DE19964386B4

DE19964386B4 - Verfahren zur Herstellung von Makrophagenmigrations-Inhibitionsfaktor (MIF)

Info

Publication number: DE19964386B4
Application number: DE19964386A
Authority: DE
Inventors: Herwig Prof. Dr. Brunner; Jürgen Dr. Bernhagen; Robert Kleemann; Ralf Mischke; Afroditi Dr. Kapurniotu
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1999-11-26
Filing date: 1999-11-26
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2019-11-27
Also published as: DE19964287B4

Abstract

Verfahren zur Herstellung von MIF, umfassend
a) Bereitstellung einer MIF enthaltenden ersten Quelle
b) Inkontaktbringen der MIF enthaltenden ersten Quelle mit einer Jab enthaltenden zweiten Quelle unter Bedingungen, die die Bindung von MIF und Jab erlauben, und
c) Abtrennen von MIF und Jab.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von MIF (Makrophagenmigrations-Inhibitionsfaktor).
Als Reaktion auf eine antigene oder mitogene Stimulation sezernieren Lymphocyten als Lymphokine bezeichnete Protein-Mediatoren, die bei der Regulation von Immunreaktionen, Entzündungsreaktionen, Stress-Reaktionen und Effektormechanismen der zellulären Immunität eine Rolle spielen. Die zuerst beschriebene Lymphokin-Aktivität wurde in Kulturüberständen von antignisch sensibilisierten und aktivierten Meerschweinchen-Lymphocyten beobachtet. Aufgrund ihrer Fähigkeit, in vitro die Migration von Meerschweinchen-Makrophagen aus Kapillargefäßen zu verhindern, wurde diese Aktivität als Migrations-Inhibitionsfaktor (MIF) bezeichnet. Der MIF ist auch als sezernierbares Produkt von Makrophagen, Hypophysenvorderlappen-Zellen und Endothelzellen identifiziert worden, das sowohl Makrophagen als auch T-Lymphocyten und bestimmte andere Zelltypen aktiviert.
Der Nachweis der MIF-Aktivität geht mit verschiedenen Entzündungsreaktionen einschließlich verzögerter Hypersensibilität und zellulärer Immunität, der Abstoßung allogener Transplantate, rheumatoider polyarthritischer Synovialis und Autoimmunkrankheiten einher. Außerdem weist der MIF enzymatische Aktivität auf und zeigt sowohl eine Tautomerase-Aktivität als auch eine Thiolprotein-Oxidoreduktase-Aktivität. Der MIF besitzt verschiedene Eigenschaften, die Enzündungen fördern. Es wurde gezeigt, daß der MIF in dieser Funktion ein Mediator mehrerer Entzündungserkrankungen ist, wozu durch gramnegative und grampositive Erreger bedingter septischer Schock und akute respiratorische Insuffizienz gehören, wobei seine entzündungsfördernden Eigenschaften teilweise auf seine Fähigkeit zur Induktion der Freisetzung anderer entzündungsfördernder Cytokine, wie Interleukin-1 und Tumornekrosefaktor, sowie auf die Gegenregulation der Glucocorticoid-Wirkung zurückzuführen sind. Der MIF spielt auch bei der Regulation der zellulären Redox-Homöostase eine Rolle. Trotz funktioneller Ähnlichkeiten mit anderen Cytokinen zeigt der MIF eine Reihe charakteristischer Merkmale. Beispielsweise ist die MIF-Expression nicht auf Zellen des Immunsystems und des endokrinen Systems beschränkt und das MIF-Protein ist in den meisten MIF exprimierenden Zellen als Vorform zu finden.
Obwohl sie eine enorme Bedeutung für die Entwicklung diagnostischer und therapeutischer Mittel für im Zusammenhang mit dem MIF stehende Krankheiten haben, sind die molekularen Ziele der MIF-Wirkung nicht identifiziert worden. Der MIF könnte direkte intrazelluläre Funktionen besitzen, die auf Wechselwirkungen mit intrazellulären Proteinen basieren. Moleküle, sogen. Arzneistoffe, die die Wechselwirkung des MIF mit anderen Proteinen unterbrechen, verhindern, steigern oder modulieren, können die Schlüsselrolle des MIF bei der Zellzyklus-Kontrolle, der Modulation von Immunreaktionen, Redox-Wirkungen und Regulations-Wegen beeinflussen.
Prinzipiell kann die Wechselwirkung des MIF mit anderen Proteinen mit Hilfe eines Zweihybrid-Systems getestet werden. Das Hefe-Zweihybrid-System ist zum Nachweis der Assoziation von Proteinpaaren verwendet worden (vgl. beispielsweise Fields et al., US-Patent Nr. 5,283,173). Dieses Verfahren umfaßt die Rekonstitution eines Transkriptionsfaktors aus zwei trennbaren Domänen in vivo. Die DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors ist zur Erkennung eines ausgewählten Promotors erforderlich. Die Aktivierungsdomäne ist zum Inkontakttreten mit anderen Bestandteilen des Transkriptionssystems der Zelle erforderlich. In diesem System wird der Transkriptionsfaktor unter Verwendung von Hybridproteinen rekonstituiert. Ein Hybrid besteht aus der Aktivierungsdomäne und einem ersten Protein von Interesse. Das zweite Hybrid besteht aus der Bindungsdomäne und einem zweiten Protein von Interesse. Falls das erste Protein von Interesse und das zweite Protein von Interesse in Wechselwirkung miteinander treten, werden die Aktivierungsdomäne und die Bindungsdomäne in unmittelbare physische Nähe zueinander gebracht, wodurch der Transkriptionsfaktor rekonstituiert wird. Die Assoziation der Proteine kann gemessen werden, indem die Fähigkeit des rekonstituierten Transkriptionsfaktors zur Aktivierung eines Reportergens getestet wird.
Verfahren und Zusammensetzungen zum Screenen von Arzneistoffen sind bekannt (US-Patent Nr. 5,569,588). Ein Verfahren zur Modellierung der Fähigkeit eines Organismus, auf einen Arzneistoff-Kandidaten eine Transkriptionsreaktion zu zeigen, umfaßt beispielsweise (a) den Nachweis von Signalen eines Reportergen-Produkts bei jeder einer Vielzahl verschiedener, separat isolierter Zellen eines Zielorganismus, wobei jede Zelle ein rekombinantes Konstrukt enthält, das ein mit einem unterschiedlichen endogenen Transkriptions-Regulationselement des Zielorganismus funktionell verbundenes Reportergen umfaßt, so daß das Transkriptions-Regulationselement die Expression des Reportergens reguliert und die Zellen insgesamt eine Gruppe der Transkriptions-Regulationselemente des Organismus umfassen, die ausreicht, um die Fähigkeit des Organismus, auf einen Arzneistoff eine Transkriptionsreaktion zu zeigen, zu modellieren; (b) das Inkontaktbringen jeder Zelle mit einem Arzneistoff-Kandidaten; (c) den Nachweis von Signalen eines Reportergen-Produkts bei jeder Zelle; (d) den Vergleich der Signale eines Reportergen-Produkts bei jeder Zelle vor und nach Inkontaktbringen der Zelle mit dem Arzneistoff-Kandidaten, um das Profil der Reaktion auf den Arzneistoff zu erhalten, wobei ein Modell der Fähigkeit des Organismus, auf den Arzneistoff-Kandidaten eine Transkriptionsreaktion zu zeigen, bereitgestellt wird.
Daher ist anzunehmen, daß es besonders wichtig ist, Verfahren und Mittel zu entwickeln und bereitzustellen, die (i) den Nachweis der Wechselwirkung des MIF mit einem intrazellulären Zielmolekül, beispielsweise einem Protein, und (ii) die Identifizierung von Molekülen, die diese Wechselwirkung des MIF mit dem intrazellulären Zielmolekül modifizieren, erlauben.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht in der Bereitstellung von Verfahren zum Herstellen von MIF.
Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch Bereitstellung eines Verfahrens zum Herstellen von MIF gemäß Hauptanspruch.
Die vorliegende Erfindung basiert u.a. auf der Beobachtung, daß der MIF und das Jab in Wechselwirkung treten, insbesondere aneinander binden und so einen MIF/Jab-Komplex bilden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine große Bandbreite medizinischer Anwendungen, bei denen MIF/Jab-Komplexe eine wichtige Rolle spielen, z.B. Tinnitus oder allgemein mit dem Zellwachstum im Zusammenhang stehende Krankheiten.
Die Wechselwirkung zwischen dem MIF und dem Jab zeigt, daß ein Cytokin die zellulären Regulationsvorgänge durch direkte Wechselwirkung mit einem Transkriptions-Coaktivator modulieren kann. Die MIF-Jab-Wechselwirkung stellt die molekulare Basis für die hervorstechenden MIF-Aktivitäten dar.
