号５２）、５’-ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＡＧＣ
ＡＣＴＣＧＧＡＧＧＣＴＴＣＡＣＴ-３’（配列番号５３）および５’-ＧＣＴＣ
ＴＡＧＡＧＣＴＴＡＣＣＡＡＴＣＴＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧ-３’（配列番号５
４）のそれぞれを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅のために、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE,La Jolla,CA）を用いた。最初の変性工程を
９４℃で５分間行った。増幅の最初のサイクルを、９４℃で１分間、５３℃で１
分間、７２℃で１分間で行い、次いでさらに２５サイクルを、９４℃で１分間、
６５℃で１分間、および７２℃で１分間行った。サイクルを、７２℃で１５分間
の最終的な伸張工程で終結させた。
【００７０】 このＰＣＲ産物を、EcoRIとXbaIで切断し、プラスミドｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ
のEcoRI部位とXbaI部位に一方向にクローン化し、実施例２に記載されたＤＥＡ
Ｅ−デキストラン−クロロキニン方法を用いて、ＣＯＳ−７細胞にｐｃＤＮＡＩ
／Ａｍｐ−Ａ２と共にトランスフェクトした。ＣＴＬ刺激アッセイを、実施例１
および２に記載されたように、トランスフェクタントを用いて実施した。図３に
示されているように、８２５ｂｐのフラグメントは、トランスフェクタントを、
ＣＴＬ４４７Ａ／５によるＴＮＦ産生を刺激できるようにしたが、５４６ｂｐフ
ラグメントでは刺激できるようにしなかった。これは、抗原性ペプチドをコード
する配列が、ＭＡＧＥ−Ａ１０ ＯＲＦのｎｔ５４７から８２５の間に位置する
ことを示している。
のEcoRI部位とXbaI部位に一方向にクローン化し、実施例２に記載されたＤＥＡ
Ｅ−デキストラン−クロロキニン方法を用いて、ＣＯＳ−７細胞にｐｃＤＮＡＩ
／Ａｍｐ−Ａ２と共にトランスフェクトした。ＣＴＬ刺激アッセイを、実施例１
および２に記載されたように、トランスフェクタントを用いて実施した。図３に
示されているように、８２５ｂｐのフラグメントは、トランスフェクタントを、
ＣＴＬ４４７Ａ／５によるＴＮＦ産生を刺激できるようにしたが、５４６ｂｐフ
ラグメントでは刺激できるようにしなかった。これは、抗原性ペプチドをコード
する配列が、ＭＡＧＥ−Ａ１０ ＯＲＦのｎｔ５４７から８２５の間に位置する
ことを示している。
【００７１】 ヌクレオチド５４７−８２５に対応するアミノ酸配列には、二つのノナペプチ
ド、ＭＬＬＶＦＧＩＤＶ（ＯＲＦのコドン１８３−１９１）（配列番号４６）お
よびＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（２５４−２６２）（配列番号４２）が存在し、これは
、ＨＬＡ−Ａ２．１ペプチド結合モチーフ、すなわち、ＬｅｕまたはＭｅｔを２
位に備え、かつ、そのＣ末端にＬｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅを有するノナ−また
はデカペプチドに適合する（Rammensee,H.G.ら,1995,Immunogenetics.41:178-22
8）。これら二つのペプチドおよびその重複デカペプチドを、一時的なＮＨ2-末
端保護のためにＦ-ｍｏｃを用いて固相上で合成し、質量分析により特徴決定し
た。ペプチドは、分析ＨＰＬＣで示されるように＞９０％の純度を有し、以下の
ように修正を加えたBoon,T.ら,1980,J.Exp.Med.152:1184-1193に記載されている
クロム放出アッセイにおいて自己リンパ芽球細胞系統ＬＢ１７５１−ＥＢＶを感
作するために使用した。標的細胞を、３７℃で１時間、51Ｃｒ−ラベル化し、強
く洗浄した。１０００のターゲット細胞を、３７℃で３０分間、種々の濃度のペ
プチドの存在下で、９６ウェルマイクロプレートにおいて、インキュベートし、
ＣＴＬを２０のＥ／Ｔ比で添加した。クロム放出を３７℃で４時間後に測定した
。
ド、ＭＬＬＶＦＧＩＤＶ（ＯＲＦのコドン１８３−１９１）（配列番号４６）お
よびＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（２５４−２６２）（配列番号４２）が存在し、これは
、ＨＬＡ−Ａ２．１ペプチド結合モチーフ、すなわち、ＬｅｕまたはＭｅｔを２
位に備え、かつ、そのＣ末端にＬｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅを有するノナ−また
はデカペプチドに適合する（Rammensee,H.G.ら,1995,Immunogenetics.41:178-22
8）。これら二つのペプチドおよびその重複デカペプチドを、一時的なＮＨ2-末
端保護のためにＦ-ｍｏｃを用いて固相上で合成し、質量分析により特徴決定し
た。ペプチドは、分析ＨＰＬＣで示されるように＞９０％の純度を有し、以下の
ように修正を加えたBoon,T.ら,1980,J.Exp.Med.152:1184-1193に記載されている
