DE69937349T2

DE69937349T2 - Kv6.2, EINE POTENTIAL-ABHÄNGIGE UNTEREINHEIT DES KALIUMKANALS.

Info

Publication number: DE69937349T2
Application number: DE69937349T
Authority: DE
Inventors: Timothy James Durham JEGLA
Original assignee: Icagen Inc
Current assignee: Icagen Inc
Priority date: 1998-07-01
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2019-07-01
Also published as: EP1092018A4; EP1092018A1; ATE376058T1; AU751553B2; CA2331829A1; EP1092018B1; AU751553C; AU4852599A; WO2000001811A1; DE69937349D1; JP2002519060A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung stellt isolierte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen von Kv6.2, Antikörper gegen Kv6.2, Verfahren zum Detektieren von Kv6.2, Verfahren zum Screenen nach Aktivatoren und Inhibitoren von spannungsgesteuerten Kaliumkanälen mit biologisch aktivem Kv6.2 und Kits zum Screenen nach Aktivatoren und Inhibitoren von spannungsgesteuerten Kaliumkanälen, die Kv6.2 umfassen, zur Verfügung.
Hintergrund der Erfindung
Kaliumkanäle sind in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen involviert, einschließlich der Regulierung des Herzschlages, der Weitung von Arterien, der Freisetzung von Insulin, der Erregbarkeit von Nervenzellen und der Regulierung des renalen Elektrolytentransports einschließt. Kaliumkanäle werden somit in einer großen Vielzahl von Tierzellen wie Nerven-, Muskel-, Drüsen-, Immun-, Reproduktions- und Epithelgewebe gefunden. Diese Kanäle erlauben den Fluss von Kalium in und/oder aus der Zelle unter bestimmten Bedingungen. Zum Beispiel macht der Auswärtsfluss von Kaliumionen nach dem Öffnen dieser Kanäle das Innere der Zelle negativer, was depolarisierenden Spannungen, die an die Zelle angelegt werden, entgegenwirkt. Diese Kanäle werden, z. B., durch Kalziumsensitivität, Spannungssteuerung, Zweitbotenstoffe, extrazelluläre Liganden und ATP-Sensitivität reguliert.
Kaliumkanäle werden durch Alpha-Untereinheiten hergestellt, die in 8 Familien, basierend auf ihren vorhergesagten strukturellen und funktionalen Ähnlichkeiten, eingeteilt sind (Wei et al., Neuropharmacology 35(7): 805–829 (1997)). Drei dieser Familien (Kv, Eag-verwandt und KQT) weisen ein gemeinsames Motiv von sechs Transmembrandomänen auf und werden primär durch Spannung gesteuert. Zwei andere Familien CNG und SK/IK enthalten auch dieses Motiv, werden aber durch zyklische Nukleotide bzw. Kalzium gesteuert. Die drei anderen Familien von Kaliumkanal-Alpha-Untereinheiten besitzen distinkte Muster von Transmembrandomänen. Die Familie der Slo-Kaliumkanäle oder der BK-Kanäle besitzen sieben Transmembrandomänen (Meers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(25): 14066–71 (1997)) und werden sowohl durch Spannung als auch Kalzium oder pH gesteuert (Schreiber et al., J. Biol. Chem. 273:3509–16 (1998)). Eine andere Familie, die nach innen richtenden Kaliumkanäle (Kir) gehören zu einer Strukturfamilie, die 2 Transmembrandomänen enthält (siehe, z. B., Lagrutta et al., Jpn. Heart. J. 37:651-660 1996)), und eine achte funktional verschiedenartige Familie (TP, oder "zweiporige") enthält 2 Tandemwiederholungen dieses nach innen richtenden Motivs.
Kaliumkanäle werden typischerweise durch vier Alpha-Untereinheiten gebildet, und können homomer (aus identischen Alpha-Untereinheiten hergestellt) oder heteromer (aus zwei oder mehr unterschiedlichen Typen von Alpha-Untereinheiten hergestellt) sein. Zusätzlich wurde gefunden, dass Kaliumkanäle, die aus Kv, KQT und Slo oder Bk Untereinheiten hergestellt sind, oft zusätzliche, strukturell verschiedene Hilfs- oder Beta-Untereinheiten enthalten. Diese Beta-Untereinheiten bilden selber keine Kaliumkanäle, sondern wirken stattdessen als Hilfsuntereinheiten, um die funktionalen Eigenschaften der Kanäle zu modifizieren, die durch Alpha-Untereinheiten gebildet werden. Zum Beispiel sind die Kv Beta-Untereinheiten zytoplasmatisch und von ihnen ist bekannt, dass sie die Oberflächenexpression von Kv-Kanälen erhöhen und/oder die Inaktivierungskinetiken des Kanals modifizieren (Heinemann et al., J. Physiol. 493: 625–633 (1996); Shi et al., Neuron 16(4): 843–852 (1996)). In einem anderen Beispiel ändert die Beta-Unterheit der KQT-Familie, mink, primär die Aktivierungskinetiken (Sanguinetti et al., Nature 384: 80–83 (1996)).
Die Kv-Superfamilie von spannungsgesteuerten Kaliumkanälen beinhaltet sowohl heteromere abs auch homomere Kanäle, die typischerweise aus vier Untereinheiten zusammengesetzt sind (siehe, z. B.., Salinas et al., J. Biol. Chem. 272: 8774–8780 (1997); Salinas et al., J. Biol. Chem 272: 24371–24379 (1997); Post et al., FEBS Letts. 399: 177–182 (1996)). Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle wurden in einer breiten Vielzahl von Geweben und Zelltypen gefunden und sind in Prozessen wie z. B. neuronaler Integration, Herzschrittmachen, Muskelkontraktion, Hormonsekretion, Regulierung des Zellvolumens, Lymphozytendifferenzierung und Zellproliferation involviert (siehe, z. B., Salinas et al., J. Biol. Chem. 39: 24371–24379 (1997)). Einige Alpha-Untereinheiten der Kv-Superfamilie, aus denen die Kanäle zusammengesetzt sind, sind kloniert und exprimiert worden, z. B., Kv5.1, Kv6.1 (Drewe et al., J. Neurosci. 12: 538–548 (1992), Post et al., FEBS Letts. 399: 177–182 (1996)); Kv8.1 (Hugnot et al., EMBO J. 15: 3322–3331 (1996)); und Kv9.1 und 9.2 (Salinas et al., J. Biol. Chem. 39: 24371–24379 (1997)). Die Expressionsmuster einige dieser Gene wurden auch untersucht (siehe, z. B., Verma-Kurvari et al., Mol. Brain. Res. 46: 54–62 (1997); Maletic-Savatic et al., J. Neurosci. 15: 3840–3851 (1995); Du et al., Neurosci. 84: 37–48 (1998)).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt somit zum ersten Mal Kv6.2 zur Verfügung, einen Polypeptid-Monomer, der eine Alpha-Untereinheit eines heteromeren spannungsgesteuerten Kaliumkanals ist. Kv6.2 wurde nicht zuvor kloniert oder identifiziert, und die vorliegende Erfindung stellt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für Maus- und Mensch-Kv6.2 zur Verfügung.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für ein Polypeptid-Monomer kodiert, das eine Alpha-Untereinheit eines heteromeren Kaliumkanals umfasst, wobei das Polypeptid-Monomer die Fähigkeit besitzt, mit wenigstens einer weiteren Kv-Alpha-Untereinheit einen heteromeren Kaliumkanal zu bilden, der die Eigenschaft zur spannungsabhängigen Durchgangsregulation besitzt und wobei die Nukleinsäure unter stringenten Bedingungen spezifisch an SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 18 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen eine Inkubation bei 42°C in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC und 1% SDS umfasst, oder eine Inkubation bei 65°C in einer Lösung, die 5x SSC und 1% SDS und einen Waschschritt bei 65°C in einer Lösung, die 0,2 × SSC und 0,1% SDS umfasst.
Die Nukleinsäure kann für ein Maus- oder Mensch-Kv6.2 kodieren. In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 17. In einer anderen Ausführungsform besitzt die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 18. In einer Ausführungsform ist die Nukleinsäure durch Amplifikation mit Primern erhältlich, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an dieselbe Sequenz selektiv hybridisieren wie die Primersätze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure für ein Polypeptid-Monomer, das ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 53 kDa bis ungefähr 65 kDa besitzt. Die Nukleinsäure hybridisiert spezifisch unter hoch stringenten Bedingungen an SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 18. In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypetid-Monomer bereit, umfassend eine Alpha-Untereinheit eines heteromeren Kaliumkanals, wobei das Polypeptid-Monomer die Fähigkeit besitzt, mit wenigstens einer weiteren Kv Alpha-Untereinheit einen heteromeren Kaliumkanal zu bilden, der die Eigenschaft zur spannungsabhängigen Regulation besitzt und durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die spezifisch unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 18 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen eine Inkubation bei 42°C in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC und 1% SDS umfasst, oder eine Inkubation bei 65°C in einer Lösung, die 5 × SSC und 1% SDS und einen Waschschritt bei 65°C in einer Lösung, die 0,2 × SSC und 0,1% SDS umfasst, umfassen.
Das Polypeptid-Monomer kann eine Aminosäure-Sequenz von Maus- oder Mensch-Kv6.2 besitzen. In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid-Monomer eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:17.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper bereit, der selektiv an das oben beschriebene Polypeptid-Monomer bindet.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der die Nukleinsäure umfasst, die für das oben beschriebene Polypeptid-Monomer kodiert. In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle bereit, die mit dem oben beschriebenen Expressionsvektor transfiziert ist.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren zur Identifikation einer Verbindung bereit, welche den Ionendurchfluss durch einen spannungskontrollierten Kaliumkanal erhöht oder vermindert, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einer eukaryotischen Wirtszelle oder einer Zellmembran, in der ein Polypeptid-Monomer der Erfindung, wie oben beschrieben, exprimiert wird, und (ii) Bestimmung der funktionellen Wirkung der Verbindung auf die Zelle oder Zellmembran, die Kaliumkanal exprimiert, wobei die funktionelle Wirkung eine Veränderung des Ionendurchflusses, des Membranpotentials, der Transkription oder eine Freisetzung eines Hormons, eines Neurotransmitters oder eines zweiten Botenstoffes umfasst.
In einer Ausführungsform wird der erhöhte oder verminderte Ionenfluss durch Messen der Änderungen des Stroms oder der Spannung bestimmt. In einer anderen Ausführungsform ist das Polypeptid-Monomer rekombinant. In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von Kv6.2 in Säugetiergewebe bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) In-Kontakt-Bringen einer isolierten biologischen Probe mit einem Kv6.2-spezifischen Reagenz, das sich selektiv mit Kv6.2 assoziiert, und (ii) Nachweis der Konzentration des Kv6.2-spezifischen Reagenz, das mit der Probe spezifisch assoziiert ist.
In einer Ausführungsform ist das Kv6.2-spezifische Reagenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Kv6.2-spezifischen Antikörpern, Kv6.2-spezifischen Oligonukleotid-Primern und Kv6.2 Nukleinsäure-Sonden. In einer anderen Ausführungsform ist die Probe von einem Menschen.
Auch beschrieben ist eine Computersystem, ein Verfahren zum Screenen nach Mutationen von Kv6.2-Genen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Eingeben in den Computer einer ersten Nukleinsäuresequenz, die für ein spannungsgesteuertes Kaliumkanalprotein kodiert, der eine Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 18 besitzt, und konservativ modifizierte Versionen davon; (ii) Vergleichen der ersten Nukleinsäuresequenz mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz, die substantielle Identität mit der ersten Nukleinsäuresequenz besitzt; und (iii) Identifizieren der Nukleotidunterschiede zwischen den ersten und zweiten Nukleinsäuresequenzen.
Die zweite Nukleinsäure kann mit einem Erkrankungszustand assoziiert sein. Auch ist ein Verfahren zum identifizieren einer dreidimensionalen Struktur von Kv6.2-Polypeptiden in einem Computersystem beschrieben, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Eingeben in das Computersystem einer Aminosäuresequenz von mindestens 25 Aminosäuren eines Kaliumkanalmonomers oder mindestens 75 Nukleotide eines Gens, das für das Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 17 besitzt, und konservativ modifizierte Versionen davon; und (ii) Erzeugen einer dreidimensionalen Struktur des Polypeptids, das durch die Aminosäuresequenz kodiert wird. Die Aminosäuresequenz kann eine Primärstruktur sein, und wobei der Schritt des Erzeugens die Schritte einschließt: (i) Bilden einer Sekundärstruktur aus der Primärstruktur mit Energiebedingungen, die durch die Primärstruktur bestimmt werden; und (ii) Bilden einer Tertiärstruktur aus der Sekundärstruktur mit Energiebedingungen, die durch die Sekundärstruktur definiert werden. Der Schritt des Erzeugens kann den Schritt des Bildens einer Quartärstruktur aus der Tertiärstruktur unter Verwendung anisotropischer Bedingungen, die durch die Tertiärstruktur bestimmt werden, beinhalten. Die Verfahren können ferner den Schritt des Identifizierens der Regionen der dreidimensionalen Struktur des Proteins, die an Liganden binden, und das Verwenden der Regionen, um Liganden zu identifizieren, die an das Protein binden, umfassen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Aminosäuregegenüberstellung der humanen und murinen Kv6.2 Gene. Identische Reste sind dunkel unterlegt und Lücken in der Gegenüberstellung werden durch Gedankenstriche angezeigt. Die Nummerierung der Aminosäurereste wird am linken Rand angegeben. Humanes und murines Kv6.2 sind auf Aminosäureebene zu insgesamt 80% identisch.
2. Expression von Kv6.2-Genen in Xenopus Oozyten. (A) Ströme, die von einer Oozyte aufgezeichnet wurden, die mit cRNA aus dem murinen Kv6.2-Gen injiziert wurde. Die Spannungsschritte waren von einem Ruhepotential von –90 mV und reichten von –80 mV bis +20 mV in 20 mV Stufungen. Weder das murine noch das humane Kv6.2 ergaben unter diesen Bedingungen nach außen gerichtete spannungsabhängige Kaliumströme. (B-D) Ströme, die von Oozyten aufgezeichnet wurden, in die cRNA des humanen Kv2.1 Gens alleine (B) einer Koinjektion mit humanem Kv2.1 und murinem Kv6.2 (C), und einer Koinjektion mit humanem Kv2.1 und humanem Kv6.2 injiziert wurde. Identische Spannungsschritte wurden auf jedes Ei angewendet. Das Ruhepotential war in jedem Fall –90 mV und die Spannungsschritte reichten von –80 mV bis +20 mV in 20 mV Stufungen. Beachtenswerterweise aktivieren beide Kv6.2/Kv2.1-Heteromere bei hyperpolarisierteren Spannungen als Kv2.1 Homomere. Es ist auch bemerkenswert, dass die Deaktivierung der Heteromere wesentlich langsamer ist als diejenige, die für Kv2.1-Homomere gesehen wird. Die Menge von Kv2.1 cRNA, die in (B) verwendet wurde, war ein Achtel von der, die in (C) und (D) verwendet wurde. Beide Kv6.2-Gene verursachten beständig eine Verminderung der Größe des Kv2.1 Stromes.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
I. Einführung
Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal ein Nukleinsäure bereit, die für Kv6.2 kodiert, die aus murinem und humanem Gewebe identifiziert und kloniert wurde. Das Polypeptidmonomer ist ein Mitglied der „Kv"-Superfamilie der Kaliumkanalmonomere. Mitglieder dieser Familie sind Polypeptidmonomere, die Untereinheiten von spannungsabhängigen Kaliumkanälen mit sechs Transmembranregionen sind (K = Kalium, v = spannungsabhängig). Spannungsabhängige Kaliumkanäle haben bedeutende Rollen beim Erhalten des Ruhepotentials und dem Kontrollieren der Erregbarkeit einer Zelle.
Die Erfindung stellt auch Verfahren bereit zum Screenen nach Aktivatoren und Inhibitoren der spannungsabhängigen Kaliumkanäle, die eine Kv6.2-Untereinheit enthalten. Solche Modulatoren von spannungsabhängiger Kanalaktivität sind nützlich beim Behandeln von ZNS-Störungen wie Migränen, Hör- und Sehproblemen, psychotischen Störungen, Anfällen, und bei neuroprotektiven Agenzien (z. B. um Schlaganfälle zu vermeiden).
Weiterhin stellt die Erfindung Assays auf Kv6.2-Aktivität bereit, worin Kv6.2 als ein direktes oder indirektes Reportermolekül wirkt. Solche Verwendungen von Kv6.2 als ein Reportermolekül in Assay- und Detektionssystemen besitzen breite Anwendungen, z. B kann Kv6.2 als eine Reportermolekül verwendet werden, um Veränderungen der Kaliumkonzentration, des Membranpotentials, Stromflusses, Ionenflusses, der Transkription, Signaltransduktion, der Rezeptor-Liganderinteraktionen, Konzentrationen der Zweitbotenstoffe, in vitro, in vivo und ex vivo zu messen. In einer Ausführungsform kann Kv6.2 als eine Indikator der Stromflusses in eine bestimmte Richtung verwendet werden (z. B. nach außen oder innen gerichteter Kaliumfluss), und in einer anderen Ausführungsform kann Kv6.2 als ein indirekter Reporter über eine Anbringung an ein zweites Reportermolekül, wie dem grün fluoreszierenden Protein verwendet werden.
Schließlich stellt die Erfindung Verfahren zum Detektieren der Kv6.2 Nukleinsäure- und Proteinexpression bereit, die die Untersuchung der Kanaldiversität ermöglichen, die durch Kv6.2 zur Verfügung gestellt wird, und die Regulierung/Modulierung der heteromeren Kanalaktivität ermöglicht, die durch Kv6.2 zur Verfügung gestellt wird wie auch die Diagnose von Erkrankungen ermöglicht, die abnormalen Ionenfluss involvieren, was die Diagnose von ZNS-Krankheiten wie Migräne, Hör- und Sehprobleme, Anfälle und psychotische Störungen einschließt.
Funktional ist Kv6.2 eine Alphauntereinheit eines spannungsabhängigen Kaliumkanals. Typischerweise sind solche spannungsabhängigen Kanäle heteromer oder homomer und enthalten vier Untereinheiten oder Monomere jeder mit sechs Transmembrandomänen. Spannungsabhängige Kaliumkanäle, die Kv6.2 umfassen, sind typischerweise heteromer und können eine oder mehrere Untereinheiten von Kv6.2 zusammen mit einem oder mehreren anderen Untereinheiten aus der Kv-Superfamilie enthalten, z. B. Kv 2.1 und Kv 2.2. Das Vorliegen von Kv6.2 in einem spannungsabhängigen Kaliumkanal moduliert die Aktivität des heteromeren Kanals und erhöht somit die Kanaldiversität. Zum Beispiel kann, wenn Kv6.2 mit einem anderen Monomer assoziiert, der resultierende Kanal eine distinkte Einzelkanal-Leitfähigkeit wie auch geänderte kinetische Eigenschaften besitzen, z. B. Veränderungen der Aktivierungs- oder Inaktivierungsraten und Veränderungen der Spannungen und Schwellen für die Aktivierung. Zum Beispiel zeigt 2 eine hyperpolarisierte Verschiebung der Aktivierungsspannungen um ungefähr 20 mV, und eine dramatische Verlangsamung der Deaktivierung der Kanäle, die Kv6.2 und Kv2.1 umfassen, verglichen mit Kanälen, die nur Kv2.1 umfassen. Die Kanaldiversität wird auch durch alternative gespleißte Formen von Kv6.2 erhöht.
Strukturell kodiert die Nukleotidsequenz von murinem Kv6.2 (SEQ ID NO: 2) für ein Polypeptidmonomer von ungefähr 506 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 58 kDa (SEQ ID NO: 1) und einem vorhergesagten Bereich von 53–63 kDa. Die Nukleotidsequenz von humanem Kv6.2 (SEQ ID NO: 18) kodiert für ein Polypeptidmonomer von ungefähr 519 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 60 kDa (SEQ ID NO: 17) und einen vorhergesagten Bereich von 55–65 kDa. Insbesondere besitzt die Aminosäuresequenz von Kv6.2 eine „Untereinheiten-Assoziierungs-" Region (ungefähr Aminosäuren 70 bis 182, siehe, z. B., Aminosäuren 70–182 von SEQ ID NO: 1, murines Kv6.2), die eine konservierte Aminosäuresequenz besitzt. Verwandte Kv6.2-Gene von anderen Spezies und/oder Kv6-Familienmitgliedern weisen mindestens ungefähr 70% Aminosäureidentität in dieser Region auf. Die Aminosäuresequenz von Kv6.2 besitzt auch eine konservierte S4–S6 Region (ungefähr Aminosäuren 326–466, siehe, z. B., Aminosäuren 326–466 von SEQ ID NO 1, murines Kv6.2). Verwandte Kv6.2-Gene von anderen Spezies und/oder Kv6-Familienmitgliedern besitzen mindestens 85% Aminosäureidentität in dieser Region.
Auch sind polymorphe Varianten des Kv6.2, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt sind, beschrieben: Variante #1, in welcher ein Aspartatrest für den Glutamatrest an Aminosäureposition 484 substituiert ist; Variante #2, in welcher ein Valinrest für den Leucinrest an Aminosäureposition 174 substituiert ist; und Variante #3, in welcher ein Serinrest für den Alaninrest an Aminosäureposition 195 substituiert ist.
Auch sind polymorphe Varianten des Kv6.2, die in SEQ ID NO:17 dargestellt sind, beschrieben: Variante #1, in welcher ein Leucinrest für den Methioninrest an Aminosäureposition 501 substituiert ist; Variante #2, in welcher ein Serinrest für den Alaninrest an Aminosäureposition 148 substituiert ist; Variante #3, in welcher ein Valinrest für den Isoleucinrest an Aminosäureposition 508 substituiert ist; und Variante #4, in welcher ein Phenylalaninrest für den Tyrosinrest an Aminosäureposition 17 substituiert ist. Spezifische Regionen der Kv6.2 Nukleotid- und Aminosäuresequenz können verwendet werden, um polymorphe Varianten, Interspezieshomologe, und Allele von Kv6.2 zu identifizieren. Die Identifikation kann in vitro erfolgen, z. B., unter stringenten Hybridisierungsbedingungen und durch Sequenzieren, oder durch Verwenden der Sequenzinformation in einem Computersystem für den Vergleich mit anderen Nukleotidsequenzen oder mit Antikörpern, die gegen Kv6.2 erzeugt wurden. Typischerweise wird die Identifikation der polymorphen Varianten und Allele von Kv6.2 durch Vergleichen der Aminosäuresequenz (oder Nukleinsäuresequenz, die für die Aminosäuresequenz kodiert) der Untereinheiten-Assoziierungsregion (ungefähr Aminosäuren 70 bis 182 von murinem Kv6.2, siehe SEQ ID NO 1 zum Beispiel) oder der S4–S6 Region (ungefähr Aminosäuren 326–466 von murinem Kv6.2, siehe SEQ ID NO: 1 zum Beispiel). Aminosäureidentität von ungefähr mindestens 70% oder darüber, vorzugsweise 80%, 85%, am meisten bevorzugt 90–95% oder darüber in der Untereinheiten-Assoziierungsregion oder der S4–S6 Region belegt typischerweise, dass ein Protein eine polymorphe Variante, ein Interspezieshomolog oder Allel von Kv6.2 ist. Der Sequenzvergleich kann mit jeder der unten diskutierten Sequenzvergleichsalgorithmen durchgeführt werden. Antikörper, die spezifisch an die Untereinheiten-Assoziierungsregion von Kv6.2 binden, können auch verwendet werden, um Allele, Interspezieshomologe und polymorphe Varianten zu identifizieren.
