DE69808743T2

DE69808743T2 - Netrinrezeptoren

Info

Publication number: DE69808743T2
Application number: DE69808743T
Authority: DE
Inventors: Lindsay Hinck; Kazuko Keino-Masu; David Leonardo; Masayuki Masu; Marc Tessier-Lavigne
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1997-02-19
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2003-07-24
Anticipated expiration: 2018-02-20
Also published as: JP2004121244A; US20030059859A1; US7041806B2; ATE226216T1; US7919588B2; EP0973794A4; US6277585B1; DK0973794T3; JP2001505062A; CA2280290C; EP0973794A1; US20060147988A1; WO1998037085A1; PT973794E; US20030040046A1; JP4387735B2; AU6174498A; ES2185146T3; EP0973794B1; AU718795B2

Description

Gebiet der Erfindung

Das Gebiet dieser Erfindung sind Proteine, welche die Lenkung von Wirbeltierzellen regulieren.

Hintergrund

In dem sich entwickelnden Nervensystem werden wandernde Zellen und Axons durch Hinweise in der extrazellulären Umgebung zu ihren Zielen gelenkt. Die Netrine sind eine Familie phylogenetisch konservierter Lenkhinweise, welche als diffusionsfähige Lockstoffe und Abstoßungsmittel für unterschiedliche Klassen von Zellen und Axons fungieren können¹&supmin;¹&sup0;. Neuere Untersuchungen in Wirbeltieren, Insekten und Nematoden haben Mitglieder der DCC-Unterfamilie der Immunglobulin(Ig)superfamilie mit Rezeptoren, die an Wanderungen zu Netrinquellen hin beteiligt sind, in Zusammenhang gebracht6,11-13. Die Mechanismen, welche die Wanderungen von Netrinquellen weg leiten (vermutete Abstoßungen) werden weniger gut verstanden. In Caenorhabditis elegans bewirkt der Verlust der unc-5 (welches das Transmembranprotein UNC-5¹&sup4; codiert)-Funktion Defekte bei diesen Wanderungen15,16 und eine ektopische Expression von unc-5 in gewissen Neuronen kann deren Axons wieder von einer Netrinquelle weg leiten¹&sup7;. Jedoch wurde die Beziehung zwischen UNC-5 und den Netrinen nicht definiert. Wir offenbaren hierin Wirbeltierhomologe des UNC-5 von C. elegans, welche eine neue Unterfamilie der Ig-Superfamilie definieren und deren mRNAs in verschiedenen Klassen von sich differenzierenden Neuronen eine auffällige Expression zeigen, und wir offenbaren, dass diese Wirbeltier-UNC-5-Homologen netrinbindende Wirbeltierproteine sind.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung, welche Wirbeltier- UNC-5-Proteine und -Nukleinsäuren betreffen. Die Proteine können rekombinant aus transfizierten Wirtszellen mit den betreffenden Wirbeltier-UNC-5-codierenden Nukleinsäuren erzeugt werden oder aus Wirbeltierzellen gereinigt werden.
Die Erfindung stellt ein isoliertes Wirbeltier-UNC-5-Protein bereit, das die SEQ ID Nr. 5, 6, 7 oder 8 umfasst. Die Erfindung stellt ebenfalls eine rekombinante Nukleinsäure bereit, welche ein UNC-5-Protein der Erfindung codiert.
Die Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zur Erzeugung eines isolierten Wirbeltier-UNC-5- Proteins bereit, welches die folgenden Schritte umfasst: Einführen einer Nukleinsäure der Erfindung in eine Wirtszelle oder einen Zellextrakt, Inkubieren der Wirtszelle oder des Extraktes unter Bedingungen, wodurch die Nukleinsäure als ein Transkript exprimiert wird und das Transkript als ein Translationsprodukt exprimiert wird, welches das Protein umfasst, und Isolieren des Translationsprodukts.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine isolierte Wirbeltier-UNC-5-Nukleinsäure bereit, welche die SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 4 umfasst.
Zusätzlich stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screenen auf ein Mittel bereit, welches die Bindung eines Wirbeltier-UNC-5-Proteins an ein Bindungstarget moduliert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
Inkubieren einer Mischung, welche umfasst:
ein isoliertes Protein der Erfindung,
ein Bindungstarget des Proteins und
ein zu testendes Mittel;
unter Bedingungen, bei welchen das Protein, ohne Gegenwart des Mittels, bei einer Referenzaffinität spezifisch an das Bindungstarget bindet;
Feststellen der Bindungsaffinität des Proteins zu dem Bindungstarget, um eine von dem Mittel beeinflusste Affinität festzustellen,
wobei ein Unterschied zwischen der durch das Mittel beeinflussten Affinität und der Referenzaffinität anzeigt, dass das Mittel die Bindung des Proteins an das Bindungstarget moduliert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Nukleotidsequenzen der natürlichen unc5h-1-cDNAs aus der Ratte und dem Menschen sind als SEQ ID Nr. 1 bzw. 2 gezeigt, und die begrifflichen Übersetzungen sind als SEQ ID Nr. 5 bzw. 6 gezeigt. Die Nukleotidsequenzen der natürlichen unc5h-2-cDNAs aus der Ratte und dem Menschen sind als SEQ ID Nr. 3 bzw. 4 gezeigt, und die begrifflichen Übersetzungen sind als SEQ ID Nr. 7 bzw. 8 gezeigt.
