WO2014155022A1 - Proteine kinase aurora a mutee sensible a un inhibiteur - Google Patents

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WO2014155022A1
WO2014155022A1 PCT/FR2014/050754 FR2014050754W WO2014155022A1 WO 2014155022 A1 WO2014155022 A1 WO 2014155022A1 FR 2014050754 W FR2014050754 W FR 2014050754W WO 2014155022 A1 WO2014155022 A1 WO 2014155022A1
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WO
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aurora
protein
mutated
cells
wild
Prior art date
Application number
PCT/FR2014/050754
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Claude Prigent
David REBOUTIER
Marie Berengère TROADEC
Patrick SALAUN
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite De Rennes 1
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Publication date
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    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/10—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation

Definitions

  • the present invention relates to an Aurora A protein kinase with a specific mutation, as well as its use as a research tool, and more particularly to allow the validation of cancer molecules.
  • Cancer is a major public health problem affecting one in two men and one in three women under 85 in France. Some cancers have a mortality rate of up to 25%, for example in the case of lung cancer in humans. Cancer is characterized by the uncontrolled proliferation of cells. This disease is linked to an escape of regulatory mechanisms that ensure the control of cell division. The regulation of cell division is ensured by signaling proteins. Aurora A protein is a major signaling protein kinase involved in regulating the progression of cell division.
  • Aurora A During the early phases of mitosis, Aurora A's functions are strictly related to its location. Aurora A is localized at the level of centrosomes to ensure the maturation of the centrosome, then to the poles of the spindle to ensure the assembly of the bipolar spindle. The loss of Aurora A function thus causes spindle abnormalities and then a prometaphase cell cycle arrest.
  • Aurora A is found in the central anaphase and midbody in telophase and cytokinesis, although no function has been clearly identified to date.
  • Aurora A protein kinase thus controls many key events in cell division. For this reason, the disruption of Aurora A protein kinase expression is oncogenic, and this protein kinase is frequently found to be overexpressed in many cancers. As such, Aurora A protein kinase has become a priority target for therapeutic inhibitor development (Kollareddy et al., 2012. Invest New Drugs 30: 241 1-2432).
  • the search for selective Aurora A inhibitors is usually based on in vitro tests of chemical molecule banks. These in vitro tests do not, however, take into account the complexity of the molecular context of the kinase in vivo, such as the presence of activating cofactors.
  • the potentially inhibitory molecules identified in vitro must then be tested on cell models of cells in culture to verify that the observed effects are actually due to specific inhibition of Aurora A kinase activity. These tests are intended to evaluate the unavoidable side effects (inhibition of the activity of other protein kinases such as Aurora A for example) of these drugs and therefore their specificity.
  • Aurora A has been shown to have functions independent of its kinase activity (Anderson et al., Biochemistry 46: 10287-10295). The presence of the inactive Aurora A protein kinase is sufficient to ensure some of these functions (Kress et al., 2011 Nat Cell Biol 13 (6): 638-9, Toya et al., 201 1. Nat Cell Biol 13 ( 6): 708-14). The effects of inhibition of Aurora A kinase activity and protein withdrawal by RNA interference are therefore not comparable.
  • An object of the invention is thus to provide a mutated Aurora A protein whose kinase activity can be specifically inhibited by an inhibitor.
  • Another object of the invention is to provide a research tool for the study of Aurora A protein.
  • Another object of the invention is also to provide a research tool for testing the effects of Aurora A kinase inhibitors.
  • Another object of the invention is to provide a research tool for characterizing anti-cancer molecules.
  • the invention relates to a mutated protein derived from an Aurora A protein kinase and whose sequence has at least 80% similarity, preferably at least 90%, with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • said mutated protein having at least one substitution of the amino acid located at position 210 or equivalent, with respect to the sequence SEQ ID NO: 1, by a natural or non-natural amino acid other than leucine.
  • the reference sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to the protein sequence of the wild-type human Aurora A protein.
  • the nucleotide sequence encoding this protein corresponds to the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the percentages of similarity given correspond to the amino acid percentages of the complete sequence SEQ ID NO: 1 which are similar or identical in the sequence of the complete Aurora A protein.
  • the inventors have found that the replacement of an amino acid in the active site of the Aurora A protein makes it possible to bind a molecule derived from or analogous to ⁇ , and that the binding of this molecule is capable of inhibiting specifically the kinase activity of the mutated Aurora A protein.
  • the amino acid replaced by mutation corresponds to Leucine located at position 210 with respect to the sequence of the human Aurora A protein (SEQ ID NO: 1).
  • as-AurA retains complete kinase activity and is specifically inhibited by 10 ⁇ M 1-Na-PP1 (1-Naphtyl-PP1) (which has no effect on wild-type Aurora A kinase).
  • Aurora A overexpression elicits mitotic abnormalities, so the inventors produced the mutated Aurora A kinase under the control of the endogenous ⁇ Aurora A transcriptional minimal regulatory region. This construction allowed the production of mutated Aurora A kinase at physiological levels, when the endogenous Aurora A was previously removed by interfering RNA.
  • the localization of the mutated Aurora A protein is similar to that of the wild-type Aurora A protein, and the in vivo complementation experiments indicate that the mutated protein is fully functional in the cultured cells.
  • the invention relates to a mutated protein defined above, said mutated protein having kinase activity that can be inhibited completely or partially in the presence of an inhibitory compound, said inhibitory compound being inactive with respect to the Aurora A protein kinase from which the mutated protein is derived.
  • Aurora protein A GQAQRVLCPSNSSQRVPLQAQKLVSSHKPVQNQKQKQLQA chimpanzee TSVPHPVSRPLNNTQKSKQPLPSAPENNPEEELASKQKNEES
  • mutated protein mutated Aurora A protein
  • as- AurA Aurora A sensitive analogue
  • Aurora A protein kinase corresponds, for their part, to the protein kinase that does not possess a leucine mutation. position 210.
  • the invention relates to a mutated protein defined above, said mutated protein identically providing the same cellular functions as those provided by said Aurora A protein kinase from which it derives.
  • the inventors have also surprisingly found that said mutated Aurora A protein retains the same functions as the wild Aurora A protein from which it derives. In other words, in the absence of said specific inhibitor, a cell expressing only the mutated Aurora A protein has the same phenotype as a cell expressing only the unmutated Aurora A protein.
  • phenotype corresponds to any observable cellular characteristic. In a nonlimiting manner, it may be, for example, cell proliferation, cell death, destruction of the mitotic spindle, or even mitotic segregation.
  • the invention relates to a mutated protein defined above, wherein the amino acid at position 210 or equivalent, with respect to SEQ ID NO: 1, is substituted with alanine.
  • Another embodiment of the invention relates to a mutated protein defined above, wherein the amino acid at position 210 or equivalent, with respect to SEQ ID NO: 1, is substituted with a neutral amino acid, preferably selected from the group consisting of: ⁇ alanine, proline, valine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, serine, threonine, cysteine, asparagine and glutamine.
  • the invention relates more particularly to a mutated protein as defined above, said mutated protein corresponding to the sequence SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO. : 17 or SEQ ID NO: 19.
  • Aurora protein A AQRVLCPSNSQRVPPQAQKPVAGQKPVLKQLPAASGPRPAS rat mutant RLSNPQKSEQPQPAASGNNSEKEQTSIQKTEDSKKRQWTLE
  • Aurora Protein A SENMAPASKPLPGSSGALIRKPGLGGSNSIASSEG NFQKPM mutated Drosophila VPSVKKTTSEFAAPAPVAPIKKPESLSKQKPTAASSESSKELG
  • the invention relates to a protein mutated defined above, said kinase activity corresponding to the phosphorylation of a substrate protein selected from the group consisting of: PLK-1, P 150 Glued, TACC, CRMP-1, MKLP-1, Eg5, TPX2, P53, CDC25 , Histone H3 and NIMA.
  • a mutated protein defined above, said inhibitory compound being a moléc-like molecule.
  • analog of ⁇ corresponds to a molecule derived from ⁇ or having a chemical structure close to ⁇ .
  • the invention relates to a mutated protein defined above, said inhibitory compound being 1-Na-PP1.
  • the inventors have determined that a concentration of 10 ⁇ l of 1-Na-PP1 completely inhibits the mutated Aurora A protein in the cells, but has no effect on the wild Aurora A protein.
  • the invention provides a mutated Aurora A protein derived from wild-type Aurora A protein kinase and having a sequence of at least 80% identity, preferably at least 90%, with the sequence SEQ ID NO: 1, said mutated Aurora A protein, providing identically the same cellular functions as those provided by said wild Aurora A protein kinase from which it derives, and possessing :
  • a kinase activity that can be completely or partially inhibited in the presence of a inhib-like inhibitory compound, said PATP-like inhibitor compound being inactive with respect to the wild-type Aurora A protein kinase from which said mutated Aurora A protein is derived.
  • the percentages of identity given that is to say “at least 80%” and “preferably at least 90%” correspond to the amino acid percentages of the complete sequence SEQ ID NO: 1 which are identical in the sequence of the complete Aurora A protein.
  • Another aspect of the invention relates to a nucleic acid encoding the mutated protein defined above.
  • the invention relates to a nucleic acid defined above possessing silent mutations with respect to the sequence of the nucleic acid encoding the Aurora A protein from which the mutated protein is derived.
  • the inventors have replaced the CCTGTCTTACTGT motif, between positions 729 and 741, in the sequence SEQ ID NO: 12 by the ACTATC AT ATTGC motif, to obtain the sequence SEQ ID NO: 21 .
  • the two nucleotide sequences SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 21 therefore encode the same mutated Aurora A protein SEQ ID NO: 11, but the sequence SEQ ID NO: 21 is not sensitive to an interfering RNA having the motif ACTATCATATTGC and targeting the endogenous protein, unlike the sequence SEQ ID NO: 12.
  • the invention relates to a nucleic acid defined above corresponding to the sequence SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 or 21.
  • Another aspect of the invention also relates to an expression vector comprising a nucleic acid defined above.
  • the invention relates to an expression vector as defined above, said expression vector corresponding to the sequence SEQ ID NO: 22.
  • Another aspect of the invention also relates to a cell expressing the mutated Aurora A protein defined above.
  • Another aspect of the invention also relates to the use in vitro, ex vivo or in vivo of a mutated protein defined above, as a research tool for determining the inhibitory effect of a chemical molecule vis-à-vis an Aurora A protein kinase having at least 80% similarity, preferably at least 90%, with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the invention also relates to the use in vitro, ex vivo or in vivo of a mutated protein defined above, as a research tool for determining the inhibitory effect of a chemical molecule vis-à-vis an Aurora A protein kinase having at least 80% identity, preferably at least 90%, with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the mutated protein according to the invention has the advantage of allowing a strong, rapid and specific inhibition of Aurora A. As a result, the mutated protein constitutes a true negative control to determine whether the effects observed by the treatment with a chemical molecule result or not from the inhibition of Aurora A.
  • the mutated protein according to the invention therefore represents a powerful research tool to study the functions of Aurora A.
  • the invention relates to the use defined above wherein:
  • a first sample comprising cells expressing said Aurora A protein kinase in the presence of said chemical molecule
  • a second sample comprising cells expressing said mutated protein, but not expressing said Aurora A protein kinase, in the presence of an inhibitor of kinase activity
  • said second sample being representative of a specific inhibition of kinase activity of said Aurora A protein.
  • Aurora A kinase plays a central role in mitosis and is frequently overexpressed in many types of tumors. Accordingly, its specific inhibition is a major strategy for combating cancer (Sloane et al., 2010 ACS Chem Biol., 5: 563-576). New drugs are therefore needed to treat the different varieties of cancers that are resistant to conventional chemotherapy. It is therefore important to identify specific Aurora A or B inhibitors that can be used in chemotherapy.
