DE19820224A1 - Bindungspartner und Verfahren zur kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin, sowie Mittel und Verwendung bei HIV-Erkrankungen - Google Patents

Bindungspartner und Verfahren zur kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin, sowie Mittel und Verwendung bei HIV-Erkrankungen

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Bindungspartner für NEF-Protein oder Calmodulin, welche die Bindung zwischen Calmodulin und NEF-Protein kompetitiv hemmen. Sie betrifft auch ein Verfahren zur intra- und/oder extrazellulären kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin, wobei man wenigstens einen dieser Bindungspartner mit HIV-infizierten Zellen in Kontakt bringt. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Mittel, die wenigstens einen dieser Bindungspartner enthalten sowie die Verwendung dieser Bindungspartner zur Prävention, Diagnose und/oder Behandlung von HIV-Erkrankungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Bindungspartner für NEF- Protein, Bindungspartner für Calmodulin, Verfahren zur kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin unter Verwendung dieser Bindungspartner, Mittel zur Behandlung von HIV-Erkrankungen, die diese Bindungspartner enthalten, sowie die Verwendung dieser Bindungspartner zur Prävention, Diagnose und Behandlung von HIV-Erkrankungen.
Weltweit sind etwa 30 Mio. Menschen mit HIV infiziert und die Rate an Neuinfizierten steigt jährlich an. Verläßliche Vakzine sind derzeit nicht verfügbar und können wegen der hohen Mutationsrate der viralen Hüllproteine möglicherweise niemals entwickelt werden. Das derzeitige Vorgehen gegen HIV umfaßt zwei Hauptstrategien: Zum einen reine Präventionsmaßnahmen ("safer sex") und zum anderen eine medizinische Kombinationstherapie aus Substanzen, die alle unterschiedliche modulatorische Effekte auf die Virus-eigene Reverse Transkriptase, Integrase und Proteinase haben. Die Kombiationstherapie ist bisher eine sehr erfolgreiche Therapie, allerdings müssen die Medikamente (ein Cocktail aus Proteinase-, Integrase- und Reverse Transkriptase-Hemmer) dauerhaft und in hohen Mengen eingenommen werden, um zu einer deutlichen Verringerung der viralen Replikation zu führen. Da diese Medikamente eine starke unspezifische cytotoxische Aktivität haben, führt gerade die hohe Dosierung zu signifikanten und unerwünschten Nebenreaktionen, deren Langzeitwirkungen noch gänzlich unbekannt sind.
Eine Schlüsselrolle bei AIDS kommt dem Virus-kodierten NEF- Protein zu. NEF (Negative factor) ist ein 27-35 kDa Protein, das N-terminal myristoyliert ist und bei HIV-1, -2 und SIV gefunden wurde.
Das NEF-Protein, dessen mRNA 80% der gesamten frühen mRNA ausmacht, wird bereits in der frühen Phase der Virusreplikation in relativ großen Mengen im Vergleich zu den ebenfalls frühen Proteinen REV und TAT gebildet. Während REV und TAT sowohl für die Genexpression als auch die HIV-Replikation in Kultur essentiell sind, hat das NEF-Protein keinen Einfluß auf die HIV-Expression (AIDS-Forschung, April 1995, 171).
Dem NEF-Protein wird eine Vielzahl an Effekten in vitro zugeschrieben. Beispielsweise soll NEF nach HIV-Infektion von T-Helferzellen die Internalisierung und Degradation von CD4- Rezeptoren induzieren. In "Brian R. Cullen, Current Biology 1996, Vol. 6 : 1557-1559" wird vorgeschlagen, daß NEF eine PAK-abhängige Signalkaskade spezifisch aktiviere. Nach "Bregino et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, April 1997, Vol. 94: S. 3178-3182" soll Interleukin 10 durch rekombinantes HIV-1 NEF-Protein induziert werden. Auch für diesen Effekt wird eine Involvierung von Signalübertragungswegen in Betracht gezogen, da der Effekt auf die Produktion von Interleukin 10 durch W-7, einem Inhibitor von Calcium/Calmodulin-abhängigen Phosphodiesterase- Signalübertragungswegen, beeinflußt wird.
Als Interaktionspartner für NEF werden verschiedene Targets vorgeschlagen. In den obengenannten Publikationen von Cullen und Bregino et al wird vermutet, daß das NEF-Protein an zwei Serin-/Threonin-Kinasen, p62 und p72, bzw. an einen Oberflächenrezeptor oder an Calciumkanäle bindet.
Die überragende Bedeutung von NEF geht weiterhin aus Studien über sogenannte Langzeitüberlebende hervor, d. h. Menschen, deren HIV-Test positiv ausfällt, die jedoch auch nach 10 und mehr Jahren symptomfrei sind und das Vollbild AIDS nicht entwickelt haben: diese Personen zeigen häufig einen Defekt im nef-Gen.
Es ist vermutlich der unzureichenden Aufklärung der molekularen Mechanismen, die den Effekten von NEF zugrundeliegen, zuzuschreiben, daß bislang keine auf NEF abzielende Therapie von HIV-Erkrankungen zur Verfügung gestellt werden konnte. Dies ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß NEF-Protein und Calmodulin aneinander binden und eine Behandlung von HIV- Erkrankungen möglich ist, indem man die Bindung zwischen NEF- Protein und Calmodulin hemmt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Bindungspartner für NEF-Protein, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Bindung von Calmodulin an NEF-Protein kompetitiv hemmen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Bindungspartner für Calmodulin, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Bindung von NEF-Protein an Calmodulin kompetitiv hemmen.