Die Wirbeltiert-UNC-5-spezifische Aktivität oder Funktion kann durch geeignete in vitro-, auf Zellen basierenden oder in vivo-Tests festgestellt werden: z. B. in v/tro-Bindungstests, Zellkulturtests, in Tieren (z. B. Gentherapie, transgene Verfahren usw.), usw.. Bindungstests umfassen alle Tests, wo die molekulare Wechselwirkung eines Wirbeltier-UNC-5-Proteins mit einem Bindungstarget ausgewertet wird. Das Bindungstarget kann ein natürliches extrazelluläres Bindungstarget wie beispielsweise ein Netrinprotein oder ein anderer Regulator, welcher die Wirbeltier-UNC-5-Aktivität oder dessen Lokalisierung direkt moduliert, sein; oder ein nicht natürliches Bindungstarget wie beispielsweise ein spezifisches Immunprotein wie z. B. ein Antikörper, oder ein Wirbeltier-UNC-5-spezifisches Mittel wie beispielsweise jene, die in Screeningtests, wie sie beispielsweise nachstehend beschrieben werden, identifiziert wurden.
Die Wirbeltier-UNC-5-Bindungsspezifität kann durch Gleichsgewichtsbindungskonstanten (gewöhnlich wenigstens ca. 10&sup7; M&supmin;¹, vorzugsweise wenigstens ca. 10&sup8; M&supmin;¹, insbesondere wenigstens ca. 10&sup9; M&supmin;¹), durch die Fähigkeit des betreffenden Proteins, in Wirbeltier-UNC-5-exprimierenden Zellen als negative Mutanten zu fungieren, um einen Wirbeltier-UNC-5-spezifischen Antikörper in einem heterologen Säugetierwirt (z. B. einem Nagetier oder Kaninchen) hervorzurufen usw., getestet werden. In jedem Fall unterscheidet sich die Wirbeltier-UNC-5- Bindungsspezifität des betreffenden Wirbeltier-UNC-5-Proteins notwendigerweise von C. elegans-UNC-5.
Die beanspruchten Wirbeltier-UNC-5-Proteine sind isoliert oder rein: Ein "isoliertes" Protein ist nicht mehr von wenigstens einem Teil des Materials, mit welchem es in seinem natürlichen Zustand verbunden ist, begleitet, der vorzugsweise wenigstens ca. 0,5% und noch bevorzugter wenigstens ca. 5 Gew.-% des Gesamtproteins in einer vorgegebenen Probe ausmacht, und ein reines Protein macht wenigstens ca. 90% und vorzugsweise wenigstens ca. 99 Gew.-% des Gesamtproteins in einer vorgegebenen Probe aus. Die Wirbeltier-UNC-5- Proteine und -Proteindomänen können synthetisiert werden, durch rekombinante Gentechnik hergestellt werden oder aus Säugetier-, vorzugsweise menschlichen Zellen gereinigt werden. Eine große Vielzahl molekularer und biochemischer Verfahren steht zur biochemischen Synthese, molekularen Expression und Reinigung der betreffenden Zusammensetzungen zur Verfügung, siehe z. B. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Herausg. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) oder ist ansonsten im Stand der Technik bekannt.
Natürliche und nicht natürliche Wirbeltier-UNC-5-spezifische Bindungsmittel können bei der Diagnose, Therapie und pharmazeutischen Entwicklung verwendet werden. Beispielsweise sind Wirbeltier-UNC-5-spezifische Mittel bei einer Vielzahl diagnostischer und therapeutischer Anwendungen nützlich. Wirbeltier-UNC-5-spezifische Bindungsmittel umfassen Wirbeltier- UNC-5-spezifische Liganden wie z. B. die Netrine und somatisch rekombinierte Proteinrezeptoren wie spezifische Antikörper oder T-Zell-Antigenrezeptoren (siehe z. B. Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory) und andere natürliche Bindungsmittel, welche mit Tests wie beispielsweise Ein-, Zwei- und Drei-Hybridscreens identifiziert wurden, nicht natürliche Bindungsmittel, die in Screens von chemischen Bibliotheken, wie sie beispielsweise nachstehend beschrieben werden, identifiziert wurden, usw.. Für diagnostische Anwendungen werden die Bindungsmittel häufig markiert, wie beispielsweise mit fluoreszierenden, radioaktiven, chemilumineszenten oder anderen leicht nachweisbaren Molekülen, welche entweder direkt mit dem Bindungsmittel konjugiert werden oder mit einer Sonde konjugiert werden, die für das Bindungsmittel spezifisch ist. Besonders interessante Mittel modulieren die Funktion des Wirbeltier-UNC-5, beispielsweise die Wirbeltier- UNC-5-abhängige Zelllenkung; beispielsweise können isolierte Zellen, ganze Gewebe oder Individuen mit einem Wirbeltier-UNC-5-Bindungsmittel behandelt werden, um die Wirbeltier- UNC-5-abhängige Zelllenkung oder Funktion zu aktivieren, zu hemmen oder zu verändern.
Die Erfindung stellt mit UNC-5 zusammenhängende Nukleinsäuren bereit, welche eine große Vielzahl von Anwendungen, einschließlich einer Verwendung als translatierbare Transkripte, Hybridisierungssonden, PCR-Primer, diagnostische Nukleinsäuren usw.; eine Anwendung bei dem Nachweisen des Vorliegens von unc-5-Genen und -Gentranskripten und beim Nachweisen oder Amplifizieren von Nukleinsäuren, welche weitere unc-5-Homologe und UNC-5- Strukturanaloge codieren, haben. Die betreffenden Nukleinsäuren bestehen aus synthetischen/nicht natürlichen Sequenzen und/oder werden isoliert, d. h. sie sind nicht mehr von wenigstens einem Teil des Materials begleitet, mit welchem diese in ihrem natürlichen Zustand verbunden sind, der vorzugsweise wenigstens ca. 0,5%, vorzugsweise wenigstens ca. 5 Gew.-% der Gesamtnukleinsäure ausmacht, die in einer vorgegebenen Fraktion vorliegt, und sie sind gewöhnlich rekombinant, was bedeutet, dass diese eine nicht natürliche Sequenz oder eine natürliche Sequenz, die mit einem Nukleotid (Nukleotiden) verknüpft ist (sind), das von dem verschieden ist, an welches dieses in einem natürlichen Chromosom gebunden ist, umfassen. Nukleinsäuren, welche die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 4 umfassen, enthalten eine solche Sequenz an einem Ende, das unmittelbar von einer Sequenz flankiert ist, welche sich von der unterscheidet, mit der diese in einem natürlichen Chromosom verbunden ist, oder das von einem nativen flankierenden Bereich von weniger als 10 kb, vorzugsweise weniger als 2 kb flankiert ist, welcher an einem Ende vorliegt oder unmittelbar von einer Sequenz flankiert ist, die sich von der unterscheidet, mit welcher diese in einem natürlichem Chromosom verbunden ist. Während die Nukleinsäuren gewöhnlich RNA oder DNA sind, ist es oft vorteilhaft, Nukleinsäuren zu verwenden, die andere Basen oder Nukleotidanaloga enthalten, um eine modifizierte Stabilität usw. bereitzustellen.
