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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Proteomics. Um genauer zu
sein, bezieht sich die Erfindung auf Protein-Protein Wechselwirkungen
und Verfahren zum Identifizieren modulierender Agentien von wechselwirkenden
Proteinen.
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Hintergrund der Erfindung
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Spezifische
Protein-Protein Wechselwirkungen sind kritische Ereignisse in biologischen
Prozessen. Protein-Protein Wechselwirkungen steuern biologische
Prozesse, die den zellulären
Informationsfluss abwickeln und zelluläre Entscheidungen kontrollieren
(z.B. Signalübertragung,
Zellzyklus Regulation und Zusammenbau zellulärer Strukturen). Das gesamte
Netzwerk der Wechselwirkungen zwischen zellulären Proteinen ist eine biologische
Karte der funktionalen Ereignisse, die den internen Mechanismus
der lebenden Organismen und ihre Antworten auf externe Signale regulieren.
Ein notwendiger Schritt zur Vervollständigung dieser biologischen
Wechselwirkungskarte ist das Wissen all der Gensequenzen in einem
vorgegebenen lebenden Organismus. Die gesamte DNA Sequenz des Homo
sapiens Genoms wird spätestens
bis zum Jahr 2003 vollständig
sein (112). Bedauerlicherweise lässt
die Sequenz eines Gens weder seine biologische Funktion noch sein
Position in der biologischen Karte erkennen. Angesichts der erwarteten
Anzahl von Proteinen im humanen Genom (80.000 bis 120.000), wird
die Kartierung der biologischen Karte der Protein-Protein Wechselwirkungen
eine gewaltige, aber lohnende Aufgabe sein.
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Während der
vergangenen paar Jahrzehnte, sind mehrere Techniken entwickelt worden
um Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu bestimmen (für eine Übersicht
siehe (82)). Diese Techniken beinhalten, i) physikalische Verfahren
zum Selektieren und Detektieren wechselwirkender Proteine (z.B.
Protein Affinitätschromatographie,
Koimmunopräzipitation,
Crosslinking, und Affinitätsblotten),
ii) Bibliotheksbasierte Verfahren (z.B. Phagendisplay und Zweihybrid-Systeme);
und iii) genetische Verfahren (z.B. Überproduktionsphenotyp, synthetische
letale Effekte und ungekoppelte Nicht-Komplementation). Von den
oben erwähnten
Verfahren zur Detektion von Protein-Protein Wechselwirkungen sind
Zweihybrid-Systeme die bekanntesten und am intensivsten genutzten.
Im klassischen Zweihybrid-System (30), hängt die Transkription von Reportergenen
von einer Wechselwirkung zwischen einem DNA-gebundenen „Köder"-Protein und einer Aktivierungsdomäne, die das „Beute"-Protein enthält, ab.
Die Zweihybrid- Systemen
können
bedauerlicherweise eine Reihe von Nachteilen haben. Zum Beispiel,
wird die Wechselwirkung der Proteine eher im Kernmilieu als im Zytoplasma,
in dem die meisten Proteine gefunden werden, beobachtet. Weiterhin
erlaubt das Zweihybrid-System nicht die gleichzeitige Identifizierung
der exakten Aminosäuresequenzen
zwischen zwei wechselwirkenden Proteinen und kann nicht ohne weiteres
auf verschiedene Zelltypen oder Gewebe, wobei verschiedene wechselwirkende Proteine
exprimiert werden, angewendet werden.
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Es
ist schon in der Vergangenheit gezeigt worden, dass kleine synthetische
Peptide an Proteine binden können
(1, 18, 55, 102). Dennoch ist die Verwendung von synthetischen Peptiden
in einem systematischen Ansatz zum Identifizieren wechselwirkender
Proteindomänen
und -sequenzen noch nicht vorgeschlagen oder bereitgestellt worden.
Es wurde gezeigt, dass bestimmte charakteristische Domänen mit
hoher Affinität
an spezifische Peptidsequenzen binden (z.B. die Src Homologie-2
oder SH2 Domäne
der Kinasen der Src-Familie binded fest an eine Sequenz mit phosphorliertem
Tyrosin (Y*-EEI, die im Rezeptor für den Epidermalen Wachstumsfaktor
und in der Fokalen Adhesions-Kinase vorhanden ist) (61).
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EP 0818467A beschreibt
einen regelmäßig angeordneten
Peptid Array, der eine Vielzahl von Peptidsegmenten enthält, der
dadurch erhalten wurde, dass die Aminosäuresequenz eines Proteins in
Sequenzsegemente jeder geeigneten Länge und jedes geeigneten überlappenden
Leserahmens geteilt wurden, und dass Peptide basierend auf den genannten
Sequenzsegmenten synthetisiert wurden, wobei die Aminosäuresequenzen
der Peptidsegmente die Aminosäuresequenz
des Proteins exprimieren (119). WO 98/15833 beschreibt Verfahren
zur Selektion von Peptiden, die eine bestimmte Bindungsaffinität für ein Zielprotein,
wie z.B. Antikörper,
besitzen. Die Bindungspeptide bzw. Proteine sind auf vermehrungsfähigen Präsentationspaketen präsentiert,
vorzugsweise Phagen (120). WO 84/03564 beschreibt eine Verfahren
zum Detektieren oder Bestimmen einer Aminosäuresequenz, die innerhalb einer
bekannten Aminosäuresequenz
eines Proteins oder eines Teils davon antigenetisch aktiv ist, indem
Peptide mit Antikörper
gegen das Protein oder einen Teil davon kontaktiert werden, wobei
die Peptide eine Sequenz einer Vielzahl von Aminosäuren enthalten,
wobei die Sequenz einer Sequenz mit bekannter Aminosäuresequenz
entspricht, und die Peptide überlappende
Aminosäuresequenzen
enthalten (121).
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Daher
besteht auch weiterhin ein Bedürfnis
ein Verfahren zur Verfügung
zu stellen, das die Identifizierung erlaubt von i) den genauen Aminosäuresequenzen
von wenigstem einen Bindungspartner zwischen wechselwirkenden Proteinen;
ii) zahlreichen, möglicherweise
allen, wechselwirkenden Proteinen in verschiedenen Zellen oder Geweben;
und iii) den spezifischen Domänen
(oder Sequenzen) zwischen zwei wechselwirkenden Proteinen als Zielproteine
zur Isolierung von Pionier-Medikamenten. Zusätzlich bleibt ein Bedürfnis Verfahren
und Assays zur Verfügung
zu stellen, die die Identifizierung von genauen Aminosäuresequenzen wechselwirkender
Domänen
von Proteinen erlauben, die beträchtlich
schneller sind als konventionelle Verfahren (z.B. Tage statt Monate).
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Die
vorliegende Erfindung strebt danach, dieses Bedürfnis und andere Bedürfnisse
zu befriedigen.
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Die
vorliegende Beschreibung bezieht sich auf eine Anzahl von Dokumenten,
deren Inhalt hiermit vollständig
gemäß ihrem
Bezug aufgenommen wird.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung strebt danach, die Nachteile des Standes der
Technik zu überwinden.
Genauer, es wird ein Ansatz beschrieben um Protein-Protein Wechselwirkungsdomänen zu identifizieren,
der sich vom Stand der Technik unterscheidet. Darüber hinaus,
basiert ein Ansatz auf dem Verständnis
des Prinzips, das Protein-Protein Wechselwirkungen steuert. Daher
erlaubt dieses Verständnis
die Verwendung mehrerer Verfahren. Ein derartiges Verfahren, wie
weiter unten veranschaulicht, identifiziert: i) wenigsten eine der
genauen Aminosäuresequenzen
zwischen wechselwirkenden Proteinen; ii) zahlreichen, möglicherweise
alle wechselwirkende Proteine in verschiedenen Zellen oder Geweben;
und iii) die spezifischen Domänen
(oder Sequenzen) zwischen zwei wechselwirkenden Proteinen als Zielproteine
zur Isolierung von Leit-Medikamenten.
Vorzugsweise erlauben das Verfahren und der Assay der vorliegenden
Erfindung die Bestimmung von i), ii) und iii). Darüber hinaus
erlaubt das hier beschriebene Verfahren die Identifizierung von
wechselwirkenden Proteinen und der genauen Aminosäuresequenzen
von Wechselwirkungen in einigen Tagen statt einigen Monaten.
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Die
Fähigkeit
Proteine (oder anderer Moleküle)
zu selektieren, die Wechselwirkungen zwischen einem Genprodukt und
einigen Partnern aber nicht anderen zu blockieren, sollte eine ausgeklüngelte Modulation
der zellulären
Nachrichtenübermittlung
oder des Zellmetabolismus in menschlichen Zellen oder anderen gegenwärtig schwer
zugänglich
Systemen erlauben. Tatsächlich
ist die Identifikation von Proteinen, die mit therapeutisch wichtigen
Proteinen wechselwirken und die Identifikation von Orten dieser
Wechselwirkung möglicherweise
wichtiger für
die Entwicklung von Medikamenten als andere genetische Ansätze wie „Knock-outs" (71). Letzterer
widmet sich den phenotypischen Konsequenzen des Disruptierens aller
Wechselwirkungen, an denen ein bestimmtes Protein teilnimmt im Gegensatz
zur Inhibierung der Wechselwirkung eines Proteins (schlimmstenfalls
einiger weniger Proteine statt aller) in einem Multimerkomplex.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf einen neuen Ansatz
zur Aufdeckung von Medikamenten. Ein wesentliches Hindernis in der
Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten ist
die Identifikation von Zielproteinen und ihrer funktionellen Stellen
gewesen. Tatsächlich
benötigen
die meisten Forschungs- und Entwicklungsprojekte (F&E) in Pharmaunternehmen
mehrere Jahre um ein wirkliches Zielprotein zu identifizieren. Die
Selektion der Wirkstoffe, die binden und die Funktionen dieser Proteine
inhibieren, beansprucht mehrere Jahre und ist im Allgemeinen unspezifisch
und zufällig.
Weiterhin sind die Wirkstoffe, die durch die gegenwärtigen Ansätze identifiziert
werden, oft auf die aktiven Stellen in Proteinen gerichtet. Daher
führen
solche Wirkstoffe oft zu großen
Nebeneffekten. Daher ist es nicht überraschend, dass viele F&E Projekte niemals
zur Entwicklung von spezifischen Wirkstoffen führte, sogar nach drei bis fünf Jahren
intensiver Forschungsbemühungen.
Die Verfahren und Assays zur Identifizierung von Protein-Protein
Wechselwirkungen könnten
sich drei wichtigen Schritten in der Wirkstoff Entwicklung widmen:
- 1) die Identifizierung von Aminosäuresequenzen
aller wechselwirkender Domänen
in Zielproteinen;
- 2) die Identifizierung eines Satzes wechselwirkender Proteine
(vorzugsweise aller wechselwirkender Proteine) zur Wirkstoffentwicklung;
und
- 3) Durchmustern nach spezifischen Wirkstoffen gegen jede der
wechselwirkenden Domänen
in einem Zielprotein.
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Es
wurde gezeigt, dass P-Glykoprotein (P-gp) Multimedikamenten-Resistenz
in Tumorzelllinien verursacht, die mit lipophilen Antikrebs-Wirkstoffen
selektiert wurden. Untersuchung der P-gp Aminosäuresequenz führte zu
einem Vorschlag für
ein Modell mit einem duplizierten Molekül mit zwei hydrophoben und
hydrophilen Domänen,
die durch eine stark geladene Region von 90 Aminosäuren verbunden
sind, der Verbindungsdomäne.
Obwohl ähnlich
geladene Domänen
bei anderen Mitgliedern der P-gp Superfamilie gefunden werden, ist (sind)
die Funktion(en) dieser Domäne
nicht bekannt. Hier wird durch die Verwendung der Verfahren der
vorliegenden Erfindung gezeigt, dass diese Domäne an andere zelluläre Proteine
bindet. Durch die Verwendung überlappender
Hexapeptide, die die gesamten Aminosäuresequenzen der Verbindungsdomäne der humanen P-Glykoprotein
Gene 1 und 3 (HP-gp1 und HP-gp3) umspannen, wird hier ein direkte
und spezifische Bindung zwischen HP-gp1 und 3 Verbindungsdomänen und
intrazellulären
Proteinen gezeigt. Drei verschiedene Abschnitte (617EKGIYFKLVTM627, 658SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA677 und 694PVSFERIMKLNLT706) für
HP-gp1 und 618LMKKEGVYFKLVNM631, 648KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS674 und 695PVSFLKVLKLNKT677 für HP-gp3)
in Verbindungsdomänen
banden spezifisch an Proteine mit apparenten Molekularmassen von
~80 kDa, 57 kDa und 30 kDa. Interessanterweise wurde nur das 57
kDa Protein, in unterschiedlichem Maße, an die drei verschiedenen
Sequenzen in der Verbindungsdomäne
gebunden. Darüber
hinaus war die Bindung zwischen den überlappenden Peptiden, die
für die
Verbindungssequenz kodierten, und dem 57 kDa Protein resistent gegenüber dem
zwitterionischem Detergenz, CHAPS, aber sensitiv gegenüber SDS.
Aufreinigung und partielle N-terminale Aminosäurensequenzierung des 57 kDa
Proteins zeigte, dass es für
die N-terminalen Aminosäuren
des Alpha- und Beta-Tubulins kodiert. Weiterhin bestätigten Western
Blot Untersuchungen unter der Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die
an α- und β-Tubulin
binden, die Identität
des 57 kDa Proteins. Zusammen genommen ist dies das erste Beispiel,
das Protein Wechselwirkungen mit der P-gp Verbindungsdomäne belegt.
Diese könnte
natürlich
für die
Gesamtfunktion von P-gp wichtig sein. Noch wichtiger, die Ergebnisse
in dieser Studie beweisen das neue Konzept, nach dem die Wechselwirkungen
zwischen zwei Proteinen von einem Strang weniger Aminosäuren mit
hohen und abstoßenden
Bindungsenergien vermittelt werden.
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Es
wird ein Verfahren zur Identifizierung von Hochaffinitätsbindungsdomänen in einem
gewähltem Protein,
einer Domäne
davon, oder eines Teils davon, und der Aminosäuresequenz davon bereitgestellt,
welches umfasst: a) zur Verfügung
stellen eines Satzes überlappender
Peptide, die eine vollständige
Sequenz des gewählten
Proteins, einer Domäne
davon, oder eines Teils davon umfassen und die kovalent an einen
Träger gebunden
sind; b) zur Verfügung
stellen einer Mischung von Proteinen und/oder einer Mischung von
Peptiden; c) inkubieren des Satzes der überlappenden Peptide aus a)
mit der Mischung aus b) unter Bedingungen, die es ermöglichen,
dass sich Bindung zwischen den Hochaffinitätsbindungsdomänen aus
einem Peptid des Satzes und einem oder mehreren Proteinen oder Peptiden
aus b) ereignet; d) abwaschen jeglicher Protein-Protein Wechselwirkung,
die nicht eine Hochaffinitäts-Wechselwirkung
wie in c) ist; und e) identifizieren, welches Peptid aus a) mit
hoher Affinität
mit einem Protein oder Peptid aus b) wechselwirkt, dadurch die Peptide
aus e) und deren Sequenzen als Hochaffinitätsbindungsdomänen identifizieren.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereit gestellt zur
Identifizierung eines Agens, das die Wechselwirkung zwischen einer
Hochaffinitätsbindungsdomäne und einem
Satz überlappender
Peptide, die eine vollständige
Sequenz des gewählten
Proteins, einer Domäne
davon, oder eines Teils davon umfassen die kovalent an eine Träger gebunden
sind und eine Mischung von Protein, wobei diese Mischung von Proteinen
eine Mischung zellulärer
Proteine ist. Dieses Verfahren umfasst:: a) inkubieren des Satzes
der überlappenden
Peptide mit der Mischung in Gegenwart mindestens eines Agens unter
Bedingungen, die es ermöglichen,
dass sich die Bindung zwischen den Hochaffinitätsbindungsdomänen aus
einem Peptid des Satzes und einem oder mehreren Proteinen oder Peptiden
der Mischung ereignet; b) abwaschen jeglicher Protein-Protein Wechselwirkung,
die nicht eine Hochaffinitäts-Wechselwirkung
wie in b) ist; und c) identifizieren, welches Peptid aus a) mit
hoher Affinität
mit einem Protein oder Peptid der Mischung in Gegenwart des Agens
wechselwirkt verglichen zu der Situation, wenn das Agens abwesend
ist; dadurch identifizieren des Agens als Modulator der Hochaffinitätswechselwirkung,
wenn die Wechselwirkung in der Gegenwart des Agens messbar verschieden
ist von der Situation, wenn das Agens abwesend ist.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden bereitgestellt Agentien, die identifiziert
wurden als Modulatoren der Hochaffinitätswechselwirkungen der vorliegenden
Erfindung.
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Für den Zweck
der vorliegenden Erfindung, werden die folgenden Abkürzungen
und Begriffe nachstehend definiert.
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Definitionen
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Der
Begriff „überlappende
Peptide, die eine Peptidsequenz umspannen" (z.B. eine Domäne, eine Volllängenproteinsequenz
oder ein Teil davon) oder ähnliche
bezieht sich auf Peptide einer gewählten Größe, die auf der Sequenz des
Proteins (oder Teils davon) basieren. Vorzugsweise sind diese Peptide
synthetische Peptide.
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Wie
hier nachstehend erklärt
wird, hat die Größe des überlappenden
Peptids einen signifikanten Einfluss auf das Funktionieren der vorliegenden
Erfindung. Zum Beispiel, scheinen Peptide aus vier zusammenhängenden
Aminosäuren
die Bindung mit niedriger Affinität an Proteine signifikant zu
steigern. Darüber
hinaus würde
erwartet werden, dass die Verwendung von größeren Peptiden, wie 20 Aminosäuren oder
größer, den Anteil
der abstoßenden
Aminosäuren
gegenüber
den der Aminosäuren
mit hoher Affinität
erhöht,
und dadurch die Bindung der spezifischen Proteine an die Peptide
maskiert oder vollkommen inhibiert. Während daher der Fachmann verstehen
würde,
dass es einen Zielkonflikt gibt, der mit der Wahl von kleinen Peptiden
gegenüber größeren Peptiden
einhergeht, beträgt
die bevorzugte Größe für die überlappenden
Peptide der vorliegenden Erfindungen zwischen 5 und 15 Aminosäuren, noch
bevorzugter zwischen 5 und 12, und besonders bevorzugt zwischen
5 und 10 Aminosäuren.