クロム放出アッセイにおいて自己リンパ芽球細胞系統ＬＢ１７５１−ＥＢＶを感
作するために使用した。標的細胞を、３７℃で１時間、51Ｃｒ−ラベル化し、強
く洗浄した。１０００のターゲット細胞を、３７℃で３０分間、種々の濃度のペ
プチドの存在下で、９６ウェルマイクロプレートにおいて、インキュベートし、
ＣＴＬを２０のＥ／Ｔ比で添加した。クロム放出を３７℃で４時間後に測定した
。
【００７２】 ノナペプチドＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（２５４−２６２）（配列番号４２）および
、より効力の弱い、デカペプチドＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩ（２５４−２６３）（配
列番号４４）が、ＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞を感作して、ＣＴＬ４４７Ａ／５に
より溶解することを可能にした（図４Ａ）。ペプチド感作前の１時間、抗ＨＬＡ
−Ａ２抗体ＭＡ２．１で予備処理した場合に、両方のペプチドでパルス化したＬ
Ｂ１７５１−ＥＢＶ細胞は、ＣＴＬによる溶解に対して顕著に増大した過敏性を
示した（図４Ｂ）。ｍＡｂ ＭＡ２．１は、細胞表面のＨＬＡ−Ａ２分子に対す
るペプチドの結合を容易にすることができ、これにより、ＨＬＡ−Ａ２−制限ペ
プチド特異的ＣＴＬによるペプチド感作ターゲット細胞の溶解を増大する（Bodm
er, H.ら,1989,Nature 342:443-446）。ＨＬＡ−Ａ２分子に結合するペプチドの
増強は、ｍＡｂ ＭＡ２．１のハイブリドーマ培養上清の１／５希釈を用いて51
Ｃｒ−ラベル化の際に、ターゲット細胞をインキュベーションすることによって
達成することができた（McMichael,A.J.ら,1980,Hum.Immunol.1:121-129;および
Bodmer,H.ら,1989,Nature 342:443-446）。その他の二つのペプチドＭＬＬＶＦ
ＧＩＤＶ（１８３−１９１）（配列番号４６）とＣＭＬＬＶＦＧＩＤＶ（１８２
−１９１）（配列番号４７）は、ＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞をｍＡｂ ＭＡ２．
１で処理した後でさえ、ＣＴＬによる認識を与えなかった。
、より効力の弱い、デカペプチドＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩ（２５４−２６３）（配
列番号４４）が、ＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞を感作して、ＣＴＬ４４７Ａ／５に
より溶解することを可能にした（図４Ａ）。ペプチド感作前の１時間、抗ＨＬＡ
−Ａ２抗体ＭＡ２．１で予備処理した場合に、両方のペプチドでパルス化したＬ
Ｂ１７５１−ＥＢＶ細胞は、ＣＴＬによる溶解に対して顕著に増大した過敏性を
示した（図４Ｂ）。ｍＡｂ ＭＡ２．１は、細胞表面のＨＬＡ−Ａ２分子に対す
るペプチドの結合を容易にすることができ、これにより、ＨＬＡ−Ａ２−制限ペ
プチド特異的ＣＴＬによるペプチド感作ターゲット細胞の溶解を増大する（Bodm
er, H.ら,1989,Nature 342:443-446）。ＨＬＡ−Ａ２分子に結合するペプチドの
増強は、ｍＡｂ ＭＡ２．１のハイブリドーマ培養上清の１／５希釈を用いて51
Ｃｒ−ラベル化の際に、ターゲット細胞をインキュベーションすることによって
達成することができた（McMichael,A.J.ら,1980,Hum.Immunol.1:121-129;および
Bodmer,H.ら,1989,Nature 342:443-446）。その他の二つのペプチドＭＬＬＶＦ
ＧＩＤＶ（１８３−１９１）（配列番号４６）とＣＭＬＬＶＦＧＩＤＶ（１８２
−１９１）（配列番号４７）は、ＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞をｍＡｂ ＭＡ２．
１で処理した後でさえ、ＣＴＬによる認識を与えなかった。
【００７３】 実施例４ ＭＡＧＥ−Ａ８抗原ペプチドの同定 ＧＬＹＤＧＭＥＨＬ（配列番号４２）をコードするＭＡＧＥ−Ａ１０遺伝子の
配列に相同なＭＡＧＥ−Ａ８の配列は、６位と９位に二つのアミノ酸の変化を示
すペプチドＧＬＹＤＧＲＥＨＳ（ＭＡＧＥ−Ａ８ ＯＲＦにおけるコドン２３２
−２４０）（配列番号４３）をコードする。このペプチドとその重複デカペプチ
ドＧＬＹＤＧＲＥＨＳＶ（コドン２３２−２４１）（配列番号４５）を、上記技
術により合成した。１０μＭ程度の高濃度の各ペプチドでインキュベートしたＬ
Ｂ１７５１−ＥＶＢ細胞は、ＣＴＬ４４７Ａ／５により溶解されなかった。しか
しながら、ペプチド濃度を１００μＭまで増加させた場合に、ＧＬＹＤＧＲＥＨ
Ｓ（配列番号４３）はＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞を環化して溶解させることがで
きた（図５）。溶解の増強は、ＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞を、ｍＡｂ ＭＡ２．
１で予備処理し、ＧＬＹＤＧＲＥＨＳＶ（配列番号４５）ではなく、ＧＬＹＤＧ