  • the mutated Aurora A protein can be used to study the specificity of candidate molecules and to validate new pharmaceutical molecules. It is indeed very simple to use it as an inhibition control of the Aurora A protein, and thus to determine, by comparison with the test samples, whether the phenotypes of the cells consecutive to the treatment with a chemical molecule result or not from
  • the invention relates to the use according to the claim defined above wherein the sample corresponding to the cells expressing the mutated Aurora A protein is used as a comparison control for the invention. measure the specificity of an inhibitor of the wild Aurora A protein.
  • the invention relates to the use defined above wherein kinase activity is measured in both samples.
  • the invention relates to the use defined above wherein said kinase activity is phosphorylation of a substrate protein selected from the group consisting of: PLK-1, P150 Glued, TACC, CRMP-1 , MKLP-1, Eg5, TPX2, P53, CDC25, Histone H3 and NIMA.
  • a substrate protein selected from the group consisting of: PLK-1, P150 Glued, TACC, CRMP-1 , MKLP-1, Eg5, TPX2, P53, CDC25, Histone H3 and NIMA.
  • the invention relates to the use defined above wherein cell proliferation is measured in both samples.
  • the invention relates to the use defined above wherein said cells are observed by microscopy in both samples.
  • the invention relates to the use defined above wherein said chemical molecule is an anticancer molecule.
  • Another aspect of the invention relates to a kit comprising a mutated protein defined above and an inhibitor compound.
  • the mutated Aurora A protein (as-AurA) retains its Idnase activity in vitro and behaves as wt-AurA when expressed in U20S cells.
  • the mutated Aurora A (as-AurA) protein is fully functional in vivo in cultured cells and is effectively inhibited by 1-Na-PP1.
  • C Periodic Fluorescence Microscopy and Differential Interference Contrast (DIC) images showing late mitotic phases of GFP-tubulin expressing WT-AurA and AS-AurA cells lacking endogenous Aurora-A and treated with 10 ⁇ 1-Na-PPl.
  • the two arrows indicate the two groups of chromosomes that separate. Time is given in minutes. The scale bars represent 10 ⁇ .
  • P150Glued is phosphorylated by Aurora A on Ser 19 in vitro.
  • the white arrows show the mitotic spindle poles in anaphase or telophase cells without HA-P150Glued accumulation, while the black arrows indicate accumulation of HA-P150Glued in AS-AurA cells lacking endogenous Aurora A and treated with 10 ⁇ 1-Na-PP1 at the entrance of the anaphase.
  • the scale bars represent 10 ⁇ .
  • the white arrows show the poles of the mitotic spindle in anaphase cells, telophase without accumulation of HA-P150Glued, while black arrows indicate accumulation of HA-P150Glued.
  • the scale bars represent 5 ⁇ .
  • EXAMPLE 1 Production of a mutated Aurora A kinase (or as-AurA, AurA sensitive analogue).
  • the gatekeeper residue was identified as corresponding to the Leucine amino acid at position 210.
  • a genetic construct was produced encoding a L210A mutant. This mutated Aurora A protein is also referred to as as-AurA.
  • the as-AurA recombinant protein is as active as wild-type Aurora A protein (called wt-AurA) and is still capable of phosphorylating TPX2, a known substrate of Aurora A ( Figure 1A).
  • 1-Naphtyl-PP1 (1-Na-PP1, Fig 1B) is one of the most potent inhibitors of as-AurA and has no effect on wt-AurA: at 10 ⁇ , 1-Na -PP1 completely inhibits as-AurA activity but has no effect on wt-AurA activity ( Figure 1A).
  • EXAMPLE 2 Cloning of the Aurora A Promoter and Characterization of the Expression of wt-AurA and As-AurA in Human U2QS Cells
  • U20S cells were transfected with these constructs, and Aurora A, GFP-wt-AurA, and GFP-as-AurA expression levels were determined during the cell cycle in synchronized cells.
  • Figures 2D (top) and 2E show that the treatment of WT-AurA or AS-AurA cells devoid of endogenous Aurora A with 1-Na-PP1 for 24 hours does not modify the level of PL 1 at the level of the centrosomes in cells in G2 phase.
  • phosphorylation of the T210 residue is significantly reduced in AS-AurA cells compared to WT-AurA cells ( Figure 2D (low) and 2F), indicating a strong inhibition of AS-AurA kinase activity. by the 1-Na-PPl.
  • anaphase A the movement of chromosomes in HeLa cells is generated by tensile forces due to the depolarization of microtubules of the kinetochore.
  • anaphase B the poles of the spindle are further separated by the action of the microtubules of the intermediate body which grow by polymerization at their longer ends, while the transverse motor proteins migrate towards the ends more, thus repelling the polar microtubules overlapping the on each other and the poles of the spindle separated more and more.
  • This event requires a functional central spindle, so we studied the central spindle assembly in the context of an Aurora A inhibition.
  • Central spindles are normally formed in WT-AurA cells, but not in AS-AurA cells, which implies Aurora A activity in the central spindle assembly.
  • the central spindle assembly is a complex process involving different molecules with very specific functions.
  • P150Glued is a microtubule-associated protein that binds to dynein (Vaughan and Valley, 1995. J Cell Biol 131: 1507-1516) and is involved in the bidirectional transport of cargo along microtubules (Deacon et al., 2003. Cell Biol 160: 297-301).
  • MBD microtubule binding domain
  • EXAMPLE 6 The phosphorylation of the Serine 19 residue of the P150Glued is necessary for the assembly of the central spindle.
  • HA-P150Glued is localized on microtubules in a manner similar to the endogenous protein (Figure 5B, up and down compared).
  • mutants S19A and S19D are significantly different.
  • the S19A mutant accumulates strongly on the microtubules of the interphase and on the spindle poles in metaphase and anaphase ( Figures 6A (top) and 6C).
  • the percentage of anaphase cells with central spindle assembly defects or HA-P150Glued accumulation at the spindle poles was significantly reduced by the expression of HA-P150Glued S19D but not by the expression of wild-type HA-P150Glued .
  • mutant mimicking the phosphorylated HA-P150Glued i.e., mutant S19D
  • mutant S19D is capable of correcting the Aurora A inhibition, at least in part.
  • the Aurora A and PI 50 Glued cDNAs corresponding to the microtubule binding domain were inserted into the pET29 vector.
  • the mutants Aurora A (L210A) and PI50 Glued (S19A, S19D) were made using the QuickChange mutagenesis kit (Stratage). Aurora A was removed from the U20S cells as described in the article by Reboutier et al. (2012, Cell Biol 197: 19-26).
  • the cells were transfected for 24 hours using a Jetprime (Polyplus transfection), according to the manufacturer's recommendations, with an interfering RNA oligonucleotide corresponding to the sequence: AUGCCCUGUCUUACUGUCA.
  • the absence of endogenous Aurora A protein was systematically verified by western blot in each experiment.
  • the cDNA corresponding to the wild-type AurA protein and the mutated aurora A protein was inserted into a pEGFP-C1 vector under the control of the Aurora A promoter sequence to control the physiological levels of expression.
  • PI 50 wild glued and mutant sequences were inserted into a pCDNA 3.1 vector.
  • Escherichia coli BL21 strains were transformed with plasmids, induced by 1 mM IPTG for 4 hours, pelleted and frozen at -80 ° C.
  • the His-Tag labeled proteins (human Aurora A, TPX2) were purified according to the protocol described in Roghi et al. (1998. J Cell Sci 11 (5): 557-772
  • the bacterial pellets were lysed and loaded on Talon® beads (Talon Beads, ClonTech), the samples were washed and the proteins were eluted with buffer containing 50 mM imidazole.
  • the purified proteins were stored at -80 ° C or in 50% glycerol at -20 ° C.
  • U20S human cells were cultured in Me Coy Medium with penicillin and streptomycin (Invitrogen), and 10% fetal calf albumin (PAA).
  • the cells were transfected into culture medium using the JetPrime transfection kit (Polyplus Transfection) according to the seller's instructions. The medium was changed after 24 hours.
  • the cells were stopped in G2 phase by a 16 hour treatment with 10 ⁇ l of R0336 (Calbiochem) and then washed three times for 30 seconds with preheated medium. The first cells enter anaphase approximately 1 hour after the first wash.
  • the cells were first plated on glass plates, fixed with methanol at -20 ° C for 10 min (or with 4% paraformaldehyde for 10 minutes for observation of GFP), and then washed three times. in PBS and saturated with 1% PBS-BSA for 1 hour at room temperature. Antibodies in 1% PBS-BSA were added to the anti-rat 1: 1000 anti-Tubulin cells (clone YL1 / 2, Millipore), mouse anti-gamma-tubulin 1: 1000 (GTU88 clone, Sigma).
  • mouse anti-Aurora A (clone 35C11: 20) (Cremet et al., 2003), anti-MKLP1 rabbit 1: 1000 (Santa-Cruz), mouse anti-P150Glued (BD Transduction Laboratories), anti-HA 1 / 1000 mouse (Covance), mouse anti-PLK1 (Abcam), mouse anti-T210 P-PLK1 (BD Pharmingen).
  • the cells were incubated with the antibodies overnight at 4 ° C, and then washed three times and incubated in the dark with secondary antibodies (anti-mouse, anti-rabbit 488 or 55 1: 1000, Alexa, Invitrogen) during 1 hour at room temperature.
  • the plates were prepared with Prolongold (Invitrogen) with 1 ⁇ g / ml of DAPI (Sigma).
  • the cells were examined using a LEICA DMRXA2 fluorescence microscope with a 63X oil immersion objective, and the images were processed using Metamorph (Uni versai Imaging) software. Visualization of living cells
  • the cells were grown in Lab Tek I partitioned plates (Nunc). Before microscopy, the medium was replaced with independent C0 medium supplemented with 10% FBS and 200 mM L-glutamine (Invitrogen).
  • 1-Na- PP1 we selected metaphase cells, waited for them to enter anaphase, and then immediately added 1-Na-PPl. Images at regular intervals were obtained using a Plan Apo 60x / 1.4 NA lens with a microscope (Nikon) equipped with a rotating disk (CSU-X1; Yokogawa), a thermostatic chamber (Life Imaging Service), a Z platform Piezo Stage (Marzhauser), and a charge-coupled camera device (CoolSnap HQ2, Roper Scientific). Metamorph (Universal imaging) software was used to collect the data. Shots were recorded every minute. The images are maximum projections of 20 Z planes separated by 0.6 mm. Data at regular intervals have been processed by the Metamorph software.
  • the cells were lysed in RIPA buffer containing anti-protease (Complete, Roche) and the lysates were clarified by centrifugation (13000 rpm, 30 min, 4 ° C). The proteins were assayed by the Bradford method (Bradford Assay) (BioRad). Equal amounts of protein lysates in Laemmli buffer were determined by 12.5% SDS-PAGE, and transferred to nitrocellulose membranes.
  • the membranes were blocked for 1 hour at room temperature with TBST with 4% milk, and then incubated overnight with the following antibodies: anti-mouse ⁇ -tubulin 1: 2000 (Sigma), anti-Aurora A mice (clone 35C1 1: 100) (Cremet et al., Mol Cell Biochem 243: 123-131), anti-mouse HA (Covance).
  • the membranes were incubated with secondary antibodies coupled to HRP (Jackson) for 1 hour and antibody uptake was detected by enhanced chemiluminescence (Pico or Dura, Pierce).
  • HRP Joint photoactivated chemiluminescence
  • the purified proteins were separated by SDS-PAGE on a pre-made 12% gel (NuPAGE, Invitrogen, Life Technologies, Saint Aubin, France).
  • the gel was labeled using the EZBlue gel labeling reagent (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), and gel pieces corresponding to P150Glued were demarcated and washed with a series of acetonitrile (ACN) solutions. 100 mM NH4HCO3. Proteins were reduced with 65 mM DTT for 15 minutes at 37 ° C and alkylated with 135 mM iodoacetamide in the dark at room temperature.
  • the samples were washed with a series of ACN / 100 mM NH4HCO3 solutions and dehydrated with 100% ACN. Proteins were digested overnight at 37 ° C with 4 ng / ⁇ l of modified trypsin (Promega, Charbonippo-les-Bains, France) in NH4HCO3. The proteolytic products were extracted from the gel by sequential incubations in ACN / H2O / HCOOH, 70: 30: 0.1 (v / v / v) and 100% ACN, and then concentrated in a Speed Vac (Thermo Scientific, Courtaboeuf, France) to a final volume of 40 ⁇ .