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Der
Begriff „Träger" im Kontext eines
Trägers,
an den die überlappenden
Peptide der vorliegenden Erfindung kovalent gebunden sind, kann
von einer Vielzahl von Trägern
ausgewählt
werden, die in der Technik bekannt sind. Zu diesen Trägern gehören CHIPS,
Platten (z.B. 96 Knocken Platten), Glassperlen und ähnliche. Die
CHIP Technologie ist in der Technik wohl bekannt. (10, 19, 24, 26,
85, 97).
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Die
Proteinsequenzen werden, wie sie in der Technik gewöhnlich und
in Einklang mit den Empfehlungen der IUPAC-IUB Biochemischen Nomenklatur
Kommission, hier dargestellt unter Verwendung der Ein Buchstaben
oder der Drei Buchstaben Aminosäurensymbole.
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Sofern
nicht anders definiert, besitzen die wissenschaftlichen und technologischen
Begriffe und die hier verwendete Nomenklatur die gleiche Bedeutung,
wie sie vom durchschnittlichen Fachmann, den die Erfindung betrifft,
gewöhnlicherweise
verstanden wird. Im Allgemeinen, sind die Verfahren für Zellkulturen,
Infektion, Molekularbiologie Verfahren und ähnliche die gewöhnlichen
in der Technik verwendeten Verfahren. Diese Standart Techniken sind
in den Handbüchern
beschrieben (4, 96).
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Die
vorliegende Beschreibung bezieht sich hauptsächlich auf Proteine gemäß den technologischen Begriffen
der rekombinanten DNA (rDNA). Ausgewählte Beispiele werden zur Klarheit
und Konsistenz bereit gestellt.
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Wie
hier verwendet, bedeutet „Nukleinsäure Molekül" ein Polymer von
Nukleotiden. Nicht einschränkende
Beispiele davon beinhalten DNA (z.B. genomische DNA, cDNA) und RNA
Moleküle
(z.B. mRNA). Das Nukleinsäure
Molekül
kann durch Klonierungs-Techniken erhalten oder synthetisiert werden.
DNA kann doppelsträngig
oder einzelsträngig
sein (kodierender Strang oder nicht-kodierender Strang [antisense]).
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Der
Begriff „rekombinante
DNA", wie in der
Technik bekannt, bezieht sich auf ein DNA Molekül, das sich aus dem Aneinanderfügen von
DNA Segmenten ergibt. Dies wird häufig als Gentechnik bezeichnet.
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Der
Begriff „DNA-Segment", wie hier verwendet,
bezieht sich auf ein DNA Molekül,
das eine lineare Folge oder Sequenz von Nukleotiden umfasst. Diese
Sequenz, wenn sie gemäß dem genetischen
Code gelesen wird, kann für
eine lineare Folge oder Sequenz von Aminosäuren kodieren, die als Polypeptid,
Protein, Proteinfragment und ähnliches
bezeichnet werden.
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Der
Ausdruck „Amplifikations
Paar" bezieht sich
hier auf ein Paar Oligonukleotide (Oligos) der vorliegenden Erfindung,
die ausgewählt
wurden bei der Amplifikation einer bestimmten Nukleinsäuresequenz
zusammen verwendet zu werden. Die Amplifation kann durch eine von
einer Vielzahl von Typen von Amplifikations Verfahren, vorzugsweise
Polymerase Kettenreaktion, erfolgen. Andere Arten von Amplikationsverfahren beinhalten
Ligase Kettenreaktion, Strangverdrängungsamplifikation, oder Nukleinsäuresequenz
basierte Amplifikation, wie detaillierter unter erklärt wird.
Wie aus der Technik gewöhnlich
bekannt, sind die Oligos so gestaltet, dass sie an ein komplementäre Sequenz
unter ausgewählten
Bedingungen binden können.
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Die
Nukleinsäure
(z.B. DNA oder RNA) zum Ausüben
der vorliegenden Erfindung kann gemäß wohl bekannter Verfahren
erhalten werden.
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Wie
hier verwendet, soll der Begriff „physiologisch relevant" Wechselwirkungen
beschreiben, die die Wirkung haben können, die Aktivität oder die
Menge von einem oder mehreren Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung
zu modulieren.
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Der
Begriff „DNA" Molekül oder Sequenz
(ebenso wie manchmal der Begriff „Oligonukleotid" bezieht sich, wie
hier definiert, auf ein Molekül
umfassend die Deoxyribonukleotide Adenin (A), Guanin (G), Thymin
(T) und/oder Cytosin (C), in einer doppelsträngigen Form, und welches ein „regulatorisches
Element" gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst oder enthält.
Der Begriff „Oligonukleotid" oder „DNA" erscheint in linearen DNA
Molekülen
oder Fragmenten, Viren, Plasmiden, Vektoren, Chromosomen oder synthetisch
gewonnenen DNA. Wie hier verwendet, können bestimmte doppelsträngige DNA
Sequenzen gemäß der normalen
Konvention beschrieben werden, nach der die Sequenz nur in 5' zu 3' Richtung angegeben
wird.
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„Nukleinsäure Hybridisierung" bezieht sich im
Allgemeinen auf die Hybridisierung zweier einzelsträngiger Nukleinsäure Moleküle mit komplementären Basensequenzen,
die unter geeigneten Bedingungen eine thermodynamisch begünstigte
doppelsträngige
Struktur bilden. Beispiele für
Hybridisierungsbedingungen können
in den zwei oben genannten Laborhandbüchern (4, 96) gefunden werden
und sind gemeinhin aus der Technik bekannt. Für den Fall der Hybridisierung
an einen Nitrozellulose Filter, wie zum Beispiel in demr wohl bekannten
Southern Blot Verfahren, kann ein Nitrozellulose Filter über Nacht
bei 65°C
mit einer markierten Sonde in einer Lösung enthaltend 50% Formamid,
Hoch-Salz (5 × SSC
oder 5 × SSPE),
5 × Denhardt's Lösung, 1%
SDS, und 100 μg/ml
denaturierte Träger
DNA (z.B. Lachsspermium DNA) inkubiert werden. Die nichtspezifische
bindende Sonde kann dann vom Filter durch mehrere Waschgänge in 0.2 × SSC/0.1%
SDS bei einer Temperatur, die im Hinblick auf die gewünschte Stringenz
ausgewählt
wurde, abgewaschen werden: Raumtemperatur (niedrige Stringenz),
42°C (mittlere
Stringenz) oder 65°C
(hohe Stringenz). Die gewählte Temperatur
basiert auf dem Schmelzpunkt (F.) des DNA Hybrids. Natürlich können auch
RNA-DNA Hybride gebildet und detektiert werden. In diesen Fällen können die
Hybridisierungs- und Waschbedingungen gemäß den wohl bekannten Verfahren
durch einen durchschnittlichen Fachmann angepasst werden. Stringente
Bedingungen werden vorzugsweise benutzt (96).
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Sonden
mit natürlich
vorkommenden Zucker-Phosphat Rückraten
sowie modifizierte Rückrate
enthaltend Phosphorothioate, Dithionate, Alkylphosphonate und α-Nukleotide
und ähnliche
können
für Nukleinsäuren zu
Anwendung kommen. Modifizierte Zucker-Phosphat Rückrate sind allgemein bekannt
(73, 75). Erfindungsgemäße Sonden
können
entweder aus Ribonukleinsäure
(RNA) oder Deoxyribonukleinsäure
(DNA), und vorzugsweise aus DNA hergestellt sein.
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Es
ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass die Detektierung
von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und/oder Peptiden von einer
Markierung abhängig
sind. Diese Markierungen stellen Sensitivität bereit und ermöglichen
häufig
die Automatisierung. In einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird Automatisierung unter Verwendung der CHIP Technologie durchgeführt. Zum
Beispiel sind die überlappenden Peptide,
die eine gewählte
Sequenz eines Proteins umspannen, an ein CHIP gebunden, das dann
verwendet werden kann, um einen Test auf Wechselwirkung mit Proteinen
oder Peptiden zu automatisieren. Natürlich versteht sich, dass die
vorliegenden Erfindung nicht unmittelbar von der Gestaltung und
der Synthese eines überlappenden
Satzes Peptide, die eine gewählte
Proteinsequenz umspannt, abhängt.
Tatsächlich
sind Peptidbanken verfügbar,
aus denen dieser Satz überlappender
Peptide hergestellt werden könnte.
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Protein
Markierung ist in der Technik wohl bekannt. Ein nicht einschränkendes
Beispiel für
Markierungen beinhaltet 3H, 14C, 32P, und 35S. Nicht
einschränkende
Beispiele für
detektierbare Markierungen beinhalten Liganden, Fluorophore, Chemilumineszens
Agentien, Enzyme, und Antikörper.
Es wird sich dem durchschnittlichen Fachmann erschließen, dass
die Wahl einer bestimmten Markierung die Weise bestimmt, in der
sie an das Protein gebunden ist.
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Die
Identifizierung der Wechselwirkung ist nicht spezifisch von der
Markierung des Proteins abhängig, da
zum Beispiel diese Wechselwirkung durch die Verwendung von Proteomics
Ansätzen
(wie 2-D Gelen und Massen Spektrometrie) oder durch die Verwendung
einer Antikörper
Bibliothek bestimmte werden könnte.
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Wie
gemeinhin bekannt können
radioaktive Aminosäuren
in erfindungsgemäße Peptide
oder Proteine durch mehrere wohl bekannte Verfahren eingebaut werden.
Ein nicht einschränkendes
Beispiel dafür
ist die in vitro oder in vivo Markierung von Proteinen mit 35SMet.
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Der
Begriff „Vektor" ist gemeinhin in
der Technik bekannt und definiert eine Plasmid DNA, Phagen DNA,
virale DNA, und ähnliche,
die als DNA Träger
dienen kann, in den erfindungsgemäße DNA kloniert werden kann.
Zahlreiche Typen an Vektoren existieren und sind in der Technik
wohl bekannt.
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Der
Begriff „Expression" definiert einen
Vorgang, durch den ein Gen in mRNA transkribiert wird (Transkription),
die mRNA dann in ein Polypeptid (oder Protein) oder mehr translatiert
wird (Translation).
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Der
Begriff „Expressionsvektor" definiert einen
Vektor oder einen wie oben beschriebenen Träger, aber derart gestaltet,
dass er die Expression einer eingefügten Sequenz nach Transformation
in einen Wirt ermöglicht.
Das klonierte Gen (die eingefügte
Sequenz) wird gewöhnlich
unter die Kontrolle von Kontroll-Element-Sequenzen wie Promoter
Sequenzen gestellt. Das Stellen eines geklonten Gens unter derartige
Kontrollsequenzen wird häufig
als funktionale Verknüpfung
mit den Kontrollelementen oder -sequenzen bezeichnet.
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Funktional
verknüpfte
Sequenzen können
auch zwei Segmente beinhalten, die in dasselbe RNA Transkript transkribiert
werden. Daher sind zwei Sequenzen, wie ein Promoter und eine „Reporter
Sequenz", funktional
verknüpft,
wenn die Einleitung der Transkription am Promoter ein RNA Transkript
der Reporter Sequenz erzeugt. Um „funktional verknüpft" zu sein ist es nicht
notwendig, dass zwei Sequenzen unmittelbar neben einander liegen.
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Expressionskontrollsequenzen
werden abhängig
davon, ob der Vektor entworfen wurde um das funktional verknüpfte Gen
in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt oder beiden (Pendel
Vektor), variieren, und können
zusätzlich
transkriptionale Elemente wie Verstärker Elemente, Beendigungssequenzen,
gewebsspezifische Elemente, und/oder translationale Start- und Beendigungsstellen
enthalten.
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Prokaryotische
Expressionen sind nützlich
für die
Erstellung großer
Mengen des Proteins, das von der interessierenden DNA Sequenz kodiert
wird. Dieses Protein kann gemäß den Standart
Protokollen aufgereinigt werden, die Nutzen ziehen aus den intrinsischen
Eigenschaften des Proteins, wie Größe und Ladung (z.B. SDS Gelelektrophorese,
Gelfiltration, Zentrifugation, Ionen Austauscher Chromatographie,
usw.). Zusätzlich kann
das interessierende Protein über
Affinitätschromatographie
unter der Verwendung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper aufgereinigt
werden. Das aufgereinigte Protein kann für therapeutische Anwendungen verwendet
werden.
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Das
DNA Konstrukt kann ein Vektor sein enthaltend einen Promoter, der
funktional mit einer erfindungsgemäßen Oligonukleotidsequenz verknüpft ist,
der wiederum funktional mit einem heterologen Gen verknüpft ist,
wie dem Gen für
das Luziferase Reporter Molekül. „Promoter" bezieht sich auf
eine DNA regulatorische Region, die fähig ist, direkt oder indirekt
an RNA Polymerase in einer Zelle zu binden, und Transkription einer
stromabwärts
kodierenden Sequenz (3' Richtung)
zu initiieren. Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung, ist der Promoter an seinem
3' Ende durch eine
Transkriptions-Initierungsstelle begrenzt und dehnt sich stromaufwärts (5' Richtung) so aus,
dass er die Minimal Anzahl an Basen oder Elementen enthält, die
notwendig sind die Transkription in Mengen zu detektieren, die über dem
Hintergrund liegen. Innerhalb des Promoters findet sich die Transkriptions-Initierungsstelle
(bequem über
Kartierung mit S1 Nuklease definiert) als auch Proteinbindedomänen (Consensus
Sequenzen), die verantwortlich sind für die Bindung der RNA Polymerase. Eukaryotische
Promotoren enthalten häufig,
aber nicht immer, „TATA" Boxen und „CCAT" Boxen. Prokaryotische
Promotoren enthalten Shine-Dalgarno Sequenzen zusätzlich zu
den –10
und –35
Consensus Sequenzen.
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Wie
hier verwendet, bezeichnet die Angabe „funktionales Derivat", im Kontext eines
funktionellen Derivats einer Sequenz, sei es einer Nukleinsäuren- oder
Aminosäurensequenz,
ein Molekül,
das eine (entweder funktionale oder strukturelle) biologische Aktivität beibehält, die
im wesentlichen ähnlich
zu der der originalen Sequenz ist. Dieses funktionale Derivat oder Äquivalent
kann ein natürliches
Derivat sein oder synthetisch hergestellt werden. Solche Derivative
enthalten Aminosäuresequenzen,
die Austäusche,
Deletionen, oder Hinzufügungen von
einer oder mehreren Aminosäuren
besitzen, vorausgesetzt dass die biologische Aktivität des Proteins
beibehalten wird. Das gleiche trifft auf Derivate von Nukleinsäuresequenzen
zu, die Austäusche,
Deletionen, oder Hinzufügungen
von einem oder mehreren Nukleotiden besitzen, vorausgesetzt dass
die biologische Aktivität
der Sequenz größtenteils
beibehalten wird. Bezogen auf eine Proteinsequenz, besitzt die Austausch-Aminosäure chemo-physikalische
Eigenschaften, die der ausgetauschten Aminosäure ähnlich sind. Die ähnlichen
chemo-physikalischen Eigenschaften beinhalten, Ähnlichkeiten in der Ladung,
Sperrigkeit, Hydrophobizität,
Hydrophilität
und ähnliche.
Der Begriff „funktionale
Derivate" soll beinhalten
Fragmente, Segmente, Varianten, Analoga oder chemische Derivate
des Gegenstandes der vorliegenden Erfindung.
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Wie
aus dem Stand der Technik wohl bekannt ist, bezieht sich ein(e) „konservative(r)
Mutation oder Austausch" auf
eine Mutation oder einen Austausch, der beibehält: 1) die Struktur des Rückrats des
Polypeptids (z.B. eine Beta Faltblatt oder alpha-helikalische Struktur);
2) die Ladung oder Hydrophobizität
der Aminosäure;
oder 3) die Sperrigkeit der Seitenkette. Um genauer zu sein, beziehen
sich die wohl bekannten Begriffe „hydrophiler Rest" auf Serin oder Threonin. „Hydrophobe
Reste" beziehen
sich auf Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Valin oder Alanin. „Positive
geladene Reste" beziehen
sich auf Lysin, Arginin oder Histidin. „Negative geladene Reste" beziehen sich auf
Asparaginsäure
oder Glutamisäure.
Reste mit „sperrigen
Seitenketten" beziehen
sich auf Phenylalanin, Tryptophan oder Tyrosin.
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Peptide,
Protein Fragmente, und ähnliche
können
erfindungsgemäß und gemäß den wohl
bekannten Verfahren abhängig
oder unabhängig
von ihrer Sequenz modifiziert werden. Zum Beispiel können aus
den Wildtyp Sequenzen, die in den Abbildungen beispielhaft erläutert sind,
unter Verwendung von konservativen Aminosäurenaustauschen an 1, 2, 3
oder mehr Postionen Peptide abgeleitet werden. Der Begriff „konservative Aminosäureaustausche", der sich auf einen
Austausch einer bestimmten Aminosäure durch eine mit ähnlichen Eigenschaften
(z.B. Asparaginsäure
für Glutaminsäure, oder
Isoleucin für
Leucin) bezieht, ist in der Technik wohl bekannt. Natürlich können nicht-konservative
Aminosäureaustausche
ausgeführt
werden, wie auch andere Arten an Modifikationen wie Deletionen oder
Einfügungen,
vorausgesetzt dass diese Modifikationen Peptide in einer geeigneten
Weise modifizieren (z.B. ohne die biologische Aktivität der Peptide
zu beeinflussen, wenn dies durch die Modifikation beabsichtigt ist).
Eine Liste von beispielhaften konservativen Aminosäureaustäuschen wird
nachfolgend zur Verfügung
gestellt.
