DE60025480T2

DE60025480T2 - Methoden zur identifizierung von modulatoren wechselwirkender proteine

Info

Publication number: DE60025480T2
Application number: DE60025480T
Authority: DE
Inventors: Elias Laval GEORGES
Original assignee: McGill University
Current assignee: GEORGES, ELIAS, DR.PHIL., LAVAL, QUEBEC, CA
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2020-05-13
Also published as: WO2000070351A2; US7176035B2; AU773957B2; US20080009068A1; AU773957C; CA2372794A1; EP1179186A2; EP1179186B1; DE60025480D1; ATE315787T1; WO2000070351A3; IL146450A0; JP2002544522A; US20020142348A1; AU4739700A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Proteomics. Um genauer zu sein, bezieht sich die Erfindung auf Protein-Protein Wechselwirkungen und Verfahren zum Identifizieren modulierender Agentien von wechselwirkenden Proteinen.
Hintergrund der Erfindung
Spezifische Protein-Protein Wechselwirkungen sind kritische Ereignisse in biologischen Prozessen. Protein-Protein Wechselwirkungen steuern biologische Prozesse, die den zellulären Informationsfluss abwickeln und zelluläre Entscheidungen kontrollieren (z.B. Signalübertragung, Zellzyklus Regulation und Zusammenbau zellulärer Strukturen). Das gesamte Netzwerk der Wechselwirkungen zwischen zellulären Proteinen ist eine biologische Karte der funktionalen Ereignisse, die den internen Mechanismus der lebenden Organismen und ihre Antworten auf externe Signale regulieren. Ein notwendiger Schritt zur Vervollständigung dieser biologischen Wechselwirkungskarte ist das Wissen all der Gensequenzen in einem vorgegebenen lebenden Organismus. Die gesamte DNA Sequenz des Homo sapiens Genoms wird spätestens bis zum Jahr 2003 vollständig sein (112). Bedauerlicherweise lässt die Sequenz eines Gens weder seine biologische Funktion noch sein Position in der biologischen Karte erkennen. Angesichts der erwarteten Anzahl von Proteinen im humanen Genom (80.000 bis 120.000), wird die Kartierung der biologischen Karte der Protein-Protein Wechselwirkungen eine gewaltige, aber lohnende Aufgabe sein.
Während der vergangenen paar Jahrzehnte, sind mehrere Techniken entwickelt worden um Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu bestimmen (für eine Übersicht siehe (82)). Diese Techniken beinhalten, i) physikalische Verfahren zum Selektieren und Detektieren wechselwirkender Proteine (z.B. Protein Affinitätschromatographie, Koimmunopräzipitation, Crosslinking, und Affinitätsblotten), ii) Bibliotheksbasierte Verfahren (z.B. Phagendisplay und Zweihybrid-Systeme); und iii) genetische Verfahren (z.B. Überproduktionsphenotyp, synthetische letale Effekte und ungekoppelte Nicht-Komplementation). Von den oben erwähnten Verfahren zur Detektion von Protein-Protein Wechselwirkungen sind Zweihybrid-Systeme die bekanntesten und am intensivsten genutzten. Im klassischen Zweihybrid-System (30), hängt die Transkription von Reportergenen von einer Wechselwirkung zwischen einem DNA-gebundenen „Köder"-Protein und einer Aktivierungsdomäne, die das „Beute"-Protein enthält, ab. Die Zweihybrid- Systemen können bedauerlicherweise eine Reihe von Nachteilen haben. Zum Beispiel, wird die Wechselwirkung der Proteine eher im Kernmilieu als im Zytoplasma, in dem die meisten Proteine gefunden werden, beobachtet. Weiterhin erlaubt das Zweihybrid-System nicht die gleichzeitige Identifizierung der exakten Aminosäuresequenzen zwischen zwei wechselwirkenden Proteinen und kann nicht ohne weiteres auf verschiedene Zelltypen oder Gewebe, wobei verschiedene wechselwirkende Proteine exprimiert werden, angewendet werden.
Es ist schon in der Vergangenheit gezeigt worden, dass kleine synthetische Peptide an Proteine binden können (1, 18, 55, 102). Dennoch ist die Verwendung von synthetischen Peptiden in einem systematischen Ansatz zum Identifizieren wechselwirkender Proteindomänen und -sequenzen noch nicht vorgeschlagen oder bereitgestellt worden. Es wurde gezeigt, dass bestimmte charakteristische Domänen mit hoher Affinität an spezifische Peptidsequenzen binden (z.B. die Src Homologie-2 oder SH2 Domäne der Kinasen der Src-Familie binded fest an eine Sequenz mit phosphorliertem Tyrosin (Y*-EEI, die im Rezeptor für den Epidermalen Wachstumsfaktor und in der Fokalen Adhesions-Kinase vorhanden ist) (61).
EP 0818467A beschreibt einen regelmäßig angeordneten Peptid Array, der eine Vielzahl von Peptidsegmenten enthält, der dadurch erhalten wurde, dass die Aminosäuresequenz eines Proteins in Sequenzsegemente jeder geeigneten Länge und jedes geeigneten überlappenden Leserahmens geteilt wurden, und dass Peptide basierend auf den genannten Sequenzsegmenten synthetisiert wurden, wobei die Aminosäuresequenzen der Peptidsegmente die Aminosäuresequenz des Proteins exprimieren (119). WO 98/15833 beschreibt Verfahren zur Selektion von Peptiden, die eine bestimmte Bindungsaffinität für ein Zielprotein, wie z.B. Antikörper, besitzen. Die Bindungspeptide bzw. Proteine sind auf vermehrungsfähigen Präsentationspaketen präsentiert, vorzugsweise Phagen (120). WO 84/03564 beschreibt eine Verfahren zum Detektieren oder Bestimmen einer Aminosäuresequenz, die innerhalb einer bekannten Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Teils davon antigenetisch aktiv ist, indem Peptide mit Antikörper gegen das Protein oder einen Teil davon kontaktiert werden, wobei die Peptide eine Sequenz einer Vielzahl von Aminosäuren enthalten, wobei die Sequenz einer Sequenz mit bekannter Aminosäuresequenz entspricht, und die Peptide überlappende Aminosäuresequenzen enthalten (121).
Daher besteht auch weiterhin ein Bedürfnis ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Identifizierung erlaubt von i) den genauen Aminosäuresequenzen von wenigstem einen Bindungspartner zwischen wechselwirkenden Proteinen; ii) zahlreichen, möglicherweise allen, wechselwirkenden Proteinen in verschiedenen Zellen oder Geweben; und iii) den spezifischen Domänen (oder Sequenzen) zwischen zwei wechselwirkenden Proteinen als Zielproteine zur Isolierung von Pionier-Medikamenten. Zusätzlich bleibt ein Bedürfnis Verfahren und Assays zur Verfügung zu stellen, die die Identifizierung von genauen Aminosäuresequenzen wechselwirkender Domänen von Proteinen erlauben, die beträchtlich schneller sind als konventionelle Verfahren (z.B. Tage statt Monate).
Die vorliegende Erfindung strebt danach, dieses Bedürfnis und andere Bedürfnisse zu befriedigen.
Die vorliegende Beschreibung bezieht sich auf eine Anzahl von Dokumenten, deren Inhalt hiermit vollständig gemäß ihrem Bezug aufgenommen wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung strebt danach, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden. Genauer, es wird ein Ansatz beschrieben um Protein-Protein Wechselwirkungsdomänen zu identifizieren, der sich vom Stand der Technik unterscheidet. Darüber hinaus, basiert ein Ansatz auf dem Verständnis des Prinzips, das Protein-Protein Wechselwirkungen steuert. Daher erlaubt dieses Verständnis die Verwendung mehrerer Verfahren. Ein derartiges Verfahren, wie weiter unten veranschaulicht, identifiziert: i) wenigsten eine der genauen Aminosäuresequenzen zwischen wechselwirkenden Proteinen; ii) zahlreichen, möglicherweise alle wechselwirkende Proteine in verschiedenen Zellen oder Geweben; und iii) die spezifischen Domänen (oder Sequenzen) zwischen zwei wechselwirkenden Proteinen als Zielproteine zur Isolierung von Leit-Medikamenten. Vorzugsweise erlauben das Verfahren und der Assay der vorliegenden Erfindung die Bestimmung von i), ii) und iii). Darüber hinaus erlaubt das hier beschriebene Verfahren die Identifizierung von wechselwirkenden Proteinen und der genauen Aminosäuresequenzen von Wechselwirkungen in einigen Tagen statt einigen Monaten.
Die Fähigkeit Proteine (oder anderer Moleküle) zu selektieren, die Wechselwirkungen zwischen einem Genprodukt und einigen Partnern aber nicht anderen zu blockieren, sollte eine ausgeklüngelte Modulation der zellulären Nachrichtenübermittlung oder des Zellmetabolismus in menschlichen Zellen oder anderen gegenwärtig schwer zugänglich Systemen erlauben. Tatsächlich ist die Identifikation von Proteinen, die mit therapeutisch wichtigen Proteinen wechselwirken und die Identifikation von Orten dieser Wechselwirkung möglicherweise wichtiger für die Entwicklung von Medikamenten als andere genetische Ansätze wie „Knock-outs" (71). Letzterer widmet sich den phenotypischen Konsequenzen des Disruptierens aller Wechselwirkungen, an denen ein bestimmtes Protein teilnimmt im Gegensatz zur Inhibierung der Wechselwirkung eines Proteins (schlimmstenfalls einiger weniger Proteine statt aller) in einem Multimerkomplex.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf einen neuen Ansatz zur Aufdeckung von Medikamenten. Ein wesentliches Hindernis in der Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten ist die Identifikation von Zielproteinen und ihrer funktionellen Stellen gewesen. Tatsächlich benötigen die meisten Forschungs- und Entwicklungsprojekte (F&E) in Pharmaunternehmen mehrere Jahre um ein wirkliches Zielprotein zu identifizieren. Die Selektion der Wirkstoffe, die binden und die Funktionen dieser Proteine inhibieren, beansprucht mehrere Jahre und ist im Allgemeinen unspezifisch und zufällig. Weiterhin sind die Wirkstoffe, die durch die gegenwärtigen Ansätze identifiziert werden, oft auf die aktiven Stellen in Proteinen gerichtet. Daher führen solche Wirkstoffe oft zu großen Nebeneffekten. Daher ist es nicht überraschend, dass viele F&E Projekte niemals zur Entwicklung von spezifischen Wirkstoffen führte, sogar nach drei bis fünf Jahren intensiver Forschungsbemühungen. Die Verfahren und Assays zur Identifizierung von Protein-Protein Wechselwirkungen könnten sich drei wichtigen Schritten in der Wirkstoff Entwicklung widmen:

1) die Identifizierung von Aminosäuresequenzen aller wechselwirkender Domänen in Zielproteinen;
2) die Identifizierung eines Satzes wechselwirkender Proteine (vorzugsweise aller wechselwirkender Proteine) zur Wirkstoffentwicklung; und
3) Durchmustern nach spezifischen Wirkstoffen gegen jede der wechselwirkenden Domänen in einem Zielprotein.

Es wurde gezeigt, dass P-Glykoprotein (P-gp) Multimedikamenten-Resistenz in Tumorzelllinien verursacht, die mit lipophilen Antikrebs-Wirkstoffen selektiert wurden. Untersuchung der P-gp Aminosäuresequenz führte zu einem Vorschlag für ein Modell mit einem duplizierten Molekül mit zwei hydrophoben und hydrophilen Domänen, die durch eine stark geladene Region von 90 Aminosäuren verbunden sind, der Verbindungsdomäne. Obwohl ähnlich geladene Domänen bei anderen Mitgliedern der P-gp Superfamilie gefunden werden, ist (sind) die Funktion(en) dieser Domäne nicht bekannt. Hier wird durch die Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass diese Domäne an andere zelluläre Proteine bindet. Durch die Verwendung überlappender Hexapeptide, die die gesamten Aminosäuresequenzen der Verbindungsdomäne der humanen P-Glykoprotein Gene 1 und 3 (HP-gp1 und HP-gp3) umspannen, wird hier ein direkte und spezifische Bindung zwischen HP-gp1 und 3 Verbindungsdomänen und intrazellulären Proteinen gezeigt. Drei verschiedene Abschnitte (⁶¹⁷EKGIYFKLVTM⁶²⁷, ⁶⁵⁸SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA⁶⁷⁷ und ⁶⁹⁴PVSFERIMKLNLT⁷⁰⁶) für HP-gp1 und ⁶¹⁸LMKKEGVYFKLVNM⁶³¹, ⁶⁴⁸KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS⁶⁷⁴ und ⁶⁹⁵PVSFLKVLKLNKT⁶⁷⁷ für HP-gp3) in Verbindungsdomänen banden spezifisch an Proteine mit apparenten Molekularmassen von ~80 kDa, 57 kDa und 30 kDa. Interessanterweise wurde nur das 57 kDa Protein, in unterschiedlichem Maße, an die drei verschiedenen Sequenzen in der Verbindungsdomäne gebunden. Darüber hinaus war die Bindung zwischen den überlappenden Peptiden, die für die Verbindungssequenz kodierten, und dem 57 kDa Protein resistent gegenüber dem zwitterionischem Detergenz, CHAPS, aber sensitiv gegenüber SDS. Aufreinigung und partielle N-terminale Aminosäurensequenzierung des 57 kDa Proteins zeigte, dass es für die N-terminalen Aminosäuren des Alpha- und Beta-Tubulins kodiert. Weiterhin bestätigten Western Blot Untersuchungen unter der Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die an α- und β-Tubulin binden, die Identität des 57 kDa Proteins. Zusammen genommen ist dies das erste Beispiel, das Protein Wechselwirkungen mit der P-gp Verbindungsdomäne belegt. Diese könnte natürlich für die Gesamtfunktion von P-gp wichtig sein. Noch wichtiger, die Ergebnisse in dieser Studie beweisen das neue Konzept, nach dem die Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen von einem Strang weniger Aminosäuren mit hohen und abstoßenden Bindungsenergien vermittelt werden.
Es wird ein Verfahren zur Identifizierung von Hochaffinitätsbindungsdomänen in einem gewähltem Protein, einer Domäne davon, oder eines Teils davon, und der Aminosäuresequenz davon bereitgestellt, welches umfasst: a) zur Verfügung stellen eines Satzes überlappender Peptide, die eine vollständige Sequenz des gewählten Proteins, einer Domäne davon, oder eines Teils davon umfassen und die kovalent an einen Träger gebunden sind; b) zur Verfügung stellen einer Mischung von Proteinen und/oder einer Mischung von Peptiden; c) inkubieren des Satzes der überlappenden Peptide aus a) mit der Mischung aus b) unter Bedingungen, die es ermöglichen, dass sich Bindung zwischen den Hochaffinitätsbindungsdomänen aus einem Peptid des Satzes und einem oder mehreren Proteinen oder Peptiden aus b) ereignet; d) abwaschen jeglicher Protein-Protein Wechselwirkung, die nicht eine Hochaffinitäts-Wechselwirkung wie in c) ist; und e) identifizieren, welches Peptid aus a) mit hoher Affinität mit einem Protein oder Peptid aus b) wechselwirkt, dadurch die Peptide aus e) und deren Sequenzen als Hochaffinitätsbindungsdomänen identifizieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereit gestellt zur Identifizierung eines Agens, das die Wechselwirkung zwischen einer Hochaffinitätsbindungsdomäne und einem Satz überlappender Peptide, die eine vollständige Sequenz des gewählten Proteins, einer Domäne davon, oder eines Teils davon umfassen die kovalent an eine Träger gebunden sind und eine Mischung von Protein, wobei diese Mischung von Proteinen eine Mischung zellulärer Proteine ist. Dieses Verfahren umfasst:: a) inkubieren des Satzes der überlappenden Peptide mit der Mischung in Gegenwart mindestens eines Agens unter Bedingungen, die es ermöglichen, dass sich die Bindung zwischen den Hochaffinitätsbindungsdomänen aus einem Peptid des Satzes und einem oder mehreren Proteinen oder Peptiden der Mischung ereignet; b) abwaschen jeglicher Protein-Protein Wechselwirkung, die nicht eine Hochaffinitäts-Wechselwirkung wie in b) ist; und c) identifizieren, welches Peptid aus a) mit hoher Affinität mit einem Protein oder Peptid der Mischung in Gegenwart des Agens wechselwirkt verglichen zu der Situation, wenn das Agens abwesend ist; dadurch identifizieren des Agens als Modulator der Hochaffinitätswechselwirkung, wenn die Wechselwirkung in der Gegenwart des Agens messbar verschieden ist von der Situation, wenn das Agens abwesend ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden bereitgestellt Agentien, die identifiziert wurden als Modulatoren der Hochaffinitätswechselwirkungen der vorliegenden Erfindung.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung, werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe nachstehend definiert.
Definitionen
Der Begriff „überlappende Peptide, die eine Peptidsequenz umspannen" (z.B. eine Domäne, eine Volllängenproteinsequenz oder ein Teil davon) oder ähnliche bezieht sich auf Peptide einer gewählten Größe, die auf der Sequenz des Proteins (oder Teils davon) basieren. Vorzugsweise sind diese Peptide synthetische Peptide.