  • ACN / H2O / HCOOH 70: 30: 0.1 (v / v / v) and 100% ACN
  • the peptides were analyzed using a nanoflow high performance chromato graphy system (Dionex, LC Packings Ultimate 3000) connected to a hybrid LTQ-OrbiTrap XL (Thermo Scientific) equipped with a nanoelectrospray ion source.
  • a nanoflow high performance chromato graphy system Lionex, LC Packings Ultimate 3000
  • a hybrid LTQ-OrbiTrap XL Thermo Scientific

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Abstract

La présente invention a pour objet une protéine kinase Aurora A possédant une mutation du site actif, la rendant sensible à un inhibiteur spécifique, lequel inhibiteur n'a aucun effet sur la protéine Aurora A sauvage non mutée. Cette protéine kinase Aurora A mutée, conservant les propriétés de la protéine kinase Aurora A sauvage, elle constitue un témoin d'inhibition efficace de la protéine Aurora A sauvage permettant l'étude de ses fonctions cellulaires et des effets associés à des inhibiteurs de kinase.

Description

PROTEINE KINASE AURORA A MUTEE SENSIBLE A UN INHIBITEUR
La présente invention concerne une protéine kinase Aurora A possédant une mutation spécifique, ainsi que son utilisation comme outil de recherche, et plus particulièrement pour permettre la validation de molécules anticancéreuses.
Le cancer est un problème de santé publique majeur qui touche un homme sur deux et une femme sur trois avant 85 ans en France. Certains cancers présentent un taux de mortalité pouvant atteindre 25%, comme par exemple dans le cas d'un cancer du poumon chez l'homme. Le cancer se caractérise par la prolifération incontrôlée de cellules. Cette maladie est liée à un échappement des mécanismes de régulation qui assurent le contrôle de la division cellulaire. La régulation de la division cellulaire est assurée par des protéines de signalisation. La protéine Aurora A est une protéine kinase de signalisation majeure impliquée dans la régulation de la progression de la division cellulaire.
Pendant les premières phases de la mitose, les fonctions d'Aurora A sont strictement liées à sa localisation. Aurora A se localise au niveau des centrosomes pour assurer la maturation du centrosome, puis aux pôles du fuseau pour assurer l'assemblage du fuseau bipolaire. La perte de la fonction d Aurora A entraîne ainsi des anomalies du fuseau et ensuite, un arrêt du cycle cellulaire en prométaphase.
Après la transition métaphase vers anaphase, Aurora A est retrouvée sur le fuseau central en anaphase et sur le corps intermédiaire en télophase et en cytokinèse, bien qu'aucune fonction n'ait pu être clairement identifiée à ce jour.
La protéine kinase Aurora A contrôle ainsi de nombreux événements clés de la division cellulaire. Pour cette raison, le dérèglement de l'expression de la protéine kinase Aurora A est oncogénique, et cette protéine kinase est fréquemment trouvée surexprimée dans de nombreux cancers. A ce titre, la protéine kinase Aurora A est devenue une cible prioritaire pour le développement d'inhibiteurs à visée thérapeutique (Kollareddy et al. 2012. Invest New Drugs. 30 : 241 1-2432).
Cependant, il n'existe à l'heure actuelle aucun inhibiteur d'Aurora A permettant d'inhiber spécifiquement son activité kinase in vivo. Cette absence d'inhibiteur spécifique a pour conséquence de fermer l'accès à l'étude des fonctions d'Aurora A impliquées dans les processus cellulaires les plus dynamiques.
La recherche d'inhibiteurs sélectifs d'Aurora A est généralement basée sur des tests in vitro de criblages de banques de molécules chimiques. Ces tests réalisés in vitro ne prennent toutefois pas en compte la complexité du contexte moléculaire de la kinase in vivo, comme par exemple la présence de cofacteurs activateurs. Les molécules potentiellement inhibitrices identifiées in vitro doivent donc ensuite être testées sur des modèles cellulaires de cellules en culture pour vérifier que les effets observés sont réellement dus à l'inhibition spécifique de l'activité kinase d'Aurora A. Ces tests ont pour but d'évaluer les effets indésirables inévitables (inhibition de l'activité d'autres protéines kinase qu'Aurora A par exemple) de ces drogues et donc leur spécificité.
A l'heure actuelle, l'effet inhibiteur de ces molécules sur les cellules est comparé à l'effet d'un retrait de la kinase Aurora A par interférence ARN. De cette manière, la cellule n'exprime pas de kinase Aurora A. Or il a été montré que la protéine Aurora A possède des fonctions indépendantes de son activité kinase (Anderson et al. 2007. Biochemistry. 46: 10287-10295). La présence de la protéine kinase Aurora A inactive suffit d'ailleurs à assurer certaines de ces fonctions (Kress et al. 2011. Nat Cell Biol 13(6) :638-9 ; Toya et al. 201 1. Nat Cell Biol 13(6) :708-14). Les effets de l'inhibition de l'activité kinase d'Aurora A et du retrait de la protéine par interférence ARN ne sont donc pas comparables. Aussi, ces tests cellulaires présentent un biais et ne sont pas satisfaisants. Une autre stratégie vise, quant à elle, à élaborer des mutants de la protéine Aurora A sensibles à certains inhibiteurs. Toutefois, bien que certains mutants sensibles aient déjà pu être produits, ceux-ci demeurent partiellement résistants aux drogues utilisées (Sloane et al. 2010. ACS Chem Biol. 5 : 563-576). En effet, il s'avère qu'il est particulièrement difficile de maintenir l'activité complète d'une kinase après l'introduction de mutations dans le site actif. Aussi, la nécessité d'un vrai contrôle d'inhibition d'Aurora A demeure. Un des buts de l'invention est ainsi de fournir une protéine Aurora A mutée dont l'activité kinase peut être inhibée spécifiquement par un inhibiteur.
Un autre but de l'invention est de fournir un outil de recherche permettant l'étude de la protéine Aurora A.
Un autre but de l'invention est également de fournir un outil de recherche permettant de tester les effets d'inhibiteurs de kinase Aurora A.
Un autre but de l'invention est de fournir un outil de recherche permettant de caractériser des molécules anticancéreuses.
Par conséquent, l'invention concerne une protéine mutée dérivée d'une protéine kinase Aurora A et dont la séquence possède au moins 80 % de similarité, de préférence au moins 90 %, avec la séquence SEQ ID NO : 1.
ladite protéine mutée possédant au moins une substitution de l'acide aminé situé en position 210 ou équivalente, par rapport à la séquence SEQ ID NO : 1 , par un acide aminé naturel ou non naturel différent de la leucine.
La séquence de référence SEQ ID NO : 1 correspond à la séquence protéique de la protéine Aurora A humaine sauvage. La séquence nucléotique codant cette protéine correspond à la séquence SEQ ID NO : 2.
SEQ ID NO: 1 MDRSKENCISGPVKATAPVGGPKRVLVTQQFPCQNPLPVNS Protéine Aurora A GQAQRVLCPSNSSQRIPLQAQKLVSSHKPVQNQKQKQLQAT humaine SVPHPVSRPLNNTQKSKQPLPSAPENNPEEELASKQKNEESK (UniProt 014965) KRQWALEDFEIGRPLGKGKFGNVYLAREKQSKFILALKVLF
KAQLEKAGVEHQLRREVEIQSHLRHPNILRLYGYFHDATRV YLILEYAPLGTVYRELQ LSKFDEQRTATYITELANALSYCH SKRVIHRDIKPENLLLGSAGELKIADFGWSVHAPSSRRTTLC GTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLWSLGVLCYEFLVGKPPFEA NTYQETYKRISRVEFTFPDFVTEGARDLISRLLKFfNPSQRPM LREVLEHPWITANSSKPSNCQNKESASKQS Dans l'invention, les pourcentages de similarité donnés, c'est-à-dire « au moins 80% » et « de préférence au moins 90% », correspondent aux pourcentages d'acides aminés de la séquence complète SEQ ID NO : 1 qui sont similaires ou identiques dans la séquence de la protéine Aurora A complète.
De manière surprenante, les Inventeurs ont constaté que le remplacement d'un acide aminé du site actif de la protéine Aurora A permet la fixation d'une molécule dérivée ou analogue de ΑΤΡ, et que la fixation de cette molécule est capable d'inhiber de manière spécifique l'activité kinase de la protéine Aurora A mutée. L'acide aminé remplacé par mutation correspond à la Leucine située en position 210 par rapport à la séquence de la protéine Aurora A humaine (SEQ ID NO : 1).
In vitro, as-AurA conserve une activité kinase complète et est spécifiquement inhibée par le 1-Na-PPl (1-Naphtyl-PPl) 10 μΜ (qui n'a pas d'effet sur la kinase Aurora A sauvage).
La sur-expression d'Aurora A déclenche des anomalies mitotiques, alors les Inventeurs ont produit la kinase Aurora A mutée sous le contrôle de la région minimale de régulation de la transcription de Γ Aurora A endogène. Cette construction a permis la production de la kinase Aurora A mutée à des quantités physiologiques, lorsque l'Aurora A endogène a été préalablement retirée par ARN interférant.
La localisation de la protéine Aurora A mutée est similaire à celle de la protéine Aurora A sauvage, et les expériences de complémentation in vivo indiquent que la protéine mutée est complètement fonctionnelle dans les cellules cultivées.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, ladite protéine mutée possédant une activité kinase pouvant être inhibée complètement ou partiellement en présence d'un composé inhibiteur, ledit composé inhibiteur étant inactif vis-à-vis de la protéine kinase Aurora A dont dérive la protéine mutée.