Die Aminosäuresequenzen der offenbarten Wirbeltier-UNC-5-Proteine werden verwendet, um Wirbeltier-UNC-5-Protein-codierende Nukleinsäuren zurück zu translatieren, die für ausgewählte Expressionssysteme optimiert sind (Holler et al. (1993) Gene 136, 323-328; Martin et al. (1995) Gene 154, 150-166), oder werden verwendet, um Oligonukleotidprimer und Sonden zur Verwendung bei der Isolierung von natürlichen Wirbeltier-UNC-5-codierenden Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen ("GCG"-Software, Genetics Computer Group, Inc. Madison WI). Wirbeltier-UNC-5-codierende Nukleinsäuren werden in Wirbeltier-UNC-5-Expressionsvektoren verwendet und in rekombinante Wirtszellen, z. B. zur Expression und zum Screenen, in transgene Tiere, z. B. für Funktionsstudien wie beispielsweise der Wirksamkeit von zu testenden Arzneimitteln für eine Krankheit, die mit der Wirbeltier-UNC-5-modulierten Transkription verbunden ist, usw. eingebracht.
Das Nachweisen einer spezifischen Hybridisierung erfordert im allgemeinen stringente Bedingungen, z. B. Hybridisieren in einem Puffer, welcher 30% Formamid in 5 · SSPE (0,18 M NaCl, 0,01 M NaPO&sub4;, pH 7,7, 0,001 M EDTA)-Puffer umfasst, bei einer Temperatur von 42ºC und ein Gebundenbleiben, wenn eine Wäsche bei 42ºC mit 0,2 · SSPE durchgeführt wird; vorzugsweise Hybridisieren in einem Puffer, welcher 50% Formamid in 5 · SSPE-Puffer umfasst, bei einer Temperatur von 42ºC und Gebundenbleiben, wenn eine Wäsche bei 42ºC mit 0,2 · SSPE-Puffer bei 42ºC durchgeführt wird. Wirbeltier-UNC-5-cDNA-Homologe können ebenfalls von einem anderen Protein unterschieden werden, indem Ausrichtungsalgorithmen wie beispielsweise BLASTX (Altschu) et al. (1990) Basic Local Alignment Search Tool, J Mol Biol 215, 403-410) verwendet werden.
Wirbeltier-une 5-Hybridisierungssonden finden Anwendung beim Identifizieren von Wildtyp- und Mutantenallelen von Wirbeltier-une 5 in klinischen und Laborproben. Mutantenallele werden verwendet, um allelespezifische Oligonukleotid(ASO)-Sonden für klinische Hochdurchsatzdiagnosen zu erzeugen. Therapeutische Wirbeltier-UNC-5-Nukleinsäuren werden verwendet, um die zelluläre Expression oder die intrazelluläre Konzentration oder Verfügbarkeit von aktivem Wirbeltier-UNC-5 zu modulieren. Beispielsweise werden Wirbeltier-UNC-5-Nukleinsäuren ebenfalls verwendet, um die zelluläre Expression oder die intrazelluläre Konzentration oder Verfügbarkeit von aktivem Wirbeltier-UNC-5-Protein zu modulieren. Inhibitorische Wirbeltier-UNC-5-Nukleinsäuren sind typischerweise antisense: einzelsträngige Sequenzen, die komplementäre Sequenzen zu den offenbarten natürlichen Wirbeltier-UNC-5-codierenden Sequenzen umfassen. Eine antinsense-Modulation der Expression eines vorgegebenen Wirbeltier-UNC-5-Proteins kann antisense-Nukleinsäuren einsetzen, die funktionsfähig mit genregulatorischen Sequenzen verknüpft sind. Zellen werden mit einem Vektor transfiziert, welcher eine Wirbeltier-UNC-5-Sequenz mit einer Promotorsequenz umfasst, die derart orientiert ist, dass die Transkription des Gens ein antisense-Transkript ergibt, das in der Lage ist, endogene Wirbeltier-UNC-5-codierende mRNA zu binden. Die Transkription der antisense-Nukleinsäure kann konstitutiv oder induzierbar sein, und der Vektor kann für eine stabile extrachromosomale Erhaltung oder eine Integration sorgen. Alternativ können einzelsträngige antisense-Nukleinsäuren, welche an genomische DNA oder mRNA binden, die ein vorgegebenes Wirbeltier-UNC-5-Protein codiert, einer Zielzelle, die sich in einem Wirt befindet oder zeitweise aus diesem isoliert wurde, bei einer Konzentration, die zu einer wesentlichen Verringerung der Expression des Zielproteins führt, verabreicht werden. Eine Verstärkung der Wirbeltier-UNC-5-Expression wird bewirkt, indem in den Targetzelltyp Wirbeltier-UNC-5-Nukleinsäuren eingeführt werden, welche die funktionale Expression der entsprechenden Genprodukte erhöhen. Solche Nukleinsäuren können Wirbeltier-UNC-5-Expressionsvektoren, Vektoren, welche die funktionelle Expression eines endogenen Allels nach oben regulieren, oder Austauschvektoren für eine angestrebte Korrektur von Mutantenallelen sein. Techniken zum Einführen der Nukleinsäuren in lebensfähige Zellen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen eine auf Retroviren basierende Transfektion, eine Virenhüllprotein-Liposomenvermittelte Transfektion usw..