Wie hier nachstehend erklärt wird, hat die Größe des überlappenden Peptids einen signifikanten Einfluss auf das Funktionieren der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel, scheinen Peptide aus vier zusammenhängenden Aminosäuren die Bindung mit niedriger Affinität an Proteine signifikant zu steigern. Darüber hinaus würde erwartet werden, dass die Verwendung von größeren Peptiden, wie 20 Aminosäuren oder größer, den Anteil der abstoßenden Aminosäuren gegenüber den der Aminosäuren mit hoher Affinität erhöht, und dadurch die Bindung der spezifischen Proteine an die Peptide maskiert oder vollkommen inhibiert. Während daher der Fachmann verstehen würde, dass es einen Zielkonflikt gibt, der mit der Wahl von kleinen Peptiden gegenüber größeren Peptiden einhergeht, beträgt die bevorzugte Größe für die überlappenden Peptide der vorliegenden Erfindungen zwischen 5 und 15 Aminosäuren, noch bevorzugter zwischen 5 und 12, und besonders bevorzugt zwischen 5 und 10 Aminosäuren.
Der Begriff „Träger" im Kontext eines Trägers, an den die überlappenden Peptide der vorliegenden Erfindung kovalent gebunden sind, kann von einer Vielzahl von Trägern ausgewählt werden, die in der Technik bekannt sind. Zu diesen Trägern gehören CHIPS, Platten (z.B. 96 Knocken Platten), Glassperlen und ähnliche. Die CHIP Technologie ist in der Technik wohl bekannt. (10, 19, 24, 26, 85, 97).
Die Proteinsequenzen werden, wie sie in der Technik gewöhnlich und in Einklang mit den Empfehlungen der IUPAC-IUB Biochemischen Nomenklatur Kommission, hier dargestellt unter Verwendung der Ein Buchstaben oder der Drei Buchstaben Aminosäurensymbole.
Sofern nicht anders definiert, besitzen die wissenschaftlichen und technologischen Begriffe und die hier verwendete Nomenklatur die gleiche Bedeutung, wie sie vom durchschnittlichen Fachmann, den die Erfindung betrifft, gewöhnlicherweise verstanden wird. Im Allgemeinen, sind die Verfahren für Zellkulturen, Infektion, Molekularbiologie Verfahren und ähnliche die gewöhnlichen in der Technik verwendeten Verfahren. Diese Standart Techniken sind in den Handbüchern beschrieben (4, 96).
Die vorliegende Beschreibung bezieht sich hauptsächlich auf Proteine gemäß den technologischen Begriffen der rekombinanten DNA (rDNA). Ausgewählte Beispiele werden zur Klarheit und Konsistenz bereit gestellt.
Wie hier verwendet, bedeutet „Nukleinsäure Molekül" ein Polymer von Nukleotiden. Nicht einschränkende Beispiele davon beinhalten DNA (z.B. genomische DNA, cDNA) und RNA Moleküle (z.B. mRNA). Das Nukleinsäure Molekül kann durch Klonierungs-Techniken erhalten oder synthetisiert werden. DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein (kodierender Strang oder nicht-kodierender Strang [antisense]).
Der Begriff „rekombinante DNA", wie in der Technik bekannt, bezieht sich auf ein DNA Molekül, das sich aus dem Aneinanderfügen von DNA Segmenten ergibt. Dies wird häufig als Gentechnik bezeichnet.
Der Begriff „DNA-Segment", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein DNA Molekül, das eine lineare Folge oder Sequenz von Nukleotiden umfasst. Diese Sequenz, wenn sie gemäß dem genetischen Code gelesen wird, kann für eine lineare Folge oder Sequenz von Aminosäuren kodieren, die als Polypeptid, Protein, Proteinfragment und ähnliches bezeichnet werden.
Der Ausdruck „Amplifikations Paar" bezieht sich hier auf ein Paar Oligonukleotide (Oligos) der vorliegenden Erfindung, die ausgewählt wurden bei der Amplifikation einer bestimmten Nukleinsäuresequenz zusammen verwendet zu werden. Die Amplifation kann durch eine von einer Vielzahl von Typen von Amplifikations Verfahren, vorzugsweise Polymerase Kettenreaktion, erfolgen. Andere Arten von Amplikationsverfahren beinhalten Ligase Kettenreaktion, Strangverdrängungsamplifikation, oder Nukleinsäuresequenz basierte Amplifikation, wie detaillierter unter erklärt wird. Wie aus der Technik gewöhnlich bekannt, sind die Oligos so gestaltet, dass sie an ein komplementäre Sequenz unter ausgewählten Bedingungen binden können.
Die Nukleinsäure (z.B. DNA oder RNA) zum Ausüben der vorliegenden Erfindung kann gemäß wohl bekannter Verfahren erhalten werden.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „physiologisch relevant" Wechselwirkungen beschreiben, die die Wirkung haben können, die Aktivität oder die Menge von einem oder mehreren Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung zu modulieren.
Der Begriff „DNA" Molekül oder Sequenz (ebenso wie manchmal der Begriff „Oligonukleotid" bezieht sich, wie hier definiert, auf ein Molekül umfassend die Deoxyribonukleotide Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und/oder Cytosin (C), in einer doppelsträngigen Form, und welches ein „regulatorisches Element" gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst oder enthält. Der Begriff „Oligonukleotid" oder „DNA" erscheint in linearen DNA Molekülen oder Fragmenten, Viren, Plasmiden, Vektoren, Chromosomen oder synthetisch gewonnenen DNA. Wie hier verwendet, können bestimmte doppelsträngige DNA Sequenzen gemäß der normalen Konvention beschrieben werden, nach der die Sequenz nur in 5' zu 3' Richtung angegeben wird.
„Nukleinsäure Hybridisierung" bezieht sich im Allgemeinen auf die Hybridisierung zweier einzelsträngiger Nukleinsäure Moleküle mit komplementären Basensequenzen, die unter geeigneten Bedingungen eine thermodynamisch begünstigte doppelsträngige Struktur bilden. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen können in den zwei oben genannten Laborhandbüchern (4, 96) gefunden werden und sind gemeinhin aus der Technik bekannt. Für den Fall der Hybridisierung an einen Nitrozellulose Filter, wie zum Beispiel in demr wohl bekannten Southern Blot Verfahren, kann ein Nitrozellulose Filter über Nacht bei 65°C mit einer markierten Sonde in einer Lösung enthaltend 50% Formamid, Hoch-Salz (5 × SSC oder 5 × SSPE), 5 × Denhardt's Lösung, 1% SDS, und 100 μg/ml denaturierte Träger DNA (z.B. Lachsspermium DNA) inkubiert werden. Die nichtspezifische bindende Sonde kann dann vom Filter durch mehrere Waschgänge in 0.2 × SSC/0.1% SDS bei einer Temperatur, die im Hinblick auf die gewünschte Stringenz ausgewählt wurde, abgewaschen werden: Raumtemperatur (niedrige Stringenz), 42°C (mittlere Stringenz) oder 65°C (hohe Stringenz). Die gewählte Temperatur basiert auf dem Schmelzpunkt (F.) des DNA Hybrids. Natürlich können auch RNA-DNA Hybride gebildet und detektiert werden. In diesen Fällen können die Hybridisierungs- und Waschbedingungen gemäß den wohl bekannten Verfahren durch einen durchschnittlichen Fachmann angepasst werden. Stringente Bedingungen werden vorzugsweise benutzt (96).
Sonden mit natürlich vorkommenden Zucker-Phosphat Rückraten sowie modifizierte Rückrate enthaltend Phosphorothioate, Dithionate, Alkylphosphonate und α-Nukleotide und ähnliche können für Nukleinsäuren zu Anwendung kommen. Modifizierte Zucker-Phosphat Rückrate sind allgemein bekannt (73, 75). Erfindungsgemäße Sonden können entweder aus Ribonukleinsäure (RNA) oder Deoxyribonukleinsäure (DNA), und vorzugsweise aus DNA hergestellt sein.
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass die Detektierung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und/oder Peptiden von einer Markierung abhängig sind. Diese Markierungen stellen Sensitivität bereit und ermöglichen häufig die Automatisierung. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Automatisierung unter Verwendung der CHIP Technologie durchgeführt. Zum Beispiel sind die überlappenden Peptide, die eine gewählte Sequenz eines Proteins umspannen, an ein CHIP gebunden, das dann verwendet werden kann, um einen Test auf Wechselwirkung mit Proteinen oder Peptiden zu automatisieren. Natürlich versteht sich, dass die vorliegenden Erfindung nicht unmittelbar von der Gestaltung und der Synthese eines überlappenden Satzes Peptide, die eine gewählte Proteinsequenz umspannt, abhängt. Tatsächlich sind Peptidbanken verfügbar, aus denen dieser Satz überlappender Peptide hergestellt werden könnte.
Protein Markierung ist in der Technik wohl bekannt. Ein nicht einschränkendes Beispiel für Markierungen beinhaltet ³H, ¹⁴C, ³²P, und ³⁵S. Nicht einschränkende Beispiele für detektierbare Markierungen beinhalten Liganden, Fluorophore, Chemilumineszens Agentien, Enzyme, und Antikörper. Es wird sich dem durchschnittlichen Fachmann erschließen, dass die Wahl einer bestimmten Markierung die Weise bestimmt, in der sie an das Protein gebunden ist.
Die Identifizierung der Wechselwirkung ist nicht spezifisch von der Markierung des Proteins abhängig, da zum Beispiel diese Wechselwirkung durch die Verwendung von Proteomics Ansätzen (wie 2-D Gelen und Massen Spektrometrie) oder durch die Verwendung einer Antikörper Bibliothek bestimmte werden könnte.
Wie gemeinhin bekannt können radioaktive Aminosäuren in erfindungsgemäße Peptide oder Proteine durch mehrere wohl bekannte Verfahren eingebaut werden. Ein nicht einschränkendes Beispiel dafür ist die in vitro oder in vivo Markierung von Proteinen mit ³⁵SMet.
Der Begriff „Vektor" ist gemeinhin in der Technik bekannt und definiert eine Plasmid DNA, Phagen DNA, virale DNA, und ähnliche, die als DNA Träger dienen kann, in den erfindungsgemäße DNA kloniert werden kann. Zahlreiche Typen an Vektoren existieren und sind in der Technik wohl bekannt.
Der Begriff „Expression" definiert einen Vorgang, durch den ein Gen in mRNA transkribiert wird (Transkription), die mRNA dann in ein Polypeptid (oder Protein) oder mehr translatiert wird (Translation).
Der Begriff „Expressionsvektor" definiert einen Vektor oder einen wie oben beschriebenen Träger, aber derart gestaltet, dass er die Expression einer eingefügten Sequenz nach Transformation in einen Wirt ermöglicht. Das klonierte Gen (die eingefügte Sequenz) wird gewöhnlich unter die Kontrolle von Kontroll-Element-Sequenzen wie Promoter Sequenzen gestellt. Das Stellen eines geklonten Gens unter derartige Kontrollsequenzen wird häufig als funktionale Verknüpfung mit den Kontrollelementen oder -sequenzen bezeichnet.
Funktional verknüpfte Sequenzen können auch zwei Segmente beinhalten, die in dasselbe RNA Transkript transkribiert werden. Daher sind zwei Sequenzen, wie ein Promoter und eine „Reporter Sequenz", funktional verknüpft, wenn die Einleitung der Transkription am Promoter ein RNA Transkript der Reporter Sequenz erzeugt. Um „funktional verknüpft" zu sein ist es nicht notwendig, dass zwei Sequenzen unmittelbar neben einander liegen.
Expressionskontrollsequenzen werden abhängig davon, ob der Vektor entworfen wurde um das funktional verknüpfte Gen in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt oder beiden (Pendel Vektor), variieren, und können zusätzlich transkriptionale Elemente wie Verstärker Elemente, Beendigungssequenzen, gewebsspezifische Elemente, und/oder translationale Start- und Beendigungsstellen enthalten.
Prokaryotische Expressionen sind nützlich für die Erstellung großer Mengen des Proteins, das von der interessierenden DNA Sequenz kodiert wird. Dieses Protein kann gemäß den Standart Protokollen aufgereinigt werden, die Nutzen ziehen aus den intrinsischen Eigenschaften des Proteins, wie Größe und Ladung (z.B. SDS Gelelektrophorese, Gelfiltration, Zentrifugation, Ionen Austauscher Chromatographie, usw.). Zusätzlich kann das interessierende Protein über Affinitätschromatographie unter der Verwendung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper aufgereinigt werden. Das aufgereinigte Protein kann für therapeutische Anwendungen verwendet werden.
Das DNA Konstrukt kann ein Vektor sein enthaltend einen Promoter, der funktional mit einer erfindungsgemäßen Oligonukleotidsequenz verknüpft ist, der wiederum funktional mit einem heterologen Gen verknüpft ist, wie dem Gen für das Luziferase Reporter Molekül. „Promoter" bezieht sich auf eine DNA regulatorische Region, die fähig ist, direkt oder indirekt an RNA Polymerase in einer Zelle zu binden, und Transkription einer stromabwärts kodierenden Sequenz (3' Richtung) zu initiieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, ist der Promoter an seinem 3' Ende durch eine Transkriptions-Initierungsstelle begrenzt und dehnt sich stromaufwärts (5' Richtung) so aus, dass er die Minimal Anzahl an Basen oder Elementen enthält, die notwendig sind die Transkription in Mengen zu detektieren, die über dem Hintergrund liegen. Innerhalb des Promoters findet sich die Transkriptions-Initierungsstelle (bequem über Kartierung mit S1 Nuklease definiert) als auch Proteinbindedomänen (Consensus Sequenzen), die verantwortlich sind für die Bindung der RNA Polymerase. Eukaryotische Promotoren enthalten häufig, aber nicht immer, „TATA" Boxen und „CCAT" Boxen. Prokaryotische Promotoren enthalten Shine-Dalgarno Sequenzen zusätzlich zu den –10 und –35 Consensus Sequenzen.
Wie hier verwendet, bezeichnet die Angabe „funktionales Derivat", im Kontext eines funktionellen Derivats einer Sequenz, sei es einer Nukleinsäuren- oder Aminosäurensequenz, ein Molekül, das eine (entweder funktionale oder strukturelle) biologische Aktivität beibehält, die im wesentlichen ähnlich zu der der originalen Sequenz ist. Dieses funktionale Derivat oder Äquivalent kann ein natürliches Derivat sein oder synthetisch hergestellt werden. Solche Derivative enthalten Aminosäuresequenzen, die Austäusche, Deletionen, oder Hinzufügungen von einer oder mehreren Aminosäuren besitzen, vorausgesetzt dass die biologische Aktivität des Proteins beibehalten wird. Das gleiche trifft auf Derivate von Nukleinsäuresequenzen zu, die Austäusche, Deletionen, oder Hinzufügungen von einem oder mehreren Nukleotiden besitzen, vorausgesetzt dass die biologische Aktivität der Sequenz größtenteils beibehalten wird. Bezogen auf eine Proteinsequenz, besitzt die Austausch-Aminosäure chemo-physikalische Eigenschaften, die der ausgetauschten Aminosäure ähnlich sind. Die ähnlichen chemo-physikalischen Eigenschaften beinhalten, Ähnlichkeiten in der Ladung, Sperrigkeit, Hydrophobizität, Hydrophilität und ähnliche. Der Begriff „funktionale Derivate" soll beinhalten Fragmente, Segmente, Varianten, Analoga oder chemische Derivate des Gegenstandes der vorliegenden Erfindung.
Wie aus dem Stand der Technik wohl bekannt ist, bezieht sich ein(e) „konservative(r) Mutation oder Austausch" auf eine Mutation oder einen Austausch, der beibehält: 1) die Struktur des Rückrats des Polypeptids (z.B. eine Beta Faltblatt oder alpha-helikalische Struktur); 2) die Ladung oder Hydrophobizität der Aminosäure; oder 3) die Sperrigkeit der Seitenkette. Um genauer zu sein, beziehen sich die wohl bekannten Begriffe „hydrophiler Rest" auf Serin oder Threonin. „Hydrophobe Reste" beziehen sich auf Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Valin oder Alanin. „Positive geladene Reste" beziehen sich auf Lysin, Arginin oder Histidin. „Negative geladene Reste" beziehen sich auf Asparaginsäure oder Glutamisäure. Reste mit „sperrigen Seitenketten" beziehen sich auf Phenylalanin, Tryptophan oder Tyrosin.
Peptide, Protein Fragmente, und ähnliche können erfindungsgemäß und gemäß den wohl bekannten Verfahren abhängig oder unabhängig von ihrer Sequenz modifiziert werden. Zum Beispiel können aus den Wildtyp Sequenzen, die in den Abbildungen beispielhaft erläutert sind, unter Verwendung von konservativen Aminosäurenaustauschen an 1, 2, 3 oder mehr Postionen Peptide abgeleitet werden. Der Begriff „konservative Aminosäureaustausche", der sich auf einen Austausch einer bestimmten Aminosäure durch eine mit ähnlichen Eigenschaften (z.B. Asparaginsäure für Glutaminsäure, oder Isoleucin für Leucin) bezieht, ist in der Technik wohl bekannt. Natürlich können nicht-konservative Aminosäureaustausche ausgeführt werden, wie auch andere Arten an Modifikationen wie Deletionen oder Einfügungen, vorausgesetzt dass diese Modifikationen Peptide in einer geeigneten Weise modifizieren (z.B. ohne die biologische Aktivität der Peptide zu beeinflussen, wenn dies durch die Modifikation beabsichtigt ist). Eine Liste von beispielhaften konservativen Aminosäureaustäuschen wird nachfolgend zur Verfügung gestellt.