Das Jab (an die Aktivierungsdomäne von c-Jun bindendes Protein), insbesondere Jab1, speziell p38^Jab1, ist ein 38K-Protein, das ursprünglich als spezifischer Coaktivator der Transkripitonsfaktoren c-Jun und JunD identifiziert worden ist und das auch als negativer Regulator des Inhibitors p27^Kip1 der Cyclin-abhängigen Kinase (CDK) wirkt. Die Funktion des Jab1 als Transkriptions-Coaktivator ist auf die Steigerung der AP-1-abhängigen Transkriptionsaktivität zurückzuführen. Das Jab1 ist ein Vertreter der Mov34-Proteinfamilie (Hofmann und Bacher, 1998; Asano et al., 1997). Der MIF hemmt die Steigerung der AP-1-Transkriptionsaktivität durch das Jab1. Man hat bestimmt, daß das Jab1 die N-terminale Kinase-Aktivität von c-Jun (JNK) aktiviert, wobei diese Wirkung durch den MIF deutlich herunterreguliert wird. MIF blockiert die Jab1- und TNF-vermittelte JNK- Aktivierung. MIF übt auch eine den Jab1-abhängigen Zellzyklus-Prozessen entgegenwirkende Regulation aus. Der MIF steigert die Expression von p27^Kip1 und hemmt die Jab1-vermittelte Rettung von Fibroblasten aus einer durch mangelhafte Nährstoffversorgung induzierten Wachstumshemmung. Die Wirkung des MIF besteht in einer allgemeinen negativen Regulation der von dem Jab1 kontrollierten zellulären Stoffwechselwege. Die MIF-Jab1-Wechselwirkung stellt die molekulare Basis für Schlüsselaktivitäten des MIF dar, da die MIF-Jab1-Wechselwirkung mit Stoffwechselwegen und zellulären und molekularen Zyklen verbunden ist, die im Kontext mit Krankheiten stehen, die mit dem MIF zusammenhängen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollte eine Reihe allgemeiner Begriffe wie folgt verwendet werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei einer "mit dem MIF im Zusammenhang stehenden Krankheit" um eine Krankheit, wie Arthritis, Carcinogenese, Nephritis, Proteinurie, Dermatitis, Diabetes/Fettleibigkeit, akute und chronische Abstoßung allogener Nierentransplantate, Nervenzell-Degeneration, Parkinson-Krankheit, septischer Schock, Endotoxinaämie, Hypersensibilität, Uveitis, Tinnitus, Wundverschluß/Zellwachstum. Der MIF spielt auch bei der Regulation des Immunsystems, Entzündungs- und Effektor-Mechanismen der zellulären und humoralen Immunität, septischem Schock, Augenentzündungen, bei der Regulation von Transkriptions- und Zellzyklen und akuter respiratorischer Insuffizienz, physiologischem Stress und anderen Störungen eine wichtige Rolle.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Arzneistoff" eine Substanz, die zur Diagnose und/oder Behandlung von Krankheiten, insbesondere von mit dem MIF im Zusammenhang stehenden Krankheiten, geeignet ist, vorzugsweise in einer Menge, die ausreicht, um eine solche Wirkung zu erzielen. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "Arzneistoff" bedeutet sowohl den Wirkstoff selbst als auch den Wirkstoff in Verbindung mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, Adjuvantien, anderen Wirkstoffen, usw.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Behandlung" die prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung eines Arzneistoffs.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft ein "den MIF und das Jab umfassendes System" ein System, in dem synthetisch hergestellte oder natürlich vorkommende MIF- und Jab-Proteine unter Bedingungen vorliegen, die gestatten, daß sie miteinander in Kontakt treten und aneinander binden, entweder unter natürlichen oder künstlichen Bedingungen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein den MIF und das J ab umfassendes System eine natürlich vorkommende Zelle oder eine mittels Rekombinationstechniken erzeugte Zelle. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das den MIF und das Jab umfassende System ein Rohextrakt sein, der aus den vorstehend beschriebenen Zellen oder aus anderen Quellen hergestellt worden ist, sofern diese den MIF und das Jab enthalten. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das den MIF und das Jab umfassende System beispielsweise ein in vitro-Translationssystem sein, das Elemente enthält, die die Erzeugung oder Aufreinigung reiner oder halbreiner MIF- und Jab-Proteine oder Fusionsproteine oder komplexer Proteine, die den MIF und das Jab insgesamt oder teilweise, entweder allein oder zusammen enthalten, erlauben.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff "MIF" sowohl den natürlich vorkommenden MIF als auch alle Modifikationen, Mutanten oder Derivate des MIF, wie mittels Rekombinationstechniken hergestellten MIF, der Aminosäure-Modifikationen, wie Inversionen, Deletionen, Insertionen, Anlagerungen usw. enthält, sofern zumindest ein Teil der essentiellen Funktionen des Wildtyp-MIF vorhanden ist. Ein solcher MIF kann auch ungewöhnliche Aminosäuren und/oder Modifikationen, wie eine Alkylierung, Oxidation, Thiol-Modifikation, Denaturierung und Oligomerisation und dergleichen umfassen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein MIF insbesondere ein Protein sein, speziell ein Fusionsprotein, das neben anderen Proteinen, Peptiden oder Teilen davon den MIF insgesamt oder teilweise enthält. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der MIF eine verkürzte Form des natürlich vorkommenden MIF, wie ein kleines Peptid.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff "Jab" sowohl das natürlich vorkommende Jab als auch alle Modifikationen, Mutanten oder Derivate des Jab, wie mittels Rekombinationstechniken hergestelltes Jab, das Aminosäure-Modifikationen, wie Inversionen, Deletionen, Insertionen, Anlagerungen usw. enthält, sofern zumindest ein Teil der essentiellen Funktionen des Wildtyp-Jab vorhanden ist. Ein solches Jab kann auch ungewöhnliche Aminosäuren und/oder Modifikationen, wie eine Alkylierung, Oxidation, Thiol-Modifikation, Denaturierung und Oligomerisation und dergleichen umfassen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein Jab insbesondere ein Protein sein, speziell ein Fusionsprotein, das neben anderen Proteinen, Peptiden oder Teilen davon das Jab insgesamt oder teilweise enthält. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Jab eine verkürzte Form des natürlich vorkommenden Jab, wie ein kleines Peptid.
Der Begriff "Promotor" bedeutet eine DNA-Sequenz, die sich meistens stromaufwärts (5') von der codierenden Sequenz eines Strukturgens befindet und die die Expression des codierenden Bereichs kontrolliert, indem eine Erkennungssequenz für eine RNA-Polymerase und/oder für andere Faktoren, die erforderlich sind, damit die Transkription an der richtigen Stelle beginnt, bereitgestellt wird. Promotorsequenzen sind notwendig, jedoch nicht immer ausreichend, um die Expression des Gens zu steuern.
"Nucleinsäure" bedeutet ein großes Molekül, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und aus Monomeren (Nucleotiden) besteht, die eine Zucker-Einheit, eine Phosphat-Einheit und entweder einen Purin- oder einen Pyrimidin-Rest enthalten. Bei der Nucleinsäure kann es sich um cDNA, genomische DNA oder RNA, beispielsweise mRNA, handeln.
Der Begriff "Nucleinsäuresequenz" bedeutet ein natürliches oder synthetisches Polymer einzel- oder doppelsträngiger DNA oder RNA, die alternativ synthetische, nicht-natürliche oder veränderte Nucleotidbasen enthält, die in DNA- oder RNA-Polymere eingebaut werden können.
Der Begriff "Gen" bedeutet eine ein spezifisches Protein codierende DNA-Sequenz und Regulationselemente, die die Expression dieser DNA-Sequenz kontrollieren.
Der Begriff "codierende Sequenz" bezieht sich auf den Teil eines Gens, der ein Protein, ein Polypeptid oder einen Teil davon codiert, wobei die Regulationssequenzen, die die Initiation oder Termination der Transkription steuern, ausgeschlossen werden. Die codierende Sequenz und/oder das Regulationselement kann eine/eines sein, die/das normalerweise in der Zelle zu finden ist, wobei sie/es in diesem Fall als "autolog" oder als "endogen" bezeichnet wird, oder eine/eines, die normalerweise nicht in der Zelle lokalisiert ist, wobei es/sie in diesem Fall als "heterolog" bezeichnet wird.
Auch ein heterologes Gen kann aus autologen Elementen bestehen, die in einer Reihenfolge und/oder Orientierung angeordnet sind, die in der Zelle, in die das Gen übertragen wird, normalerweise nicht zu finden ist. Ein heterologes Gen kann insgesamt oder teilweise aus einer beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten Quelle stammen, wozu ein bakterielles oder virales Genom oder Episom, eukaryontische Kern- oder Plasmid-DNA, cDNA oder chemisch synthetisierte DNA gehören. Das Strukturgen kann einen ununterbrochenen codierenden Bereich bilden oder kann ein oder mehrere Introns umfassen, die durch geeignete Spleißverbindungen begrenzt sind. Das Strukturgen kann aus Abschnitten zusammengesetzt sein, die aus unterschiedlichen, natürlich vorkommenden oder synthetischen Quellen stammen.
Ein "Transaktivator-Protein" ist ein Protein, das an den Operator-Bereich eines Gens binden und dadurch die Transkription des Gens fördern kann.
Eine "DNA-Bindungsdomäne" ist eine Aminosäuresequenz, die an eine spezifische DNA-Sequenz binden kann.
Ein "Fusionsprotein" ist ein Protein, das aus Aminosäuresequenzen besteht, die aus mindestens zwei verschiedenen Quellen stammen. Im Zusammenhang mit einem Fusionsprotein ist eine "heterologe" Aminosäuresequenz eine Sequenz, die aus einer anderen Quelle als die anderen Teile des Fusionsproteins stammt.
Ein "nachweisbares Genprodukt" ist eine Nucleotid- oder Aminosäuresequenz, die sich mit Hilfe eines Tests nachweisen läßt. Vorzugsweise verleiht die Expression eines nachweisbaren Genprodukts der Zelle ein Merkmal, das eine einfache Selektion der Zelle aus anderen Zellen erlaubt, die das nachweisbare Genprodukt nicht exprimieren.
Mit "funktionell verbunden" ist gemeint, daß ein Gen und eine Regulationssequenz bei einer Sense-Expression oder Antisense-Expression so miteinander verbunden sind, daß eine Genexpression ermöglicht wird, wenn geeignete Moleküle (z.B. Transkriptions-Aktivator-Proteine) an die Regulationssequenz gebunden werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "assoziiert" einen beliebigen Typ einer Wechselwirkung zwischen dem MIF und dem Jab, insbesondere eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung oder Assoziation, wie eine kovalente Bindung, hydrophobe/hydrophile Wechselwirkung, Van-der-Waalssche Kräfte, Ionenpaare, Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung, Wechselwirkung zwischen Epitop und der Antikörper-Bindungsstelle, Enzym-Substrat-Wechselwirkung, Wechselwirkung zwischen Liposomen und hydrophoben Molekülen, Nucleotidbasenpaarung, Wechselwirkung zwischen Membranen und hydrophoben Molekülen und dergleichen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Eine solche Assoziation kann auch das Vorliegen weiterer Moleküle, wie Peptide, Proteine, wie Kip oder Jun, oder weiterer Nucleotidsequenzen umfassen.