Die Erfindung stellt effiziente Verfahren zum Identifizieren von Mitteln, Verbindungen oder Leitverbindungen für Mittel, die auf der Stufe einer durch Wirbeltier-UNC-S modulierbaren Zellfunktion aktiv sind, bereit. Im allgemeinen beinhalten diese Screeningverfahren ein Testen auf Verbindungen, welche die Wirbeltier-UNC-5-Wechselwirkung mit einem natürlichen Wirbeltier-UNC-5-Bindungstarget modulieren. Eine große Vielzahl von Tests für Bindungsmittel wird bereitgestellt, einschließlich markierter in vitro-Protein-Proteinbindungstests, Immunoassays, auf Zellen basierenden Tests, auf Tieren basierenden Tests usw.. Bevorzugte Verfahren sind für ein automatisiertes kostengünstiges Hochdurchsatzscreenen von chemischen Bibliotheken auf Leitverbindungen geeignet. Solche Bibliotheken umfassen Testkandidaten aus zahlreichen chemischen Klassen, auch wenn diese typischerweise organische Verbindungen sind, vorzugsweise kleine organische Verbindungen, und werden aus einer großen Vielzahl von Quellen, einschließlich Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen erhalten. Die identifizierten Mittel finden eine Anwendung in der pharmazeutischen Industrie für Versuche mit Tieren und Menschen; beispielsweise können die Mittel derivatisiert werden und erneut in in vitro- und in vivo-Tests gescreent werden, um für die pharmazeutische Entwicklung die Aktivität zu optimieren und die Toxizität zu minimieren.
In vitro-Bindungstests setzen eine Mischung von Komponenten ein, welche das Wirbeltier- UNC-5-Protein einschließen, welches Teil eines Fusionsprodukts mit einem anderen Peptid oder Polypeptid, beispielsweise einem Label zum Nachweis oder zur Verankerung usw. sein kann. Die Testmischungen umfassen ein natürliches extrazelluläres Wirbeltier-UNC-5-Bindungstarget wie beispielsweise ein Netrin. Während native Bindungstargets verwendet werden können, ist es oft bevorzugt, Teile (z. B. Peptide) von diesen zu verwenden, solange wie der Teil eine Bindungsaffinität und -avidität zu dem betreffenden Wirbeltier-UNC-5-Protein bereitstellt, die in dem Test bequem gemessen werden kann. Die Testmischung umfasst ebenfalls ein zu testendes pharmakologisches Mittel und typischerweise eine Vielzahl anderer Reagenzien wie z. B. Salze, Puffer, neutrale Proteine, z. B. Albumin, Detergentien, Proteaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel usw.. Die Mischungskomponenten können in jeder Reihenfolge zugegeben werden, welche für die erforderlichen Bindungen sorgt, und die Inkubationen können bei jeder Temperatur durchgeführt werden, welche eine optimale Bindung erleichtert. Die Mischung wird dann unter Bedingungen inkubiert, unter welchen ohne Vorliegen des zu testenden pharmakologischen Mittels das Wirbeltier-UNC-5- Protein spezifisch an das zelluläre Bindungstarget, den Teil oder das Analoge mit einer Referenzbindungsaffinität bindet. Inkubationsperioden werden in ähnlicher Weise im Hinblick auf eine optimale Bindung ausgewählt, werden aber ebenfalls minimiert, um ein schnelles, Hochdurchsatzscreenen zu erleichtern.
Nach der Inkubation wird die von dem Mittel beeinflusste Bindung zwischen dem Wirbeltier- UNC-5-Protein und einem oder mehreren Bindungstargets festgestellt. Ein Trennungsschritt wird oft anfangs angewendet, um gebundene von ungebundenen Komponenten abzutrennen. Die Trennung kann durch Präzipitation (z. B. TCA-Präzipitation, Immunpräzipitation usw.), Immobilisierung (z. B. auf einem festen Substrat) usw. durchgeführt werden, worauf ein Waschen durch beispielsweise Membranfiltration, Gelchromatographie (z. B. Gelfiltration, Affinität usw.) folgt. Eine der Komponenten umfasst gewöhnlich eine Markierung oder ist mit dieser gekoppelt. Die Markierung kann für einen direkten Nachweis, beispielsweise durch Radioaktivität, Lumineszenz, optische oder Elektronendichte usw., oder einen indirekten Nachweis, beispielsweise durch ein Epitoplabel, ein Enzym usw. sorgen. Eine Vielzahl von Verfahren kann verwendet werden, um die Markierung nachzuweisen, was von der Natur der Markierung und von anderen Testkomponenten abhängt, z. B. durch optische oder Elektronendichte, Strahlenemissionen, nicht strahlende Energieübertragungen usw., oder kann indirekt mit Antikörperkonjugaten usw. nachgewiesen werden. Ein Unterschied bei der Bindungsaffinität des Wirbeltier-UNC-5-Proteins an das Target in Abwesenheit des Mittels im Vergleich zu der Bindungsaffinität in Gegenwart des Mittels zeigt, dass das Mittel die Bindung des Wirbeltier-UNC-5-Proteins an das Wirbeltier-UNC-5-Bindungstarget moduliert. In analoger Weise zeigt bei dem auf Zellen basierenden Transkriptionstest, welcher ebenfalls nachstehend beschrieben wird, ein Unterschied bei der transkriptionalen Induktion des Wirbeltier-UNC-5 in Gegenwart und Abwesenheit eines Mittels, dass das Mittel die Wirbeltier- UNC-5-induzierte Transkription moduliert. Ein Unterschied, wie hierin verwendet, ist statistisch signifikant und stellt vorzugsweise einen Unterschied von wenigstens 50%, noch bevorzugter wenigstens 90% dar.
Der folgende experimentelle Abschnitt und die Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben.