Polymorphe Varianten, Interspezieshomologe und Allele von Kv6.2 können durch Koexpression des putativen Kv6.2 Polypeptidmonomers und Prüfen, ob der Monomer einen heteromeren spannungsabhängigen Kaliumkanal bildet, wenn er mit einer anderem Mitglied der Kv Familie wie Kv 2.1 oder 2.2 koexpremiert wird, bestätigt werden. Dieser Assay wird verwendet, um zu zeigen, dass ein Protein mit ungefähr 70% oder mehr, vorzugsweise 75, 80, 85, 90 oder 95% oder höherer Aminosäureidentität mit der „Untereinheiten-Assoziierungsregion" von Kv6.2 die gleichen funktionalen Charakteristika wie Kv6.2 besitzt und somit eine Spezies von Kv6.2 ist. Dieser Assay wird auch verwendet, um zu zeigen, dass ein Protein mit ungefähr 85% oder mehr, vorzugsweise 90%, 95% oder mehr Aminosäureidentität zu der „S4–S6 Region" von Kv6.2 die gleichen funktionalen Charakteristika wie Kv6.2 besitzt und somit eine Spezies von Kv6.2 ist. Typischerweise wird Kv6.2 mit der Aminosäursequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 17 als eine Positivkontrolle im Vergleich zum putativen Kv6.2 Protein verwendet, um die Identifikation einer polymorphen Variante oder eines Allels von Kv6.2 zu zeigen.
Kv6.2-Nukleotid- und Aminosäuresequenzinformation kann auch verwendet werden, um Modelle eines heteromeren spannungsabhängigen Kaliumkanals in einem Computersystem zu konstruieren. Diese Modelle werden danach verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die heteromere spannungsabhängige Kanäle, die Kv6.2 Kanäle umfassen, aktivieren oder inhibieren können. Solche Verbindungen, die die Aktivität von Kanälen modulieren, die Kv6.2 umfassen, können verwendet werden, um die Rolle von Kv6.2 bei der Modulierung von Kanalaktivität und bei der Kanaldiversität zu untersuchen.
Die erstmalige Isolierung von biologisch aktivem Kv6.2 stellt ein Mittel zum Testen auf Inhibitoren und Aktivatoren von heteromeren spannungsabhängigen Kaliumkanälen bereit, die Kv6.2-Untereinheiten beinhalten. Biologisch aktives Kv6.2 ist nützlich für das Testen von Inhibitoren und Aktivatoren von spannungsabhängigen Kaliumkanälen, die Untereinheiten von Kv6.2 und andere Kv-Mitglieder umfassen, unter Verwendung von in vivo und in vitro Expression, die, z. B., Veränderung der Spannung oder des Stroms messen. Solche Aktivatoren und Inhibitoren, die mit einem spannungsabhängigen Kaliumkanal identifiziert wurden, der mindestens eine Kv6.2-Untereinheit enthält, können verwendet werden, um weiter Spannungsabhängigkeit, Kanalkinetiken und Leitfähigkeitseigenschaften der heteromeren Kanäle zu untersuchen.
Solche Aktivatoren und Inhibitoren sind nützlich als pharmazeutische Agenzien zum Behandeln von Krankheiten, die abnormalen Ionenfluss involvieren, z. B. ZNS-Störungen, wie oben beschrieben.
Verfahren zum Detektieren von Kv6.2 und der Expression der Kanäle, die Kv6.2 umfassen, sind auch nützlich für diagnostische Anwendungen für Krankheiten, die abnormalen Ionenfluss, z. B. ZNS-Störungen und andere Störungen, involvieren. Zum Beispiel kann die Chromosomenlokalisierung des Gens, das für Kv6.2 kodiert, verwendet werden, um Krankheiten zu identifizieren, die durch Kv6.2 verursacht sind und mit Kv6.2 assoziiert sind. Verfahren zum Detektieren von Kv6.2 sind auch nützlich zur Untersuchung der Rolle von Kv6.2 bei der Kanaldiversität und Modulation der Kanalaktivität.
II. Definitionen
Wie hier verwendet, habe die folgende Begriffe die Bedeutungen, die ihnen zugeordnet werden, falls sie nicht anders spezifiziert wurden.
Der Begriff „spannungsabhängige" Aktivität oder „Spannungsabhängigkeit" bezeichnet eine Eigenschaft eines Kaliumkanals, der aus individuellen Polypeptid-Monomeren oder Untereinheiten zusammengesetzt ist. Im Allgemeinen nimmt die Wahrscheinlichkeit zu, dass ein spannungsabhängiger Kanal sich öffnet, wenn eine Zelle depolarisiert ist. Spannungsabhängige Kaliumkanäle ermöglichen primär den Ausfluss von Kalium, da es wahrscheinlicher ist, dass sie bei Membranpotentialen geöffnet sind, die positiver sind als das Membranpotential für Kalium (E_K) in typischen Zellen. E_K oder das Membranpotential für Kalium hängt von den relativen Konzentrationen von Kalium ab, die auf der Außen- und Innenseite der Zellmembran gefunden werden, und beträgt typischerweise zwischen –60 und –100 mV für Säugerzellen. E_K ist das Membranpotential, bei dem es keinen Nettofluss von Kaliumionen gibt, da das elektrische Potential (d. h., Spannungspotential), das den Kaliumeinfluss antreibt, durch den Konzentrationsgradienten (das [K⁺] Potential), das den Kaliumausfluss antreibt, ausgeglichen wird. Dieser Wert ist auch als das „Reverspotential" oder das „Nernst"-Potential für Kalium bekannt. Einige spannungsabhängige Kaliumkanäle werden inaktiviert, was den Kaliumausfluss bei höheren Membranpotentialen vermindern kann. Kaliumkanäle können auch Kaliumeinfluss in bestimmten Situationen ermöglichen, wenn sie bei Membranpotentialen, die negativ zu E_K sind, offen bleiben (siehe, z. B., Adams & Nonner, in Potassium Channels, S. 40–60 (Cook, Hrg., 1990)). Die Eigenschaft der Spannungsabhängigkeit kann durch eine Vielzahl von Techniken zum Messen von Veränderungen des Stromflusses und Ionenflusses durch einen Kanal gemessen werden, z. B, durch Verändern der [K⁺] der externen Lösung und Messen des Aktivierungspotentials des Kanalstromes (siehe z. B. US Patent Nr. 5,670,335 ), durch Messen der Stromes mit „Patch Clamp"-Techniken oder Spannungs-"Clamp" unter verschiedenen Bedingungen, und durch Messen des Ionenflusses mit radioaktiv markierten Tracern oder spannungssensitiven Farbstoffen unter verschiedenen Bedingungen.
„Homomerer Kanal" bezieht sich auf einen Kv6.2 Kanal, der aus identischen Alpha-Untereinheiten zusammengesetzt ist, wobei „heteromerer Kanal" sich auf ein Kv6.2-Kanal bezieht, der aus wenigstens einer Kv6.2-Alpha-Untereinheit plus wenigstens einem anderen Typ von Alpha-Untereinheit aus der Kv-Familie, z. B. Kv2.1, zusammengesetzt ist. Sowohl homomere als auch heteromere Kanäle können zusätzliche Beta-Untereinheiten enthalten. Typischerweise ist der Kanal aus vier Alpha-Untereinheiten zusammengesetzt und der Kanal kann heteromer oder homomer sein.
Eine „Beta-Untereinheit" ist ein Polypeptid-Monomer, das eine Hilfsuntereinheit eines Kaliumkanals ist, der aus Alpha-Untereinheiten zusammengesetzt ist; jedoch können Beta-Untereinheiten alleine keinen Kanal bilden (siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,776,734 ). Von Beta-Untereinheiten ist bekannt, dass sie, zum Beispiel, die Anzahl der Kanäle erhöhen, indem sie die Alpha-Untereinheiten dabei unterstützen, die Zelloberfläche zu erreichen, die Aktivierungskinetiken zu ändern und die Sensitivität natürlicher Liganden, die an die Kanäle binden, zu ändern. Beta-Untereinheiten können außerhalb der Porenregion sein und mit Alpha-Untereinheiten assoziiert sein, die die Porenregion umfassen. Sie können auch zu dem externen Schlund der Porenregion beitragen.
Der Begriff „Untereinheiten-Assoziierungsregion" bezeichnet eine Region von Kv6.2, die dieses bestimmte Protein strukturell identifiziert (ungefähr Aminosäure 70–182 von murinem Kv6.2, siehe SEQ ID NO: 1). Diese Region kann verwendet werden, um durch Aminosäuresequenz-Identitätsvergleich mit einem Sequenzvergleichsalgorithmus wie PILEUP Kv6.2 polymorphe Varianten und Kv6.2 Allele von Kv6.2 zu identifizieren. Die Untereinheiten-Assoziierungsregion wird beschrieben in Shen et al., Neuron 11: 67–76 (1993); Yu et al., Neuron 16: 441–453 (1996); Xu et al., J. Biol. Chem. 270: 24761–24768 (1995); Shen & Pfaffinger, Neuron 14: 625–633 (1995); Kreusch et al., Nature 392: 945–948 (1998); und Li et al., Science 257: 1225–1230 (1992).
Der Begriff „S4–S6 Region" (S4 bis S6 Region) bezeichnet die Region von Kv6.2, die dieses bestimmte Protein strukturell identifiziert (ungefähr Aminosäure 326–466 von murinem Kv6.2, siehe SEQ ID NO: 1). Diese Region kann verwendet werden, um durch Aminosäuresequenz-Identitätsvergleich mit einem Sequenzvergleichsalgorithmus wie PILEUP Kv6.2 polymorphe Varianten und Kv6.2 Allele von Kv6.2 zu identifizieren. S4–S6 enthält drei Transmembranregionen: S4, S5, die Porendomäne, und S6 und ist in der Spannungsabhängigkeit und Ionenleitung involviert (siehe, z. B., Ackerman & Clapham, New Engl. J. Med. 336: 1575–1586 (1997); Jan & Jan, Annu. Rev. Neurosci. 20: 91–123 (1997)). „Kv6.2" bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine Untereinheit oder Monomer eines spannungsgesteuerten Kaliumkanals, ein Mitglied der Kv6 Familie und ein Mitglied der Kv-Superfamilie von Kaliumkanalmonomeren ist. Wenn Kv6.2 Teil eines Kaliumkanals ist, vorzugsweise eines heteromeren Kaliumkanals, besitzt der Kanal spannungsabhängige Aktivität. Der Begriff Kv6.2 bezieht sich daher auf Kv6.2 polymorphe Varianten, Allele, Mutanten und Interspezieshomologe, die: (1) eine Untereinheiten-Assoziierungsregion besitzen, die mehr als ungefähr 70% Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise 75, 80, 85, 90, oder 95% Aminosäuresequenzidentität mit einer Kv6.2-Untereinheiten-Assoziierungsregion besitzen; (2) eine S4–S6 Region besitzen, die mehr als ungefähr 85% Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise ungefähr 90 oder 95% Aminosäuresequenzidentität zu einer Kv6.2 S4–S6 Region besitzen (3) an Antikörper binden, die gegen ein Immunogen erzeugt wurden, das eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 17, der Untereinheiten-Assoziierungsregion, der S4–S6 Region und konservativ modifizierte Varianten davon besitzt; (4) spezifisch unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 18, einer Nukleinsäure, die für die Untereinheiten-Assoziierungsregion kodiert, einer Nukleinsäure, die für die S4–S6 Region kodiert und konservativ modifizierte Varianten davon besitzt; oder (5) durch Primer amplifiziert werden, die spezifisch unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die gleiche Sequenz hybridisieren, wie ein Primersatz, bestehend aus SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
Der Begriff „funktionale Effekte" in dem Kontext von Assays zum Testen von Verbindungen, die einen Kanal beeinflussen, der Kv6.2 umfasst, schließt die Bestimmung jedes Parameters ein, der indirekt oder direkt unter dem Einfluss des Kanals ist. Er schließt Änderungen des Ionenflusses und Membranpotentials, und auch andere physiologische Effekte, wie Anstiege oder Absenkungen der Transkription oder der Hormonfreisetzung ein.
„Bestimmen des funktionalen Effekts" bezieht sich auf die Untersuchung des Effektes einer Verbindung, die den Ionenfluss auf eine Zelle oder Zellmembran in Hinsicht auf Zell- und Zellmembranfunktion erhöht oder vermindert. Der Ionenfluss kann jedes Ion und Analog davon sein, das durch einen Kanal tritt, z. B. Kalium, Rubidium, Natrium. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff auf den funktionalen Effekt der Verbindung auf die Kanäle, die Kv6.2 umfassen, z. B. Änderungen des Ionenflusses einschließlich Radioisotopen, Stromamplitude, Membranpotential, Stromfluss, Transkription, Proteinbindung, Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Zweitbotenkonzentrationen (cAMP, cGMP, Ca²⁺, IP₃), und andere physiologische Effekte, wie Hormon- und Neurotransmitterfreisetzung, wie auch Änderungen der Spannung und Stromstärke. Solche funktionalen Effekte können durch jegliches Mittel, das den Fachleuten bekannt ist, gemessen werden z. B. Patchclamping, spannungssensitive Farbstoffe, Ganzzell-Ströme, Radioisotopenausfluss, induzierbare Marker und ähnliche. „Inhibitoren", „Aktivatoren" oder „Modulatoren" von spannungsabhängigen Kaliumkanälen, die Kv6.2 umfassen, beziehen sich auf inhibitorische oder aktivierende Moleküle, die mit in vitround in vivo-Assays für Kv6.2 Kanalfunktion identifiziert wurden. Inhibitoren sind Verbindungen, die die Aktivierung verringern, blocken, verhindern oder aufschieben, inaktivieren, die Empfindlichkeit herabsetzen oder herunterregulieren. Aktivatoren sind Verbindungen, die die Aktivierung erhöhen, eröffnen, aktivieren, ermöglichen, verstärken, die Kanalaktivität in ihrer Empfindlichkeit erhöhen oder sie heraufregulieren. Solche Assays für Inhibitoren und Aktivatoren schließen z. B. das Exprimieren eines Kv6.2 in Zellen oder Zellmembranen und anschließendes Messen des Ionenflusses durch den Kanal und Bestimmen der Änderungen der Polarisierung (d. h. des elektrischen Potentials) ein. Alternativ können Zellen, die endogene Kv6.2 Kanäle exprimieren , in solchen Assays verwendet werden. Um das Ausmaß der Inhibierung zu untersuchen wurden Proben oder Assays, die einen Kv6.2 Kanal umfassen, mit einem potentiellen Aktivator oder Inhibitor behandelt und mit Kontrollproben ohne den Inhibitor verglichen. Kontrollbeispielen (nicht mit Inhibitoren behandelt) wird ein relativer Kv6.2 Aktivitätswert von 100% zugeordnet. Inhibition von Kanälen, die Kv6.2 umfassen, wird erreicht, wenn der Kv6.2 Aktivitätswert relativ zu der Kontrolle ungefähr 90%, vorzugsweise 50%, noch bevorzugter 25–0% ist. Aktivierung von Kanälen, die Kv6.2 umfassen, wird erreicht, wenn der Kv6.2 Aktivitätswert relativ zu der Kontrolle ungefähr 110%, noch bevorzugter 150%, am meisten bevorzugt wenigstens 200–500% höher ist oder 1000% oder höher ist.
„Biologisch aktives" Kv6.2 bezieht sich auf Kv6.2, das die Fähigkeit besitzt, einen Kaliumkanal zu bilden mit der Eigenschaft der Spannungsabhängigkeit, die, wie oben beschrieben, getestet wurde.
Die Begriffe „isoliert", „aufgereinigt" oder „biologisch rein" beziehen sich auf Material, das im Wesentlichen oder essentiell frei von Verbindungen ist, die es normalerweise begleiten, wenn es in seinem natürlichen Zustand gefunden wird. Reinheit und Homogenität werden typischerweise mit Techniken der analytischen Chemie bestimmt, wie Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie. Ein Protein, das die vorherrschende Spezies in einer Zubereitung ist, ist im Wesentlichen aufgereinigt. Insbesondere wird eine isolierte Kv6.2 Nukleinsäure von offenen Leserastern getrennt, die das Kv6.2 Gen flankieren und die Proteine, die nicht Kv6.2 sind, kodieren. Der Begriff „aufgereinigt" bedeutet, dass eine Nukleinsäure oder ein Protein essentiell nur eine Bande in einem elektrophoretischen Gel erzeugt. Insbesondere bedeutet es, dass die Nukleinsäure oder das Protein wenigstens 85% rein, bevorzugter wenigstens 95% rein und am bevorzugtesten wenigstens 99% rein ist.
„Nukleinsäure" bezieht sich auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon in entweder einzel- oder doppelsträngiger Form. Der Begriff umfasst Nukleinsäuren, die bekannte Nukleotidanaloge oder modifizierte Rückgratreste oder Verbindungen, die synthetisch sind, natürlich vorkommend und nicht natürlich vorkommend sind, enthalten, die ähnliche Bindungseigenschaften wie die Referenznukleinsäure besitzen und die in einer Weise ähnlich der der Referenznukleotide metabolisiert werden. Beispiele solcher Analoge schließen ein, ohne Beschränkung, Phosphorothioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, Chiralmetyl-Phosphonate, 2-O-Methylribonukleotide, Peptidnukleinsäuren (PNAs). Falls nicht anders angemerkt, umfasst eine bestimmte Nukleinsäuresequenz auch implizit konservativ modifizierte Varianten davon (z. B. degenerierte Codonersetzungen) und komplementäre Sequenzen wie auch die explizit dargestellte Sequenz. Spezifisch können degenerierte Codonersetzungen durch Erzeugen von Sequenzen erreicht werden, die in der dritten Position eines oder mehrerer ausgewählter (oder aller) Codons mit gemischten Basen und/oder Deoxyinosinresten substituiert sind (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605–2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91–98 (1994)). Der Begriff Nukleinsäure wird austauschbar mit Gen, cDNA, mRNA, Oligonukleotid und Polynukleotid verwendet.
Eine bestimmte Nukleinsäuresequenz umfasst auch implizit „Spleißvarianten". In ähnlicher Weise umfasst ein bestimmtes Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, implizit jedes Protein, das durch eine Spleißvariante dieser Nukleinsäure kodiert wird. „Spleißvarianten", wie der Name nahe legt, sind Produkte von alternativen Spleißungen eines Gens. Nach Transkription kann ein erstes Nukleinsäuretranskript so gespleißt werden, dass verschiedene (alternative) Nukleinsäure-Spleißprodukte verschiedene Polypeptide kodieren. Mechanismen für die Produktion von Spleißvarianten variieren, aber schließen das alternative Spleißen von Exons ein. Alternative Polypeptide, die von der gleichen Nukleinsäure durch Durchlese-Transkription abgeleitet wurden, sind auch durch diese Erfindung umfasst. Alle Produkte einer Spleißreaktion, einschließlich der rekombinanten Formen der Spleißprodukte, sind in dieser Definition eingeschlossen. Ein Beispiel für Spleißvarianten von Kaliumkanalspleißvarianten wird in Leicher, et al., J. Biol. Chem. 273(52): 35095–35101 (1998) diskutiert.
Die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" werden hier austauschbar verwendet, um sich auf einen Polymer von Aminosäureresten zu beziehen. Die Begriffe werden verwendet für Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehr Aminosäurereste eine künstliche chemische Nachahmung einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure sind, wie auch für natürlich vorkommende Aminosäurepolymere und nicht natürlich vorkommendes Aminosäurepolymer.
Der Begriff „Aminosäure" bezieht sich auf natürlich vorkommende und synthetische Aminosäuren wie auch Aminosäureanaloge und Aminosäurenachahmer, die in einer Weise funktionieren, die ähnlich ist der von natürlich vorkommenden Aminosäuren. Natürlich vorkommende Aminosäuren sind diejenigen, die durch den genetischen Code kodiert werden, wie auch diejenigen Aminosäuren, die später modifiziert werden, z. B. Hydroxyprolin, γ-Carboxyglutamat und O-Phosphoserin. Aminosäureanaloge beziehen sich auf Verbindungen, die die gleiche chemische Basisstruktur haben wie eine natürlich vorkommende Aminosäure, d. h. einen Kohlenstoff, der an einen Wasserstoff, eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe und eine R-Gruppe gebunden ist, z. B. Homoserin, Norleucin, Methioninsulfoxid, Methioninmethylsulfonium. Solche Analoge besitzen modifizierte R-Gruppen (z. B. Norleucin) oder modifizierte Peptidrückgrate, behalten aber die gleiche chemische Basisstruktur wie eine natürlich vorkommende Aminosäure bei. Aminosäurenachahmer beziehen sich auf chemische Verbindungen, die eine Struktur besitzen, die verschieden ist von der allgemeinen chemischen Struktur einer Aminosäure, die aber in ähnlichen Weise wie eine natürliche vorkommende Aminosäure funktionieren.