Le site actif de la protéine Aurora A étant particulièrement conservée, le résidu leucine est également retrouvé dans des positions équivalentes au sein de la protéine Aurora A d'autres organismes, notamment les mammifères. De manière non limitative, des exemples de ces protéines Aurora A sauvages issues de différents organismes sont présentés ci-dessous :
SEQ ID NO: 3 MDRSKENCISGPVKATAPVGGPKRVLVTQQFPCQNPLPVNS
Protéine Aurora A GQAQRVLCPSNSSQRVPLQAQKLVSSHKPVQNQKQKQLQA de chimpanzé TSVPHPVSRPLNNTQKSKQPLPSAPENNPEEELASKQKNEES
KKRQWALEDFEIGRPLGKGKFGNVYLAREKQSKFILALKVL
FKAQLEKAGVEHQLRREVEIQSHLRHPNILRLYGYFHDATR
VYLILEYAPLGTVYRELQKLSKFDEQRTATYITELANALSYC
HSKRVIHRDIKPENLLLGSAGELKIADFGWSVHAPSSRRTTL
CGTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLWSLGVLCYEFLVGKPPFE
ANTYQETYKRISRVEFTFPDFVTEGARDLISRLLKHNPSQRP
MLREVLEHPWITANSSKPSNCQN ESASKQS
SEQ II) NO: 5 MAVEGEPGCCKRIGKAVWRRGDMDRCKENCVSRPVKTTVP
Protéine Aurora A FGPKRVLVTEQIPSQNLGSASSGQAQRVLCPSNSQRVPSQAQ de souris KLGAGQKPAPKQLPAASVPRPVSRLNNPQKNEQPAASGNDS
EKEQASLQKTEDTKKRQWTLEDFDIGRPLGKGKFGNVYLA
RERQSKFILALKVLFKTQLEKANVEHQLRREVEIQSHLRHPN
ILRLYGYFHDATRVYLILEYAPLGTVYRELQKLSKFDEQRTA
TYITELANALSYCHSKRVIHRDIKPENLLLGSNGELKIADFG
WSVHAPSSRRTTMCGTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLWSLG
VLCYEFLVGMPPFEAHTYQETYRRISRVEFTFPDFVTEGARD
LISRLLKHNASQRLTLAEVLEHPWIKANSSKPPTGHTS EPTS
KSS
SEQ II) NO: 7 MDRCKENCVSRPVKSTVPFGP RVLVTEQIPSQHPGSASSGQ
Protéine Aurora A AQRVLCPSNSQRVPPQAQKPVAGQKPVLKQLPAASGPRPAS de rat RLSNPQKSEQPQPAASGNNSEKEQTSIQKTEDSKKRQWTLE
DFDIGRPLGKGKFGNVYLAREKQSKFILALKVLFKVQLEKA
GVEHQLRREVEIQSHLRHPNILRLYGYFHDATRVYLILEYAP
LGTVYRELQKLSKFDEQRTATYITELANALSYCHSKRVIHRD
IKPENLLLGSNGELKIADFGWSVHAPSSRRTTLCGTLDYLPP
EMIEGRMHDEKVDLWSLGVLCYEFLVGMPPFEAHTYQETY
RRISRVEFTFPDFVTEGARDLISRLLKHNSSQRLTLAEVLEHP
WIKANSSKPPTGHNSKEATSKSS
SEQ ID NO: 9 MSHPSDHVLRPKENAPHRMPEKSAAVHNMQKNLLLGKKPN
Protéine Aurora A SENMAPASKPLPGSSGALIRKPGLGGSNSIASSEGNNFQKPM de drosophile VPSVKKTTSEFAAPAPVAPIKKPESLSKQKPTAASSESSKELG
AASSSAEKEKTKTETQPQKPKKTWELNNFDIGRLLGRG FG
NVYLAREKESQFVVALKVLFKRQIGESNVEHQVRREIEIQSH
LRHPHILRLYAYFHDDVRIYLILEYAPQGTLFNALQAQPMKR
FDERQSATYIQALCSALLYLHERDIIHRDIKPENLLLGHKGVL
KIADFGWSVHEPNSMRMTLCGTVDYLPPEMVQGKPHTKNV
DLWSLGVLCFELLVGHAPFYSKNYDETYKKILKVDYKLPEH
ISKAASHLISKLLVLNPQHRLPLDQVMVHPWILAHTQ Les séquences nucléotidiques codant les protéines SEQ ID NO : 3, 5, 7 et 9 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO : 4, 6, 8 et 10.
Dans l'invention, les termes « protéine mutée », « protéine Aurora A mutée » ou « as- AurA » (analogue-sensitive Aurora A) correspondent tous à une protéine Aurora A possédant une mutation de la leucine en position 210.
Dans l'invention, les termes « protéine kinase Aurora A », « Aurora A » ou « wt-AurA » (wild-type Aurora A) correspondent, quant à eux, à la protéine kinase ne possédant pas de mutation de la leucine en position 210.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, ladite protéine mutée assurant de manière identique les mêmes fonctions cellulaires que celles assurées par ladite protéine kinase Aurora A dont elle dérive. Les Inventeurs ont également constaté de manière surprenante que ladite protéine Aurora A mutée conserve les mêmes fonctions que la protéine Aurora A sauvage dont elle dérive. En d'autres termes, en l'absence dudit inhibiteur spécifique, une cellule exprimant uniquement la protéine Aurora A mutée présente le même phénotype qu'une cellule exprimant uniquement la protéine Aurora A non mutée.
Dans l'invention, le terme « phénotype » correspond à n'importe quelle caractéristique cellulaire observable. De manière non limitative, il peut s'agir par exemple de la prolifération cellulaire, de la mort cellulaire, de la destruction du fuseau mitotique, ou encore de la ségrégation mitotique.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, dans laquelle l'acide aminé en position 210 ou équivalente, par rapport à la SEQ ID NO : 1, est substitué par une alanine. Un autre mode de réalisation de l'invention concerne une protéine mutée définie ci- dessus, dans laquelle l'acide aminé en position 210 ou équivalente, par rapport à la SEQ ID NO : 1, est substitué par un acide aminé neutre, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : Γ alanine, la proline, la valine, l'isoleucine, la méthionine, la phénylalanine, le tryptophane, la tyrosine, la serine, la thréonine, la cystéine, 1 ' asparagine et la glutamine .
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne plus particulièrement une protéine mutée telle que définie ci-dessus, ladite protéine mutée correspondant à la séquence SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 17 ou SEQ ID NO : 19.
SEQ ID NO: 11 MDRSKENCISGPVKATAPVGGPKRVLVTQQFPCQNPLPVNS
Protéine Aurora A GQAQRVLCPSNSSQRIPLQAQKLVSSHKPVQNQKQKQLQAT mutée humaine SVPHPVSRPLNNTQKSKQPLPSAPENNPEEELASKQKNEESK
KRQWALEDFEIGRPLGKGKFGNVYLAREKQSKFILALKVLF
KAQLEKAGVEHQLRREVEIQSHLRHPNILRLYGYFHDATRV
YLIAEYAPLGTVYRELQKLSKFDEQRTATYITELANALSYCH
SKRVIHRDIKPENLLLGSAGELKIADFGWSVHAPSSRRTTLC
GTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLWSLGVLCYEFLVGKPPFEA
NTYQETYKRISRVEFTFPDFVTEGARDLISRLLKHNPSQRPM
LREVLEHPWITANSSKPSNCQNKESASKQS
SEQ ID NO: 13 MDRSKENCISGPVKATAPVGGPKRVLVTQQFPCQNPLPVNS
Protéine Aurora A GQAQRVLCPSNSSQRVPLQAQKLVSSHKPVQNQKQKQLQA mutée de chimpanzé TSVPHPVSRPLNNTQKSKQPLPSAPENNPEEELASKQKNEES
KKRQWALEDFEIGRPLGKGKFGNVYLAREKQSKFILALKVL
FKAQLEKAGVEHQLRREVEIQSHLRHPNILRLYGYFHDATR
VYLIAEYAPLGTVYRELQKLSKFDEQRTATYITELANALSYC
HSKRVIHRDIKPENLLLGSAGELKIADFGWSVHAPSSRRTTL
CGTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLWSLGVLCYEFLVGKPPFE
ANTYQETYKRISRVEFTFPDFVTEGARDLISRLLKHNPSQRP
MLREVLEHPWITANSSKPSNCQNKESASKQS
SEQ II) NO: 15 MAVEGEPGCCKRIGKAVWRRGDMDRCKENCVSRPVKTTVP
Protéine Aurora A FGPKRVLVTEQIPSQNLGSASSGQAQRVLCPSNSQRVPSQAQ mutée de souris KLGAGQKPAPKQLPAASVPRPVSRLNNPQKNEQPAASGNDS
EKEQASLQKTEDTKKRQWTLEDFDIGRPLGKGKFGNVYLA
RERQ SKFIL ALKVLFKTQLEKANVEHQLRRE VEIQ SHLRHPN
ILRLYGYFHDATRVYLIAEYAPLGTVYRELQKLSKFDEQRTA
TYITELANALSYCHSKRVIHRDIKPENLLLGSNGELKIADFG
WSVHAPSSRRTTMCGTLDYLPPEMIEGRMHDEKVDLWSLG
VLCYEFLVGMPPFEAHTYQETYRRISRVEFTFPDFVTEGARD
LISRLLKHNASQRLTLAEVLEHPWIKANSSKPPTGHTSKEPTS
KSS
SEQ ID NO: 17 MDRCKENC VSRP VKSTVPFGPKRVLVTEQIP S QHPGS AS SGQ
Protéine Aurora A AQRVLCPSNSQRVPPQAQKPVAGQKPVLKQLPAASGPRPAS mutée de rat RLSNPQKSEQPQPAASGNNSEKEQTSIQKTEDSKKRQWTLE
DFDIGRPLGKG FGNVYLAREKQSKFILALKVLFKVQLEKA
GVEHQLRREVEIQSHLRHPNILRLYGYFHDATRVYLIAEYAP
LGTVYRELQKLSKFDEQRTATYITELANALSYCHSKRVIHRD
IKPENLLLGSNGELKIADFGWSVHAPSSRRTTLCGTLDYLPP EMIEGRMHDE VDLWSLGVLCYEFLVGMPPFEAHTYQETY RRISRVEFTFPDFVTEGARDLISRLLKHNSSQRLTLAEVLEHP WIKANS SKPPTGF1NSKEATSKS S
SEQ ID NO: 19 MSHPSDHVLRPKENAPHRMPEKSAAVHNMQKNLLLGKKPN
Protéine Aurora A SENMAPASKPLPGSSGALIRKPGLGGSNSIASSEG NFQKPM mutée de drosophile VPSVKKTTSEFAAPAPVAPIKKPESLSKQKPTAASSESSKELG
AASSSAEKEKTKTETQPQKP KTWELNNFDIGRLLGRGKFG
NVYLAREKESQFVVALKVLFKRQIGESNVEHQVRREIEIQSH
LRHPHILRLYAYFHDDVRIYLIAEYAPQGTLFNALQAQPMK
RFDERQSATYIQALCSALLYLHERDIIHRDIKPENLLLGHKGV
LKIADFGWSVHEPNSMRMTLCGTVDYLPPEMVQGKPHTKN
VDLWSLGVLCFELLVGHAPFYSKNYDETYKKILKVDYKLPE
HISKAASHLISKLLVLNPQHRLPLDQVMVHPWILAHTQ
Les séquences nucléotidiques codant les protéines SEQ ID NO : 1 1 , 13, 15, 17 et 19 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO : 12, 14, 16, 18 et 20. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, ladite activité kinase correspondant à la phosphorylation d'une protéine substrat choisie parmi le groupe consistant en : PLK-1 , P 150 Glued, TACC, CRMP- 1, MKLP-1 , Eg5, TPX2, P53, CDC25, Histone H3 et NIMA. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, ledit composé inhibiteur étant une molécule analogue de ΓΑΤΡ.
Dans l'invention, le terme « analogue de ΓΑΤΡ» correspond à une molécule dérivée de ΓΑΤΡ ou possédant une structure chimique proche de ΓΑΤΡ.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine mutée définie ci-dessus, ledit composé inhibiteur étant le 1-Na-PPl .
Par exemple et de manière non limitative, les Inventeurs ont déterminé qu'une concentration de 10 μΜ de 1-Na-PPl inhibe complètement la protéine Aurora A mutée dans les cellules, mais n'a aucun effet sur la protéine Aurora A sauvage.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une protéine Aurora A mutée dérivée d'une protéine kinase Aurora A sauvage et dont la séquence possède au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 90 %, avec la séquence SEQ ID NO : 1, ladite protéine Aurora A mutée, assurant de manière identique les mêmes fonctions cellulaires que celles assurées par ladite protéine kinase Aurora A sauvage dont elle dérive, et possédant :
- au moins une substitution de l'acide aminé Leucine situé en position 210 ou équivalente, par rapport à la séquence SEQ ID NO : 1 , par un acide aminé naturel ou non naturel différent de la leucine, et
- une activité kinase pouvant être inhibée complètement ou partiellement en présence d'un composé inhibiteur analogue de ΑΤΡ, ledit composé inhibiteur analogue de PATP étant inactif vis-à-vis de la protéine kinase Aurora A sauvage dont dérive ladite protéine Aurora A mutée.
Dans l'invention, les pourcentages d'identité donnés, c'est-à-dire « au moins 80% » et « de préférence au moins 90% », correspondent aux pourcentages d'acides aminés de la séquence complète SEQ ID NO : 1 qui sont identiques dans la séquence de la protéine Aurora A complète.
Un autre aspect de l'invention concerne un acide nucléique codant la protéine mutée définie ci-dessus. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique défini ci-dessus possédant des mutations silencieuses par rapport à la séquence de l'acide nucléique codant la protéine Aurora A dont dérive la protéine mutée.
L'introduction de mutations silencieuses dans la séquence nucléotidique codant la protéine Aurora A mutée permet de rendre l'expression de celle-ci, dans une cellule, insensible à une interférence ARN qui a pour cible la protéine Aurora A endogène.