Unter Bindung versteht man jede molekulare Wechselwirkung zwischen Calmodulin und NEF-Protein, vorzugsweise in Anwesenheit von Calcium-Ionen und insbesondere unter physiologischen Bedingungen. Dies sind in der Regel klassische Protein-Protein-Wechselwirkungen, zu denen elektrostatische Anziehung, Wasserstoffbrücken-Bindung, hydrophobe Bindungen, van-der-Waals-Kräfte oder metallkomplexartige koordinative Bindungen gehören. Zusätzlich zu den vorstehend genannten reversiblen molekularen Wechselwirkungen kommen für die Bindung erfindungsgemäßer Bindungspartner an Calmodulin oder NEF- Protein auch irreversible Wechselwirkungen, wie kovalente Bindungen, in Betracht.
Unter kompetitiver Hemmung versteht man, daß erfindungsgemäße Bindungspartner mit Calmodulin oder NEF-Protein um die Bindung an NEF-Protein bzw. Calmodulin konkurrieren, d. h. die Bindung des einen behindert die Bindung des anderen.
Vorzugsweise wird die NEF-seitige Bindungsstelle, über die der Bindungspartner an NEF-Protein bindet, von wenigstens einem Teil der NEF-seitigen Bindungsstelle, über die NEF-Protein an Calmodulin bindet, gebildet. Entsprechendes gilt für die Calmodulin-seitige Bindungsstelle im Hinblick auf die Bindung zwischen Calmodulin und NEF-Protein bzw. Calmodulin und Bindungspartner.
Bevorzugt werden Bindungspartner für NEF-Protein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung binden Bindungspartner für NEF-Protein an einen Teil der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz 1 bis 206, oder homologe Sequenzen davon (S. Wain-Hobson et al, Cell 1985, 40, S. 9-17).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung binden Bindungspartner für NEF-Protein an einen Teil der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz 1 bis 80, oder homologe Sequenzen davon, wobei die Bindung an einen Teil der Aminosäuren 1 bis 57 oder an einen Teil der Aminosäuren 1 bis 57 und einen Teil der Aminosäuren 58 bis 80 erfolgen kann.
Unter homologen Sequenzen versteht man Aminosäuresequenzen, die sich von der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz durch ein- oder mehrfache Aminosäuredeletion, -substitution, -insertion und/oder -inversion ableiten. Homologe Sequenzen sind somit Teil mutierter NEF-Proteine oder alleler Varianten davon, sofern man die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz als Wildtyp-Sequenz definiert. Definitionsgemäß sind homologe Sequenzen der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz zu dieser im wesentlichen funktionell gleichwirkend. Insbesondere vermögen homologe NEF-Sequenzen an Calmodulin zu binden, wobei sich die Bindungsaffinität einer homologen NEF-Sequenz zu Calmodulin von der Bindungsaffinität der in Fig. 1 gezeigten Sequenz zu Calmodulin unterscheiden kann.
Erfindungsgemäß steht der Begriff "NEF-Protein" für die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz genauso wie für homologe Sequenzen davon.
Vorzugsweise binden erfindungsgemäße Bindungspartner an Calmodulin oder NEF-Protein mit höherer Affinität als Calmodulin an NEF-Protein bzw. NEF-Protein an Calmodulin. Eine höhere Bindungsaffinität hat den Vorteil, daß geringere Konzentrationen an Bindungspartner erforderlich sind, um eine kompetitive Hemmung zu bewirken. Andererseits kann eine geeignete Hemmung auch mit Bindungspartnern geringerer Bindungsaffinität erreicht werden, indem man eine höhere Konzentration an Bindungspartner anwendet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Dissoziations-Konstante für die Bindung eines Bindungspartners an NEF-Protein oder Calmodulin weniger als 1 µM, vorzugsweise weniger als 0,1 µM und insbesondere weniger als 10 nM.
Bei den erfindungsgemäßen Bindungspartnern kann es sich um Peptide, Peptoide, organische oder anorganische Substanzen handeln. Bevorzugt sind Peptide und Peptoide.
Unter Peptiden versteht man Sequenzen natürlich vorkommender, proteogener Aminosäuren, die über Peptidbindung miteinander verknüpft sind. Sequenzen von Peptoiden, d. h. Peptid-ähnlichen Verbindungen, können neben natürlich vorkommenden, proteogenen Aminosäuren auch weitere Aminosäuren und Aminosäure-Derivate enthalten, beispielsweise bestimmte Stereo- und Diastereoisomere, wie D-Aminosäuren, natürlich vorkommende, nichtproteogene Aminosäuren oder chemisch synthetisierte Verbindungen mit Eigenschaften, die dem Fachmann als Aminosäure-ähnlich bekannt sind, wie β-Alanin, γ-Carboxyglutaminsäure, Hydroxyprolin, Norleucin, Norvalin, Ornithin, Phenylglycin, Pyroglutaminsäure, Sarcosin, Statin, oder t-Leucin. Unter Peptiden versteht man auch solche Sequenzen, deren N- und/oder C-Terminus modifiziert sein kann, beispielsweise mit acetyliertem N-Terminus und/oder amidiertem C-Terminus. Das gleiche gilt natürlich auch für chemisch­ modifizierbare Aminosäuren-Seitengruppen, die insbesondere die in der organischen Chemie geläufigen und vor allem in der Peptidchemie zur Anwendung kommenden Schutzgruppen tragen können.