Auf Aminosäuren wird hier Bezug genommen entweder durch ihre allgemein bekannten Dreibuchstabensymbole oder durch die Einbuchstabensymbole, die durch die IUPAC-IUB „Biochemical Nomenclature Commission" empfohlen werden. Nukleotide können in ähnlicher Weise mit ihren allgemein akzeptierten Einbuchstaben-Codes bezeichnet werden. „Konservativ modifizierte Varianten" bezieht sich sowohl auf Aminosäure- als auch auf Nukleinsäuresequenzen. Bei Bezug auf bestimmte Nukleinsäuresequenzen bezeichnen konservativ modifizierte Varianten diejenigen Nukleinsäuren, die identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen kodieren, oder wo die Nukleinsäure nicht eine Aminosäuresequenz kodiert, im Wesentlichen identische Sequenzen. Wegen der Degeneration des genetischen Codes kodieren eine große Anzahl von funktional identischen Nukleinsäuren jedes gegebene Protein. Zum Beispiel kodieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle die Aminosäure Alanin. Somit kann an jeder Position, an der ein Alanin durch ein Codon spezifiziert wird, das Codon zu jedem der entsprechenden beschriebenen Codons geändert werden, ohne das kodierte Polypeptid zu ändern. Solche Nukleinsäurevariationen sind „stumme Variationen", die eine Spezies von konservativ modifizierten Variationen sind. Jede Nukleinsäuresequenz hierin, die ein Polypeptid kodiert, beschreibt entsprechend jede mögliche stumme Variation der Nukleinsäure. Ein Fachmann wird erkennen, dass jedes Codon in einer Nukleinsäure (außer AUG, das normalerweise das einzige Codon für Methionin ist, und TGG, das normalerweise das einzige Codon für Tryptophan ist) modifiziert werden kann, um ein funktional identisches Molekül zu ergeben. Entsprechend ist jede stumme Variation einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, in jeder beschriebenen Sequenz implizit enthalten. In Hinblick auf Aminosäuresequenzen wird ein Fachmann erkennen, dass individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen an einer Nukleinsäure, Peptid, Polypeptid oder Proteinsequenz, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren in der kodierten Sequenz ändern, hinzufügen oder deletieren, eine „konservativ modifizierte Variante" ist, in der die Änderung in der Substitution einer Aminosäure mit einer chemisch ähnlichen Aminosäure resultiert. Konservative Substitutionstabellen, die funktional ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind in der Technik wohl bekannt. Solche konservativ modifizierten Varianten sind zusätzlich zu den polymorphen Varianten, Interspezieshomologe und Allelen der Erfindung und schließen diese nicht aus.
Die folgenden acht Gruppen enthalten jede der Aminosäuren, die für einander konservative Substitutionen sind:
Alanin (A), Glycin (G);
Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
Asparagin (N), Glutamin (Q);
Arginin (R), Lysine (K);
Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V);
Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W);
Serine (S), Threonin (T); und
Cystein (C), Methionin (M)
(siehe z. B., Creighton, Proteins (1984)).
Makromolekulare Strukturen, wie Polypeptidstrukturen, können in Begriffen für zahlreiche Organisationslevels beschrieben werden. Für eine allgemeine Diskussion dieser Organisation, siehe z. B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3te Ausgabe, 1994) und Cantor und Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980). „Primärstruktur" bezeichnet die Aminosäuresequenz eines bestimmten Peptids. „Sekundärstruktur" bezeichnet lokal geordnete, dreidimensionale Strukturen innerhalb eines Polypeptids. Diese Strukturen sind gemeinhin als Domänen bekannt. Domänen sind Teile eines Polypeptids, die eine kompakte Einheit des Polypeptids bilden und sind typischerweise 50 bis 350 Aminosäuren lang. Typische Domänen werden hergestellt aus Sektionen mit geringerer Organization, wie Bereichen von β-Faltblättern und α-Helizes. „Tertiärstruktur" bezeichnet die vollständige dreidimensionale Struktur eines Polypeptidmonomers. „Quatärstruktur" bezeichnet die dreidimensionale Struktur, die durch die nicht kovalente Assoziierung von unabhängigen tertiären Einheiten gebildet wird. Anisotropische Bedingungen sind auch als Energiebedingungen bekannt.
Eine „Markierung" ist eine durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Mittel detektierbare Zusammensetzung. Zum Beispiel schließen nützliche Markierungen ³²P, fluoreszente Farbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme (z. B. wie gemeinhin in einem ELISA verwendet), Biotin, Digoxigenin oder Haptene und Proteine, für die Antisera oder monoklonale Antikörper verfügbar sind (z. B. das Polypeptid SEQ ID NO: 1 kann detektierbar gemacht werden, z. B. durch Einbau einer radioaktiven Markierung in das Peptid, und verwendet werden, um Antikörper zu detektieren, die mit dem Peptid spezifisch reagieren) ein.
Wie hier verwendet wird eine „Nukleinsäuresonde oder Oligonukleotid" als eine Nukleinsäure definiert, die in der Lage ist an eine Targetnukleinsäure mit komplementärer Sequenz durch einen oder mehrere Typen von chemischen Bindungen zu binden, gewöhnlich durch komplementäre Basenpaarung, gewöhnlich durch Wasserstoffbrückenbindungsbildung. Wie hier verwendet kann eine Sonde natürliche (d. h. A, G, C oder T) oder modifizierte Basen (7-Deazaguanosin, Inosin, etc.) einschließen. Zusätzlich können die Basen in einer Sonde durch eine Bindung verbunden werden, die nicht eine Phosphodiesterbindung ist, so lange, wie sie nicht mit der Hybridisierung interferiert. Somit können zum Beispiel Sonden Peptidnukleinsäuren sein, in der die konstituierenden Basen eher durch Peptidbindungen als durch Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Ein Fachmann wird verstehen, dass Sonden Targetsequenzen binden können, denen eine vollständige Komplementarität in Abhängigkeit von den Hybridisierungsbedingungen mit der Sondensequenz fehlt. Die Sonden sind vorzugsweise direkt markiert, wie mit Isotopen, Chromophoren, Lumiphoren, Chromogenen oder indirekt markiert, so wie mit Biotin, an das ein Streptavidin-Komplex später binden kann. Durch Testen auf das Vorliegen oder Nicht-Vorliegen der Sonde kann man das Vorliegen oder Nicht-Vorliegen der gewählten Sequenz oder Subsequenz detektieren.
Eine „markierte Nukleinsäurensonde oder Oligonukleotid" ist eine, die entweder kovalent durch einen Linker oder eine chemische Bindung, oder nicht kovalent durch ionische, van der Waals, elektrostatische oder Wasserstoffbrückenbindungen so an eine Markierung gebunden ist, dass das Vorliegen der Sonde durch Detektieren des Vorliegens der Markierung, die an die Sonde gebunden ist, detektiert werden kann.
Der Begriff „rekombinant", wenn er unter Bezug auf, z. B. eine Zelle oder Nukleinsäure, Protein oder Vektor verwendet wird, zeigt an, dass die Zelle, Nukleinsäure, Protein oder Vektor durch das Einführen einer heterologen Nukleinsäure oder eines Proteins oder der Änderung einer nativen Nukleinsäure oder Proteins modifiziert wurde, oder dass die Zelle aus einer Zelle abgeleitet ist, die so modifiziert wurde. Somit exprimieren zum Beispiel rekombinante Zellen Gene, die nicht innerhalb der nativen (nicht rekombinanten) Form der Zelle gefunden werden oder exprimieren native Gene, die sonst abnormalerweise exprimiert, unterexprimiert oder überhaupt nicht exprimiert werden.
Ein „Promotor" wird als ein Array von Nukleinsäure-Kontrollsequenzen definiert, der die Transkription einer Nukleinsäure steuert. Wie hier verwendet, schließt ein Promotor notwendige Nukleinsäuresequenzen nahe der Startstelle der Transkription ein so, wie im Fall eines Polymerase II Typ Promotors, ein TATA Element. Ein Promotor schließt auch optional distale Enhancer- oder Repressorelemente ein, die bis zu viele tausend Basenpaare von der Startstelle der Transkription lokalisiert sein können. Ein „konstitutiver" Promotor ist ein Promotor, der unter den meisten Umwelt- und Entwicklungsbedingungen aktiv ist. Ein „induzierbarer" Promotor ist ein Promotor, der unter Umwelt- und Entwicklungsregulierung aktiv ist. Der Begriff „funktional verbunden" bezeichnet eine funktionale Verbindung zwischen einer Nukleinsäure-Expressionskontrollsequenz (wie einem Promotor, oder einem Array von Transkriptionsfaktorbindungsstellen) und einer zweiten Nukleinsäuresequenz, wobei die Expressionskontrollsequenz die Transkription der Nukleinsäure steuert, die zu der zweiten Sequenz korrespondiert.
Der Begriff „heterolog", wenn er unter Bezug auf Teile einer Nukleinsäure verwendet wird, zeigt an, dass die Nukleinsäure zwei oder mehr Subsequenzen umfasst, die nicht in der gleichen Beziehung zueinander in der Natur gefunden werden. Zum Beispiel wird die Nukleinsäure typischerweise rekombinant produziert, wobei zwei oder mehr Sequenzen von nicht verwandten Genen angeordnet sind, eine neue funktionale Nukleinsäure zu ergeben, z. B. einen Promotor aus einer Quelle und eine kodierende Region aus einer anderen Quelle. In ähnlicher Weise bedeutet ein heterologes Protein, dass das Protein zwei oder mehr Subsequenzen umfasst, die nicht in der gleichen Beziehung zu einander in der Natur gefunden werden (z. B. ein Fusionsprotein).
Ein „Expressionsvektor" ist ein Nukleinsäurekonstrukt, das rekombinant oder synthetisch erzeugt wird, mit einer Serie von spezifizierten Nukleinsäureelementen, die Transkription einer bestimmten Nukleinsäure in einer Wirtszelle erlauben. Der Expressionsvektor kann Teil eines Plasmids, Virus oder Nukleinsäurefragments sein. Typischerweise schließt der Expressionsvektor eine Nukleinsäure ein, die funktional mit einem Promotor verknüpft ist, um transkribiert zu werden.
Die Begriffe „identisch" oder Prozent „Identität" beziehen sich in dem Kontext von zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Polypeptidsequenzen auf zwei oder mehr Sequenzen oder Subsequenzen, die die gleichen sind oder einen bestimmten Prozentsatz von Aminosäureresten oder Nukleotiden besitzen, die die gleichen sind (d. h. 70% Identität, vorzugsweise 75%, 80%, 85%, 90% oder 95%, über eine spezifizierte Region wie der Kv6.2-Untereinheiten-Assoziierungsregion oder die S4–S6 Region), wenn sie für maximale Entsprechung über ein Vergleichsfenster oder eine bestimmte Region, wie mit einem der folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch manuelle Gegenüberstellung und Untersuchung mit dem Auge verglichen und gegenübergestellt werden. Solche Sequenzen werden dann als „im Wesentlichen identisch" bezeichnet. Diese Definition bezieht sich auch auf das Komplement einer Testsequenz. Vorzugsweise existiert die Identität in einer Region, die wenigstens 25 Aminosäuren oder Nukleotide lang ist, oder noch bevorzugter in einer Region, die 50–100 Aminosäuren oder Nukleotide lang ist.
Für den Sequenzvergleich funktioniert typischerweise eine Sequenz als eine Referenzsequenz, mit der die Testsequenzen verglichen werden. Bei Verwendung eines Sequenzvergleichsalgorithmus werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, Subsequenzkoordinaten werden, wenn nötig, bestimmt, und Sequenzalgorithmusprogramm-Parameter können bestimmt werden.
Standardprogrammparameter können verwendet werden oder alternative Parameter können bestimmt werden. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann den Prozentsatz der Sequenzidentität der Testsequenzen bezogen auf die Referenzsequenz basierend auf den Programmparametern.
Ein „Vergleichsfenster", wie hier verwendet, schließt den Bezug auf ein Segment jede der Anzahl von zusammenhängenden Positionen ein, die aus der Gruppe bestehend aus 20 bis 600, gewöhnlich ungefähr 50 bis ungefähr 200, noch gewöhnlicher ungefähr 100 bis ungefähr 150 ausgewählt sind, in denen eine Sequenz mit einer Referenzsequenz der gleichen Anzahl von zusammenhängenden Positionen verglichen werden kann, nachdem die zwei Sequenzen optimal gegenübergestellt sind. Verfahren für die Gegenüberstellung von Sequenzen für den Vergleich sind in der Technik gut bekannt. Optimale Gegenüberstellung von Sequenzen für den Vergleich kann z. B. durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Watermann, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), durch den Homologiegegenüberstellungs-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch das Ähnlichkeitssucheverfahren von Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), durch Computerimplementationen dieser Algorithmenten (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), oder durch manuelle Gegenüberstellung und Überprüfung mit dem Auge (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrg. 1995 Annex)) durchgeführt werden.
Ein Beispiel eines nützlichen Algorithmus ist PILEUP. PILEUP erzeugt eine multiple Sequenzgegenüberstellung aus einer Gruppe von verwandten Sequenzen mit progressiven paarweisen Gegenüberstellungen, um die Verwandtschaft und Prozentigkeit der Sequenzidentität zu zeigen. Es zeichnet auch einen Baum oder Dendogramm, der die Gruppierungsverwandtschaften zeigt, die verwendet wurden, um die Gegenüberstellung zu erzeugen. PILEUP verwendet eine Vereinfachung des progressiven Gegenüberstellungsverfahrens von Feng & Doolittle, J. Mol. Evol: 35: 351–360 (1987). Das Verfahren ist dem durch Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151–153 (1989) beschriebenen ähnlich. Das Programm kann bis zu 300 Sequenzen gegenüberstellen, jede mit einer Maximallänge von 5,000 Nukleotiden oder Aminosäuren. Die multiple Gegenüberstellungsprozedur beginnt mit der paarweisen Gegenüberstellung der zwei ähnlichsten Sequenzen, was einen Cluster von zwei gegenübergestellten Sequenzen erzeugt. Dieser Cluster wird dann den am meisten verwandten Sequenzen oder Cluster von gegenübergestellten Sequenzen gegenübergestellt. Zwei Cluster der Sequenzen werden durch eine einfache Erweiterung der paarweisen Gegenüberstellung von zwei individuellen Sequenzen gegenübergestellt. Die finale Gegenüberstellung wird durch eine Reihe von progressiven paarweisen Gegenüberstellungen erreicht. Das Programm wird durch Bezeichnen spezifischer Sequenzen und ihrer Aminosäure- oder Nukleotidkoordinaten für Regionen des Sequenzvergleichs und durch Bezeichnen der Programmparameter betrieben. Mit PILEUP wird eine Referenzsequenz mit anderen Testsequenzen verglichen, um die Prozentigkeit der Sequenzidentität mit den folgenden Parameter zu bestimmen: Standardlückengewichtung (3.00), Standardlückenlängengewichtung (0.10) und gewichtete Endlücken. PILEUP kann aus dem GCG Sequenzanalyse-Softwarepaket erhalten werden, z. B. Version 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387–395 (1984).
Ein anderes Beispiel eines Algorithmus, der geeignet ist zum Bestimmen des Prozentsatzes der Sequenzidentität und der Sequenzähnlichkeit sind die BLAST und BLAST 2.0 Algorithmen, die beschrieben sind in Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389–3402 (1977) bzw. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990). Software, um Blast Analysen durchzuführen, ist öffentlich über das „National Center for Biotechnology Information" verfügbar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Dieser Algorithmus involviert zunächst das Identifizieren von Sequenzpaaren mit hoher Trefferquote („high scoring sequence pairs", HSPs) durch das Identifizieren von kurzen Worten der Länge W in der Suchsequenz, die entweder einen bestimmten positiven Mindestwert T treffen oder ihm genügen, wenn sie mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz gegenübergestellt sind. T wird als der Nachbarschaftswortmindestwert bezeichnet (Altschul et al., supra), Diese initialen Nachbarschaftswort-Treffer funktionieren als Ausgangspunkte für das Initiieren von Suchen, um längere HSPs, die diese enthalten, zu finden. Die Worttreffer werden in beide Richtungen entlang jeder Sequenz ausgedehnt, solange der kulmulative Gegenüberstellungstreffer erhöht werden kann. Kumulative Treffer werden mit, für Nukleotidsequenzen, den Parametern M (Ergebniswert für ein Paar von passenden Resten; immer > 0) und N (Strafwert für ein Paar von nicht passenden Resten; immer < 0) berechnet. Für Aminosäuresequenzen wird eine Treffermatrix verwendet, um den kumulativen Treffer zu berechnen. Verlängerung der Worttreffer in jede Richtung wird angehalten, wenn: der kumulative Gegenüberstellungswert um die Menge X von seinem maximal erreichten Wert abfällt; der kumulative Wert wegen der Anhäufung einer oder mehrerer Restegegenüberstellung/-en mit negativem Wert auf Null oder darunter geht; oder das Ende jeder Sequenz erreicht ist. Die BLAST Algorithmusparameter W, T und X bestimmen die Sensitivität und Geschwindigkeit der Gegenüberstellung. Das BLASTN Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Standardwerte eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP Programm als Standardwerte eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10, und die BLOSUM62 Treffermatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) Gegenüberstellungen (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4, und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST Algorithmus führt auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe auch Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787 (1993)). Ein Maß für Ähnlichkeit, das durch den BLAST Algorithmus bereitgestellt wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), das ein Maß für die Wahrscheinlichkeit ist, mit der ein Aufeinanderpassen zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen per Zufall sich ereignen würde. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäure als mit einer Referenzsequenz als ähnlich angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Testnukleinsäure mit der Referenznukleinsäure weniger als ungefähr 0.2 ist, noch bevorzugter weniger als ungefähr 0.01, und am bevorzugtesten weniger als ungefähr 0.001 ist.
Ein Anzeichen dafür, dass zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide im Wesentlichen identisch sind, ist, dass das Polypeptid, das durch die erste Nukleinsäure kodiert wird, immunologisch kreuzreaktiv ist mit den Antikörpern, die gegen das Polypeptid erzeugt wurden, die durch die zweite Nukleinsäure kodiert werden, wie unten beschrieben wird. Somit ist ein Polypeptid typischerweise im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Polypeptid, zum Beispiel wenn sich die zwei Peptide nur durch konservative Substitutionen unterscheiden. Ein anderes Anzeichen, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist dass die zwei Moleküle oder ihre Komplemente mit einander unter stringenten Bedingungen hybridisieren, wie unten beschrieben wird. Ein weiteres Anzeichen, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist dass die gleichen Primer verwendet werden können, um die Sequenz zu amplifizieren.
Der Begriff „hybridisiert selektiv (oder spezifisch) an" bezeichnet das Binden, Ausbilden einer Duplex oder Hybridisieren eines Moleküls nur an eine bestimmte Nukleinsäuresequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wenn die Sequenz in einer komplexen Mischung vorliegt (z. B. vollständige Zell- oder Bibliotheks-DNA oder RNA).
Der Begriff „stringente Hybridisierungsbedingungen" bezeichnet die Bedingungen, unter denen eine Sonde an seine Targetsubsequenz, typischerweise in einer komplexen Mischung von Nukleinsäuren, aber nicht an andere Sequenzen hybridisieren wird. Stringenzbedingungen sind sequenzabhängig und werden unter verschiedenen Bedingungen verschieden sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Eine ausführliche Anleitung für die Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Im Allgemeinen werden die stringenten Bedingungen gewählt ungefähr 5–10°C niedriger sein als der thermale Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz an einem pH mit definierter Ionenstärke. Der T_m ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration) bei dem 50% der Sonden, die mit dem Target komplementär sind, mit der Targetsequenz im Äqulibrium hybridisieren (wenn die Targetsequenzen im Überschuss vorhanden sind, sind am T_m 50% der Sonden im Äquilibrium besetzt). Stringente Bedingungen werden diejenigen sein, bei denen die Salzkonzentration weniger als ungefähr 1.0 M Natriumionen beträgt, typischerweise eine Konzentration von ungefähr 0.01 bis 1.0 M Natriumionen (oder anderer Salze) bei einem pH von 7.0 bis 8.3 besitzt und die Temperatur mindestens ungefähr 30°C für kurze Sonden (z. B. 10 bis 50 Nukleotide) und mindestens ungefähr 60°C für lange Sonden (z. B. mehr als 50 Nukleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch mit der Zugabe von destabilisierenden Agenzien wie Formamid bewirkt werden. Für eine Hochstringenzhybridisierung entspricht ein positives Signal wenigstens zweimal dem Hintergrund, vorzugsweise zehnmal der Hintergrundhybridisierung. Exemplarische stringente Hybridisierungsbedingungen schließen ein: 50% Formamid, 5 × SSC und 1% SDS, inkubiert bei 42°C, oder 5 × SSC, 1% SDS, inkubiert bei 65°C, mit Waschungen in 0.2 × SSC, und 0.1% SDS bei 65°C.
Nukleinsäuren, die nicht aneinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren, sind immer noch im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, die sie kodieren im Wesentlichen identisch sind. Dies tritt auf, zum Beispiel, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure mit der maximalen Codondegeneration erzeugt wird, die durch den genetischen Code erlaubt ist. In solchen Fällen hybridisieren die Nukleinsäuren typischerweise unter moderat stringenten Hybridisierungsbedingungen. Beispielhafte „moderat stringente Hybridisierungsbedingungen" schließen eine Hybridisierung in einem Puffer aus 40% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C, und eine Waschung in 1 × SSC bei 45°C ein. Eine positive Hybridisierung ist wenigstens Faktor 2 über dem Hintergrund. Die Fachleute werden leicht erkennen, dass alternative Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden können, um Bedingungen ähnlicher Stringenz bereitzustellen.
"Antikörper" bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine Gerüstregion aus einem Immmunoglobulingen oder Fragmenten davon, die ein Antigen spezifisch binden und erkennen, umfasst. Die anerkannten Immunoglobulinregionen schließen die Kappa, Lambda, Alpha, Gamma, Delta, Epsilon und Mu konstanten Region-Gene, wie auch die Myriaden von Genen für die variable Region der Immunoglobuline ein. Leichte Ketten werden entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert. Schwere Ketten werden als Gamma, Mu, Alpha, Delta oder Epsilon klassifiziert, die wiederum die Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE definieren.
Eine exemplarische strukturelle Immunglobulin (Antikörper) Einheit umfasst ein Tetramer. Jeder Tetramer ist aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten zusammengesetzt, jedes Paar mit einer „leichten" (ungefähr 25 kD) und einer „schweren" Kette (ungefähr 50–70 kD). Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von ungefähr 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die primär für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Die Begriffe variable leichte Kette (V_L) und variable schwere Kette (V_H) bezieht sich auf diese leichten bzw. schweren Ketten.
Es gibt Antikörper, z. B. als intakte Immunoglobuline oder als eine Vielzahl von gut charakterisierten Fragmenten, die durch Verdau mit zahlreichen Peptidasen produziert werden. Somit verdaut Pepsin zum Beispiel einen Antikörper unter den Disulfidbrücken in der Gelenkregion, um F(ab)'2 zu produzieren, einen Dimer von Fab, der seinerseits eine leichte Kette ist, die mit VH-CH1 durch eine Disulfidbindung verbunden ist. Das F(ab)'2 kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disufidbindung in der Gelenkregion zu brechen, wodurch der F(ab)'2 Dimer in einen Fab' Monomer umgewandelt wird. Das Fab' Monomer ist im Wesentlichen Fab mit einem Teil der Gelenkregion (siehe Fundamental Immunology (Paul Hrg., 3d Ausgabe. 1993)). Während zahlreiche Antikörperfragmente durch Begriffe des Verdaus eines intakten Antikörpers definiert sind, wird ein Fachmann es zu schätzen wissen, dass solche Fragmente de novo entweder chemisch oder durch Verwendung der rekombinanten DNA Methodologien synthetisiert werden können. Somit schließt der Begriff Antikörper, wie hier verwendet, auch Antikörperfragmente ein, die entweder durch die Modifikation ganzer Antikörper produziert werden, oder diejenigen ein, die de novo mit rekombinanter DNA Methodik (z. B. Einzelketten FV) synthetisiert werden oder diejenigen ein, die mit Phagendisplay Bibliotheken identifiziert werden (siehe z. B. McCafferty et al., Nature 348: 552–554 (1990)).
Zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern kann jede in der Technik bekannte Technik verwendet werden (siehe, z. B., Kohler & Milstein, Nature 256: 495–497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., S. 77–96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)). Techniken für die Produktion von Einzelkettenantikörpern ( U.S. Patent 4,946,778 ) können adaptiert werden, um Antikörper gegen Polypeptide dieser Erfindung zu produzieren. Auch können transgene Mäuse oder andere Organismen, wie andere Säuger, verwendet werden, um humanisierte Antikörper zu exprimieren . Alternativ kann die Phagendisplaytechnologie verwendet werden, um Antikörper und heteromere Fab Fragmente zu identifizieren, die spezifisch an ausgewählte Antigene binden (siehe McCafferty et al., Nature 348: 552–554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10: 779–783 (1992)).
Ein „Anti-Kv6.2 " Antikörper ist ein Antikörper oder Antikörperfragment, das spezifisch an ein Polypeptid bindet, das durch das Kv6.2 Gen, cDNA oder eine Subsequenz davon kodiert wird. Ein „chimärer Antikörper" ist ein Antikörpermolekül, in dem (a) die konstante Region, oder ein Teil davon, geändert, ersetzt oder ausgetauscht ist, so dass die Antigenbindungsstelle (variable Region) mit einer konstanten Region einer anderen oder veränderten Klasse, Effektorfunktion und/oder Spezies oder eines vollkommen verschiedenen Moleküls verbunden ist, das dem chimären Antikörper neue Eigenschaften verleiht, z. B. ein Enzym, Toxin, Hormon, Wachstumsfaktor, Wirkstoff etc.; oder (b) die variable Region oder ein Teil davon geändert, ersetzt oder durch eine variable Region ausgetauscht ist, die eine andere oder geänderte Antigenspezifität besitzt.
Der Begriff „Immunoassay" ist ein Assay, der einen Antikörper verwendet, um ein Antigen spezifisch zu binden. Der Immunoassay wird durch die Verwendung von spezifischen Bindungseigenschaften eines bestimmten Antikörpers gekennzeichnet, um das Antigen zu isolieren, anzuzielen und/oder zu quantifizieren.
Der Begriff „bindet spezifisch (oder selektiv)" an einen Antikörper oder „ist spezifisch (oder selektiv) immunoreaktiv mit", bezeichnet, wenn er sich auf ein Protein oder Peptid bezieht, eine Bindungreaktion, die das Vorliegen des Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen und anderen Biologica anzeigt. Somit binden unter angegebenen Immunoassay-Bedingungen die spezifischen Antikörper an ein bestimmtes Protein mit wenigstens dem zweifachen des Hintergrunds und binden nicht wesentlich in einer signifikanten Menge an andere in der Probe vorhandene Proteine. Spezifische Bindung an einen Antikörper unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper notwendig machen, der für seine Spezifität für ein bestimmtes Protein selektiert ist. Zum Beispiel können polyklonale Antikörper, die gegen Kv6.2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 17, kodiert durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 18, oder Spleißvarianten oder Teile davon erzeugt wurden, können selektiert werden, um nur diejenigen polyklonalen Antikörper zu erhalten, die mit Kv6.2 und nicht mit anderen Proteinen, außer polymorphen Varianten, Orthologen und Allelen von Kv6.2, spezifisch immunreaktiv sind. Diese Selektion kann durch Abziehen der Antikörper erreicht werden, die mit Molekülen, wie Kv6.1, anderen Kv6.2-Orthologen, und mit anderen Kv6 Familienmitgliedern oder anderen Kv-Superfamiliemitgliedern kreuzreagieren. Eine Vielzahl von Immunoassayformaten kann verwendet werden, um Antikörper zu selektieren, die mit einem bestimmten Protein spezifisch immunreaktiv sind. Zum Beispiel werden Festphasen ELISA Immunoassays routinemäßig verwendet, um Antikörper, die mit einem Protein spezifisch immunreaktiv sind zu selektieren (siehe z. B. Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) für eine Beschreibung der Immunosassayformate und Bedingungen, die verwendet werden können, um die spezifische Immunreaktivität zu bestimmen). Typischerweise wird eine spezifische oder selektive Reaktion wenigsten zwei Mal dem Hintergrundsignal oder Rauschen entsprechen und noch typischer mehr als 10 bis 100 Mal dem Hintergrund entsprechen. Der Begriff „selektiv assoziiert mit" bezeichnet die Fähigkeit einer Nukleinsäure mit einander „selektiv zu hybridisieren" , wie oben definiert wurde, oder die Fähigkeit eines Antikörpers an ein Protein „selektiv (oder spezifisch) zu binden", wie oben definiert wurde.
Mit „Wirtszelle" wird eine Zelle gemeint, die einen Expressionsvektor enthält und die Replikation oder Expression des Expressionsvektors unterstützt. Wirtszellen können prokaryotische Zellen, wie E. coli, oder eukaryotische Zellen, wie Hefe-, Insekten-, Amphibien- oder Säugerzellen sein, wie CHO, HeLa und ähnliche, z. B. kultivierte Zellen, Explantate und Zellen in vivo.
„Biologische Probe", wie hierin verwendet, ist eine Probe eines biologischen Gewebes oder Flüssigkeit, die Kv6.2 Polypeptide enthält oder Nukleinsäure, die für ein Kv6.2 Protein kodiert. Solche Proben schließen Gewebe ein, das aus Menschen isoliert wurde, sind darauf aber nicht eingegrenzt. Biologische Proben können auch Schnitte aus Geweben, wie gefrorene Schnitte, die für histologische Zwecke verwendet wurden, einschließen. Eine biologische Probe wird typischerweise aus einem eukaryotischen Organismus erhalten, vorzugsweise Eukaryoten wie Pilzen, Pflanzen, Insekten, Protozoen, Vögeln, Fischen, Reptilien und vorzugsweise einem Säuger, wie Ratte, Mäusen, Kuh, Hund, Meerschweinchen oder Kaninchen und am bevorzugtesten einem Primaten, wie Schimpansen oder Menschen.
III. Isolieren des Gens, das Kv6.2 kodiert
A. Allgemeine rekombinante DNA Verfahren
Diese Erfindung beruht auf Routinetechniken in dem Gebiet der rekombinanten Genetik. Grundlegende Texte, die allgemeine Verfahren für die Verwendung in dieser Erfindung offenbaren, schließen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laborstory Manual-(2te A. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrg., 1994)) ein.
Für Nukleinsäuren sind die Größen entweder in Kilobasen (Kb) oder Basenpaaren (bp) angegeben. Diese sind Schätzungen, die aus Agarose oder Acrylamid-Gelelektrophoresen, aus sequenzierten Nukleinsäuren oder aus veröffentlichten DNA-Sequenzen abgeleitet wurden. Für Proteine sind die Größen in Kilodalton (kD) oder in der Anzahl der Aminosäurereste angegeben. Proteingrößen werden aus Gelelektropherese, aus sequenzierten Proteinen, aus abgeleiteten Aminosäuresequenzen oder aus veröffentlichten Proteinsequenzen abgeschätzt.
Oligonukleotide, die kommerziell nicht verfügbar sind, können gemäß dem Festphasen Phosphoramidit-Triester Verfahren synthetisiert werden, das zuerst beschrieben wurde von Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859–1862 (1981), mit einem automatisierten Synthesegerät, wie beschrieben in Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159–6168 (1984). Reinigung der Oligonukleotide erfolgt entweder durch native Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch Anionenaustauscher HPLC, wie beschrieben in Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137–149 (1983).
Die Sequenz der klonierten Gene und synthetischen Oligonukleotide kann nach dem Klonieren mit z. B. dem Kettenterminationsverfahren zum Sequenzieren von doppelsträngigen Templates von Wallace et al., Gene 16: 21–26 (1981) verifiziert werden.
B. Klonierungsverfahren für die Isolierung von Nukleotidsequenzen, die Kv6.2 kodieren
Im Allgemeinen werden die Nukleinsäuresequenzen, die Kv6.2 und verwandte Nukleinsäurehomologe kodieren, aus Bibliotheken mit cDNA und mit genomischer DNA kloniert oder mittels Amplifikationstechniken mit Oligonukleotidprimern isoliert. Zum Beispiel werden Kv6.2 Sequenzen typischerweise aus humanen Nukleinsäure (genomische oder cDNA) Bibliotheken durch Hybridisieren mit einer Nukleinsäuresonde oder einem Polynukleotid isoliert, dessen Sequenz aus SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 18 abgeleitet werden kann, vorzugsweise aus der Region, die die Untereinheiten-Assoziierungsregion oder die S4–S6 Region kodiert.. Ein geeignetes Gewebe, aus dem Kv6.2 RNA und cDNA isoliert werden können, ist Hirngewebe, wie das Gesamthirn.
Amplifikationstechniken mit Primern können auch verwendet werden, um Kv6.2 aus DNA oder RNA zu amplifizieren und zu isolieren. Die folgenden Primer können auch verwendet werden, um eine Sequenz von Kv6.2 zu amplifizieren:
Diese Primer können verwendet werden, z. B., um die Volllängensequenz oder eine Sonde von einem oder mehreren hundert Nukleotiden zu amplifizieren, welche dann verwendet wird, um eine humane Bibliothek nach Volllängen Kv6.2 zu screenen.
Nukleinsäuren, die Kv6.2 kodieren, können auch aus Expressionsbibliotheken mit Antikörpern als Sonden isoliert werden. Solche polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 17 oder einem immunogenen Teil davon erzeugt werden.
Kv6.2 polymorphe Varianten, Orthologe und Allele, die im Wesentlichen mit der Untereinheiten-Assoziierungsregion oder S4–S6 Region von Kv6.2 identisch sind, können mit Kv6.2 Nukleinsäuresonden und Oligonukleotiden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durch das Screenen von Bibliotheken isoliert werden. Alternativ können Expressionsbibliotheken verwendet werden, um Kv6.2 und Kv6.2 polymorphe Varianten, Orthologe und Allele durch das immunologische Detektieren von exprimierten Homologen mittels Antiseren oder gereinigten Antikörpern, die gegen Kv6.2 oder Teile davon (z. B., die Untereinheiten-Assoziierungsregion oder S4–S6 Region von Kv6.2) hergestellt wurden, die auch das Kv6.2 Homolog erkennen und selektiv daran binden, zu klonieren. Um eine cDNA Bibliothek herzustellen, sollte man eine Quelle wählen, die reich an Kv6.2 mRNA ist, z. B., Gewebe, wie das gesamte Gehirn. Die mRNA wird dann in cDNA mit reverser Transkriptase überführt, in einen rekombinanten Vektor ligiert und in einen rekombinanten Wirt für die Vermehrung, das Screenen und Klonieren transfiziert. Verfahren zum Herstellen und Screenen von cDNA Bibliotheken sind gut bekannt (siehe z. B. Gubler & Hoffman, Gene 25: 263–269 (1983); Sambrook et. al., supra ; Ausubel et al., siehe oben).
Für eine genomische Bibliothek wird die DNA aus dem Gewebe extrahiert und entweder mechanisch geschert oder enyzmatisch verdaut, um Fragmente von ungefähr 12–20 kb zu ergeben. Die Fragmente werden dann durch Gradientenzentrifugation von unerwünschten Größen getrennt und werden in Bakteriophage Lambda-Vektoren konstruiert. Diese Vektoren und Phagen werden in vitro verpackt. Rekombinante Phagen werden durch Plaque-Hybridisierung analysiert, wie in Benton & Davis, Science 196: 180–182 (1977) beschrieben wurde. Koloniehybridisierung wird durchgeführt, wie allgemein beschrieben in Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72: 3961–3965 (1975).
Ein alternatives Verfahren zum Isolieren von Kv6.2 Nukleinsäure und ihren Homologen kombiniert die Verwendung von synthetischen Oligonukleotidprimern und die Amplifikation eines RNA oder DNA Templats (siehe U. S. Patente 4,683,195 und 4,683,202 ; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Hrg., 1990)). Verfahren wie Polymerase Kettenreaktion (PCR) und Ligase Kettenreaktion (LCR) können verwendet werden, um Nukleinsäuresequenzen von Kv6.2 direkt aus mRNA, aus cDNA, aus genomischen Bibliotheken oder cDNA Bibliotheken zu amplifizieren. Degenerierte Oligonukleotide können designt werden, um Kv6.2 Homologe mit den hierin bereit gestellten Sequenzen zu amplifizieren. Restriktionsendonuklease-Stellen können in die Primer eingebaut werden. Polymerase Kettenreaktion oder andere in vitro Amplifikationsverfahren können auch nützlich sein, zum Beispiel, um Nukleinsäuresequenzen zu klonieren, die für Proteine kodieren, die exprimiert werden sollen, um Nukleinsäuren herzustellen, um sie als Sonden zum Detektieren des Vorliegens von Kv6.2 kodierender mRNA in physiologischen Proben, zum Sequenzieren von Nukleinsäure oder für andere Zwecke zu verwenden. Durch die PCR Reaktion amplifizierte Gene können aus Agarosegelen aufgereinigt werden und in einen geeigneten Vektor kloniert werden.
Genexpression von Kv6.2 kann auch durch Techniken analysiert werden, die in der Technik bekannt sind, z. B. Reverse Transkription und Amplifikation von mRNA, Isolierung von Gesamt-RNA oder Poly-A⁺-RNA, Northernblotting, Dotblotting, in situ Hybridisierung, RNase Protektion, Hochdichte-Polynukleotidarraytechnologie und ähnliche.
Synthetische Oligonukleotide können verwendet werden, um rekombinante Kv6.2 Gene zur Verwendung als Sonden oder für die Expression von Protein zu konstruieren. Dieses Verfahren wird mit einer Reihe von überlappenden Oligonukleotiden, die gewöhnlicherweise 40–120 bp lang sind, durchgeführt, die sowohl die Sense als auch die nicht Sense (Antisense) Stränge des Gens darstellen. Diese DNA-Fragmente werden dann annealt, ligiert und kloniert. Alternativ können Amplifikationstechniken mit präzisen Primern verwendet werden, um eine spezifische Subsequenz des Kv6.2–Gens zu amplifizieren. Die spezifische Subsequenz wird dann in einen Expressionsvektor ligiert.
Das Gen für Kv6.2 wird typischerweise in intermediäre Vektoren vor der Transformation in prokaryotische oder eurkaryotische Zellen für die Replikation und/oder Expression kloniert. Diese intermediären Vektoren sind typischerweise prokaryotische Vektoren, z. B., Plasmide oder Shuttle-Vektoren.
C. Expression in Prokaryoten und Eukaryoten
Um ein hohes Niveau an Expression eines klonierten Gens zu erhalten, wie von denjenigen cDNAs, die für Kv6.2 kodieren, subkloniert man typischerweise Kv6.2 in einen Expressionsvektor, der einen starken Promotor, um die Transkription zu steuern, einen Transkriptions/Translationsterminator und, falls er für eine Nukleinsäure ist, der für ein Protein kodiert, eine Ribosomenbindungsstelle für die Translations-Initiierung enthält. Geeignete bakterielle Promotoren sind in der Technik wohl bekannt und werden beschrieben z. B. in Sambrook et al., und Ausubel et al., siehe oben. Bakterielle Expressionssysteme zur Expression des Kv6.2 Proteins sind verfügbar in z. B. E. coli, Bacillus sp., und Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229–235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543–545 (1983). Kits für solche Expressionssysteme sind kommerziell verfügbar. Eukaryotische Expressionssysteme für Säugerzellen, Hefe und Insektenzellen sind in der Technik wohl bekannt und sind auch kommerziell verfügbar.
Die Auswahl des Promotors, der verwendet wird, um die Expression einer heterologen Nukleinsäure zu steuern, hängt von der speziellen Anwendung ab. Der Promotor wird vorzugsweise ungefähr im gleichen Abstand von der heterologen Transkriptionsstartstelle positioniert, wie von der Transkriptionsstartstelle in seiner natürlichen Umgebung. Wie in der Technik bekannt ist, kann jedoch einige Variation dieses Abstands ohne Verlust der Promotorfunktion erreicht werden.
Zusätzlich zu dem Promotor enthält der Expressionsvektor typischerweise eine Transkriptionseinheit oder Expressionskassette, die all die zusätzlichen Elemente enthält, die für die Expression der Kv6.2 kodierenden Nukleinsäure in Wirtszellen benötigt werden. Eine typische Expressionskassette enthält somit einen Promoter, der funktional mit der Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, die für Kv6.2 kodiert und Signale, die für die effiziente Polyadenylierung des Transkript benötigt werden, Ribosomenbindungsstellen und Translationstermination. Zusätzliche Elemente der Kassette können Enhancer einschließen und, falls genomische DNA als das strukturelle Gen verwendet wird, Introns mit funktionalen Spleißdonor- und Akzeptorstellen einschließen.
Zusätzlich zu einer Promotorsequenz sollte die Expressionskassette auch eine Transkriptionsterminationsregion stromab des strukturellen Gens enthalten, um effiziente Termination zu gewährleisten. Die Terminationsregion kann aus dem gleichen Gen wie die Promotorsequenz erhalten werden oder kann aus anderen Genen erhalten werden. Der spezielle Expressionsvektor, der verwendet wird, um die genetische Information in die Zelle zu transportieren, ist nicht besonders kritisch. Jeder der konventionellen Vektoren, der für die Expression in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen verwendet wird, kann verwendet werden. Standard bakterielle Expressionsvektoren schließen Plasmide, wie pBR322 basierte Plasmide, pSKF, pEP23D und Fusionsexpressionssysteme, wie GST und LacZ ein. Epitop-Tags können auch zu den rekombinanten Proteinen hinzugefügt werden, um bequeme Isolierungsverfahren zu gewährleisten, z. B., c-myc.
Expressionsvektoren, die regulatorische Elemente aus eukaryotischen Viren enthalten, werden typischerweise in eukaryotischen Expressionsvektoren verwendet, z. B. SV40 Vektoren, Papilloma Virusvektoren und Vektoren, die von Epstein-Barr Virus abgeleitet sind. Andere exemplarische eukaryotische Vektoren schließen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, Baculovirus pDSVE und jeden anderen Vektor ein, der die Expression von Proteinen unter der Steuerung des CMV Promotors, SV40 „Early Promotors", SV40 „Later Promotors", Metallothionein-Promotors, murinen „Mammary Tumor" Viruspromotors, Rous sarcoma Viruspromotors, Polyhedrin-Promotors oder anderen Promotoren erlaubt, die sich als für die Expression in eukaryotischen Zellen als effektiv gezeigt haben.
Einige Expressionssysteme besitzen Marker, die Genamplifikation gewährleisten, wie Thymidinkinase und Dihydrofolat-Reductase. Alternativ sind Expressionssysteme mit hoher Ausbeute, die keine Genamplifikation involvieren, auch geeignet, wie die Verwendung eines Baculovirusvektors in Insektenzellen, mit einer für Kv6.2 kodierenden Sequenz unter der Steuerung des Polyhedrin-Promotors oder anderer starker Baculovirus-Promotoren. Die Elemente, die typischerweise in Expressionsvektoren enthalten sind, enthalten auch ein Replicon, das in E. coli funktioniert, ein Gen, das eine Antibiotikaresistenz kodiert, um die Selektion von Bakterien zu erlauben, die die rekombinanten Plasmide enthalten, und einzigartige Restriktionsstellen in nicht-essentiellen Regionen des Plasmids beinhalten, um Insertion von eukaryotischen Sequenzen zu erlauben. Das spezifisch gewählte Antibiotikaresistenzgen ist nicht kritisch jedes der vielen in der Technik bekannten Resistenzgene ist geeignet. Die prokaryotischen Sequenzen werden vorzugsweise ausgewählt, so dass sie nicht mit der Replikation der DNA in eukaryotischen Zellen, falls notwendig, interferieren.
Standard-Transfektionsverfahren werden verwendet, um bakterielle, Säuger-, Hefe- oder Insektenzellen zu produzieren, die große Mengen von Kv6.2 Protein exprimieren , die dann mit Standardtechniken aufgereinigt werden (siehe z. B. Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619– 17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, Vol. 182 (Deutscher, Hrg., 1990)). Transformation von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen wird gemäß den Standardtechniken durchgeführt. (siehe, z. B., Morrison, J. Bact. 132: 349–351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347–362 (Wu et al., Hrg., 1983). Jede der gut bekannten Prozeduren zum Einführen von fremden Nukleotidsequenzen in Wirtszellen kann verwendet werden. Diese schließen die Verwendung von Kalziumphospat Transfektion, Polybren, Protoplastenfusion, Elektroporation, Liposomen, Mikroinjektion, Plasmavektoren, viralen Vektoren und jedes der anderen gut bekannten Verfahren zum Einführen von klonierter genomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA oder anderen fremden genetischen Materials in eine Wirtszelle ein (siehe z. B. Sambrook et al., siehe oben). Es ist nur notwendig, dass das verwendete spezifische genetische Konstruktionsverfahren in der Lage ist, erfolgreich wenigstens ein Gen in die Wirtszelle einzuführen, das in der Lage ist Kv6.2, zu exprimieren.
Nachdem der Expressionsvektor in die Zellen eingeführt wurde, werden die transfizierten Zellen unter Bedingungen kultiviert, die die Expression von Kv6.2 begünstigen, das aus der Kultur mit Standardtechniken, die unten identifiziert werden, gewonnen wird.
IV. Aufreinigung von Kv6.2 Polypeptiden
Zur Verwendung in funktionalen Assays kann entweder natürlich vorkommendes oder rekombinantes Kv6.2 aufgereinigt werden. Natürlich vorkommende Kv6.2-Monomere können z. B. aus humanem Gewebe, wie dem Gesamthirn oder jeder anderen Quelle eines Kv6.2 Homologem aufgereinigt werden. Rekombinante Kv6.2-Monomere können aus jedem geeigneten Expressionssystem aufgereinigt werden.
Die Kv6.2-Monomere können durch Standardtechniken zu substantieller Reinheit aufgereinigt werden, einschließlich der selektiven Präzipitation mit solchen Substanzen wie Ammoniumsulfat, Säulenchromatographie, Immunoaufreinigungsverfahren und andere (siehe z. B. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); U. S. Patent Nr. 4,673,641 ; Ausubel et al., siehe oben; und Sambrook et al., siehe oben).