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Tabelle
2 Konservative
Aminosäure
Ersetzungen
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Wie
aus der Tabelle ersichtlich, können
einige der Modifikationen benutzt werden, um die Peptide gegen Proteolyse
resistenter zu machen. Natürlich
können
Modifikationen der Peptide auch bewirkt werden, ohne in deren Primärsequenz
einzugreifen, indem enzymatische oder chemische in der Technik bekannte
Verfahren angewendet werden.
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Der
Begriff „Variante" bezieht sich hier
auf ein Protein oder ein Nukleinsäuremolekül, das in Struktur und biologischer
Aktivität
dem erfindungsgemäßen Protein
oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure im Wesentlichen ähnlich ist.
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Die
erfindungsgemäßen funktionalen
Derivate können
chemisch synthetisiert oder durch rekombinante DNA Technologie unter
Verwendung von in der Technik wohl bekannten Verfahren hergestellt
werden. In einer speziellen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann eine erfindungsgemäße Variante
unter Verwendung von erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert
werden. Sie kann auch entworfen werden, um formell die Konservierung
bestimmter Aminosäuren
zu überprüfen (z.B.
durch das Synthetisieren einer Variante oder eines mutierten Peptids).
Diese Varianten können
auch als Teil einer Volllängensequenz
des Proteins getestet werden, um die Wechselwirkung zu validieren.
Natürlich
wird der Fachmann verstehen, dass die Identifikation einer Region
eines gewählten
Proteins als einer Region, die an Hochaffinitätsprotein-Wechselwirkungen)
beteiligt ist, die in vitro Mutagenese (oder eine Testung von verwandten
Peptidsequenzen) dieser Region ermöglicht, um die Struktur/Funktionsbeziehung
dieser Region zu identifizieren und analysieren. Solche Verfahren sind
in der Technik wohl bekannt. Wenn die Wechselwirkungsdomäne zweier
Proteine identifiziert wurde, ist es daher für den Fachmann möglich Varianten
zu identifizieren und/oder zu entwerfen, die eine modifizierte Affinität für ein wechselwirkendes
Protein besitzen. Wenn natürlich
beide wechselwirkenden Sequenzen bekannt sind, können sehr mächtige Fragen gestellt werden,
um die Struktur-Funktions Beziehung zu analysieren, die die Hochaffinitäts-Wechselwirkung zwischen
diesen Sequenzen leiten.
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Wie
hier verwendet, sollen „chemische
Derivative" zusätzliche
chemische Einheiten umfassen, die nicht normalerweise Teil des Gegenstands
der Erfindung sind. Solche Einheiten könnten die physiko-chemische
Charakteristik der Derivative betreffen (z.B. Solubilität, Absorption,
Halbwertszeit und ähnliche,
Abnahme der Toxizität).
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Derartige
Einheiten werden in „Remington's Pharmazeutic Sciences" (88) exemplarisch
vorgestellt. Verfahren zur Kopplung dieser chemo-physikalischen
Einheiten an ein Polypeptid sind in der Technik wohl bekannt.
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Der
Begriff „Allel" definiert eine alternative
Form eines Gens, die einen vorgegebenen Lokus auf einem Chromosom
innehat.
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Wie
gemeinhin bekannt, ist eine „Mutation" eine nachweisbare Änderung
im genetischen Material, die an eine Tochterzelle weitergegeben
werden kann. Wie wohl bekannt ist, kann eine Mutation zum Beispiel
eine nachweisbare Änderung
in einer oder mehreren Deoxyribonukleotiden sein. Zum Bespiel können Nukleotide hinzugefügt, deletiert,
ersetzt, invertiert, oder an eine neue Position versetzt weiden.
Spontane Mutationen und experimentell induzierte Mutationen existieren.
Das Ergebnis einer Mutation eines Nukleinsäuremoleküls ist ein mutiertes Nukleinsäuremolekül. Ein mutiertes
Polypeptide kann durch mutiertes Nukleinsäuremolekül kodiert werden.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff „aufgereinigt" auf ein Molekül, dass
von einem zellulären Bestandteil
getrennt wurde. Daher ist ein „aufgereinigtes
Protein" in einem
Maße aufgereinigt,
wie es in der Natur nicht vorkommt. Ein „im wesentlichen reines" Molekül ist ein
Molekül,
dem die meisten anderen zellulären
Bestandteile fehlen.
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Wie
hier verwendet, werden die Begriffe „Molekül", „Verbindung" oder „Ligand" austauschbar verwendet
und beziehen sich grob gesagt auf natürliche, synthetische oder semisynthetische Moleküle oder
Verbindungen. Der Begriff „Molekül" bezeichnet daher
zum Beispiel Chemikalien, Makromoleküle, Zell- oder Gewebeextrakte
(von Pflanzen und Tieren) und ähnliche.
Nicht einschränkende
Beispiele für
Moleküle
beinhalten Nukleinsäuremoleküle, Peptide,
Antikörper,
Kohlenhydrate und pharmazeutische Agentien. Die Agentien können durch
verschiedene Mittel ausgewählt
und durchmustert werden, welche beinhalten Zufallsdurchmusterung,
rationale Auswahl und rationalen Entwurf unter der Verwendung von
beispielsweise Protein und Liganden Modellierungsverfahren wie Computer-Modellierung,
kombinatorische Bibliotheksdurchmusterung und ähnliche. Die Begriffe „rational
ausgewählt" oder „rational
entworfen" sollen
Verbindungen definieren, die ausgewählt wurden basierend auf der
Konfiguration der Wechselwirkungsdomänen der vorliegenden Erfindung. Wie
der durchschnittliche Fachmann verstehen wird, sind Makromoleküle mit nicht-natürlich vorkommenden Modifikationen
auch vom Begriff „Molekül" umfasst.
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Zum
Beispiel „Peptidomimetics", die in der pharmazeutischen
Industrie wohl bekannt sind und die für gewöhnlich als Peptidanaloga bezeichnet
werden, können,
wie oben erwähnt,
durch Modellierung erzeugt werden. Gleichermaßen werden in einer bevorzugten
Ausführungsform
die erfindungsgemäßen Polypeptide
modifiziert, um ihre Stabilität
zu erhöhen.
Es versteht sich, dass in den meisten Fällen die Modifikation nicht
die biologische Aktivität
der wechselwirkenden Domäne ändern sollte.
Die gemäß der Lehre
der vorliegenden Erfindung identifizierten Moleküle sind bei Krankheiten und
bei Umständen
von therapeutischen Wert, bei denen die Physiologie oder die Homeostase
der Zelle und/oder des Gewebes durch eine erfindungsgemäß identifizierte
Hochaffinitätswechselwirkung
beeinträchtigt
wird. Alternativ finden die gemäß der Lehre
der vorliegenden Erfindung identifizierten Moleküle Anwendung bei der Entwicklung
von effizienteren Agentien, die derartige Wechselwirkungen modulieren
können.
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Bibliotheken
von Verbindungen (öffentliche
oder kommerziell verfügbar,
z.B. eine kombinatorische Bibliothek) sind in der Technik wohl bekannt.
Bibliotheken von Peptiden sind ebenfalls verfügbar. Derartige Bibliotheken
können
verwendet werden, um einen überlappenden
Satz an Peptidsequenzen zu erstellen, die eine ausgewählte Domäne, ein
ausgewähltes
Protein oder einen Teil davon, umspannen.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Indikatorzellen" auf Zellen, die
wechselwirkende Peptiddomänen
exprimieren, und wobei die Wechselwirkung zwischen diesen Protein
oder deren wechselwirkenden Domänen
mit einem identifizierbaren und selektierbaren Phänotyp oder
Eigenschaft in der Weise gekoppelt ist, dass eine Bewertung oder
Bestätigung
dieser Wechselwirkung zwischen denselben möglich ist. Solche Indikatorzellen
können
auch in den Durchmusterungsassays der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen
wurden die Indikatorzellen so konstruiert, dass sie das gewählte Derivat, Fragment,
Homolog oder Mutante dieser wechselwirkenden Domäne exprimieren. Die Zellen
können Hefezellen
oder höhere
eukaryotische Zellen, wie Säugerzellen
sein (WO 96/41169). In einer bestimmten Ausführungsform, ist die Indikatorzelle
eine Hefezelle, die Vektoren enthält, die die Verwendung der
Zweihybrid-Technologie ermöglicht,
die in der Technik ebenfalls bekannt ist (4) und verwendet werden
kann, eine Verbindung oder eine Bibliothek davon zu testen.
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In
einer Ausführungsform
kann ein Reportergen, das für
einen selektierbaren Marker oder ein bestimmbares Protein kodiert,
funktional so mit einem Kontrollelement gekoppelt werden, dass die
Expression des selektierbaren Markers oder bestimmbaren Proteins
abhängig
ist von der Wechselwirkung der Wechselwirkungsdomänen von
Protein A und B. Eine derartige Indikatorzelle könnte verwendet werden um rasch
bei einem hohen Durchsatz einen großen Array von Testmolekülen zu durchmustern.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Reportergen Luziferase oder β-Gal.
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In
einer Ausführungsform
kann mindestens eines) der zwei wechselwirkende Proteine oder wechselwirkenden
Domänen
der vorliegenden Erfindung als Fusionsprotein zur Verfügung gestellt
werden. Das Design von Konstrukten dafür und die Expression und Produktion
von Fusionsproteinen sind in der Technik wohl bekannt (4, 96). In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind beide Wechselwirkungsdomänen
Teil von Fusionsproteinen. Ein nicht einschränkendes Beispiel solcher Fusionsproteine
umfassend eine LexA-Protein A Fusion (DNA bindende Domäne Protein
A; Köder)
und eine B42-Protein B Fusion (Transaktivatordomäne-Protein B; Beute). In einer weiteren
anderen bevorzugten Ausführungsform
werden das LexA-Protein
A und B42-Protein B Fusionsprotein in einer Hefezelle exprimiert,
die auch ein Reportergen besitzt, das funktional mit einem LexA
Operator und/oder LexA Responsive Element verknüpft ist. Natürlich ist
klar, dass andere Fusionsproteine in derartigen Zweihybrid-Systemen verwendet
werden können.
Weiterhin ist klar, dass die Fusionsproteine keine Volllängen Wechselwirkungsproteine
beinhalten brauchen. Tatsächlich
können
Fragmente dieser Polypeptide, wenn sie Wechselwirkungsdomänen umfassen,
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, wie durch das Peptide umspannende Verfahren
der vorliegenden Erfindung belegt ist.
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Nicht
einschränkende
Beispiele derartiger Fusionsproteine beinhalten Hemaglutinin-Fusionen,
Gluthion-S-Transferase (GST) Fusionen und Maltose bindendes Protein
(MBP)Fusionen. In bestimmten Ausführungsformen kann es von Vorteil
sein eine Protease Spaltungsstelle zwischen zwei Polypeptidsequenzen,
die fusioniert wurden, einzuführen.
Derartige Protease Spaltungsstellen zwischen zwei heterologen fusionierten Polypeptiden
sind in der Technik wohl bekannt.
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In
bestimmten Ausführungsformen
kann es auch vorteilhaft sein die erfindungsgemäßen Wechelwirkungsdomänen mit
Signalpeptidsequenzen zu verbinden, was eine Sekretion des Fusionsproteins
aus der Wirtszelle ermöglicht.
Die Signalpeptide diverser Organismen sind in der Technik wohl bekannt.
Bakterielles OmpA und Hefe Suc2 sind zwei nicht einschränkende Beispiele
von Proteinen, die Signalsequenzen beinhalten. In bestimmten Ausführungsformen,
kann es vorteilhaft sein einen Linker (wie allgemein bekannt) zwischen die
Wechselwirkungsdomäne
und den heterologen Polypeptidanteil einzuführen. Solche Fusionsproteine
finden in den erfindungsgemäßen Assays
so wie für
Aufreinigungszwecke, Detektionszwecke und ähnliches Anwendung.
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Mit
Sicherheit beinhalten die Sequenzen und Polypeptide, die nützlich sind,
um die Erfindung auszuführen,
ohne sich auf diese einschränken
zu wollen, Mutanten, Homologe, Subtypen, Allele und ähnliches.
Es versteht sich, dass im Allgemeinen die Sequenzen der vorliegenden
Erfindung für
eine funktionale (wenn auch defekte) Wechselwirkungsdomäne kodieren.
Für den
durchschnittlichen Fachmann wird es klar sein, dass, ob eine Wechselwirkungsdomäne, eine
Variante, ein Derivat, oder ein Fragment der vorliegenden Erfindung
davon ihre/seine Funktion bei der Bindung an ihre/seinen Partner
beibehält,
durch Verwendung der Lehre und der Assays der vorliegenden Erfindung
und durch Verwendung der allgemein aus dem Stand der Technik bekannten
Lehre bestimmt werden kann.
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Wie
hier beispielhaft gezeigt, können
die erfindungsgemäßen Interaktionsdomänen modifiziert
werden, zum Beispiel durch in vitro Mutagenese, um die Struktur-Funktions
Beziehung davon zu analysieren und ein besseres Design und die Identifikation
der modulierenden Verbindungen zu ermöglichen. Obgleich einige Derivate
oder Analoge ihre biologische Funktion des Wechselwirkens mit ihren
jeweiligen Interaktionspartnern verloren haben, können diese
immer noch, zum Beispiel zum Erzeugen von Antikörpern, Verwendung finden. Diese
Analoga oder Derivate können
zum Beispiel verwendet werden, um Antikörper gegen die Interaktionsdomänen der
vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Diese Antikörper können für Detektions- oder Aufreinigungszwecke
verwendet werden. Zusätzlich
könnten
diese Antikörper
auch als kompetetive oder nicht-kompetetive Inhibitoren agieren
und es könnte
gezeigt werden, dass sie Modulatoren einer Wechselwirkung sind, die
gemäß der vorliegenden
Erfindung identifiziert wurde.
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Eine
Wirtszelle oder Indikatorzelle ist mit exogener oder heterologer
DNA (z.B. einem DNA Konstrukt) „transfiziert" worden, wenn diese
DNA in die Zelle eingeführt
wurde. Die transfizierende DNA kann oder kann nicht in die chromosomale
DNA, die das Genom der Zelle ausmacht, integriert (kovalent verbunden)
werden. In Prokaryoten, Hefe, und Säugerzellen zum Beispiel kann
die transfizierende DNA auf einem episomalen Element, wie einem
Plasmid, beibehalten werden. Bezogen auf eukaryotische Zellen ist
eine stabil transfizierte Zelle eine Zelle, bei der die transfizierende
DNA so in das Chromosom integriert wurde, dass sie von ihren Tochterzellen
durch Chromosomenreplikation geerbt wird. Diese Stabilität zeigt
sich durch die Fähigkeit
der eukaryotischen Zellen Zelllinien oder Klone zu bilden umfassend
ein Population von Tochterzellen, die die transfizierende DNA enthalten.
Transfektionsverfahren sind in der Technik wohl bekannt (4, 96).
Die Verwendung einer Säugerzelle
als Indikator kann den Vorteil haben, dass ein intermediärer Faktor
bereitgestellt wird, der die Wechselwirkung von zwei Polypeptiden,
die getestet werden, erlaubt oder moduliert, die vielleicht nicht in
niederen Eukaryoten oder Prokaryoten vorhanden sind. Natürlich kann
der Vorteil entfallen, wenn beide getesteten Polypeptide direkt
wechselwirken. Es versteht sich, dass Extrakte von Säugerzellen
zum Beispiel in bestimmten Ausführungsformen
verwendet werden können,
um den Mangel an bestimmten Faktoren in der gewählten Indikator Zelle auszugleichen.
Man sollte sich bewusst sein, dass das Gebiet der Translation zahlreiche
Lehren von Verfahren zur Herstellung und Rekonstitution verschiedener
Typen an Extrakten zur Verfügung
stellt
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Im
Allgemeinen sind Techniken zur Herstellung von Antikörpern (einschließlich monoklonaler
Antikörper
und Hybridome) und zur Detektion von Antigenen mittels Antikörpern in
der Technik wohl bekannt (12). Die vorliegende Erfindung stellt
auch polyklonale, monoklonale Antikörper, oder humanisierte Versionen
davon, chimäre
Antikörper
und ähnliches
zur Verfügung,
die ihre entsprechenden Wechselwirkungsdomänen inhibieren oder neutralisieren
und/oder für
diese spezifisch sind.
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In
der Beschreibung und den angehängten
Ansprüchen
sollte der Begriff „therapeutisches
Agens" in einem
breiten Sinne verstanden werden, nämlich so dass auch eine Kombination
von wenigstens zweier solcher therapeutischen Agentien beinhaltet
ist. Die DNA Segmente oder Proteine der vorliegenden Erfindung können auf
einer Reihe von Wegen in die Individuen einführt werden. Zum Beispiel können die
erythropoietischen Zellen von dem betroffenen Individuum isoliert
werden, mit einem erfindungsgemäßen DNA
Konstrukt transformiert und in ein betroffenes Individuum auf einer
Reihe von Wegen einschließlich
intervenöser
Injektion, wieder eingeführt
werden. Alternativ kann das DNA Konstrukt direkt an das bettoffene
Individuum verabreicht werden, zum Beispiel, über Injektion im Knochenmark.
Das therapeutische Agens kann auch durch eine Transportform wie
ein Liposom verabreicht werden, dass entworfen sein kann auf einen
bestimmte Zelltypen zu zielen, und konstruiert sein kann auf verschiedenen
Wegen verabreicht zu werden.