Geeignete Bindungspartner sind auch Antikörper, insbesondere monoklonale und rekombinante Antikörper, die an wenigstens einen Teil der Bindungsstelle zwischen NEF-Protein und Calmodulin binden. Ganz besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang antigenbindende Fragmente der hypervariablen Domänen derartiger Antikörper, beispielsweise Fab-, Fv-, scFv- Fragmente oder auf einer oder mehrere CDRs aufbauende Fragmente.
Im Hinblick auf die erfindungsgemäße Verwendung der Bindungspartner in pharmazeutischen Mitteln ist der Einbau von Aminosäuren, die in der Natur nicht vorkommen, insofern von Vorteil, als dadurch die Stabilität gegenüber natürlichen Abbauprozessen erhöht wird. Soll einem Säuger als erfindungsgemäßer Bindungspartner ein bestimmtes Peptid verabreicht werden, so läßt sich dessen Halbwertszeit in vivo beispielsweise dadurch verlängern, daß man zumindest einen Teil der natürlichen L-Aminosäuren durch D-Isomere ersetzt und so zu einem entsprechenden Peptoid gelangt.
Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Peptide und Peptoide sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt werden Festphasen-Synthesen unter Verwendung funktionalisierter Harze, an welche die zu synthetisierenden Peptide geknüpft werden können. Wang-Harze für die FMOC-Festphasen-Peptidsynthese oder Merrifield-Harze zur BOC-Festphasen-Peptidsynthese sind geläufige Beispiele. Nach erfolgtem Aufbau eines gewünschten Peptids wird dieses dann vom Träger abgelöst, wobei gleichzeitig oder auch im Anschluß daran möglicherweise vorhandene Schutzgruppen abgespalten werden können. Eine gegebenenfalls erforderliche, sich anschließende Aufreinigung, beispielsweise über HPLC, liefert das Peptid in gewünschter Reinheit, die beispielsweise mittels Massenspektroskopie oder NMR festgestellt werden kann. Die genaue Ausgestaltung des Verfahrens richtet sich nach dem zu synthetisierenden Peptid oder Peptoid und beruht auf fachmännischem Wissen.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Peptide und Peptoide auch mit Hilfe molekularbiologischer Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann die primäre Aminosäuresequenz des zu synthetisierenden Peptids in die entsprechende c-DNA- oder m-RNA-Sequenz umgesetzt werden. Die Nukleinsäuren können auf bekannte Art synthesiert werden und dann in eine geeignete Wirtszelle eingeschleust, exprimiert und anschließend gegebenenfalls zu den gewünschten Peptoiden modifiziert werden. Weitere Ausgestaltungen dieses Verfahrens beruhen ebenfalls auf fachmännischem Wissen.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Anlage von Bibliotheken randomisierter Peptidgene, aus denen dann Peptide mit der gewüschten Bindungsspezifität isoliert werden können. Beispielsweise kann man randomisierte Oligonukleotide in ein geeignetes Expressionssystem einfügen, welches die Auswahl von erfindungsgemäßen aus Oligopeptiden unterschiedlicher Aminosäuresequenz erlaubt.
Die Herstellung spezifischer, monoklonaler und rekombinanter Antikörper und insbesondere Antikörperfragmente ist dem Fachmann ebenfalls geläufig.
Beispielsweise können monoklonale Antikörper, die spezifisch gegen die NEF- bzw. Calmodulin-seitige, an der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin beteiligte Bindungsstelle gerichtet sind, mittels herkömmlicher Hybridomtechnik gezogen werden, indem man Peptidfragmente aus der NEF- bzw. Calmodulin-seitigen Bindungsstelle zur Immunisierung verwendet. Antikörperfragmente dieser monoklonalen Antikörper können auf übliche Weise, beispielsweise durch Verdauung, erhalten werden.
Die Grundlage zur Herstellung rekombinanter Antikörper und Antikörperfragmente bilden bevorzugt Antikörper- Genbibliotheken, die von unterschiedlicher Komplexität sein können. Durch die Anwendung der PCR gelingt es beispielsweise, ausgehend von antikörperbezogener genetischer Information derartige Bibliotheken anzulegen. Als genetische Information können beispielsweise cDNA aus definierten Zellinien, wie Hybridomen oder Myelomen, cDNA aus seropositiven Spendern oder nicht immunisierten Spendern, genomische DNA als Gesamtheit der variablen Regionen oder randomisierte Oligonukleotide für hypervariable Regionen verwendet werden, was in der Reihenfolge der vorstehend genannten Beispiele zu Bibliotheken mit zunehmender Komplexität führt. Aus diesen können dann einzelne Antikörper oder Antikörperfragmente mit der gewünschten Spezifität, d. h. erfindungsgemäße Bindungspartner, hergestellt werden, indem man das betreffende Gen in einen Produktionsvektor kloniert und in prokaryontischen, wie E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, oder eukaryontischen Systemen, wie Plasmacytoma- oder Myeloma- Zellen, COS-Zellen, CHO-Zellen, bestimmten Insekten-, Pflanzen- oder Pilzzellen, beispielsweise einzelligen Hefezellen, exprimiert. Auch zellfreie Systeme, insbesondere bei Anfügung eines zytotoxischen Fusionsanteils an den erfindungsgemäßen Bindungspartner, können zur Anwendung kommen. Beispiele hierfür bieten Retikulozyten-Extrakte.