ＲＥＨＳ（配列番号４３）でパルス化した場合に観察された。ＨＬＡ−Ａ２分子
に対するペプチド結合の増強は、ｍＡｂ ＭＡ２．１のハイブリドーマ培養上清
の１／５希釈を用いて51Ｃｒ−ラベル化の際に、ターゲット細胞をインキュベー
ションすることによって達成された（McMichael,A.J.ら,1980,Hum.Immunol.1:12
1-129;およびBodmer,H.ら,1989,Nature 342:443-446）。
配列に相同なＭＡＧＥ−Ａ８の配列は、６位と９位に二つのアミノ酸の変化を示
すペプチドＧＬＹＤＧＲＥＨＳ（ＭＡＧＥ−Ａ８ ＯＲＦにおけるコドン２３２
−２４０）（配列番号４３）をコードする。このペプチドとその重複デカペプチ
ドＧＬＹＤＧＲＥＨＳＶ（コドン２３２−２４１）（配列番号４５）を、上記技
術により合成した。１０μＭ程度の高濃度の各ペプチドでインキュベートしたＬ
Ｂ１７５１−ＥＶＢ細胞は、ＣＴＬ４４７Ａ／５により溶解されなかった。しか
しながら、ペプチド濃度を１００μＭまで増加させた場合に、ＧＬＹＤＧＲＥＨ
Ｓ（配列番号４３）はＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞を環化して溶解させることがで
きた（図５）。溶解の増強は、ＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞を、ｍＡｂ ＭＡ２．
１で予備処理し、ＧＬＹＤＧＲＥＨＳＶ（配列番号４５）ではなく、ＧＬＹＤＧ
ＲＥＨＳ（配列番号４３）でパルス化した場合に観察された。ＨＬＡ−Ａ２分子
に対するペプチド結合の増強は、ｍＡｂ ＭＡ２．１のハイブリドーマ培養上清
の１／５希釈を用いて51Ｃｒ−ラベル化の際に、ターゲット細胞をインキュベー
ションすることによって達成された（McMichael,A.J.ら,1980,Hum.Immunol.1:12
1-129;およびBodmer,H.ら,1989,Nature 342:443-446）。
【００７４】 実施例５ ＭＡＧＥ−Ａ１０＋アロ腫瘍は、ＣＴＬ４４７Ａ／５により認識された抗原を提
示する 刺激細胞としてＭＡＧＥ−Ａ１０またはＭＡＧＥＡ８を発現する同種異系ＨＬ
Ａ−Ａ２＋腫瘍細胞系統を用いて、上記タイプのＣＴＬ刺激アッセイを、ＣＴＬ
４４７Ａ／５によるＴＮＦ産生を評価するために行った。メラノーマ細胞系統Ｌ
Ｂ３７３−ＭＥＬとＡＶＬ３−ＭＥＬをそれぞれ、患者ＬＢ３７３およびＡＶＬ
から誘導し、１０％のＦＣＳを含むIscoveの修飾ダルベッコ培地で培養した。骨
髄の甲状腺癌腫細胞系統ＴＴ（ＡＴＣＣ（登録商標）No.:CRL1803）を、America
n Type Culture Collection (Rockville,MD)から入手し、１０％ＦＣＳを添加し
たＤＭＥＭに維持した。これらのアッセイの結果は図６に記載されており、これ
は、二つのＭＡＧＥ−Ａ１０＋細胞系統ＬＢ３７３−ＭＥＬとＡＶＬ３−ＭＥＬ
がＣＴＬ４４７Ａ／５を刺激してＴＮＦを産生することができたが、ＭＡＧＥ−
Ａ８＋細胞系統ＴＴは刺激しなかったことを示す。さらに、ＡＶＬ３−ＭＥＬ細
胞は、ＬＢ３７３−ＭＥＬ細胞よりも低い効力でＣＴＬ４４７Ａ／５により認識
され、これは、ＡＶＬ３−ＭＥＬにおけるＭＡＧＥ−Ａ１０の転写レベルがＬＢ
３７３−ＭＥＬよりも低いという知見に一致する（Serranoら、調製原稿）。
示する 刺激細胞としてＭＡＧＥ−Ａ１０またはＭＡＧＥＡ８を発現する同種異系ＨＬ
Ａ−Ａ２＋腫瘍細胞系統を用いて、上記タイプのＣＴＬ刺激アッセイを、ＣＴＬ
４４７Ａ／５によるＴＮＦ産生を評価するために行った。メラノーマ細胞系統Ｌ
Ｂ３７３−ＭＥＬとＡＶＬ３−ＭＥＬをそれぞれ、患者ＬＢ３７３およびＡＶＬ
から誘導し、１０％のＦＣＳを含むIscoveの修飾ダルベッコ培地で培養した。骨
髄の甲状腺癌腫細胞系統ＴＴ（ＡＴＣＣ（登録商標）No.:CRL1803）を、America
n Type Culture Collection (Rockville,MD)から入手し、１０％ＦＣＳを添加し
たＤＭＥＭに維持した。これらのアッセイの結果は図６に記載されており、これ
は、二つのＭＡＧＥ−Ａ１０＋細胞系統ＬＢ３７３−ＭＥＬとＡＶＬ３−ＭＥＬ
がＣＴＬ４４７Ａ／５を刺激してＴＮＦを産生することができたが、ＭＡＧＥ−
Ａ８＋細胞系統ＴＴは刺激しなかったことを示す。さらに、ＡＶＬ３−ＭＥＬ細
胞は、ＬＢ３７３−ＭＥＬ細胞よりも低い効力でＣＴＬ４４７Ａ／５により認識
され、これは、ＡＶＬ３−ＭＥＬにおけるＭＡＧＥ−Ａ１０の転写レベルがＬＢ
３７３−ＭＥＬよりも低いという知見に一致する（Serranoら、調製原稿）。
【００７５】 実施例６ ＭＡＧＥ−Ａ１０は種々の腫瘍において発現される ＭＡＧＥ−Ａ１０の発現が少数の腫瘍でのみ研究されてきたので、さまざまな
組織タイプの一連の３１４の腫瘍を、遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１０に対する特異性を
確認するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによってテストした。要約すると、逆
転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行って、腫瘍組織におけるＭＡＧＥ−Ａ１０の発