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Für die Verabreichung
an Menschen wird der verschreibende Mediziner letztendlich die geeignete Form
und Dosierung für
jeden gegebenen Patienten bestimmen, und es kann erwartet werden,
dass diese gemäß des gewählten therapeutischen
Behandlungsschemas (z.B. DNA Konstrukt, Protein, Molekül), der
Reaktion und dem Zustand des Patenten sowie der Schwere der Erkrankung
variiert
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Zusammensetzungen
innerhalb des Schutzbereiches der vorliegenden Erfindung sollten
das aktive Agens (z.B. Protein, Nukleinsäure, oder Molekül) in einer
Menge enthalten, die wirksam ist den effizient den gewünschten
therapeutischen Effekt zu erreichen, während nachteilige Nebeneffekte
vermieden werden. Typischerweise können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an
Säuger
(z.B.) Menschen in Dosierung verabreicht werden, die von 0.005 bis
1 mg pro kg pro Tag des Körpergewichts
des zu behandelnden Säugers
reichen. Pharmazeutisch verträgliche
Präparationen
und Salze des aktiven Agens gehören
zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung und sind in der Technik
wohl bekannt (88). Für
die Verabreichung der Polypeptide, Antagonisten, Agonisten und ähnlicher,
sollte die verabreichende Menge so gewählt werden, dass nachteilige Nebeneffekte
vermieden werden. Die Dosierung wird durch den Kliniker gemäß den üblichen
Faktoren wie dem Ausmaß der
Krankheit und verschiedenen Parametern des Patienten angepasst.
Typischerweise werden 0.001 bis 50 mg/kg/Tag dem Säuger verabreicht.
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Die
Verfahren und Assays der vorliegenden Erfindung sind auch für Annexin
bestätigt
worden. Dieses Protein ist signifikant von P-Glykoprotein sowohl
in Struktur als auch Funktion verschieden. Konsequenterweise zusammen
mit dem Wissen über
Proteinchemie und Molekularbiologie unterstützen diese Bestätigungen die
Anwendbarkeit der vorliegenden Assays und Verfahren auf alle Proteine
(von Viren, lebenden Zellen, Tieren, Pflanzen, usw.).
-
Kurze Beschreibung der
Abbildungen
-
Nachdem
bisher die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird nun auf die
beigefügten
Abbildungen verwiesen, die bildlich eine bevorzugte Ausführungsform
darstellen, und in denen:
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1 das
Prinzip der Protein-Protein Wechselwirkung zeigt. Die Pluszeichen
(+) markieren die Regionen der Hochaffinitätsbindung. Die Minuszeichen
(–) markieren
die Regionen der stark abstoßenden
Kräfte. Wie
im Text vermerkt ist, bestehen die Wechselwirkungen zwischen zwei
Proteinen aus diskontinuierlichen Regionen von Hochaffinitätsbindung
und stark abstoßenden
Kräften,
die fast im Gleichgewicht sind, wobei die Hochaffinitätsbindung
bevorzugt ist, während
die Proteine zusammen sind.
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2 zeigt eine schematische Darstellung
eines Verfahrens zur Identifikation von Hochaffinitätsbindungs-Sequenzen
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. A, die verschiedenen Formen stellen
verschieden Proteine im vollständigen
Zelllysat dar. Die Bezeichnungen entsprechen denen von 1.
B, kleine überlappenden
Peptide, die die gesamte Sequenz (oder ein Segment) des Proteins
abdecken. A wird direkt auf derivatisierten Nocken der 96-Polypropylen
Nockenplatten synthetisiert. Nach der Peptidsynthese, wird metabolisch radioaktiv
markiertes vollständiges
Zelllysat zu jeder Nocke, die die zahlreichen Peptide enthält, hinzu
gegeben und in einem Inkubationspuffer inkubiert. C, die dunklen
gefüllten
Kreise stellen die radioaktiv markierten Proteine des vollständigen Zelllysats
dar, die aus den metabolisch radioaktiv markierten Zellen isoliert
wurden und die zu allen Nocken der 96 Nockenplatten hinzu gefügt wurden,
um Hochaffinitätsbindungssequenzen
auf Protein A zu identifizieren. D, nach einer intensiven Waschung,
sind die Hochaffinitätsbindungssequenzen
(überlappenden
Peptide von Protein A) in jenen Nocken, die radioaktive markierte Proteine
binden (dunkel). Vier Hochaffinitätsbindungssequenzen zwischen
Protein A und (einem) anderen Proteinen) werden in Reihen 1, 3,
6 und 8 identifiziert. Die Nocken, die Hochaffinitätsbindungssequenzen
enthalten, werden durch radioaktiv markiertes Zählen und SDS-PAGE identifiziert.
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3 ist eine schematische Darstellung eines
Verfahrens zur Identifizierung von Hochaffinitätsbindungssequenzen gemäß einer
anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. A zeigt eine schematische Darstellung
der Wechselwirkung zwischen Protein A und Protein B. B, kleine überlappende
Peptide, die die gesamte Sequenz (oder ein Segment) von Protein
A abdecken werden direkt auf derivatisierten 96 Polypropylen Nockenplatten
synthetisiert. Nach der Peptidsynthese wird ein radioaktiv markiertes
Protein B (synthetisiert aus einem in vitro Transkriptions-Translations-Reaktions-Gemisch)
zu jeder Nocke, die die zahlreichen Peptide enthält, hinzu gegeben, und in einem
Inkubationspuffer inkubiert. C, die dunklen gefüllten Kreise stellen radioaktiv
markiertes Protein B dar und das zu allen Nocken der 96 Nockenplatten
hinzu gefügt
wurde, um Hochaffinitätsbindungssequenzen
auf Protein A zu identifizieren. D, nach einem Waschungsverfahren
sind die Hochaffinitätsbindungssequenzen
in jenen Nocken, in welchen Protein B (radioaktiv markiertes Protein
in dunkel) immer noch an die Peptide von Protein A gebunden ist.
E, vier Hockaffinitätsbindungssequenzen
zwischen Protein A und Protein B werden in Reihen 1, 3, 6 und 8
identifiziert. Die Nocken, die Hochaffinitätsbindungssequenzen enthalten,
werden durch radioaktiv markiertes Zählen und SDS-PAGE identifiziert.
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4 ist eine schematische Darstellung eines
Verfahrens zur Selektion von Wirkstoffen, die gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung spezifisch die Bindung des Proteins A
an B inhibieren. A zeigt eine schematische Darstellung der Wechselwirkung
zwischen Protein A und Protein B. B, Peptide, die für Hochaffinitätsbindungssequenzen
kodieren, werden als Pionier Sequenzen für die Selektion von spezifischen Wirkstoffen
verwendet, die die Assoziation zwischen Protein A und Protein B
und letztendlich die Funktion des Komplexes inhibieren. Um auf Hochaffinitätssequenzen
zu abzuzielen, die in den 2 oder 3 identifiziert wurden, werden Peptide
synthetisiert, die für
eine der Hochaffinitätsbindungssequenzen
kodieren, und verwendet um Proteine zu identifizieren, die an diese
Peptide binden. Graue Kreise stellen eine der vier Hochaffinitätsverbindungssequenzen,
die in 2 und 3 identifiziert
wurden, dar. C, nach Zugabe der zu testenden Verbindung zu jeder
Nocke der 96 Nockenplatten, wird ein radioaktive markiertes Protein
B zu jede der Nocken hinzugefügt.
Natürlich
können
kombinatorische Bibliotheken durchmustert werden, um Wirkstoffe
zu identifizieren, die spezifisch an die Hochaffinitätsbindungsequenzen
von Protein A binden. Wie zuvor angemerkt, ist radioaktiv markiertes
Protein B aus der Transkriptions-Translationsmischung
dargestellt. Die Platten werden gewaschen und die Wirkstoffe, die
spezifisch an die Hochaffinitätssequenzen
von Protein A binden, werden in den Nocken gefunden, die nicht das
radioaktiv markierte Protein B enthalten. D, Nocken enthaltend die
Wirkstoffe/Verbindungen, die spezifisch and der Hochaffinitätsbindungssequenzen
in Protein A binden, und daher die Bindung von Protein B verhindern,
werden durch die Abwesenheit eines dunkle Kreises identifiziert
(d.h. Nocken 28, 70 und 75). Ausgewählte Wirkstoffe/Verbindungen
stellen unschätzbare
Pionier Verbindungen dar, die in biologischen Assays verwendet werden
können,
um ihren Wirkungsmechanismus zu bestätigen. Bestätigte Wirkstoffe können zu
in vivo Studien vorangehen.
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5 zeigt
die vorausgesagte Sekundärstruktur
und Aminosäure
einer Verbindungsdomäne
von P-Glykoprotein. Eine schematische Darstellung der vorausgesagten
Sekundärstruktur
von P-gp. Die zwölf
gefüllten
Vierecke stellen die vermutlichen Transmembrandomänen dar.
Die zwei ATP-Bindungsdomänen
sind durch zwei Kreise in der N- und
C-terminalen Hälfte
von P-gp dargestellt. Die eingefügte
Abbildung stellt die Verbindungsdomäne dar. Die Aminosäuresequenz
der Verbindungsdomänen
von humanem P-gp
1 (HP-gp1) und HP-gp3 ist im Einbuchstaben-Aminosäuren-Code
angegeben. Die Ziffern in den Klammern zu Beginn und dem Ende jeder
Aminosäuresequenz
von HP-gp1 und HP-gp3 zeigt die Länge der Verbindungsdomänen (1–90 und
1–88 für HP-gp1
bzw. HP-gp3). Die nummerierten Linien unter der Aminosäuresequenz
zeigen die Sequenzen der überlappenden
Hexapeptide, die sich um eine Aminosäure unterscheiden. Für HP-gp3
hat das letzte Hexapeptid die Nummer 88.
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6 zeigt
die Proteinbindung an überlappende
Hexapeptide, die für
die HP-gp1 Verbindungsdomäne
kodieren. Überlappende
Hexapeptide, die die Verbindungsdomäne von HP-gp1 kodieren, wurden
auf Polypropylen Stäbchen
synthetisiert und verwendet, um Proteine zu identifizieren, die
an diese Peptide binden. Eine Gesamtheit von 90 Hexapeptiden plus
zwei Kontrollhexapeptiden für
HP-gp1 wurde mit vollständigen Zelllysat
aus [35S] Methionin metabolisch markierten
Zellen inkubiert (siehe Methoden). Alle gebundenen Proteine wurden
von den Stäben
mit fixierten Peptiden eluiert und in 10% SDS-PAGE aufgetrennt.
Spuren 1 bis 92 zeigen die [35S] Methionin
gebundenen Proteine von HP-gp1. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker wird
auf der linken Seite des Gels gezeigt.
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7 zeigt
die Effekte der verschiedenen Detergentien oder von Hochsalz auf
die Bindung von Protein an HP-gp1 Hexapeptide. Metabolisch radioaktiv
markierte Proteine, die an Hexapeptide (Hexapeptide 50–53) der
HP-gp1 Verbindungsdomäne
gebunden sind, wurden in der Gegenwart von ansteigenden Konzentrationen
von anionischen Detergenz (0.12%–0.5% SDS), zwitterionischen
Detergenz (20 mM–80
mM CHAPS) oder Salz (0.3 M–1.2
M KCl) eluiert. Die Y-Achse stellt die Menge der Radioaktivität dar, die
von einem Pool der drei Hexapeptide (50 bis 53) eluiert wurde.
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8 zeigt
die Effekte von CHAPS auf die Bindung von Proteinen an die überlappenden
Hexapeptide, die die HP-gp1 Verbindungsdomäne kodieren. Überlappende
Hexapeptide der Verbindungsdomäne
von HP-gp1 wurden mit vollständigem
Zelllysat, das mit 10 mM CHAPS aus mit [35S]
Methionin metabolisch markierten Zellen extrahiert wurde, inkubiert.
Gebundene Proteine wurden von den Stäbchen mit fixierten Peptiden eluiert
und in 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Spuren 1 bis 92 zeigen die [35S] Methionin gebundenen Proteine der HP-gp1
Verbindungsdomäne.
Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker wird auf der linken Seite
des Gels gezeigt.
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9 zeigt
die Proteinbindung an überlappenden
Hexapeptide, die die HP-gp3 Verbindungsdomäne kodieren. Überlappende
Hexapeptide, die die HP-gp3 Verbindungsdomäne kodieren, wurden auf Polypropylen-Stäbchen synthetisiert
und verwendet um Protein zu identifizieren, die an diese Peptide
binden. Eine Gesamtheit von 88 Hexapeptiden plus zwei Kontrollhexapeptiden
für HP-gp3
wurde mit vollständigen
Zelllysat aus [35S] Methionin metabolisch
markierten Zellen inkubiert. Alle gebundenen Proteine wurden von
den Stäbchen
mit fixierten Peptiden eluiert und auf 10% SDS-PAGE aufgetrennt.
Spuren 1 bis 90 zeigen die [35S] Methionin
gebundenen Proteine von HP-gp3. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker
wird auf der linken Seite des Gels gezeigt.
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10 zeigt
eine Sequenzgegenüberstellung
der drei bindenden Regionen von HP-gp1 und HP-gp3 Bindungsdomänen. Die
Gegenüberstellung
der HP-gp1 und HP-gp3 Verbindungsdomänen wird unter Verwendung des
Einbuchstaben-Codes für
Aminosäuren
gezeigt. Die Regionen der Hochaffinitätsbindung von HP-gp3 und HP-gp1
sind fettgedruckt. Identische Aminosäuren sind mittels Einbuchstaben-Code
zwischen den zwei gegenübergestellten
Sequenzen dargestellt. Konservierte Aminosäuren werden durch ein Plus
(+) Zeichen markiert. Die Zahlen auf jeder Seite der Aminosäuresequenz
der Verbindungsdomäne
bezieht sich auf die Aminosäuresquenz
der humanen HP-gp1 und 3 wie in (90, 111).
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11 zeigt
zwei Hochaffinitätsbindungs-Hexapeptide.
Zwei Hochaffinitätsbindungssequenzen 658RSSLIR663 und 669SVRGSQ674 aus
der HP-gp1 Verbindungsdomäne
wurden resynthetisiert und mit vollständigen Zelllysat aus [35S] Methionin metabolisch markierten Zellen
inkubiert gefolgt von 24 oder 48 stündigen Inkubationszeiten. Gebundene
Proteine wurden von den Stäbchen
mit fixierten Peptiden eluiert und in 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Spuren 1 bis 92 zeigen
die [35S] Methionin gebundenen Proteine
von HP-gp1. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker wird auf der
linken Seite des Gels gezeigt.
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12 zeigt
die Effekte von verschiedenen Trägerproteinen
als Blockierungsagens mit unspezifischer Bindung. Vollständiges Zelllysat
aus [35S] Methionin metabolisch markierten
CEM Zellen wurden mit oder ohne 1% Gelatine, 0.3% BSA oder 3% BSA
verwendet. Die Zelllysate wurden mit einem Hochaffinitätsbindungs-Hexapeptid 658RSSLIR663 einer
HP-gp1 Verbindungsdomäne
inkubiert. Die gebundenen Proteine wurden mit SDS Probenpuffer eluiert
und auf 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker
wird auf der linken Seite des Gels gezeigt.
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13 zeigt
die Aufreinigung eines 57 kDa Proteins. Vollständiges Zelllysat wurde mit
fünfzig
HP-gp1 Hexapeptiden 658RSSLIR663 und 669SVRGSQ674 inkubiert.
Proben, die das 57 kDa Protein (P57) aus einem hundert Hexapeptidinkubationsmischung
enthalten, wurden vereinigt und auf 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Die aufgetrennten
Proteine wurden auf PVDF Membran transferriert und mit Ponceau S
angefärbt.
Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker wird auf der rechten Seite
des Gels gezeigt.
-
14 zeigt
eine Westerblotanalyse mit monoklonalen Antitubilin-Antikörpern. Vollständiges Zelllysat
von CEM Zellen und Proteinen, die von Hochaffinitätsbindungshexapeptiden
der HP-gp1 Verbindungsdomäne
(P57) eluiert wurden, wurden über
SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose Membran transferriert. Eine
Hälfte
der Membran wurde mit monoklonalen Anti-α und Anti-β Tubulin Antikörpern als
Sonde inkubiert. Die Wanderung der Molekukulargewichtsmarker wird
auf der linken Seite der Abbildung gezeigt.
-
15 zeigt
die Helixraddarstellung der Hochaffinitätsbindungsregion der HP-gp1
und HP-gp3 Verbindungsdomäne.
Der Einbuchstaben Aminosäurecode
für die
Hochaffinitätsbindungsregion
von HP-gp1 und HP-gp3 wird gezeigt. Die positiv geladenen Aminosäuren auf
einer Seite der Helix sind umkreist.
-
Andere
Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden nach
Lesen der folgenden nicht-beschränkenden
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen unter Bezug auf
die beigefügte
Abbildung, die als Beispiel dienen soll und nicht als den Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung beschränkend verstanden werden sollte,
klarer werden.
-
Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsform
-
Die
Funktion oder die Funktionen der Proteine wird vermittelt durch
ihre Wechselwirkung mit anderen zellulären oder extrazellulären Proteinen.
Bislang wurde angenommen, dass Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen
große
Bereiche der Polypeptide involviert, die komplementäre Aminosäuresequenzen
haben. Es ist jedoch nicht bekannt, wie diese komplementären Sequenzen
die Wechselwirkungen zwischen den Proteinen vermitteln. In dieser
Anmeldung wird ein neues Konzept vorgeschlagen, um das Prinzip der
Protein-Protein Wechselwirkungen zu erklären. Kurz gesagt, werden die
Wechselwirkungen zwischen jeglichen zwei oder mehreren Proteinen
durch eine Folge von unterbrochenen Sequenzen mit Hochaffinitätsbindungs-
und hoch abstoßenden
Kräften
vermittelt (siehe 1). Die Summe dieser Kräfte über die
gesamte exponierte Sequenz an Proteinen bestimmt die Natur und das
Ausmaß dieser
Wechselwirkungen zwischen Proteinen. Die Größen dieser wechselwirkenden
Domänen
können
zwischen 5 und 25 Aminosäuren
Länge variieren.
-
Die
Anziehungskräfte
zwischen zwei kleinen Hochaffinitätsbindungssequenzen sind im
Allgemeinen größer als
die Summe aller Hochaffinitätsbindungs-
und Abstoßungskräfte zwischen
zwei Proteinen.