Erfindungsgemäße Bindungspartner binden an NEF-Protein oder Calmodulin, wobei sie die Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin kompetitiv hemmen. Zum Nachweis einer derartigen Bindung sind dem Fachmann eine Vielzahl von Verfahren bekannt.
In der Regel wird wenigstens eine an der Bindung beteiligte Komponente, d. h. Bindungspartner, NEF-Protein und/oder Calmodulin, mit Markierungen und/oder Immobilisierungsmitteln versehen. Eine Markierung kann so gewählt sein, daß der Nachweis direkt oder indirekt unter Verwendung spezifischer Bindungspaare geführt werden kann.
Derartige spezifische Bindungspaare können immunologischer oder nicht-immunologischer Art sein. Immunologische, spezifische Bindungspaare basieren in der Regel auf Hapten/anti-Hapten- Systemen unter Verwendung spezifischer anti-Hapten-Antikörper.
Hierzu gehören beispielsweise Fluoreszein/anti-Fluoreszein-, Dinitrophenyl/anti-Dinitrophenyl-, Biotin/anti-Biotin-, Digoxigenin/anti-Digoxigenin-Systeme und dergleichen. In nicht­ immunologischen Bindungspaaren besitzen beide Komponenten eine natürliche Affinität zueinander, wie Biotin/Streptavidin.
Markierungen oder Teile von Markierungen, beispielsweise eine Komponente eines spezifischen Bindungspaares, können kovalent an das nachzuweisende Molekül gebunden werden. Dazu sind dem Fachmann verschiedene Verfahren bekannt und vielfach auch geeignete Reagenzien im Handel erhältlich. Beispielsweise kann Biotin an Amin-, Aldehyd-, Carboxyl- und Sulfhydrylgruppen unter Verwendung von Biotin-N-Hydroxysuccinimidester, Biotinhydrazid, Biotinmaleimid bzw. Jodacetylbiotin gebunden werden. Analoge Reagenzien sind auch für Fluorescein oder Digoxigenin erhältlich. Der Nachweis wird dann über eine an das Hapten bindende Komponente geführt, die beispielsweise an ein radioaktives Isotop, wie 125I oder 3H, ein Enzym, sowie fluorogene, chemilumineszierende oder elektrochemische Mittel gekoppelt sein kann. Meßmethoden zum Nachweise von Radioaktivität, Fluoreszenz, z. B. der EVOTEK-Ansatz zum Nachweis von Fluoreszenzkorrelation, Fluoreszenzenergie­ transfer, vgl. z. B. WO 97/28261, oder konventionellem Fluoreszenz-Quenching, Chemilumineszenz oder elektrochemischen Vorgängen sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Enzyme sind beispielsweise Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glukoseoxidase, Luciferase, β-Lactamase, Urease oder Lysozym. Die daran gebundenen Nachweisreaktionen, wie die Umsetzung von o-Phenylendiamin, 4-Chlornaphthol oder Tetramethylbenzidin durch Meerrettich-Perioxidasen, sind dem Fachmann ebenfalls hinlänglich bekannt.
Der Nachweis und gegebenenfalls die Quantifizierung einer kompetitiven Hemmung kann mittels Verdrängungstitration erfolgen. Beispielsweise wird fluoreszenzmarkiertes NEF-Protein einerseits und Bindungspartner andererseits in einer Stopped Flow-Vorrichtung zusammengeführt und die resultierende Fluoreszenzzunahme gemessen. In einer zweiten Messung wird ein Gemisch aus fluoreszenzmarkiertem NEF-Protein und Bindungspartner einerseits und Calmodulin andererseits in einer Stopped Flow-Vorrichtung zusammengeführt. Die Fluoreszenz bleibt unverändert, wenn der Komplex aus NEF-Protein und Bindungspartner stabiler ist als der Komplex aus NEF-Protein und Calmodulin.
Die Nachweisverfahren können auch eine Immobilisierung wenigstens einer Bindungskomponente an einen festen Träger beinhalten. Geeignete sind beispielsweise Träger aus synthetischen Polymeren, wie Polypropylen, Polystyrol, substituiertem Polystyrol, beispielsweise aminiertem oder carboxyliertem Polystyrol, Polyacrylamiden, Polyamiden, Polyvinylchloriden und dergleichen. Es kann sich um Gefäße, wie Mikrotiterkammern, Tauchstäbe, Fasern oder Partikel, beispielsweise magnetische Kügelchen, handeln. Bei der Immobilisierung finden weitgehend die zuvor als Markierungsmittel beschriebenen spezifischen Bindungspaare Anwendung. In der Regel wird NEF-Protein oder Calmodulin immobilisiert, während der Bindungspartner frei an diese immobilisierten Proteine binden kann.
Der Nachweis der kompetitiven Bindung erfindungsgemäßer Bindungspartner an Calmodulin oder NEF-Protein läßt sich auch über strukturabbildende Verfahren, wie Kernspinresonanz oder Röntgen-Kristallbeugung, führen. Hierzu werden Komplexe aus Bindungspartnern mit NEF oder Calmodulin oder Fragmenten davon spektroskopisch untersucht. Auf diese Weise kann der Bindungsbereich zwischen einem erfindungsgemäßen Bindungspartner und NEF oder Calmodulin abgebildet werden. Erfindungsgemäß überlappt dieser Bindungsbereich zumindest teilweise mit dem Bindungsbereich zwischen NEF-Protein und Calmodulin.