EXPERIMENTELLES

cDNAs, die für zwei Rattenhomologe von UNC-5 codieren, welche UNC5H-1 (SEQ ID Nr. 1) und UNC5H-2 (SEQ ID Nr. 3) genannt wurden, wurden aus einer E18-Rattenhirn-cDNA-Bibliothek isoliert (siehe Methoden). Die vorhergesagten Proteine (SEQ ID Nr. 5 und 7) zeigen eine Sequenzähnlichkeit mit UNC-5 über deren gesamte Längen, sind einander aber ähnlicher (52% Identität) als zu UNC-5 (in jedem Fall 28% Identität). Wie UNC-514 besitzen beide zwei vorhergesagte Ig-ähnliche Domänen und zwei vorhergesagte Thrombospondin Typ-1 Repeats in ihren extrazellulären Domänen, einen vorhergesagten membranüberspannenden Bereich und eine große intrazelluläre Domäne. Die UNC5H-Proteine besitzen jeweils ebenfalls eine Signalsequenz, welche merkwürdigerweise in UNC-514 fehlt. Die vorhergesagte Topologie der UNC5H-Proteine in Zellmembranen wurde unter Verwendung von rekombinanten Versionen der Proteine, die in transfizierten Zellen exprimiert wurden, und Antikörpern, welche gegen die extrazelluläre und intrazelluläre Domäne gerichtet waren, verifiziert (siehe Methoden). Die zytoplasmatischen Domänen der zwei UNC5H-Proteine enthalten keine offensichtlichen Signalmotive, besitzen aber einen kleinen Homologiebereich mit der Zona Occludens-1 (ZO-1), einem Protein, das an Haftzonen lokalisiert ist und an der Bildung von Verbindungsstellen beteiligt ist18,19. ZO-1 enthält PDZ-Domänen18,19, Strukturen, die an der Proteinclusterbildung beteiligt sind²&sup0;, aber der Homologiebereich mit UNC-5-Homologen entspricht einer einzigen Sequenz an dem Carboxyterminus von ZO-1. Die Homologie zwischen ZO-1 und C. elegans-UNC-5 ist weniger ausgeprägt, ist aber nichtsdestotrotz ersichtlich, wenn alle vier Sequenzen gegeneinander ausgerichtet werden.
Um festzustellen, ob die UNC-5-Homologen Kandidaten für Rezeptoren sind, die an der neuronalen Wanderung oder der Lenkung von Axons beteiligt sind, haben wir zuerst die Expressionsstellen von Unc5h-1 und Unc5h-2 durch RNA-in situ-Hybridisierung in Rattenembryos untersucht. Unc5h-1-Transkripte werden in frühen Stadien der Nervenbahnentwicklung im ventralen Rückenmark nachgewiesen. Am 11. Tag des Embryos (E11), wenn die Motoneuronen anfangen, sich in diesem Bereich zu differenzieren²¹, liegen Transkripte über das gesamte ventrale Rückenmark hinweg vor, wobei der Bereich der mittleren Bodenplatte ausgeschlossen ist, diese aber in der ventrikulären Zone und an den seitlichen Rändern am intensivsten vorliegen. An E12 wird eine vorherrschende Expression in den motorischen Säulen beobachtet, diese erstreckt sich aber ebenfalls mehr in Richtung dorsal und wird nun aus der ventrikulären Zone ausgeschlossen. Diese mehr dorsal gelegene Expression scheint vorübergehend zu sein, da die Expression ab E13 auf postmitotische Zellen im ventralen Rückenmark beschränkt ist, welche offensichtlich die Motoneuronen einschließen. Unc5h-2Transkripte werden im Rückenmark bis zu E14 nicht in signifikanten Mengen nachgewiesen, wenn diese in dem Bereich der Dachplatte gefunden werden. Unc5h-2 Transkripte werden jedoch in sich entwickelnden sensorischen Ganglien, welche das Rückenmark flankieren, mit niedrigen Niveaus an E12 und mit höheren Niveaus ab E14 nachgewiesen. Die Expression dieser zwei Gene wird somit in Bereichen beobachtet, wo sich differenzierende Neuronen eine Axonogenese durchlaufen, was mit einer möglichen Rolle in diesem Prozess im Einklang steht.
Die Expression dieser Gene wird ebenfalls bei höheren axialen Stufen des Nervensystems wie auch bei nicht neuralen Strukturen beobachtet. An E13 wird Unc5h-1 in der Basalplatte (ventrale Nervenbahn) im Rautenhirn und im Mittelhirn, in dem sich entwickelnden Hypothalamus und Thalamus und im Pallidum exprimiert. Eine Unc5h-2 Expression in diesem Stadium wird auf der dorsalen Seite der sich entwickelnden Papillenexkavation, der Nasengruben, des apikalen Rands der Gliedmassenanlagen, des Urogenitaltuberkels und in begrenzten Bereichen des Mittelhirns und des kaudalen Zwischenhirns nachgewiesen. Ab E16 wird Unc5h-1-mRNA ebenfalls mit hohen Niveaus in der Entorhinalrinde und mit niedrigeren Niveaus über den gesamten Kortex hinweg nachgewiesen. Unc5h-2 wird in diesem Stadium ebenfalls mit niedrigen Niveaus im Kortex nachgewiesen und mit höheren Niveaus in hypertrophen Chondrozyten. Die Expression der zwei Homologen bleibt nach der Geburt bestehen, mit einer am 10. Tag nach der Geburt (P10) fortbestehenden Expression von beiden mit niedrigen Niveaus über den gesamten Kortex hinweg, einer Expression von beiden in unterschiedlichen Mustern im Septumbereich und einem hohen Niveau der Expression von Unc5h-1 in dem sich entwickelnden Hippocampus und der Entorhinalrinde. Zusätzlich liegt eine vorherrschende Stelle der postnatalen Expression beider Gene im Cerebellum. Beide werden in der inneren Granulozytenschicht exprimiert, und Unc5h-2 wird zusätzlich auf der Innenseite der äußeren Keimschicht exprimiert, wo sich Granulozytenvorläufer differenzieren, bevor diese zu ihrem endgültigen Ziel in der inneren Granulozytenschicht wandern22,23. Somit ist die Expression von Unc5h-2 in diesem Bereich mit dem Auftreten einer deutlichen Zellwanderung in dem sich entwickelnden Cerebellum verbunden.