Eine Anzahl von Prozeduren kann eingesetzt werden, wenn rekombinante Kv6.2-Monomere aufgereinigt werden. Zum Beispiel können Proteine mit etablierten molekularen Adhäsionseigenschaften reversibel mit den Kv6.2-Monomeren verbunden werden. Mit dem geeigneten Liganden können die Kv6.2-Monomere selektiv an eine Aufreingungssäule adsorbiert werden und dann von der Säule in einer relativ reinen Form freigesetzt werden. Das verbundene Protein wird dann durch enzymatische Aktivität entfernt. Schließlich könnten die Kv6.2 Monomere mit Immunaffinitätssäulen aufgereinigt werden.
A. Aufreinigung von Kv6.2-Monomeren aus rekombinanten Bakterien
Rekombinante Proteine werden durch transformierte Bakterien in großen Mengen, typischerweise nach Promotorinduktion, exprimiert; Expression kann aber konstitutiv sein. Promotorinduktion mit IPTG ist ein Beispiel eines induzierbaren Promotorsystems. Bakterien werden gemäß den Standardverfahren in der Technik gezogen. Frische oder gefrorene Bakterienzellen werden für die Isolierung von Protein verwendet.
Proteine, die in Bakterien exprimiert werden, können unlösliche Aggregate bilden („Inclusion Bodies"). Zahlreiche Protokolle sind für die Aufreinigung der Kv6.2-Monomere aus Inclusions Bodies geeignet. Zum Beispiel involviert die Aufreinigung von Inclusion Bodies typischerweise die Extraktion, Separation und/oder Aufreinigung von Inclusion Bodies durch Disruption der bakteriellen Zellen, z.B. durch Inkubation in einem Puffer mit 50 mM TRIS/HCL pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.1 mM ATP und 1 mM PMSF. Die Zellsuspension kann mit 2-3 Passagen durch eine French Press lysiert, mit einem Polytron (Brinkmann Instruments) homogenisiert oder auf Eis sonifiziert werden. Alternative Verfahren des Lysierens von Bakterien sind dem Fachmann offenkundig (siehe z. B. Sambrook et al., siehe oben; Ausubel et al., siehe oben).
Wenn notwendig, werden die Inclusion Bodies solubilisiert und die lysierte Zellsuspension wird typischerweise zentrifugiert, um ungewolltes unlösliches Material zu entfernen. Proteine, die die Inclusion Bodies gebildet haben, können durch Verdünnung oder Dialyse mit einem kompatiblen Puffer renaturiert werden. Geeignete Lösungen schließen, sind aber nicht beschränkt auf, Harnstoff (ungefähr 4 M bis ungefähr 8 M), Formamid (wenigstens ungefähr 80%, Volumen/Volumen-Basis) und Guanidinium-hydrochlorid (ungefähr 4 M bis ungefähr 8 M) ein. Einige Lösungsmittel, die in der Lage sind Aggregat bildende Proteine zu solubilisieren, zum Beispiel SDS (Natriumdodecylsulfat), 70% Ameisensäure sind nicht geeignet für die Verwendung in diesem Verfahren wegen der der Möglichkeit der irreversiblen Denaturierung der Proteine, die mit einem Mangel an Immunogenität und/oder Aktivität einhergeht. Obwohl Guanidinium hydrochlorid und ähnliche Agenzien Denaturierungsmittel sind, ist diese Denaturierung nicht irreversibel und Renaturierung kann nach Entfernung (durch zum Beispiel Dialyse) oder Verdünnung des Denaturierungsmittels auftreten, was die erneute Bildung des immunologisch und/oder biologisch aktiven Proteins ermöglicht. Andere geeignete Puffer sind den Fachleuten bekannt. Humane Kv6.2-Monomere werden von anderen bakteriellen Proteinen durch Standardseparationtechniken abgetrennt, z. B., mit Ni-NTA Agarosematerial. Alternativ ist es möglich die Kv6.2-Monomere aus dem Bakterienperiplasma aufzureinigen. Nach Lyse der Bakterien, wenn die Kv6.2-Monomere in das Periplasma der Bakterien exportiert werden, kann die periplasmatische Fraktion der Bakterien durch kalten osmotischen Schock zusätzlich zu anderen dem Fachmann bekannten Verfahren isoliert werden. Um rekombinante Proteine aus dem Periplasma zu isolieren, werden die bakteriellen Zellen zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden. Das Pellet wird in einem Puffer, der 20% Saccharose enthält, resuspendiert. Um die Zellen zu lysieren, werden die Bakterien zentrifugiert und das Pellet in eiskaltem 5 mM MgSO₄ resuspendiert und in einem Eisbad für ungefähr 10 Minuten gehalten. Die Zellsuspension wird zentrifugiert und der Überstand dekantiert und aufbewahrt. Die rekombinanten Proteine, die in dem Überstand vorliegen, können von den Wirtsproteinen durch Standardauftrennungstechniken abgetrennt werden, die dem Fachmann wohl bekannt sind.
B. Standardproteintrennungstechniken zum Aufreinigen von Kv6.2-Monomeren
Solubilitätsfraktionierung
Eine anfängliche Salzfraktionierung kann, oft als ein anfänglicher Schritt, besonders dann, wenn die Proteinmischung komplex ist, viele der ungewollten Wirtszellproteine (oder Proteine, die aus dem Zellkulturmedium stammen) von den interessierenden rekombinanten Protein abtrennen. Das bevorzugte Salz ist Ammoniumsulfat. Ammoniumsulfat präzipitiert Proteine durch effektives Reduzieren der Wassermenge in der Proteinmischung. Proteine präzipitieren dann aufgrund ihrer Solubilität. Je hydrophober ein Protein ist, desto wahrscheinlicher wird es bei geringeren Ammoniumsulfat Konzentrationen präzipitieren. Ein typisches Protokoll schließt das Hinzugeben von gesättigtem Ammoniumsulfat zu einer Proteinlösung ein, so dass die resultierende Ammoniumsulfat Konzentration zwischen 20–30% ist. Diese Konzentration wird die am meisten hydrophoben Proteine präzipitieren. Das Präzipitat wird dann verworfen (außer das interessierende Protein ist hydrophob) und Ammoniumsulfat wird zu dem Überstand bis zu einer Konzentration hinzugegeben, von der bekannt ist, dass dabei das interessierende Protein präzipitiert. Das Präzipitat wird dann in einem Puffer solubilisiert und das überschüssige Salz wird, falls notwendig entweder durch Dialyse oder Membranfiltrierung, entfernt. Andere Verfahren, die auf der Löslichkeit von Proteinen basieren, wie kalte Ethanolfällung, sind den Fachleuten bekannt, und können verwendet werden, um komplexe Proteinmischungen zu fraktionieren.
Differentielle Größenfiltration.
Das Molekulargewicht der Kv6.2-Monomere kann verwendet werden, um sie von Proteinen mit größerer und geringerer Größe unter Verwendung von Ultrafiltration durch Membranen von verschiedener Porengröße zu isolieren (zum Beispiel Amicon oder Millipore Membranen). Als ein erster Schritt wird die Proteinmischung durch eine Membran mit einer Porengröße ultrafiltriert, die eine geringere Molekulargewichtsausschlussgröße besitzt als das Molekulargewicht des interessierenden Proteins. Das Retentat der Ultrafiltration wird dann gegen eine Membran ultrafiltriert mit einer molekularen Ausschlussgröße, die größer ist als das Molekulargewicht des interessierenden Proteins. Das rekombinante Protein wird durch die Membran in das Filtrat hindurch treten. Das Filtrat kann dann, wie unter beschrieben, chromatographiert werden.
Säulenchromatographie
Die Kv6.2-Monomere können auch von anderen Proteinen auf der Basis ihrer Größe, Nettooberflächenladung, Hydrophobizität und Affinität für Liganden separiert werden. Zusätzlich können Antikörper, die gegen Proteine erzeugt werden, mit den Säulenmatrizen konjugiert werden und die Proteine immuno-gereinigt werden. All diese Verfahren sind in der Technik wohl bekannt. Es wird auch für einen Fachmann offensichtlich sein, dass chromatographische Techniken in jedem Maßstab und unter Verwendung der Geräte von vielen verschiedenen Herstellern (z. B. Pharmacia Biotech) durchgeführt werden können.
V. Immunologische Detektion von Kv6.2
Zusätzlich zu der Detektion von Kv6.2-Genen und Genexpression mit der Nukleinsäurehybridisierungstechnologie kann man auch Immunoassays verwenden, um die Kv6.2-Monomere zu detektieren. Immunoassays können verwendet werden, um qualitativ oder quantitativ die Kv6.2-Monomere zu analysieren. Einen allgemeinen Überblick über die geeignete Technologie kann in Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) gefunden werden.
A. Antikörper gegen Kv6.2-Monomere
Verfahren zum Produzieren von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die mit Kv6.2-Monomeren spezifisch reagieren, sind den Fachleuten bekannt (siehe, z. B., Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, siehe oben; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2te A. 1986); und Kohler & Milstein, Nature 256: 495–497 (1975). Solche Techniken schließen die Antikörperpräparation durch Auswahl von Antikörpern aus Bibliotheken von rekombinanten Antikörpern in Phagen- oder ähnlichen Vektoren ein, wie auch die Präparation von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern durch das Immunisieren von Kaninchen oder Mäusen (siehe, z. B., Huse et al., Science 246: 1275–1281 (1989); Ward et al., Nature 341: 544–546 (1989)).
Eine Vielzahl von Immunogenen, die Teile von Kv6.2-Monomeren umfassen, können verwendet werden, um Antikörper zu produzieren, die mit Kv6.2-Monomeren spezifisch reaktiv sind. Zum Beispiel können rekombinante Kv6.2-Monomere oder ein antigenes Fragment davon, wie die Untereinheiten-Assoziierungsregion oder S4–S6 Region, wie hier beschrieben, isoliert werden. Rekombinantes Protein kann in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen, wie oben beschrieben, exprimiert werden, und gereinigt werden, wie oben im Allgemeinen beschrieben wurde. Rekombinantes Protein ist das bevorzugte Immunogen für die Produktion von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern. Alternativ kann ein synthetisches Peptid, das von den hier offenbarten Sequenzen abgeleitet wurde, und mit einem Trägerprotein konjugiert wurde, als ein Immunogen verwendet werden. Natürlich vorkommendes Protein kann auch entweder in reiner oder unreinen Form verwendet werden. Das Produkt wird dann in ein Tier injiziert, das in der Lage ist Antikörper zu produzieren. Entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper können für die nachfolgende Verwendung in Immunoassays erzeugt werden, um das Protein zu messen.
Verfahren zur Produktion von polyklonalen Antikörpern sind den Fachleuten bekannt. Ein durch Inzucht erzeugter Mausstamm (z. B. BALB/C Mäuse) oder Kaninchen wird/werden mit dem Protein mit einem Standardadjuvans, wie Freund's Adjuvans, und einem Standardimmunisierungprotokoll immunisiert. Die Immunantwort des Tieres auf die Immunogen-Präparation wird durch das Nehmen von Testblutungen und das Bestimmen des Reaktivitätstiters gegenüber Beta-Untereinheiten überwacht. Wenn geeignet hohe Antikörpertiter gegen das Immunogen erhalten wurden, wird Blut aus dem Tier gesammelt und Antisera werden hergestellt. Weitere Fraktionierung der Antiseren, um Antikörper anzureichern, die gegen das Protein reaktiv sind, kann unternommen werden, falls das gewünscht ist (siehe Harlow & Lane, siehe oben).
Monoklonale Antikörper können durch zahlreiche Techniken erhalten werden, die den Fachleuten vertraut sind. Kurz gesagt, werden Milzzellen aus einem Tier, das mit einem gewünschten Antigen immunisiert ist, gewöhnlich durch Fusion mit einer Myelomazelle immortalisiert (siehe Kohler & Milstein, Eur. J Immunol. 6: 511–519 (1976)). Alternative Verfahren der Immortalisierung schließen die Transformation mit Epstein Barr Virus, Oncogenen oder Retroviren oder andere in der Technik wohl bekannte Verfahren ein. Kolonien, die aus einzelnen immortalisierten Zellen hervorgehen, werden auf die Produktion von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität und Affinität für das Antigen gescreent und die Produktionsmenge der monoklonalen Antikörper, die durch solche Zellen produziert werden, kann durch zahlreiche Techniken erhöht werden, einschließlich der Injektion in die Peritonealhöhle eines Wirbeltierwirts. Alternativ kann man DNA-Sequenzen isolieren, die einen monoklonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon durch Screenen einer DNA- Bibliothek aus humanen B-Zellen gemäß dem allgemeinen Protokoll, das durch Huse, et al., Science 246: 1275–1281 (1989) umrissen wird, kodieren.
Monoklonale Antikörper und polyklonale Seren werden gesammelt und gegen das Immunogenprotein in einem Immunoassay, zum Beispiel einem Festphasen-Immunoassay, titriert, wobei das Immunogen auf einem festen Träger immobilisiert ist. Typischerweise werden polyklonale Antiseren mit einem Titer von 10⁴ oder größer selektiert und auf ihre Kreuzreaktivität mit Nicht-Kv Proteinen oder anderen Kv6 Familienmitgliedern wie Kv6.1 oder anderen Kv-Superfamiliemitgliedern mit einem kompetitiven Bindungsimmunoassay getestet. Spezifische polyklonale Antiseren und monoklonale Antikörper werden gewöhnlich mit einem K_d von wenigstens ungefähr 0.1 mM, noch gewöhnlicher von wenigstens ungefähr 1 μM, bevorzugt wenigstens ungefähr 0.1 μM oder besser, und am bevorzugtesten 0.01 μM oder besser binden.
Sobald die spezifischen Antikörper gegen ein Kv6.2 verfügbar sind, kann das Kv6.2 mit einer Vielzahl von Immunoassayverfahren detektiert werden. Für eine Übersicht über immunologische und Immunoassayprozeduren, siehe Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr Hrg., 7te A. 1991). Darüber hinaus können die Immunoassays der vorliegenden Erfindung in jeder der zahlreichen Konfigurationen durchgeführt werden, die im Überblick in Enzyme Immunoassay (Maggio, Hrg., 1980); und Harlow & Lane, siehe oben, eingehend dargestellt werden.
B. Immunologische Bindungsassays
Das Kv6.2 kann mit jeder einer Anzahl von gut anerkannten immunologischen Bindungsassays detektiert und/oder quantifiziert werden (siehe, z. B. U.S. Patente 4,366,241 ; 4,376,110 ; 4,517,288 ; und 4,837,168 ). Für eine Übersicht über die allgemeinen Immunoassays siehe auch Methods in Cell Biology : Antibodies in Cell Biology, Band 37 (Asai, Hrg. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, Hrgs., 7te A. 1991). Immunologische Bindungsassays (oder Immunoassays) verwenden typischerweise einen Antikörper, der spezifisch an ein Protein oder ein Antigen der Wahl bindet (in diesem Fall das Kv6.2 oder eine antigene Subsequenz davon). Der Antikörper (z. B. Anti-Kv6.2 ) kann durch jede einer Anzahl von Mitteln hergestellt werden, die Fachleuten wohl bekannt sind und wie sie oben beschrieben sind.
Immunoassays verwenden oft auch ein Markierungsagens, um spezifisch an den Komplex zu binden und ihn zu markieren, der durch den Antikörper und das Antigen gebildet wird. Das Markierungsagens kann selbst eine der Einheiten sein, die den Antikörper/das Antigen umfassen. Somit kann das Markierungsagens ein markiertes Kv6.2 Polypeptid oder ein markierter Anti-Kv6.2 Antikörper sein. Alternativ kann das Markierungsagens eine dritte Einheit wie ein sekundärer Antikörper sein, der spezifisch an den Antikörper/Kv6.2-Komplex bindet (ein sekundärer Antikörper ist typischerweise für Antikörper der Spezies spezifisch, aus der der erste Antikörper abgeleitet ist). Andere Proteine, die in der Lage sind, spezifisch konstante Immunoglobulin-Regionen zu binden, wie Protein A oder Protein G können auch als das Markierungsagens verwendet werden. Diese Proteine weisen eine starke nicht immunogene Reaktivität mit den konstanten Immunoglobulinregionen aus einer Vielzahl von Spezies auf (siehe z. B. Kronval et al., J. Immunol. 111: 1401–1406 (1973); Akerstrom et al., J. Immunol. 135: 2589–2542 (1985)). Das Markierungsagens kann mit einer detektierbaren Einheit modifiziert werden, wie Biotin, an das ein anderes Molekül spezifisch binden kann, wie Straptavidin. Eine Vielzahl von detektierbaren Einheiten sind den Fachleuten wohl bekannt. Überall in den Assays können Inkubations- und/oder Waschschritte nach jeder Kombinierung von Reagenzien notwendig sein. Inkubationsschritte können von ungefähr 5 Sekunden bis zu zahlreichen Stunden variieren, vorzugsweise von ungefähr 5 Minuten bis ungefähr 24 Stunden. Jedoch wird die Inkubationszeit von dem Assayformat, Antigen, Lösungsvolumen, Konzentrationen und ähnlichem abhängen. Gewöhnlicherweise werden die Assays bei Raumtemperatur durchgeführt, obwohl sie über einen breiten Temperaturbereich, wie von 10°C bis 40°C, durchgeführt werden können.
Nicht kompetetive Assayformate
Immunoassays zum Detektieren des Kv6.2 in Proben können entweder kompetetiv oder nicht kompetetiv sein. Nicht kompetetive Immunoassays sind Assays, in denen die Menge des Antigens direkt gemessen wird. In einem bevorzugten „Sandwich"-Assay, zum Beispiel, können die Anti-Kv6.2-Untereinheitsantikörper direkt an ein festes Substrat, auf dem sie immobilisiert sind, gebunden werden. Diese immobilisierten Antikörper fangen dann Kv6.2 ein, das in der Testprobe vorliegt. Die Kv6.2-Monomere werden somit immobilisiert und dann durch ein Markierungsreagens gebunden, wie einen zweiten Kv6.2 Antikörper, der eine Markierung trägt. Alternativ kann dem zweiten Antikörper eine Markierung fehlen, aber er kann selbst durch einen markierten dritten Antikörper gebunden werden, der wiederum für Antikörper der Spezies spezifisch ist, von der der zweite Antikörper abgeleitet ist. Der zweite oder dritte Antikörper wird typischerweise mit einer detektierbaren Einheit, wie Biotin, modifiziert, an die ein anderes Molekül spezifisch bindet, z. B., Streptavidin, um eine detektierbare Einheit bereit zu stellen.
Kompettive Assayformate
In kompetitiven Assays wird die Menge des in der Probe vorliegenden Kv6.2 indirekt durch Messen der Menge von bekanntem (exogen) hinzu gefügten Kv6.2 gemessen, das von einem Anti-Kv6.2 Antikörper durch das unbekannte in einer Probe vorliegende Kv6.2 verdrängt (weg kompetiert) wird. In einem kompetitiven Assay wird eine bekannte Menge des Kv6.2 einer Probe hinzugefügt und die Probe wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der spezifisch an das Kv6.2 bindet. Die Menge von exogenem Kv6.2, das an den Antikörper gebunden ist, ist invers proportional mit der Konzentration des in der Probe vorliegenden Kv6.2. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper auf einem festen Substrat immobilisiert. Die Menge des an den Antikörper gebundenen Kv6.2 kann entweder durch Messen des in einem Kv6.2/Antikörperkomplex vorliegendem Kv6.2 oder alternativ durch Messen der Menge des verbleibenden unkomplexierten Proteins bestimmt werden. Die Menge von Kv6.2 kann durch Bereitstellen eines markierten Kv6.2 Moleküls detektiert werden. Ein Hapten-Inhibierungsassay ist ein anderer bevorzugter kompetitiver Assay. In diesem Assay wird das bekannte Kv6.2 auf einem festen Substrat immobilisiert. Eine bekannte Menge von Anti-Kv6.2 Antikörper wird der Probe hinzugefügt, und die wird dann mit dem immobilisierten Kv6.2 in Kontakt gebracht. Die Menge des an das bekannte immobilisierte Kv6.2 gebundenen Anti-Kv6.2 Antikörpers ist invers proportional zu der Menge des in der Probe vorhandenen Kv6.2. Wiederum kann die Menge des immobililisierten Antikörpers durch Detektieren entweder der immobilisierten Fraktion des Antikörpers oder der Fraktion des Antikörpers detektiert werden, die in Lösung bleibt. Detektion kann direkt sein, wenn der Antikörper markiert ist oder indirekt durch die nachfolgende Zugabe einer markierten Einheit, die spezifisch den Antikörper, wie oben beschrieben, bindet.
Kreuzreaktivitätsbestimmungen
Immunoassays in dem kompetitiven Bindungsformat können auch für Kreuzreaktivitätsbestimmungen von Kv6.2 verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Protein, das wenigstens eine Teilsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 17 besitzt, oder ein Protein, das wenigstens zum Teil durch SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 18 kodiert wird oder eine immunogenen Region, auf einem festen Träger immobilisiert werden. Andere Proteine wie andere Kv6 Familienmitglieder werden dem Assay hinzugefügt, z. B. Kv6.1 oder Kv6.2-Orthologe, um so um das Binden der Antisera an das immobilisierte Antigen zu kompetetieren. Die Fähigkeit der hinzugefügten Proteine, die Bindung der Antisera an das immobilisierte Protein zu kompetetieren, wird mit der Fähigkeit des Kv6.2 mit einer Sequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 17 verglichen, mit sich selbst zu kompetetieren. Der Prozentsatz der Kreuzreaktivität mit den obigen Proteinen wird mit Standardberechnungen berechnet. Die Antisera mit weniger als 10% Kreuzreaktivität mit jedem der oben aufgeführten hinzugefügten Proteine werden ausgewählt und gepoolt. Die kreuzreaktiven Antikörper werden optional aus den gepoolten Antisera durch Immunoabsorption mit den hinzugefügten betrachteten Proteinen entfernt, z. B., entfernt verwandten Homologen.
Die immunoabsorbierten und gepoolten Antisera werden in einem kompetetiven Bindungsimmunassay, wie oben beschrieben, verwendet, um ein zweites Protein zu vergleichen, von dem gedacht wird, dass es vielleicht ein Allel, Ortholog oder eine polymorphe Variante von Kv6.2 zu dem immunogenen Protein sei. Um diesen Vergleich durchzuführen, werden die zwei Proteine jeweils in einem breiten Konzentrationsbereich in Assays getestet und die Menge jedes Proteins, die benötigt wird, um 50% der Antiserabindung an das immobilisierte Protein zu inhibieren, bestimmt. Wenn die Menge des zweiten Proteins, die benötigt wird, um 50% Bindung zu inhibieren, geringer als das 10fache der Menge des Proteins ist, das durch Kv6.2 kodiert wird, die benötigt wird, um 50% Bindung zu inhibieren, dann soll das zweite Protein spezifisch an den polyklonalen Antikörper binden, die durch das jeweilige Kv6.2 Immunogen erzeugt wurde.