Tabelle 2 Konservative Aminosäure Ersetzungen
Wie aus der Tabelle ersichtlich, können einige der Modifikationen benutzt werden, um die Peptide gegen Proteolyse resistenter zu machen. Natürlich können Modifikationen der Peptide auch bewirkt werden, ohne in deren Primärsequenz einzugreifen, indem enzymatische oder chemische in der Technik bekannte Verfahren angewendet werden.
Der Begriff „Variante" bezieht sich hier auf ein Protein oder ein Nukleinsäuremolekül, das in Struktur und biologischer Aktivität dem erfindungsgemäßen Protein oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure im Wesentlichen ähnlich ist.
Die erfindungsgemäßen funktionalen Derivate können chemisch synthetisiert oder durch rekombinante DNA Technologie unter Verwendung von in der Technik wohl bekannten Verfahren hergestellt werden. In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine erfindungsgemäße Variante unter Verwendung von erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert werden. Sie kann auch entworfen werden, um formell die Konservierung bestimmter Aminosäuren zu überprüfen (z.B. durch das Synthetisieren einer Variante oder eines mutierten Peptids). Diese Varianten können auch als Teil einer Volllängensequenz des Proteins getestet werden, um die Wechselwirkung zu validieren. Natürlich wird der Fachmann verstehen, dass die Identifikation einer Region eines gewählten Proteins als einer Region, die an Hochaffinitätsprotein-Wechselwirkungen) beteiligt ist, die in vitro Mutagenese (oder eine Testung von verwandten Peptidsequenzen) dieser Region ermöglicht, um die Struktur/Funktionsbeziehung dieser Region zu identifizieren und analysieren. Solche Verfahren sind in der Technik wohl bekannt. Wenn die Wechselwirkungsdomäne zweier Proteine identifiziert wurde, ist es daher für den Fachmann möglich Varianten zu identifizieren und/oder zu entwerfen, die eine modifizierte Affinität für ein wechselwirkendes Protein besitzen. Wenn natürlich beide wechselwirkenden Sequenzen bekannt sind, können sehr mächtige Fragen gestellt werden, um die Struktur-Funktions Beziehung zu analysieren, die die Hochaffinitäts-Wechselwirkung zwischen diesen Sequenzen leiten.
Wie hier verwendet, sollen „chemische Derivative" zusätzliche chemische Einheiten umfassen, die nicht normalerweise Teil des Gegenstands der Erfindung sind. Solche Einheiten könnten die physiko-chemische Charakteristik der Derivative betreffen (z.B. Solubilität, Absorption, Halbwertszeit und ähnliche, Abnahme der Toxizität).
Derartige Einheiten werden in „Remington's Pharmazeutic Sciences" (88) exemplarisch vorgestellt. Verfahren zur Kopplung dieser chemo-physikalischen Einheiten an ein Polypeptid sind in der Technik wohl bekannt.
Der Begriff „Allel" definiert eine alternative Form eines Gens, die einen vorgegebenen Lokus auf einem Chromosom innehat.
Wie gemeinhin bekannt, ist eine „Mutation" eine nachweisbare Änderung im genetischen Material, die an eine Tochterzelle weitergegeben werden kann. Wie wohl bekannt ist, kann eine Mutation zum Beispiel eine nachweisbare Änderung in einer oder mehreren Deoxyribonukleotiden sein. Zum Bespiel können Nukleotide hinzugefügt, deletiert, ersetzt, invertiert, oder an eine neue Position versetzt weiden. Spontane Mutationen und experimentell induzierte Mutationen existieren. Das Ergebnis einer Mutation eines Nukleinsäuremoleküls ist ein mutiertes Nukleinsäuremolekül. Ein mutiertes Polypeptide kann durch mutiertes Nukleinsäuremolekül kodiert werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „aufgereinigt" auf ein Molekül, dass von einem zellulären Bestandteil getrennt wurde. Daher ist ein „aufgereinigtes Protein" in einem Maße aufgereinigt, wie es in der Natur nicht vorkommt. Ein „im wesentlichen reines" Molekül ist ein Molekül, dem die meisten anderen zellulären Bestandteile fehlen.
Wie hier verwendet, werden die Begriffe „Molekül", „Verbindung" oder „Ligand" austauschbar verwendet und beziehen sich grob gesagt auf natürliche, synthetische oder semisynthetische Moleküle oder Verbindungen. Der Begriff „Molekül" bezeichnet daher zum Beispiel Chemikalien, Makromoleküle, Zell- oder Gewebeextrakte (von Pflanzen und Tieren) und ähnliche. Nicht einschränkende Beispiele für Moleküle beinhalten Nukleinsäuremoleküle, Peptide, Antikörper, Kohlenhydrate und pharmazeutische Agentien. Die Agentien können durch verschiedene Mittel ausgewählt und durchmustert werden, welche beinhalten Zufallsdurchmusterung, rationale Auswahl und rationalen Entwurf unter der Verwendung von beispielsweise Protein und Liganden Modellierungsverfahren wie Computer-Modellierung, kombinatorische Bibliotheksdurchmusterung und ähnliche. Die Begriffe „rational ausgewählt" oder „rational entworfen" sollen Verbindungen definieren, die ausgewählt wurden basierend auf der Konfiguration der Wechselwirkungsdomänen der vorliegenden Erfindung. Wie der durchschnittliche Fachmann verstehen wird, sind Makromoleküle mit nicht-natürlich vorkommenden Modifikationen auch vom Begriff „Molekül" umfasst.
Zum Beispiel „Peptidomimetics", die in der pharmazeutischen Industrie wohl bekannt sind und die für gewöhnlich als Peptidanaloga bezeichnet werden, können, wie oben erwähnt, durch Modellierung erzeugt werden. Gleichermaßen werden in einer bevorzugten Ausführungsform die erfindungsgemäßen Polypeptide modifiziert, um ihre Stabilität zu erhöhen. Es versteht sich, dass in den meisten Fällen die Modifikation nicht die biologische Aktivität der wechselwirkenden Domäne ändern sollte. Die gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung identifizierten Moleküle sind bei Krankheiten und bei Umständen von therapeutischen Wert, bei denen die Physiologie oder die Homeostase der Zelle und/oder des Gewebes durch eine erfindungsgemäß identifizierte Hochaffinitätswechselwirkung beeinträchtigt wird. Alternativ finden die gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung identifizierten Moleküle Anwendung bei der Entwicklung von effizienteren Agentien, die derartige Wechselwirkungen modulieren können.
Bibliotheken von Verbindungen (öffentliche oder kommerziell verfügbar, z.B. eine kombinatorische Bibliothek) sind in der Technik wohl bekannt. Bibliotheken von Peptiden sind ebenfalls verfügbar. Derartige Bibliotheken können verwendet werden, um einen überlappenden Satz an Peptidsequenzen zu erstellen, die eine ausgewählte Domäne, ein ausgewähltes Protein oder einen Teil davon, umspannen.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Indikatorzellen" auf Zellen, die wechselwirkende Peptiddomänen exprimieren, und wobei die Wechselwirkung zwischen diesen Protein oder deren wechselwirkenden Domänen mit einem identifizierbaren und selektierbaren Phänotyp oder Eigenschaft in der Weise gekoppelt ist, dass eine Bewertung oder Bestätigung dieser Wechselwirkung zwischen denselben möglich ist. Solche Indikatorzellen können auch in den Durchmusterungsassays der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen wurden die Indikatorzellen so konstruiert, dass sie das gewählte Derivat, Fragment, Homolog oder Mutante dieser wechselwirkenden Domäne exprimieren. Die Zellen können Hefezellen oder höhere eukaryotische Zellen, wie Säugerzellen sein (WO 96/41169). In einer bestimmten Ausführungsform, ist die Indikatorzelle eine Hefezelle, die Vektoren enthält, die die Verwendung der Zweihybrid-Technologie ermöglicht, die in der Technik ebenfalls bekannt ist (4) und verwendet werden kann, eine Verbindung oder eine Bibliothek davon zu testen.
In einer Ausführungsform kann ein Reportergen, das für einen selektierbaren Marker oder ein bestimmbares Protein kodiert, funktional so mit einem Kontrollelement gekoppelt werden, dass die Expression des selektierbaren Markers oder bestimmbaren Proteins abhängig ist von der Wechselwirkung der Wechselwirkungsdomänen von Protein A und B. Eine derartige Indikatorzelle könnte verwendet werden um rasch bei einem hohen Durchsatz einen großen Array von Testmolekülen zu durchmustern. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reportergen Luziferase oder β-Gal.
In einer Ausführungsform kann mindestens eines) der zwei wechselwirkende Proteine oder wechselwirkenden Domänen der vorliegenden Erfindung als Fusionsprotein zur Verfügung gestellt werden. Das Design von Konstrukten dafür und die Expression und Produktion von Fusionsproteinen sind in der Technik wohl bekannt (4, 96). In einer bevorzugten Ausführungsform sind beide Wechselwirkungsdomänen Teil von Fusionsproteinen. Ein nicht einschränkendes Beispiel solcher Fusionsproteine umfassend eine LexA-Protein A Fusion (DNA bindende Domäne Protein A; Köder) und eine B42-Protein B Fusion (Transaktivatordomäne-Protein B; Beute). In einer weiteren anderen bevorzugten Ausführungsform werden das LexA-Protein A und B42-Protein B Fusionsprotein in einer Hefezelle exprimiert, die auch ein Reportergen besitzt, das funktional mit einem LexA Operator und/oder LexA Responsive Element verknüpft ist. Natürlich ist klar, dass andere Fusionsproteine in derartigen Zweihybrid-Systemen verwendet werden können. Weiterhin ist klar, dass die Fusionsproteine keine Volllängen Wechselwirkungsproteine beinhalten brauchen. Tatsächlich können Fragmente dieser Polypeptide, wenn sie Wechselwirkungsdomänen umfassen, gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie durch das Peptide umspannende Verfahren der vorliegenden Erfindung belegt ist.
Nicht einschränkende Beispiele derartiger Fusionsproteine beinhalten Hemaglutinin-Fusionen, Gluthion-S-Transferase (GST) Fusionen und Maltose bindendes Protein (MBP)Fusionen. In bestimmten Ausführungsformen kann es von Vorteil sein eine Protease Spaltungsstelle zwischen zwei Polypeptidsequenzen, die fusioniert wurden, einzuführen. Derartige Protease Spaltungsstellen zwischen zwei heterologen fusionierten Polypeptiden sind in der Technik wohl bekannt.
In bestimmten Ausführungsformen kann es auch vorteilhaft sein die erfindungsgemäßen Wechelwirkungsdomänen mit Signalpeptidsequenzen zu verbinden, was eine Sekretion des Fusionsproteins aus der Wirtszelle ermöglicht. Die Signalpeptide diverser Organismen sind in der Technik wohl bekannt. Bakterielles OmpA und Hefe Suc2 sind zwei nicht einschränkende Beispiele von Proteinen, die Signalsequenzen beinhalten. In bestimmten Ausführungsformen, kann es vorteilhaft sein einen Linker (wie allgemein bekannt) zwischen die Wechselwirkungsdomäne und den heterologen Polypeptidanteil einzuführen. Solche Fusionsproteine finden in den erfindungsgemäßen Assays so wie für Aufreinigungszwecke, Detektionszwecke und ähnliches Anwendung.
Mit Sicherheit beinhalten die Sequenzen und Polypeptide, die nützlich sind, um die Erfindung auszuführen, ohne sich auf diese einschränken zu wollen, Mutanten, Homologe, Subtypen, Allele und ähnliches. Es versteht sich, dass im Allgemeinen die Sequenzen der vorliegenden Erfindung für eine funktionale (wenn auch defekte) Wechselwirkungsdomäne kodieren. Für den durchschnittlichen Fachmann wird es klar sein, dass, ob eine Wechselwirkungsdomäne, eine Variante, ein Derivat, oder ein Fragment der vorliegenden Erfindung davon ihre/seine Funktion bei der Bindung an ihre/seinen Partner beibehält, durch Verwendung der Lehre und der Assays der vorliegenden Erfindung und durch Verwendung der allgemein aus dem Stand der Technik bekannten Lehre bestimmt werden kann.
Wie hier beispielhaft gezeigt, können die erfindungsgemäßen Interaktionsdomänen modifiziert werden, zum Beispiel durch in vitro Mutagenese, um die Struktur-Funktions Beziehung davon zu analysieren und ein besseres Design und die Identifikation der modulierenden Verbindungen zu ermöglichen. Obgleich einige Derivate oder Analoge ihre biologische Funktion des Wechselwirkens mit ihren jeweiligen Interaktionspartnern verloren haben, können diese immer noch, zum Beispiel zum Erzeugen von Antikörpern, Verwendung finden. Diese Analoga oder Derivate können zum Beispiel verwendet werden, um Antikörper gegen die Interaktionsdomänen der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Diese Antikörper können für Detektions- oder Aufreinigungszwecke verwendet werden. Zusätzlich könnten diese Antikörper auch als kompetetive oder nicht-kompetetive Inhibitoren agieren und es könnte gezeigt werden, dass sie Modulatoren einer Wechselwirkung sind, die gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde.
Eine Wirtszelle oder Indikatorzelle ist mit exogener oder heterologer DNA (z.B. einem DNA Konstrukt) „transfiziert" worden, wenn diese DNA in die Zelle eingeführt wurde. Die transfizierende DNA kann oder kann nicht in die chromosomale DNA, die das Genom der Zelle ausmacht, integriert (kovalent verbunden) werden. In Prokaryoten, Hefe, und Säugerzellen zum Beispiel kann die transfizierende DNA auf einem episomalen Element, wie einem Plasmid, beibehalten werden. Bezogen auf eukaryotische Zellen ist eine stabil transfizierte Zelle eine Zelle, bei der die transfizierende DNA so in das Chromosom integriert wurde, dass sie von ihren Tochterzellen durch Chromosomenreplikation geerbt wird. Diese Stabilität zeigt sich durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zellen Zelllinien oder Klone zu bilden umfassend ein Population von Tochterzellen, die die transfizierende DNA enthalten. Transfektionsverfahren sind in der Technik wohl bekannt (4, 96). Die Verwendung einer Säugerzelle als Indikator kann den Vorteil haben, dass ein intermediärer Faktor bereitgestellt wird, der die Wechselwirkung von zwei Polypeptiden, die getestet werden, erlaubt oder moduliert, die vielleicht nicht in niederen Eukaryoten oder Prokaryoten vorhanden sind. Natürlich kann der Vorteil entfallen, wenn beide getesteten Polypeptide direkt wechselwirken. Es versteht sich, dass Extrakte von Säugerzellen zum Beispiel in bestimmten Ausführungsformen verwendet werden können, um den Mangel an bestimmten Faktoren in der gewählten Indikator Zelle auszugleichen. Man sollte sich bewusst sein, dass das Gebiet der Translation zahlreiche Lehren von Verfahren zur Herstellung und Rekonstitution verschiedener Typen an Extrakten zur Verfügung stellt
Im Allgemeinen sind Techniken zur Herstellung von Antikörpern (einschließlich monoklonaler Antikörper und Hybridome) und zur Detektion von Antigenen mittels Antikörpern in der Technik wohl bekannt (12). Die vorliegende Erfindung stellt auch polyklonale, monoklonale Antikörper, oder humanisierte Versionen davon, chimäre Antikörper und ähnliches zur Verfügung, die ihre entsprechenden Wechselwirkungsdomänen inhibieren oder neutralisieren und/oder für diese spezifisch sind.
In der Beschreibung und den angehängten Ansprüchen sollte der Begriff „therapeutisches Agens" in einem breiten Sinne verstanden werden, nämlich so dass auch eine Kombination von wenigstens zweier solcher therapeutischen Agentien beinhaltet ist. Die DNA Segmente oder Proteine der vorliegenden Erfindung können auf einer Reihe von Wegen in die Individuen einführt werden. Zum Beispiel können die erythropoietischen Zellen von dem betroffenen Individuum isoliert werden, mit einem erfindungsgemäßen DNA Konstrukt transformiert und in ein betroffenes Individuum auf einer Reihe von Wegen einschließlich intervenöser Injektion, wieder eingeführt werden. Alternativ kann das DNA Konstrukt direkt an das bettoffene Individuum verabreicht werden, zum Beispiel, über Injektion im Knochenmark. Das therapeutische Agens kann auch durch eine Transportform wie ein Liposom verabreicht werden, dass entworfen sein kann auf einen bestimmte Zelltypen zu zielen, und konstruiert sein kann auf verschiedenen Wegen verabreicht zu werden.
Für die Verabreichung an Menschen wird der verschreibende Mediziner letztendlich die geeignete Form und Dosierung für jeden gegebenen Patienten bestimmen, und es kann erwartet werden, dass diese gemäß des gewählten therapeutischen Behandlungsschemas (z.B. DNA Konstrukt, Protein, Molekül), der Reaktion und dem Zustand des Patenten sowie der Schwere der Erkrankung variiert
Zusammensetzungen innerhalb des Schutzbereiches der vorliegenden Erfindung sollten das aktive Agens (z.B. Protein, Nukleinsäure, oder Molekül) in einer Menge enthalten, die wirksam ist den effizient den gewünschten therapeutischen Effekt zu erreichen, während nachteilige Nebeneffekte vermieden werden. Typischerweise können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an Säuger (z.B.) Menschen in Dosierung verabreicht werden, die von 0.005 bis 1 mg pro kg pro Tag des Körpergewichts des zu behandelnden Säugers reichen. Pharmazeutisch verträgliche Präparationen und Salze des aktiven Agens gehören zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung und sind in der Technik wohl bekannt (88). Für die Verabreichung der Polypeptide, Antagonisten, Agonisten und ähnlicher, sollte die verabreichende Menge so gewählt werden, dass nachteilige Nebeneffekte vermieden werden. Die Dosierung wird durch den Kliniker gemäß den üblichen Faktoren wie dem Ausmaß der Krankheit und verschiedenen Parametern des Patienten angepasst. Typischerweise werden 0.001 bis 50 mg/kg/Tag dem Säuger verabreicht.