Obwohl die Expressionsmuster der zwei UNC5H-Proteine mögliche Rollen bei der Wanderung von Zellen oder Axons nahelegten, haben wir, um einen direkteren Beweis zu erhalten, dass diese an den Vermittlungsreaktionen zu den Netrinen beteiligt waren, getestet, ob Netrin-1 Zellen binden kann, welche diese Proteine exprimieren. Transfizierte Affennieren COS-1- Zellen oder menschliche embryonale Nieren 293-Zellen, welche entweder UNC5H-1 oder UNC5H-2 exprimierten, zeigten eine signifikante Bindung des Netrin-1-Proteins über dem Hintergrund, wie sie ebenfalls für transfizierte Zellen beobachtet wird, welche die Netrinrezeptoren DCC und Neogenin exprimieren, nicht aber für transfizierte Zellen, welche TAG-1 oder L1, zwei weitere Miglieder der Ig-Superfamilie¹³, exprimieren. In diesen Experimenten wurde die Bindung in Gegenwart von löslichem Heparin durchgeführt, welches eine nicht spezifische Bindung von Netrin-1 an die Zellen eliminiert¹³, aber eine Bindung an die UNC5-Homologen nicht ersichtlich verhindert. Um in dem Fall von UNC5H-2 zu verifizieren, dass exogen zugegebenes Heparin für die Wechselwirkung nicht notwendig ist, haben wir ein lösliches Protein erzeugt, das die extrazelluläre Domäne von UNC5H-2 fusioniert mit dem konstanten Bereich (Fc) eines menschlichen Immunglobulinmoleküls umfasst. Dieses UNC5H- 2-Fc-Fusionsprotein band an transfizierte 293-Zellen, welche Netrin-1 exprimierten (von dem ein Teil mit der Oberfläche dieser Zellen verbunden bleibt3,10), in Abwesenheit von zugegebenem Heparin zeigten, aber keine Bindung an nicht transfizierte Zellen, noch an Zellen, die UNC5H-2 selbst, DCC oder Neogenin exprimierten. Die UNC5H2-Fc-Fusion band ebenfalls nicht an transfizierte Zellen, welche F-Spondin, ein anhaftendes extrazelluläres Matrixprotein, das von Grundplattenzellen erzeugt wird²&sup4;, oder Semaphorin III, ein Chemorepellens für sensorische Axons in den Stadien, in welchen Unc5h-2 in sensorischen Ganglien exprimiert wird²&sup5;, exprimierten. Beide diese Proteine werden wie Netrin-1 sezerniert, teilen sich aber zwischen Zelloberflächen und der löslichen Fraktion auf24,26. Somit scheint die Wechselwirkung zwischen Netrin-1 und UNC5H-2 spezifisch zu sein und erfordert weder Heparin, noch spiegelt diese eine generalisierte Wechselwirkung mit Proteinen wider, die nicht-spezifisch mit Zelloberflächen assoziieren.
Die Affinität der UNC-5-Homologen für Netrin-1 wurde in Gleichgewichtsbindungsexperimenten abgeschätzt, wobei Netrin (VIoV)-Fc, eine Fusion der aminoterminalen zwei Drittel von Netrin-1 mit dem konstanten Bereich von menschlichem IgG verwendet wurde¹³. Dieses Netrin-1-Derivat ist biologisch aktiv, aggregiert aber anders als Netrin-1 nicht bei hohen Konzentrationen, und es bindet DCC mit einer Kd, welche mit der für das Netrin-1 mit voller Länge vergleichbar ist¹³. Die spezifische Bindung von Netrin (VIoV)-Fc an jedes der drei UNC5- Homologen zeigte eine Sättigung, und die Bindungskurven wurden mit der Hill-Gleichung angepasst, was Kd-Werte von 19 ± 0,8 nM und 3,4 ± 1,0 nM für UNC5H1 bzw. UNC5H2 ergab. Diese Werte sind mit der Kd für die DCC-Netrin (VIoV-Fc)-Wechselwirkung (~5 nM) vergleichbar und stehen mit der wirksamen Dosis für die das Auswachsen von Axons fördernden Wirkungen von Netrin-112,13 in Einklang.
Ein Feststellen der Beteiligung dieser Wirbeltier-UNC5H-Proteine an der Zellwanderung und der Lenkung von Axons erfordert, deren Funktionen in vivo zu stören. In der Zwischenzeit sind unsere Ergebnisse jedoch zumindest mit einer solchen Beteiligung konsistent, da diese Homologen durch einige Zellpopulationen exprimiert werden, die Wanderungen durchmachen oder Axons verlängern. Beispielsweise wird Unc5h1 von spinalen Motoneuronen exprimiert, deren Axons in vitro durch Grundplattenzellen abgestoßen werden²&sup7; und deren Auswachsen in vitro durch Netrin-1 unterdrückt werden kann. Es wird ebenfalls in dem Bereich von trochlearen Motoneuronen exprimiert, welche durch Netrin-1 abgestoßen werden können&sup4;. Beide Unc5h-Gene werden ebenfalls in dem sich entwickelnden Cerebellum exprimiert, welches ein Ort einer ausgeprägten Zellwanderung ist.
Obwohl die in vivo-Funktionen der UNC-5-Homologen, die hier beschrieben werden, noch festgestellt werden müssen, liefert unser Beweis, dass Wirbeltier-UNC5H-Proteine Netrin-1 binden, eine direkte Unterstützung für die Vorstellung, dass Mitglieder dieser neuen Unterfamilie der Ig-Superfamilie Netrin-Rezeptoren sind. Diese Vorstellung wurde zuerst für C. elegans-UNC-5 vorgeschlagen, auf der Grundlage der Feststellung, dass unc-5 zellautonom für dorsale Wanderungen benötigt wird, welche die Funktion des Netrins UNC-614 erfordern, und dass die ektopische Expression von ung-5 in Neuronen, die normalerweise in Längsrichtung oder ventral hervorstehen, deren Axons nach dorsal steuern kann¹&sup7;. Obwohl diese Ergebnisse mit der Möglichkeit in Einklang stehen, dass UNC-5 ein UNC-6-Rezeptor ist, stehen sie ebenfalls mit einer Rolle für UNC-5 beim Modifizieren der Funktion eines bestimmten UNC-6- Rezeptors in Einklang. Die Möglichkeit einer Funktion als Modifikator