Andere Assayformate
Westernblot (Immunoblot) Analyse wird verwendet, um das Vorliegen von Kv6.2 in der Probe zu detektieren und quantifizieren. Die Technik umfasst im Allgemeinen das Auftrennen der Probenproteine durch Gelelektrophorese auf der Basis des Molekulargewichts, das Transferieren der aufgetrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger (wie Nitrozellulosefilter, einen Nylonfilter oder derivatisierten Nylonfilter) und das Inkubieren der Probe mit Antikörpern, die spezifisch Kv6.2 binden. Die Anti-Kv6.2 Antikörper binden spezifisch an Kv6.2 auf dem festen Träger. Diese Antikörper können direkt markiert werden oder können alternativ dann mit markierten Antikörpern detektiert werden (z. B. markierten Schaf Anti-Maus Antikörpern), die spezifisch an die Anti-Kv6.2 Antikörper binden. Andere Assayformate schließen Liposom-Immunoassays (LIA) ein, die Liposomen verwenden, die designt sind, um spezifische Moleküle (z. B. Antikörper) zu binden und eingekapselte Reagenzien oder Marker frei zusetzen. Die freigesetzten Chemikalien werden gemäß Standardtechniken detektiert (siehe Monroe et el., Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34–41 (1986)).
Reduktion von nicht spezifischer Bindung
Ein Fachmann wird zu schätzen wissen, dass es oft wünschenswert ist, nicht spezifische Bindung in Immunoassays zu minimieren. Besonders, wenn der Asssay ein Antigen oder Antikörper involviert, der auf einem festen Substrat immobilisiert ist, ist es wünschenswert, die Menge von nicht spezifischer Bindung an das Substrat zu minimieren. Mittel zum Reduzieren solcher nicht spezifischer Bindung sind den Fachleuten wohl bekannt. Typischerweise involviert diese Technik das Beschichten des Substrats mit einer proteinhaltigen Zusammensetzung. Insbesondere Proteinzusammensetzungen wie bovines Serumalbumin (BSA), nicht-fettige Trockenmilch und Gelatine werden häufig verwendet, wobei Trockenmilch am meisten bevorzugt ist.
Markierungen
Die genaue Markierung oder detektierbare Gruppe, die in dem Assay verwendet wird, ist nicht ein kritischer Aspekt der Erfindung, so lange wie sie nicht signifikant mit der spezifischen Bindung des Antikörpers, der in dem Assay verwendet wird, interferiert. Die detektierbare Gruppe kann jedes Material mit einer detektierbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Solche detektierbaren Markierungen sind in dem Gebiet der Immunoassays weit entwickelt worden und im Allgemeinen kann fast jede Markierung, die in solchen Verfahren nützlich ist, in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Daher ist eine Markierung jede Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Mittel detektierbar ist. Nützliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung schließen magnetische Kügelchen (z. B. DYNABEADS^TM) ein, fluoroeszente Farbstoffe (z. B. Fluorescein-isothiocyanat, Texas-rot, Rhodamin, und ähnliche), radioaktive Markierungen (z. B. ³H,¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³²P), Enzyme (z. B. Meerrettich-Peroxidase, Alkalische-Phosphatase und andere, die in einem ELISA gemeinhin verwendet werden) und colometrische Markierungen wie kolloidales Gold oder gefärbtes Glas oder Plastikkügelchen (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex, etc.). Die Markierung kann direkt oder indirekt an die gewünschte Komponente des Assays gemäß den in der Technik wohl bekannten Verfahren gekoppelt werden. Wie oben angezeigt, kann eine breite Vielzahl von Markierungen verwendet werden, wobei die Wahl der Markierung von der benötigten Sensitivität, der Einfachheit, sie mit der Komponente zu konjugieren, Stabilitätsanforderungen, den verfügbaren Geräten und Entsorgungsvorschriften abhängt. Nicht radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel angebracht. Im Allgemeinen wird ein Ligandenmolekül (z. B. Biotin) kovalent mit dem Molekül verbunden. Der Ligand bindet dann an ein anderes Molekül (z. B. Streptavidin), das entweder inhärent detektierbar oder kovalent an ein Signalsystem gebunden ist, wie einem detektierbaren Enzym, einer fluoreszierenden Verbindung oder einer chemilumineszenten Verbindung. Die Liganden und ihre Targets können in jeder geeigneten Kombination mit Antikörpern, die Kv6.2 erkennen, oder sekundären Antikörpern verwendet werden, die Anti-Kv6.2 Antikörper erkennen. Die Moleküle können auch direkt mit Signal erzeugenden Verbindungen konjugiert werden, z. B. durch Konjugieren mit einem Enzym oder Fluorophor. Als Markierungen interessierende Enyzme werden primär Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidasen, insbesondere Peroxidasen sein. Fluoreszierende Verbindungen schließen Fluoreszin und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon etc. ein. Chemilumineszente Verbindungen schließen Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazindion, z. B. Luminol ein. Für eine Übersicht über die zahlreichen Markierungs- oder Signal produzierenden Systeme, die verwendet werden können, siehe U.S. Patent Nr. 4,391,904 .
Mittel zum Detektieren von Markierungen sind den Fachleuten wohl bekannt. Somit schließen, wenn zum Beispiel die Markierung eine radioaktive Markierung ist, die Detektionsmittel einen Szintillationszähler oder photographischen Film ein, wie bei der Autoradiographie. Wenn die Markierung eine fluoreszente Markierung ist, kann sie durch Anregen des Fluorochroms mit der geeigneten Wellenlänge und Detektieren der resultierenden Fluoreszenz detektiert werden. Die Fluoreszenz kann visuell, durch Mittel des photographischen Films, durch die Verwendung von elektronischen Detektoren wie Geräten mit Ladungskopplung (CCD) oder Photomultiplikatoren und ähnlichen detektiert werden. In ähnlicher Weise können enzymatische Markierungen durch das Bereitstellen der geeigneten Substrate für das Enzym und das Detektieren des resultierenden Reaktionsprodukts detektiert werden. Schließlich können einfache kolometrische Markierungen durch Beobachten der Farbe, die mit der Markierung assoziiert ist, detektiert werden. Somit erscheint in zahlreichen Eintauch- („Dipstick") Assays konjugiertes Gold oft als rosa, während zahlreiche konjugierte Kügelchen als die Farbe des Kügelchens erscheinen.
Einige Assayformate benötigen nicht die Verwendung von markierten Komponenten. Zum Beispiel können Agglutinierungsassays verwendet werden, um das Vorliegen der Target-Antikörper zu detektieren. In diesem Fall werden Antigen-beschichtete Partikel durch Proben agglutiniert, die die Target-Antikörper umfassen. In diesem Format braucht keine der Komponenten markiert zu sein und das Vorliegen des Target-Antikörpers wird durch einfache visuelle Beobachtung detektiert.
VI. Assays für Modulatoren von Kv6.2
A. Assays
Kv6.2-Monomere und Kv6.2-Allele, Orthologe und polymorphe Varianten sind Untereinheiten von spannungsabhängigen Kaliumkanälen. Die Aktivität eines Kaliumkanals, der Kv6.2 umfasst, kann mit einer Vielzahl von in vitro und in vivo Assays bewertet werden, z. B. durch Messen des Stromes, durch Messen des Membranpotentials, durch Messen des Ionenflusses, wie z. B. Kalium oder Rubidium, durch Messen der Kaliumkonzentration, durch Messen der Zweitbotenstoffe und Transkriptionsniveaus unter Verwendung von kaliumabhängigen Hefewachstumsassays und unter Verwendung von, z. B., spannungssensitiven Farbstoffen, radioaktiven Markierungen und „Patchclamp" Elektrophysiologie.
Weiterhin können solche Assays verwendet werden, um auf Inhibitoren und Aktivatoren der Kanäle, die Kv6.2 umfassen, zu testen. Solche Modulatoren eines Kaliumkanals sind für die Behandlung von zahlreichen Störungen, die Kaliumkanäle involvieren, nützlich. Die Behandlung von Dysfunktionen schließt, z. B., endokrine Störungen, ZNS-Störungen wie Migränen, Hör- und Sehprobleme, psychotische Störungen, Anfälle und die Verwendung als neuroprotektive Agenzien (z. B. um einen Schlaganfall zu verhindern) ein. Solche Modulatoren sind auch nützlich zum Untersuchen der Kanalvielfalt, die durch Kv6.2 bereitgestellt wird, und der Regulation/Modulation der Kaliumkanalaktivität, die durch Kv6.2 bereitgestellt wird.
Modulatoren der Kaliumkanäle werden mit biologisch aktivem, entweder rekombinantem oder natürlich vorkommenden, Kv6.2 getestet. Kv6.2 kann isoliert, in einer Zelle coexprimiert oder in einer Membran, die aus einer Zelle abgeleitet wurde, coexprimiert werden. In solchen Assays kann Kv6.2 alleine exprimiert werden, um einen homomeren Kaliumkanal zu bilden, oder wird bevorzugt mit einer zweiten Alpha-Untereinheit (z. B. einem anderem Kv-Superfamilienmitglied, wie Kv2.1 oder Kv2.2 oder einem Kv6 Familienmitglied) coexprimiert, um einen heteromeren Kaliumkanal zu bilden. Kv6.2 kann auch mit anderen zusätzlichen Beta-Einheiten exprimert werden. Modulation wird mit einem der in vitro oder in vivo Assays, die hierin beschrieben sind, getestet. Proben oder Assays, die mit einem potentiellen Kaliumkanalinhibitor oder Aktivator behandelt werden, werden mit Kontrollproben ohne die Testverbindung verglichen, um das Ausmaß der Modulation zu untersuchen. Kontrollproben (die nicht mit Aktivatoren oder Inhibitoren behandelt werden) wird eine relative Kaliumkanalaktivität von 100 zugewiesen. Inhibierung von Kanälen, die Kv6.2 umfassen, wird erreicht, wenn der Wert der Kaliumkanalaktivität relativ zu der Kontrolle ungefähr 90%, vorzugsweise 50%, noch bevorzugter 25% ist. Aktivierung von Kanälen, die Kv6.2 umfassen, wird erreicht, wenn der Wert der Kaliumkanalaktivität relativ zu der Kontrolle ungefähr 110%, vorzugsweise 150%, noch bevorzugter 200% höher ist. Verbindungen, die den Ionenfluss erhöhen, werden durch Erhöhen der Wahrscheinlichkeit, dass ein Kanal, der ein Kv6.2 umfasst, offen ist, durch Erniedrigen der Wahrscheinlichkeit, dass er geschlossen ist, durch Erhöhen der Leitfähigkeit durch den Kanal und/oder durch Erlauben des Durchtritts von Ionen einen detektierbaren Anstieg der Ionenstromdichte verursachen.
Änderungen des Ionenflusses können durch Bestimmen der Änderungen der Polarisation (d.h. des elektrischen Potentials) der Zelle oder Membran, die den Kaliumkanal exprimiert, der Kv6.2 umfasst, bewertet werden. Ein bevorzugtes Mittel, um Änderungen der zellulären Polarisation zu bestimmen, ist durch Messen der Änderungen des Stromes (wodurch Änderung der Polarisation gemessen werden) mit Spannungs-Clamp und Patch-Clamp Techniken, z. B. dem „an der Zelle angebrachten" Modus, dem „drinnen-draußen" Modus und dem „Gesamtzell" Modus (siehe auch Ackerman et al., New Engl. J Med. 336: 1575–1595 (1997)). Gesamtzellströme werden mit Standardmethodologie bequem bestimmt (siehe z. B. Hamil et al., PFlugers. Archiv. 391: 85 (1981). Andere bekannte Assays schließen ein: Flussassys von radioaktiv markiertem Rubidium und Fluoreszenzassays mit spannungsabhängigen Farbstoffen (siehe z. B. Vestergarrd-Bogind et al., J. Membrane Biol. 88: 67–75 (1988); Daniel et al., J. Pharmacol. Meth. 25: 185–193 (1991); Holevinsky et al., J. Membrane Biology 137: 59–70 (1994)). Assays für Verbindungen, die in der Lage sind, den Kaliumfluss durch die Kanalproteine, die Kv6.2 umfassen, zu inhibieren oder zu erhöhen, können durchgeführt werden, indem die Verbindungen in einer Badlösung eingesetzt werden, die in Kontakt ist mit den Zellen und diese umfasst, die Kanal der vorliegenden Erfindung besitzen (siehe, z. B.,Blatz et al. Nature 323: 718–720 (1986); Park, J. Physiol. 481: 555–570 (1994)). Im Allgemeinen sind die Verbindungen, die getestet werden sollen in dem Bereich von 1 pM bis 100 mM.
Die Effekte der Testverbindungen auf die Funktion der Kanäle können durch Änderungen der elektrischen Ströme oder des Ionenflusses oder durch die Folgen der Änderungen der Ströme und des Flusses gemessen werden. Änderung des elektrischen Stromes oder Ionenflusses werden entweder durch Erhöhung oder Verringerung des Flusses von Ionen wie z. B. Kalium- oder Rubidiumionen gemessen. Die Kationen können auf eine Vielzahl von Standardwegen gemessen werden. Sie können direkt durch Konzentrationsänderungen der Ionen, z. B. Änderungen der intrazellulären Konzentrationen, z. B., mit jeder der oben aufgeführten Farbstoffe oder radioaktiv markierten Ionen oder indirekt durch das Membranpotential gemessen werden. Die Folgen der Testverbindung für den Ionenfluss können ziemlich variabel sein. Demzufolge kann jede geeignete physiologische Änderung verwendet werden, um den Einfluss einer Testverbindung auf die Kanäle der Erfindung zu bewerten. Die Effekte einer Testverbindung können durch einen Toxinbindungsassay gemessen werden. Wenn die funktionalen Konsequenzen mit intakten Zellen oder Tieren bestimmt werden, kann man auch eine Vielzahl von Effekten, wie Transmitterfreisetzung (z. B. Dopamin), Hormonfreisetzung (z. B. Insulin), transkriptionale Änderungen sowohl von bekannten als auch uncharakterisierten genetischen Markern (z. B. Northern-Blots), Zellvolumenänderungen (z. B. von roten Blutzellen), Immunreaktionen (z. B. T-Zellaktivierung), Änderungen des Zeltmetabolismus, wie Zellwachstum oder pH-Änderungen, Änderungen der intrazellulären Zweitbotenstoffe wie Ca²⁺ oder zyklischen Nukleotiden messen.
Vorzugsweise wird das Kv6.2, das ein Teil des Kaliumkanals ist, der in dem Assay verwendet wird, die Sequenz haben, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 17 oder einer konservativ modifizierte Variante davon dargestellt ist. Alternativ wird das Kv6.2 des Assays von einem Eukaryoten abgeleitet sein, und eine Aminosäuresubsequenz einschließen, die die wesentliche Aminosäuresequenz-Identität mit der Untereinheiten-Assoziierungsregion oder S4–S6 Region von Kv6.2 besitzt. Im Allgemeinen wird die Aminosäuresequenz-Identität mindensten 70%, vorzugsweise mindestens 75, 80, 85, 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% sein. Kv6.2-Orthologe werden im Allgemeinen im Wesentlichen einem Kanal ähnliche Eigenschaften verleihen, wie einem, der ein Kv6.2 umfasst, wie oben beschrieben wurde. Die Zelle, die in Kontakt mit einer Verbindung gebracht wurde, von der vermutet wird, dass sie ein Kv6.2 Homolog ist, kann auf das Erhöhen oder Erniedrigen des Ionenflusses in einer eukaryotischen Zelle getestet werden, z. B. eine Oozyte von Xenopus (z. B. Xenopus laevis) oder eine Säugerzelle, wie eine CHO oder HeLa Zelle. Kanäle, die durch Verbindungen auf Arten und Weisen, die denen von Kv6.2 ähnlich sind, beeinflusst werden, werden als Homologe oder Orthologe von Kv6.2 betrachtet.
B. Modulatoren
Die Verbindungen, die als Modulatoren der Kv6.2 Kanäle getestet werden, die eine Kv6.2-Untereinheit umfassen, können jedes kleine organische Molekül oder eine biologische Einheit sein, wie ein Protein, Zucker, Nukleinsäure oder Lipid. Alternativ können Modulatoren genetisch veränderte Versionen einer humanen Kv6.2-Untereinheit sein. Typischerweise werden Testverbindungen kleine chemische Moleküle und Peptide sein. Praktisch jede chemische Verbindung kann als ein potentieller Modulator oder Ligand in den Assays der Erfindung verwendet werden, obwohl meistens Verbindungen, die in wässrigen oder organischen (insbesondere DMSO basierten) Lösungen gelöst werden können, verwendet werden. Die Assays sind designt, um große chemische Bibliotheken durch Automatisieren der Assayschritte und Bereitstellen von Verbindungen aus jeder zugänglichen Quelle für Assays zu screenen, die typischerweise parallel durchgeführt werden (z. B. in Microtiterformaten auf Microtiterplatten in robotischen Assays). Es wird gewürdigt werden, dass es viele Lieferanten für chemische Verbindungen gibt, einschließlich Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemika Analytika (Buchs Schweiz) und ähnliche.
Hochdurchsatz-Screeningverfahren involvieren das Bereitstellen einer kombinatorischen chemischen oder Peptid-Bibliothek, die eine große Anzahl von potentiellen therapeutischen Verbindungen (potentielle Modulator- oder Ligandenverbindungen) enthält. Solche „kombinatorischen chemischen Bibliotheken" oder „Ligandenbibliotheken" werden dann in einem oder mehr Assays, wie hier beschrieben, gescreent, um die Bibliotheksmitglieder zu identifizieren (bestimmte chemische Spezies oder Subklassen), die eine gewünschte charakteristische Aktivität aufweisen. Die somit identifizierten Verbindungen können als konventionelle „Leitverbindungen" dienen oder können selbst als potentielle oder tatsächliche Therapeutika verwendet werden.
Eine kombinatorische chemische Bibliothek ist eine Sammlung von diversen chemischen Verbindungen, die entweder durch chemische Synthese oder biologische Synthese durch Kombinieren einer Anzahl von chemischen „Baublöcken", wie Reagenzien, erzeugt wurden. Zum Beispiel wird eine lineare kombinatorische chemische Bibliothek, wie eine Polypeptidbibliothek, durch Kombinieren eines Satzes von chemischen Baublöcken (Aminosäuren) auf jede mögliche Weise für eine bestimmte Verbindungslänge gebildet (d. h. die Anzahl von Aminosäuren in einer Polypeptidverbindung). Millionen von chemischen Verbindungen können durch solches kombinatorisches Mischen von chemischen Baublöcken synthetisiert werden.
Präparation und Screenen von kombinatorischen chemischen Bibliotheken wird von den Fachleuten gut verstanden. Solche kombinatorischen chemischen Bibliotheken schließen ein, sind aber nicht eingegrenzt auf Peptidbibliotheken (siehe, z. B., U. S. Patent 5,010,175 , Furka, Int. J. Pept. Prot.
Res. 37: 487–493 (1991) und Houghton et al., Nature 354: 84–88 (1991)). Andere Chemieen zum Erzeugen von chemischen Diversitätsbibliotheken können auch verwendet werden. Solche Chemieen schließen ein, sind aber nicht eingegrenzt auf: Peptoide (z. B., PCT Veröffentlichungsnr. WO 91/19735 ), kodierte Peptide (z. B., PCT Veröffentlichungsnr. WO 93/20242 ), zufällige Bio-Oligomere (z. B., PCT Veröffentlichungsnr. WO 92/00091 ), Benzodiazepine (z. B., U. S. Pat. Nr. 5,288,514 ), Diversomere wie Hydantoine, Benzodiazepine und Dipeptide (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909–6913 (1993)), Vinyloge Polypeptide (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), nicht peptidale Peptidomimetica mit Glucosegerüst (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217–9218 (1992)), analoge organische Synthese von kleinen Verbindungsbibliotheken (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), Oligocarbamate (Cho et al., Science 261: 1303 (1993)), und/oder Peptidylphosphonate (Campbell et al., J. Org. Chem. 59: 658 (1994)), Nukleinsäurebibliotheken (siehe Ausubel, Berger und Sambrook, alle oben), Peptidnukleinsäure-Bibliotheken (siehe z. B., U. S. Patent 5,539,083 ), Antikörper-Bibliotheken (siehe z. B., Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14 (3): 309–314 (1996) und PCT/US96/10287 ), Kohlenhydrat-Bibliotheken (siehe z. B., Lang et al., Science, 274: 1520–1522 (1996) und U.S. Patent 5,593,853 ), kleine organische Molekülbibliotheken (siehe z. B., Benzodiazepine, Baum C & EN, Jan 18, Seite 33 (1993); Isoprenoide, U.S. Patent 5,569,588 ; Thiazolidinone und Metathiazanone, U. S. Patent 5,549,974 ; Pyrrolidine, U. S. Patente 5,525,735 und 5,519,134 ; Morpholino-Verbindungen, U. S. Patent 5,506,337 ; Benzodiazepine, 5,288,514 , und ähnliche).
Geräte für die Präparation von kombinatorischen Bibliotheken sind kommerziell verfügbar (siehe z. B., 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Zusätzlich sind zahlreiche kombinatorische Bibliotheken selbst kommerziell verfügbar (siehe z. B., ComGenex, Princeton, N. J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).
Hierin beschrieben sind auf Festphasen basierende in vitro Assays in einem Hochdurchsatz-Format, in dem die Zelle oder das Gewebe, das einen Kv6.2 Kanal exprimiert, der eine humane Kv6.2-Untereinheit umfasst, an einem Festphasensubstrat angebracht ist. In den Hochdurchsatz-Assays der Erfindung ist es möglich, zahlreiche tausend verschiedene Modulatoren oder Liganden in einem einzelnen Tag zu screenen. Insbesondere kann jede Nocke einer Mikrotiterplatte verwendet werden, um einen separaten Assay gegen einen ausgewählten potentiellen Modulator laufen zu lassen, oder, falls Konzentrations- oder Inkubationszeiteffekte beobachtet werden sollen, könne alle 5–10 Nocken einen einzelnen Modulator testen. Somit kann eine einzelne Standard-Mikrotiterplatte ungefähr 96 Modulatoren testen. Wenn 1536 Nockenplatten verwendet werden, dann kann eine einzelne Platte leicht ungefähr 100- ungefähr 1500 verschiedene Verbindungen testen. Es ist möglich viele Platten pro Tag zu testen; Assayscreens für bis zu ungefähr 6,000–20,000 verschiedene Verbindungen sind mit den integrierten Systemen der Erfindung möglich.