Massenspektroskopische Verfahren sind insbesondere zum raschen Nachweis von Bindungen mit kleinen Substanzmengen von Vorteil.
Computergestützte, qualitative und quantitative Methoden unter Zuhilfenahme zweckmäßiger Suchalgorithmen oder Substanz-Daten­ bänke, wie das Programm DOCK der Universität von San Franzisko oder QSAR-Methoden, und struktureller Vorgaben für NEF-Protein und/oder Calmodulin, wie Kristall- und NMR-Strukturdaten, bieten eine weitere Möglichkeit zum Bindungsnachweis.
Auch eignen sich bekannte Systeme zum Nachweis von Protein/Protein-Interaktionen, wie der sogenannte GST-pull­ down-Assay und insbesondere yeast-two-hybrid-Ansätze. Letztere basieren auf dem modularen Aufbau eukaryotischer Transkriptionsfaktoren, wobei erfindungsgemäß die Interaktion von Bindungspartner mit NEF-Protein bzw. mit Calmodulin zur funktionellen Rekonstitution eines Transkriptionsfaktors führt, dessen DNA-Binde- und Transaktivierungsdomäne zuvor getrennt worden ist. Der Nachweis der Interaktion, d. h. der Bindung, gelingt beispielsweise über auxotrophe Marker oder Reportergene, wie dem LacZ-Gen aus E.coli und den daran gekoppelten enzymatischen Nachweisreaktion.
Erfindungsgemäße Bindungspartner, die in Gen-Bibliotheken niedergelegt sind, können auf ihre Bindung an NEF-Protein bzw. Calmodulin untersucht werden, indem man sie oberflächengebunden, d. h. in der Regel membrangebunden auf der Oberfläche eines Organismus exprimiert. Hierzu eignen sich beispielsweise Bakteriophagen, insbesondere filamentöse Bakteriophagen, Bakterien, wie E. coli, in deren Zellwand der Bindungspartner verankert werden kann, oder auch eukaryontische Viren, wie Baculoviren. Phagen-Display und Bakterien-Display werden zum Screenen erfindungsgemäßer Bindungspartner bevorzugt. Eukaryontische Viren, die erfindungsgemäße Bindungspartner tragen, besitzen den Vorteil, daß sie direkt zur Einschleusung des Bindungspartners in Targetzellen, insbesondere HIV-infizierten Zellen, benutzt werden können.
Die Bindung der oberflächenexprimierten Bindungspartner an NEF- Protein bzw. Calmodulin kann dann über die oben beschriebenen Methoden nachgewiesen werden, die auf der Bindungspartneraffinität zu NEF-Protein bzw. Calmodulin basieren. Darüber hinaus kann diese Bindung zur Abtrennung erfindungsgemäßer Bindungspartner von anderen in der Bibliothek niedergelegten Peptiden benutzt werden. Der Einsatz von Fluoreszenz und Biotinylierung zur Markierungen und Abtrennung mittels FACS, Affinitätschromatographie oder Adsorption an feste, beispielsweise immobilisiertes Streptavidin aufweisende Träger, wie Polystyrolgefäßen, ist von Vorteil.
Es können auch Kombinationen der vorstehend beschriebenen Verfahren zum Nachweis der Bindung erfindungsgemäßer Bindungspartner an NEF-Protein bzw. Calmodulin durchgeführt werden. Besonders effiziente Bindungspartner führen in mehreren dieser Verfahren zu einem positiven Nachweis. Auch können die Eigenschaften eines Bindungspartners optimiert, d. h. vorteilhaft ausgestaltet werden, indem man durch leichte Veränderungen des Bindungspartners einen Pool möglicher weiterer Bindungspartner mit abweichenden Eigenschaften bereitstellt, aus denen Bindungspartner mit verbesserten Eigenschaften durch die nochmalige Durchführung eines oder mehrerer der oben genannten Verfahren abgeleitet werden können. Ein derartiges iteratives Vorgehen führt zu besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung leiten sich Bindungspartner für NEF-Protein von den in Fig. 2 und 3 gezeigten Calmodulin-Aminosäuresequenzen 1 bis 148 bzw. 149 ab (D. Marshak et al., Biochemistry 1984, 23, S. 2891-2899). Bevorzugt sind Fragmente davon mit 3 bis 30, vorzugsweise 4 bis 20 und insbesondere 5 bis 15 Aminosäuren. Vorteilhafterweise unterscheidet sich die Aminosäuresequenz eines Bindungspartners von der entsprechenden in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz dadurch, daß wenigstens eine Aminosäure derart ausgetauscht, entfernt, hinzugefügt oder modifiziert ist, daß der Bindungspartner eine höhere Affinität für die Bindung an NEF-Protein aufweist als Calmodulin selbst.