Der Begriff "Vektor" bedeutet ein rekombinantes DNA-Konstrukt, das ein Plasmid, Virus oder eine autonom replizierende Sequenz, ein Phage oder eine Nucleotidsequenz sein kann, das linear oder zirkulär ist, das aus einzel- oder doppelsträngiger DNA oder RNA besteht, bei dem eine Reihe von Nucleotidsequenzen zu einer einzigartiger Konstruktion verknüpft oder rekombiniert worden sind und das ein Promotorfragment und eine DNA-Sequenz eines ausgewählten Genprodukts in Sense- oder Antisense-Orientierung zusammen mit geeigneten untranslatierten 3'-Sequenzen in eine Zelle einschleusen kann.
"Plasmide" sind genetische Elemente, die stabil vererbt werden, ohne ein Teil des Chromosoms ihrer Wirtszelle zu sein. Sie können DNA oder RNA umfassen und linear oder zirkulär sein. Plasmide codieren Moleküle, die ihre Replikation und stabile Vererbung während der Zellreplikation sicherstellen, und können Produkte mit beträchtlicher Bedeutung für Medizin, Landwirtschaft und Umwelt codieren. Beispielsweise codieren sie Toxine, die die Virulenz pathogener Bakterien stark erhöhen. Sie können auch Gene codieren, die Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen. Plasmide werden in der Molekularbiologie allgemein als Vektoren zur Clonierung und Expression rekombinanter Gene verwendet. Entsprechend den dem Fachmann vertrauten Regeln der Standardbezeichnung werden Plasmide in der vorliegenden Beschreibung allgemein mit dem Kleinbuchstaben p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Ziffern vorangestellt sind oder folgen. In der vorliegenden Beschreibung offenbarte Ausgangsplasmide sind entweder im Handel erhältlich, der Öffentlichkeit zugänglich oder können aus verfügbaren Plasmiden mittels routinemäßiger Anwendung wohlbekannter veröffentlichter Verfahren konstruiert werden. Viele Plasmide und andere Clonierungs- und Expressionsvektoren, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind wohlbekannt und für den Fachmann ohne weiteres erhältlich. Außerdem kann der Fachmann ohne weiteres eine beliebige Anzahl anderer Plasmide konstruieren, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind. Aus der vorliegenden Offenbarung erschließen sich dem Fachmann ohne weiteres die Eigenschaften, Kontruktion und Verwendung sowohl solcher Plasmide als auch anderer Vektoren.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "Expression" soll die Transkription und/oder Codierung der Sequenz des Genprodukts beschreiben. Bei der Expression wird zuerst eine DNA-Kette, die die Sequenz eines Genprodukts codiert, in eine komplementäre RNA transkribiert, bei der es sich häufig um eine mRNA handelt, und dann wird die so transkribierte mRNA in das vorstehend erwähnte Genprodukt translatiert, wenn es sich bei dem Genprodukt um ein Protein handelt. Die Expression umfaßt jedoch auch die Transkription einer DNA, die in bezug auf ihre Regulationselemente in Antisense-Richtung insertiert worden ist. Eine Expression, die konstitutiv verläuft und möglicherweise durch ein von außen kontrolliertes Promotorfragment weiter gesteigert werden kann, wobei mehrere mRNA-Kopien und große Mengen des ausgewählten Genprodukts erzeugt werden, kann auch die Überproduktion eines Genprodukts umfassen.
Der Begriff "Wirtszelle" bedeutet eine Zelle, die durch die Übertragung von einer chimären, heterologen oder autologen Nucleinsäuresequenz oder deren Abkömmlinge, die diese Sequenz noch enthalten, genetisch modifiziert worden ist. Diese Zellen werden auch als "transgene Zellen" bezeichnet. Im Falle der Übertragung einer autologen Nucleinsäuresequenz liegt die Sequenz in der Wirtszelle in höherer Kopiezahl vor als die natürlich vorkommenden Sequenzen.
Der Begriff "MIF-Jab-Komplex" bedeutet eine Assoziation des MIF und des Jab, z.B. eine Wechselwirkung zwischen MIF- und Jab-Domänen.
Der Begriff "Zielaktivität" bedeutet eine durch den MIF-Jab-Komplex induzierte Aktivität, z.B. die Expression eines Reportergens oder die Regulation einer AP-1-Aktivität oder die Regulation des CDK(Cyclinabhängige Kinasen)-Inhibitoren.
Proteine, die nicht in ihrer natürlichen (zellulären) Umgebung vorkommen, sind isoliert. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "isoliert" bedeutet im Zusammenhang mit Proteinen ein Polypeptid, das ohne das Material, mit dem es in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist, vorliegt oder höchstens mit einem Teil davon. Bezogen auf das Gewicht des Gesamtproteins in einer bestimmten Probe macht das isolierte Protein mindestens 0,5%, vorzugsweise mindestens 5%, bevorzugter mindestens 25% und noch bevorzugter mindestens 50% aus. Am bevorzugtesten ist das "isolierte" Protein im wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Substanzen, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist, und bildet auf einem nicht-reduzierenden Polyacrylamid-Gel eine einzige Hauptbande. "Im wesentlichen frei" bedeutet, daß das Protein zu mindestens 75%, vorzugsweise zu mindestens 85%, bevorzugter zu mindestens 95% und am bevorzugtesten zu mindestens 99% frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Substanzen ist, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist.
Bekanntlich umfaßt eine "Affinitäts-Chromatographie" die Trennung von Proteinen durch eine selektive Absorption an ein festes Medium oder einen festen Träger (z.B. immobilisiertes Jab, immobilisierter MIF, immobilisierte Antikörper gegen MIF-Jab-Domänen und/oder immobilisierte Antikörper gegen MIF-Jab-Fusionsproteine, usw.), das/der im allgemeinen in Form einer Säule vorliegt, und/oder die Elution davon. Bei dem festen Medium handelt es sich normalerweise um eine inerte Trägermatrix, an die ein Ligand angelagert wird, der die Fähigkeit aufweist, unter bestimmten Bedingungen vorzugsweise mit dem gewünschten Protein oder den gewünschten Proteinen gegenüber anderen in der gleichen Probe vorliegenden Proteinen eine Bindung einzugehen, obwohl in einigen Fällen die Matrix selbst eine solche selektive Bindungsfähigkeit besitzen kann. Der Ligand kann zu dem abzutrennenden Protein biologisch komplementär sein, beispielsweise kann es sich um ein Antigen und einen Antikörper handeln, oder kann ein beliebiges Molekül sein, das biologisch in keinem Zusammenhang zum Protein steht, jedoch aufgrund der Beschaffenheit und sterischen Verwandtschaft seiner aktiven Gruppen das Vermögen zur Bindung des Proteins besitzt. Die im Zusammenhang mit solchen Protein-bindenden Liganden allgemein verwendeten Trägermatrizes umfassen beispielsweise Polymere und Copolymere von Agarose, Dextranen und Amiden, insbesondere Acrylamid, oder Glasperlen oder Nylon-Matrizes. Es hat sich herausgestellt, daß bei Verwendung von Farbstoffen Cellulose und substituierte Cellulosen im allgemeinen ungeeignet sind, da, obwohl sie große Farbstoff-Mengen binden, der Farbstoff in nur geringem Maße für das Protein zugänglich ist, was zu einer schwachen Proteinbindung führt.
Mit "fester Träger" ist eine unlösliche Matrix gemeint, die entweder von Natur aus ein biologisches Material ist, wie ein Zell- oder Bakteriophagen-Partikel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, oder ein synthetisches Material, wie ein Acrylamid-Derivat, Cellulose, Nylon, Siliciumdioxid und magnetisierte Partikel, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, an das lösliche Moleküle fixiert oder gebunden werden können.
"Antikörper" bedeutet ein Polypeptid, das im wesentlichen von einem Immunglobulin-Gen oder Immunglobulin-Genen codiert wird, oder Fragmente davon, das/die einen Analyten (Antigen) spezifisch bindet/binden und erkennt/erkennen. Bekannte Immunglobulin-Gene umfassen sowohl die kappa-, lambda-, alpha-, gamma-, delta-, epsilon- und mu-Gene für den konstanten Bereich als auch die unzähligen Gene für den variablen Immunglobulin-Bereich. Antikörper kommen beispielsweise als intakte Immunglobuline oder als eine Reihe gut charakterisierter Fragmente vor, die mittels Spaltung mit verschiedenen Peptidasen erzeugt werden. "Antikörper" bedeutet auch modifizierte Antikörper (z.B. oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper). Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "Antikörper" umfaßt auch Antikörper-Fragmente, die entweder mittels Modifikation ganzer Antikörper oder mittels de novo-Synthese unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken erzeugt worden sind. Der Begriff "Antikörper" umfaßt sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie Fab, F(ab')₂ und Fv, die die Epitop-Determinante binden können. Bei diesen Fragmenten ist die Fähigkeit des Antikörpers zur selektiven Bindung seines Antigens oder Rezeptors teilweise erhalten geblieben, wobei die Fragmente wie folgt definiert sind:

(1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes Antigenbindungs-Fragment eines Antikörper-Moleküls enthält, läßt sich mittels Spaltung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Papain erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil einer schweren Kette erhalten werden;
(2) das Fab'-Fragment eines Antikörper-Moleküls läßt sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden zwei Fab'-Fragmente erhalten;
(3) F(ab')₂, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten läßt; F(ab')₂ ist ein Dimer von zwei Fab'-Fragmenten, die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
(4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält und in Form von zwei Ketten exprimiert wird; und
(5) Einzelketten-Antikörper ("SCA"), definiert als gentechnisch verändertes Molekül, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten Polypeptid-Linker zu einem genetisch fusionierten Einzelketten-Molekül verbunden sind.

Die Verfahren zur Herstellung dieser Fragmente sind auf dem Fachgebiet bekannt (vgl. beispielsweise Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, New York).
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Epitop" bedeutet eine beliebige Antigen-Determinante auf einem Antigen, an den das Paratop eines Antikörpers bindet. Epitop-Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächen-Gruppierungen von Molekülen, wie Aminosäuren oder Zucker-Seitenketten, und besitzen normalerweise sowohl spezifische Merkmale der dreidimensionalen Struktur als auch spezifische Ladungs-Merkmale.
Der Fachmann kann leicht monoclonale Antikörper gegen die Proteine und die Fragmente davon herstellen. Die allgemeinen Methoden zur Herstellung monoclonaler Antikörper unter Verwendung von Hybridom-Techniken sind wohlbekannt. Immortalisierte, Antikörper produzierende Zellinien können mittels Zellfusion und auch mittels anderer Verfahren, wie direkter Transformation von B-Lymphocyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit dem Epstein-Barr-Virus, erzeugt werden. Vgl. beispielsweise M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques", (1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas", (1981); Kennett et al., "Monoclonal Antibodies", (1980); vgl. auch die US-Patente Nr. 4,341,761, Nr. 4,399,121, Nr. 4,427,783, Nr. 4,444,887, Nr. 4,452,570, Nr. 4,466,917, Nr. 4,472,500, Nr. 4,491,632 und Nr. 4,493,890. Gruppen von gegen das interessierende Protein erzeugten monoclonalen Antikörpern oder Fragmenten davon können im Hinblick auf verschiedene Eigenschaften, nämlich Isotyp, Epitop, Affinität, usw., gescreent werden. In einer anderen Ausführungsform können Gene, die monoclonale Antikörper von Interesse codieren, mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten PCR-Verfahren aus Hybridomen isoliert und in geeigneten Vektoren cloniert und exprimiert werden. Bei Verwendung von Immunaffinitäts-Verfahren eignen sich monoclonale Antikörper zur Aufreinigung der einzelnen Proteine, gegen die sie gerichtet sind. Ungeachtet, ob es sich um monoclonale oder polyclonale Antikörper handelt, weisen die erfindungsgemäßen Antikörper insofern einen zusätzlichen Nutzen auf, als sie als Reagenzien bei Immuntests, wie RIA, ELISA und ähnlichen, eingesetzt werden können. Außerdem können sie zur Isolierung des MIF, des Jab, von MIF-Jab-Domänen, usw., aus Zellen verwendet werden. Die Antikörper könnten z.B. zur Etablierung eines auf einer Gewebekultur basierenden Tests verwendet werden, um neuartige Verbindungen, die die Wechselwirkung des MIF und des Jab blockieren, zu finden oder zu modifzieren.
Die humanisierten oder chimären Antikörper können Teile umfassen, die von zwei unterschiedlichen Arten stammen (z.B. menschlicher konstanter Bereich und Maus-Bindungsbereich). Die von zwei unterschiedlichen Arten stammenden Teile können mittels herkömmlicher Verfahren chemisch verbunden oder unter Verwendung gentechnischer Verfahren als einzelnes Fusionsprotein hergestellt werden. Eine DNA, die die Proteine der beiden Teile des chimären Antikörpers codiert, kann als einzelnes Fusionsprotein exprimiert werden.
Ein Antikörper "bindet spezifisch an" ein Protein oder zeigt damit "eine spezifische Immunreaktivität", wenn der Antikörper in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Substanzen in einer Bindungsreaktion seine Funktion ausübt, anhand der sich entscheiden läßt, ob das Protein vorliegt. Unter den festgelegten Bedingungen eines Immuntests binden die angegebenen Antikörper vorzugsweise an ein spezielles Protein, während keine signifikante Bindung an andere in der Probe vorhandene Proteine erfolgt. Eine spezifische Bindung an ein Protein unter solchen Bedingungen erfordert einen Antikörper, der aufgrund seiner Spezifität für ein spezielles Protein selektiert worden ist. Zur Selektion von Antikörpern, die mit einem speziellen Protein eine spezifische Immunreaktivität zeigen, können verschiedene Immuntest-Ausführungsformen verwendet werden. Beispielsweise werden Festphasen-ELISA-Immuntests routinemäßig zur Selektion monoclonaler Antikörper verwendet, die eine spezifische Immunreaktivität mit einem Protein zeigen. Bei Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Publications, New York, findet man eine Beschreibung von Immuntest-Ausführungsformen und Bedingungen, die sich zur Bestimmung einer spezifischen Immunreaktivität verwenden lassen.
"Immuntest" betrifft einen Test, bei dem ein Antikörper zur spezifischen Bindung eines Analyten verwendet wird. Der Immuntest ist dadurch charakterisiert, daß spezifische Bindungseigenschaften eines speziellen Antikörpers genutzt werden, um den Analyten zu isolieren, zielgerichtet zu testen und/oder quantitativ zu bestimmen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die MIF-Jab-Bindung unter Verwendung herkömmlicher Verfahren zur radioaktiven Markierung, Photo-Markierung, Fluoreszenz-Markierung, Biotin-Markierung, Copräzipitation, Immunpräzipitation, chromatographischen Fraktionierung, usw., des MIF, des Jab und/oder des Komplexes davon in Gegenwart oder Abwesenheit eines zu screenenden Arzneistoffs gemessen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Bindung zwischen dem MIF und dem Jab beispielsweise mittels Copräzipitation untersucht werden: der MIF wird entweder kovalent oder nicht-kovalent an Perlen immobilisiert, beispielsweise über eine Bindung von GST-MIF an GSH-Perlen oder über eine Bindung von Biotin-MIF an Streptavidin-Perlen oder über eine Bindung von MBP-MIF an Malat-Perlen (MBP: Malatbindungsprotein), und mit einem löslichen Jab in Abwesenheit (Kontrolle) oder Gegenwart von Arzneistoffen inkubiert. Die Suspension wird gewaschen und die Mengen des an die Festphase gebundenen Jab werden nach Elution des Jab vom Komplex mittels Western-Blot-Analyse oder ähnlicher Verfahren nachgewiesen oder der Jab-Nachweis erfolgt im Überstand. Die Jab-Mengen in Gegenwart und Abwesenheit von Arzneistoffen werden verglichen.
Auch die Bindung zwischen dem Jab und dem MIF kann beispielsweise mittels Copräzipitation untersucht werden: das Jab wird an Nylon oder Perlen immobilisiert und mit einem löslichen MIF in Abwesenheit (Kontrolle) und Gegenwart von Arzneistoffen inkubiert. Das Jab kann entweder kovalent oder nicht-kovalent an Perlen gebunden werden, beispielsweise über eine Bindung von GST-Jab an GSH-Perlen oder über eine Bindung von Biotin-Jab an Streptavidin-Perlen oder über eine Bindung von MBP-Jab an Malat-Perlen. Die Suspension wird gewaschen und die Mengen des an die Festphase gebundenen MIF werden beispielsweise nach Elution des MIF vom Komplex mittels Western- Blot-Analyse oder ähnlicher Verfahren nachgewiesen oder der MIF-Nachweis erfolgt im Überstand. Die MIF-Mengen in Gegenwart und Abwesenheit von Arzneistoffen werden verglichen.
Das allgemeine Konzept dieser Copräzipitations-Ausführungsformen besteht in der Inkubation der beiden Partner, z.B. des Jab und des MIF, wobei ein Partner, z.B. der MIF, kovalent an GST gebunden ist. Die beiden Partner MIF-GST und Jab werden in Gegenwart einer Festphase, beispielsweise GSH-Perlen, inkubiert. Auf diese Weise kann der MIF-Jab-Komplex an die GSH-Perlen binden, da zwischen GSH und dem kovalent an den MIF gebundenen GST eine nicht-kovalente Bindung erfolgt. Die Suspension, die die Festphase, d.h. GSH-Perlen, und den nicht-kovalent gebundenen GST-MIF-Komplex enthält, der nicht-kovalent an das Jab gebunden ist, wird gewaschen und das Jab wird dann mittels Kochen in SDS-Puffer eluiert. Der Überstand der Suspension wird mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Das SDS-Gel wird einem Western-Blot-Verfahren unterworfen und das Jab wird auf dem Blot mit Hilfe von Antikörpern nachgewiesen, die gegen das Jab gerichtet sind.
Verschiedene Ausführungsformen dieses allgemeinen Konzepts sind bevorzugt:

(i) GSH-Perlen werden mit GST-MIF und Jab inkubiert und das über GST-MIF an GSH-Perlen gebundene Jab (vgl. vorstehend) wird mittels eines Western-Blot-Verfahrens mit Antikörpern nachgewiesen, die gegen das Jab gerichtet sind,
(ii) MIF-Perlen werden mit Jab inkubiert und das an die MIF-Perlen gebundene Jab wird mittels eines Western-Blot-Verfahrens mit Antikörpern nachgewiesen, die gegen das Jab gerichtet sind,
(iii) GSH-Perlen werden mit GST-Jab und MIF inkubiert und der über GST-Jab an GSH-Perlen gebundene MIF wird mittels eines Western-Blot-Verfahrens mit Antikörpern nachgewiesen, die gegen den MIF gerichtet sind,
(iv) Jab-Perlen werden mit löslichem MIF inkubiert und der an Jab-Perlen gebundene MIF wird mittels eines Western-Blot-Verfahrens mit Antikörpern nachgewiesen, die gegen den MIF gerichtet sind,
(v) Malat-Perlen werden mit MBP-MIF und Jab inkubiert und das über MBP-MIF an Malat-Perlen gebundene Jab wird mittels eines Western-Blot-Verfahrens mit Antikörpern nachgewiesen, die gegen das Jab gerichtet sind,
(vi) Malat-Perlen werden mit MBP-Jab und MIF inkubiert und der über MBP-Jab an Malat-Perlen gebundene MIF wird mittels eines Western-Blot-Verfahrens mit Antikörpern nachgewiesen, die gegen den MIF gerichtet sind,
(vii) Protein A-Perlen werden mit gegen den MIF gerichteten Antikörpern und MIF und Biotin-Jab inkubiert und an Protein A-Perlen gebundenes Streptavidin wird mittels eines Western-Blot-Verfahrens nachgewiesen,
(viii) Protein A-Perlen werden mit gegen den MIF gerichteten Antikörpern und MIF und Jab1 inkubiert und das an Protein A-Perlen gebundene Jab wird mittels eines Western-Blot-Verfahrens mit Antikörpern nachgewiesen, die gegen das Jab gerichtet sind, und
(ix) Streptavidin-Dynalperlen werden mit Biotin-EGFP-MIF und Jab inkubiert und das an Streptavidin-Dynalperlen gebundene Jab wird mittels eines Western-Blot-Verfahrens mit Antikörpern nachgewiesen, die gegen das Jab gerichtet sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Verfahren zum Testen der Bindung zwischen dem MIF und dem Jab um einen "electromobility shift assay" (Test zur Änderung der elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit). Durch die MIF-Jab-Bindung wird die Flexibilität/Wanderungsgeschwindigkeit von c-Jun/DNA-Komplexen oder Jab/c-Jun/DNA-Komplexen in einem Gel (beispielsweise einem nativen Polyacrylamid-Gel) verringert oder erhöht. Verschiebungen der allein oder in einem Komplex vorliegenden DNA-Sonde in Gegenwart oder Abwesenheit von Arzneistoffen können mittels radioaktiver Markierung oder Fluoreszenz-Markierung der DNA-Sonde nachgewiesen werden.
Das Verfahren zur Beseitigung der MIF-Jab-Bindung umfaßt auch eine Reihe von Proteinen: eine MIF-Jab-Protein-Bindung verringert oder erhöht die Flexibilität/Wanderungsgeschwindigkeit des MIF und des Jab in einem Gel (z.B. einem nativen Polyacrylamid-Gel). Verschiebungen der Proteine (MIF, Jab, MIF-Jab-Komplex) im Gel in Abwesenheit und Gegenwart von Arzneistoffen lassen sich mittels radioaktiver Markierung oder Fluoreszenz-Markierung des MIF und/oder des Jab nachweisen.
Das Verfahren zum Nachweis der MIF-Jab-Bindung mittels Chromatographie ermöglicht auch die Absorption des MIF an einen das Jab enthaltenden Chromatographieträger in Abwesenheit und Gegenwart von Arzneistoffen und das Waschen der Säule mit einem Puffer und den Nachweis des MIF im Eluat oder den direkten Nachweis des gebundenen MIF. Beispielsweise ist die MIF-Menge im Eluat in Gegenwart des Arzneistoffs höher als die Menge in Abwesenheit des Arzneistoffs, wenn der Arzneistoff ein Dissoziationsmittel ist. Das Verfahren zum Nachweis der MIF-Jab-Bindung mittels Chromatographie umfaßt auch die Absorption des Jab an einen den MIF enthaltenden Chromatographieträger, immobilisierte Antikörper gegen MIF-Jab-Domänen und/oder immobilisierte Antikörper gegen MIF-Jab-Fusionsproteine in Abwesenheit und Gegenwart von Arzneistoffen und das Waschen der Säule mit einem Puffer und den Nachweis des Jab im Eluat. Beispielsweise ist die Jab-Menge im Eluat in Gegenwart des Arzneistoffs geringer als die Menge in Abwesenheit des Arzneistoffs, wenn der Arzneistoff kein Dissoziationsmittel ist. Das Verfahren zum Nachweis der MIF-Jab-Bindung umfaßt auch die Adsorption des löslichen MIF oder Jab an eine MTP (Mikrotiterplatte) oder einen Biochip mit dem immobilisierten MIF oder Jab in Abwesenheit oder Gegenwart von Arzneistoffen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der zu verwendende MIF und/oder das zu verwendende Jab mittels in vitro-Translation erhalten.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind MIF und Jab in Zell-Rohextrakten oder in teilweise aufgereinigten Zellextrakten enthalten. Zellextrakte, die die vorliegende Erfindung umfaßt, sind biologische Gewebe oder Flüssigkeiten oder Suspensionen mit Zellen oder Fragmenten davon. Solche Zellextrakte können erhalten werden, wenn Zellen oder Gewebe mechanisch gerührt oder geschert, mit Ultraschall behandelt, elektrische Felder daran angelegt oder wenn sie mit chemischen und/oder enzymatischen Mitteln behandelt werden, usw.. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine beliebige Kombination der "in vitro"- und Zellextraktions"-Verfahren, z.B. sind der MIF und das Jab in einer Suspension enthalten, wobei das Jab in einem Zellextrakt enthalten ist und der reine MIF an Perlen gebunden ist.
Die Erfindung gestattet die Identifizierung von Molekülen, die die Wechselwirkung oder Bindung zwischen dem MIF und dem Jab unterbrechen oder verhindern. Die Arzneistoffe, die die Bindung zwischen MIF und Jab potentiell unterbrechen, d.h. sogen. Dissoziations-Verbindungen, können in Zellen eingeschleust werden, indem sie beispielsweise Kulturen einfach zugegeben werden. Mit "Dissoziations-Verbindung" ist ein beliebiges Molekül gemeint, das eine Wechselwirkung, insbesondere die Bindung des MIF und des Jab, unterbricht, verhindert oder moduliert. Beispiele für Dissoziations-Verbindungen sind Polypeptide, Nucleinsäuren, organische oder anorganische Moleküle und Ionen. Viele potentielle Dissoziations-Verbindungen sind so klein, dass sie von einer Zelle durch Endocytose aufgenommen werden können oder durch die Membran hindurch diffundieren können, wenn sie ausreichende hydrophobe Eigenschaften besitzen. Wenn die Dissoziations-Verbindung ein RNA-Molekül oder ein Protein ist, kann sie in einer anderen Ausführungsform in einer Zelle produziert werden, indem die Zelle mit dem entsprechenden DNA-Konstrukt transformiert wird und dann die Expression der gewünschten RNA oder des gewünschten Proteins erfolgt. Mit Hilfe dieser Verfahren lassen sich auch Verbindungen identifizieren, die molekulare Wechselwirkungen zwischen dem MIF und dem Jab stabilisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Herstellung eines MIF-Proteins, umfassend: (i) die Bereitstellung einer das MIF-Protein enthaltenden Quelle, (ii) das Inkontaktbringen der das MIF-Protein enthaltenden Quelle mit einer das Jab enthaltenden Quelle unter Bedingungen, die sowohl (iii) die Bindung zwischen dem MIF und dem Jab als auch (iv) die Trennung des MIF von dem Jab erlauben.
Das Verfahren zur Aufreinigung des MIF aus einer Quelle umfaßt beispielsweise:

a) Konzentrieren der MIF-Quelle;
b) Absorbieren des MIF an einen das Jab enthaltenden Chromatographieträger;
c) Waschen des absorbierten MIF mit mindestens einem Puffer;
d) selektrives Eluieren des gewaschenen MIF, und
e) Gewinnen des MIF aus dem Eluat.

Außerdem könnte das Aufreinigungsverfahren verwendet werden zur:

(i) Aufreinigung von rekombinantem MIF aus Bakterien,
(ii) Aufreinigung von nativem MFI aus Gewebe,
(iii) Aufreinigung MIF-artiger Homologer, wie bestimmter Tautomerasen,
(iv) Aufreinigung von "nativem" MIF ohne stringente Behandlung, wobei das Jab als schonendes Einfang-Molekül verwendet wird.