VII. Computer unterstütztes Wirkstoffdesign mit Kv6.2
Ein weiterer Assay für Verbindungen, die die Aktivitäten von Kv6.2 modulieren, involviert das durch Computer unterstützte Wirkstoffdesign, bei dem ein Computersystem verwendet wird, um eine dreidimensionale Struktur von Kv6.2 zu erzeugen, das auf der strukturellen Information, die durch die Aminosäuresequenz kodiert wird, basiert. Die eingegebene Aminosäuresequenz interagiert direkt und aktiv mit einem vorgelegten Algorithmus in einem Computerprogramm, um sekundäre, tertiäre und quatäre Strukturmodelle des Proteins zu ergeben. Die Modelle der Proteinstruktur werden dann untersucht, um Strukturregionen zu identifizieren, die die Fähigkeit besitzen beispielsweise Liganden oder andere Kaliumkanaluntereinheiten zu binden. Diese Regionen werden dann verwendet, um Liganden zu identifizieren, die an das Protein oder der Region binden, an der Kv6.2 mit anderen Kaliumkanalunterheiten interagiert.
Das dreidimensionale Strukturmodell des Proteins wird durch Eingabe von Kanalprotein-Aminosäuresequenzen von wenigstens 25, 50, 75 oder 100 Aminosäureresten oder entsprechenden Nukleinsäuresequenzen in das Computersystem erzeugt, die für ein Kv6.2 Monomer kodieren. Die Aminosäuresequenz jedes der Monomere wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 17, und konservativ modifizierten Versionen davon, ausgewählt. Die Aminosäuresequenz stellt die Primärsequenz oder Subsequenz jedes der Proteine dar, die die strukturelle Information des Proteins kodieren. Wenigstens 25, 50, 75, oder 100 Reste der Aminosäuresequenz (oder einer Nukleotidsequenz, die wenigstens ungefähr 25, 50, 75 oder 100 Aminosäuren kodiert) werden in das Computersystem von Computertastaturen, Computer lesbaren Substraten, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf, elektronische Speichermedien (z. B. magnetische Disketten, Bänder, Gerätschaften und Chips), optische Medien (z. B. CD ROM), Information, die über Internetseiten verteilt wird, und durch RAM eingegeben. Das dreidimensionale strukturelle Modell des Kanalproteins wird dann durch Interaktion der Aminosäuresequenz und des Computersystems mit Software, die den Fachleuten bekannt ist, erzeugt. Das resultierende dreidimensionale Computermodell kann dann auf einem Computer lesbaren Substrat aufbewahrt werden.
Die Aminosäuresequenz stellt eine Primärstruktur dar, die die Information kodiert, die notwendig ist, um die sekundäre, tertiäre und quatäre Struktur des Monomers zu bilden und das heteromere Kaliumkanalprotein, das vier Monomere umfasst. Die Software betrachtet bestimmte Parameter, die durch die Primärsequenz kodiert werden, um das Strukturmodell zu erzeugen. Diese Parameter werden als „Energiebedingungen" oder anisotropische Bedingungen bezeichnet und beinhalten primäre elektrostatische Potentiale, hydrophobe Potentiale, flüssigkeitszugängliche Oberflächen und Wasserstoffbrückenbindungen. Sekundäre Energiebedingungen beinhalten van der Waals Potentiale. Biologische Moleküle bilden die Strukturen, die die Energiebedingungen in einer kumulativen Weise minimieren. Das Computerprogramm verwendet daher diese Bedingungen, die durch die Primärstruktur oder Aminosäuresequenz kodiert werden, um das Sekundärstrukturmodell zu erzeugen.
Die Tertiärstruktur des Proteins, die durch die Sekundärstruktur kodiert wird, wird dann auf der Basis der Energiebedingungen der Sekundärstruktur gebildet. Der Verwender kann an diesem Punkt zusätzliche Variablen, wie ob das Protein membrangebunden oder löslich ist, seine Lokalisierung in dem Körper und seine zelluläre Lokalisierung, z. B. zytoplasmatisch, an der Oberfläche oder nuklear, eingeben. Diese Variablen zusammen mit den Energiebedingungen der Sekundärstruktur werden verwendet, um das Modell der Tertiärstruktur zu bilden. Beim Modellieren der Tertiärstruktur fügt das Computerprogramm einander entsprechende hydrophobe Oberflächen der Sekundärstruktur, und einander entsprechende hydrophile Oberflächen der Sekundärstruktur zusammen.
Sobald die Struktur erzeugt wurde, werden potentielle Ligandenbindungsregionen durch das Computersystem identifiziert. Dreidimensionale Strukturen für potentielle Liganden werden durch Eingabe der Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen oder chemischer Formeln von Verbindungen, wie oben beschrieben, erzeugt. Die dreidimensionale Struktur des potentiellen Liganden wird dann mit dem des Kv6.2 Proteins verglichen, um Liganden zu identifizieren, die an Kv6.2 binden. Bindungsaffinität zwischen dem Protein und den Liganden wird mit Energiebedingungen bestimmt, um zu bestimmen, welche Liganden eine erhöhte Wahrscheinlichkeit besitzen, an das Protein zu binden.
Computersysteme werden auch verwendet, um nach Mutationen, polymorphen Varianten, Allelen und Interspezies-Homologen von Kv6.2 Genen zu screenen. Solchen Mutationen können mit Krankheitszuständen assoziiert sein. Sobald die Varianten identifiziert wurden, können diagnostische Assays verwendet werden, um Patienten mit solchen mutierten Genen, die mit Krankheitszuständen assoziiert sind, zu identifizieren. Identifikation der mutierten Kv6.2 Gene involviert das Erhalten einer Eingabe einer ersten Nukleinsäure, z. B. SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 18, oder einer Aminosäuresequenz, die für Kv6.2 kodiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 17, und konservativ modifizierten Versionen davon. Die Sequenz wird in das Computersystem, wie oben beschrieben, eingegeben. Die erste Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz wird mit einer zweiten Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz verglichen, die wesentliche Identität mit der ersten Sequenz besitzt. Die zweite Sequenz wird in das Computersystem in der oben beschriebenen Weise eingegeben. Sobald die ersten und zweiten Sequenzen verglichen sind, werden Nukleotid- oder Aminosäuredifferenzen zwischen den Sequenzen identifiziert. Solche Sequenzen können allelische Unterschiede der Kv6.2 Gene darstellen, und Mutationen, die mit Krankheitszuständen assoziiert sind. Die oben beschriebenen ersten und zweiten Sequenzen können auf einem Computer lesbaren Substrat gespeichert werden. Kv6.2 Monomere und die Kaliumkanäle, die diese Kv6.2-Monomere enthalten, können mit der hoch dichten Oligonnukleotid-Arraytechnologie verwendet werden (z. B. GeneChip^TM), um Homologe und polymorphe Varianten von Kv6.2 zu identifizieren. In dem Fall, in dem die identifizierten Homologe mit einer bekannten Krankheit in Verbindung stehen, können sie mit GeneChip^TM als einem diagnostischen Werkzeug zur Detektion der Krankheit in einer biologischen Probe verwendet werden, siehe z. B. Gunthand et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 869–876 (1998); Kozal et al., Nat. Med. 2: 753–759 (1996); Matson et al., Anal. Biochem. 224: 110106 (1995); Lockhart et al., Nat. Biotechnol. 14: 1675–1680 (1996); Gingeras et al., Genome Res. 8: 435–448 (1998); Hacia et al., Nucleic Acids Res. 26: 3865–3866 (1998).
VIII. Zelluläre Transfektions- und Gentherapie
Die vorliegende Erfindung stellt die Nukleinsäuren von Kv6.2, die für die Transfektion von Zellen in vitro und in vivo geeignet sind, bereit. Diese Nukleinsäuren können in jede einer Anzahl von gut bekannten Vektoren für die Transfektion von Target-Zellen und Organismen, wie oben beschrieben, eingefügt werden. Die Nukleinsäuren werden, ex vivo und in vivo, über die Interaktion des Vektors und der Target-Zelle in Zellen transfiziert. Die Nukleinsäure für Kv6.2 exprimiert dann unter der Kontrolle eines Promotors einen Kv6.2 Monomer der vorliegenden Erfindung, wodurch die Effekte von nicht vorhandener, partieller Inaktivierung oder abnormaler Expression des Kv6.2 Gens abgeschwächt werden.
Solche Gentherapieprozeduren wurden verwendet, um erworbene und vererbte genetische Defekte, Krebs und virale Infektion in einer Anzahl von Kontexten zu korrigieren. Die Fähigkeit künstliche Gene in Menschen zu exprimieren , erleichtert die Prävention und/oder Heilung von vielen wichtigen menschlichen Krankheiten, einschließlich vieler Krankheiten, die nicht durch andere Therapien behandelbar sind (für eine Übersicht über die Gentherapieprozeduren, siehe Anderson, Science 256: 808–813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211–217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162–166 (1993); Mulligan, Science 926–932 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167–175 (1993); Miller, Nature 357: 455–460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1149–1154 (1998); Vigne, Restorative Neurology and NeuroScience 8: 35–36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1): 31–44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology (Doerfler & Böhm Hrg., 1995); und Yu et al., Gene Therapy 1: 13–26 (1994)).
Lieferung des Gens oder des genetischen Materials in die Zelle ist der erste kritische Schritt bei der Gentherapiebehandlung von Krankheit. Eine große Anzahl von Lieferungsverfahren sind den Fachleuten gut bekannt. Vorzugsweise werden die Nukleinsäuren für in vivo oder in vitro Gentherapieverwendungen verabreicht. Nicht virale Vektor Lieferungssysteme schließen DNA Plasmide, nackte Nukleinsäure und Nukleinsäure, die mit einem Liefervehikel wie einem Liposom komplexiert ist, ein. Liefersysteme mit viralem Vektor schließen DNA und RNA Viren ein, die entweder episomale oder integrierte Genome nach Lieferung an die Zelle besitzen. Verfahren zur nicht viralen Lieferung der Nukleinsäuren schließen Lipofection, Microinjektion, Biolistics, Virosomen, Liposomen, Immunoliposomen, Polykation oder Lipid:Nukleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche Virionen und durch Agens verstärkte Aufnahme von DNA ein. Lipofection wird beschrieben in z. B. US Pat. Nr. 5,049,386 , US Pat. Nr. 4,946,787 ; und US Pat. Nr. 4,897,355 und Lipofectionsreagenzien werden kommerziell vertrieben (z. B. Transfectam^TM und Lipofectin^TM). Kationische und neutrale Lipide, die für effiziente Rezeptorerkennungs-Lipofection von Polynukleotiden geeignet sind, schließen diejenigen von Feigner ein, WO 91/17424 , WO 91/16024 . Lieferung kann an Zellen (ex vivo Verabreichung) oder Target-Gewebe sein (in vivo Verabreichung).
Die Präperation von Lipid:Nukleinsäurekomplexen, einschließlich von getargeten Liposomen, wie Immunolipidkomplexen, ist dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Crystal, Science 270: 404–410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291–297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382–389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647–654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817–4820 (1992); U.S. Pat. Nr. 4,186,183 , 4,217,344 , 4,235,871 , 4,261,975 , 4,485,054 , 4,501,728 , 4,774,085 , 4,837,028 und 4,946,787 ).
Die Verwendung von RNA oder DNA viral basierten Systemen für die Lieferung von Nukleinsäuren profitieren von den hoch evolvierten Prozessen des Targeting eines Virus zu spezifischen Zellen in dem Körper und das Wandern der viralen Ladung zu dem Nukleus. Virale Vektoren können direkt an Patienten (in vivo) verabreicht werden oder sie können verwendet werden, um Zellen in vitro zu behandeln und die modifizierten Zellen werden an Patienten verabreicht (ex vivo). Konventionelle auf Virus basierte Systeme für die Lieferung von Nukleinsäuren können Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, Adeno-assoziierte und Herpes simplex Virusvektoren für den Gentransfer einschließen. Virale Vektoren sind gegenwärtig die effizientesten und vielseitigsten Verfahren für Gentransfer in Target-Zellen und Geweben. Integration in das Wirtsgenom ist mit den Retrovirus-, Lentivirus- und Adeno-assoziierten Virusgentransferverfahren möglich, was oft in lang andauernder Expression des eingefügten Transgens resultiert. Zusätzlich wurden hohe Transduktionseffizienzen in vielen verschiedenen Zelltypen und Zielgeweben beobachtet.
Der Tropismus eines Retrovirus kann durch Einbauen von fremden Hüllproteinen geändert werden, was die potentielle Target-Population der Target-Zellen erweitert. Lentivirus Vektoren sind retrovirale Vektoren, die in der Lage sind, nicht teilende Zellen zu transduzieren oder infizieren und produzieren typischerweise hohe virale Titer. Die Auswahl eines retroviralen Gentransfersystems würde daher von dem Target-Gewebe abhängen. Retrovirale Vektoren sind aus cis-wirkenden langen terminalen Wiederholsequenzen (LTRs) mit einer Packungskapazität für bis zu 6–10 kb der fremden Sequenz zusammengesetzt. Die Minimum cis-wirkenden LTRs sind ausreichend für die Replikation und das Verpacken der Vektoren, die dann verwendet werden, um das therapeutische Gen in die Target-Zelle zu integrieren, um permanente Transgenexpression bereitzustellen. Häufig verwendete retrovirale Vektoren schließen diejenigen ein, die auf Murine Leukemia Virus (MuLV), Gibbon Ape Leukemia Virus (GaLV), Simian Immunodeficiency Virus (SIV), Humanem Immundefizenz Virus (HIV), und Kombinationen davon basieren (siehe z. B. Buchscher et al., J Virol. 66: 2731–2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66: 1635–1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176: 58–59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2374–2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65: 2220–2224 (1991); PCT/US94/05700 ).
In Anwendungen, in denen transiente Expression der Nukleinsäure bevorzugt ist, werden auf Adenovirus-basierenden Vektoren typischerweise verwendet. Auf Adenovirus basierende Vektoren sind zu sehr hoher Transduktionseffizienz in vielen Zelltypen in der Lage und benötigen keine Zellteilung. Mit solchen Vektoren wurden hohe Titer und Expressionslevels erreicht. Dieser Vektor kann in großen Mengen in einem relativ einfachen System produziert werden. Adeno-assoziierte Virusvektoren („AAV") werden auch verwendet um Zellen mit Target-Nukleinsäuren zu transduzieren, z. B. bei der in vitro Produktion von Nukleinsäuren und Peptiden, und für in vivo und ex vivo Gentherapieprozeduren (siehe z. B. West et al., Virology 160: 38–47 (1987); U. S. Patent Nr. 4,797,368 ; WO 93/24641 ; Kotin, Human Gene Therapy 5: 793–801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994)). Die Konstruktion von rekombinanten AAV Vektoren wurde in einer Anzahl von Publikationen beschrieben, einschließlich U.S. Pat. No. 5,173,414 ; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251–3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072–2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6466–6470 (1984); und Samulski et al., J. Virol. 63: 03822–3828 (1989). Insbesondere sind gegenwärtig wenigstens sechs virale Vektoransätze für den Gentranfer in klinischen Studien verfügbar, wobei retrovirale Vektoren bei weitestem das am häufigsten verwendete System sind. Alle diese viralen Vektoren nutzen Ansätze, die die Komplementierung von defekten Vektoren durch Gene, die in Helferzelllinien inseriert sind, involvieren, um das Transduktionsagens zu erzeugen.
pLASN und MFG-S sind Beispiele retroviraler Vektoren, die in klinischen Studien verwendet wurden (Dunbar et al., Blood 85: 3048–305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1: 1017–102 (1995); Malech et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 22 12133–12138 (1997)). PA317/pLASN war der erste therapeutische Vektor, der in einer Gentherapie-Studie verwendet wurde (Blaese et al., Science 270: 475–480 (1995)). Transduktionseffizienzen von 50% oder mehr wurden für MFG-S gepackte Vektoren beobachtet (Ellem et al., Immunol Immunotlaer. 44(1): 10–20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1: 111–2 (1997)).
Rekombinante adeno-assoziierte Virusvektoren (rAAV) sind vielversprechende alternative Genverabreichungssysteme, die auf dem defekten und nicht-patogenen Parvovirus adenoassoziierten Typ 2 Virus aufbauen. Alle Vektoren sind von einem Plasmid abgeleitet, das lediglich die AAV 145 bp invertierten terminalen Repeats behält, die die transgene Expressionskassette flankieren. Effizienter Gentransfer und stabile transgene Verabreichung sind wegen der Integration in die Genome der transduzierten Zelle Schlüsseleigenschaften für dieses Vektorsystem (Wagner et al., Lancet 351: 9117 1702–3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9: 748–55 (1996)).
Replikationsdefiziente, rekombinante adenovirale Vektoren (Ad) werden vorherrschend bei der Gentherapie mit transienter Expression verwendet, weil sie bei höherem Titer produziert werden können und sie einfach eine Zahl von verschiedenen Zelltypen infizieren. Die meisten Adenovirusvektoren werden so hergestellt, dass ein Transgen die Ad E1a, E1b und E3 Gene ersetzt; anschließend wird der replikationsdefiziente Vektor in humanen 293 Zellen propagiert, die die deletierte Genfunktion in trans zur Verfügung stellen. Ad Vektoren können verschiedene Gewebetypen in vivo transduzieren, einschließlich nichtteilender, differenzierter Zellen, wie diese, die in der Leber, der Niere und dem Gewebe des Muskelsystems gefunden werden. Konventionelle Ad Vektoren haben große Tragekapazitäten. Ein Beispiel für die Verwendung eines Ad Vektors in einer klinischen Studie, involvierte die Polynukleotidtherapie für Antitumorimmunisierung mit intramuskulärer Injektion (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083–9 (1998)). Weitere Beispiele für die Verwendung von Adenovirusvektoren zum Gentransfer in klinischen Studien schließen ein Rosenecker et al., Infection 241: 5–10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9: 7 1083–1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2: 205–18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5: 597–613 (1997); Topf et al., Gene Sher. 5: 507–513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083–1089 (1998).
Verpackungszellen werden verwendet, um Viruspartikel zu bilden, die in der Lage sind, eine Wirtszelle zu infizieren. Solche Zellen schließen 293 Zellen ein, die Adenvirus verpacken, und 4,2 Zellen oder PA317 Zellen ein, die Retrovirus verpacken. Virale Vektoren, die in der Gentherapie verwendet werden, werden gewöhnlich durch Produktionszelllinien erzeugt, die einen Nukleinsäurevektor in ein virales Partikel verpacken. Die Vektoren enthalten typischerweise die minimalen viralen Sequenzen, die für das Verpacken und die nachfolgende Integration in einen Wirt benötigt werden, während andere virale Sequenzen durch eine Expressionskassette für das zu exprimierende Protein ersetzt werden. Die fehlenden viralen Funktionen werden in trans durch die Verpackungszelllinie bereitgestellt. Zum Beispiel besitzen AAV Vektoren typischerweise, die in der Gentherapie verwendet werden, nur ITR Sequenzen aus dem AAV Genom, die für das Verpacken und die Integration in ein Wirtsgenom benötigt werden. Virale DNA wird in eine Zelllinie gepackt, die eine Helferplasmid enthält, die für die anderen AAV Gene kodiert, nämlich rep und cap, aber der die ITR Sequenzen fehlen. Die Zelllinie wird auch mit Adenovirus als einem Helfer infiziert. Der Helfervirus fördert die Replikation des AAV Vektors und Expression der AAV Gene von dem Helferplasmid. Das Helferplasmid wird wegen des Fehlens der ITR Sequenzen nicht in signifikanten Mengen verpackt. Die Kontamination mit Adenovirus kann durch, z. B. Hitzebehandlung, reduziert werden, gegen die Adenovirus empfindlicher ist als AAV.
Bei vielen Gentherapieanwendungen ist es wünschenswert, dass der Gentherapievektor mit einem hohen Grad an Spezifität an einen bestimmten Zelltyp geliefert wird. Ein Virusvektor wird typischerweise so modifiziert, dass er eine Spezifität für einen bestimmten Zelltyp durch Expression eines Liganden als ein Fusionsprotein mit einem viralen „Coat"-Protein auf den Viren der äußeren Oberfläche besitzt. Der Ligand wird so gewählt, dass er eine Affinität für einen Rezeptor besitzt, von dem man weiß, dass er auf dem interessierenden Zelltyp vorliegt. Zum Beispiel, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9747–9751 (1995), berichteten, dass "Moloney murine leukaemia virus" modifiziert werden kann, humanes Heregulin zu exprimieren, das mit gp70 fusioniert ist, und der rekombinante Virus infiziert bestimmte humane Brustkrebszellen, die „human epidermal growth factor receptor" exprimieren . Dieses Prinzip kann auf andere Paare von Virus, das ein Ligandenfusionsprotein exprimiert, und Targetzelle, die einen Rezeptor exprimiert, ausgedehnt werden. Zum Beispiel können filamentöse Phagen konstruiert werden, Antikörperfragmente (z. B. FAB oder Fv) mit spezifischer Bindungsaffinität für praktisch jeden gewählten zellulären Rezeptor darzubieten.
Obwohl die obige Beschreibung primär auf virale Vektoren zutrifft, können die gleichen Prinzipien auch auf nicht virale Vektoren angewendet werden. Solche Vektoren können so konstruiert werden, dass sie spezifische Aufnahmesequenzen enthalten, von denen man annimmt, dass sie die Aufnahme durch spezifische Target-Zellen befördern.
Gentherapievektoren können in vivo durch Verabreichung an einen individuellen Patienten verabreicht werden, typischerweise durch systemische Verabreichung (z. B. intravenöse, intraperitoneal, intramuskuläre, subdermale oder intracraniale Infusion) oder topische Applikation, wie unten beschrieben wird. Alternativ können Vektoren an Zellen ex vivo geliefert werden, wie Zellen, die aus einem individuelle Patienten explantiert wurden (z. B. Lymphozyten, Knochenmarkaspirate, Gewebebiopsie) oder einen Universaldonor hämatopoetischer Stammzellen, gefolgt von Reimplantation der Zellen in einen Patienten, gewöhnlich nach Selektion auf Zellen, die den Vektor inkorporiert haben.
Ex vivo Zelltransfektion für Diagnose, Forschung oder für Gentherapie (z. B. über Reinfusion der transfizierten Zellen in den Wirtsorganismus) ist den Fachleuten gut bekannt. Zellen können aus dem Subjekts-Organismus isoliert, mit einer Nukleinsäure (Gen oder cDNA) transfiziert, und in den Subjekts-Organismus zurück infundiert werden (z. B. einem Patienten). Zahlreiche Zelltypen, die für die ex vivo Transfektion geeignet sind, sind den Fachleuten gut bekannt (siehe z. B. Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3te A. 1994)) und die darin zitierten Fundstellen für eine Diskussion über das Wie des Isolierens und Kultivierens von Zellen aus Patienten).