Erfindungsgemäß steht der Begriff "Calmodulin" für die in den Fig. 2 und 3 gezeigten Aminosäuresequenz genauso wie für homologe Sequenzen davon.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung leiten sich Bindungspartner für Calmodulin von der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz 1 bis 206 und insbesondere 1 bis 80 ab. Bevorzugt sind Fragmente davon mit 3 bis 30, vorzugsweise 4 bis 20 und insbesondere 5 bis 15 Aminosäuren. Vorteilhafterweise unterscheidet sich die Aminosäuresequenz eines Bindungspartners von der entsprechenden in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz dadurch, daß wenigstens eine Aminosäure derart ausgetauscht, entfernt, hinzugefügt oder modifiziert ist, daß der Bindungspartner eine höhere Affinität für die Bindung an Calmodulin aufweist als NEF-Protein selbst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur intra- und/oder extrazellulären kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man wenigstens einen
i) Bindungspartner für NEF-Protein, der die Bindung von Calmodulin an NEF-Protein kompetitiv hemmt und/oder
ii) Bindungspartner für Calmodulin, der die Bindung von NEF an Calmodulin kompetitiv hemmt,
mit HIV-infizierten Zellen, vorzugsweise T-Lymphozyten und Makrophagen, und/oder mit NEF-Protein aus Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, in Kontakt bringt.
Dieses Verfahren kann sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden. In vitro kann der Bindungspartner direkt in eine die HIV-infizierten Zellen und/oder NEF-Protein enthaltende Lösung, beispielsweise ein Gewebekulturmedium, gegeben werden oder zunächst selbst in einer geeigneten Flüssigkeit, beispielsweise einem Puffer, gelöst oder dispergiert und anschließend zu dem zell- und/oder NEF-Protein­ haltigen Medium gegeben werden.
Die in vitro Anwendung ist auch für die Diagnose von HIV- Erkrankungen von großer Bedeutung. So können die erfindungsgemäßen Bindungspartner zum spezifischen Nachweis von intra- und/oder extrazellulärem NEF-Protein benutzt werden. Dadurch kann nicht nur eine HIV-Infektion allgemein festgestellt sondern auch eine NEF-abhängige Diagnose gestellt werden, die weitere qualitative und auch quantitative Rückschlüsse über die Infektion, beispielsweise deren Stadium, ermöglicht. Bindungspartner zur diagnostischen Anwendung werden in der Regel auf die oben beschriebene Art und Weise markiert und/oder immobilisiert, so daß sie in üblichen Tests, die auf den oben beschriebenen Nachweisverfahren basieren, eingesetzt werden können. Handliche Kits zur raschen und zuverlässigen Durchführung des diagnostischen Verfahrens stellen ausreichend Bindungspartner und wenigstens einen Teil der weiteren, zur Erkennung der Bindung an NEF-Protein erforderlichen Reagenzien in einer zweckmäßigen Anordnung zur Verfügung, beispielsweise beschichtete Gefäße zur Immobilisierung von bindungspartner­ gebundenem Nef-Protein und/oder Antikörper zur spezifischen Erkennung des Bindungspartner/NEF-Protein-Komplexes. Kits zum serologischen Nachweis von NEF-Protein sind bevorzugt. Diese können die zur Blutaufbereitung üblichen Mittel beinhalten, wie gängige Lyse-Puffer und Mittel zur Anreicherung bestimmter Zellfraktionen.
Für eine Anwendung in vivo eignen sich pharmazeutische Formulierungen, die einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Bindungspartner zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder üblichen Hilfsstoffen enthalten.
Zur Bewirkung einer kompetiven Hemmung der NEF-Calmodulin- Bindung werden vorzugsweise Dosierungen an Bindungspartner gewählt, die extrazelluläre Bindungspartner-Konzentrationen von weniger als 100 ng/ml, vorzugsweise von weniger als 10 ng/ml und insbesondere von weniger als 1 ng/ml Körperflüssigkeit ergeben.
Beispiele geeigneter pharmazeutischer Formulierungen sind feste Arzneiformen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arzneiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder Pflaster, sowie flüssige Arzneiformen, wie Lösungen, Emul­ sionen, insbesondere Öl-in-Wasser-Emulsionen, Suspensionen, beispielsweise Lotionen, Injektions- und Infusionszuberei­ tungen, Augen- und Ohrentropfen, zu nennen. Auch implantierte Abgabevorrichtungen können zur Verabreichung erfindungsgemäßer Bindungspartner verwendet werden. Ferner können auch Liposomen, Mikroshären oder Polymermatrizes zur Anwendung kommen.
Zu pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder üblichen Hilfsstoffen zählen beispielsweise Antioxidantien, Antireizstoffe, Chelatbildner, Desinfektionsmittel, Dispergiermittel, Dragierhilfsmittel, Emulgatoren, Emulsionsstabilisatoren, gegebenenfalls ethoxylierte und/oder propoxylierte Fettalkohole, Fettamine, Fettaminoxide, Fettsäurealkylolamide, Fettsäureester, Fettsäuren, Feuchthaltemittel, Filmbildner, Gelbildner, Geruchsmaskierungsmittel, Geschmackskorrigentien, Harze, Hydrokolloide, Konservierungsmittel, Lösemittel, Lösungsvermittler, Netzmittel, Neutralisierungsmittel, Permeationsbeschleuniger, Pigmente, Protein-Derivate und/oder -Hydrolysate, quaternäre Ammoniumverbindungen, Rückfettungs- und Überfettungsmittel, Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe, Salbengrundlagen, Silikon-Derivate, Spreithilfsmittel, Stabilisatoren, Sterilanzien, Suppositoriengrundlagen, Suspendiermittel, Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge, Tone, Treibstoffe, Trocknungsmittel, Trübungsmittel, Verdickungsmittel, Wachse, Weichmacher, Weißöle. Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie es beispielsweise in Fiedler, H.P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, dargestellt ist.