A titre d'exemple et de manière non limitative, les Inventeurs ont remplacé le motif CCTGTCTTACTGT, entre les positions 729 et 741, dans la séquence SEQ ID NO : 12 par le motif ACTATC AT ATTGC, pour obtenir la séquence SEQ ID NO : 21.
Les deux séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 21 codent donc la même protéine Aurora A mutée SEQ ID NO : 11, mais la séquence SEQ ID NO : 21 n'est pas sensible à un ARN interférant ayant le motif ACTATCATATTGC et visant la protéine endogène, contrairement à la séquence SEQ ID NO : 12.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique défini ci-dessus correspondant à la séquence SEQ ID NO : 12, 14, 16, 18, 20 ou 21.
Un autre aspect de l'invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique défini ci-dessus. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, ledit vecteur d'expression correspondant à la séquence SEQ ID NO : 22.
Un autre aspect de l'invention concerne aussi une cellule exprimant la protéine Aurora A mutée définie ci-dessus.
Un autre aspect de l'invention concerne également l'utilisation in vitro, ex vivo ou in vivo d'une protéine mutée définie ci-dessus, comme outil de recherche pour déterminer l'effet inhibiteur d'une molécule chimique vis-à-vis d'une protéine kinase Aurora A possédant au moins 80 % de similarité de préférence au moins 90 %, avec la séquence SEQ ID NO : 1.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne également l'utilisation in vitro, ex vivo ou in vivo d'une protéine mutée définie ci-dessus, comme outil de recherche pour déterminer l'effet inhibiteur d'une molécule chimique vis-à-vis d'une protéine kinase Aurora A possédant au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 90 %, avec la séquence SEQ ID NO : 1.
Différents inhibiteurs d'Aurora A avec une bonne efficacité in vitro sont maintenant disponibles. Cependant, il est important d'être prudent dans l'interprétation des résultats obtenus avec ces outils car l'environnement moléculaire de la kinase peut considérablement modifier l'activité et la sensibilité de la kinase vis-à-vis de molécules inhibitrices. Par exemple, la fixation de TPX2 à Aurora A réduit fortement l'effet d'inhibiteurs chimiques sur Aurora A (Anderson et al. 2007. Biochemistry. 46: 10287-10295). Les laboratoires Millenium ont par exemple identifié la molécule MLN8054 comme un inhibiteur intéressant. Cependant, cette drogue est plus de 40 fois moins sélective pour Aurora A que pour Aurora B in vitro, une inhibition importante d'Aurora A nécessite 1 μΜ de MLN8054 : une concentration qui affecte également Aurora B (Manfredi et al. 2007. Proc Natl Acad Sci USA. 104 :4106-41 11).
En conséquence, il est compliqué d'interpréter les résultats d'inhibition d'Aurora A par de telles molécules à cause de l'inliibition d'Aurora B (Taylor et Peters. 2008. Curr Opin Cell Biol. 20 : 77-84).
Un problème avec ce type d'approche est l'absence de contrôle négatif pour identifier les effets collatéraux. Une étude récente a tenté de résoudre ce problème en mutant Aurora A pour empêcher l'inhibition par MLN8054 ou son analogue proche MLN8237. Bien que cette étude suggère fortement que la cible principale de ces molécules est Aurora A, ces mutants ne sont que partiellement sensibles aux drogues, de telle sorte qu'ils ne sont pas satisfaisants en biologie cellulaire (Sloane et al. 2010. ACS Chem Biol. 5 : 563-576).
La protéine mutée selon l'invention présente l'avantage de permettre une inhibition forte, rapide et spécifique d'Aurora A. En conséquence, la protéine mutée constitue un vrai contrôle négatif permettant de déterminer si les effets observés par le traitement avec une molécule chimique résultent ou non de l'inhibition d'Aurora A. La protéine mutée selon l'invention représente donc un outil de recherche puissant pour étudier les fonctions d'Aurora A.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle :
un premier échantillon comprenant des cellules exprimant ladite protéine kinase Aurora A en présence de ladite molécule chimique, et un second échantillon comprenant des cellules exprimant ladite protéine mutée, mais n'exprimant pas ladite protéine kinase Aurora A, en présence d'un inhibiteur de l'activité kinase,
sont comparés l'un à l'autre,
ledit second échantillon étant représentatif d'une inhibition spécifique de l'activité kinase de ladite protéine Aurora A.
La kinase Aurora A a un rôle central dans la mitose et est fréquemment surexprimée dans de nombreux types de tumeurs. En conséquence, son inhibition spécifique est une stratégie majeure pour combattre le cancer (Sloane et al. 2010. ACS Chem Biol. 5 : 563-576). De nouveaux médicaments sont donc nécessaires pour traiter les différentes variétés de cancers qui résistent à la chimiothérapie classique. Il est donc important d'identifier des inhibiteurs spécifiques d' Aurora A ou B qui peuvent être utilisés en chimiothérapie.
Dans ce contexte, la protéine Aurora A mutée peut être utilisée pour étudier la spécificité de molécules candidates et permettre de valider de nouvelles molécules pharmaceutiques . II est en effet très simple de l'utiliser comme témoin d'inhibition de la protéine Aurora A, et ainsi de déterminer, par comparaison avec les échantillons tests, si les phénotypes des cellules consécutifs au traitement avec une molécule chimique résultent ou non d'une inhibition de la protéine kinase Aurora A. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation selon la revendication définie ci-dessus dans laquelle l'échantillon correspondant aux cellules exprimant la protéine Aurora A mutée est utilisée comme témoin de comparaison pour mesurer la spécificité d'un inhibiteur de la protéine Aurora A sauvage. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle une activité kinase est mesurée dans les deux échantillons. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle ladite activité kinase correspond à la phosphorylation d'une protéine substrat choisie parmi le groupe consistant en : PLK-1, P150 Glued, TACC, CRMP-1, MKLP-1, Eg5, TPX2, P53, CDC25, Histone H3 et NIMA.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle la prolifération cellulaire est mesurée dans les deux échantillons.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle lesdites cellules sont observées par microscopie dans les deux échantillons.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation définie ci-dessus dans laquelle ladite molécule chimique est une molécule à visée anticancéreuse. Un autre aspect de l'invention concerne un kit comprenant une protéine mutée définie ci-dessus et un composé inhibiteur.
Les figures et les exemples suivants illustreront mieux l'invention, sans pour autant en limiter sa portée.
LEGENDES DES FIGURES Figure 1
La protéine Aurora A mutée (as-AurA) conserve son activité Idnase in vitro et se comporte comme wt-AurA quand elle est exprimée dans les cellules U20S.
(A) 0,5 pmoles de chaque protéine Aurora A sauvage et Aurora A mutée sont incubées avec 20 pmoles deTPX2 et les quantités indiquées de 1-Na-PPl . La phosphorylation du TPX2 (TPX2*) est examinée par autoradiographie (haut), et la présence de TPX2 et Aurora A est examinée par coloration au bleu de Coomassie (centre) et par Western blot (bas).
(B) La structure chimique de l'inhibiteur spécifique de as-AurA : le 1-NA-PP1. (C) Séquence nucléotidique de la région promotrice de 189 à +311 de Aurora A . Les sites putatifs de fixation des facteurs de transcription sont soulignés. Le site d'initiation majeur (cercle) est désigné +1.
(D) Western blot montrant l'expression de GFP-as-AurA et de Aurora A endogène dans les cellules U20S cells. Chaque ligne correspond à un point de cinétique (en heures) après libération du double bloque thymidine. La béta-Tubuline sert de contrôle de charge.
(E) Microscopie par Immuno-Fluorescence des cellules as-AurA à chaque phase de la mitose. Les encarts montrent un agrandissement de la région des centrosomes. Les barres d'échelle font 10 μηι.
(F) Les lysats protéiques préparés à partir de cellules contrôles U20S et de cellules AS- AurA, dans lesquelles Aurora A endogène a été retirée ou non, sont marquées avec des anticorps anti-Aurora A (haut) et des anti-béta-tubuline (bas) Figure 2
La protéine mutée Aurora A (as-AurA) est complètement fonctionnelle in vivo dans des cellules en cultures et est efficacement inhibée par le 1-Na-PPl.
(A) Microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules U20S contrôles ou dépourvues d'Aurora A endogène (Si AurA) en métaphase. Les barres d'échelle représentent 5 μιη. (B) Histogramme présentant le pourcentage de cellules avec des pôles de fuseau fragmentés ou multiples. Les valeurs représentent 3 expériences indépendantes; 100 cellules sont comptées dans chaque expérience.
(C) Histogramme représentant le pourcentage de cellules avec des pôles de fuseau fragmentés ou multiples, en fonction de la concentration de 1-Na-PPl, dans des cellules WT-AurA or AS-AurA dépourvues en Aurora A endogène. Les valeurs représentent 3 expériences indépendantes; 100 cellules sont comptées dans chaque expérience.
(D) Microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules WT-AurA ou AS-AurA dépourvues d'Aurora A endogène traitées pendant 24 heures avec 10 μΜ de 1-Na-PPl . Les cellules sont marquées avec des anticorps anti-PLKl (haut) ou anti-T210 P-PLK1. Les encarts montrent des agrandissements des régions des centrosomes. Les barres d'échelle représentent 7 μηι.
(E) Histogramme représentant l'intensité du marquage de PLKl aux centrosomes en pourcentages, rapportés au contrôle (WT-AurA + 1-Na-PPl). (F) Histogramme présentant l'intensité du marquage T210 P-PLK1 aux centrosomes, en pourcentages, rapportés au contrôle (WT-AurA + 1-Na-PPl). Les valeurs représentent 3 expériences indépendantes; 20 cellules sont comptées dans chaque expérience. Les barres d'erreur représentent les déviations standard.
Figure 3
L'inhibition de Aurora A à l'entrée de l'anaphase entraîne des défauts de l'assemblage du fuseau central.
(A) Images de microscopie à intervalles réguliers montrant les phases tardives de mitose dans des cellules WT-AurA et AS-AurA déplétées en Aurora A endogène et traitées avec 10 mM 1 -Na-PPl . Le temps est donné en minutes. Les deux flèches indiquent les lots de chromosomes qui se séparent. Les flèches doubles indiquent la distance mesurée et reportée en B. Les barres d'échelle représentent 10 μηι.
(B) Graphique montrant l'évolution de distance (in microns) entre les deux lots de chromosomes des cellules WT-AurA and AS-AurA présentés en A. Chaque courbe est l'enregistrement d'une expérience représentant 13 et 9 expériences, respectivement.
(C) Images à intervalles réguliers de microscopie à Fluorescence et par contraste interférentiel différentiel (DIC) montrant des phases tardives de mitose de cellules WT- AurA et AS-AurA exprimant la GFP-tubuline, dépourvues de Aurora-A endogène et traitées avec 10 μΜ 1-Na-PPl . Les deux flèches indiquent les deux groupes de chromosomes qui se séparent. Le temps est donné en minutes. Les barres d'échelle représentent 10 μιη.
(D) Microscopie à Immuno-Fluorescence de cellules WT-AurA et AS-AurA dépourvues en Aurora A endogène et traitées avec 10 μΜ 1-Na-PPl à l'entrée en anaphase. La flèche montre la désorganisation des microtubules dans le fuseau central.
Figure 4
L'inhibition de Aurora A à l'entrée de l'anaphase entraîne une mauvaise localisation de MKLP1 et une accumulation de P150Glued aux pôles du fuseau. (A) Microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules WT-AurA et AS-AurA dépourvues d'Aurora A endogène et traitées avec 10 μΜ de 1-Na-PPl à l'entrée de l'anaphase. La barre d'échelle représente 10 μιη. (B) Histogramme représentant le pourcentage de cellules avec une mauvaise localisation de MKLP1 ou de P150Glued dans les cellules WT- et AS-AurA montrées en A. Les valeurs sont des moyennes de 3 expériences indépendantes; 30 cellules sont comptées dans chaque expérience. Les barres d'erreurs représentent les déviations standard.
(C) Western blot montrant l'absence de P150Glued dans les cellules U20S. siRNA Luciferase sert de contrôle négatif. La béta-tubuline sert de contrôle de charge.