-
Daher
ist es unter Verwendung des vorliegenden Ansatzes möglich wechselwirkende
Proteine aus einer Mischung von Proteinen mit Hilfe eines kurzen
Peptids (fast sechs Aminosäuren)
zu isolieren. Unter Berücksichtigung
dieser Erkenntnisse ist es nun leicht zu verstehen, warum viele
Verfahren, die versuchten wechselwirkende Proteine zu isolieren,
gescheitert sind. Die Verwendung großer Fragmente oder Proteine,
um wechselwirkende Proteine zu isolieren, sind weniger effizient,
da die Summe der Anziehungs-/Abstoßungskräfte viel schwächer ist
als jegliche Abfolge von Anziehungskräften. Das hier vorgeschlagene
Prinzip ist auch konsistent mit der Tatsache, dass Protein-Protein
Wechselwirkungen durch posttranslationale Modifikationen (z.B. durch
Phosphorylierung (29)) und die Präsens andere wechselwirkender
Proteine (60) moduliert werden können.
Demzufolge kann die Hinzufügung
oder der Verlust von schwachen Kräften in Folge der posttranslationalen
Modifikation das empfindliche Gleichgewicht zwischen den Hochaffinitätsbindungs-
und Hochabstoßungskräften zerstören, die
Proteine zusammenhalten oder ihre Assoziation verhindern. Die Größe der Anziehungskräfte zwischen
zwei Hochaffinitätsbindungssequenzen
wird bei der Antikörper-Antigen
Bindung demonstriert, wobei das Antigen nur aus wenigen Aminosäuren bestehen
kann (36, 37). Weiterhin existieren zahlreiche Beispiele in der
Biologie, bei denen zelluläre
Wechselwirkungen zwischen Proteinen aufgrund der Vorhandenseins
einer kleinen Konsensussequenz von fünf bis zehn Aminosäuren vorkommen.
Nichteinschränkende
Beispiele solcher kleinen Konsensussequenzen schließen ein die
Leucin-Zipper (63), und SH2 und SH3 Bindungssequenzen (63, 80).
Zusätzlich
zu den Wechselwirkungsdomänen
zwischen zwei oder mehreren Proteinen (wie oben beschrieben), können Protein-Protein
Wechselwirkungen viele messbare Effekte haben, wie: i) Änderungen
der kinetischen Eigenschaften von einem oder beiden Proteinen (83,
84); ii) Bildung neuer Bindungs- oder
Funktionsstellen (65, 104); und iii) die Inaktivierung von einer
Funktion oder Funktionen (106, 114). In anderen Worten, ein gegebenes
Protein könnte
verschiedene Funktionsdomänen
oder Sequenzen in der Gegenwart (im Gegensatz zu der Abwesenheit)
jeglicher wechselwirkende Proteine exponieren. Daher kann in der
Gegenwart von Protein B Protein A andere Sequenzen exponieren, die
zuvor nicht für
Wechselwirkungen mit anderen Proteinen exponiert wurden (65, 83,
84, 104, 106, 114). Das letztgenannte Konzept ist sehr wichtig,
da es Argumente liefert gegen die Effektivität einiger struktureller Studien
(d.h. Röntgenstruktur und
NMR) zur Voraussage funktionaler oder Oberflächen exponierter Domänen aus
der gelösten
Kristallstruktur der Proteine. Durch die Ermöglichung der Messung und Identifikation
möglicherweise
aller Hochaffinitätsbindungsstellen
eines gegebenen Proteins werden die Nachteile der Ergebnisse, die
mit solchen strukturellen Studien gewonnen wurden, überwunden.
-
Neben
den obigen Beispielen von Protein-Protein Wechselwirkungen ist eine
Untergruppe der Protein-Protein Wechselwirkungen die Dimerisierung.
Es gibt eine sehr große
Vielzahl an Beispielen in der Biologie, bei denen Protein-Protein
Wechselwirkungen essentiell für
die Aktivierung oder Inhibierung der Funktion sind (59). Nicht einschränkende Beispiele
von Homo- oder Heterodimeren
schließen
ein: Wachstumsfaktorrezeptoren (52); Membrantransportproteine (9,
36. 76); Tumorsuppressorproteine (72); und Proteine die Apoptose vermitteln
(87). In der Tat ist dynamische Dimerisierung ein häufiges Thema
bei der Regulation der Signalübertragung.
Einige der funktionalen Konsequenzen der Dimerisierung beinhalten
den verringerten Abstand zur Aktivierung der Einzeltransmembranzelloberflächenrezeptoren
(z.B. EGF Rezeptor (52)) und differenzierte Regulierung bei der
Heterodimerisierung, z.B. der BCL2 Proteinfamilie (87). Die Proteinkonzentration
in lebenden Zellen ist sehr hoch und im Bereich von 10–30 mg/ml.
Bei dieser hohen Proteinkonzentration, sollten fast alle Proteine
genau und spezifisch mit anderen zellulären Proteinen wechselwirken.
Einige dieser wechselwirkenden Proteine wirken als Funktionsinhibitoren,
während
andere Aktivatoren sein können
(z.B. die BCL2-BAX Proteinfamilie (87)). Darüber hinaus verlangt das Wechseln
eines gegebenen Proteins zwischen Aktivator- und Inhibitorassozierung,
dass der Assoziierung-Dissoziierungs-Prozess rasch geschieht. Wenn
zum Beispiel Protein X mit einem Inhibitorprotein I assoziiert ist,
sind vielleicht die Domänen
(kleinen Sequenzen), die für
die Assoziierung des Proteins X mit einem Aktivatorprotein A nötig sind,
in dem X-I Komplex nicht leicht zugänglich. Daher sind bestehende
Verfahren zur Identifikation assoziierter Proteine (d.h. das Zweihybrid-System
und ähnliche
Ansätze)
vielleicht nicht in der Lage alle assoziierten Proteine zu identifizieren.
In anderen Worten können
bestehende Verfahren, falls erfolgreich, vielleicht einige aber
nicht alle funktionale Domänen
und ihre assoziierten Proteine identifizieren. Im Gegensatz dazu
ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des
Peptid Durchmusterungs-Ansatzes in der Lage alle funktionalen oder
Hochaffinitätsbindungsdomänen der
Proteins X und seiner assoziierten Proteine zu identifizieren. Sind
die assoziierten Proteine einmal identifiziert, können ihre
biologischen Funktionen, sofern sie sich auf das Zielprotein X beziehen,
getestet werden. Daher sollte die Wechselwirkung eines gegebenen
wechselwirkenden Proteins mit einem oder mehreren möglichen
assoziierten Proteinen sich als wichtig für die Funktion erweisen, können die
Hochaffinitätsbindungssequenzen
(zwischen Protein X und I oder A) leicht identifiziert werden und
als Zielstelle in einem Hochdurchsatz Wirkstoff Durchmusterungs-Assay
(siehe unten) oder anderen Assays verwendet werden.
-
Diese
Erfindung beinhaltet das Konzept (beschrieben in 1A–1D), dass Protein-Protein Wechselwirkungen aus diskontinuierlichen
Hochaffinitätsbindungs-
und Hochabstoßungskräften bestehen,
die über
die ganze 3-D Sequenz des Proteins verteilt sind, und dass diese
Sequenzen unter Verwendung von einem der vielen möglichen
hier angegebenen Ansätze
isoliert werden können
(z.B. den Ansatz mit überlappenden
Peptiden). Obwohl in dieser Anmeldung der Ansatz mit überlappenden
Peptiden beispielhaft dargestellt wird, sind andere Ansätze vorstellbar,
die ähnliche
Ergebnisse liefern. Es sollte hervorgehoben werden, dass der hier
beschriebene Ansatz unempfindlich ist gegenüber Änderungen in der Konformation,
die sich bei wechselwirkenden Proteinen ergeben, und die andere
gemeinhin benutzte Verfahren zur Identifikation von Protein-Protein Wechselwirkungen
beeinflussen können
(z.B. Zweihybridsystem, Affinitätsblotting,
und Quervernetzung). Im Zweihybridsystem ist zum Beispiel Protein
A mit einer anderen Proteinsequenz (dem DNA-gebundenen „Köder" Protein) verbunden
und das andere wechselwirkende Protein ist verbunden mit der Aktivierungsdomäne, die
das „Beute" Protein enthält. Das
Binden der wechselwirkende Proteine an Protein A könnte Stellen
exponieren, die sonst nicht in der nativen Konformation gefunden
werden und die ihre Wechselwirkungen beeinflussen können. Weiterhin
hat das Zweihybridsystem zahlreiche Nachteile die unten aufgezählt werden,
- i. Die Wechselwirkung von Proteinen wird im
Kernmilieu statt im Zytoplasma, in dem die meisten Proteine gefunden
werden, beobachtet.
- ii. Proteine können
toxisch sein, wenn sie in verschiedenen Zellen oder Organismen exprimiert
werden.
- iii. Die Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen in einem Komplex
im Zweihybridsystem können
sterisch die Bindung von anderen wechselwirkenden Proteinen verhindern.
- iv. Die posttranslationale Modifikation eines Proteins kann
seine Wechselwirkung mit anderen Proteinen verhindern.
- v. Das Zweihybridsystem erlaubt nicht die gleichzeitige Identifizierung
der exakten Aminosäuresequenzen zwischen
zwei wechselwirkenden Proteinen.
- vi. Die Anwendung des Zweihybridsystems geht mit einem hohen
Anteil von falsch Positiven einher.
- vii. Das Zweihybridsystem kann nicht ohne weiteres auf verschiedene
Zelltypen oder Gewebe, bei denen verschiedene wechselwirkende Proteine
exprimiert werden können,
angewendet werden (dies kann ein kritischer Nachteil dieses Systems
sein).
-
Verfahren
zur Identifikation wechselwirkender Proteine und Wechselwirkungsstellen
für Protein
A
-
Der
vorliegende Ansatz und die Methodologie, die verwendet wird um diskontinuierliche
Sequenzstränge
zwischen zwei oder mehreren wechselwirkenden Proteinen zu identifizieren,
ist der Ansatz des Scannens überlappender
Peptide. Bei Verwendung dieses Ansatzes wird eine große Anzahl
kleiner überlappender Peptide,
der „Köder", parallel auf einem
inerten festen Träger
synthetisiert, die die gesamte Aminosäuresequenz eines gegebenen
Proteins abdecken (siehe 2). Die Überlegung
eine große
Anzahl kleiner überlappender
Peptide zu synthetisieren statt einer diskontinuierlichen Peptidbibliothek
fußt auf
der Tatsache, das man nicht a priori weiß, welche exakte Sequenz eines
gegebenen Proteins die Hochaffinitätsbindungsstellen und die abstoßenden Sequenzen
enthalten wird. Daher führt
der Ansatz mit diskontinuierlichen Peptiden of zum Vorhandensein
sowohl von Hochaffinitätsbindungssequenzen
als auch Abstoßungssequenzen
im dem gleichen Peptid. Derartige Peptide werden nicht mit hoher
Affinität
an potentielle Wechselwirkungsproteine binden. Darüber hinaus
erhält
man durch die Verwendung überlappender
Peptide auch interne Kontrollen zur unspezifischen Bindung. Zum
Beispiel werden bei der Verwendung überlappender Peptide die Hochaffinitätsbindungssequenzen
einen Signalpeak geben, wenn die Peptide innerhalb der Hochaffinitätsbindungsdomäne die Hochaffinitätsaminosäuresequenzen,
aber nicht die Aminosäuren
besitzen, die Abstoßungskräfte verursachen (siehe 6 in
Beispiel I). Natürlich
versteht sich, dass die vorliegende Erfindung nicht davon abhängig ist, die
gesamte Peptidsequenz zu umspannen. In der Tat, kann/können die
Teilregion(en) des Proteins verwendet werden.
-
Zusätzlich können überlappende
Peptide von einer gewählten
Domäne
des Proteins abgeleitet werden. Es ließe sich auch vorstellen, dass
ein überlappender
Satz an Peptiden eines ersten Proteins als Sonde für einen überlappenden
Satz an Peptiden eines zweiten Proteins dient.
-
Um
zu zeigen, wie man diesen Ansatz der überlappenden Peptide als „Köder" verwenden kann,
um wechselwirkende Proteine „die
Beute" aus einer
Mischung mit allen Zellproteinen zu isolieren, kann das folgende
Beispiel betrachtet werden. P-Glykoprotein ist ein Membranprotein
(46), das Resistenz gegen Antikrebs Medikamente verleiht, und daher
verantwortlich ist für
das Scheitern der Chemotherapie. Obgleich nachgewiesen wurde, dass
P-Glykoprotein funktioniert, indem es die Anhäufung von chemotherapeutischen
Medikamenten in Tumorzellen verhindert, ist der genaue Mechanismus
unbekannt, wie dieses Protein funktioniert und ist unbekannt, was
die assoziierten Protein sind, die seine Funktion modulieren. Daher
besteht ein Interesse Proteine zu identifizieren, die mit P-Glykoprotein
wechselwirken, um eine Inhibierung der Bindung zwischen P-Glykoprotein
und seinen assoziierten Proteinen zu ermöglichen, und dadurch möglicherweise
seine Funktion in resistenten Tumorzellen zu modulieren. Diesem
Beispiel lag das Interesse zu Grunde jene Proteine zu identifizieren,
die an die Verbindungsdomäne
der P-Glykoproteins binden. Daher wurde in diesem bestimmten Beispiel
eine Domäne
eines gewählten
Proteins verwendet. Die Verbindungsdomäne kodiert für eine Region
von etwa 90 Aminosäuren.
Daher wurden auf einen festen Träger überlappende
Hexapeptide, die diese gesamte Verbindungssequenz des P-Glykoproteins überdecken,
mit Standard F-moc Chemie synthetisiert (74). Die kovalent fixierten
Peptide (auf dem festen Träger)
wurden mit vollständigem
Zelllysat inkubiert, das aus Zellen isoliert wurde, die metabolisch
mit [35S] Methionin markiert waren. Die
Peptide und das vollständige
Zelllysat wurden in der Gegenwart eines Trägersubstrats für 18 Stunden
bei 4°C
inkubiert (1–3%
bovines Serumalbumin, oder 1–3%
Gelatine, 1–3%
Magermilch etc.). Nach dieser Inkubationsphase, wurden die kovalent
fixierten Peptide intensiv mit isotonischem Puffer gewaschen. Alle
Proteine aus dem radioaktive markiertem vollständigen Zelllysat, die mit den überlappenden
Hexapeptiden nach dem Waschschritt assoziiert blieben, werden in SDS
enthaltenem Probenpuffer eluiert und durch SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) analysiert (62). Das Vorhandensein von radioaktiv markierten
Proteinen auf SDS Polyacrylamid Gelen nach Geltrocknung und Signalverstärkung stellt
die folgende Information zur Verfügung:
- 1)
jene spezifischen überlappenden
Peptide repräsentieren
Hochaffinitätsbindungssequenzen
in der P-Glykoprotein Verbindungsdomäne (oder anderen gewählten Domänen oder
nicht-gewählten
Domänen);
und
- 2) die Proteine, die an die spezifischen überlappenden Peptide gebunden
sind, sind assoziierte Proteine (siehe 6).
-
Die
assoziierten Proteine, die an die Hochaffinitätsbindungssequenzen gebunden
sind, können
in großen
Mengen für
den Zweck isoliert werden, die Identität über N-terminale Aminosäuresequenzierung,
durch Edman Abbau (27) oder ähnliches
zu bestimmen. Kurz gesagt, werden die Sequenzen der überlappenden Peptide,
die ein gegebenes Protein gebunden haben, auf einem festen Träger resynthetisiert
und an diesen fixiert gehalten. Vollständiges Zelllysat aus [35S] Methionin metabolisch radioaktiv markierten
Zellen wird zu dem festen Träger
hinzugefügt,
der die fixierten Hochaffinitätssequenzpeptide
enthält,
und wie oben beschrieben inkubiert. Nach Waschschritten und einem
Elutionsschritt mit SDS-enthaltenem
Puffer (siehe unten), um ungebundenes Material zu entfernen, wird
das assoziierte Protein in großen
Mengen isoliert. Das aufgereinigte assoziierte Protein ist nun fertig
für die
Aminosäuresequenzierung.
Sollten weitere Aufreinigungsschritte notwendig sein, sind diese
dem Fachmann natürlich
wohl bekannt. Das aufgereinigte Protein wird auf SDS Polyacrylamid
Gelen laufen gelassen und das aufgetrennte Protein wird, wie zuvor
beschrieben (108), auf PVDF Membranen transferriert. Andere Verfahren
zur Aminosäuresequenzbestimmung
können
auch leicht angewendet werden (27, 33).
-
Verfahren
zur Identifizierung der Aminosäuresequenzen
zwischen zwei wechselwirkenden Proteinen
-
Dasselbe
oben beschriebene Konzept kann auch angewendet werden, wenn man
nur daran interessiert ist, die Hochaffinitätsbindungssequenzen zwischen
zwei Proteinen zu identifizieren. Ein nicht einschränkendes
Beispiel für
zwei derartige Proteine sind die Wechselwirkungsregionen zwischen
p53 und MDM (28, 103). Der Zweck dieser Übung ist es daher insbesondere
Hochaffinitätsbindungssequenzen
zwischen Protein A (p53) und Protein B (MDM) zu identifizieren,
um diese Sequenzen als Zielstellen für die Identifikation von Verbindungen
zu verwenden, die diese Wechselwirken modulieren und noch spezieller
für die
Entwicklung von Wirkstoffen. Wenn ein gegebener Wirkstoff an eine
dieser Hochaffinitätsbindungsstellen
auf Protein A gebunden ist, wird der Wirkstoff daher in einer Ausführungsform
die Bildung des aktiven Komplexes (Protein A + B) verhindern und
daher die Funktionen des Komplexes verhindern. Um den Strang der
Hochaffinitätsbindungssequenzen
zwischen Protein A und B (siehe 3)
zu isolieren, werden kleine überlappende
Peptide (5 bis 7 Aminosäuren),
die die gesamte Aminosäuresequenz
des Proteins A, „dem
Köder", abdecken, parallel
auf einen festen Träger
synthetisiert (wie oben erwähnt
und detaillierter in Beispiel 3 beschrieben). Es ist bei dieser speziellen
Ausführungsform
zu beachten, dass nur die primäre
Aminosäuresequenz
des Proteins A, „des
Köders", benötigt wird.