Die Verfahren und Assays der vorliegenden Erfindung sind auch für Annexin bestätigt worden. Dieses Protein ist signifikant von P-Glykoprotein sowohl in Struktur als auch Funktion verschieden. Konsequenterweise zusammen mit dem Wissen über Proteinchemie und Molekularbiologie unterstützen diese Bestätigungen die Anwendbarkeit der vorliegenden Assays und Verfahren auf alle Proteine (von Viren, lebenden Zellen, Tieren, Pflanzen, usw.).
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Nachdem bisher die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird nun auf die beigefügten Abbildungen verwiesen, die bildlich eine bevorzugte Ausführungsform darstellen, und in denen:
1 das Prinzip der Protein-Protein Wechselwirkung zeigt. Die Pluszeichen (+) markieren die Regionen der Hochaffinitätsbindung. Die Minuszeichen (–) markieren die Regionen der stark abstoßenden Kräfte. Wie im Text vermerkt ist, bestehen die Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen aus diskontinuierlichen Regionen von Hochaffinitätsbindung und stark abstoßenden Kräften, die fast im Gleichgewicht sind, wobei die Hochaffinitätsbindung bevorzugt ist, während die Proteine zusammen sind.
2 zeigt eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Identifikation von Hochaffinitätsbindungs-Sequenzen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. A, die verschiedenen Formen stellen verschieden Proteine im vollständigen Zelllysat dar. Die Bezeichnungen entsprechen denen von 1. B, kleine überlappenden Peptide, die die gesamte Sequenz (oder ein Segment) des Proteins abdecken. A wird direkt auf derivatisierten Nocken der 96-Polypropylen Nockenplatten synthetisiert. Nach der Peptidsynthese, wird metabolisch radioaktiv markiertes vollständiges Zelllysat zu jeder Nocke, die die zahlreichen Peptide enthält, hinzu gegeben und in einem Inkubationspuffer inkubiert. C, die dunklen gefüllten Kreise stellen die radioaktiv markierten Proteine des vollständigen Zelllysats dar, die aus den metabolisch radioaktiv markierten Zellen isoliert wurden und die zu allen Nocken der 96 Nockenplatten hinzu gefügt wurden, um Hochaffinitätsbindungssequenzen auf Protein A zu identifizieren. D, nach einer intensiven Waschung, sind die Hochaffinitätsbindungssequenzen (überlappenden Peptide von Protein A) in jenen Nocken, die radioaktive markierte Proteine binden (dunkel). Vier Hochaffinitätsbindungssequenzen zwischen Protein A und (einem) anderen Proteinen) werden in Reihen 1, 3, 6 und 8 identifiziert. Die Nocken, die Hochaffinitätsbindungssequenzen enthalten, werden durch radioaktiv markiertes Zählen und SDS-PAGE identifiziert.
3 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von Hochaffinitätsbindungssequenzen gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. A zeigt eine schematische Darstellung der Wechselwirkung zwischen Protein A und Protein B. B, kleine überlappende Peptide, die die gesamte Sequenz (oder ein Segment) von Protein A abdecken werden direkt auf derivatisierten 96 Polypropylen Nockenplatten synthetisiert. Nach der Peptidsynthese wird ein radioaktiv markiertes Protein B (synthetisiert aus einem in vitro Transkriptions-Translations-Reaktions-Gemisch) zu jeder Nocke, die die zahlreichen Peptide enthält, hinzu gegeben, und in einem Inkubationspuffer inkubiert. C, die dunklen gefüllten Kreise stellen radioaktiv markiertes Protein B dar und das zu allen Nocken der 96 Nockenplatten hinzu gefügt wurde, um Hochaffinitätsbindungssequenzen auf Protein A zu identifizieren. D, nach einem Waschungsverfahren sind die Hochaffinitätsbindungssequenzen in jenen Nocken, in welchen Protein B (radioaktiv markiertes Protein in dunkel) immer noch an die Peptide von Protein A gebunden ist. E, vier Hockaffinitätsbindungssequenzen zwischen Protein A und Protein B werden in Reihen 1, 3, 6 und 8 identifiziert. Die Nocken, die Hochaffinitätsbindungssequenzen enthalten, werden durch radioaktiv markiertes Zählen und SDS-PAGE identifiziert.
4 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Selektion von Wirkstoffen, die gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung spezifisch die Bindung des Proteins A an B inhibieren. A zeigt eine schematische Darstellung der Wechselwirkung zwischen Protein A und Protein B. B, Peptide, die für Hochaffinitätsbindungssequenzen kodieren, werden als Pionier Sequenzen für die Selektion von spezifischen Wirkstoffen verwendet, die die Assoziation zwischen Protein A und Protein B und letztendlich die Funktion des Komplexes inhibieren. Um auf Hochaffinitätssequenzen zu abzuzielen, die in den 2 oder 3 identifiziert wurden, werden Peptide synthetisiert, die für eine der Hochaffinitätsbindungssequenzen kodieren, und verwendet um Proteine zu identifizieren, die an diese Peptide binden. Graue Kreise stellen eine der vier Hochaffinitätsverbindungssequenzen, die in 2 und 3 identifiziert wurden, dar. C, nach Zugabe der zu testenden Verbindung zu jeder Nocke der 96 Nockenplatten, wird ein radioaktive markiertes Protein B zu jede der Nocken hinzugefügt. Natürlich können kombinatorische Bibliotheken durchmustert werden, um Wirkstoffe zu identifizieren, die spezifisch an die Hochaffinitätsbindungsequenzen von Protein A binden. Wie zuvor angemerkt, ist radioaktiv markiertes Protein B aus der Transkriptions-Translationsmischung dargestellt. Die Platten werden gewaschen und die Wirkstoffe, die spezifisch an die Hochaffinitätssequenzen von Protein A binden, werden in den Nocken gefunden, die nicht das radioaktiv markierte Protein B enthalten. D, Nocken enthaltend die Wirkstoffe/Verbindungen, die spezifisch and der Hochaffinitätsbindungssequenzen in Protein A binden, und daher die Bindung von Protein B verhindern, werden durch die Abwesenheit eines dunkle Kreises identifiziert (d.h. Nocken 28, 70 und 75). Ausgewählte Wirkstoffe/Verbindungen stellen unschätzbare Pionier Verbindungen dar, die in biologischen Assays verwendet werden können, um ihren Wirkungsmechanismus zu bestätigen. Bestätigte Wirkstoffe können zu in vivo Studien vorangehen.
5 zeigt die vorausgesagte Sekundärstruktur und Aminosäure einer Verbindungsdomäne von P-Glykoprotein. Eine schematische Darstellung der vorausgesagten Sekundärstruktur von P-gp. Die zwölf gefüllten Vierecke stellen die vermutlichen Transmembrandomänen dar. Die zwei ATP-Bindungsdomänen sind durch zwei Kreise in der N- und C-terminalen Hälfte von P-gp dargestellt. Die eingefügte Abbildung stellt die Verbindungsdomäne dar. Die Aminosäuresequenz der Verbindungsdomänen von humanem P-gp 1 (HP-gp1) und HP-gp3 ist im Einbuchstaben-Aminosäuren-Code angegeben. Die Ziffern in den Klammern zu Beginn und dem Ende jeder Aminosäuresequenz von HP-gp1 und HP-gp3 zeigt die Länge der Verbindungsdomänen (1–90 und 1–88 für HP-gp1 bzw. HP-gp3). Die nummerierten Linien unter der Aminosäuresequenz zeigen die Sequenzen der überlappenden Hexapeptide, die sich um eine Aminosäure unterscheiden. Für HP-gp3 hat das letzte Hexapeptid die Nummer 88.
6 zeigt die Proteinbindung an überlappende Hexapeptide, die für die HP-gp1 Verbindungsdomäne kodieren. Überlappende Hexapeptide, die die Verbindungsdomäne von HP-gp1 kodieren, wurden auf Polypropylen Stäbchen synthetisiert und verwendet, um Proteine zu identifizieren, die an diese Peptide binden. Eine Gesamtheit von 90 Hexapeptiden plus zwei Kontrollhexapeptiden für HP-gp1 wurde mit vollständigen Zelllysat aus [³⁵S] Methionin metabolisch markierten Zellen inkubiert (siehe Methoden). Alle gebundenen Proteine wurden von den Stäben mit fixierten Peptiden eluiert und in 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Spuren 1 bis 92 zeigen die [³⁵S] Methionin gebundenen Proteine von HP-gp1. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker wird auf der linken Seite des Gels gezeigt.
7 zeigt die Effekte der verschiedenen Detergentien oder von Hochsalz auf die Bindung von Protein an HP-gp1 Hexapeptide. Metabolisch radioaktiv markierte Proteine, die an Hexapeptide (Hexapeptide 50–53) der HP-gp1 Verbindungsdomäne gebunden sind, wurden in der Gegenwart von ansteigenden Konzentrationen von anionischen Detergenz (0.12%–0.5% SDS), zwitterionischen Detergenz (20 mM–80 mM CHAPS) oder Salz (0.3 M–1.2 M KCl) eluiert. Die Y-Achse stellt die Menge der Radioaktivität dar, die von einem Pool der drei Hexapeptide (50 bis 53) eluiert wurde.
8 zeigt die Effekte von CHAPS auf die Bindung von Proteinen an die überlappenden Hexapeptide, die die HP-gp1 Verbindungsdomäne kodieren. Überlappende Hexapeptide der Verbindungsdomäne von HP-gp1 wurden mit vollständigem Zelllysat, das mit 10 mM CHAPS aus mit [³⁵S] Methionin metabolisch markierten Zellen extrahiert wurde, inkubiert. Gebundene Proteine wurden von den Stäbchen mit fixierten Peptiden eluiert und in 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Spuren 1 bis 92 zeigen die [³⁵S] Methionin gebundenen Proteine der HP-gp1 Verbindungsdomäne. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker wird auf der linken Seite des Gels gezeigt.
9 zeigt die Proteinbindung an überlappenden Hexapeptide, die die HP-gp3 Verbindungsdomäne kodieren. Überlappende Hexapeptide, die die HP-gp3 Verbindungsdomäne kodieren, wurden auf Polypropylen-Stäbchen synthetisiert und verwendet um Protein zu identifizieren, die an diese Peptide binden. Eine Gesamtheit von 88 Hexapeptiden plus zwei Kontrollhexapeptiden für HP-gp3 wurde mit vollständigen Zelllysat aus [³⁵S] Methionin metabolisch markierten Zellen inkubiert. Alle gebundenen Proteine wurden von den Stäbchen mit fixierten Peptiden eluiert und auf 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Spuren 1 bis 90 zeigen die [³⁵S] Methionin gebundenen Proteine von HP-gp3. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker wird auf der linken Seite des Gels gezeigt.
10 zeigt eine Sequenzgegenüberstellung der drei bindenden Regionen von HP-gp1 und HP-gp3 Bindungsdomänen. Die Gegenüberstellung der HP-gp1 und HP-gp3 Verbindungsdomänen wird unter Verwendung des Einbuchstaben-Codes für Aminosäuren gezeigt. Die Regionen der Hochaffinitätsbindung von HP-gp3 und HP-gp1 sind fettgedruckt. Identische Aminosäuren sind mittels Einbuchstaben-Code zwischen den zwei gegenübergestellten Sequenzen dargestellt. Konservierte Aminosäuren werden durch ein Plus (+) Zeichen markiert. Die Zahlen auf jeder Seite der Aminosäuresequenz der Verbindungsdomäne bezieht sich auf die Aminosäuresquenz der humanen HP-gp1 und 3 wie in (90, 111).
11 zeigt zwei Hochaffinitätsbindungs-Hexapeptide. Zwei Hochaffinitätsbindungssequenzen ⁶⁵⁸RSSLIR⁶⁶³ und ⁶⁶⁹SVRGSQ⁶⁷⁴ aus der HP-gp1 Verbindungsdomäne wurden resynthetisiert und mit vollständigen Zelllysat aus [³⁵S] Methionin metabolisch markierten Zellen inkubiert gefolgt von 24 oder 48 stündigen Inkubationszeiten. Gebundene Proteine wurden von den Stäbchen mit fixierten Peptiden eluiert und in 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Spuren 1 bis 92 zeigen die [³⁵S] Methionin gebundenen Proteine von HP-gp1. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker wird auf der linken Seite des Gels gezeigt.
12 zeigt die Effekte von verschiedenen Trägerproteinen als Blockierungsagens mit unspezifischer Bindung. Vollständiges Zelllysat aus [³⁵S] Methionin metabolisch markierten CEM Zellen wurden mit oder ohne 1% Gelatine, 0.3% BSA oder 3% BSA verwendet. Die Zelllysate wurden mit einem Hochaffinitätsbindungs-Hexapeptid ⁶⁵⁸RSSLIR⁶⁶³ einer HP-gp1 Verbindungsdomäne inkubiert. Die gebundenen Proteine wurden mit SDS Probenpuffer eluiert und auf 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker wird auf der linken Seite des Gels gezeigt.
13 zeigt die Aufreinigung eines 57 kDa Proteins. Vollständiges Zelllysat wurde mit fünfzig HP-gp1 Hexapeptiden ⁶⁵⁸RSSLIR⁶⁶³ und ⁶⁶⁹SVRGSQ⁶⁷⁴ inkubiert. Proben, die das 57 kDa Protein (P57) aus einem hundert Hexapeptidinkubationsmischung enthalten, wurden vereinigt und auf 10% SDS-PAGE aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurden auf PVDF Membran transferriert und mit Ponceau S angefärbt. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker wird auf der rechten Seite des Gels gezeigt.
14 zeigt eine Westerblotanalyse mit monoklonalen Antitubilin-Antikörpern. Vollständiges Zelllysat von CEM Zellen und Proteinen, die von Hochaffinitätsbindungshexapeptiden der HP-gp1 Verbindungsdomäne (P57) eluiert wurden, wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose Membran transferriert. Eine Hälfte der Membran wurde mit monoklonalen Anti-α und Anti-β Tubulin Antikörpern als Sonde inkubiert. Die Wanderung der Molekukulargewichtsmarker wird auf der linken Seite der Abbildung gezeigt.
15 zeigt die Helixraddarstellung der Hochaffinitätsbindungsregion der HP-gp1 und HP-gp3 Verbindungsdomäne. Der Einbuchstaben Aminosäurecode für die Hochaffinitätsbindungsregion von HP-gp1 und HP-gp3 wird gezeigt. Die positiv geladenen Aminosäuren auf einer Seite der Helix sind umkreist.
Andere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden nach Lesen der folgenden nicht-beschränkenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen unter Bezug auf die beigefügte Abbildung, die als Beispiel dienen soll und nicht als den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung beschränkend verstanden werden sollte, klarer werden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Die Funktion oder die Funktionen der Proteine wird vermittelt durch ihre Wechselwirkung mit anderen zellulären oder extrazellulären Proteinen. Bislang wurde angenommen, dass Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen große Bereiche der Polypeptide involviert, die komplementäre Aminosäuresequenzen haben. Es ist jedoch nicht bekannt, wie diese komplementären Sequenzen die Wechselwirkungen zwischen den Proteinen vermitteln. In dieser Anmeldung wird ein neues Konzept vorgeschlagen, um das Prinzip der Protein-Protein Wechselwirkungen zu erklären. Kurz gesagt, werden die Wechselwirkungen zwischen jeglichen zwei oder mehreren Proteinen durch eine Folge von unterbrochenen Sequenzen mit Hochaffinitätsbindungs- und hoch abstoßenden Kräften vermittelt (siehe 1). Die Summe dieser Kräfte über die gesamte exponierte Sequenz an Proteinen bestimmt die Natur und das Ausmaß dieser Wechselwirkungen zwischen Proteinen. Die Größen dieser wechselwirkenden Domänen können zwischen 5 und 25 Aminosäuren Länge variieren.
Die Anziehungskräfte zwischen zwei kleinen Hochaffinitätsbindungssequenzen sind im Allgemeinen größer als die Summe aller Hochaffinitätsbindungs- und Abstoßungskräfte zwischen zwei Proteinen.