現を検出した。全体のＲＮＡ精製およびｃＤＮＡ合成を、上記のように行った（
Weynantsら.Int.J.Cancer.56:826-829;1994）。２μｇの全ＲＮＡから生成され
た１／４０のｃＤＮＡを、センスプライマー５’-ＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＣ
ＴＧＡＡＧＧＡＧ-３’（配列番号５５）と、アンチセンスプライマー５’-ＣＴ
ＧＧＧＴＡＡＡＧＡＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＧＧ-３’（配列番号５６）を用いて
増幅し、ＭＡＧＥ−Ａ１０の４８５ｂｐの特異的フラグメントを得た。ＰＣＲで
は、最初の変性工程を９４℃で４分間行い、その後、３０サイクルの増幅を、９
４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で１分間で実施した。サイクルを７
２℃で１５分間の最終的伸張工程で終結させた。表２に示したように、ＭＡＧＥ
−Ａ１０は、種々の組織タイプの多数の腫瘍において発現された。別のＭＡＧＥ
遺伝子の発現についても、ＲＴ−ＰＣＲで調べた。ＭＡＧＥ−Ａ１０を発現する
７１の腫瘍サンプルのうち、二つを除いた全てが、遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１、Ａ２
、Ａ３、Ａ４およびＡ６の少なくとも一つを同時に発現した（データ示さず）。
組織タイプの一連の３１４の腫瘍を、遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１０に対する特異性を
確認するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによってテストした。要約すると、逆
転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行って、腫瘍組織におけるＭＡＧＥ−Ａ１０の発
現を検出した。全体のＲＮＡ精製およびｃＤＮＡ合成を、上記のように行った（
Weynantsら.Int.J.Cancer.56:826-829;1994）。２μｇの全ＲＮＡから生成され
た１／４０のｃＤＮＡを、センスプライマー５’-ＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＣ
ＴＧＡＡＧＧＡＧ-３’（配列番号５５）と、アンチセンスプライマー５’-ＣＴ
ＧＧＧＴＡＡＡＧＡＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＧＧ-３’（配列番号５６）を用いて
増幅し、ＭＡＧＥ−Ａ１０の４８５ｂｐの特異的フラグメントを得た。ＰＣＲで
は、最初の変性工程を９４℃で４分間行い、その後、３０サイクルの増幅を、９
４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で１分間で実施した。サイクルを７
２℃で１５分間の最終的伸張工程で終結させた。表２に示したように、ＭＡＧＥ
−Ａ１０は、種々の組織タイプの多数の腫瘍において発現された。別のＭＡＧＥ
遺伝子の発現についても、ＲＴ−ＰＣＲで調べた。ＭＡＧＥ−Ａ１０を発現する
７１の腫瘍サンプルのうち、二つを除いた全てが、遺伝子ＭＡＧＥ−Ａ１、Ａ２
、Ａ３、Ａ４およびＡ６の少なくとも一つを同時に発現した（データ示さず）。
【００７６】
【表２】
【配列表】
【図１】 ＣＴＬ４４７Ａ／５による自己ＬＢ１７５１−ＭＥＬ細胞の特異
的溶解を示す。コントロールターゲットは、自己ＥＢＶトランスフォーム化リン
パ芽球系統ＬＢ１７５１−ＥＢＶおよびＮＫ過敏性系統Ｋ５６２を含む。クロム
放出を、種々のエフェクター−ターゲット比において、クロムラベル化ターゲッ
ト細胞をＣＴＬと４時間インキュベーションした後に測定した。
的溶解を示す。コントロールターゲットは、自己ＥＢＶトランスフォーム化リン
パ芽球系統ＬＢ１７５１−ＥＢＶおよびＮＫ過敏性系統Ｋ５６２を含む。クロム
放出を、種々のエフェクター−ターゲット比において、クロムラベル化ターゲッ
ト細胞をＣＴＬと４時間インキュベーションした後に測定した。
【図２】 ＣＴＬ４４７Ａ／５によるＬＢ１７５１−ＭＥＬ細胞のＨＬＡ制
限認識を示す。ＬＢ１７５１−ＭＥＬ細胞を、単独で、または、示された特異性
を備えたｍＡｂの存在下で、ＣＴＬ４４７Ａ／５を刺激するために使用した。２
４時間共培養した後、ＣＴＬによるＴＮＦの産生を、ＴＮＦ過敏性ＷＥＨＩ−１
６４．１３細胞に対する上清の毒性試験をすることにより測定した。
限認識を示す。ＬＢ１７５１−ＭＥＬ細胞を、単独で、または、示された特異性
を備えたｍＡｂの存在下で、ＣＴＬ４４７Ａ／５を刺激するために使用した。２
４時間共培養した後、ＣＴＬによるＴＮＦの産生を、ＴＮＦ過敏性ＷＥＨＩ−１
６４．１３細胞に対する上清の毒性試験をすることにより測定した。
【図３】 ＣＴＬ４４７Ａ／５により認識された抗原性ペプチドをコードす
る領域の同定を示す。示された種々の長さのＰＣＲフラグメントをｐｃＤＮＡＩ
／Ａｍｐにクローン化し、ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子を用いてＣＯＳ−７細胞にコ
トランスフェクションした。トランスフェクトされた細胞を、ＣＴＬ４４７Ａ／