Nachdem die Peptide einmal synthetisiert sind (Peptidsynthese wird
parallel auf einem festen Träger
in 96 Nockenplatten gemacht), wird eine angereichertes und radioaktiv
markiertes Volllängen Protein
B, „die
Beute" (das radioaktiv
markierte Protein B ist leicht aus einer in vitro Transkriptions-Translationsreaktionen
erhältlich;
(118)) zu jeder der Nocken der 96-Nockenplatte hinzu gegeben, die
die kovalent fixierten überlappenden
Peptide enthalten. Die Peptide, die für Protein A kodieren, werden
mit radioaktiv markiertem Protein B inkubiert, um zu erlauben, dass
Bindung stattfindet. Nach einer Inkubationsperiode (5 bis 24 Stunden)
wird nicht gebundenes radioaktiv markiertes Protein B durch intensive
Waschung in isotonischem Puffer entfernt. Alle überlappenden Peptide, die an
radioaktiv markiertes Protein B gebunden sind, werden in der Gegenwart
von denaturierenden Agentien eluiert. Das Eluat jeder dieser 96-Nockenplatten
wird auf das Vorhandensein von radioaktiv markiertem Protein B untersucht,
indem man die Proben über
SDS-PAGE laufen lässt
(62). Hochaffinitätsbindungspeptide
werden als jene identifiziert, die radioaktiv markiertes Protein
B zurückbehalten.
-
Die
Verwendung von metabolisch markierten Proteinen als „Beute", um mit den überlappenden
Peptiden „des
Köders" zu wechselwirken,
erhöht
die Sensitivität
dieser Technik und erlaubt die Identifizierung der wechselwirkende
Proteine mit Bindungsaffinitäten
von 10–10 – 10–12 M
für ein
Standard 50 kDa Protein, das für ein
bis zehn radioaktiv markierte Methionin Reste kodiert (82).
-
Verfahren zur Verwendung
von Hochaffinitätsbindungssequenzen
in Hochdurchsatzassays zur Durchmusterung von Pionierverbindungen
-
Der
hier beschriebene Ansatz zur Identifizierung von Hochaffinitätsbindungssequenzen
oder Zielstellen zur Wirkstoffentwicklung kann auch in Hochdurchsatzassays
verwendet werden, um nach kleinen Molekülen aus kombinatorischen Bibliotheken
zu durchmustern. Um zum Beispiel Wirkstoffe zu selektieren, die
spezifisch die Bindung von Protein A an B verhindern (siehe 4), werden eine oder mehrere Zielstellen
(die Hochaffitätsbindungssequenzen),
wie zuvor beschrieben, in jeder der 96-Nockenplatten synthetisiert.
In diesem Beispiel (4) wird die gleiche
Hockaffinitätsbindungssequenz
in allen Nocken synthetisiert. Zu jeder Hochaffinitätsbindungssequenzen
enthaltender Nocke werden ein oder mehrere Moleküle) aus einer kombinatorischen
Bibliothek hinzugefügt.
Nach Zugabe des/der Wirkstoff(s/e), wird zum Beispiel ein radioaktiv
markiertes Protein B aus einem in vitro Transkriptions-Translationsgemisch
hinzu gegeben und, wie oben angegeben, inkubiert. Nach mehreren
Waschungen, wird gebundenes Protein mit SDS-Probenpuffer eluiert.
Radioaktiv markiertes Protein B enthaltende Nocken zeigen an, dass
der Wirkstoff keinen Effekt auf die Bindung zwischen der Hochaffinitätsbindungssequenz
und Protein B hatte. Wenn andererseits eine oder mehrere Nocken kein
radioaktiv markiertes Protein B in der Gegenwart des Wirkstoffes
enthalten, dann hat dieser Wirkstoff die Wechselwirkungen zwischen
der Hochaffinitätsbindungssequenz
auf A und Protein B verhindert. Demzufolge ist der letztere Wirkstoff
eine gute Pionierverbindung. Diese Wirkstoffe können nun in die zweite Phase
ihrer Analyse eintreten, um zu bestimmen, ob sie die Bildung eines
aktiven Komplexes aus Volllängenprotein
A und B verhindern. Aktive Wirkstoffe, die identifiziert werden,
werden in vivo getestet werden, um ihren Wirkmechanismus weiter
zu bestätigen.
Auf diese Weise werden spezifischere Wirkstoffe mit geringeren oder
keinen Nebeneffekten entwickelt.
-
Der
letztgenannte Punkt stellt einen Vorteil dar, da die meisten Proteine
mehr als eine biologische Funktion haben. Wenn zum Beispiel Protein
A mit sich selbst wechselwirkt, wird es eine Funktion ausüben, während das
gleiche Protein, das mit einem anderen Protein wechselwirkt, eine
andere Funktion ausüben
wird. Darüber
hinaus wird Protein A, wenn es Teil eines vorgegebenen Komplexes
assoziierter Proteine ist, mehrere Funktionen vermitteln, die Wechselwirkungen
zwischen Protein A und B verhindern, während die Wechselwirkungen
zwischen Proteinen A und C, D oder F nicht beeinflusst werden, einer
oder einige zelluläre
Wege inhibiert werden. Dem gegenüber
wird die Inhibierung der Funktion von Protein A die Funktionen des
gesamten Komplexes inhibieren. In dieser Hinsicht wird die Identifikation,
Isolierung und Entwicklung von Wirkstoffen, die spezifisch Wechselwirkungen
zwischen zwei Proteinen innerhalb eines Proteinkomplexes inhibieren
werden, in spezifischeren Wirkstoffen mit geringeren Nebeneffekten
resultieren. Außerdem
wird die Zusammensetzung eines gegebenen Proteinkomplexes bei unterschiedlichen
Geweben unterschiedlich sein, da unterschiedliche Proteine in unterschiedlichen
Geweben oder Organen differentiell exprimiert werden. Demzufolge
wird der Ansatz Wirkstoffe zu entwickeln, die Protein-Protein Wechselwirkungen
inhibieren auch zu Wirkstoffen führen,
die Organ- und Gewebsspezifisch sind.
-
Es
versteht sich natürlich,
dass die vorliegende Erfindung auch quantitative Assays zur Messung
der Protein-Protein Wechselwirkung und ihrer Modulation durch Verbindungen
zur Verfügung
stellt.
-
Schließlich hat
der Ansatz, der in dieser Anmeldung beschrieben wurde, zur Identifikation
wechselwirkender Proteine, der genauen Aminosäuresequenz zwischen wechselwirkenden
Proteinen, und das Zielen auf solche spezifischen Sequenzen in Proteinen
mit Wirkstoffen, die Protein-Protein Wechselwirkungen, ein enormes
Potential die zukünftige
Wirkstofffindung in der pharmazeutischen Industrie zu diktieren.
-
Die
vorliegende Erfindung wird in mehr Detail durch die folgenden nicht
eingrenzenden Beispiele veranschaulicht.
-
BEISPIEL 1
-
P-Glykoprotein Bindung
an Tubulin wird durch Sequenzen in der Verbindungsdomäne vermittelt
-
Die
erfolgreiche Behandlung von Krebspatienten mit chemotherapeutischen
Wirkstoffen ist oft durch die Entwicklung Wirkstoff resistenten
Tumoren begrenzt. Tumorzelllinien, die in vitro mit einem einzelnen
Antikrebs-Wirkstoff selektiert wurden, werden resistent gegenüber einem
breiten Spektrum chemotherapeutischer Wirkstoffe, die multiwirkstoff
resistente (oder MDR) Tumorzellen genannt werden (Übersicht
in (21, 45, 66)). Darüber
hinaus wurde die Expression von MDR in diesen Tumorzellen mit der Überexpression
von zwei Membranproteinen assoziiert; dem MDR1 P-Glykoprotein (P-gp)
und dem „Multidrug
Resistance-associated Protein" (MRP1)(21,
45, 66). Sowohl P-gp als auch MRP sind Mitglieder einer großen Familie
von Membrantransporterproteinen, die als „ATP binding cassete" Proteine oder ABC
Membrantransporter bekannt sind (54). Obgleich die Struktur von
P-gp1 spekulativ bleibt (91), lassen kumulative topologische Hinweise
auf eine tandemartig verdoppelte Struktur mit sechs Transmembrandomänen und
einer großen
zytoplasmatischen Domäne
schließen,
die für
eine ATP Bindungskassette kodiert (58, 68). Die zwei Hälften von
P-gp1 sind über
einen Strang aus 90, reich an polaren oder geladenen Aminosäuren, Resten
verbunden, der Verbindungsdomäne genannt
wird.
-
Die
P-gp Genfamilie besteht aus drei strukturell ähnlichen Isoformen in Nagern
(Klassen I, II, und III) und zwei Isoformen im Menschen (Klassen
I und III) (20). Gentransfer Studien lassen auf funktionale Differenzen
zwischen diesen strukturell ähnlichen
Isoformen schließen.
Zum Beispiel weisen nur die P-gp Isoformen der Klassen I und II
den MDR Phänotyp
auf (25, 111), während
die Klasse III Isoformen dies nicht tun (11, 98). Die Klasse III
Isoformen vermitteln den Transfer von Phosphatidylcholin aus der
inneren Schicht in die äußere Schicht
der Plasmamembran (d.h. „Flipase")(92, 100). In normalen
Geweben beschränkt
sich die P-gp Verteilung hauptsächlich
auf Gewebe mit sekretorischen Funktionen (79, 116). Ihre polarisierte
Lokalisierung auf apikalen Oberflächen, die einem Lumen der Nebennierendrüse, der
Leber, dem Niereninnere zugewandt sind, lässt eine normalen Transport-
oder Entgiftungsmechanismus vermuten. Darüber hinaus exprimieren die
hematopoietischen Stammzellen und spezifischen Lymphozyten-Unterklassen
auch große
Mengen von P-gp (49). Die normale Funktion oder das/die normale(n)
Substrat(e) der Klassen I und II bleiben undefiniert; jedoch führt die
Disruption der Klasse I oder/und II Gene aus dem Mausgenom zu einer
Anhäufung
der zytostatischen Wirkstoffe oder lipophilen Verbindungen in den
meisten normalen Geweben, aber besonders eindrucksvoll im Gehirn
(99, 100). Basierend auf diesen Ergebnissen wird spekuliert, dass
die normale Funktion von P-gp (der Klasse I und II oder des P-gp
verursachenden MDR) die Entgiftung ist, ähnlich wie die Entgiftung,
die in MDR Zellen zu sehen ist, insbesondere an der Bluthirnschranke
(57). Hohe Mengen an P-gp fanden sich in vielen intrinsisch Medikamentenresistenten
Tumoren aus Darm, Niere, Brust und Nebennieren, sowie bei anderen Tumoren,
die den MDR Phänotyp
nach Chemotherapie angenommen haben (zum Beispiel bei akuter nicht-lymphoplastischer
Leukämie)
(22, 32, 35, 47, 53, 78). Zahlreiche Studien haben nun eine inverse
Korrelation zwischen der P-gp Expression und der Reaktion auf Chemotherapie
belegt (5, 89, 113). Weiter haben Chan et al. (16, 17) gezeigt,
dass P-gp Expression für
das MDR und die Reaktion bei Kinderleukämie, Weichgewebssarkomas und
Neuroblastomas bei Kindern prognostisch ist. Im Lichte dieser Studien
scheint es überzeugende
Belege zu geben, dass zumindest bei einigen Krebsarten die P-gp
Mengen die Reaktion auf die chemotherapeutische Behandlung vorraussagen.
-
Direkte
Bindung zwischen P-gp und verschiedenen lipophilen Verbindungen
wurde durch Verwendung von photoaktiven Wirkstoffanalogen gezeigt
(77, 93, 94). Bei bestimmten Verbindungen, die P-gp binden, wurde
gezeigt, dass sie den MDR Phänotyp,
vermutlich durch Kompetierung um die gleiche Medikamentenbindungsstelle
in P-gp, revertieren (34, 38). Diese Verbindungen, die alle zusammen
als MDR-revertierende Agentien bezeichnet werden, schließen ein
Verapamil, Quinidin, Ivermectin, Cyclosporine, und Dipyrimadol Analoge,
um nur wenige zu nennen (34, 38). Klinische Versuche mit MDR-revertierenden
Agentien (z.B. Verapamil oder Quinidin) haben einige Reaktion in
Tumoren gezeigt, die sonst nicht auf Chemotherapie ansprechen (23,
44, 117). Jedoch hat die mit zahlreichen MDR-revertierenden Agenten
assoziierte hohe pharmakologische Toxizität ihre Verwendung bei einer
effizienten Konzentration verhindert (67). Eine bessere klinische Reaktion
wurde bei Verwendung anderer MDR-revertierenden Agentien (d.h. Cyclosporin
A und sein nicht immunsuppremierendes Analog PSC833) beobachtet;
allerdings wurden toxische Effekte auch mit Cyclosporin gesehen
(101, 115).
-
Es
wurde gezeigt, dass P-gp ein Substrat für Proteinkinase C und A ist
(2, 9). Darüber
hinaus wurde gezeigt, dass Agentien, die Proteinkinase C Aktivität modulieren,
P-gp Phosphorylierung und seine MDR-vermittelten Phänotype modulieren
(7, 13). In einer Studie wurde gezeigt (31), dass PMA Phorbol Ester
(ein Proteinkinase C Aktivator) den MDR Phänotyp und den Medikamenten
Ausfluss in MCF7 Brustkrebszellen verstärkt. In einer anderen Studie
(6) wurde gezeigt, dass Natrium Butyrat Behandlung von SW620 humanen Darmkrebszellen
zu einem starken Anstieg der P-gp Expression führte, ohne einen gleichzeitigen
Anstieg der Medikamentenresistenz oder des Medikamentenausflusses.
Interessanterweise erwies sich P-gp in SW620 Zellen auch nach Natrium
Butyrat Behandlung als wenig phosphoryliert (6). Zusammengenommen
war das Fehlen der Transportfunktion von P-gp in SW620 Zellen nicht
klar, allerdings wurde gezeigt, dass Mutationen der P-gp Phosphorylierungsstellen
innerhalb der Verbindungsdomäne
keinen Einfluss auf seine Medikamententransportfunktion haben (40).
Stattdessen regulierte die Protein Kinase C Modulation der Serin/Threonin Reste
in der Verbindungsdomäne
die Aktivität
der endogenen Chloridkanäle
und lässt
daher vermuten, das P-gp den Kanal steuert (41, 110). Obwohl es
daher unklar bleibt, welche Funktionen die Verbindungsdomäne von P-gp1
vermittelt, was es von Interesse die Proteine mit einem in vitro
Assay zu identifizieren, die mit der Verbindungsdomäne wechselwirken.
Der letztere Assay basiert auf einem neuen Verständnis der Proteinwechselwirkungen,
das durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird. Die weiter
unten gezeigten Ergebnisse zeigen, dass drei Sequenzen in der Verbindungsdomäne an Proteine
mit den apparenten Molekularmassen von ~80 kDa, 57 kDa und 30 kDa
binden. Aufreinigung und partielle N-terminale Aminosäuresequenzierung
des 57 kDa Proteins zeigten, das es für die N-terminalen Aminosäuren von α und β-Tubulin kodiert.
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Es
wurde daher, unter Verwendung einer Proteindomäne als ein Beispiel für die Gültigkeit
der Mächtigkeit
der vorliegenden Erfindung, gezeigt, dass: i) diese Domäne spezifisch
an die Proteine gebunden wird; ii) die spezifisch bindenden Protein
formell identifiziert werden können;
und iii) die Sequenz verantwortlich ist für die spezifische Bindung an
diese formell identifizierten Proteine (zusammen mit den wechselwirkenden
Domänen
dieses bindenden Proteins, wenn abgeleitet).
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Beispiel 2
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Materialien
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[35S] Methionin (1000 Ci/mmol; Amersham Life
Sciences, Inc.) und [125I] Ziegen Anti-Maus
Antikörper wurden
von Amersham Biochemical Inc. gekauft. Protein-A Sepharose-4B wurde von
Bio-Rad Life Science bezogen. Alle anderen verwendeten Chemikalien
wurden mit dem höchsten
verfügbaren
kommerziellen Reinheitsgrad verwendet.
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Beispiel 3
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Peptidsynthese
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Vorderivatisierte
Plastikstäbchen,
Aktivester und Polypropylen Schalen wurden von Cambridge Research
Biochemicals (Valley Stteam, NY bezogen. Peptide wurden, wie zuvor
beschrieben (36, 37) auf festen Polypropylen Stäbchen synthetisiert. Kurz gesagt,
wurde die F-moc Schutzgruppe auf den vorderivatisierten Polypropylen
Stäbchen
als festem Träger
(im 96 Nockenformat angeordnet) durch Inkubation mit 20% (v/v) Piperidin
in Dimethlyformamid (DMF) für
30 Minuten unter Schütteln
entfernt. Nach Aufhebung des Schutzes der β-Alanin Spacer auf den Polypropylen
Stäbchen,
wurden die F-moc geschützten
Aminosäuren
in HOBt/DMF aufgetrennt und zu den dazugehörigen Nocken hinzu gegeben,
die die entschützten
Stäbchen
enthielten. Das Koppeln der Aminosäuren fand für 18 Stunden bei Raumtemperatur
statt, danach wurden die Stäbchen
in DMF (1 × 2
Minuten), Methanol (4 × 2
Minuten), und DMF (1 × 2
Minuten) gewaschen. Zum Koppeln der zweiten Aminosäure war
eine Entschützung
der F-moc Aminoschutzgruppe der ersten Aminosäure und die Inkubation der
Stäbchen
mit der zweiten voraktivierten F-moc geschützten Aminosäure (Pentaflurphenyl
Derivaten) notwendig. Man ließ die
Reaktion für
18 Stunden stattfinden, und die Stäbchen wurden entfernt und,
wie oben angegeben, gewaschen. Die gleichen Schritte wurden für jede Aminosäurekopplung
wiederholt bis sechs Aminosäuren
gekoppelt waren. Nach dem letzten Kopplungsschritt wurde die F-moc
N-terminale Schutzgruppe mit 20% Piperidin/DMF entfernt und die
freie Aminogruppe für
90 Minuten in einem Acetanhydrid: Diisopropylethylamin (DIEA): DMF
(50:1:50 v/v/v) enthaltenden Acetylierungs Cocktail acetyliert.