Dieses Verfahren macht sich die Tatsache zunutze, daß der MIF und das Jab auf spezifische Weise miteinander in Wechselwirkung treten. Diese Affinitäts-Chromatographie beruht auf der Wechselwirkung des MIF-Proteins mit einem immobilisierten Liganden (z.B. Jab). Der erfindungsgemäße Ligand kann für das spezielle Protein von Interesse spezifisch sein, wobei in diesem Fall der Ligand ein Substrat, Substratanalog, Inhibitor oder Antikörper ist, das/der mit dem MIF reagiert. Zur Isolierung des MIF aus einer Quelle, wie einem Zellextrakt, wird eine Probe des Zellextrakts beispielsweise auf eine Säule aufgetragen, die aus mit Jab-Funktionen versehenen oder beschichteten Partikeln besteht, und die Säule wird wiederholt mit einem Puffer gewaschen. Die einzigen Proteine, die an der Säule zurückgehalten werden, sind diejenigen, die hohe Affinität zu dem im Polymer verankerten Jab aufweisen, während andere Proteine einfach ausgewaschen werden. Zur Elution des an dem erfindungsgemäßen Affinitäts-Chromatographieträger fixierten MIF kann eine Pufferlösung, die Salze und/oder bekannte chaotrope Mittel, wie Magnesiumchlorid, in ausreichender Konzentration enthält, oder ein Carbonatpuffer eingesetzt werden, da beispielsweise die Affinität und Spezifität zwischen dem MIF und dem Jab sehr hoch sind, können der MIF oder das Jab aus einem Zellextrakt isoliert und aufgereinigt werden. Dieses Chromatographie-Verfahren verbessert das bestehende Verfahren zur Isolierung des MIF und stellt ein Verfahren zur Isolierung des Jab bereit.
Die als Träger für das Jab verwendeten Polymere können selbst an einem porösen mineralischen Träger fixiert werden, der beispielsweise ein Metalloxid, wie Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Magnesiumoxid, oder natürliche oder synthetische Derivate dieser Oxide, wie Glas, Silikate, Borosilikate, Kaolin, usw., umfaßt. Die Polymere können mittels Imprägnierung an dem porösen mineralischen Träger fixiert werden, wobei die Polymerbeschichtung danach gegebenenfalls durch Vernetzung entsprechend bekannten Verfahren stabilisiert werden kann. Das Vernetzungsmittel ist beispielsweise eine Dicarbonyl-Verbindung, wie Halogenhydrin, Diepoxid, usw. Die Polymerträger können auch mit Hilfe eines intermediären bifunktionellen Kupplungsmittels an mineralischen Trägern fixiert werden. Die von Sialyl-Gruppen befreiten Proteine können auch mit Hilfe eines geeigneten bifunktionellen Kupplungsmittels entsprechend bekannten Verfahren an dem polymeren Träger fixiert werden. Bei den Kupplungsmitteln handelt es sich beispielsweise um bifunktionelle Derivate, wie Cyanbromid, Dialdehyde, Diepoxide, usw. Die Proteine können auch direkt an dem porösen mineralischen Träger fixiert werden. Im Falle eines Siliciumdioxid-Trägers wird beispielsweise ein Aminoalkylsilan-Derivat von Siliciumdioxid hergestellt und das von Sialyl-Gruppen befreite Protein wird unter Verwendung eines bifunktionellen Mittels, wie Glutaraldehyd, an Aminoalkylsilan fixiert. Vgl. beispielsweise P. J. Robinson et al., Biochem. Biophys. Acta, 242 (1971), 659–661. Die von Sialyl-Gruppen befreiten Proteine können auch entsprechend dem in der Französischen Patentanmeldung Nr. 77.28163 (Veröffentlichung Nr. 2.403.098) beschriebenen Verfahren an porösen minerischen Trägern fixiert werden. Dieses Verfahren umfaßt die Beschichtung eines porösen mineralischen Trägers mit einem Polymer, das unter Verwendung von Oxidationsmitteln, wie Periodaten, einer Spaltungsreaktion unterzogen werden kann, wobei die Glycol-Gruppen oxidiert werden. Eine Polycarbonyl-Beschichtung wird erhalten und der Ligand, z.B. das von Sialyl-Gruppen befreite Glycoprotein kann dann an den gebildeten Carbonyl-Gruppen fixiert werden. Auf Wunsch kann die gebildete Imin-Gruppe zu dem Amin reduziert werden.
Isolierte erfindungsgemäße MIF- oder Jab-Polypeptide (z.B. menschliche MIF- oder Jab-Proteine) können mit Hilfe verschiedener auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren erhalten werden. Beispielsweise können die isolierten Peptide, Proteine oder Fragmente mittels biochemischer Verfahren aufgereinigt werden, wozu beispielsweise Affinitäts-Chromatographie gehört. Affinitätsmatrizes, die zur Isolierung des MIF oder des Jab (z.B. menschliche MIF-Peptide) verwendet werden können, sind gegen den MIF gerichtete monoclonale oder polyclonale Antikörper, die gegen die MIF oder Jab codierende Aminosäuresequenz oder Fragmente davon, wie synthetische Peptide, rekombinante Fragmente oder dergleichen, erzeugt wurden. In einer anderen Ausführungsform können sowohl verwandte Bindungsdomänen oder Polypeptide als auch andere auf dem Fachgebiet bekannte Verbindungen, die spezifisch an den MIF binden, ebenso als Affinitätsmatrizes verwendet werden, um im wesentliche reine erfindungsgemäße Proteine oder Antikörper (z.B. reine menschliche MIF-Protein, halbreine Maus-Jab-Polypeptide oder Antikörper, dfie mit den MIF-Jab-Domänen in Wechselwirkung treten) zu isolieren. Die Chromatographie stellt ein Verfahren dar, mit dem noch unbekannte Jab-Homologe, wie Proteine der MOV34-Familie oder Proteine mit einer MPN-Domäne, wie Pad1, durch Bindung homologer Domänen an den MIF isoliert werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den MIF und/oder Jab enthaltenden Quellen um Zellen, wozu Bakterien oder Hefe oder mittels Rekombinationstechniken erzeugte Zellen gehören, Gewebe, Zellkulturen, Zellkulturüberstände, Zellextrakte, Proteinpräparate, isolierter MIF oder isoliertes Jab.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die das MIF-Protein enthaltende Quelle im Bedarfsfall vor dem Inkontaktbringen des MIF und des Jab vorbehandelt, insbesondere aufgeschlossen, wobei die als Quelle verwendeten Zellen beispielsweise einer Ultraschallbehandlung unterworfen, chemisch oder enzymatisch lysiert oder gepulsten oder konstanten elektrischen Feldern unterworfen werden.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unterpunkten der Patentansprüche erläutert.
Die folgenden Beispiele dienen der vollständigeren Veranschaulichung der Erfindung, sollen den Schutzumfang der Erfindung jedoch nicht beschränken.
Beispiel 1:
Nachweis der Wechselwirkung zwischen dem MIF und dem Jab unter Verwendung des Zweihybrid-Systems
In allen Beispielen verwendete Materialien und Verfahren
Rekombinante Proteine, Fusionskonstrukte und Antikörper
Rekombinanter menschlicher MIF wurde aus E. coli aufgereinigt, wie von Kleemann et al., Eur. J. Biochem., 261 (1999), 753, beschrieben. Zur radioaktiven [³⁵S]-Markierung wurde menschlicher MIF im E. coli-Stamm BL21(DE3) exprimiert, der in mit PRO-MIX angereichertem Standard-Minimalmedium gezüchtet worden war, und aufgereinigt, wie für rMIF von Bernhagen, Biochemistry, 33 (1994), 14144, beschrieben. Die vollständige codierende Sequenz von Jab1 wurde mittels RT-PCR aus Jurkat-Zellen gewonnen und mittels Sequenzierung in beiden Richtungen bestätigt. Die Jab1-cDNA wurde in den Vektor pCl-neo (Promega) zur Expression in den in vitro-Translations- und Transfektions-Experimenten cloniert. TNF wurde von R&D-Systems bezogen. EGFP-Fusionsproteine: EGFP wurde unter Verwendung des Vektors pN3-EGFP (Clontech) am C-Terminus mit dem MIF fusioniert. P33-EGFP ist als mitochondrialer Marker beschrieben worden. PKCμ(KD)-EGFP ist im Cytosol lokalisiert und wurde als entsprechende Kontrolle verwendet. Ein gegen rMIF gerichteter polyclonaler Kaninchen-Antikörper wurde erhalten, wie von Bernhagen et al., Nature, 365 (1993), 756, beschrieben. Alle anderen Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology bezogen.
In vitro-Transkriptions/Translations-Reaktion
Gekoppelte in vitro-Transkriptions/Translations-Reaktionen wurden mit dem TNT-T7-Quick-Retikulocyten-Lysat-System in Kombination mit dem nicht-radioaktiven Transcend-Translationsnachweissystem (Promega) durchgeführt. Eine Expression von jab1 und c-Jun wurde unter Verwendung der Plamide pCl-neo-Jab1 (vgl. vorstehend) und pBAT-c-Jun erreicht. Die Expressionswirksamkeit von Biotin-markiertem Jab 1 und c-Jun wurde mittels des Immunblot-Verfahrens unter Verwendung eines gegen Jab1 bzw. c-Jun gerichteten Antikörpers oder mittels Färben mit einem Streptavidin/Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (S-HRP) bestätigt.
Protein-Protein-Wechselwirkung
rMIF wurde bei einem pH-Wert von 8,5 auf Affigel 10-Agarose (BIO-RAD) immobilisiert, wobei nach den Empfehlungen des Herstellers gearbeitet wurde. Kontroll-Perlen wurden mit L-Gycin, pH-Wert 8, und Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Die Bindung von Jab1 an Perlen wurde in Lysaten von 293T-Zellen analysiert, die einer 48-stündigen transienten Transfektion mit pCl-neo-Jab1 unterworfen worden waren (Wirksamkeit > 80%). Die Zellyse (30 min auf Eis) erfolgte in 25 mM HEPES, pH-Wert 7,7, 0,4 M NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 2 mM EDTA, 0,54% Triton X-100, 3 mM DTT und 1 × Proteinase-Inhibitor-Gemisch (PI) (Roche Diagnostics). Bindung und Waschen wurden im gleichen Puffer durchgeführt, wobei allerdings NaCl auf 0,1 M verdünnt wurde. Zur Bindung von löslichem rMIF an Jab 1 wurden die TNT-Retikulocyten-Lysate mit 1 μM rMIF oder BSA, Biotin-markiertem Jab 1 oder Biotin-markiertem c-Jun, die mittels in vitro-Transkription/Translation exprimiert worden waren, angereichert, die Reaktionsgemische wurden in PI enthaltender phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) sechsfach verdünnt und man ließ die Reaktionsgemische 3 h bei 4°C rotieren. Ein Antikörper wurde zugegeben, die Reaktionsgemische wurden 1 h inkubiert und man ließ Immunpräzipitate an Protein-A-Sepharose (Amersham-Pharmacia) binden (1 h, 4°C), dann wurde in PBS und danach in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 170 mM NaCl, 0,5% NP-40, 50 mM NaF gewaschen. Coimmunpräzipitierte biotinylierte Proteine wurden mit Hilfe eines Immunblot-Verfahrens und Färben mit S-HRP nachgewiesen. Zur Copräzipitation von biotinyliertem MIF-EGFP und Jab1 wurden Streptavidinkonjugierte Magnetperlen (Dyna1) verwendet, die Komplexe wurden, wie vorstehend beschrieben, gewaschen und Jab1 wurde nach einem Immunblot-Verfahren mit einem gegen Jab1 gerichteten Antikörper nachgewiesen.