５と２４時間インキュベートし、上清のＴＮＦをＷＥＨＩ−１６４．１３細胞に
対する毒性により測定した。
る領域の同定を示す。示された種々の長さのＰＣＲフラグメントをｐｃＤＮＡＩ
／Ａｍｐにクローン化し、ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子を用いてＣＯＳ−７細胞にコ
トランスフェクションした。トランスフェクトされた細胞を、ＣＴＬ４４７Ａ／
５と２４時間インキュベートし、上清のＴＮＦをＷＥＨＩ−１６４．１３細胞に
対する毒性により測定した。
【図４】 ペプチド感作ＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞のＣＴＬ４４７Ａ／５に
よる溶解の程度を示す。（Ａ）ＭＡＧＥ−Ａ１０から誘導されたペプチドを用い
てパルスされたＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞。クロムラベル化自己ＥＢＶトランス
フォーム化リンパ芽球ＬＢ１７５１−ＥＢＶを種々の濃度で、記載のペプチドを
用いて３０分間パルスし、その後、Ｅ／Ｔ比２０においてＣＴＬ４４７Ａ／５を
添加した。クロム放出を４時間後に測定した。（Ｂ）ＭＡＧＥ−Ａ１０ペプチド
でパルスしたＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞の溶解のｍＡＢ ＭＡ２．１による増強
。ＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞を抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＭＡ２．１を用いて、または
、用いずに予備処理した。51Ｃｒ-ラベル化の際にｍＡｂ ＭＡ２．１を加えるこ
とにより予備処理を行った。ペプチド感作およびクロム放出アッセイを、（Ａ）
と同様に行った。
よる溶解の程度を示す。（Ａ）ＭＡＧＥ−Ａ１０から誘導されたペプチドを用い
てパルスされたＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞。クロムラベル化自己ＥＢＶトランス
フォーム化リンパ芽球ＬＢ１７５１−ＥＢＶを種々の濃度で、記載のペプチドを
用いて３０分間パルスし、その後、Ｅ／Ｔ比２０においてＣＴＬ４４７Ａ／５を
添加した。クロム放出を４時間後に測定した。（Ｂ）ＭＡＧＥ−Ａ１０ペプチド
でパルスしたＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞の溶解のｍＡＢ ＭＡ２．１による増強
。ＬＢ１７５１−ＥＢＶ細胞を抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＭＡ２．１を用いて、または
、用いずに予備処理した。51Ｃｒ-ラベル化の際にｍＡｂ ＭＡ２．１を加えるこ
とにより予備処理を行った。ペプチド感作およびクロム放出アッセイを、（Ａ）
と同様に行った。
【図５】 ＭＡＧＥ−Ａ８から誘導されたペプチドで感作されたＬＢ１７５
１−ＥＢＶ細胞のＣＴＬ４４７Ａ／５による溶解の程度を示す。ＬＢ１７５１−
ＥＢＶ細胞を、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＭＡ２．１Ａｂを用いて、または用いずに予
備処理し、細胞のペプチド感作およびクロム放出アッセイを、図４に示すように
実施した。
１−ＥＢＶ細胞のＣＴＬ４４７Ａ／５による溶解の程度を示す。ＬＢ１７５１−
ＥＢＶ細胞を、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＭＡ２．１Ａｂを用いて、または用いずに予
備処理し、細胞のペプチド感作およびクロム放出アッセイを、図４に示すように
実施した。
【図６】 ＣＴＬ４４７Ａ／５による同種異系腫瘍細胞系統の認識の程度を
示す。ＨＬＡ−Ａ２患者から誘導されたＬＢ３７３−ＭＥＬ（ＭＡＧＥ−Ａ１０
＋）、ＡＶＬ３−ＭＥＬ（ＭＡＧＥ−Ａ１０＋）およびＴＴ（ＭＡＧＥ−Ａ８＋
）細胞系統を、ＣＴＬ４４７Ａ／５を刺激するために使用した。自己腫瘍細胞系
統ＬＢ１７５１−ＭＥＬをコントロールとして含めた。２４時間共培養した後、
ＣＴＬによるＴＮＦの産生を、ＴＮＦ過敏性ＷＥＨＩ−１６４．１３細胞に対す
る上清の毒性を試験することによって測定した。
示す。ＨＬＡ−Ａ２患者から誘導されたＬＢ３７３−ＭＥＬ（ＭＡＧＥ−Ａ１０
＋）、ＡＶＬ３−ＭＥＬ（ＭＡＧＥ−Ａ１０＋）およびＴＴ（ＭＡＧＥ−Ａ８＋
）細胞系統を、ＣＴＬ４４７Ａ／５を刺激するために使用した。自己腫瘍細胞系
統ＬＢ１７５１−ＭＥＬをコントロールとして含めた。２４時間共培養した後、
ＣＴＬによるＴＮＦの産生を、ＴＮＦ過敏性ＷＥＨＩ−１６４．１３細胞に対す
る上清の毒性を試験することによって測定した。
【図７】 ＭＡＧＥ−Ａ１０遺伝子によりコードされたタンパクのアミノ酸
配列を示す（配列番号１）。
配列を示す（配列番号１）。
【図８】 ＭＡＧＥ−Ａ８遺伝子によりコードされたタンパクのアミノ酸配
列を示す（配列番号２）。
列を示す（配列番号２）。
【図９】 ＭＡＧＥ−Ａ１０遺伝子の核酸配列を示す（配列番号３）。
【図１０】 図１０ａと１０ｂは、ＭＡＧＥ−Ａ１０ ｃＤＮＡの核酸配列