Daher ist es unter Verwendung des vorliegenden Ansatzes möglich wechselwirkende Proteine aus einer Mischung von Proteinen mit Hilfe eines kurzen Peptids (fast sechs Aminosäuren) zu isolieren. Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnisse ist es nun leicht zu verstehen, warum viele Verfahren, die versuchten wechselwirkende Proteine zu isolieren, gescheitert sind. Die Verwendung großer Fragmente oder Proteine, um wechselwirkende Proteine zu isolieren, sind weniger effizient, da die Summe der Anziehungs-/Abstoßungskräfte viel schwächer ist als jegliche Abfolge von Anziehungskräften. Das hier vorgeschlagene Prinzip ist auch konsistent mit der Tatsache, dass Protein-Protein Wechselwirkungen durch posttranslationale Modifikationen (z.B. durch Phosphorylierung (29)) und die Präsens andere wechselwirkender Proteine (60) moduliert werden können. Demzufolge kann die Hinzufügung oder der Verlust von schwachen Kräften in Folge der posttranslationalen Modifikation das empfindliche Gleichgewicht zwischen den Hochaffinitätsbindungs- und Hochabstoßungskräften zerstören, die Proteine zusammenhalten oder ihre Assoziation verhindern. Die Größe der Anziehungskräfte zwischen zwei Hochaffinitätsbindungssequenzen wird bei der Antikörper-Antigen Bindung demonstriert, wobei das Antigen nur aus wenigen Aminosäuren bestehen kann (36, 37). Weiterhin existieren zahlreiche Beispiele in der Biologie, bei denen zelluläre Wechselwirkungen zwischen Proteinen aufgrund der Vorhandenseins einer kleinen Konsensussequenz von fünf bis zehn Aminosäuren vorkommen. Nichteinschränkende Beispiele solcher kleinen Konsensussequenzen schließen ein die Leucin-Zipper (63), und SH2 und SH3 Bindungssequenzen (63, 80). Zusätzlich zu den Wechselwirkungsdomänen zwischen zwei oder mehreren Proteinen (wie oben beschrieben), können Protein-Protein Wechselwirkungen viele messbare Effekte haben, wie: i) Änderungen der kinetischen Eigenschaften von einem oder beiden Proteinen (83, 84); ii) Bildung neuer Bindungs- oder Funktionsstellen (65, 104); und iii) die Inaktivierung von einer Funktion oder Funktionen (106, 114). In anderen Worten, ein gegebenes Protein könnte verschiedene Funktionsdomänen oder Sequenzen in der Gegenwart (im Gegensatz zu der Abwesenheit) jeglicher wechselwirkende Proteine exponieren. Daher kann in der Gegenwart von Protein B Protein A andere Sequenzen exponieren, die zuvor nicht für Wechselwirkungen mit anderen Proteinen exponiert wurden (65, 83, 84, 104, 106, 114). Das letztgenannte Konzept ist sehr wichtig, da es Argumente liefert gegen die Effektivität einiger struktureller Studien (d.h. Röntgenstruktur und NMR) zur Voraussage funktionaler oder Oberflächen exponierter Domänen aus der gelösten Kristallstruktur der Proteine. Durch die Ermöglichung der Messung und Identifikation möglicherweise aller Hochaffinitätsbindungsstellen eines gegebenen Proteins werden die Nachteile der Ergebnisse, die mit solchen strukturellen Studien gewonnen wurden, überwunden.
Neben den obigen Beispielen von Protein-Protein Wechselwirkungen ist eine Untergruppe der Protein-Protein Wechselwirkungen die Dimerisierung. Es gibt eine sehr große Vielzahl an Beispielen in der Biologie, bei denen Protein-Protein Wechselwirkungen essentiell für die Aktivierung oder Inhibierung der Funktion sind (59). Nicht einschränkende Beispiele von Homo- oder Heterodimeren schließen ein: Wachstumsfaktorrezeptoren (52); Membrantransportproteine (9, 36. 76); Tumorsuppressorproteine (72); und Proteine die Apoptose vermitteln (87). In der Tat ist dynamische Dimerisierung ein häufiges Thema bei der Regulation der Signalübertragung. Einige der funktionalen Konsequenzen der Dimerisierung beinhalten den verringerten Abstand zur Aktivierung der Einzeltransmembranzelloberflächenrezeptoren (z.B. EGF Rezeptor (52)) und differenzierte Regulierung bei der Heterodimerisierung, z.B. der BCL2 Proteinfamilie (87). Die Proteinkonzentration in lebenden Zellen ist sehr hoch und im Bereich von 10–30 mg/ml. Bei dieser hohen Proteinkonzentration, sollten fast alle Proteine genau und spezifisch mit anderen zellulären Proteinen wechselwirken. Einige dieser wechselwirkenden Proteine wirken als Funktionsinhibitoren, während andere Aktivatoren sein können (z.B. die BCL2-BAX Proteinfamilie (87)). Darüber hinaus verlangt das Wechseln eines gegebenen Proteins zwischen Aktivator- und Inhibitorassozierung, dass der Assoziierung-Dissoziierungs-Prozess rasch geschieht. Wenn zum Beispiel Protein X mit einem Inhibitorprotein I assoziiert ist, sind vielleicht die Domänen (kleinen Sequenzen), die für die Assoziierung des Proteins X mit einem Aktivatorprotein A nötig sind, in dem X-I Komplex nicht leicht zugänglich. Daher sind bestehende Verfahren zur Identifikation assoziierter Proteine (d.h. das Zweihybrid-System und ähnliche Ansätze) vielleicht nicht in der Lage alle assoziierten Proteine zu identifizieren. In anderen Worten können bestehende Verfahren, falls erfolgreich, vielleicht einige aber nicht alle funktionale Domänen und ihre assoziierten Proteine identifizieren. Im Gegensatz dazu ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des Peptid Durchmusterungs-Ansatzes in der Lage alle funktionalen oder Hochaffinitätsbindungsdomänen der Proteins X und seiner assoziierten Proteine zu identifizieren. Sind die assoziierten Proteine einmal identifiziert, können ihre biologischen Funktionen, sofern sie sich auf das Zielprotein X beziehen, getestet werden. Daher sollte die Wechselwirkung eines gegebenen wechselwirkenden Proteins mit einem oder mehreren möglichen assoziierten Proteinen sich als wichtig für die Funktion erweisen, können die Hochaffinitätsbindungssequenzen (zwischen Protein X und I oder A) leicht identifiziert werden und als Zielstelle in einem Hochdurchsatz Wirkstoff Durchmusterungs-Assay (siehe unten) oder anderen Assays verwendet werden.
Diese Erfindung beinhaltet das Konzept (beschrieben in 1A–1D), dass Protein-Protein Wechselwirkungen aus diskontinuierlichen Hochaffinitätsbindungs- und Hochabstoßungskräften bestehen, die über die ganze 3-D Sequenz des Proteins verteilt sind, und dass diese Sequenzen unter Verwendung von einem der vielen möglichen hier angegebenen Ansätze isoliert werden können (z.B. den Ansatz mit überlappenden Peptiden). Obwohl in dieser Anmeldung der Ansatz mit überlappenden Peptiden beispielhaft dargestellt wird, sind andere Ansätze vorstellbar, die ähnliche Ergebnisse liefern. Es sollte hervorgehoben werden, dass der hier beschriebene Ansatz unempfindlich ist gegenüber Änderungen in der Konformation, die sich bei wechselwirkenden Proteinen ergeben, und die andere gemeinhin benutzte Verfahren zur Identifikation von Protein-Protein Wechselwirkungen beeinflussen können (z.B. Zweihybridsystem, Affinitätsblotting, und Quervernetzung). Im Zweihybridsystem ist zum Beispiel Protein A mit einer anderen Proteinsequenz (dem DNA-gebundenen „Köder" Protein) verbunden und das andere wechselwirkende Protein ist verbunden mit der Aktivierungsdomäne, die das „Beute" Protein enthält. Das Binden der wechselwirkende Proteine an Protein A könnte Stellen exponieren, die sonst nicht in der nativen Konformation gefunden werden und die ihre Wechselwirkungen beeinflussen können. Weiterhin hat das Zweihybridsystem zahlreiche Nachteile die unten aufgezählt werden,

i. Die Wechselwirkung von Proteinen wird im Kernmilieu statt im Zytoplasma, in dem die meisten Proteine gefunden werden, beobachtet.
ii. Proteine können toxisch sein, wenn sie in verschiedenen Zellen oder Organismen exprimiert werden.
iii. Die Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen in einem Komplex im Zweihybridsystem können sterisch die Bindung von anderen wechselwirkenden Proteinen verhindern.
iv. Die posttranslationale Modifikation eines Proteins kann seine Wechselwirkung mit anderen Proteinen verhindern.
v. Das Zweihybridsystem erlaubt nicht die gleichzeitige Identifizierung der exakten Aminosäuresequenzen zwischen zwei wechselwirkenden Proteinen.
vi. Die Anwendung des Zweihybridsystems geht mit einem hohen Anteil von falsch Positiven einher.
vii. Das Zweihybridsystem kann nicht ohne weiteres auf verschiedene Zelltypen oder Gewebe, bei denen verschiedene wechselwirkende Proteine exprimiert werden können, angewendet werden (dies kann ein kritischer Nachteil dieses Systems sein).

Verfahren zur Identifikation wechselwirkender Proteine und Wechselwirkungsstellen für Protein A
Der vorliegende Ansatz und die Methodologie, die verwendet wird um diskontinuierliche Sequenzstränge zwischen zwei oder mehreren wechselwirkenden Proteinen zu identifizieren, ist der Ansatz des Scannens überlappender Peptide. Bei Verwendung dieses Ansatzes wird eine große Anzahl kleiner überlappender Peptide, der „Köder", parallel auf einem inerten festen Träger synthetisiert, die die gesamte Aminosäuresequenz eines gegebenen Proteins abdecken (siehe 2). Die Überlegung eine große Anzahl kleiner überlappender Peptide zu synthetisieren statt einer diskontinuierlichen Peptidbibliothek fußt auf der Tatsache, das man nicht a priori weiß, welche exakte Sequenz eines gegebenen Proteins die Hochaffinitätsbindungsstellen und die abstoßenden Sequenzen enthalten wird. Daher führt der Ansatz mit diskontinuierlichen Peptiden of zum Vorhandensein sowohl von Hochaffinitätsbindungssequenzen als auch Abstoßungssequenzen im dem gleichen Peptid. Derartige Peptide werden nicht mit hoher Affinität an potentielle Wechselwirkungsproteine binden. Darüber hinaus erhält man durch die Verwendung überlappender Peptide auch interne Kontrollen zur unspezifischen Bindung. Zum Beispiel werden bei der Verwendung überlappender Peptide die Hochaffinitätsbindungssequenzen einen Signalpeak geben, wenn die Peptide innerhalb der Hochaffinitätsbindungsdomäne die Hochaffinitätsaminosäuresequenzen, aber nicht die Aminosäuren besitzen, die Abstoßungskräfte verursachen (siehe 6 in Beispiel I). Natürlich versteht sich, dass die vorliegende Erfindung nicht davon abhängig ist, die gesamte Peptidsequenz zu umspannen. In der Tat, kann/können die Teilregion(en) des Proteins verwendet werden.
Zusätzlich können überlappende Peptide von einer gewählten Domäne des Proteins abgeleitet werden. Es ließe sich auch vorstellen, dass ein überlappender Satz an Peptiden eines ersten Proteins als Sonde für einen überlappenden Satz an Peptiden eines zweiten Proteins dient.
Um zu zeigen, wie man diesen Ansatz der überlappenden Peptide als „Köder" verwenden kann, um wechselwirkende Proteine „die Beute" aus einer Mischung mit allen Zellproteinen zu isolieren, kann das folgende Beispiel betrachtet werden. P-Glykoprotein ist ein Membranprotein (46), das Resistenz gegen Antikrebs Medikamente verleiht, und daher verantwortlich ist für das Scheitern der Chemotherapie. Obgleich nachgewiesen wurde, dass P-Glykoprotein funktioniert, indem es die Anhäufung von chemotherapeutischen Medikamenten in Tumorzellen verhindert, ist der genaue Mechanismus unbekannt, wie dieses Protein funktioniert und ist unbekannt, was die assoziierten Protein sind, die seine Funktion modulieren. Daher besteht ein Interesse Proteine zu identifizieren, die mit P-Glykoprotein wechselwirken, um eine Inhibierung der Bindung zwischen P-Glykoprotein und seinen assoziierten Proteinen zu ermöglichen, und dadurch möglicherweise seine Funktion in resistenten Tumorzellen zu modulieren. Diesem Beispiel lag das Interesse zu Grunde jene Proteine zu identifizieren, die an die Verbindungsdomäne der P-Glykoproteins binden. Daher wurde in diesem bestimmten Beispiel eine Domäne eines gewählten Proteins verwendet. Die Verbindungsdomäne kodiert für eine Region von etwa 90 Aminosäuren. Daher wurden auf einen festen Träger überlappende Hexapeptide, die diese gesamte Verbindungssequenz des P-Glykoproteins überdecken, mit Standard F-moc Chemie synthetisiert (74). Die kovalent fixierten Peptide (auf dem festen Träger) wurden mit vollständigem Zelllysat inkubiert, das aus Zellen isoliert wurde, die metabolisch mit [³⁵S] Methionin markiert waren. Die Peptide und das vollständige Zelllysat wurden in der Gegenwart eines Trägersubstrats für 18 Stunden bei 4°C inkubiert (1–3% bovines Serumalbumin, oder 1–3% Gelatine, 1–3% Magermilch etc.). Nach dieser Inkubationsphase, wurden die kovalent fixierten Peptide intensiv mit isotonischem Puffer gewaschen. Alle Proteine aus dem radioaktive markiertem vollständigen Zelllysat, die mit den überlappenden Hexapeptiden nach dem Waschschritt assoziiert blieben, werden in SDS enthaltenem Probenpuffer eluiert und durch SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert (62). Das Vorhandensein von radioaktiv markierten Proteinen auf SDS Polyacrylamid Gelen nach Geltrocknung und Signalverstärkung stellt die folgende Information zur Verfügung:

1) jene spezifischen überlappenden Peptide repräsentieren Hochaffinitätsbindungssequenzen in der P-Glykoprotein Verbindungsdomäne (oder anderen gewählten Domänen oder nicht-gewählten Domänen); und
2) die Proteine, die an die spezifischen überlappenden Peptide gebunden sind, sind assoziierte Proteine (siehe 6).

Die assoziierten Proteine, die an die Hochaffinitätsbindungssequenzen gebunden sind, können in großen Mengen für den Zweck isoliert werden, die Identität über N-terminale Aminosäuresequenzierung, durch Edman Abbau (27) oder ähnliches zu bestimmen. Kurz gesagt, werden die Sequenzen der überlappenden Peptide, die ein gegebenes Protein gebunden haben, auf einem festen Träger resynthetisiert und an diesen fixiert gehalten. Vollständiges Zelllysat aus [³⁵S] Methionin metabolisch radioaktiv markierten Zellen wird zu dem festen Träger hinzugefügt, der die fixierten Hochaffinitätssequenzpeptide enthält, und wie oben beschrieben inkubiert. Nach Waschschritten und einem Elutionsschritt mit SDS-enthaltenem Puffer (siehe unten), um ungebundenes Material zu entfernen, wird das assoziierte Protein in großen Mengen isoliert. Das aufgereinigte assoziierte Protein ist nun fertig für die Aminosäuresequenzierung. Sollten weitere Aufreinigungsschritte notwendig sein, sind diese dem Fachmann natürlich wohl bekannt. Das aufgereinigte Protein wird auf SDS Polyacrylamid Gelen laufen gelassen und das aufgetrennte Protein wird, wie zuvor beschrieben (108), auf PVDF Membranen transferriert. Andere Verfahren zur Aminosäuresequenzbestimmung können auch leicht angewendet werden (27, 33).
Verfahren zur Identifizierung der Aminosäuresequenzen zwischen zwei wechselwirkenden Proteinen
Dasselbe oben beschriebene Konzept kann auch angewendet werden, wenn man nur daran interessiert ist, die Hochaffinitätsbindungssequenzen zwischen zwei Proteinen zu identifizieren. Ein nicht einschränkendes Beispiel für zwei derartige Proteine sind die Wechselwirkungsregionen zwischen p53 und MDM (28, 103). Der Zweck dieser Übung ist es daher insbesondere Hochaffinitätsbindungssequenzen zwischen Protein A (p53) und Protein B (MDM) zu identifizieren, um diese Sequenzen als Zielstellen für die Identifikation von Verbindungen zu verwenden, die diese Wechselwirken modulieren und noch spezieller für die Entwicklung von Wirkstoffen. Wenn ein gegebener Wirkstoff an eine dieser Hochaffinitätsbindungsstellen auf Protein A gebunden ist, wird der Wirkstoff daher in einer Ausführungsform die Bildung des aktiven Komplexes (Protein A + B) verhindern und daher die Funktionen des Komplexes verhindern. Um den Strang der Hochaffinitätsbindungssequenzen zwischen Protein A und B (siehe 3) zu isolieren, werden kleine überlappende Peptide (5 bis 7 Aminosäuren), die die gesamte Aminosäuresequenz des Proteins A, „dem Köder", abdecken, parallel auf einen festen Träger synthetisiert (wie oben erwähnt und detaillierter in Beispiel 3 beschrieben). Es ist bei dieser speziellen Ausführungsform zu beachten, dass nur die primäre Aminosäuresequenz des Proteins A, „des Köders", benötigt wird. Nachdem die Peptide einmal synthetisiert sind (Peptidsynthese wird parallel auf einem festen Träger in 96 Nockenplatten gemacht), wird eine angereichertes und radioaktiv markiertes Volllängen Protein B, „die Beute" (das radioaktiv markierte Protein B ist leicht aus einer in vitro Transkriptions-Translationsreaktionen erhältlich; (118)) zu jeder der Nocken der 96-Nockenplatte hinzu gegeben, die die kovalent fixierten überlappenden Peptide enthalten. Die Peptide, die für Protein A kodieren, werden mit radioaktiv markiertem Protein B inkubiert, um zu erlauben, dass Bindung stattfindet. Nach einer Inkubationsperiode (5 bis 24 Stunden) wird nicht gebundenes radioaktiv markiertes Protein B durch intensive Waschung in isotonischem Puffer entfernt. Alle überlappenden Peptide, die an radioaktiv markiertes Protein B gebunden sind, werden in der Gegenwart von denaturierenden Agentien eluiert. Das Eluat jeder dieser 96-Nockenplatten wird auf das Vorhandensein von radioaktiv markiertem Protein B untersucht, indem man die Proben über SDS-PAGE laufen lässt (62). Hochaffinitätsbindungspeptide werden als jene identifiziert, die radioaktiv markiertes Protein B zurückbehalten.