Handelt es sich bei dem Bindungspartner um ein Peptid, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch darin bestehen, daß ein zur Expression dieses Peptids befähigtes System, in der Regel ein geeignetes Vekor-System, mit HIV-infizierten Zellen in Kontakt gebracht wird. Vorzugsweise werden geeignete Nukleinsäurekonstrukte in die HIV-infizierten Zellen eingeschleust, in denen dann das Peptid exprimiert wird. Zu diesem Zweck können verschiedene physikalische Methoden verwendet werden, z. B. liposomen, virosomen- oder ligandenvermittelte Gentransfers, oder Viren, wie Retro-, Adeno-, Adenoassoziierte oder Herpesviren. Maßnahmen zur gewebsspezifischen Infektion und/oder Expression sind dem Fachmann bekannt.
Auch kann ein peptidischer Bindungspartner direkt oder an Träger, beispielsweise Liposomen, gekoppelt in die Virus­ infizierten Zellen eingeschleust werden.
Aufgrund der kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF- Protein und Calmodulin sind die erfindungsgemäßen Bindungspartner und pharmazeutische Mittel, die wenigstens einen erfindungsgemäßen Bindungspartner enthalten, und das erfindungsgemäße Verfahren zur intra- und/oder extrazellulären kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin zur Prävention, Diagnose und/oder Behandlung von HIV-Erkrankungen geeignet.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1
Die Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin wurde mittels Protein-Overlay untersucht.
Das hierzu verwendete Calmodulin wurde in bekannter Weise erhalten, indem man das Calmodulin-Gen aus Dictyostelium discoideum in Escherichia coli (E. coli) exprimierte und reinigte.
Folgende NEF-Proben wurden untersucht:
  • a) Das nef-Gen des HIV-1 Stammes pNL4-3 wurde in E. coli exprimiert und gereinigt (Wolber V. et al (1992) Eur. J. Biochem. 205 : 1115-1121). Das so erhaltene Protein wird als NEF-full bezeichnet.
  • b) Ein um 57 Aminosäuren N-terminal verkürztes NEF-Fragment (NEF-core ; Freund J. et al (1994) Eur. J. Biochem. 223 : 589-593) wurde ebenfalls in E. coli exprimiert und sukzessive mittels DEAE-Ionenaustauscher-Chromatographie, Ammoniumsulfatfällung (40%) und Gelfiltration gereinigt.
  • c) Das 57 Aminosäuren umfassende N-terminale Fragment (NEF- Anker) wurde synthetisch hergestellt (Freund et al, ibid).
1 µl einer NEF-full, NEF-core bzw. NEF-Anker enthaltenden Lösung (2 mg/ml) wurde auf eine Nitrozellulose-Membran (Schleicher & Schuell) getropft. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, wurde die Membran 1 h bei Raumtemperatur mit 5% Milchpulver in TBS + 0,2% CaCl2 bzw. 5 mM EGTA inkubiert. Nach 3-maligem Waschen von je 5 min mit TBS + 0,2% CaCl2 bzw. 5 mM EGTA wurde die Membran mit 5 µg Calmodulin in Anwesenheit von 0,2% CaCl2 oder 5 mM EGTA 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Als Kontrolle diente eine mit NEF- Protein behandelte Membran, die aber nicht mit Calmodulin inkubiert wurde, um unspezifische Bindungen des anti-Calmodulin Antikörpers erkennen zu können. Gebundenes Calmodulin wurde nach dreimaligem Waschen der Membran in TBS mit Antikörper detektiert. Als erster Antikörper dient polyklonaler anti- Calmodulin aus Rabbit, der 1 : 1000 in 3% Milchpulver in TBS eingesetzt wurde. Inkubiert wurde 1 h bei Raumtemperatur. Der zweite Antikörper, monoklonaler Goat anti-Rabbit von BioRad wurde ebenfalls 1 : 1000 eingesetzt. Der Immunkomplex wurde mit Sigma fast DAB-Tabletten detektiert.
Ergebnisse
Sowohl NEF-full als auch der NEF-Anker zeigten eine Bindung an Calmodulin in Anwesenheit von CaCl2. Die Bindung konnte durch die Anwesenheit von EGTA geschwächt (inhibiert) werden. Als Kontrollexperiment wurde eine mit NEF-full und NEF-core behandelte Membran ohne Calmodulin inkubiert, um sicherzugehen, daß der spezifisch gegen Calmodulin gerichtete Antikörper nicht auch NEF erkennt.
Beispiel 2
Die Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin wurde mittels Fluoreszenzmessung untersucht.
Für die Fluoreszenzmessungen wurden sowohl Pyren-markiertes und unmarkiertes NEF (full und core), als auch Dansyl-markiertes und unmarkiertes Calmodulin eingesetzt. Die Messungen wurden bei 25°C durchgeführt.
Pyren-Markierung
NEF-Lösungen (full und core) wurden mit einem zweifachen Überschuß an Pyrenmaleimid (gelöst in DMF) 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend über eine PD 10 Säule von überschüssigem Reagenz abgetrennt.
Das Dansyl-markierte Calmodulin wurde von der Firma Sigma bezogen.
Die Fluoreszenz-Emissionsspektren für Pyren-markiertes NEF wurden von 360 nm bis 450 nm aufgenommen, bei einer Anregungswellenlänge von 344 nm. Die Schlitzbreiten betrugen für die Anregung 0,5 nm und für die Emission 2,0 nm.