Die Seitenketten Schutzgruppen der N-terminal acetylierten Hexapeptide
auf den Polypropylen Stäbchen
wurden durch Inkubation mit einer Spaltungsmischung enthaltend Trifluressigsäure: Phenol:
Ethandithiol (95:2.5:2.5 v/v/v) für 4 Stunden bei Raumtemperatur
entfernt. Nach dem Spaltungsschritt wurden die Stäbchen mit
Dichlormethan (DCM) gewaschen und in 5% (v/v DIEA/DCM) neutralisiert.
Die entschützten
Peptid-gekoppelten Stäbchen
wurden in DCM, Methanol gewaschen und für 18 Stunden getrocknet.
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Beispiel 4
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Gewebekultur
und Metabolisches Markieren der Zellen
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Medikamenten
sensitive Zellen (CEM) und resistente Zellen (CEM/VLB1.0)
wurden in α-MEM Medium supplementiert
mit 10% fötalem
Kälberserum
(Hyclone, Inc.), wie zuvor beschrieben (8), kultiviert. Alle Zellen wurden
alle drei Monate unter Verwendung des Mycoplasma PCR Kits von Stratagene
Inc. (San Diego, CA) auf Mycoplasma Kontamination untersucht. Für die metabolische
Markierung der Zellen wurden CEM oder CEM/VLB1.0 Zellen
bei 70–80%
Konfluenz mit [35S] Methionin (100 μCi/ml) für 6 Stunden
bei 37°C
in Methionin freiem α-MEM
Medium metabolisch markiert.
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Beispiel 5
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Zellextraktion und Bindungsassay
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Nach
metabolischer Markierung der Proteine mit [35S]
Methionin wurde die Zellen 3 Mal mit Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS)
und in hypotonischem Puffer (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2,
10 mM Tris-HCl, pH 7.4) enthaltend Protease Inhibitoren (2mM PMSF,
3 μg/ml
Leupeptin, 4 μg/ml
Pepstatin A und 1 μg/ml
Aprotinin) aufgenommen und für
30 Minuten auf Eis gehalten. Zellen wurden durch Homogenisierung
in einem hypotonischen Puffer lysiert und das Zelllysat bei 6000 × g für 10 Minuten
sequentiell zentrifugiert. Nach der letztgenannten Zentrifugation
wurde der Überstand
entfernt und auf eine Endkonzentration von 0.5 M NaCl aus einer
Stammlösung
von 4 M NaCl eingestellt. Das Zelllysat wurde auf Eis für 30 Minuten
inkubiert. Die Probe wurde gemischt und auf eine Endkonzentration
von 0.1 M NaCl zurückgebracht.
Das Zelllysat wurde für
10 Minuten bei 15,000 × g
bei 4°C
zentrifugiert. Der letztgenannte Überstand wurde entfernt und
noch mal bei 100,000 × g
für 60
Minuten in einer Beckmann Ultrazentrifuge mit einem SW55 Rotor zentrifugiert.
Die Proteinmenge in den oben genannten Proben wurde mittels des
Lowry Verfahrens bestimmt (69).
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Für einen
Bindungsassay wurden [35S] Methionin markierte
Proteine aus vollständigem
Zelllysat mit einem gleichen Volumen an 3–6% BSA in Phosphat gepufferter
Salzlösung
(PBS) gemischt, mit überlappenden
Hexapeptiden, die kovalent an Polypropylen Stäbchen fixiert sind, inkubiert.
Die Peptide und vollständigen Zelllysate
wurden über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Die Stäbchen
wurden dann entfernt und vier Mal in PBS gewaschen. Die gebundenen
Proteine wurden durch Inkubation der mit Peptid fixierten Stäbchen in
1 × SDS
Probenpuffer für
60 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln eluiert. Die mit Peptid
fixierten Stäbchen
wurden durch Inkubation in PBS, enthaltend 2% SDS und 1 mM β-Mercaptoethanol bei
65°C, mit
einem Sonikator für 30
Minuten regeneriert. Nach der letztgenannten Inkubation wurden die
Stäbchen
für fünf Minuten
in 65°C
ionisiertem Wasser und zwei Minuten in 65°C Methanol gewaschen. Die mit
Peptiden fixierten Stäbchen
sind nun für
die nächste
Runde der Durchmusterung fertig. In Fällen, bei denen die Effekte
der zahlreichen Detergentien auf die Bindung getestet wurden [35S] Methionin markierte Proteine aus vollständigem Zelllysat
mit einem gleichen Volumen an 3% BSA in Phosphat gepufferter Salzlösung enthaltend
KCl (300 mM bis 1200 mM), SDS (0.12% bis 2%), oder CHAPS (20 mM
bis 160 mM) gemischt und, wie oben beschrieben, mit kovalent fixierten
Peptiden inkubiert.
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Beispiel 6
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Polyacrylamid Gel Elektrophorese
und Western Blotting
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Protein
Fraktionen (100–150 μl) wurden
auf SDS-PAGE mit dem Laemmli Gelystem (62) aufgetrennt. Kurz gesagt,
wurden die Proteine in 1× Solubilisierungs
Puffer I (62.5 mM Tris-HCl,
pH 6.8, enthaltend 2% (w/v) SDS, 10% (w/v) Glyzerin und 5% β-Mercaptoethanol)
aufgelöst
und die Proben bei konstanter Stromstärke der Elektrophorese unterzogen.
Gelscheiben enthaltend die aufgetrennten Proteine wurden in 50%
Methanol und 10% Essigsäure
fixiert. Polyacrylamid Gele enthaltend [35S]
Methionin Proteine wurden nach einer dreißig Minuten Inkubation in einer
AmplifyTM Lösung (Amersham Inc.) Kodak
Röntgenfilm
ausgesetzt.
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Alternativ
wurden die Proteine auf Nitrozellulosemembran in Tris-Glyzin Puffer
in der Gegenwart von 20% Methanol gemäß dem Verfahren von Towbin
et al. (108) für
die Western Blot Analyse transferiert. Vor der Zugabe der anti-α oder anti-β monoklonalen
Tubulin Antikörpern
(0.5 μg/ml
in 3% BSA; Amersham, Inc.) wurde die Nitrozellulosemembran in 5%
Magermilch/PBS inkubiert. Nach zahlreichen Waschungen mit PBS wurde die
Nitrozellulose Membran mit Ziegen Anti-Maus Peroxidase-konjugierten
Antikörper
inkubiert und die immunoreaktiven Proteine wurden durch Chemolumineszenz
mit der ECL Methode (Amersham, Inc.) sichtbar gemacht.
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Beispiel 7
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Proteinaufreinigung und
N-terminale Sequenzierung
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Das
57 kDa assoziierte Protein wurde unter Verwendung eines Blocks von
Polypropylen Stäbchen
mit zwei Hochaffinitätsbindungs-Peptiden
aufgereinigt. Kurz gesagt, wurden die mit Peptid fixierten Stäbchen, wie oben
beschrieben, mit vollständigem
Zelllysat inkubiert; allerdings war in diesem Fall die Trägersubstanz
Gelatine (1%). Die gebundenen Proteine wurden in 100 mM Phosphat
Puffer, pH 7.4 enthaltend 2% SDS und 0.1% β- Mercaptoethanol eluiert. Die eluierten
Proteine wurden durch Mischung mit 9 Volumen eiskalten Ethanols
gefällt
und bei –20°C inkubiert.
Nach Hochgeschwindigkeitszentrifugation der letztgenannten Probe
(15 Minuten Zentrifugation bei 15,000 × g bei 4°C) wurden die gefällten Proteine
in 1% SDS in PBS aufgenommen und mit einem gleichen Volumen 2× SDS Laemmli
Proben Puffer (62) gemischt. Protein Proben wurden über ein
10% SDS-PAGE aufgetrennt
und auf PVDF Membranen transferriert. Die Wanderung der 57 kDa Bande wurde
durch Anfärbung
der PVDF Membran mit Ponceau S sichtbar gemacht. Die PVDF Membran
enthaltend die 57 kDa Bande wurde ausgeschnitten und der Proteinsequenzierungs-Einrichtung
am Biotechnologie Service Centre in Toronto, Ontario, übergeben.
Aminosäuresequenzierung
der Peptide wurde gemäß dem Verfahren
von Edman und Begg (27) durchgeführt
unter Verwendung eines Applied Biosystems Gas-Phase Model 470 A
SequenatorsTM gemäß des von Flynn (33) beschriebenen
Verfahrens.
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Beispiel 8
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Identifizierung eines
P-gp Wechselwirkungsproteins
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Wie
oben erklärt,
ist P-gp ein tandemartig dupliziertes Molekül bestehend aus zwei Hälften, wobei
jede davon für
sechs Transmembrandomänen
und eine ATP Bindungsdomäne
kodiert. Die zwei Hälften
von P-gp sind durch eine Verbindungsdomäne verbunden. Von den 90 Aminosäuren, die
die Verbindungsdomäne
bilden, sind 32 Aminosäuren
bei physiologischem pH entweder positiv oder negativ geladen. Während P-gp Phosphorylierungstellen
für die
P-gp Funktion wichtig
zu sein scheinen, bleiben die Funktionen der Verbindungsdomäne von P-gp
unbekannt. Um die Rolle dieser Domäne im MDR zu identifizieren
und zu analysieren, wurde das Verfahren der überlappenden Peptide der vorliegenden
Erfindung verwendet. Ein neuer Ansatz wurde entwickelt, um wechselwirkende
Proteine mit überlappenden
synthetischen Hexapeptiden zu isolieren. Die Verwendung überlappender
Peptide, um wechselwirkende Proteine zu isolieren, erlaubt die spezifische Identifikation
von wechselwirkenden Proteinen und umgeht viele der Probleme, die
mit der Verwendung zufälliger
Peptide einhergehen. 5 zeigt die Aminosäuresequenzen
der Verbindungsdomäne
von HP-gp 1 und HP-gp 3. Die zwei Verbindungsdomänen von HP-gp 1 und HP-gp 3
besitzen 41% Aminosäuresequenz
Identität
und 66% Sequenzhomologie. Überlappende
Hexapeptide wurden parallel auf derivatisierten Polyproylen Stäbchen synthetisiert,
wie zuvor beschrieben (36, 37). 92 und 90 Hexapeptide wurden synthetisiert,
um die gesamte Verbindungssequenz von HP-gp1 bzw. HP-gp3 abzudecken.
Die Hexapeptide bleiben kovalent an die Polypropylen Stäbchen geheftet.
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Um
die Proteine zu identifizieren, die mit den zahlreichen Hexapeptiden
der Verbindungsdomänen wechselwirken,
wurden die mit Peptid fixierten Stäbchen mit [35S]
Methionin metabolisch markierten vollständigem Zelllysat aus CEM oder
CEM/VLB1.0 Zellen inkubiert. Nach Abwaschen
der unspezifisch bindenden Lysatproteine, wurden die spezifisch
bindenden Proteine mit SDS enthaltenden Puffern eluiert und über SDS-PAGE
aufgetrennt. 6 zeigt die Proteine, die spezifisch
an die 92 überlappenden
Hexapeptide der HP-gp1 Verbindungssequenz gebunden sind. Drei Regionen
der HP-gp1 Verbindungsdomäne
(617EKGIYFKLVTM627, 657SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA676 und 693PVSFWRIMKLNLT705)
banden ein 57 kDa Protein. Die Hexapeptide mit den Nummern 46–60, 81–89 und
5–9 (siehe 5)
banden mit abnehmender Affinität
an das 57 kDa Protein (6). Darüber hinaus zeigten die Peptide
46–60
Bindung an zwei andere Proteine mit apparenten Molekularmessen von
80 kDa und 30 kDa, allerdings viel schwächer als an das 57 kDa Protein.
Es ist wahrscheinlich, dass die letztgenannten Proteine (80 kDa
und 30 kDa) mit dem 57 kDa assoziiert sind, da diese Proteine nachweisbar
sind, wenn die Intensität
des 57 kDa Proteinsignals hoch ist (6, Peptide
50–56).
Der Vergleich der Aminosäuresequenzen
der drei 57 kDa Bindungsproteine enthüllte keine signifikante Homologie zwischen
diesen, die ihre Bindung an das gleiche Protein erklären könnte. Interessanterweise,
kodiert allerdings die Aminosäuresequenz
der zweiten Region (Peptide 46–60)
für Protein
Kinase C Konsensus Sequenzen (15). Außerdem wurde gezeigt, dass
die dritte Region (Peptide 81–89)
für eine
Protein Kinase A Stelle kodiert (43).
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Um
die Bindungsaffinität
zwischen den Sequenzen der Hexapeptide und dem 57 kDa Protein zu
bestimmen, war es von Interesse, den Einfluss von Hochsalz (0.3–2.4 M KCl),
zwitterionischen Detergenz (10–160
mM CHAPS) und ionischen Detergentien (0.1%–2%SDS) auf die Wechselwirkungen
zwischen den Hexapeptiden, die von 657SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA676 kodiert werden, und dem 57 kDa Protein
zu bestimmen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Bindung unter Hochsalz
stabil ist, moderat stabil ist gegenüber hohen Konzentrationen an
CHAPS, aber sensitiv ist gegenüber
geringen Konzentrationen an SDS (7). Vor dem
Hintergrund der Stabilität
der Proteinbindung an kovalent angeheftete Proteine in Gegenwart
von 10 mM CHAPS, war es von Interesse, die Bindung der Hexapeptide
der HP-gp 1 Verbindungsdomäne
an CHAPS lösliche
Proteine, die integrale Membranproteine beinhalten könnten, zu
bestimmen. Die Ergebnisse in 8 zeigen
Proteine gebunden an dieselben überlappenden
Hexapeptide, die für
die Verbindungsdomäne
von HP-gp1 kodieren. Obwohl die Hexapeptide mit den Nummern 46–60, 81–89 und
5–9 (siehe 5)
an das 57 kDa Protein banden, zeigte sich bei anderen Proteinen,
dass sie mit den gleichen oder anderen Hexapeptiden wechselwirken,
die keine Proteine in Abwesenheit von 10 mM CHAPS binden. Zum Beispiel
banden Hexapeptide 3–10
an das 210 kDa Protein, das ohne CHAPS nicht nachgewiesen wurde. Ähnlich banden
Hexapeptide 16–20,
die ohne CHAPS keine Protein banden, an das gleiche Protein mit
hohem Molekulargewicht (7). Peptide 40–60 banden
stärker
an zahlreiche Niedermolekulagewichtsproteine (~45–25 kDa)
in der Gegenwart von CHAPS. Die Hexapeptide 80–89 banden zusätzlich zu
dem 57 kDa Protein an zwei andere Proteine. Zusammen genommen belegen
die Ergebnisse in 8, dass die Bindung zwischen
den verschiedenen Hexapeptiden an das 57 kDa Protein resistent ist
gegenüber
milden zwitterionischen Detergentien wie CHAPS. Darüber hinaus
zeigt die Solubilisierung von Membranproteinen in 10 mM CHAPS Bindung
an andere Proteine, die in der Abwesenheit von 10 mM CHAPS, nicht
gesehen werden. Eine Möglichkeit
ist, dass 10 mM CHAPS den integralen Membranproteinen erlaubt mit
den verschiedenen Hexapeptiden der HP-gp 1 Verbindungsdomäne zu wechselwirken.
Alternativ legt CHAPS neue Domänen
frei, die ihrerseits die Bindung an die Hexapeptide der HP-gp1 Verbindungsdomäne erlauben.
Außerdem
können
einige der Proteine mit geringerem Molekulargewicht, die an die
Hexapeptide 40–60
und 80–89
binden, Abbauprodukte des 57 kDa Proteins sein.
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Die
P-gp Genfamilie im Menschen ist durch zwei Isoformen kodiert, HP-gp
1 und HP-gp 3 (oder mdr 1 und mdr 3; (20)). Wie allerdings bereits
vorher bemerkt, führt
nur HP-gp 1 zu dem MDR Phänotyp.
Obwohl HP-gp 1 und 3 etwa 80% Aminosäuresesequenz-Homologie besitzen
(111), ist die Verbindungsdomäne
die am stärksten
variable Domäne
unter den zwei Isoformen mit 66% Aminosäuresequenz-Homologie. Um zu
bestimmen, ob die HP-gp 3 Verbindungsdomäne an die gleichen oder andere
Proteine bindet, wurden überlappende Hexapeptide,
die für
die HP-gp 3 Verbindungsdomäne
kodieren, auf Polypropylen Stäbchen
synthetisiert und ihre Bindung an lösliche Protein wurde, wie oben
beschrieben, untersucht. 9 zeigt die Profile von Proteinen,
die an die Hexapeptide von HP-gp 3 binden. Interessanterweise band
auch ein Protein mit ähnlichem Molekulargewicht
(57 kDa) an die Hexapeptide von HP-gp 3. Allerdings war die Bindung
an einige Hexapeptide anders als die bei HP-gp 1 gesehene (6 gegenüber 9).
Von HP-gp 3 banden drei größere Aminosäuren Abschnitte
an das 57 kDa Protein (618LMKKEGVYFKLVNM631, 648KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS674 und 695PVSFLKVLKLNKT707). Die erste und die dritte Region der
HP-gp 3 Verbindungsdomäne
weist eine beträchtliche
Sequenzidentität
mit der ersten und dritten Region der HP-gp 1 Verbindungsdomäne auf (10).
Daher ist es nicht verwunderlich, dass die gleichen Hexapeptide
an das gleiche Protein banden. Die zweite Region der HP-gp 1 und
HP-gp 3 Verbindungsdomäne
sind verschieden (10). Konsequenterweise ist die
Wechselwirkungsregion zwischen HP-gp 3 und dem 57 kDa Protein größer als
die des HP-gp 1 (6 und 9), obwohl
sowohl HP-gp 1 als auch HP-gp 3 Sequenzen an ein 57 kDa banden.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen
von HP-gp 1 und HP-gp 3, die Hexapeptide binden, wird in 10 gezeigt.