(D) Microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules dépourvues de P150Glued par siRNA pendant 24 heures. Les barres d'échelle représentent 10 μιη.
Figure 5
P150Glued est phosphorylée par Aurora A sur la Ser 19 in vitro.
(A) 50 pmoles de MBD de P150Glued (MBD) sont incubés avec 20 pmoles de protéines wt-AurA ou as-AurA. La phosphorylation de MBD (MBD*) est observée par autoradiographie (bas), et la présence de MBD et AurA est observée par coloration au bleu de Coomassie (haut). La flèche indique la place de MBD sur l'autoradiographie. Le nombre sous la figure représente le taux de phosphorylation dans le premier, le troisième et la quatrième puits en comparaison au troisième puits.
(B) Microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules montrant la localisation de P150Glued endo gène (haut) et HA-P150Glued (bas, expression de HA-P150Glued dans des cellules exprimant P150Glued endogène) dans les phases tardives de la mitose. Les flèches blanches montrent les pôles de fuseaux mitotiques dans des cellules en anaphase ou télophase sans accumulation de HA-P150Glued, alors que les flèches noires indiquent une accumulation de HA-P150Glued dans des cellules AS-AurA dépourvues d'Aurora A endogène et traitées avec 10 μΜ 1-Na-PPl à l'entrée de l'anaphase. Les barres d'échelle représentent 10 μιη.
Figure 6
La phosphorylation par Aurora A de la Serine 19 (Ser 19) de PlSOGIued est requise pour l'assemblage du fuseau central.
(A) Images de microscopie par Immuno-Fluorescence de cellules montrant la localisation de HA-P150Glued S19A (haut) ou HA-P150Glued S19D (bas) pendant l'interphase, la métaphase ou l'anaphase. Les flèches blanches montrent les pôles du fuseau mitotique dans des cellules en anaphase, télophase sans accumulation de HA- P150Glued, alors que les flèches noires indiquent une accumulation de HA-P150Glued. Les barres d'échelles représentent 5 μηι.
(B) Western blot montrant l'absence de Aurora A endogène des cellules exprimant le mutant S 19 de P150Glued. La coloration Ponceau sert de contrôle de charge.
(C) Histogramme représentant le pourcentage de cellules avec des défauts d'assemblage du fuseau central. Les valeurs sont des moyennes de 3 expériences indépendantes; 50 cellules sont comptées à chaque expérience.
(D) Histogramme représentant le pourcentage de cellules avec accumulation de P150Glued aux pôles du fuseau. Les valeurs sont des moyennes de 3 expériences indépendantes; 50 cellules sont comptées pour chaque expérience. Les barres d'erreur représentent les déviations standard.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Production d'une kinase Aurora A mutée (ou as-AurA, analogue sensitive AurA).
Pour produire un variant d'Aurora A avec une sensibilité augmentée vis-à-vis d'analogues de l'ATP, nous avons modifié la spécificité de la poche de fixation de l'ATP en remplaçant un acide aminé avec une chaîne latérale volumineuse (l'acide aminé gardien ou gatekeeper) par un résidu alanine.
A partir de la structure cristalline, le résidu gatekeeper a été identifié comme correspondant à l'acide aminé Leucine en position 210. Une construction génétique a été produite codant un mutant L210A. Cette protéine Aurora A mutée est également dénommée as-AurA. In vitro, la protéine recombinante as-AurA est aussi active que la protéine Aurora A sauvage (dénommée wt-AurA) et est toujours capable de phosphoryler TPX2, un substrat connu de Aurora A (Figure 1 A).
Nous avons ensuite recherché et testé des analogues de l'ATP comme inhibiteurs adéquats de as-AurA. Le 1-Naphtyl-PPl (1-Na-PPl, Figue 1B) est l'un des plus puissants inhibiteurs d'as-AurA et n'a pas d'effet sur wt-AurA : à 10 μΜ, le 1-Na-PPl inhibe complètement l'activité d'as-AurA mais n'a pas d'effet sur l'activité de wt-AurA (Figure 1A). EXEMPLE 2 : Clonage du promoteur d'Aurora A et caractérisation de l'expression de wt-AurA et de as-AurA dans les cellules humaines U2QS.
Pour étudier l'effet de l'inhibition spécifique de l'as- AurA par le 1-Na-PPl durant la mitose, les allèles wt-AurA et as-AurA ont besoin d'être exprimés à un niveau physiologique.
Toutefois, la sur-expression d'Aurora A à partir du promoteur CMV conduit à des caractéristiques non physiologiques durant la division cellulaire et même à la mort cellulaire (Anand et al. 2003. Cancer Cell. 3 : 51-62 ; Dutertre et al. 2004. J Cell Sci. 1 1 1 : 2523-2531 ; Goepfert et al. 2002. Cancer Res. 62 : 41 15-4122).
En conséquence, nous avons utilisé la région minimale de régulation de la transcription d'Aurora A décrite par Tanaka et al. (2002. J Biol Chem. 277 : 10719-10726) (Figure 1C). Ce fragment d'ADN a été amplifié par PCR et ajouté en amont des gènes codant wt-AurA ou as-AurA (fusionné à la séquence codant la GFP) dans un plasmide peGFP- Cl , remplaçant le promoteur CMV.
Les cellules U20S ont été transfectées avec ces constructions, et les niveaux d'expression de Aurora A, GFP- wt- AurA et GFP-as-AurA ont été déterminés durant le cycle cellulaire dans des cellules synchronisées.
Bien que le niveau d'expression de GFP-as-AurA est légèrement plus faible que celui de la protéine Aurora A endogène, les cinétiques d'accumulation dans la cellule sont similaires : les niveaux sont bas entre 0 et 4 heures après la sortie du double blocage par thymidine, correspondant à la phase S, ils augmentent entre 8 et 12 heures après la sortie, durant les phases G2/M, et ensuite reviennent au niveau basai (Figure 1D).
Nous avons déterminé la localisation cellulaire de l'as-AurA (Figure 1E) : la GFP-as- AurA est associée aux centrosomes durant la phase G2, elle est ensuite associée avec les centrosomes et le fuseau mitotique de la prophase à la télophase et avec le corps intermédiaire durant la télophase et la cytokinèse. Ce modèle est entièrement en accord celui décrit pour AUrora A (Marumoto et al. 2005. Nat Rev Cancer. 5 : 42-50).
Des mutations silencieuses ont ensuite été introduites dans les constructions wt-AurA et as-AurA afin de les rendre résistantes à l'ARN interférant utilisé pour empêcher l'expression de la protéine Aurora A endogène : la séquence ACTATCATATTGC, entre les positions 729 et 741, a été remplacée par CCTGTCTTACTGT. Nous avons ensuite produit des cellules U20S exprimant de manière stable les constructions GFP-wt-AurA (nommée WT-AurA) et GFP-as-AurA (nommée As- AurA). EXEMPLE 3 : Validation cellulaire de l'approche de chimie génétique
Tout d'abord, nous avons validé notre approche de chimie génétique.
Le fait d'empêcher l'expression de Aurora A par l'utilisation d'AR interférant ou par l'utilisation d'anticorps anti-Aurora A entraîne une amplification du centrosome conduisant à de multiples pôles du fuseau, ou à une fragmentation des pôles du fuseau (De Luca et al. 2008. Oncogene. 27 : 6539-6549 ; Marumoto et al. 2003. J Biol Chem. 278 :51786-51795).
Nous avons donc comparé l'effet d'une inhibition de l'expression d' Aurora A endogène par ARN interférant dans les cellules U20S et les cellules WT-AurA ou As-AurA avec ou sans traitement au 1-Na-PPl . L' Aurora A endogène est absente en raison de l'ARN interférant dans toutes les cellules U20S, WT-AurA et AS-AurA.
De manière intéressante, le niveau de protéines GFP-wt-AurA et de GFP-as-AurA a augmenté légèrement pour atteindre le niveau d'expression de l 'Aurora A endogène (Figure 1F et 6B).
Comme observé précédemment (Asteriti et al. 201 1. Mol Cancer. 10 : 131), l'absence d' Aurora A pendant 24 heures dans les cellules U20S conduit à l'apparition de cellules métaphasiques avec des pôles de fuseau multiples ou fragmentés (56 ± 7%, Figure 2 A et 2B).
L'absence d'Aurora A endogène dans les cellules WT-AurA ou As-AurA n'entraîne aucune augmentation significative des anomalies au niveau du pôle du fuseau mitotique (Figure 2B), montrant que la GFP-wt-AurA et la GFP-as-AurA complémente chacun efficacement l'absence de l'Aurora endogène.
Nous avons ensuite testé l'efficacité du 1-Na-PPl sur les cellules WT-AurA et AS- AurA dépourvues d'Aurora A endogène (Figure 2C). Le 1-Na-PPl (de 0,1 μΜ à 20 μΜ) n'a pas d'effet significatif sur les pôles du fuseau mitotique dans les cellules WT- AurA, mais il augmente de manière substantielle le pourcentage de pôles multiples ou fragmentés chez les cellules AS-AurA. L'effet maximum est atteint à 1-Na-PPl 10 μΜ. Cette concentration a été systématiquement utilisée pour les expériences présentées ensuite. Pour confirmer l'inhibition de la protéine mutée As-AurorA par le 1-Na-PPl in vivo, nous avons vérifié l'état de phosphorylation d'un substrat bien connu d'Aurora A, le résidu thréonine 210 (T210) de PLK1.
Il a été démontré que ce résidu est phosphorylé par Aurora A dans les centrosomes dans les cellules en phase G2 (Macurek et al. 2008. Nature. 455 : 1 19-123).
Les figures 2D (haut) et 2E montrent que le traitement des cellules WT-AurA ou AS- AurA dépourvues d'Aurora A endogène avec le 1 -Na-PPl pendant 24 heures ne modifie pas le niveau de PL 1 au niveau des centrosomes dans les cellules en phase G2. Par contre, la phosphorylation du résidu T210 est considérablement réduite dans les cellules AS-AurA en comparaison des cellules WT-AurA (Figure 2D (bas) et 2F), ce qui indique une forte inhibition de l'activité kinase d' AS-AurA par le 1 -Na-PPl .
EXEMPLE 4 : L'inhibition spécifique de l'activité d'Aurora A en début d'anaphase entraîne un défaut d'assemblage du fuseau central
Nous avons utilisé la microscopie vidéo à intervalle réguliers pour filmer la prolifération des cellules WT-AurA et AS-AurA dépourvues d'Aurora A endogène et traitées avec du 1 -Na-PPl 10 μΜ (Figure 3A).
L'ajout de 1 -Na-PPl pour contrôler les cellules WT-AurA au moment du démarrage de l'anaphase n'a aucun effet : les deux groupes de chromosomes se séparent et les cellules subissent une télophase et une cytokinèse normales (n=13).
Dans les cellules AS-AurA traitées avec du 1 -Na-PPl à l'anaphase, les chromosomes se séparent mais s'arrêtent rapidement, et les cellules ne subissent pas la télophase ou la cytokinèse, ce qui conduit à des cellules binuclées (60 ± 6 %, n = 9).
La distance entre les deux groupes de chromosomes augmente jusqu'à la fin de la télophase dans les cellules WT-AurA contrôles, mais s'arrête rapidement d'augmenter dans les cellules AS-AurA, ce qui indique une probable anomalie en anaphase B (Figure 3B).
Durant l'anaphase A, le mouvement des chromosomes dans les cellules HeLa est généré par des forces de traction dues à la dépolarisation des microtubules du kinétochore. En anaphase B, les pôles du fuseau se séparent plus encore par l'action des microtubules du corps intermédiaire qui grandissent par polymérisation à leurs extrémités plus, tandis que les protéines motrices transversales migrent vers les extrémités plus, repoussant ainsi les microtubules polaires se chevauchant les uns sur les autres et les pôles du fuseau séparés de plus en plus. Cet événement nécessite un fuseau central fonctionnel, nous avons donc étudié l'assemblage du fuseau central dans le contexte d'une inhibition d'Aurora A.