Die Fluoreszenz-Emissionsspektren für Dansyl-markiertes Calmodulin wurden von 450 nm bis 550 nm aufgenommen, bei einer Anregungswellenlänge von 340 nm.
Von der jeweils markierten Probe wurde eine 1 µM Lösung in einer Quarzküvette vorgelegt und das Emissionsspektrum aufgenommen. Die Probe wurde dann mit dem unmarkierten Protein titriert und der Fluoreszenzverlauf gemessen.
Ergebnisse
Fig. 4 zeigt das Fluoreszenz-Emissionsspektrum von Pyren-markiertem NEF-full allein (Kurve 1), in Anwesenheit von Calmodulin (Kurve 2) und nach Zugabe von 5 mM EGTA zu NEF- Calmodulin-Komplex (Kurve 3).
Fig. 5 zeigt das Fluoreszenz-Emissionsspektrum von Pyren-markiertem NEF-core allein (Kurve 1) und in Anwesenheit von Calmodulin (Kurve 2).
Fig. 6 zeigt das Fluoreszenz-Emissionsspektrum von Dansyl-markiertem Calmodulin allein (Kurven 1 und 2) und nach Zugabe von NEF-full (Kurve 3).
Die Zugabe von Calmodulin zu gelabeltem NEF-full (Fig. 4) bewirkte einen deutlichen Anstieg der Fluoreszenz, was auf eine Interaktion der beiden Proteine hinweist. Durch Zugabe von 5 mM EGTA konnte diese Interaktion inhibiert werden. Calmodulin konnte auch eine Fluoreszenzzunahme bei NEF-core (Fig. 5) bewirken, die ebenfalls mit einem Überschuß an EGTA (5 mM) inhibiert werden konnte.
Die Zugabe von BSA (Bovine serum albumin) oder CaCl2 zu markiertem NEF zeigte diesen Effekt der Fluoreszenzänderung nicht. Die Zugabe von NEF-full zu markiertem Calmodulin (Fig. 6) zeigte ebenfalls einen Fluoreszenzanstieg und einen leichten Blaushift.
Beispiel 3
Die Bindung von NEF-Protein an Calmodulin wurde mittels Stopped-Flow untersucht.
Für die Stopped-Flow Messungen wurden die gleichen Proteinproben wie in Beispiel 2 eingesetzt. Die Messungen erfolgten bei 25°C.
Die Anregungswellenlänge für die Pyren-Markierung (Dansyl- Markierung) lag bei 344 nm (340 nm), die Emission wurde mit einem Kantenfilter bei Wellenlängen über 370 nm (389 nm) gemessen.
Um die Geschwindigkeitskonstante der Assoziation kon zu bestimmen, wurde eine 1 µM Lösung der markierten Probe in die eine Spritze der Stopped-Flow Apparatur und eine Proteinlösung der Konzentration von 1 µM bis ∼40 (90) µM in die andere Spritze gefüllt.
Für eine genaue Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten koff wurde in eine Spritze eine Lösung aus 1 µM markierter NEF-Probe + 8 µM unmarkierte CaM-Probe gegeben und in die andere Spritze eine ∼40 µM unmarkierte NEF-Probe.
Mit der Dansyl-markierten Calmodulin-Probe wurde ebenso verfahren.
Ergebnisse
Mit Hilfe der Stopped-Flow wurden die Experimente der Beispiele 1 und 2 bestätigt. Es wurde jeweils eine Fluoreszenzzunahme beobachtet, wenn Calmodulin zu markiertem NEF (full oder core) gegeben wurde. Jedoch wurde bei Dansyl-markiertem Calmodulin nur eine Änderung der Fluoreszenz mit NEF-full erreicht.

Claims (10)

1. Bindungspartner für NEF-Protein, dadurch gekennzeichnet, daß er die Bindung von Calmodulin an NEF-Protein kompetitiv hemmt.
2. Bindungspartner für Calmodulin, dadurch gekennzeichnet, daß er die Bindung von NEF-Protein an Calmodulin kompetitiv hemmt.
3. Bindungspartner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er an einen Teil der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz 1 bis 206, vorzugsweise 1 bis 80, oder homologe Sequenzen davon, bindet.
4. Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Dissoziations-Konstante für seine Bindung an NEF-Protein oder Calmodulin weniger als 1 µM beträgt.
5. Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Peptid, ein Peptoid, eine organische oder anorganische Substanz handelt.
6. Verfahren zur intra- und/oder extrazellulären kompetitiven Hemmung der Bindung zwischen NEF-Protein und Calmodulin, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens einen
  • i) Bindungspartner für NEF-Protein, der die Bindung von Calmodulin an NEF-Protein kompetitiv hemmt und/oder
  • ii) Bindungspartner für Calmodulin, der die Bindung von NEF an Calmodulin kompetitiv hemmt,
    mit HIV-infizierten Zellen und/oder NEF-Protein aus Körperflüssigkeit in Kontakt bringt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Bindungspartner um ein Peptid handelt, dessen cDNA oder mRNA in die HIV-infizierten Zellen eingeschleust und exprimiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Bindungspartner um ein Peptid oder Peptoid handelt, das an einen Träger gekoppelt in die HIV-infizierten Zellen eingeschleust wird.
9. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend wenigstens einen Bindungspartner der Ansprüche 1 bis 5 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder Hilfsstoff.
10. Verwendung wenigstens eines Bindungspartners der Ansprüche 1 bis 5 zur Prävention, Diagnose und/oder Behandlung von HIV-Erkrankungen.
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