、塩基３５７から１４６６の間に存在する配列番号１のアミノ酸配列をコードす
る領域を示す（配列番号４）。
、塩基３５７から１４６６の間に存在する配列番号１のアミノ酸配列をコードす
る領域を示す（配列番号４）。
【図１１】 図１１ａと１１ｂは、ＭＡＧＥ−Ａ８遺伝子の核酸配列を示す
（配列番号５）。
（配列番号５）。
【図１２】 WO92/20356に記載されたＭＡＧＥ−Ａ８遺伝子の一部の配列を
、同定された遺伝子のコード部位のコドンと共に示す（配列番号６）。
、同定された遺伝子のコード部位のコドンと共に示す（配列番号６）。
【図１３】 WO92/20356に記載されたＭＡＧＥ−Ａ１０遺伝子の一部の配列
を、同定された遺伝子のコード部位のコドンと共に示す（配列番号７）。
を、同定された遺伝子のコード部位のコドンと共に示す（配列番号７）。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年２月６日（２００１．２．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 7/06 ４Ｃ０８６ 43/00 １２１ 14/705 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 7/06 16/28 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 5/10 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/566 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ Ｅ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 アリーン・ヴァン・ペル ベルギー・Ｂ−1200・ブリュッセル・ユー シーエル・7459・アヴェニュ・ヒッポクラ ート・74・ルードヴィッヒ・インスティテ ュート・フォー・キャンサー・リサーチ (72)発明者 フランシス・ブラッセール ベルギー・Ｂ−1200・ブリュッセル・ユー シーエル・7459・アヴェニュ・ヒッポクラ ート・74・ルードヴィッヒ・インスティテ ュート・フォー・キャンサー・リサーチ (72)発明者 エティエンヌ・ドゥ・プラエン ベルギー・Ｂ−1200・ブリュッセル・ユー シーエル・7459・アヴェニュ・ヒッポクラ ート・74・ルードヴィッヒ・インスティテ ュート・フォー・キャンサー・リサーチ (72)発明者 ティエリー・ブーン ベルギー・Ｂ−1200・ブリュッセル・ユー シーエル・7459・アヴェニュ・ヒッポクラ ート・74・ルードヴィッヒ・インスティテ ュート・フォー・キャンサー・リサーチ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA01 GA11 HA01 HA03 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ08 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR42 QR55 QR59 QR62 QR77 QR80 QS05 QS25 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA87X AA94Y AB01 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA14 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA18 CA36 DA01 MA01 NA14 ZB012 ZB261 ZC751 4C085 AA14 BB01 BB17 CC03 DD61 DD62 DD63 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 NA14 ZB01 ZB26 ZC75 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 BA20 BA21 CA40 DA76 DA86 EA20 EA50 FA72 FA74
Claims (39)
- 【請求項１】 主要組織適合遺伝子複合体分子型ＨＬＡ−Ａ２、好ましくは
ＨＬＡ−Ａ２．１と複合体を形成可能なことを特徴とする、配列番号１または２
に由来するアミノ酸の未破壊配列を含む単離されたポリペプチド。 - 【請求項２】 ヒトリンパ球から免疫応答を誘導できることを特徴とする、
配列番号１または２に由来するアミノ酸の未破壊配列を含む単離されたポリペプ
チド。 - 【請求項３】 Ｎ末端アミノ酸に隣接するアミノ酸がＬまたはＭ、好ましく
はＬであり、Ｃ末端アミノ酸がＬ、ＶまたはＩ、好ましくはＬである、配列番号
１または２に由来するアミノ酸の未破壊配列を含むノナペプチド。 - 【請求項４】 ３位のアミノ酸がＹであり、かつ／または、４位のアミノ酸
がＤであり、かつ／または、５位のアミノ酸がＧであり、かつ／または、７位の
アミノ酸がＥであり、かつ／または、８位のアミノ酸がＨである、請求項３記載