Stammzellen können in ex vivo Prozeduren für die Zelltransfektion und Gentherapie verwendet werden. Der Vorteil der Verwendung von Stammzellen ist, dass sie in vitro in andere Zelltypen differenziert werden können, oder in einen Säuger (wie dem Donor der Zellen) eingeführt werden können, in dem sie in dem Knochenmark siedeln werden. Verfahren zum Differenzieren von CD34+ Zellen in vitro in klinisch wichtigen Immunzelltypen unter Verwendung von Cytokinen wie GM-CSF, IFN-γ und TNF-α sind bekannt (siehe Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693–1702 (1992)).
Stammzellen werden für die Transduktion und Differenzierung mit bekannten Verfahren isoliert. Zum Beispiel, werden Stammzellen aus Knochenmarkszellen durch Schwenken der Knochenmarkszellen mit Antikörpern, die ungewollte Zellen, wie CD4+ und CD8+ (T-Zellen), CD45+ (panB Zellen), GR-1 (Granulozyten), und lad (differenzierte Antigen präsentierende Zellen), binden, isoliert (Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693–1702 (1992)).
Vektoren (z. B. Retroviren, Adenoviren, Liposomen etc.), die therapeutische Nukleinsäuren enthalten, können auch direkt an den Organismus zur Transduktion der Zellen in vivo verabreicht werden. Alternativ kann nackte DNA verabreicht werden. Verabreichung erfolgt über jede der Routen, die normalerweise für das letztliche in Kontakt bringen eines Moleküls mit Blut oder Gewebezellen verwendet werden. Geeignete Verfahren zum Verabreichen solcher Nukleinsäuren sind verfügbar und den Fachleuten wohl bekannt und, obwohl mehr als eine Route verwendet werden kann, um eine bestimmte Zusammensetzung zu verabreichen, kann eine bestimmte Route oft eine unmittelbarere und effektivere Reaktion als eine andere Route bewirken.
Verabreichung erfolgt über jede der Routen, die normalerweise für das letztliche in Kontakt bringen eines Moleküls mit Blut oder Gewebezellen verwendet werden. Die Nukleinsäuren werden auf jede geeignete Weise verabreicht, vorzugsweise mit pharmazeutisch verträglichen Trägern. Geeignete Verfahren zum Verabreichen solcher Nukleinsäuren sind verfügbar und den Fachleuten wohl bekannt, und, obwohl mehr als eine Route verwendet werden kann, um eine bestimmte Zusammensetzung zu verabreichen, kann eine bestimmte Route oft eine unmittelbarere und effektivere Reaktion als eine andere Route bewirken.
IX. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Pharmazeutisch verträgliche Träger werden zum Teil durch die jeweilige Zusammensetzung, die verabreicht wird, bestimmt (z. B. Nukleinsäure, Protein, modulatorische Verbindungen oder transduzierte Zelle), wie auch durch das spezielle Verfahren, das verwendet wird, um die Zusammensetzung zu verabreichen. Entsprechend gibt es eine breite Vielzahl von geeigneten Formulierungen von pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17te A., 1989).
Formulierungen, die für orale Verabreichung geeignet sind, können bestehen aus (a) flüssigen Lösungen, wie einer effizienten Menge der verpackten Nukleinsäure, die in Verdünnungsmitteln suspendiert ist, wie Wasser, Kochsalzlösung oder PEG 400; (b) Kapseln, Päckchen oder Tabletten, jede eine vorbestimmte Menge des aktiven Inhaltsstoffes enthaltend, wie Flüssigkeiten, Feststoffen, Granulat oder Gelatine; (c) Suspensionen in einer geeigneten Flüssigkeit, und (d) geeignete Emulsionen. Tablettenformen können eine oder mehrere von Lactose, Saccharose, Mannitol, Sorbitol, Kalziumphosphate, Maisstärke, Kartoffelstärke, mikrokristalline Zellulose, Gelatine, kolloidales Siliziumdioxid, Talk, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Auszüge, Farbstoffe, Füllstoffe, Binder, Verdünnungsmittel, Pufferagenzien, Befeuchtungsagenzien, Konservierungsstoffe, Geschmacksstoffe, Farbstoffe, Zersetzungsagenzien und pharmazeutische verträgliche Träger enthalten. Rautenformen können den aktiven Inhaltsstoff in einem Geschmacksstoff, z. B. Saccharose umfassen, wie auch Pastillen den aktiven Inhaltsstoff in einer inerten Base, wie Gelatine und Glyzerin oder Saccharose und Akazienemulsionen, Gelen und ähnliche umfassen, die zusätzlich zu dem aktiven Inhaltsstoff in der Technik bekannte Träger enthalten.
Die Verbindung der Wahl kann alleine oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten als Aerosol-Formulierungen hergestellt werden (d. h. sie können „vernebelt" werden), um über Inhalation verabreicht zu werden. Aerosol-Formulierungen können mit akzeptablen Treibmitteln verdichtet werden, wie Dichlorodifluoromethan, Propan, Stickstoff und ähnlichen.
Geeignete Formulierungen für die rektale Verabreichung schließen, z. B. Zäpfchen, die aus der verpackten Nukleinsäure mit einer Zäpfchenbasis bestehen, ein. Geeignete Zäpfchenbasen schließen natürliche oder synthetische Triglyceride oder Paraffinkohlenwasserstoffe ein. Zusätzlich ist es auch möglich, rektale Gelatinekapseln zu verwenden, die aus einer Kombination der gewählten Verbindung mit einer Basis besteht, die zum Beispiel flüssige Triglyceride, Polyethylenglycole und Paraffinkohlenwasserstoffe einschließt.
Formulierungen, die für parenterale Verabreichung, wie zum Beispiel durch intraartikuläre (in die Gelenke), intravenöse, intramuskuläre, intradermale, intraperitonale und subkutane Routen geeignet sind, beinhalten wässrige und nicht wässrige, isotonische sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Rezipienten isotonisch machen, und wässrige und nicht wässrige sterile Suspensionen, die Suspendierungsmittel, Lösungsmittel, Verdickungsmittel, Stabilisierungsmittel und Konservierungsmittel beinhalten können. Zusammensetzungen können verabreicht werden zum Beispiel durch intravenöse Infusion, oral, topisch, intraperitoneal, intravesical oder intrathecal. Parenterale Verabreichung und intravenöse Verabreichung sind die bevorzugten Verfahren der Verabreichung. Die empfohlenen Formulierungen können als versiegelte Eindosis- oder Mehrdosis-Behälter, wie Ampullen oder Röhrchen präsentiert werden.
Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pudern, Granulat und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden. Durch Nukleinsäure für ex vivo Therapie transduzierte Zellen können auch intravenös oder parenteral verabreicht werden, wie zuvor beschrieben.
Die an einen Patienten verabreichte Dosis sollte ausreichend sein, um eine vorteilhafte therapeutische Reaktion in dem Patienten mit der Zeit zu bewirken. Die Dosis wird durch die Effizienz des jeweiligen eingesetzten Vektors und den Zustand des Patienten bestimmt werden, wie auch durch das Körpergewicht oder die Oberflächenregion des zu behandelnden Patienten. Die Größe der Dosis wird auch das Vorhandensein, die Natur und das Ausmaß jeglicher nachteiliger Nebenwirkungen bestimmen, die mit der Verabreichung eines bestimmten Vektors oder transduzierten Zelltyps in einem bestimmten Patienten einhergehen. Bei der Bestimmung der wirksamen Menge des Vektors, der bei der Behandlung oder Prophylaxe von Zuständen verabreicht werden wird, die auf die verringerte oder falsche Expression der Kv6.2 Kanäle zurückzuführen wird, die eine humane Kv6.2 Alpha-Untereinheit umfassen, bewertet der Arzt die zirkulierenden Plasmamengen des Vektors, Vektortoxizitäten, Fortschritt der Krankheit und die Produktion von Anti-Vektor Antikörpern. Im Allgemeinen ist das Dosisäquivalent einer nackten Nukleinsäure eines Vektors ungefähr 1 μg bis 100 μg für einen typischen 70 Kilogramm Patienten, und die Dosen von Vektoren, die einen Retrovirus-Partikel enthalten, werden berechnet eine äquivalente Menge von therapeutischer Nukleinsäure zu ergeben.
Für die Verabreichung können Verbindungen und transduzierte Zellen bei einer Rate verabreicht werden, die bei dem LD-50 des Inhibitors, Vektors, oder transduzierten Zelltyps und der Nebenwirkungen des Inhibitors, Vektors, oder Zelltyps bei verschiedenen Konzentrationen, wie sie auf die Masse und dem Gesamtgesundheitszustand des Patienten angewendet werden, bestimmt wurde. Verabreichung kann über einzelne oder aufgeteilte Dosen erreicht werden.
Transduzierte Zellen zur Reiinfusion werden gemäß etablierten Verfahren hergestellt (siehe, z. B., Abrahamsen et al., J. Clin. Apheresis 6: 48–53 (1991); Carter et al., J. Clin. Apheresis 4: 113–117 (1998); Aebersold et al., J. Immunol. Meth. 112: 1–7 (1998); Muul et al., J. Immunol. Methods 101: 171–181 (1987); und Carter et al., Transfusion 27: 362–365 (1987)).)
X. Kits
Humanes Kv6.2 und seine Homologe sind nützliche Werkzeuge zum Untersuchen der Expression und Regulation von Kaliumkanälen. Humane Kv6.2-spezifische Reagenzien, die spezifisch an Kv6.2 Nukleinsäure hybridisieren, wie Kv6.2 Sonden und Primer, und Kv6.2-spezifische Reagenzien, die spezifisch an das Kv6.2 Protein binden, z. B., Kv6.2 Antikörper, werden verwendet, um Expression und Regulation zu untersuchen.
Nukleinsäureassays für das Vorliegen von Kv6.2 DNA und RNA in einer Probe beinhalten zahlreiche Techniken, die den Fachleuten wohl bekannt sind, wie Southern-Analyse, Northern-Analyse, Dot-Blots, RNase Schutz, Si Analyse, Amplifikationstechniken wie PCR und LCR und in situ Hybridisierung. Bei der in situ Hybridisierung wird zum Beispiel die Target-Nukleinsäure aus ihrer zellulären Umgebung freigesetzt, so dass sie für Hybridisierung innerhalb der Zelle verfügbar ist, während die zelluläre Morphologie für nachfolgende Interpretation und Analyse bewahrt wird. Die folgenden Artikel stellen einen Überblick über die Technik der in situ Hybridisierung zur Verfügung: Singer et al., Biotechniques 4: 230250 (1986); Haase et al., Methods in Virology, Vol. VII, S. 189–226 (1984); und Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Hames et al., Hrg. 1987). Zusätzlich kann Kv6.2 Protein mit den zahlreichen oben beschriebenen Immunoassay-Techniken detektiert werden. Die Testprobe wird typischerweise sowohl mit einer positiven Kontrolle (z. B. einer Probe, die rekombinante Kv6.2-Monomere exprimiert) als auch einer negativen Kontrolle typischerweise verglichen.
Auch werden Kits zum Screenen nach Modulatoren der heteromeren Kaliumkanäle beschrieben. Solche Kits können aus problemlos verfügbaren Materialien und Reagenzien hergestellt werden. Zum Beispiel können solche Kits jedes oder mehrere der folgenden Materialien enthalten: Kv6.2 Monomere, Reaktionsröhrchen und Instruktionen zum Testen der Aktivitäten der Kaliumkanäle, die Kv6.2 enthalten. Eine große Vielzahl von Kits und Komponenten können hergestellt werden, abhängig von dem voraussichtlichen Verwender des Kits und den speziellen Anforderung des Verwenders. Zum Beispiel kann der Kit für in vitro oder in vivo Assays zum Messen der Aktivität eines Kaliumkanals, der einen Kv6.2 Monomer enthält, ausgelegt werden.
Beispiele
Das folgende Beispiel wird nur zum Zwecke der Illustration bereitgestellt und nicht zum Zwecke der Einschränkung. Die Fachleute werden leicht eine Vielzahl von nicht-kritischen Parametern erkennen, die geändert und modifiziert werden können, um im Wesentlichen ähnliche Ergebnisse zu ergeben.
Beispiel I: Klonieren von murinem Kv6.2
Unter Verwendung von PCR und Primer wird gemäß Standardbedingungen murines Kv6.2 aus Gesamthirn cDNA amplifiziert. Die folgenden Primer werden für die Amplifikation verwendet:
Die cDNA wird aus Gesamt-RNA gemäß Standardverfahren aus Gesamthirn isoliert. Kv6.2 wird mit den oben beschriebenen Primer unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 15 Sekunden bei 96°C, 15 Sekunden bei 72–60°C, und 3 Minuten bei 72°C für 40 Zyklen.
Die PCR Produkte wurden in Plasmide subkloniert und gemäß Standardtechniken sequenziert. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von murinem Kv6.2 werden bereitgestellt in SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 1 (siehe auch 1 für einen Vergleich von humanen und murinen Kv6.2 Aminosäuresequenzen).
Beispiel II: Klonieren von humanem Kv6.2
Ein ungefähr 200 bp Fragment des humanen Kv6.2 Gens wurde mit RT-PCR aus humaner Gesamthirn-mRNA mit einem Sense Primer aus der Porenregion von murinem Kv6.2 (TAGCATCCCGGCATCCTATTGGTG; SEQ ID NO: 11) und einem degeneriertem Antisense-Primer zu der S6 Region kloniert (AGGAGTGAGAGAACGTRTGRAADAT; SEQ ID NO: 12). Die verwendeten Zyklenbedingungen waren 20 Zyklen bei 95 Grad – 15 Sekunden, 65–45 Grad – 15 Sekunden (1 Grad weniger/Zyklus), 72 Grad 2 Minuten, gefolgt von 20 Zyklen bei 95 Grad – 15 Sekunden, 45 Grad – 15 Sekunden, 72 Grad – 2 Minuten.
Das 3' Ende des Gens wurde mit einer einzelnen Runde von Standard 3' RACE PCR unter Verwendung des genspezifischen Sense-Primers, der an die P Region bindet, kloniert (CATCCTATTGGTGGGCCATCATCT; SEQ ID NO: 13). Die Zyklenbedingungen waren: 24 Zyklen bei 95 Grad – 15 Sekunden, 72–60 Grad – 15 Sekunden (0.5 Grad weniger/Zyklus), 72 Grad – 2 Minuten, gefolgt von 21 Zyklen bei 95 Grad-15 Sekunden, 60 Grad-15 Sekunden, 72 Grad – 2 Minuten. Eine einzelne Bande von ungefähr 500 bp wurde isoliert und sequenziert. Sie enthielt durch das Stop-Codon von humanem Kv6.2 hindurch die P Region.
Das 5' Ende wurde mit zwei Runden von 5' RACE-PCR unter Verwendung von genspezifischen verschachtelten Oligos kloniert. Die Erst-Rundenreaktionsbedingungen waren identisch zu denen, die für die 3' RACE verwendet wurden, mit der Ausnahme, dass ein anderer genspezifischer Primer (GGGAGAAGGTGTGGAAGATAGACG; SEQ ID NO: 10), der an S6 in der Antisense Richtung bindet, verwendet wurde. Ein Zehntel eines Mikroliters dieser Reaktion wurde als ein Template für eine zweite Reaktion verwendet, in der ein verschachtelter genspezifischer Antisense Primer verwendet wurde(GCCACCATCTGGCCTGGCACACTG; SEQ ID NO: 14). Die Zyklenbedingungen für diese Reaktion waren 95 Grad – 15 Sekunden, 60 Grad 15 Sekunden, 72 Grad 2 Minuten (25 Zyklen). Eine einzelne Bande von ungefähr 1.7 Kb wurde isoliert. Es stellt sich heraus, dass sie das 5' Ende des humanen Kv6.2 Gens, einschließlich des Initiator-Methionins durch die P Region hindurch, enthält.
Das gesamte humane Kv6.2 Gen wurde dann in einem einzelnen Stück für einen Expressionsvektor mit dem Sense-Primer TCTTGAATTCCGCCATGCCCATGCCTTCCAGAGACGG (SEQ ID NO: 15) (der eine EcoRI Restriktionsschnittstelle und eine Kozak Consensus-Sequenz dem Initiator-Methionin hinzufügt) und dem Antisense Primer CTGGGCTCTAGAAACACCACCAGGT (SEQ ID NO: 16), der in dem 3' UTR von humanen Kv6.2 liegt, amplifiziert. Die Zyklen waren zu denjenigen, die für die 3'RACE PCR verwendet wurden, identisch. Eine einzelne Bande von ungefähr 1.7 Kb wurde isoliert und es stellte sich heraus, dass sie den gesamten offenen Leserahmen von humanen Kv6.2 enthält. Das Primerpaar ATGCCCATGCCTTCCAGAGACGG (SEQ ID NO: 7) und TTACATGTGCATGATAGGCAAGGCTG (SEQ ID NO: 8) reicht aus, um den offenen Leserahmen von Kv6.2 unter diesen Bedingungen zu amplifizieren. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von murinem Kv6.2 werden bereitgestellt in SEQ ID NO: 18 bzw. SEQ ID NO: 17 (siehe auch 1 für einen Vergleich von humanen und murinen Kv6.2 Aminosäuresequenzen).
Beispiel III: Expression und spannungsgesteuerte Aktivität von heteromeren Kanäle, die Kv6.2-Monomere enthalten
Humanes Kv6.2 Monomer wurden in Xenopus Oozyten mit humanem Kv2.1 Monomer gemäß Standardverfahren coexprimiert, um seine Fähigkeit zu zeigen, heteromere Kaliumkanäle mit spannungsabhängiger Aktivität zu bilden (siehe 2). Murines Kv6.2 und humanes Kv2.1 wurden auch koexprimiert. Veränderungen der Stromstärke werden mit einem spannungssensitiven fluoreszenten Reporterfarbstoff indirekt gemessen (siehe, z. B. Etts et al., Chemistry and Physiology of Lipids, 69: 137 (1994)). Veränderungen der Stromstärke werden auch unter Verwendung von Elektrophysiologie, und mittels Ionenflusses direkt gemessen. Allein exprimiertes Kv6.2 war elektrisch nicht aktiv (siehe 2). Sequenzliste Murine Kv6.2 Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1)
Murine Kv6.2 Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 2)
Humane Kv6.2 Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 17)
Humane Kv6.2 Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 18)
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid-Monomer kodiert, das eine Alpha-Untereinheit eines heteromeren Kaliumkanals umfasst, wobei das Polypeptid-Monomer die Fähigkeit besitzt, mit wenigstens einer weiteren Kv Alpha-Untereinheit einen heteromeren Kaliumkanal zu bilden, der die Eigenschaft zur spannungsabhängigen Durchgangsregulation besitzt und wobei die Nukleinsäure unter stringenten Bedingungen spezifisch an SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 18 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen eine Inkubation bei 42°C in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC und 1% SDS umfasst, oder eine Inkubation bei 65°C in einer Lösung, die 5 × SSC und 1% SDS und einen Waschschritt bei 65°C in einer Lösung, die 0,2 × SSC und 0,1% SDS umfasst, umfassten
Nukleinsäure nach Anspruch 1, welche für ein Polypeptid kodiert, das SEQ ID NO: 1 umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die Nukleinsäure SEQ ID NO: 2 umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, welche für ein Polypeptid kodiert, das SEQ ID NO: 17 umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei die Nukleinsäure SEQ ID NO: 18 umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, welche erhältlich ist durch Amplifikation mit Primern, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an dieselbe Sequenz selektiv hybridisieren wie die Primersätze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Nukleinsäure nach Anspruch 1, welche für ein Polypeptid-Monomer kodiert, das ein Molekulargewicht zwischen 53 kDa bis 65 kDa besitzt.
Expressionsvektor, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Wirtszelle, transfiziert mit dem Vektor nach Anspruch 8.
Isoliertes Polypetid-Monomer, umfassend eine Alpha-Untereinheit eines heteromeren Kaliumkanals, wobei das Polypeptid-Monomer die Fähigkeit besitzt, mit wenigstens einer weiteren Kv Alpha-Untereinheit einen heteromeren Kaliumkanal zu bilden, der die Eigenschaft zur spannungsabhängigen Durchgangsregulation besitzt und wobei die Nukleinsäure unter stringenten Bedingungen spezifisch an SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 18 hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen eine Inkubation bei 42°C in einer Lösung, die 50 % Formamid, 5 × SSC und 1% SDS umfasst, oder eine Inkubation bei 65°C in einer Lösung, die 5 × SSC und 1% SDS und einen Waschschritt bei 65°C in einer Lösung, die 0,2 × SSC und 0,1% SDS umfasst, umfassen.
Polypeptid-Monomer nach Anspruch 10, welches SEQ ID NO: 1 umfasst.
Polypeptid-Monomer nach Anspruch 10, welches SEQ ID NO: 17 umfasst.
Antikörper, der an das Polypeptid-Monomer nach einem der Ansprüche 10 bis 12 selektiv bindet.
In-vitro-Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, welche den Ionendurchfluss durch einen heteromeren spannungskontrollierten Kaliumkanal erhöht oder vermindert, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einer eukaryontischen Wirtszelle oder einer Zellmembran, in der ein Polypeptid-Monomer nach Anspruch 10 exprimiert wird, und (ii) Bestimmung der funktionellen Wirkung der Verbindung auf die Zelle oder Zellmembran, wobei die funktionelle Wirkung eine Veränderung des Ionendurchflusses, des Membranpotentials, der Transkription oder eine Freisetzung eines Hormons, eines Neurotransmitters oder eines zweiten Botenstoffes umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Polypeptid-Monomer rekombinant ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Polypeptid-Monomer SEQ ID NO: 1 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Polypeptid-Monomer SEQ ID NO: 17 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die funktionelle Wirkung eine Veränderung beim Ionendurchfluss ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Veränderung beim Ionendurchfluss durch Messung der Veränderungen des Stroms oder der Spannung bestimmt wird.
In-vitro-Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Polypeptid-Monomers wie in Anspruch 10 definiert in Säugetiergewebe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) In-Kontakt-Bringen einer isolierten biologischen Probe mit einem spezifischen Reagenz, das sich mit dem wie im Anspruch 10 definierten Polypeptid-Monomer selektiv assoziiert, und (ii) Nachweis der Konzentration des Reagenz, das mit der Probe spezifisch assoziiert ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Reaganz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Antikörpern, Oligonukleotid-Primern und Nukleinsäure-Sonden.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei die Probe eine menschliche Probe ist.