Die Verwendung von metabolisch markierten Proteinen als „Beute", um mit den überlappenden Peptiden „des Köders" zu wechselwirken, erhöht die Sensitivität dieser Technik und erlaubt die Identifizierung der wechselwirkende Proteine mit Bindungsaffinitäten von 10^–10 – 10^–12 M für ein Standard 50 kDa Protein, das für ein bis zehn radioaktiv markierte Methionin Reste kodiert (82).
Verfahren zur Verwendung von Hochaffinitätsbindungssequenzen in Hochdurchsatzassays zur Durchmusterung von Pionierverbindungen
Der hier beschriebene Ansatz zur Identifizierung von Hochaffinitätsbindungssequenzen oder Zielstellen zur Wirkstoffentwicklung kann auch in Hochdurchsatzassays verwendet werden, um nach kleinen Molekülen aus kombinatorischen Bibliotheken zu durchmustern. Um zum Beispiel Wirkstoffe zu selektieren, die spezifisch die Bindung von Protein A an B verhindern (siehe 4), werden eine oder mehrere Zielstellen (die Hochaffitätsbindungssequenzen), wie zuvor beschrieben, in jeder der 96-Nockenplatten synthetisiert. In diesem Beispiel (4) wird die gleiche Hockaffinitätsbindungssequenz in allen Nocken synthetisiert. Zu jeder Hochaffinitätsbindungssequenzen enthaltender Nocke werden ein oder mehrere Moleküle) aus einer kombinatorischen Bibliothek hinzugefügt. Nach Zugabe des/der Wirkstoff(s/e), wird zum Beispiel ein radioaktiv markiertes Protein B aus einem in vitro Transkriptions-Translationsgemisch hinzu gegeben und, wie oben angegeben, inkubiert. Nach mehreren Waschungen, wird gebundenes Protein mit SDS-Probenpuffer eluiert. Radioaktiv markiertes Protein B enthaltende Nocken zeigen an, dass der Wirkstoff keinen Effekt auf die Bindung zwischen der Hochaffinitätsbindungssequenz und Protein B hatte. Wenn andererseits eine oder mehrere Nocken kein radioaktiv markiertes Protein B in der Gegenwart des Wirkstoffes enthalten, dann hat dieser Wirkstoff die Wechselwirkungen zwischen der Hochaffinitätsbindungssequenz auf A und Protein B verhindert. Demzufolge ist der letztere Wirkstoff eine gute Pionierverbindung. Diese Wirkstoffe können nun in die zweite Phase ihrer Analyse eintreten, um zu bestimmen, ob sie die Bildung eines aktiven Komplexes aus Volllängenprotein A und B verhindern. Aktive Wirkstoffe, die identifiziert werden, werden in vivo getestet werden, um ihren Wirkmechanismus weiter zu bestätigen. Auf diese Weise werden spezifischere Wirkstoffe mit geringeren oder keinen Nebeneffekten entwickelt.
Der letztgenannte Punkt stellt einen Vorteil dar, da die meisten Proteine mehr als eine biologische Funktion haben. Wenn zum Beispiel Protein A mit sich selbst wechselwirkt, wird es eine Funktion ausüben, während das gleiche Protein, das mit einem anderen Protein wechselwirkt, eine andere Funktion ausüben wird. Darüber hinaus wird Protein A, wenn es Teil eines vorgegebenen Komplexes assoziierter Proteine ist, mehrere Funktionen vermitteln, die Wechselwirkungen zwischen Protein A und B verhindern, während die Wechselwirkungen zwischen Proteinen A und C, D oder F nicht beeinflusst werden, einer oder einige zelluläre Wege inhibiert werden. Dem gegenüber wird die Inhibierung der Funktion von Protein A die Funktionen des gesamten Komplexes inhibieren. In dieser Hinsicht wird die Identifikation, Isolierung und Entwicklung von Wirkstoffen, die spezifisch Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen innerhalb eines Proteinkomplexes inhibieren werden, in spezifischeren Wirkstoffen mit geringeren Nebeneffekten resultieren. Außerdem wird die Zusammensetzung eines gegebenen Proteinkomplexes bei unterschiedlichen Geweben unterschiedlich sein, da unterschiedliche Proteine in unterschiedlichen Geweben oder Organen differentiell exprimiert werden. Demzufolge wird der Ansatz Wirkstoffe zu entwickeln, die Protein-Protein Wechselwirkungen inhibieren auch zu Wirkstoffen führen, die Organ- und Gewebsspezifisch sind.
Es versteht sich natürlich, dass die vorliegende Erfindung auch quantitative Assays zur Messung der Protein-Protein Wechselwirkung und ihrer Modulation durch Verbindungen zur Verfügung stellt.
Schließlich hat der Ansatz, der in dieser Anmeldung beschrieben wurde, zur Identifikation wechselwirkender Proteine, der genauen Aminosäuresequenz zwischen wechselwirkenden Proteinen, und das Zielen auf solche spezifischen Sequenzen in Proteinen mit Wirkstoffen, die Protein-Protein Wechselwirkungen, ein enormes Potential die zukünftige Wirkstofffindung in der pharmazeutischen Industrie zu diktieren.
Die vorliegende Erfindung wird in mehr Detail durch die folgenden nicht eingrenzenden Beispiele veranschaulicht.
BEISPIEL 1
P-Glykoprotein Bindung an Tubulin wird durch Sequenzen in der Verbindungsdomäne vermittelt
Die erfolgreiche Behandlung von Krebspatienten mit chemotherapeutischen Wirkstoffen ist oft durch die Entwicklung Wirkstoff resistenten Tumoren begrenzt. Tumorzelllinien, die in vitro mit einem einzelnen Antikrebs-Wirkstoff selektiert wurden, werden resistent gegenüber einem breiten Spektrum chemotherapeutischer Wirkstoffe, die multiwirkstoff resistente (oder MDR) Tumorzellen genannt werden (Übersicht in (21, 45, 66)). Darüber hinaus wurde die Expression von MDR in diesen Tumorzellen mit der Überexpression von zwei Membranproteinen assoziiert; dem MDR1 P-Glykoprotein (P-gp) und dem „Multidrug Resistance-associated Protein" (MRP1)(21, 45, 66). Sowohl P-gp als auch MRP sind Mitglieder einer großen Familie von Membrantransporterproteinen, die als „ATP binding cassete" Proteine oder ABC Membrantransporter bekannt sind (54). Obgleich die Struktur von P-gp1 spekulativ bleibt (91), lassen kumulative topologische Hinweise auf eine tandemartig verdoppelte Struktur mit sechs Transmembrandomänen und einer großen zytoplasmatischen Domäne schließen, die für eine ATP Bindungskassette kodiert (58, 68). Die zwei Hälften von P-gp1 sind über einen Strang aus 90, reich an polaren oder geladenen Aminosäuren, Resten verbunden, der Verbindungsdomäne genannt wird.
Die P-gp Genfamilie besteht aus drei strukturell ähnlichen Isoformen in Nagern (Klassen I, II, und III) und zwei Isoformen im Menschen (Klassen I und III) (20). Gentransfer Studien lassen auf funktionale Differenzen zwischen diesen strukturell ähnlichen Isoformen schließen. Zum Beispiel weisen nur die P-gp Isoformen der Klassen I und II den MDR Phänotyp auf (25, 111), während die Klasse III Isoformen dies nicht tun (11, 98). Die Klasse III Isoformen vermitteln den Transfer von Phosphatidylcholin aus der inneren Schicht in die äußere Schicht der Plasmamembran (d.h. „Flipase")(92, 100). In normalen Geweben beschränkt sich die P-gp Verteilung hauptsächlich auf Gewebe mit sekretorischen Funktionen (79, 116). Ihre polarisierte Lokalisierung auf apikalen Oberflächen, die einem Lumen der Nebennierendrüse, der Leber, dem Niereninnere zugewandt sind, lässt eine normalen Transport- oder Entgiftungsmechanismus vermuten. Darüber hinaus exprimieren die hematopoietischen Stammzellen und spezifischen Lymphozyten-Unterklassen auch große Mengen von P-gp (49). Die normale Funktion oder das/die normale(n) Substrat(e) der Klassen I und II bleiben undefiniert; jedoch führt die Disruption der Klasse I oder/und II Gene aus dem Mausgenom zu einer Anhäufung der zytostatischen Wirkstoffe oder lipophilen Verbindungen in den meisten normalen Geweben, aber besonders eindrucksvoll im Gehirn (99, 100). Basierend auf diesen Ergebnissen wird spekuliert, dass die normale Funktion von P-gp (der Klasse I und II oder des P-gp verursachenden MDR) die Entgiftung ist, ähnlich wie die Entgiftung, die in MDR Zellen zu sehen ist, insbesondere an der Bluthirnschranke (57). Hohe Mengen an P-gp fanden sich in vielen intrinsisch Medikamentenresistenten Tumoren aus Darm, Niere, Brust und Nebennieren, sowie bei anderen Tumoren, die den MDR Phänotyp nach Chemotherapie angenommen haben (zum Beispiel bei akuter nicht-lymphoplastischer Leukämie) (22, 32, 35, 47, 53, 78). Zahlreiche Studien haben nun eine inverse Korrelation zwischen der P-gp Expression und der Reaktion auf Chemotherapie belegt (5, 89, 113). Weiter haben Chan et al. (16, 17) gezeigt, dass P-gp Expression für das MDR und die Reaktion bei Kinderleukämie, Weichgewebssarkomas und Neuroblastomas bei Kindern prognostisch ist. Im Lichte dieser Studien scheint es überzeugende Belege zu geben, dass zumindest bei einigen Krebsarten die P-gp Mengen die Reaktion auf die chemotherapeutische Behandlung vorraussagen.
Direkte Bindung zwischen P-gp und verschiedenen lipophilen Verbindungen wurde durch Verwendung von photoaktiven Wirkstoffanalogen gezeigt (77, 93, 94). Bei bestimmten Verbindungen, die P-gp binden, wurde gezeigt, dass sie den MDR Phänotyp, vermutlich durch Kompetierung um die gleiche Medikamentenbindungsstelle in P-gp, revertieren (34, 38). Diese Verbindungen, die alle zusammen als MDR-revertierende Agentien bezeichnet werden, schließen ein Verapamil, Quinidin, Ivermectin, Cyclosporine, und Dipyrimadol Analoge, um nur wenige zu nennen (34, 38). Klinische Versuche mit MDR-revertierenden Agentien (z.B. Verapamil oder Quinidin) haben einige Reaktion in Tumoren gezeigt, die sonst nicht auf Chemotherapie ansprechen (23, 44, 117). Jedoch hat die mit zahlreichen MDR-revertierenden Agenten assoziierte hohe pharmakologische Toxizität ihre Verwendung bei einer effizienten Konzentration verhindert (67). Eine bessere klinische Reaktion wurde bei Verwendung anderer MDR-revertierenden Agentien (d.h. Cyclosporin A und sein nicht immunsuppremierendes Analog PSC833) beobachtet; allerdings wurden toxische Effekte auch mit Cyclosporin gesehen (101, 115).
Es wurde gezeigt, dass P-gp ein Substrat für Proteinkinase C und A ist (2, 9). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Agentien, die Proteinkinase C Aktivität modulieren, P-gp Phosphorylierung und seine MDR-vermittelten Phänotype modulieren (7, 13). In einer Studie wurde gezeigt (31), dass PMA Phorbol Ester (ein Proteinkinase C Aktivator) den MDR Phänotyp und den Medikamenten Ausfluss in MCF7 Brustkrebszellen verstärkt. In einer anderen Studie (6) wurde gezeigt, dass Natrium Butyrat Behandlung von SW620 humanen Darmkrebszellen zu einem starken Anstieg der P-gp Expression führte, ohne einen gleichzeitigen Anstieg der Medikamentenresistenz oder des Medikamentenausflusses. Interessanterweise erwies sich P-gp in SW620 Zellen auch nach Natrium Butyrat Behandlung als wenig phosphoryliert (6). Zusammengenommen war das Fehlen der Transportfunktion von P-gp in SW620 Zellen nicht klar, allerdings wurde gezeigt, dass Mutationen der P-gp Phosphorylierungsstellen innerhalb der Verbindungsdomäne keinen Einfluss auf seine Medikamententransportfunktion haben (40). Stattdessen regulierte die Protein Kinase C Modulation der Serin/Threonin Reste in der Verbindungsdomäne die Aktivität der endogenen Chloridkanäle und lässt daher vermuten, das P-gp den Kanal steuert (41, 110). Obwohl es daher unklar bleibt, welche Funktionen die Verbindungsdomäne von P-gp1 vermittelt, was es von Interesse die Proteine mit einem in vitro Assay zu identifizieren, die mit der Verbindungsdomäne wechselwirken. Der letztere Assay basiert auf einem neuen Verständnis der Proteinwechselwirkungen, das durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird. Die weiter unten gezeigten Ergebnisse zeigen, dass drei Sequenzen in der Verbindungsdomäne an Proteine mit den apparenten Molekularmassen von ~80 kDa, 57 kDa und 30 kDa binden. Aufreinigung und partielle N-terminale Aminosäuresequenzierung des 57 kDa Proteins zeigten, das es für die N-terminalen Aminosäuren von α und β-Tubulin kodiert.
Es wurde daher, unter Verwendung einer Proteindomäne als ein Beispiel für die Gültigkeit der Mächtigkeit der vorliegenden Erfindung, gezeigt, dass: i) diese Domäne spezifisch an die Proteine gebunden wird; ii) die spezifisch bindenden Protein formell identifiziert werden können; und iii) die Sequenz verantwortlich ist für die spezifische Bindung an diese formell identifizierten Proteine (zusammen mit den wechselwirkenden Domänen dieses bindenden Proteins, wenn abgeleitet).
Beispiel 2
Materialien
[³⁵S] Methionin (1000 Ci/mmol; Amersham Life Sciences, Inc.) und [¹²⁵I] Ziegen Anti-Maus Antikörper wurden von Amersham Biochemical Inc. gekauft. Protein-A Sepharose-4B wurde von Bio-Rad Life Science bezogen. Alle anderen verwendeten Chemikalien wurden mit dem höchsten verfügbaren kommerziellen Reinheitsgrad verwendet.
Beispiel 3
Peptidsynthese
Vorderivatisierte Plastikstäbchen, Aktivester und Polypropylen Schalen wurden von Cambridge Research Biochemicals (Valley Stteam, NY bezogen. Peptide wurden, wie zuvor beschrieben (36, 37) auf festen Polypropylen Stäbchen synthetisiert. Kurz gesagt, wurde die F-moc Schutzgruppe auf den vorderivatisierten Polypropylen Stäbchen als festem Träger (im 96 Nockenformat angeordnet) durch Inkubation mit 20% (v/v) Piperidin in Dimethlyformamid (DMF) für 30 Minuten unter Schütteln entfernt. Nach Aufhebung des Schutzes der β-Alanin Spacer auf den Polypropylen Stäbchen, wurden die F-moc geschützten Aminosäuren in HOBt/DMF aufgetrennt und zu den dazugehörigen Nocken hinzu gegeben, die die entschützten Stäbchen enthielten. Das Koppeln der Aminosäuren fand für 18 Stunden bei Raumtemperatur statt, danach wurden die Stäbchen in DMF (1 × 2 Minuten), Methanol (4 × 2 Minuten), und DMF (1 × 2 Minuten) gewaschen. Zum Koppeln der zweiten Aminosäure war eine Entschützung der F-moc Aminoschutzgruppe der ersten Aminosäure und die Inkubation der Stäbchen mit der zweiten voraktivierten F-moc geschützten Aminosäure (Pentaflurphenyl Derivaten) notwendig. Man ließ die Reaktion für 18 Stunden stattfinden, und die Stäbchen wurden entfernt und, wie oben angegeben, gewaschen. Die gleichen Schritte wurden für jede Aminosäurekopplung wiederholt bis sechs Aminosäuren gekoppelt waren. Nach dem letzten Kopplungsschritt wurde die F-moc N-terminale Schutzgruppe mit 20% Piperidin/DMF entfernt und die freie Aminogruppe für 90 Minuten in einem Acetanhydrid: Diisopropylethylamin (DIEA): DMF (50:1:50 v/v/v) enthaltenden Acetylierungs Cocktail acetyliert. Die Seitenketten Schutzgruppen der N-terminal acetylierten Hexapeptide auf den Polypropylen Stäbchen wurden durch Inkubation mit einer Spaltungsmischung enthaltend Trifluressigsäure: Phenol: Ethandithiol (95:2.5:2.5 v/v/v) für 4 Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Nach dem Spaltungsschritt wurden die Stäbchen mit Dichlormethan (DCM) gewaschen und in 5% (v/v DIEA/DCM) neutralisiert. Die entschützten Peptid-gekoppelten Stäbchen wurden in DCM, Methanol gewaschen und für 18 Stunden getrocknet.
Beispiel 4
Gewebekultur und Metabolisches Markieren der Zellen
Medikamenten sensitive Zellen (CEM) und resistente Zellen (CEM/VLB^1.0) wurden in α-MEM Medium supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (Hyclone, Inc.), wie zuvor beschrieben (8), kultiviert. Alle Zellen wurden alle drei Monate unter Verwendung des Mycoplasma PCR Kits von Stratagene Inc. (San Diego, CA) auf Mycoplasma Kontamination untersucht. Für die metabolische Markierung der Zellen wurden CEM oder CEM/VLB^1.0 Zellen bei 70–80% Konfluenz mit [³⁵S] Methionin (100 μCi/ml) für 6 Stunden bei 37°C in Methionin freiem α-MEM Medium metabolisch markiert.