Gewebekultur und transiente Transfektionen
Zellinien wurden nach den empfohlenen Standardverfahren kultiviert. Alle transienten Transfektionen wurden unter Verwendung von Superfect (Quiagen) durchgeführt. Zur gemeinsamen Inkubation mit rMIF wurde MIF 2 h nach Zugabe der Plasmide zugegeben. Transfektionen von NIH3T3-Zellen, die einem Serum-Mangel ausgesetzt worden waren, wurden durchgeführt, wie beschrieben (Tomoda et al., 1999).
Aktivitäts-Tests
Die Aktivität des Reportergens wurde mittels eines beschriebenen Verfahrens unter Verwendung des Galacto-Light-Kits von TROPIX Inc. und des Luciferase-Testsystems von Promega gemessen. 0,15 μg pCl-neo-Jab1 oder des Kontrollplasmids pCl-neo und 0,005 μg des Tk-LUC-5xTRE-Reporter-Konstrukts und 0,005 μg des R15-RSV-LacZ-Reporter-Konstrukts wurden verwendet. JNK-Tests wurden wie beschrieben durchgeführt. p27^Kip1-Induktionsexperimente und Proliferations-Untersuchungen mittels eines BrdU-Einbaus wurden durchgeführt; wobei nach einem veröffentlichten Verfahren gearbeitet wurde (Tomoda et al., 1999).
Ergebnisse:
Wechselwirkung des MIF mit dem Jab1
Das Zweihybrid-Screeningverfahren wurde verwendet, um die Möglichkeit zu testen, daß der MIF direkte intrazelluläre Funktionen besitzt, indem er mit intrazellulären Proteinen in Wechselwirkung tritt. Der vollständige codierende Bereich des menschlichen MIF wurde unter Verwendung des Vektors pAS2-1 im Leseraster mit der GAL4-DNA-Bindungsdomäne fusioniert. Unter Verwendung des erhaltenen Einfang-Plasmids pMIF-BD wurde eine menschliche fötale Hirn-Genbank mit Hilfe des Hefe-Zweihybrid-Verfahrens im wesentlichen, wie vom Hersteller (Clontech) beschrieben, gescreent. Obwohl der MIF Oligomere bildet, wurde eine Selbstaktivierung des MIF nicht nachgewiesen. Nach Selektion auf Trp-Leu-His-Medium und Testen der erhaltenen Clone auf β-Galactosidase-Aktivität wurden drei positive Fusionsproteine erhalten, die die GAL4-DNA-Aktivierungsdomäne enthielten. Die Ergebnisse des β-Galactosidase-Tests in Flüssigmedien sind in Miller-Einheiten angegeben und stellen die Durchschnittswerte ± Standardabweichung von 7 Messungen bei unabhängigen Clonen dar.
Da der MIF mit großer Häufigkeit im Gehirn und in Lymphocyten exprimiert wird, wurden eine Genbank mit cDNA aus dem ganzen menschlichen Gehirn und eine Lymphocyten-cDNA-Genbank eingesetzt, wobei menschliche MIF-cDNA zum Einfangen verwendet wurde. Aus 3,5 × 10⁶ bzw. 3,0 × × 10⁶ Transfektanten wurden insgesamt 4 Typen von Clonen identifiziert, die eine spezifische Wechselwirkung zeigten, wenn sie auf Nährstoff-Selektion und β-Galactosidase-Aktivität getestet wurden. Einer dieser Clone enthielt eine cDNA-Insertion mit fast der gesamten codierenden Sequenz (die den Aminosäuren 20–335 entsprach) von menschlichem p38^Jab1. (Zu mehr als 99% mit der entsprechenden p38^Jab1-Sequenz identisch). Die gesamte codierende Sequenz von zwei anderen Clonen war zu 100% mit der menschlichen MIF-cDNA-Sequenz identisch, was bestätigte, daß sich der MIF selbst zu Oligomeren verbindet. Es wurde der Schluß gezogen, daß der MIF im Hefe-Zweihybrid-System spezifisch an das Jab1 bindet.
Beispiel 2:
Nachweis der Wechselwirkung des MIF mit dem Jab unter Verwendung des Copräzipitations-Verfahrens
Die Spezifität der Wechselwirkung zwischen MIF und p38^Jab1 wurde mit Hilfe von in vitro-Copräzipitations-Experimenten untersucht. Aufgereinigter rekombinanter menschlicher MIF wurde an Agarose-Perlen immobilisiert und die Bindung an p38^Jab1 voller Länge, das aus Jurkat T-Zellen cloniert und in der menschlichen embryonalen Nierenzelle 293 überexprimiert worden war, wurde bestimmt. P38^Jab1 band stark an die MIF-Perlen, während nur eine unspezifische Hintergrundbindung an nicht-funktionalisierte Kontrollperlen beobachtet wurde. Löslicher rMIF konnte außerdem spezifisch an in vitro translatiertes, Biotin-markiertes p38^Jab1 binden, während Biotin-markiertes c-Jun nicht mit dem MIF copräzipitiert wurde. Umgekehrt band ein Biotinmarkiertes, aus dem MIF und dem "enhanced green fluorescent protein" bestehendes Fusionsprotein (MIF-EGFP) an p38^Jab1.
Signifikante Teile von p38^Jab1 sind im Kern und im Cytosol zu finden, was nahelegt, daß in einem dieser Kompartimente eine Wechselwirkung mit dem MIF stattfindet. Eine Färbung von endogenem MIF mit einem gegen den MIF gerichteten Antikörper und Cy-2 und eine transiente Transfektion von HeLa- und COS-1-Zellen mit einem MIF-EGFP-Fusionsprotein und ein mikroskopischer Vergleich der subzellulären Lokalisation mit anderen EGFP-gebundenen Marker-Proteinen zeigte, daß sowohl der endogene MIF als auch das überexprimierte MIF-Fusionsprotein überwiegend im Cytosol vorkommen. Da zirkulierender extrazellulärer MIF entscheidend für die zahlreichen immunologischen Funktionen des MIF ist, wurde auch getestet, ob extrazellulärer MIF zielgerichtet dem Cytosol zugeführt werden kann. Exogen zugegebener [³⁵S]rMIF, der außerdem aus der Lysosomen-Fraktionen gewonnen werden konnte, wurde in signifikanten Konzentrationen zielgerichtet dem Cytosol zugeführt und war dort mehrere Stunden stabil, was zeigte, daß transzellulär wirkender MIF nach Aufnahme in Zielzellen mit p38^Jab1 in Wechselwirkung treten konnte. Zusammengefaßt zeigten diese Daten, daß MIF sowohl in vivo als auch in vitro spezifisch an p38^Jab1 bindet.
Beispiel 3:
Nachweis der Wechselwirkung des MIF mit dem Jab unter Verwendung einer Modulation der AP-1-abhängigen Reportergen-Aktivität
Als nächstes wurden die MIF-Wirkungen durch Messen der AP-1-abhängigen Reportergen-Aktivität in transfizierten 293-Zellen unter Verwendung des 5 TRE-Luciferase-Reporters bestimmt. Rekombinanter MIF hob die TNF-α-induzierte AP-1-abhängige Reportergen-Aktivität in Abhängigkeit von der Konzentration völlig auf und hemmte in einer Konzentration von 1 μM völlig die verstärkende Wirkung von p38^Jab1, das gleichzeitig mit der Zugabe des rMIF als cDNA voller Länge transient in Zellen transfiziert worden war. Eine signifikante verstärkende Wirkung von p38^Jab1 (2-fach) wurde in Abwesenheit von transfiziertem c-Jun beobachtet, was zeigte, daß endogene c-Jun-Mengen ausreichten, damit die verstärkende Wirkung von p38^Jab1 erfolgte. Der MIF zeigte bereits bei einer Konzentration von 1 pM eine signifikante Hemmung (~ 30%), während bei Anwendung von 10 nM–1 μM rMIF eine vollständige Hemmung erfolgte.
Beispiel 4:
Nachweis der Wechselwirkung des MIF mit dem Jab unter Verwendung des "electromobility-shift"-Tests
Die Coaktivator-Funktion von p38^Jab1 bei der Transkription ist auf die Steigerung der Bindung von c-Jun an die AP-1-Stelle zurückzuführen. Daher war anzunehmen, daß der MIF durch Bindung an p38^Jab1 diese Aktivität modulieren konnte. Eine solche Wirkung auf die DNA-Bindung wurde zuerst bestimmt, indem ein "electromobility-shift"-Test (EMSA) mit Kernextrakten von 293-Zellen durchgeführt wurde, die mit p38^Jab1 und/oder c-Jun transfiziert und in Gegenwart oder Abwesenheit von rMIF inkubiert worden waren, wobei das 12-o-Tetradecanolphorbolacetat-Reaktionselement (TRE) verwendet wurde. Wie erwartet, förderte p38^Jab1 die Bindung von c-Jun an das TRE. Wenn der MIF mit Zellen inkubiert wurde, die sowohl p38^Jab1 als auch c-Jun überexprimierten, war eine deutliche Hemmung (2-fach) der aktivierenden Wirkung von p38^Jab1 auf die Bindung von c-Jun an die AP-1-Stelle zu sehen. Im Gegensatz dazu war die aktivierende Wirkung von MIF gering, wenn nur einer oder keiner der Transkriptionsfaktoren überexprimiert wurde, wobei diese Wirkung bei einem EMSA mit entsprechend programmierten Retikulocyten-Lysaten jedoch nicht zu sehen war. Ein EMSA mit Kernextrakten der HeLa-Tet-off-Zellinie HtTA, die das Tetracyclinkontrollierte Transaktivator-System stabil exprimiert und die mit cDNA des menschlichen MIF stabil transfiziert worden war, wobei nach Entfernung von Doxycyclin eine 5- bis 6-fache Überexpression des MIF-Proteins gegenüber endogenem MIF erreicht wurde, bestätigte, daß der MIF die AP-1-abhängigen DNA-Verschiebungen signifikant hemmen kann. Das Ausmaß der Hemmung in diesem System ist wahrscheinlich sogar noch deutlicher, da die Banden-Intensität bei der Doxycyclin-reprimierten Inkubation wahrscheinlich eine DNA-Verschiebung darstellt, die bereits durch die signifikanten Konzentrationen des endogenen MIF (~ 100 fg/Zelle) gehemmt ist.
Literaturstellen