Nous avons généré des cellules WT-AurA et AS-AurA exprimant la GFP-tubuline de manière stable et nous les avons filmées avec un microscope vidéo con-focal. Comme décrit précédemment, les cellules ont d'abord été dépourvues d'Aurora A endogène et ensuite traitées avec du 1 -Na-PPl en début d'anaphase (Figure 3C).
Les fuseaux centraux se forment normalement dans les cellules WT-AurA, mais pas dans les cellules AS-AurA, ce qui implique une activité d'Aurora A dans l'assemblage du fuseau central.
De manière intéressante, l'ajout de 1-Na-PPl dans les cellules AS-AurA déjà engagées en anaphase B (avec les premiers microtubules du fuseau central qui grandissent) ne perturbe pas l'assemblage du fuseau. Pour mieux caractériser ce phénotype de manière morphologique et statistique, nous avons synchronisé les cellules en anaphase et les avons observées par immunofluorescence (IF). Pour cela, les cellules WT-AurA ou AS- AurA dépourvues d'Aurora A endogène ont été bloquées en fin de G2 par ajout de l'inhibiteur de CDK1 , RO 3306 (Vassilev. 2006. Cell Cycle. 5 : 2555-2556), et relâchées en mitose par lavage avec du milieu frais. Une fois la majorité des cellules entrées en tout début d'anaphase (75 minutes), celles-ci ont été traitées avec du 1-Na- PPl . Douze minutes après la transition de la métaphase à l'anaphase, les cellules WT- AurA sont entrées en télophase, tandis que les cellules AS-AurA ont présenté des anomalies substantielles concernant l'assemblage du fuseau central (Figure 3 A et 3C). Nous avons donc bloqué les cellules à ce point précis et analysé l'état anaphase/télophase par infrarouge. La figure 3D montre que l'inhibition d'Aurora A en début d'anaphase entraîne des défauts substantiels dans l'assemblage du fuseau central (42 ± 6% dans les cellules AS-AurA en comparaison avec 10 ± 3% pour les cellules WT-AurA contrôles, similaires aux cellules U20S non traitées). Parmi les cellules présentant ce phénotype, 45% ont montré une désorganisation importante du fuseau central et 55 % une absence totale de fuseau central.
Dans celles ayant des fuseaux désorganisés, quelques microtubules sont présents et les microtubules du corps intermédiaire ne sont pas transversaux pour former un fuseau central fonctionnel (Figure 3D, comparer i et ii avec iii). Dans les cellules sans fuseau central, les deux groupes de chromosomes apparaissent très proches l'un de l'autre et mal orientés (Figure 3D, iv). Nous n'avons pas noté la présence de cellules avec des chromosomes retardataires. EXEMPLE 5 : L'inhibition d'Aurora A en début d'anaphase altère fortement la localisation de MKLPl et de P150Glued
L'assemblage du fuseau central est un processus complexe impliquant différentes molécules avec des fonctions très spécifiques.
Le « Centralspindlin complex », très conservé en ternies d'évolution, est central dans ce processus. Il est composé d'une protéine kinésine 6 orientée plus, appelée MKLPl chez les mammifères et protéine kinesin-like Pavarotti (Pav-KLP) chez la drosophile, et une protéine de type Rho activatrice de la GTPase (GAP), nommée RacGAPl chez les mammifères et RacGAP50C chez la drosophile (Adams et al. 1998. Gènes Dev. 12 : 1483-1494 ; Hirose et al. 2001. J Biol Chem. 276 : 5821-5828 ; Mishima et al. 2002. Dev Cell. 2 : 41-54).
La localisation correcte du Centralspindlin chez la drosophile dépend du complexe de la dynactine et le retrait de la sous-unité dynactine de la P150Glued par ARN interférant dans les cellules S2 de drosophile perturbe la localisation de Pav-KLP et l'organisation du fuseau central (Delcros et al. 2006. J Cell Sci. 1 19 : 4431-4441).
P150Glued est une protéine associée aux microtubules qui se lie à la dynéine (Vaughan et Vallée. 1995. J Cell Biol. 131 : 1507-1516) et est impliquée dans le transport bidirectionnel de cargo le long des microtubules (Deacon et al. 2003. J Cell Biol. 160 : 297-301).
Récemment, il a été démontré que le domaine de fixation aux microtubules (MBD) de PI 50 chez la drosophile est phosphorylé par Aurora A pendant la prométaphase. Cet événement est nécessaire pour que P150Glued soit relâchée des microtubules mitotiques et pour un assemblage correct du fuseau mitotique en métaphase.
Le retrait d'Aurora A par ARN interférant dans les cellules S2 ou cellules embryonnaires de drosophile déclenche l'accumulation de P150Glued aux pôles du fuseau (Rome et al. 2010. J Cell Biol. 189 : 651-659). Nous avons donc étudié la localisation cellulaire de P150Glued et MKLPl pendant l'anaphase/télophase en conditions d'inactivation d'Aurora A. Nous avons observé par infrarouge que l'inhibition de l'activité d'Aurora A en début d'anaphase déclenche une mauvaise localisation de MKLP1 et l'accumulation de P150Glued aux pôles du fuseau mitotique (55 ± 8 % et 77 ± 5% respectivement, figure 4A et 4B).
De manière intéressante, l'absence de P150Glued par ARN interférant déclenche l'apparition de cellules présentant un fort défaut d'assemblage du fuseau central(Figures 4 C et D).
Nous avons également testé l'effet d'une inhibition d'Aurora B car il a été démontré que cette kinase est impliquée dans l'organisation du fuseau central à travers le recrutement de facteurs d'empaquetage tels que Pav-KLP (Giet et Glover. 2001. J Cell Biol. 152 : 669-682 ; Glotzer. 2009. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 : 9-20) et dans la ségrégation des chromosomes en collaboration avec Aurora A (Hegarat et al. 201 1. J Cell Biol. 195 : 1 103-1 1 13). Comme décrit plus haut, nous avons traité les cellules du RO3306 et les avons relâchées en mitose tardive après lavages. Une fois une majorité des cellules entrées en anaphase, celles-ci ont été traitées avec du ZM447439 3 μΜ.
Bien que l'inhibition d'Aurora B à ce moment précis ait déclenché l'apparition de chromosomes retardataires et une désorganisation du fuseau central, nous n'avons pu détecter aucune accumulation de P150Glued aux pôles du fuseau, ni aucune cellule sans microtubule dans le corps intermédiaire.
EXEMPLE 6 : La phosphorylation du résidu Serine 19 de la P150Glued est nécessaire pour l'assemblage du fuseau central.
Chez la drosophile, huit sérines dans le MBD de P150Glued sont phosphorylées par Aurora A (Romé et al. 2010. J Cell Biol. 189 : 651-659), mais ces huit sérines ne sont pas conservées chez l'Homme. Pour identifier les résidus qui sont phosphorylés par Aurora A chez la P150Glued humaine, nous avons réalisé une Aurora A et un MBD de P150Glued recombinants (acides aminés 1 à 213).
Nous avons utilisé une analyse phosphoprotéomique pour déterminer quels résidus de MBD sont phosphorylés par Aurora A in vitro. Nous avons obtenu plus de 85% de couverture de séquence avec des analyses MS/MS, et ainsi identifié le résidu sérine 19 (Serl9) comme étant le seul résidu du MBD phosphorylé par Aurora A.
Pour confirmer ce résultat, nous avons généré un MBD mutant S19A (l'alanine ne peut pas être phosphorylée) et réalisé des tests de phosphorylation in vitro (Figure 5A). Le MBD de P150Glued contrôle a été phosphorylé par Aurora A, et la mutation S 19A a fortement éliminé la phoshorylation du MBD : le signal 32P est six fois plus faible dans le mutant S19A en comparaison avec le contrôle. Ceci confirme que le résidu S19 du MBD de P150Glued est phosphorylé directement par Aurora A in vitro.
Pour vérifier l'effet de la phosphorylation de S 19 de P150Glued sur l'assemblage du fuseau central, nous avons construit des mutants sauvage et S19 (S19A ne peut pas être phosphorylé, et S19D représente une sérine phosphorylée de manière constitutive) de la protéine complète P150Glued-HAtag (HA-P150Glued) dans les cellules U20S.
HA-P150Glued est localisée sur les microtubules de manière similaire à la protéine endogène (Figure 5B, haut et bas comparés).
L'inhibition d' Aurora A conduit à une accumulation de HA-P150Glued aux pôles du fuseau en anaphase/télophase et à des anomalies dans l'assemblage du fuseau central (Figures 5B (bas), 6C et 6D).
Les localisations des mutants S 19A et S19D sont significativement différentes. Le mutant S19A s'accumule fortement sur les microtubules de l'interphase et sur les pôles du fuseau en métaphase et anaphase (Figures 6A (haut) et 6C).
Contrairement à S 19A, la fixation de S19D aux microtubules est fortement réduite en interphase et nous n'avons pu détecter aucune accumulation de S19D aux pôles du fuseau en métaphase ou anaphase (Figures 6 A (bas) et 6D).
De manière intéressante, si l'expression du mutant S19D n'a pas déclenché d'anomalie d'organisation du fuseau central, celle de S19A a été associée à une forte augmentation du pourcentage de cellules présentant des anomalies du fuseau central (54 ± 3%, Figures 6A et 6C).
Pour confirmer que la phosphorylation de S 19 par Aurora A est nécessaire pour un assemblage normal du fuseau central, nous avons testé si l'expression du mutant S19D est capable de corriger l'inhibition d'Aurora A. Les cellules AS-AurA ont été dépourvues d'Aurora A pendant 24, et ensuite transfectées avec des plasmides codant la P150Glued sauvage ou S19D. Après 24 heures, les cellules ont été synchronisées en début d'anaphase avec du RO3306, traitées avec du 1-Na-PPl pendant 12 minutes et ensuite bloquées. Nous avons d'abord vérifié l'absence complète d'Aurora A endogène et vérifié que les protéines HA-P150Glued sont correctement produites quand du 1-Na- PP1 est ajouté (Figure 6B). Nous avons ensuite quantifié les cellules en anaphase/télophase présentant des défauts d'assemblage du fuseau central ou une accumulation de HA-P150Glued aux pôles du fuseau (Figure 6C et D).
Le pourcentage de cellules en anaphase présentant des défauts d'assemblage du fuseau central ou une accumulation de HA-P150Glued aux pôles du fuseau a été significativement réduit par l'expression de HA-P150Glued S19D mais pas par l'expression de HA-P150Glued sauvage.
Ceci confirme que le mutant mimant la HA-P150Glued phosphorylée (c'est-à-dire le mutant S19D) est capable de corriger l'inhibition d'Aurora A, au moins partiellement.
EXEMPLE 7 : Matériels et Méthodes
Constructions génétiques et purification des protéines
Pour la purification des protéines recombinantes, les ADNc d'Aurora A et de PI 50 Glued correspondant au domaine de fixation du microtubule ont été insérés dans le vecteur pET29. Les mutants Aurora A (L210A) et PI 50 Glued (S19A, S 19D) ont été réalisés en utilisant le kit de mutagénèse QuickChange (Stratage). Aurora A a été retirée des cellules U20S de la manière décrite dans l'article de Reboutier et al. (2012. J Cell Biol. 197 : 19-26). En bref, les cellules ont été transfectées pendant 24 heures en utilisant un Jetprime (Polyplus transfection), selon les recommandations du fabriquant, avec un oligonucléotide d'ARN interférant correspondant à la séquence : AUGCCCUGUCUUACUGUCA. L'absence de protéine Aurora A endogène a été systématiquement vérifiée par western blot dans chaque expérience. L'ADNc correspondant à la protéine AurA sauvage et à la protéine aurora A mutée a été inséré dans un vecteur pEGFP-Cl sous le contrôle de la séquence du promoteur d'Aurora A pour contrôler les niveaux physiologiques d'expression. PI 50 glued sauvage et les séquences mutantes ont été insérées dans un vecteur pCDNA 3.1. Pour la production des protéines recombinantes, des souches d'Escherïchia coli BL21 ont été transformées avec des plasmides, induites par 1 mM d'IPTG pendant 4 heures, culottées et congelées à -80°C. Les protéines marquées par His-Tag (Aurora A humaine, TPX2) ont été purifiées selon le protocole décrit dans Roghi et al. (1998. J Cell Sci. 1 11(5) : 557-772. Les culots bactériens ont été lysés et chargés sur des billes Talon® (Talon Beads, ClonTech), les échantillons ont été lavés et les protéines ont été éluées avec du tampon contenant 50 mM d'imidazole. Les protéines purifiées ont été conservées à -80°C ou dans du glycérol 50% à -20°C.