のノナペプチド。 - 【請求項５】 アミノ酸配列： （ａ）ＦＬＬＦＫＹＱＭＫ； （ｂ）ＦＩＥＧＹＣＴＰＥ；または （ｃ）ＧＬＥＧＡＱＡＰＬ のいずれか一つを備えたノナペプチド以外である、請求項１ないし４のいずれか
一項に記載のポリペプチド。 - 【請求項６】 主要組織適合遺伝子複合体分子型ＨＬＡ−Ａ２、好ましくは
ＨＬＡ−Ａ２．１と複合体を形成可能なことをさらに特徴とする、請求項２ない
し５のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 請求項３ないし５のいずれか一項に記載のノナペプチド、好
ましくは配列番号１または２に由来するアミノ酸の未破壊配列を含むデカペプチ
ド。 - 【請求項８】 アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＭＥＨＬまたはＧＬＹＤＧＲＥＨＳ
、好ましくはＧＬＹＤＧＭＥＨＬを有するノナペプチド。 - 【請求項９】 アミノ酸配列ＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩまたはＧＬＹＤＧＲＥＨ
ＳＶ、好ましくはＧＬＹＤＧＭＥＨＬＩを有するデカペプチド。 - 【請求項１０】 請求項３ないし９のいずれか一項に記載されたノナペプチ
ドまたはデカペプチドを含むことを特徴とする、約９３アミノ酸までの長さの単
離されたポリペプチド。 - 【請求項１１】 配列番号１または２に由来するアミノ酸の未破壊配列を含
む請求項１０記載のポリペプチド。 - 【請求項１２】 前記未破壊配列が配列番号１に由来する、請求項１ないし
１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 【請求項１３】 ヒトリンパ球から免疫応答を誘導することができる、請求
項１ないし１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 【請求項１４】 主要組織適合遺伝子複合体分子型ＨＬＡ−Ａ２、好ましく
はＨＬＡ−Ａ２．１と複合体を形成した場合に、ヒトリンパ球から免疫応答を誘
導することができる請求項１３記載のポリペプチド。 - 【請求項１５】 前記免疫応答が、ヒトＴリンパ球による細胞溶解性応答で
ある、請求項１３または１４記載のポリペプチド。 - 【請求項１６】 請求項１ないし１５のいずれか一項に記載のポリペプチド
を含む単離された、ポリペプチドまたはタンパクであって、前記単離された、ポ
リペプチドまたはタンパクのアミノ酸配列が、配列番号１および２に記載された
アミノ酸配列のいずれでも、配列番号７のヌクレオチド３３４−９１８にコード
されたアミノ酸配列でもない、単離されたポリペプチドまたはタンパク。 - 【請求項１７】 請求項１ないし１６のいずれか一項に記載されたポリペプ
チドまたはタンパクに機能的に等価な相同体である単離されたポリペプチドまた
はタンパクであって、前記単離されたポリペプチドまたはタンパクのアミノ酸配
列が、配列番号１および２に記載されたアミノ酸配列のいずれでも、配列番号７
のヌクレオチド３３４−９１８にコードされたアミノ酸配列でもない、単離され
たポリペプチドまたはタンパク。 - 【請求項１８】 請求項１ないし１６のいずれか一項に記載のポリペプチド
またはタンパクをコードするヌクレオチド配列または相補的ヌクレオチド配列を
含む単離された核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が配列番号３、４、５
、６または７のいずれかに記載された配列ではない、単離された核酸分子。 - 【請求項１９】 請求項１８記載の核酸分子であって、配列番号３、４また
は５に由来するヌクレオチドの未破壊配列、相補配列、または前記核酸分子のＲ
ＮＡ転写物を含む核酸分子。 - 【請求項２０】 ヌクレオチド配列が、複数のエピトープまたはポリトープ
をコードする、請求項１８または１９に記載の核酸分子。 - 【請求項２１】 プロモーターに機能的に連結された請求項１８ないし２０
のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。 - 【請求項２２】 主要組織適合遺伝子複合体分子型ＨＬＡ−Ａ２、好ましく
はＨＬＡ−Ａ２．１、サイトカインまたは共刺激分子、または細菌性もしくはウ
イルス性ゲノムまたはこれらの一部をコードするヌクレオチド配列をさらに含む
、請求項２１記載の発現ベクター。 - 【請求項２３】 請求項２１または２２に記載された発現ベクターを用いて
トランスフォームまたはたトランスフェクトされた宿主細胞。 - 【請求項２４】 主要組織適合遺伝子複合体分子型ＨＬＡ−Ａ２、好ましく
はＨＬＡ−Ａ２．１、サイトカインまたは共刺激分子をコードする発現ベクター
を用いてトランスフォームまたはたトランスフェクトされた、請求項２３記載の
宿主細胞。 - 【請求項２５】 請求項１ないし１７のいずれか一項に記載の単離されたポ
リペプチドまたはタンパクに対し、選択的に結合する、または、特異的な、ポリ
ペプチド結合剤。 - 【請求項２６】 請求項１ないし１７のいずれか一項に記載された単離され
たポリペプチドに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体または抗体フラ
グメントを含む、請求項２５記載のポリペプチド結合剤。 - 【請求項２７】 請求項１ないし１７のいずれか一項に記載されたポリペプ