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Beispiel 9
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Aufreinigung und Sequenzierung
des 57 kDa Proteins
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Um
die Identität
des 57 kDa Proteins zu bestimmen, wurden zahlreiche Kopien der zwei
Hexapeptide (658RSSLIR663 und 669SVRGSQ674) aus
der zweiten Region der HP-gp 1 Verbindungsdomäne synthetisiert. Die letztgenannten
Hexapeptidsequenzen waren diejenigen, die mit der höchsten Affinität an das
57 kDa Protein banden. 11 zeigt die Bindung dieser
zwei Peptide an vollständiges
Zelllysat aus mit [35S] Methionin metabolisch
markierten Zellen. Beide Hexapeptide banden spezifisch an das 57
kDa Protein und ein anderes Protein mit der apparenten Molekularmasse
von ~41 kDa. Interessanterweise, führten längere Inkubationszeiten des
vollständigen
Zelllysats zu einer Erhöhung
der Menge des 41 kDa Proteins (11). Daher
ist die 41 kDa Bande wahrscheinlich ein Abbauprodukt des 57 kDa
Proteins.
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Um
das 57 kDa Protein mit Hilfe der zwei Hexapeptide aufzureinigen,
war es von Interesse zu bestimmen, ob statt BSA andere Trägerproteine
verwendet werden können. 12 zeigt
die Auswirkungen von keinem blockierenden Träger, 1% Gelatine und 0.3% oder
3% BSA auf die Bindung der Hexapeptide an das 57 kDa Protein. Die
Ergebnisse dieses Experiments waren überraschend, in so fern als
kein Trägerprotein
notwendig war, um die unspezifische Bindung zu reduzieren (12).
Die zu letzt genannten ermittelten Bindungsbedingungen wurden verwendet,
um große
Mengen des 57 kDa Proteins zu isolieren, die an mehrere Kopien der
Hexapeptide 658RSSLIR663 und 669SVRGSQ674 banden. 13 zeigt
aufgereinigtes 57 kDa Protein auf SDS-PAGE angefärbt mit Commassie Blau. Das
zu letzt genannte aufgereinigte Protein wurde auf PVDF Membran transferiert
und mit Ponceau S angefärbt,
um die Position des 57 kDa Proteins zu bestimmen. Die mit Ponceau
S angefärbte
Bande, die mit der erwarteten Molekularmasse wanderte, wurde ausgeschnitten und
für die
direkte N-terminale Sequenzierung verwendet (33). Die ersten sieben
Runden des Edman Abbaus zeigten zwei Sequenzen MREVISI und MREIVHI.
Diese zwei Sequenzen unterschieden sich nur um drein Aminosäuren (VIS
statt IVH). Vergleich der zwei Sequenzen mit bekannten Proteinsequenzen
mittels der FastA Proteinsuchmaschiene zeigte, dass die zwei zu
letzt genannten Sequenzen, die ersten sieben N-terminalen Aminosäuren des α- und β-Tubulins
kodierten. Die Identifikation der Tubuline, wie des 57 kDa Proteins
war konsistent mit der apparenten Molekularmasse und den möglichen
Abbauprodukten, die nach langen Inkubationsperioden beobachtet wurden.
Um die Identität
des 57 kDa Proteins als Tubulin weiter zu bestätigen, wurden mit dem Hexapeptid
gebundenen 57 kDa Protein und vollständigem Zelllysat, die über SDS-PAGE
aufgetrennt wurden, und auf Nittozellulosemembran transferiert wurden,
eine Western Blot Analyse durchgeführt. Die Nitrozellulosemembran
wurde dann mit monoklonalen anti-α-Tubulin bzw. anti-β-Tubulin
Antikörpern
als Sonden inkubiert. 14 zeigt die Ergebnisse der
Western Blot Analyse. In Einklang mit den Sequenzierungsergebnissen,
wurden beide Tubulin Untereinheiten (α und β) in den Spuren erkannt, die
die Hexapeptid gebundenen Proteine enthalten. Daher konnte die Identität des 57
kDa Proteins als α und β-Tubulin ermittelt werden.
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Beispiel 10
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Die
Leistungsfähigkeit
des Verfahrens mit überlappenden
und umspannenden Peptiden wurde daher durch P-gp belegt. Wie oben
gezeigt, stellt das auf überlappenden
Peptiden basierte Verfahren der vorliegenden Erfindung den prinzipiellen
Beweis der Hypothese dar, nach der die Region zwischen zwei wechselwirkenden
Proteinen aus Hochaffinitätsbindungssequenzen
und abstoßenden
Sequenzen besteht und belegt auch die Tatsache, dass ein derartiges
Verfahren effizient und erfolgreich benützt werden kann, um Domänen und Sequenzen
der wechselwirkenden Proteine zu identifizieren und charakterisieren.
Das Gleichgewicht der Hochaffinitäts- und Abstoßungskräfte bestimmt,
ob zwei Proteine eine stabilen Komplex bilden werden. Die Verwendung
von kurzen überlappenden
Peptiden erlaubt die Identifikation von derartigen Hochaffinitätsbindungssequenzen
zwischen Köder
und Beute Proteinen. Die Überlegung
kurze überlappende
Peptide zu verwenden, um Hochaffinitätsbindungssequenzen zu isolieren,
ist essentiell für
den Erfolg und die Effizienz des Beweises des hier beschriebenen
Prinzips. Zum Beispiel könnten
größere Peptide
sowohl Hochaffinitäts-
als auch Abstoßungsbindungssequenzen
in einer Peptidsequenz besitzen, mit der Wirkung, dass die Summe
der Wechselwirkungskräfte
negativ ist. Darüber
hinaus verringert die Verwendung überlappender Peptide, die sich um
eine Aminosäure
von dem vorherigen und folgenden Peptid unterscheiden, die Möglichkeit
der unspezifischen Bindung. Daher weisen überlappende Peptide oft einen
Höchstwert
der Bindungsaffinität
verschiedener Peptide auf (siehe 7 und 4). Für
den Fachmann ist es klar, dass auch längere überlappende Peptide verwendet
werden können.
Bedauerlicherweise, erhöhen
solche größeren Peptide
das Risiko, dass die Identifikation der wechselwirkenden Proteine
wegen einer Änderung
des Gleichgewichts zwischen den Hochaffinitäts- und Abstoßungsaminosäuren fehlschlägt.
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Die
Bindung der 57 kDa Proteins an drei verschiedene Regionen in HP-gp1
und HP-gp3 Verbindungsdomänen
ist konsistent mit der hier vorgeschlagenen Hypothese Proteinwechselwirkungen
zu erklären
(siehe Prinzip der Protein-Protein Wechselwirkungen). Die Hochaffinitätsbindungsdomänen schwanken
um die Länge
von 10–26
Aminosäuren.
Im Fall der HP-gp1 und HP-gp3 Verbindungsdomänen besitzen zwei der drei Hochaffinitätsbindungsregionen
eine beträchtliche
Sequenzidentität.
Die dritte Hochaffinitätsregion
der Verbindungsdomänen
(658SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA677 gegenüber 648KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS67 4) besitzt keine Homologie bezüglich ihrer
primären
Aminosäuresequenz.
Allerdings zeigt die Helixrad Darstellung dieser zwei Domänen einen
Anhäufung
von positiv geladenen Resten auf der einen Seite der Helix, anderseits
eine Anhäufung
von Serin/Threonin Resten auf der anderen Seite (siehe 15).
Interessanterweise kodiert die Region mit der höchsten Bindungsaffinität zu dem 57
kDa Protein die drei vermuteten Phosphorylierungsstellen in HP-gp
1 (15). Die Positionen der Phosphorylierungsstellen in HP-gp 3 sind
nicht experimentell bestimmt worden, allerdings kodieren sie für die Konsensussequenz
von Protein Kinase C. In dieser Hinsicht ist es möglich, dass
HP-gp 1 und HP-gp 3 Wechselwirkungen an den Verbindungsdomänen durch
Phosphorylierung dieser Domäne
moduliert werden. So wurde für andere
vorgeschlagene Funktionen von HP-gp 1 (z.B. Regulator des endogenen
Chlorid Kanals) gezeigt, dass sie durch seinen Phosphorylierungsstatus
beeinflusst werden (41, 110), obgleich für Mutationen der P-gp Phosphorylierungsstellen
innerhalb der Verbindungsdomäne
nicht gezeigt wurde, dass sie seine Medikamenten-Transportfunktion
beeinflussen (40). In der Tat zeigte sich, dass ein Mitglied der
ABC Transporter, CFTR (der zystische Fibrose Transmembran-Regulator),
der eine ähnliche
Verbindungsdomäne
kodiert, mit dem Mikrotubuli Netzwerk kolokalisiert (107). Weiterhin
war die Mikrotubuli abhängige
Rekrutierung von CFTR an die apikale Plasmamembran von T84 Zellen
empfänglich
für Erhöhungen des
intrazellulären
cAMP und für
die Phosphorylierung der Verbindungsdomäne (107). Zusammengenommen,
obwohl nicht klar ist, ob Phosphorylierung eine Rolle bei der Modellierung
von P-gp Funktionen in einer Tubulin abhängigen Weise spielt, und vor dem
Hintergrund der Kolokalisation von HP-gp 1 Phosphorylierung und
Bindung an Tubulin, ist solche eine Möglichkeit wahrscheinlich. Es
wird gerade daran gearbeitet herauszufinden, ob unter Verwendung
des hier beschriebenen Assays phosphorylierte Hexapeptide an Tubulin
binden. Daher öffnet
die vorliegende Erfindung die Tür
zu einer Überprüfung einer
physiologisch bedeutenden Wechselwirkung zwischen proteinartigen
Domänen.
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Die
Möglichkeit,
dass das 57 kDa Protein an die Polypropylen Stäbchen oder ihre derivatisierten
Einheiten bindet, ist unwahrscheinlich, da alle anderen Stäbchen, die ähnlich derivatisiert
waren, nicht das 57 kDa Protein banden. Darüber hinaus banden Hexapeptide,
die bei mindestens vier verschiedenen Gelegenheiten synthetisiert
wurden, an die gleichen Proteine. Schließlich banden Hexapeptide, die
die erste und dritte Hochaffinitätsbindungsregion
der Verbindungsdomäne
von HP-gp 1 und HP-gp 3 kodierten, an das 57 kDa Protein. Zusätzlich zu
dem 57 kDa Protein, banden auch andere Proteine mit apparenten Molekularmassen
von ~80 kDa und 30 kDa an einige der Hexapeptide in den Verbindungsdomänen. Allerdings
war die Bindung dieser Proteine wesentlich schwächer als die des 57 kDa und
vielleicht assoziierter Proteine. Obwohl direkte Messungen der Bindungsaffinitäten zwischen
den verschiedenen Hexapeptiden und dem 57 kDa Protein nicht gemacht
wurden, ist es interessant, dass diese Wechselwirkung resistent
ist gegenüber
10 mM CHAPS und Hochsalz. Darüber
hinaus führte
die Gegenwart von 10 mM CHAPS in der Inkubationsmischung zu der
Bindung anderer Proteine (am erwähnenswertesten
des ~210 kDa Proteins) an zahlreiche Hexapeptidstränge, die ohne
10 mM CHAPS nicht binden. Die Bindung der letztgenannten Proteine
an die Hexapeptide 15–28
ist wahrscheinlich zurückzuführen auf
die Extraktion von Proteinen aus dem membranösen Material, die in der Abwesenheit
von CHAPS ausgeschlossen waren. In der Abwesenheit von CHAPS enthielt
das Zelllysat lösliche
Proteine und membran-assoziierte Proteine.
-
Die
Signifikanz der HP-gp 1 oder HP-gp 3 Bindung an Tubulin ist nicht
klar. Allerdings zeigte sich, dass Tubulin mit zahlreichen Membranproteinen
wechselwirkt (42, 50, 81, 86). HP-gp 1 oder HP-gp 3 Wechselwirkungen
mit Tubulin und vielleicht den Mikrotubuli könnte ein Beispiel für das Membranskelett
Zaun Modell sein (56). In diesem Modell scheint eine kleine Fraktion
der Membranrezeptoren an das darunter liegende Zytoskelett fixiert
zu sein (95). In dieser Hinsicht ist es interessant, dass ein Anstieg
der Stabilität
und der Expression von P-gp in Rattenlebertumoren in vivo mit ähnlichen
Anstiegen der Stabilität
zahlreicher Zytoskelett Proteine, einschließlich α-Tubulin, β-Actin, und Zytokeratin 8/18,
einher geht (64). Er wird zur Zeit daran gearbeitet die funktionale
Bedeutung der P-gp Wechselwirkungen mit Tubulin in vivo zu bestimmen
-
Beispiel 11
-
Das Verfahren
mit überlappenden
und umspannenden Peptiden ist nicht auf Pgp-wechselwirkende Proteine beschränkt
-
Der
Ansatz mit überlappenden
Peptiden der vorliegenden Erfindung wurde weiter mit Annexin I,
das im Gegensatz zum P-Glykoprotein, welches ausschließlich ein
Transmembran Protein ist, ein lösliches
und Membran assoziiertes Protein ist, überprüft. Annexin ist daher strukturell
und funktionell von P-Glykoprotein verschieden.
-
Mittels
dieses Ansatzes wurden zahlreiche Proteine, die mit Annexin I wechselwirken,
und die genauen Aminosäuresequenzen
von Annexin I, die diese Wechselwirkungen vermitteln, identifiziert.
Annexin I ist ein Mitglied einer großen Familie von intrazellulären löslichen
und Membran assoziierten Proteinen, die Phospholipide in einer reversiblen
und Calcium abhängigen
Weise binden. Viele Mitglieder der Annexin Familie werden mit einer
Reihe von verschiedenen intrazellulären Vorgängen, einschließlich Vesikelverkehr,
Membranfusions-Exocytose,
Signalübertragung,
und Ionenkanalbildung und Medikamentenresistenz, in Verbindung gebracht.
Nimmt man die vielen möglichen
physiologischen Funktionen von Annexin I in Betracht, war das Verfahren
der vorliegenden Erfindung darauf gerichtet, die mit ihm wechselwirkenden
Proteine und die genauen Aminosäuresequenzen,
die Annexin I Wechselwirkungen mit diesen vermitteln, zu identifizieren.
-
Kurz
gesagt wurden, wie bereits beschrieben, überlappende Peptide korrespondierend
zu der gesamten Aminosäuresequenz
von Annexin I (insgesamt ~340 Peptide plus Kontrollen) auf einem
festen, wie oben beschriebenen, Träger synthetisiert. In diesem
Fall wurden, statt Hexapeptiden, überlappende Heptapeptide benützt. Die
Peptide wurden dann mit vollständigen
zellulären
Proteinen, isoliert aus MCF7 Brusttumorzellen, die metabolisch mit
[35S] Methionin markiert waren, inkubiert.
Nach zahlreichen Waschungen, wurden die gebundenen Proteine eluiert
und auf SDS-PAGE, wie oben angedeutet, aufgetrennt. Die Ergebnisse
sind mit den vorherigen Ergebnissen mit P-Glykoprotein konsistent,
da das Verfahren zur Identifikation zahlreicher Inseln von Annexin
I Aminosäuresequenzen
führt (Daten
nicht gezeigt), die mit fünf
Proteinen wechselwirken, die Molekularmassen von 10 kDa bis zu 200
kDa (genau ~10 kDa; ~29 kDa; ~85 kDa; 106 kDa und 200 kDa) besitzen. Kurz
gesagt, wurden acht wechselwirkende Domänen, die eine hohe Affinität für die zellulären Proteine
des Extraktes haben, identifiziert. Zwei dieser Hochaffinitätsinseln
wurden in der Schwanzdomäne
von Annexin lokalisiert (Reste 1–36) und sechs in den a helikalen
Bündeln
von Annexin I (Reste 37 bis zum Ende; siehe zum Beispiel WO 99/21980).
Die Identität
der letztgenannten wechselwirkenden Proteine wird gegenwärtig untersucht.
Allerdings ist die Wechselwirkung eines 10 kDa Proteins mit Annexin
I konsistent mit früheren
Arbeiten, die eine direkte Wechselwirkung zwischen Annexin I und
S100C Protein belegten (70).
-
Daher
wurde gezeigt, dass die vorliegende Erfindung sowohl die einfache
und effiziente Identifikation einer Hochaffinitäts-Proteinwechselwirkung als
auch die gleichzeitige Identifikation der genauen Aminosäuresequenz
mindestens eines wechselwirkenden Partners ermöglicht.
-
Schlussfolgerungen
-
Es
folgt, dass ein einfacher Ansatz, um P-gp wechselwirkende Proteine
aus einem vollständigem
Zelllysat zu identifizieren, verwendet wurde. Darüber hinaus
erlaubt der Ansatz die Identifikation der genauen Aminosäuresequenzen
in P-gp 1 und P-gp 3 Verbindungsdomänen, die Proteinwechselwirkungen
mit Tubulinen vermitteln. Zusätzlich
erlaubt das Wissen um die Hochaffinitätsbindungssequenzen die nachfolgende
Aufreinigung der wechselwirkenden Proteine aus einer vollständigen Mischung
von zellulären
Proteinen, wie anhand des Beispiels mit Annexin I dargestellt. In
der Tat, in Anbetracht der Einfachheit dieses Ansatzes, um Protein-Protein
Wechselwirkungen zu studieren, lässt
er sich leicht auf andere Proteine anwenden. Schließlich ist unser
Ansatz schnell und hat zahlreiche Vorteile gegenüber den gegenwärtig verwendeten
Ansätzen.
-
Obwohl
die vorliegenden Erfindung hier mittels bevorzugter Ausführungsformen
beschrieben wurde, kann sie verändert
werden, ohne vom Geist und der Natur der vorliegenden Erfindung
abzuweichen.
-
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