wurde durch den Beweis plausibler gemacht, dass das DCC-Homologe UNC-40, welches ein möglicher UNC-6- Rezeptor ist, der an ventralen Wanderungen beteiligt ist¹¹, von Axons exprimiert wird, die nach dorsal gerichtet sind und für diese Projektionen benötigt wird11,15,16, was nahe legt, dass UNC-5 so fungieren könnte, dass es einen anziehenden Netrin-Rezeptor (UNC-40) in einen abstoßenden Netrin-Rezeptor umwandelt. Jedoch legen unsere Ergebnisse nahe, dass UNC-5 ebenfalls direkt als ein Netrin-Rezeptor fungiert. Ein Modell, in welchem UNC-40 und UNC-5 einen Rezeptorkomplex bilden können, aber UNC-5 ebenfalls allein fungieren kann, indem es das UNC-6-Netrinsignal umwandelt, liefert eine Erklärung für die Beobachtung, dass der Verlust der unc-40-Funktion zu einem viel weniger ausgeprägten Phenotyp für dorsale Wanderungen führt, als dieses entweder der Verlust der unc-5'- oder der Verlust der unc-6-Funktion tun15,16.
Neuere Studien haben eine bemerkenswerte phylogenetische Konservierung bei der Funktion von Netrin-Proteinen bei der Lenkung von Axons hin zu einer Quelle von Netrin an der Mittellinie der Nervensysteme von Nematoden, Fliegen und Wirbeltieren gezeigt1,7,8,9, wie auch eine konservierte Rolle für Mitglieder der DCC-Unterfamilie der Ig-Superfamilie beim Vermitteln von axonalen Reaktionen, welche diesen Lenkungsereignissen zugrunde liegen11,12, 13. Die Identifizierung von Wirbeltierhomologen von UNC-5 und der Beweis, dass diese netrinbindende Proteine sind, legt nahe, dass die Signalmechanismen, durch welche Netrine abstoßende Reaktionen hervorrufen, ebenfalls konserviert sind.
Isolierung von Ratten-UNC-5-Homologen und in situ-Hybridisierung. Eine Suche in Datenbanken von menschlichen Expressed Sequence Tags (EST) ergab eine kleine Sequenz (Genbankzugangsnummer R11880) mit einer entfernten Ähnlichkeit zu dem carboxyterminalen Bereich von UNC-5. Das entsprechende cDNA-Fragment, das durch die Polymerase-Kettenreaktion aus einer cDNA-Bibliothek des embryonalen menschlichen Gehirns (Stratagene) amplifiziert wurde, wurde verwendet, um die Bibliothek zu screenen, was zu der Isolierung eines cDNA- Klons mit 3,8 kB führte, welcher den gesamten Codierungsbereich des menschlichen Homologen von UNC5H1 bis auf die ersten 440 nt umfasste. Nicht überlappende Sonden aus dieser cDNA wurden verwendet, um eine E18-Rattenhirnbibliothek (Geschenk von S. Nakanishi) zu screenen, was zu der Isolierung von sieben partiellen und einer UNC5H1-cDNA mit voller Länge und einer UNC5H2-cDNA mit voller Länge führte. Zusätzliche Screens von E13-Ratten- Bibliotheken des dorsalen und ventralen Rückenmarks führten zu der Isolierung einer zweiten UNC5H2-cDNA mit voller Länge wie auch einer UNC5H1-cDNA mit nahezu voller Länge. Die Sequenzierung wurde auf einem automatisierten Licor (L4000)-Sequenziergerät wie auch durch cyclische ³³P-Sequenzierung durchgeführt. Die Genbankzugangsnummern für rUNC5H1 bzw. rUNC5H2 sind U87305 und U87306. Die RNA-in situ-Hybridisierung wurde wie beschrieben¹³ durchgeführt.
Antikörper, Expressionskonstrukte und Immunhistochemie. Polyklonale Kaninchenantiseren wurden gegen ein Peptid, das einer Sequenz (YLRKNFEQEPLAKE, SEQ ID Nr. 7, Reste 148- 161) in der extrazellulären Domäne von UNC5H-2 entsprach, die in UNC5H-1 fast vollständig konserviert ist (eine Aminosäuresubstitution) und gegen Peptide, welche einmaligen Sequenzen in den zytoplasmatischen Domänen von UNC5H-1 (GEPSPDSWSLRLKKQ, SEQ ID Nr. 5, Reste 580-594) und UNC5H-2 (EARQQDDGDLNSLASA, SEQ ID Nr. 7, Reste 909-924) entsprachen, erzeugt. Die Antiseren wurden an den entsprechenden Peptiden über die Affinität gereinigt (Quality Controlled Biochemicals). cDNAs für die verschiedenen Konstrukte wurden in den COS-Zellexpressionsvektor pMT21 und den 293-EBNA-Zellexpressionsvektor pCEP4 (Invitrogen) subkloniert und vorübergehend unter Verwendung von Lipofectamin in diese Zellen transfiziert. Das Antiserum gegen das extrazelluläre Peptid kann beide UNC5H-Proteine, die in transfizierten Zellen exprimiert werden, ohne eine Permeabilisierung der Zellen nachweisen, wogegen die Antiseren, die gegen die Peptide der zytoplasmatischen Domäne gerichtet waren, ihre entsprechenden Proteine nach einer Permeabilisierung der Zellen nachwiesen. Das Netrin-1-Protein wurde hergestellt, gereinigt, in Bindungstests verwendet und sichtbar gemacht wie beschrieben wurde¹³, außer dass ein monoklonaler Antikörper (9E10)²&sup9;, welcher gegen ein C-terminales myc-Epitoplabel gerichtet ist, verwendet wurde, um rekombinantes Netrin-1 nachzuweisen, und Heparin mit 1 ug/ml verwendet wurde. Eine 293-EBNA-Zelllinie, welche stabil die UNC5H-2-Fc-Fusion exprimierte, wurde wie beschrieben abgeleitet und aufrechterhalten10,13. Das Fusionsprotein wurde aus serumfreiem Medium, das für sieben Tage konditioniert wurde, durch Affinitätschromatographie auf Protein A- Agarose gereinigt. Die Zellline 293, welche Netrin-1 exprimierte, war wie beschrieben¹³. Die Bindung der UNC5H-2-Fc-Fusion an diese Linie wurde sichtbar gemacht, indem ein sekundärer Cy3-konjugierter Antikörper (Jackson Immunoresearch), welcher gegen menschliches Fc gerichtet war, verwendet wurde.