1. Berhagen, J., Calandra, T. und Bucala, R., Regulation of the immune response by macrophage migration inhibitory factor: biological and structural features. J. Mol. Med., 76 (1998), 151–161.
2. Bernhagen, J. et al., MIF is a pituitary-derived cytokine that potentiates lethal endotoxaemia. Nature, 365 (1993), 756–759.
3. Calandra, T. et al., MIF is a glucocorticoid-induced modulator of cytokine production. Nature, 377 (1995), 68–71.
4. Donelly, S. C. et al., Regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in acute respiratory distress syndrome. Nature Med., 3 (1997), 320–323.
5. Kleemann, R. et al., Disulfide analysis reveals a role for macrophage migration inhibitory factor (MIF) as a thiol-protein oxidoreductase. J. Mol. Biol., 280 (1998), 85–102
6. Kleeman, R., Kapurniotu, A., Mischke, R., Held, J. und Bernhagen, J., Characterization of catalytic center mutants of macrophage migration inhibitory factor (MIF) and comparison with C81S MIF. Eur. J. Biochem., 261 (1999), 753–766.
7. Rosengren, E. et al., The immunoregulatory mediator migration inhibitor factor (MIF) catalyzes a tautomerization reaction. Mol. Med., 2 (1996), 143–149.
8. Claret, F.-X., Hibi, M., Dhut, S., Toda, T. und Karin, M., A new group of conserved coactivators the increase the specificity of AP-1 transcription factors. Nature, 383 (1996), 453–457.
9. Tomoda, K., Kubota, Y. und Kato, J.-Y., Degradation of the cyclin-dependentkinase inhibitor p27^Kip1 is instigated by Jab1. Nature, 398 (1999), 160–164.
10. Bacher, M. et al., Migration inhibitory factor expression in experimentally induced endotoxemia. Am. J. Pathol., 15 (1997), 235–246.
11. Fields, S. und Song, O., A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340 (1989), 245–246.
12. Bacher, M. et al., MIF expression in the rat brain-implications for neuronal function. Mol. Med., 4 (1998), 217–230.
13. Ogata, A., Nishihira, J., Suzuki, T., Nagashima, K. und Tashiro, K., Identification of macrophage migration inhibitory factor mRNA expression in neural cells of the rat brain by in situ hybridization. Neurosci. Lett., 246 (1998), 173–177.
14. Bernhagen, J. et al., Purification, bioactivity, and secondary structure analysis of mouse and human macrophage migration inhibitory factor (MIF). Biochemistry, 33 (1994), 14144–14155.
15. Sun, H., Bernhagen, J., Bucala, R. und Lolis, E., Crystal structure at 2,6 Å resolution of human macrophage migration inhibitory factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996), 5191–5196.
16. Seeger, M. et al., A novel protein complex involved in signal transduction possessing similarities to 26S proteasome subunits. FASEB J., 12 (1998), 469–478.
17. Hofmann, K. und Bucher, P., The PCl domain: a common theme in three multiprotein complexes. Trens Biochem. Sci., 23 (1998), 204–205.
18. Asano, K. et al., Structure of cDNAs encoding human eukaryotic initiation factor 3 subunits. J. Biol. Chem., 272 (1997), 27042–27052.
19. Karin, M., The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem., 270 (1995), 16483–16486.
20. Hirota, K. et al., AP-1 transcriptional activity is regulated by a direct association between thioredoxin and Ref-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997), 3633–3638.
21. Wilhelm, D., Bender, K., Knebel, A. und Angel, P., The level of intracellular glutathione is a kex factor for the induction of stress-activated signal transduction pathways including Jun N-terminal protein kinases and p38 kinase by alkylating agents. Mol. Cell. Biol., 17 (1997), 4792–4800.
22. Lanathan, A., Williams, J. B., Sanders, L. K. und Nathans, D., Growth factor-induced delayed early response genes. Mol. Cell. Biol., 12 (1992), 3919–3929.
23. Wistow, G. J., Shaughnessy, M. P., Lee, D. C., Hodin, J. und Zelenka, P. S., A macrophage migration inhibitory factor is expressed in the differentiating cells of the eye lens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993), 1271–1280.
24. Scheinman, R. I., Cogswell, P. C., Lofquist, A. K. und Baldwin, A. S., Role of transcriptional activation of IκBα in mediation of immunosuppression by glucocorticoids. Science, 270 (1995), 283–289.
25. Mitchell, R. A., Metz, C. N., Peng, T. und Bucala, R., Sustained mitogenactivated protein kinase (MAPK) and cytoplasmic phospholipase A2 activation by macrophage migration inhibitory factor (MIF). Regulatory role in cell proliferation and glucocorticoid action. J. Biol. Chem., 274 (1999), 18104–18106.
26. Dedio, J., Jahnen-Dechent, W., Bachmann, M. und Muller-Esterl, W., The multiligand-binding protein gC1qR, putative C1q receptor, is a mitochondrial protein. J. Immunol., 160 (1998), 3534–3542.
27. Johannes, F. P. et al., Protein kinase Cμ down-regulation of tumor-necrosisfactor-induced apotosis correlates with enhanced expression of nuclearfactor-kappaB-dependent protective genes. Eur. J. Biochem., 257 (1998), 47–54.
28. Angel, P. et al., Phorbol ester-inducible genes contain a common cis element recognized by a TPA-modulated transactivating factor. Cell, 49 (1987), 729–736.
29. Berberich, I. et al., Cross-linking CD40 on B cells preferentially induces stress-activated protein kinases rather then mitogen-activated protein kinases. EMBO J., 15 (1996), 92–101.

Claims

Verfahren zur Herstellung von MIF, umfassend a) Bereitstellung einer MIF enthaltenden ersten Quelle b) Inkontaktbringen der MIF enthaltenden ersten Quelle mit einer Jab enthaltenden zweiten Quelle unter Bedingungen, die die Bindung von MIF und Jab erlauben, und c) Abtrennen von MIF und Jab.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Quelle um eine Zelle, ein Gewebe, eine Zellkultur, einen Zellkultur-Überstand, einen Zellextrakt, ein Proteinpräparat, isolierten MIF oder isoliertes Jab handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Quellen vor Inkontaktbringen der Quellen aufgeschlossen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Schritte a) Konzentrieren der MIF enthaltenden ersten Quelle; b) Absorbieren des MIF an einen das Jab enthaltenden Chromatographieträger; c) Waschen des adsorbierten MIF mit mindestens einem Puffer; d) selektives Eluieren des gewaschenen MIF, und e) Gewinnen des MIF aus dem Eluat.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die das MIF enthaltene Quelle chemisch oder enzymatisch lysiert, einer Ultraschallbehandlung oder gepulsten oder konstanten oder elektrischen Feldern unterworfen wird.