チドと、主要組織適合遺伝子複合体分子型ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ
２．１との複合体に対し、選択的に結合する、または、特異的であるが、前記主
要組織適合分子単独には結合しない、請求項２５または２６に記載のポリペプチ
ド結合剤。 - 【請求項２８】 請求項１ないし１７のいずれか一項に記載されたポリペプ
チドと、主要組織適合遺伝子複合体分子型ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ
２．１との複合体に特異的な、細胞溶解性Ｔ細胞を含む、請求項２５ないし２７
のいずれか一項に記載のポリペプチド結合剤。 - 【請求項２９】 腫瘍の治療、予防または診断に使用するための、請求項１
ないし１７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはタンパク、請求項１８な
いし２０のいずれか一項に記載の単離された核酸分子、請求項２１または２２に
記載の発現ベクター、請求項２３または２４に記載の宿主細胞、あるいは、請求
項２５ないし２８のいずれか一項に記載のポリペプチド結合剤。 - 【請求項３０】 請求項１ないし１７のいずれか一項に記載のポリペプチド
またはタンパク、請求項１８ないし２０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求
項２１または２２に記載の発現ベクター、請求項２３または２４に記載の宿主細
胞、あるいは、請求項２５ないし２８のいずれか一項に記載のポリペプチド結合
剤を、任意に薬学的に許容できるキャリアーと混合して含み、さらに、任意に主
要組織適合遺伝子複合体分子型ＨＬＡ−Ａ２、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１を含
む、腫瘍の予防、治療または診断用の薬学的組成物。 - 【請求項３１】 主要組織適合分子、ＨＬＡと複合体形成し、ＡＰＣ、好ま
しくは樹状細胞の表面に提示された、請求項１ないし１７のいずれか一項に記載
のポリペプチドまたはタンパクを含む、腫瘍の予防、治療または診断用の薬学的
組成物であって、前記複合体が、前記ＡＰＣをポリペプチドまたはタンパクを用
いてパルスすることによって形成される薬学的組成物。 - 【請求項３２】 請求項１ないし１７のいずれか一項に記載のポリペプチド
またはタンパクを用いてパルスされて、前記ポリペプチドまたはタンパクを主要
組織適合分子、ＨＬＡとの複合体としてその表面に提示する細胞、好ましくはＡ
ＰＣ、さらに好ましくは樹状細胞。 - 【請求項３３】 共刺激分子をさらに含む、請求項３０または３１記載の薬
学的組成物。 - 【請求項３４】 請求項１ないし１７のいずれか一項に記載のポリペプチド
またはタンパク、または請求項１８ないし２０のいずれか一項に記載の核酸分子
に特異的な薬剤を、患者から単離された生物学的サンプルと接触させ、かつ、疾
患の測定として、サンプル中に遊離、またはサンプルの構成要素を形成する、ポ
リペプチド、タンパクまたは核酸分子のいずれかと前記薬剤との間の相互作用を
アッセイすることを含む、疾患、好ましくはガンを診断する方法。 - 【請求項３５】 薬剤が、請求項２５ないし２８のいずれか一項に記載のポ
リペプチド結合剤である、請求項３４に記載の方法。 - 【請求項３６】 個人からリンパ球サンプルを取り出し、そのリンパ球サン
プルを請求項１ないし１４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはタンパク
、請求項２１または２２記載の発現ベクター、または請求項２３または２４記載
の宿主細胞と培養することを含む、腫瘍細胞に対して反応性の細胞溶解性Ｔ細胞
培養物を生成する方法。 - 【請求項３７】 請求項１ないし１７のいずれか一項に記載のポリペプチド
またはタンパクを含む抗原を発現する腫瘍細胞に対して反応性の細胞溶解性Ｔ細
胞を含む、腫瘍の予防、治療または診断に使用するための生成物。 - 【請求項３８】 請求項３７記載の生成物であって、請求項３６に記載の方
法によって得られた、または得ることができる生成物。 - 【請求項３９】 腫瘍増殖を調節または妨げるのに有効な量で、患者に、請
求項２９、３０、３１、３３、３７または３８のいずれか一項に記載の組成物を
投与することを含む、患者の腫瘍を治療する方法。
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| JPNX006014442, Ｄｅ Ｐｌａｅｎ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．, "Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ １２ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＭＡＧＥ ｆａｍｉｌｙ", Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ, 1994, ｖｏｌ．４０, ３６０−３６９ * |
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