Beispiel 5
Zellextraktion und Bindungsassay
Nach metabolischer Markierung der Proteine mit [³⁵S] Methionin wurde die Zellen 3 Mal mit Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) und in hypotonischem Puffer (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4) enthaltend Protease Inhibitoren (2mM PMSF, 3 μg/ml Leupeptin, 4 μg/ml Pepstatin A und 1 μg/ml Aprotinin) aufgenommen und für 30 Minuten auf Eis gehalten. Zellen wurden durch Homogenisierung in einem hypotonischen Puffer lysiert und das Zelllysat bei 6000 × g für 10 Minuten sequentiell zentrifugiert. Nach der letztgenannten Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und auf eine Endkonzentration von 0.5 M NaCl aus einer Stammlösung von 4 M NaCl eingestellt. Das Zelllysat wurde auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Die Probe wurde gemischt und auf eine Endkonzentration von 0.1 M NaCl zurückgebracht. Das Zelllysat wurde für 10 Minuten bei 15,000 × g bei 4°C zentrifugiert. Der letztgenannte Überstand wurde entfernt und noch mal bei 100,000 × g für 60 Minuten in einer Beckmann Ultrazentrifuge mit einem SW55 Rotor zentrifugiert. Die Proteinmenge in den oben genannten Proben wurde mittels des Lowry Verfahrens bestimmt (69).
Für einen Bindungsassay wurden [³⁵S] Methionin markierte Proteine aus vollständigem Zelllysat mit einem gleichen Volumen an 3–6% BSA in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gemischt, mit überlappenden Hexapeptiden, die kovalent an Polypropylen Stäbchen fixiert sind, inkubiert. Die Peptide und vollständigen Zelllysate wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Stäbchen wurden dann entfernt und vier Mal in PBS gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden durch Inkubation der mit Peptid fixierten Stäbchen in 1 × SDS Probenpuffer für 60 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln eluiert. Die mit Peptid fixierten Stäbchen wurden durch Inkubation in PBS, enthaltend 2% SDS und 1 mM β-Mercaptoethanol bei 65°C, mit einem Sonikator für 30 Minuten regeneriert. Nach der letztgenannten Inkubation wurden die Stäbchen für fünf Minuten in 65°C ionisiertem Wasser und zwei Minuten in 65°C Methanol gewaschen. Die mit Peptiden fixierten Stäbchen sind nun für die nächste Runde der Durchmusterung fertig. In Fällen, bei denen die Effekte der zahlreichen Detergentien auf die Bindung getestet wurden [³⁵S] Methionin markierte Proteine aus vollständigem Zelllysat mit einem gleichen Volumen an 3% BSA in Phosphat gepufferter Salzlösung enthaltend KCl (300 mM bis 1200 mM), SDS (0.12% bis 2%), oder CHAPS (20 mM bis 160 mM) gemischt und, wie oben beschrieben, mit kovalent fixierten Peptiden inkubiert.
Beispiel 6
Polyacrylamid Gel Elektrophorese und Western Blotting
Protein Fraktionen (100–150 μl) wurden auf SDS-PAGE mit dem Laemmli Gelystem (62) aufgetrennt. Kurz gesagt, wurden die Proteine in 1× Solubilisierungs Puffer I (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, enthaltend 2% (w/v) SDS, 10% (w/v) Glyzerin und 5% β-Mercaptoethanol) aufgelöst und die Proben bei konstanter Stromstärke der Elektrophorese unterzogen. Gelscheiben enthaltend die aufgetrennten Proteine wurden in 50% Methanol und 10% Essigsäure fixiert. Polyacrylamid Gele enthaltend [³⁵S] Methionin Proteine wurden nach einer dreißig Minuten Inkubation in einer Amplify^TM Lösung (Amersham Inc.) Kodak Röntgenfilm ausgesetzt.
Alternativ wurden die Proteine auf Nitrozellulosemembran in Tris-Glyzin Puffer in der Gegenwart von 20% Methanol gemäß dem Verfahren von Towbin et al. (108) für die Western Blot Analyse transferiert. Vor der Zugabe der anti-α oder anti-β monoklonalen Tubulin Antikörpern (0.5 μg/ml in 3% BSA; Amersham, Inc.) wurde die Nitrozellulosemembran in 5% Magermilch/PBS inkubiert. Nach zahlreichen Waschungen mit PBS wurde die Nitrozellulose Membran mit Ziegen Anti-Maus Peroxidase-konjugierten Antikörper inkubiert und die immunoreaktiven Proteine wurden durch Chemolumineszenz mit der ECL Methode (Amersham, Inc.) sichtbar gemacht.
Beispiel 7
Proteinaufreinigung und N-terminale Sequenzierung
Das 57 kDa assoziierte Protein wurde unter Verwendung eines Blocks von Polypropylen Stäbchen mit zwei Hochaffinitätsbindungs-Peptiden aufgereinigt. Kurz gesagt, wurden die mit Peptid fixierten Stäbchen, wie oben beschrieben, mit vollständigem Zelllysat inkubiert; allerdings war in diesem Fall die Trägersubstanz Gelatine (1%). Die gebundenen Proteine wurden in 100 mM Phosphat Puffer, pH 7.4 enthaltend 2% SDS und 0.1% β- Mercaptoethanol eluiert. Die eluierten Proteine wurden durch Mischung mit 9 Volumen eiskalten Ethanols gefällt und bei –20°C inkubiert. Nach Hochgeschwindigkeitszentrifugation der letztgenannten Probe (15 Minuten Zentrifugation bei 15,000 × g bei 4°C) wurden die gefällten Proteine in 1% SDS in PBS aufgenommen und mit einem gleichen Volumen 2× SDS Laemmli Proben Puffer (62) gemischt. Protein Proben wurden über ein 10% SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF Membranen transferriert. Die Wanderung der 57 kDa Bande wurde durch Anfärbung der PVDF Membran mit Ponceau S sichtbar gemacht. Die PVDF Membran enthaltend die 57 kDa Bande wurde ausgeschnitten und der Proteinsequenzierungs-Einrichtung am Biotechnologie Service Centre in Toronto, Ontario, übergeben. Aminosäuresequenzierung der Peptide wurde gemäß dem Verfahren von Edman und Begg (27) durchgeführt unter Verwendung eines Applied Biosystems Gas-Phase Model 470 A Sequenators^TM gemäß des von Flynn (33) beschriebenen Verfahrens.
Beispiel 8
Identifizierung eines P-gp Wechselwirkungsproteins
Wie oben erklärt, ist P-gp ein tandemartig dupliziertes Molekül bestehend aus zwei Hälften, wobei jede davon für sechs Transmembrandomänen und eine ATP Bindungsdomäne kodiert. Die zwei Hälften von P-gp sind durch eine Verbindungsdomäne verbunden. Von den 90 Aminosäuren, die die Verbindungsdomäne bilden, sind 32 Aminosäuren bei physiologischem pH entweder positiv oder negativ geladen. Während P-gp Phosphorylierungstellen für die P-gp Funktion wichtig zu sein scheinen, bleiben die Funktionen der Verbindungsdomäne von P-gp unbekannt. Um die Rolle dieser Domäne im MDR zu identifizieren und zu analysieren, wurde das Verfahren der überlappenden Peptide der vorliegenden Erfindung verwendet. Ein neuer Ansatz wurde entwickelt, um wechselwirkende Proteine mit überlappenden synthetischen Hexapeptiden zu isolieren. Die Verwendung überlappender Peptide, um wechselwirkende Proteine zu isolieren, erlaubt die spezifische Identifikation von wechselwirkenden Proteinen und umgeht viele der Probleme, die mit der Verwendung zufälliger Peptide einhergehen. 5 zeigt die Aminosäuresequenzen der Verbindungsdomäne von HP-gp 1 und HP-gp 3. Die zwei Verbindungsdomänen von HP-gp 1 und HP-gp 3 besitzen 41% Aminosäuresequenz Identität und 66% Sequenzhomologie. Überlappende Hexapeptide wurden parallel auf derivatisierten Polyproylen Stäbchen synthetisiert, wie zuvor beschrieben (36, 37). 92 und 90 Hexapeptide wurden synthetisiert, um die gesamte Verbindungssequenz von HP-gp1 bzw. HP-gp3 abzudecken. Die Hexapeptide bleiben kovalent an die Polypropylen Stäbchen geheftet.
Um die Proteine zu identifizieren, die mit den zahlreichen Hexapeptiden der Verbindungsdomänen wechselwirken, wurden die mit Peptid fixierten Stäbchen mit [³⁵S] Methionin metabolisch markierten vollständigem Zelllysat aus CEM oder CEM/VLB^1.0 Zellen inkubiert. Nach Abwaschen der unspezifisch bindenden Lysatproteine, wurden die spezifisch bindenden Proteine mit SDS enthaltenden Puffern eluiert und über SDS-PAGE aufgetrennt. 6 zeigt die Proteine, die spezifisch an die 92 überlappenden Hexapeptide der HP-gp1 Verbindungssequenz gebunden sind. Drei Regionen der HP-gp1 Verbindungsdomäne (⁶¹⁷EKGIYFKLVTM⁶²⁷, ⁶⁵⁷SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA⁶⁷⁶ und ⁶⁹³PVSFWRIMKLNLT⁷⁰⁵) banden ein 57 kDa Protein. Die Hexapeptide mit den Nummern 46–60, 81–89 und 5–9 (siehe 5) banden mit abnehmender Affinität an das 57 kDa Protein (6). Darüber hinaus zeigten die Peptide 46–60 Bindung an zwei andere Proteine mit apparenten Molekularmessen von 80 kDa und 30 kDa, allerdings viel schwächer als an das 57 kDa Protein. Es ist wahrscheinlich, dass die letztgenannten Proteine (80 kDa und 30 kDa) mit dem 57 kDa assoziiert sind, da diese Proteine nachweisbar sind, wenn die Intensität des 57 kDa Proteinsignals hoch ist (6, Peptide 50–56). Der Vergleich der Aminosäuresequenzen der drei 57 kDa Bindungsproteine enthüllte keine signifikante Homologie zwischen diesen, die ihre Bindung an das gleiche Protein erklären könnte. Interessanterweise, kodiert allerdings die Aminosäuresequenz der zweiten Region (Peptide 46–60) für Protein Kinase C Konsensus Sequenzen (15). Außerdem wurde gezeigt, dass die dritte Region (Peptide 81–89) für eine Protein Kinase A Stelle kodiert (43).
Um die Bindungsaffinität zwischen den Sequenzen der Hexapeptide und dem 57 kDa Protein zu bestimmen, war es von Interesse, den Einfluss von Hochsalz (0.3–2.4 M KCl), zwitterionischen Detergenz (10–160 mM CHAPS) und ionischen Detergentien (0.1%–2%SDS) auf die Wechselwirkungen zwischen den Hexapeptiden, die von ⁶⁵⁷SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA⁶⁷⁶ kodiert werden, und dem 57 kDa Protein zu bestimmen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Bindung unter Hochsalz stabil ist, moderat stabil ist gegenüber hohen Konzentrationen an CHAPS, aber sensitiv ist gegenüber geringen Konzentrationen an SDS (7). Vor dem Hintergrund der Stabilität der Proteinbindung an kovalent angeheftete Proteine in Gegenwart von 10 mM CHAPS, war es von Interesse, die Bindung der Hexapeptide der HP-gp 1 Verbindungsdomäne an CHAPS lösliche Proteine, die integrale Membranproteine beinhalten könnten, zu bestimmen. Die Ergebnisse in 8 zeigen Proteine gebunden an dieselben überlappenden Hexapeptide, die für die Verbindungsdomäne von HP-gp1 kodieren. Obwohl die Hexapeptide mit den Nummern 46–60, 81–89 und 5–9 (siehe 5) an das 57 kDa Protein banden, zeigte sich bei anderen Proteinen, dass sie mit den gleichen oder anderen Hexapeptiden wechselwirken, die keine Proteine in Abwesenheit von 10 mM CHAPS binden. Zum Beispiel banden Hexapeptide 3–10 an das 210 kDa Protein, das ohne CHAPS nicht nachgewiesen wurde. Ähnlich banden Hexapeptide 16–20, die ohne CHAPS keine Protein banden, an das gleiche Protein mit hohem Molekulargewicht (7). Peptide 40–60 banden stärker an zahlreiche Niedermolekulagewichtsproteine (~45–25 kDa) in der Gegenwart von CHAPS. Die Hexapeptide 80–89 banden zusätzlich zu dem 57 kDa Protein an zwei andere Proteine. Zusammen genommen belegen die Ergebnisse in 8, dass die Bindung zwischen den verschiedenen Hexapeptiden an das 57 kDa Protein resistent ist gegenüber milden zwitterionischen Detergentien wie CHAPS. Darüber hinaus zeigt die Solubilisierung von Membranproteinen in 10 mM CHAPS Bindung an andere Proteine, die in der Abwesenheit von 10 mM CHAPS, nicht gesehen werden. Eine Möglichkeit ist, dass 10 mM CHAPS den integralen Membranproteinen erlaubt mit den verschiedenen Hexapeptiden der HP-gp 1 Verbindungsdomäne zu wechselwirken. Alternativ legt CHAPS neue Domänen frei, die ihrerseits die Bindung an die Hexapeptide der HP-gp1 Verbindungsdomäne erlauben. Außerdem können einige der Proteine mit geringerem Molekulargewicht, die an die Hexapeptide 40–60 und 80–89 binden, Abbauprodukte des 57 kDa Proteins sein.
Die P-gp Genfamilie im Menschen ist durch zwei Isoformen kodiert, HP-gp 1 und HP-gp 3 (oder mdr 1 und mdr 3; (20)). Wie allerdings bereits vorher bemerkt, führt nur HP-gp 1 zu dem MDR Phänotyp. Obwohl HP-gp 1 und 3 etwa 80% Aminosäuresesequenz-Homologie besitzen (111), ist die Verbindungsdomäne die am stärksten variable Domäne unter den zwei Isoformen mit 66% Aminosäuresequenz-Homologie. Um zu bestimmen, ob die HP-gp 3 Verbindungsdomäne an die gleichen oder andere Proteine bindet, wurden überlappende Hexapeptide, die für die HP-gp 3 Verbindungsdomäne kodieren, auf Polypropylen Stäbchen synthetisiert und ihre Bindung an lösliche Protein wurde, wie oben beschrieben, untersucht. 9 zeigt die Profile von Proteinen, die an die Hexapeptide von HP-gp 3 binden. Interessanterweise band auch ein Protein mit ähnlichem Molekulargewicht (57 kDa) an die Hexapeptide von HP-gp 3. Allerdings war die Bindung an einige Hexapeptide anders als die bei HP-gp 1 gesehene (6 gegenüber 9). Von HP-gp 3 banden drei größere Aminosäuren Abschnitte an das 57 kDa Protein (⁶¹⁸LMKKEGVYFKLVNM⁶³¹, ⁶⁴⁸KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS⁶⁷⁴ und ⁶⁹⁵PVSFLKVLKLNKT⁷⁰⁷). Die erste und die dritte Region der HP-gp 3 Verbindungsdomäne weist eine beträchtliche Sequenzidentität mit der ersten und dritten Region der HP-gp 1 Verbindungsdomäne auf (10). Daher ist es nicht verwunderlich, dass die gleichen Hexapeptide an das gleiche Protein banden. Die zweite Region der HP-gp 1 und HP-gp 3 Verbindungsdomäne sind verschieden (10). Konsequenterweise ist die Wechselwirkungsregion zwischen HP-gp 3 und dem 57 kDa Protein größer als die des HP-gp 1 (6 und 9), obwohl sowohl HP-gp 1 als auch HP-gp 3 Sequenzen an ein 57 kDa banden. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von HP-gp 1 und HP-gp 3, die Hexapeptide binden, wird in 10 gezeigt.
Beispiel 9
Aufreinigung und Sequenzierung des 57 kDa Proteins
Um die Identität des 57 kDa Proteins zu bestimmen, wurden zahlreiche Kopien der zwei Hexapeptide (⁶⁵⁸RSSLIR⁶⁶³ und ⁶⁶⁹SVRGSQ⁶⁷⁴) aus der zweiten Region der HP-gp 1 Verbindungsdomäne synthetisiert. Die letztgenannten Hexapeptidsequenzen waren diejenigen, die mit der höchsten Affinität an das 57 kDa Protein banden. 11 zeigt die Bindung dieser zwei Peptide an vollständiges Zelllysat aus mit [³⁵S] Methionin metabolisch markierten Zellen. Beide Hexapeptide banden spezifisch an das 57 kDa Protein und ein anderes Protein mit der apparenten Molekularmasse von ~41 kDa. Interessanterweise, führten längere Inkubationszeiten des vollständigen Zelllysats zu einer Erhöhung der Menge des 41 kDa Proteins (11). Daher ist die 41 kDa Bande wahrscheinlich ein Abbauprodukt des 57 kDa Proteins.