Culture cellulaire, synchronisation et transfection
Les cellules humaines U20S ont été cultivées dans du Milieu de Me Coy avec de la pénicilline et de la streptomycine (Invitrogen), et 10 % d'albumine de veau fœtal (PAA). Les cellules ont été transfectées dans un milieu de culture en utilisant le kit de transfection JetPrime (Polyplus Transfection) selon les instructions du vendeur. Le milieu a été changé après 24 heures. Pour la synchronisation anaphase/télophase, les cellules ont été stoppées en phase G2 par un traitement de 16 heures avec 10 μΜ de R0336 (Calbiochem) et ensuite lavées trois fois pendant 30 secondes avec du milieu préchauffé. Les premières cellules entrent en anaphase approximativement 1 heure après le premier lavage. Immunofluorescence
Les cellules ont été d'abord déposées sur des plaques en verre, fixées avec du méthanol à -20°C pendant 10 min (ou avec du paraformaldéhyde 4% pendant 10 minutes pour l'observation de la GFP), et ensuite lavées trois fois dans du PBS et saturées avec du PBS-BSA 1 % pendant 1 heure à température ambiante. Des anticorps dans du PBS- BSA 1% ont été ajoutés sur les cellules : anti α-Tubuline de rat 1 : 1000 (clone YL1/2, Millipore), anti-gamma-tubuline de souris 1 : 1000 (clone GTU88, Sigma), anti-Aurora A de souris (clone 35C11 :20) (Cremet et al, 2003), anti-MKLPl de lapin 1 : 1000 (Santa-Cruz), anti-P150Glued de souris (BD Transduction Laboratories), anti-HA 1/1000 de souris (Covance), anti-PLKl de souris (Abcam), anti-T210 P-PLK1 de souris (BD Pharmingen). Les cellules ont été incubées avec les anticorps durant une nuit à 4°C, et ensuite lavées trois fois et incubées dans le noir avec des anticorps secondaires (anti-souris, anti-lapin 488 ou 55 1 : 1000, Alexa, Invitrogen) pendant 1 heure à température ambiante. Après trois derniers lavages avec du PBS, les plaques ont été préparées avec du Prolongold (Invitrogen) avec 1 μg/ml de DAPI (Sigma). Les cellules ont été examinées en utilisant un microscope à fluorescence LEICA DMRXA2 avec un objectif 63X à immersion dans l'huile, et les images ont été traitées en utilisant le logiciel Metamorph (Uni versai Imaging). Visualisation des cellules vivantes
Les cellules ont été cultivées dans des plaques cloisonnées Lab Tek I (Nunc). Avant la microscopie, le milieu a été remplacé par du milieu indépendant en C0 complété avec 10% de FBS et 200 mM de L-glutamine (Invitrogen). Pour le traitement avec le 1-Na- PP1 , nous avons sélectionné les cellules métaphasiques, nous avons attendu que celles- ci entrent en anaphase, et ensuite nous avons ajouté immédiatement le 1 -Na-PPl . Des images à intervalles réguliers ont été obtenues en utilisant un objectif Plan Apo 60x/1.4 NA avec un microscope (Nikon) équipé d'un disque tournant (CSU-X1 ; Yokogawa), une chambre thermostatique (Life Imaging Service), une plateforme Z Piezo Stage (Marzhauser), et un dispositif de caméra à couplage de charge (CoolSnap HQ2, Roper Scientific). Le logiciel Metamorph (Universal imaging) a été utilisé pour collecter les données. Des prises de vue ont été enregistrées à chaque minute. Les images sont des projections maximales de 20 plans Z séparés par 0,6 mm. Les données à intervalles réguliers ont été traitées par le logiciel Metamorph.
Analyses Western Blot
Les cellules ont été lysées dans du tampon RIPA contenant de l'anti-protéase (Complète, Roche) et les lysats ont été clarifiés par centrifugation (13000 rpm, 30 min, 4°C). Les protéines ont été dosées par la méthode Bradford (Bradford Assay) (BioRad). Des quantités égales de lysats de protéines dans du tampon Laemmli ont été déterminées par SDS-PAGE 12,5%, et transférées sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées pendant 1 heure à température ambiante avec du TBST avec 4% de lait, et incubées ensuite pendant la nuit avec les anticorps suivants : anti-β- tubuline de souris 1 :2000 (Sigma), anti-Aurora A de souris (clone 35C1 1 : 100) (Cremet et al. 2003. Mol Cell Biochem. 243 : 123-131), anti-HA de souris (Covance). Les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires couplés à la HRP (Jackson) pendant 1 heure et la fixation de l'anticorps a été détectée par chimioluminescence améliorée (Pico ou Dura, Pierce). Mesures in vitro de la kinase
Des quantités déterminées de protéines recombinantes Aurora A, MBD et TPX2 ont été mélangées dans une solution de 50 mM de Tris HCL pH 7,5, 25 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,01% TritonX-100, 10 mM de MgC12. Ensuite, 100 μΜ d'ATP et 2 μϋϊ d'ATP [γ-32- P] ont été ajoutés et les mélanges réactionnels ont été incubés à 37°C pendant 10 minutes. Les réactions ont été stoppées par ajout du tampon Laemmli, et les échantillons ont été bouillis pendant 5 minutes, et analysés par SDS-PAGE 12,5%. Les gels ont été marqués au bleu de coomassie, fixés, séchés et autoradiographiés avec un Storm 840 (Molecular Dynamics).
Analyse par spectrométrie de masse
Les protéines purifiées ont été séparées par SDS-PAGE sur un gel 12% pré-fabriqué (NuPAGE, Invitrogen, Life Technologies, Saint Aubin, France). Le gel a été marqué en utilisant le réactif de marquage de gel EZBlue (Sigma- Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), et des morceaux de gel correspondant à P150Glued ont été démarqués et lavés avec une série de solutions d'acétonitrile (ACN) 100 mM NH4HCO3. Les protéines ont été réduites avec du DTT 65 mM pendant 15 minutes à 37°C et alkylées avec 135 mM d'iodoacétamide dans le noir à température ambiante. Les échantillons ont été lavés avec une série de solutions de ACN/100 mM NH4HCO3 et déshydratés avec de l'ACN 100%o. Les protéines ont été digérées pendant la nuit à 37°C avec 4 ng/μΐ de trypsine modifiée (Promega, Charbonnière-les-Bains, France) dans du NH4HCO3. Les produits protéolytiques ont été extraits du gel par incubations séquentielles dans du ACN/H20/HCOOH, 70:30:0,1 (v/v/v) et ACN 100%, puis concentrés dans un Speed Vac (Thermo Scientific, Courtaboeuf, France) à un volume final de 40 μΐ. Les peptides ont été analysés en utilisant un système de chromato graphie haute performance nanoflow (Dionex, LC Packings Ultimate 3000) connecté à un LTQ-OrbiTrap XL hybride (Thermo Scientific) équipé d'une source d'ions nanoelectrospray.

Claims

REVENDICATIONS
Protéine Aurora A mutée dérivée d'une protéine kinase Aurora A sauvage et dont la séquence possède au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 90 %, avec la séquence SEQ ID NO : 1 ,
ladite protéine Aurora A mutée, assurant de manière identique les mêmes fonctions cellulaires que celles assurées par ladite protéine kinase Aurora A sauvage dont elle dérive,
et possédant :
- au moins une substitution de l'acide aminé Leucine situé en position 210 ou équivalente, par rapport à la séquence SEQ ID NO : 1, par un acide aminé naturel ou non naturel différent de la leucine, et
- une activité kinase pouvant être inhibée complètement ou partiellement en présence d'un composé inhibiteur analogue de l'ATP, ledit composé inhibiteur analogue de l'ATP étant inactif vis-à-vis de la protéine kinase Aurora A sauvage dont dérive ladite protéine Aurora A mutée.
2. Protéine Aurora A mutée selon la revendication 1 , dans laquelle l'acide aminé en position 210 ou équivalente, par rapport à la SEQ ID NO : 1, est substitué par une alanine.
3. Protéine Aurora A mutée selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite protéine Aurora A mutée correspondant à la séquence SEQ ID NO : 11,
SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 17 ou SEQ ID NO : 19.
4. Protéine Aurora A mutée selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite activité kinase correspondant à la phosphorylation d'une protéine substrat choisie parmi le groupe consistant en : PL -1, P150 Glued, TACC, CRMP-1,
MKLP-1, Eg5, TPX2, P53, CDC25, Histone H3 et NIMA.
5. Protéine Aurora A mutée selon l'une quelconque des revendications, ledit composé inhibiteur analogue de l'ATP étant le 1-Na-PPl .
6. Acide nucléique codant la protéine Aurora A mutée telle que définie selon l'une quelconque des revendications précédentes.
7. Acide nucléique selon la revendication 6, ledit acide nucléique possédant des mutations silencieuses par rapport à la séquence de l'acide nucléique codant la protéine Aurora A sauvage dont dérive la protéine Aurora A mutée.
8. Acide nucléique selon la revendication 6 ou 7, ledit acide nucléique correspondant à la séquence SEQ ID NO : 12, 14, 16, 18, 20 ou 21.
9. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini selon l'une des revendications 6 ou 8.
10. Cellule exprimant la protéine Aurora A mutée telle que définie dans les revendications 1 à 5.
11. Utilisation in vitro ou ex vivo d'une protéine Aurora A mutée telle que définie selon une des revendications 1 à 5 comme outil de recherche pour déterminer l'effet inhibiteur d'une molécule chimique vis-à-vis d'une protéine kinase Aurora A sauvage possédant au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 90 %, avec la séquence SEQ ID NO : 1.
12. Utilisation selon la revendication précédente dans laquelle :
- un premier échantillon comprenant des cellules exprimant ladite protéine kinase Aurora A sauvage en présence de ladite molécule chimique, et
- un second échantillon comprenant des cellules exprimant ladite protéine Aurora A mutée, mais n'exprimant pas ladite protéine kinase Aurora A sauvage, en présence d'un inhibiteur de l'activité kinase analogue de ΓΑΤΡ,
sont comparés l'un à l'autre,
ledit second échantillon étant représentatif d'une inhibition spécifique l'activité kinase de ladite protéine Aurora A sauvage.
13. Utilisation selon la revendication 12 dans laquelle l'échantillon correspondant aux cellules exprimant la protéine Aurora A mutée est utilisée comme témoin de comparaison pour mesurer la spécificité d'un inhibiteur de la protéine Aurora A sauvage.
14. Utilisation selon l'une des revendications 12 à 13 dans laquelle une activité kinase est mesurée dans les deux échantillons.
15. Utilisation selon la revendication 14, dans laquelle ladite activité kinase correspond à la phosphorylation d'une protéine substrat choisie parmi le groupe consistant en : PLK-1, P150 Glued, TACC, CRMP-1 , MKLP-1 , Eg5, TPX2, P53, CDC25, Histone H3 et NIMA.
16. Utilisation selon l'une des revendications 12 à 15, dans laquelle la prolifération cellulaire est mesurée dans les deux échantillons.
17. Utilisation selon l'une des revendications 12 à 16, dans laquelle lesdites cellules sont observées par microscopie dans les deux échantillons.
18. Kit comprenant une protéine Aurora A mutée telle que définie selon une des revendications 1 à 5 et un composé inhibiteur.
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