Literaturstellen

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9. Serafini T., et al., Cell im Druck.
10. Shirasaki, R., Mirzayan, C., Tessier-Lavigne, M. & Murakami, F. Neuron im Druck (1996).
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BEISPIELE

1. Vorschrift für einen Hochdurchsatz-Wirbeltier-UNC-5-Netrin-Bindungstest.

A. Reagenzien:

- Neutralit-Avidin: 20 ug/ml in PBS.
- Blockierungspuffer: 5% BSA, 0,5% Tween 20 in PBS; 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Testpuffer: 100 mM KCl, 20 mM HEPES pH 7,6, 1 mM MgCl&sub2;, 1% Glycerol, 0,5% NP-40, 50 mM b-Mercaptoethanol, 1 mg/ml BSA, Proteaseinhibitorcocktail.
- ³³P-Wirbeltier-UNC-5-Protein, 10x-Stammlösung: 10&supmin;&sup8;-10&supmin;&sup6; M "kaltes" Wirbeltier- UNC-5, ergänzt mit 200.000-250.000 cpm markiertem Wirbeltier-UNC-51 (Beckman-Zähler). Während des Screenens in einen Mikrokühlschrank bei 4ºC stellen.
- Proteaseinhibitorcocktail (1.000X): 10 mg Trypsininhibitor (BMB # 109894), 10 mg Aprotinin (BMB # 236624), 25 mg Benzamidin (Sigma # B-6506), 25 mg Leupeptin (BMB # 1017128), 10 mg APMSF (BMB # 917575) und 2 mM NaVo3 (Sigma # S-6508) in 10 ml PBS.
- Netrin-1: 10&supmin;&sup7;-10&supmin;&sup5; M biotinyliertes Netrin-1 in PBS.

B. Herstellung der Testplatten:

- Beschichten mit 120 ul der Stammlösung von N-Avidin pro Vertiefung über Nacht bei 4ºC.
- Zweimal waschen mit 200 ul PBS.
- Blockieren mit 150 ul Blockierungspuffer.
- Zweimal waschen mit 200 ul PBS.

C. Test:

- Zugeben von 40 ul Testpuffer/Vertiefung.
- Zugeben von 10 ul Verbindung oder Extrakt.
- Zugeben von 10 ul ³³P-UNC-5 (20-25.000 cpm/0,1-10 umol/Vertiefung = 10&supmin;&sup9;-10&supmin;&sup7; M Endkonz.).
- Schütteln bei 25ºC für 15 Minuten.
- Inkubieren für weitere 45 Minuten bei 25ºC.
- Zugeben von 40 uM biotinyliertem Netrin-1 (0,1-10 umol/40 ul in Testpuffer).
- Inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Stoppen der Reaktion durch 4-maliges Waschen mit 200 uM PBS.
- Zugeben von 150 uM Szintillationscocktail.
- Zählen im Topcount.

D. Kontrollen für alle Tests (auf jeder Platte angeordnet):

a. Nichtspezifische Bindung

b. Inhibition durch lösliches (nicht biotinyliertes Netrin-1) bei 80%.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Tessier-Lavigne, Marc Leonardo, E. David Hink, Lindsay Masu, Masayuki Kazuko, Keino-Masu
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Netrin-Rezeptoren
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 8
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: SCIENCE & TECHNOLOGY LAW GROUP
(B) STRASSE: 268 BUSH STREET, SUiTE 3200
(C) STADT: SAN FRANCISCO
(D) BUNDESLAND: KALIFORNIEN
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94104
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version #1.30
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANGABEN ZU ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: OSMAN, RICHARD A
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 36,627
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: UC96-217
(ix) ANGABEN ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (415) 343-4341
(B) TELEFAX: (415) 343-4342
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3014 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 2:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1787 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 3:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2831 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 4:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 305 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 5:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 898 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: nicht relevant
(D) TOPOLOGIE: nicht relevant
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 6:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 557 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: nicht relevant
(D) TOPOLOGIE: nicht relevant
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 7:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 943 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: nicht relevant
(D) TOPOLOGIE: nicht relevant
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 8:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 102 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: nicht relevant
(D) TOPOLOGIE: nicht relevant
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 8:

Claims

1. Ein isoliertes Wirbeltier-UNC-5-Protein, welches die SEQ ID Nr. 5, 6, 7 oder 8 umfasst.

2. Eine rekombinante Nukleinsäure, welche ein Protein gemäß Anspruch 1 codiert.

3. Eine Zelle, welche eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 2 umfasst.

4. Ein Verfahren zur Erzeugung eines isolierten Wirbeltier-UNC-5-Proteins, welches die folgenden Schritte umfasst: Einführen einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 2 in eine Wirtszelle oder einen Zellextrakt, Inkubieren der Wirtszelle oder des Extraktes unter Bedingungen, bei welchen die Nukleinsäure als ein Transkript exprimiert wird und das Transkript als ein Translationsprodukt exprimiert wird, welches das Protein umfasst, und Isolieren des Translationsprodukts.

5. Eine isolierte Wirbeltier-UNC-5-Nukleinsäure, welche die SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 4 umfasst.

6. Ein Verfahren zum Screenen auf ein Mittel, welches die Bindung eines Wirbeltier-UNC- 5-Proteins an ein Bindungstarget moduliert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Inkubieren einer Mischung, welche umfasst:

ein isoliertes Protein gemäß Anspruch 1,

ein Bindungstarget des Proteins und

ein zu testendes Mittel;

unter Bedingungen, bei welchen das Protein, ohne Gegenwart des Mittels, bei einer Referenzaffinität spezifisch an das Bindungstarget bindet;

Feststellen der Bindungsaffinität des Proteins zu dem Bindungstarget, um eine von dem Mittel beeinflusste Affinität festzustellen,

wobei ein Unterschied zwischen der durch das Mittel beeinflussten Affinität und der Referenzaffinität anzeigt, dass das Mittel die Bindung des Proteins an das Bindungstarget moduliert.

7. Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Bindungstarget ein natürliches Netrinprotein ist.