Um das 57 kDa Protein mit Hilfe der zwei Hexapeptide aufzureinigen, war es von Interesse zu bestimmen, ob statt BSA andere Trägerproteine verwendet werden können. 12 zeigt die Auswirkungen von keinem blockierenden Träger, 1% Gelatine und 0.3% oder 3% BSA auf die Bindung der Hexapeptide an das 57 kDa Protein. Die Ergebnisse dieses Experiments waren überraschend, in so fern als kein Trägerprotein notwendig war, um die unspezifische Bindung zu reduzieren (12). Die zu letzt genannten ermittelten Bindungsbedingungen wurden verwendet, um große Mengen des 57 kDa Proteins zu isolieren, die an mehrere Kopien der Hexapeptide ⁶⁵⁸RSSLIR⁶⁶³ und ⁶⁶⁹SVRGSQ⁶⁷⁴ banden. 13 zeigt aufgereinigtes 57 kDa Protein auf SDS-PAGE angefärbt mit Commassie Blau. Das zu letzt genannte aufgereinigte Protein wurde auf PVDF Membran transferiert und mit Ponceau S angefärbt, um die Position des 57 kDa Proteins zu bestimmen. Die mit Ponceau S angefärbte Bande, die mit der erwarteten Molekularmasse wanderte, wurde ausgeschnitten und für die direkte N-terminale Sequenzierung verwendet (33). Die ersten sieben Runden des Edman Abbaus zeigten zwei Sequenzen MREVISI und MREIVHI. Diese zwei Sequenzen unterschieden sich nur um drein Aminosäuren (VIS statt IVH). Vergleich der zwei Sequenzen mit bekannten Proteinsequenzen mittels der FastA Proteinsuchmaschiene zeigte, dass die zwei zu letzt genannten Sequenzen, die ersten sieben N-terminalen Aminosäuren des α- und β-Tubulins kodierten. Die Identifikation der Tubuline, wie des 57 kDa Proteins war konsistent mit der apparenten Molekularmasse und den möglichen Abbauprodukten, die nach langen Inkubationsperioden beobachtet wurden. Um die Identität des 57 kDa Proteins als Tubulin weiter zu bestätigen, wurden mit dem Hexapeptid gebundenen 57 kDa Protein und vollständigem Zelllysat, die über SDS-PAGE aufgetrennt wurden, und auf Nittozellulosemembran transferiert wurden, eine Western Blot Analyse durchgeführt. Die Nitrozellulosemembran wurde dann mit monoklonalen anti-α-Tubulin bzw. anti-β-Tubulin Antikörpern als Sonden inkubiert. 14 zeigt die Ergebnisse der Western Blot Analyse. In Einklang mit den Sequenzierungsergebnissen, wurden beide Tubulin Untereinheiten (α und β) in den Spuren erkannt, die die Hexapeptid gebundenen Proteine enthalten. Daher konnte die Identität des 57 kDa Proteins als α und β-Tubulin ermittelt werden.
Beispiel 10
Die Leistungsfähigkeit des Verfahrens mit überlappenden und umspannenden Peptiden wurde daher durch P-gp belegt. Wie oben gezeigt, stellt das auf überlappenden Peptiden basierte Verfahren der vorliegenden Erfindung den prinzipiellen Beweis der Hypothese dar, nach der die Region zwischen zwei wechselwirkenden Proteinen aus Hochaffinitätsbindungssequenzen und abstoßenden Sequenzen besteht und belegt auch die Tatsache, dass ein derartiges Verfahren effizient und erfolgreich benützt werden kann, um Domänen und Sequenzen der wechselwirkenden Proteine zu identifizieren und charakterisieren. Das Gleichgewicht der Hochaffinitäts- und Abstoßungskräfte bestimmt, ob zwei Proteine eine stabilen Komplex bilden werden. Die Verwendung von kurzen überlappenden Peptiden erlaubt die Identifikation von derartigen Hochaffinitätsbindungssequenzen zwischen Köder und Beute Proteinen. Die Überlegung kurze überlappende Peptide zu verwenden, um Hochaffinitätsbindungssequenzen zu isolieren, ist essentiell für den Erfolg und die Effizienz des Beweises des hier beschriebenen Prinzips. Zum Beispiel könnten größere Peptide sowohl Hochaffinitäts- als auch Abstoßungsbindungssequenzen in einer Peptidsequenz besitzen, mit der Wirkung, dass die Summe der Wechselwirkungskräfte negativ ist. Darüber hinaus verringert die Verwendung überlappender Peptide, die sich um eine Aminosäure von dem vorherigen und folgenden Peptid unterscheiden, die Möglichkeit der unspezifischen Bindung. Daher weisen überlappende Peptide oft einen Höchstwert der Bindungsaffinität verschiedener Peptide auf (siehe 7 und 4). Für den Fachmann ist es klar, dass auch längere überlappende Peptide verwendet werden können. Bedauerlicherweise, erhöhen solche größeren Peptide das Risiko, dass die Identifikation der wechselwirkenden Proteine wegen einer Änderung des Gleichgewichts zwischen den Hochaffinitäts- und Abstoßungsaminosäuren fehlschlägt.
Die Bindung der 57 kDa Proteins an drei verschiedene Regionen in HP-gp1 und HP-gp3 Verbindungsdomänen ist konsistent mit der hier vorgeschlagenen Hypothese Proteinwechselwirkungen zu erklären (siehe Prinzip der Protein-Protein Wechselwirkungen). Die Hochaffinitätsbindungsdomänen schwanken um die Länge von 10–26 Aminosäuren. Im Fall der HP-gp1 und HP-gp3 Verbindungsdomänen besitzen zwei der drei Hochaffinitätsbindungsregionen eine beträchtliche Sequenzidentität. Die dritte Hochaffinitätsregion der Verbindungsdomänen (⁶⁵⁸SRSSLIRKRSTRRSVRGSQA⁶⁷⁷ gegenüber ⁶⁴⁸KAATRMAPNGWKSRLFRHSTQKNLKNS⁶⁷ ⁴) besitzt keine Homologie bezüglich ihrer primären Aminosäuresequenz. Allerdings zeigt die Helixrad Darstellung dieser zwei Domänen einen Anhäufung von positiv geladenen Resten auf der einen Seite der Helix, anderseits eine Anhäufung von Serin/Threonin Resten auf der anderen Seite (siehe 15). Interessanterweise kodiert die Region mit der höchsten Bindungsaffinität zu dem 57 kDa Protein die drei vermuteten Phosphorylierungsstellen in HP-gp 1 (15). Die Positionen der Phosphorylierungsstellen in HP-gp 3 sind nicht experimentell bestimmt worden, allerdings kodieren sie für die Konsensussequenz von Protein Kinase C. In dieser Hinsicht ist es möglich, dass HP-gp 1 und HP-gp 3 Wechselwirkungen an den Verbindungsdomänen durch Phosphorylierung dieser Domäne moduliert werden. So wurde für andere vorgeschlagene Funktionen von HP-gp 1 (z.B. Regulator des endogenen Chlorid Kanals) gezeigt, dass sie durch seinen Phosphorylierungsstatus beeinflusst werden (41, 110), obgleich für Mutationen der P-gp Phosphorylierungsstellen innerhalb der Verbindungsdomäne nicht gezeigt wurde, dass sie seine Medikamenten-Transportfunktion beeinflussen (40). In der Tat zeigte sich, dass ein Mitglied der ABC Transporter, CFTR (der zystische Fibrose Transmembran-Regulator), der eine ähnliche Verbindungsdomäne kodiert, mit dem Mikrotubuli Netzwerk kolokalisiert (107). Weiterhin war die Mikrotubuli abhängige Rekrutierung von CFTR an die apikale Plasmamembran von T84 Zellen empfänglich für Erhöhungen des intrazellulären cAMP und für die Phosphorylierung der Verbindungsdomäne (107). Zusammengenommen, obwohl nicht klar ist, ob Phosphorylierung eine Rolle bei der Modellierung von P-gp Funktionen in einer Tubulin abhängigen Weise spielt, und vor dem Hintergrund der Kolokalisation von HP-gp 1 Phosphorylierung und Bindung an Tubulin, ist solche eine Möglichkeit wahrscheinlich. Es wird gerade daran gearbeitet herauszufinden, ob unter Verwendung des hier beschriebenen Assays phosphorylierte Hexapeptide an Tubulin binden. Daher öffnet die vorliegende Erfindung die Tür zu einer Überprüfung einer physiologisch bedeutenden Wechselwirkung zwischen proteinartigen Domänen.
Die Möglichkeit, dass das 57 kDa Protein an die Polypropylen Stäbchen oder ihre derivatisierten Einheiten bindet, ist unwahrscheinlich, da alle anderen Stäbchen, die ähnlich derivatisiert waren, nicht das 57 kDa Protein banden. Darüber hinaus banden Hexapeptide, die bei mindestens vier verschiedenen Gelegenheiten synthetisiert wurden, an die gleichen Proteine. Schließlich banden Hexapeptide, die die erste und dritte Hochaffinitätsbindungsregion der Verbindungsdomäne von HP-gp 1 und HP-gp 3 kodierten, an das 57 kDa Protein. Zusätzlich zu dem 57 kDa Protein, banden auch andere Proteine mit apparenten Molekularmassen von ~80 kDa und 30 kDa an einige der Hexapeptide in den Verbindungsdomänen. Allerdings war die Bindung dieser Proteine wesentlich schwächer als die des 57 kDa und vielleicht assoziierter Proteine. Obwohl direkte Messungen der Bindungsaffinitäten zwischen den verschiedenen Hexapeptiden und dem 57 kDa Protein nicht gemacht wurden, ist es interessant, dass diese Wechselwirkung resistent ist gegenüber 10 mM CHAPS und Hochsalz. Darüber hinaus führte die Gegenwart von 10 mM CHAPS in der Inkubationsmischung zu der Bindung anderer Proteine (am erwähnenswertesten des ~210 kDa Proteins) an zahlreiche Hexapeptidstränge, die ohne 10 mM CHAPS nicht binden. Die Bindung der letztgenannten Proteine an die Hexapeptide 15–28 ist wahrscheinlich zurückzuführen auf die Extraktion von Proteinen aus dem membranösen Material, die in der Abwesenheit von CHAPS ausgeschlossen waren. In der Abwesenheit von CHAPS enthielt das Zelllysat lösliche Proteine und membran-assoziierte Proteine.
Die Signifikanz der HP-gp 1 oder HP-gp 3 Bindung an Tubulin ist nicht klar. Allerdings zeigte sich, dass Tubulin mit zahlreichen Membranproteinen wechselwirkt (42, 50, 81, 86). HP-gp 1 oder HP-gp 3 Wechselwirkungen mit Tubulin und vielleicht den Mikrotubuli könnte ein Beispiel für das Membranskelett Zaun Modell sein (56). In diesem Modell scheint eine kleine Fraktion der Membranrezeptoren an das darunter liegende Zytoskelett fixiert zu sein (95). In dieser Hinsicht ist es interessant, dass ein Anstieg der Stabilität und der Expression von P-gp in Rattenlebertumoren in vivo mit ähnlichen Anstiegen der Stabilität zahlreicher Zytoskelett Proteine, einschließlich α-Tubulin, β-Actin, und Zytokeratin 8/18, einher geht (64). Er wird zur Zeit daran gearbeitet die funktionale Bedeutung der P-gp Wechselwirkungen mit Tubulin in vivo zu bestimmen
Beispiel 11
Das Verfahren mit überlappenden und umspannenden Peptiden ist nicht auf Pgp-wechselwirkende Proteine beschränkt
Der Ansatz mit überlappenden Peptiden der vorliegenden Erfindung wurde weiter mit Annexin I, das im Gegensatz zum P-Glykoprotein, welches ausschließlich ein Transmembran Protein ist, ein lösliches und Membran assoziiertes Protein ist, überprüft. Annexin ist daher strukturell und funktionell von P-Glykoprotein verschieden.
Mittels dieses Ansatzes wurden zahlreiche Proteine, die mit Annexin I wechselwirken, und die genauen Aminosäuresequenzen von Annexin I, die diese Wechselwirkungen vermitteln, identifiziert. Annexin I ist ein Mitglied einer großen Familie von intrazellulären löslichen und Membran assoziierten Proteinen, die Phospholipide in einer reversiblen und Calcium abhängigen Weise binden. Viele Mitglieder der Annexin Familie werden mit einer Reihe von verschiedenen intrazellulären Vorgängen, einschließlich Vesikelverkehr, Membranfusions-Exocytose, Signalübertragung, und Ionenkanalbildung und Medikamentenresistenz, in Verbindung gebracht. Nimmt man die vielen möglichen physiologischen Funktionen von Annexin I in Betracht, war das Verfahren der vorliegenden Erfindung darauf gerichtet, die mit ihm wechselwirkenden Proteine und die genauen Aminosäuresequenzen, die Annexin I Wechselwirkungen mit diesen vermitteln, zu identifizieren.
Kurz gesagt wurden, wie bereits beschrieben, überlappende Peptide korrespondierend zu der gesamten Aminosäuresequenz von Annexin I (insgesamt ~340 Peptide plus Kontrollen) auf einem festen, wie oben beschriebenen, Träger synthetisiert. In diesem Fall wurden, statt Hexapeptiden, überlappende Heptapeptide benützt. Die Peptide wurden dann mit vollständigen zellulären Proteinen, isoliert aus MCF7 Brusttumorzellen, die metabolisch mit [³⁵S] Methionin markiert waren, inkubiert. Nach zahlreichen Waschungen, wurden die gebundenen Proteine eluiert und auf SDS-PAGE, wie oben angedeutet, aufgetrennt. Die Ergebnisse sind mit den vorherigen Ergebnissen mit P-Glykoprotein konsistent, da das Verfahren zur Identifikation zahlreicher Inseln von Annexin I Aminosäuresequenzen führt (Daten nicht gezeigt), die mit fünf Proteinen wechselwirken, die Molekularmassen von 10 kDa bis zu 200 kDa (genau ~10 kDa; ~29 kDa; ~85 kDa; 106 kDa und 200 kDa) besitzen. Kurz gesagt, wurden acht wechselwirkende Domänen, die eine hohe Affinität für die zellulären Proteine des Extraktes haben, identifiziert. Zwei dieser Hochaffinitätsinseln wurden in der Schwanzdomäne von Annexin lokalisiert (Reste 1–36) und sechs in den a helikalen Bündeln von Annexin I (Reste 37 bis zum Ende; siehe zum Beispiel WO 99/21980). Die Identität der letztgenannten wechselwirkenden Proteine wird gegenwärtig untersucht. Allerdings ist die Wechselwirkung eines 10 kDa Proteins mit Annexin I konsistent mit früheren Arbeiten, die eine direkte Wechselwirkung zwischen Annexin I und S100C Protein belegten (70).
Daher wurde gezeigt, dass die vorliegende Erfindung sowohl die einfache und effiziente Identifikation einer Hochaffinitäts-Proteinwechselwirkung als auch die gleichzeitige Identifikation der genauen Aminosäuresequenz mindestens eines wechselwirkenden Partners ermöglicht.
Schlussfolgerungen
Es folgt, dass ein einfacher Ansatz, um P-gp wechselwirkende Proteine aus einem vollständigem Zelllysat zu identifizieren, verwendet wurde. Darüber hinaus erlaubt der Ansatz die Identifikation der genauen Aminosäuresequenzen in P-gp 1 und P-gp 3 Verbindungsdomänen, die Proteinwechselwirkungen mit Tubulinen vermitteln. Zusätzlich erlaubt das Wissen um die Hochaffinitätsbindungssequenzen die nachfolgende Aufreinigung der wechselwirkenden Proteine aus einer vollständigen Mischung von zellulären Proteinen, wie anhand des Beispiels mit Annexin I dargestellt. In der Tat, in Anbetracht der Einfachheit dieses Ansatzes, um Protein-Protein Wechselwirkungen zu studieren, lässt er sich leicht auf andere Proteine anwenden. Schließlich ist unser Ansatz schnell und hat zahlreiche Vorteile gegenüber den gegenwärtig verwendeten Ansätzen.
Obwohl die vorliegenden Erfindung hier mittels bevorzugter Ausführungsformen beschrieben wurde, kann sie verändert werden, ohne vom Geist und der Natur der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
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120. WO 98 15833A
121. WO 84 03564A

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines Agens, das eine Interaktion zwischen mit hoher Affinität interagierenden Domänen zwischen einer Gruppe von überlappenden Peptiden moduliert, welche eine vollständige Sequenz von einem ausgewählten Protein, Domäne davon oder Teil davon umspannen, die kovalent an einen Träger gebunden sind und einem Gemisch von Proteinen, wobei das Gemisch von Proteinen ein Gemisch von zellulären Proteinen ist, umfassend: a) Inkubieren der Gruppe von überlappenden Peptiden mit dem Gemisch in der Gegenwart von mindestens einem Agens, unter Bedingungen, welche die Bindung zwischen einer mit hohen Affinität interagierenden Domäne in einem Peptid von der Gruppe und einem oder mehreren Proteinen oder Peptiden von dem Gemisch ermöglicht, b) Abwaschen einer bestehenden Protein-Protein-Interaktion, welche keine Hochaffinitätsinteraktion von a) ist; und c) Identifizieren, welches Peptid von a) mit hoher Affinität an ein Protein oder Peptid des Gemisches in der Gegenwart des Agens im Ver gleich zu dessen Abwesenheit interagiert, wobei dadurch das Agens als ein Modulator der Hochaffinitätsinteraktion identifiziert wird, wenn sich die Interaktion in der Gegenwart von diesem Agens messbar von der in dessen Abwesenheit unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gemisch von Proteinen und/oder Gemisch von Peptiden eine Markierung enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Gruppe von überlappenden Peptiden unter Verwendung der Sequenz des ausgewählten Proteins synthetisch synthetisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Träger ausgewählt ist aus einem Chip, einem Bead oder einer Platte.