JP7060216B2 - 多様な選択された臓器又は組織をターゲティングするための物質 - Google Patents

Description

本発明は、ターゲティングの分野にあり、多様な臓器又は組織にホーミングし、これらに結合し、これらにより取り込まれる物質を提供する。

大半の治療用化合物は、循環を介して、標的の臓器又は組織へと送達される。しかし、大半の場合、薬物又は他の処置は、罹患した臓器又は組織だけをターゲティングするのではなく、また、体内の他の臓器及び組織にも取り込まれる。これは、例えば、患者の身体にわたる、一般的な毒性作用に起因する、所望されない副作用を結果としてもたらしうる。したがって、特定の臓器又は組織を、選択的にターゲティングすることが、所望されるであろう。加えて、治療用化合物を、ターゲティング部分へと連結することにより、治療用化合物の、ターゲティングされる組織又は細胞への取込み特性を改善する結果として、より効果的な物質をもたらすことができる。同様に、診断用化合物を、ターゲティング部分へと連結することにより、診断用化合物の、ターゲティングされる組織又は細胞への取込み特性を改善結果として、より効果的な物質をもたらすことができる。したがって、ターゲティング部分へと連結することにより、親物質よりも、より効果的で、毒性が小さな物質がもたらされる（Ｃｕｒｎｉｓら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８、１１８５～１１９０を参照されたい）。これは、ペプチド、タンパク質、細胞増殖抑制剤、抗生剤、抗体、及び抗ウイルス薬剤など、広範にわたる物質へと適用することができる。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ）、又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）などの筋疾患の場合、筋特異的なペプチドを、例えば、他の核酸ベースの治療剤のほかに、一本鎖若しくは二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、合成ｍＲＮＡ、又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）へとコンジュゲートするか、又はこれらと共に製剤化することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、所望されない遺伝子発現をモジュレートすることにより、特定の疾患を処置するための、新たなクラスの薬として適用されるだけの、大きな効能を有する。ＤＭＤ治療の分野では、アンチセンス誘導型のエクソンスキッピングが、ジストロフィン転写物の翻訳リーディングフレームを補正するための、有望なツールとして関心を集めつつある。目的は、ターゲティングされたエクソンを、スキップし（ＡＯＮの、プレｍＲＮＡへの結合により）、わずかに短いがインフレームの転写物をもたらすように、スプライシングを操作することである。これは、翻訳リーディングフレームの補正と、疾患の進行を、顕著に和らげうる、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）様のジストロフィンタンパク質の合成の誘導とを可能とするであろう。

過去１０年間のうちに、この治療法は、ＤＭＤのための有望な療法として現れた（ｖａｎ Ｏｍｍｅｎら、２００８；Ｙｏｋｏｔａら、２００７；ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、２００７；Ｇｏｅｍａｎｓら、２０１１；Ｖｏｉｔら、２０１４；Ｃｉｒａｋら、２０１１）。ＡＯＮ誘導型エクソンスキッピングは、突然変異特異的であり、したがって、ＤＭＤ患者のための個別化された治療法をもたらす。突然変異の大部分は、第４５～５５エクソンの近傍にクラスター化するので、１つの特定のエクソンをスキップすることは、異なる突然変異を伴う、多くの患者にとって、治療的でありうる。第５１エクソンのスキッピングは、第４５～５０、４８～５０、５０、又は５２エクソンの欠失を伴う患者を含む、患者の最大のサブセット（約１３％）へと適用される。適用されるＡＯＮは、エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、及びＲＮａｓｅＨに抵抗し、ＲＮＡへの結合及び二本鎖の安定性を促進するように、化学的に修飾される。ＤＭＤに対して補正的なエクソンスキッピングを誘導するための異なるＡＯＮであって、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートＲＮＡ（２ＯＭｅＰＳ；Ｖｏｉｔら、２０１４）、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ；Ｃｉｒａｋら、２０１１）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ；Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら、２０１５）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ；Ｇａｏら、２０１５）を含むＡＯＮが、現在探索されつつある。ＡＯＮは、健常な筋線維による取込みが不良であることが典型的であるが、ＤＭＤ及び結果として生じる病態におけるジストロフィンの欠損であって、衛星細胞の活性化と、線維膜の損傷及び透過性の増大とを特徴とする欠損は、良好な取込みを、実際に容易としうる。それにもかかわらず、核酸／オリゴヌクレオチドベースの療法の、臨床への適用可能性及び治療指数を改善するには、全身の筋肉組織への送達、及びこれらによる取込みが改善されたオリゴヌクレオチドを開発することが、分野の課題となっている。

筋肉消耗疾患のための効果的な治療は、腕部及び脚部の骨格筋を含む、本質的に全て骨格筋、並びに呼吸に関与する筋肉のほか、心筋がターゲティングされることを要求するであろう。現在探索されているいかなる機構も、全遺伝子はいうまでもなく、（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを、全身にわたり、本質的に全ての筋組織／細胞へと、同時に、特異的に送達する能力を有さない。遺伝子又は他の化合物の、筋肉への、ｉｎ ｖｉｖｏにおける送達法であって、これまでに公表されている送達法は、例えば、エレクトロトランスファー、マイクロバブルの使用（Ｌｕら、２００３、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０、３９６～４０５）、及びポロキサマー（ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）トリブロックコポリマー）を使用する全身送達による、ネイキッドＤＮＡの注射を含む。ｍｄｘマウスでは、このポロキサマーによる、モルホリノＡＯＮの全身送達は、いくつかの筋肉における、ジストロフィン発現の増大を結果としてもたらすことが示された（Ａｌｔｅｒら、２００６、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１２、１～３）。しかし、投与を繰り返した後であってもなお、ジストロフィンの発現は、横隔膜及び心筋に限定された。さらに、これらのｍｄｘマウスでは、筋膜が損なわれているために、ＡＯＮは、少なくとも部分的に、筋肉へと取り込まれる。ＳＭＡ及びＤＭなど、他の筋疾患では、この場合、筋線維膜は、同様には損なわれないという事実のために、ＡＯＮの送達は、より複雑である。

筋肉特異的ではないＡＯＮの送達を改善するための戦略は、ナノ粒子の使用、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲーション、又は細胞への取込みを増強する添加化合物の共投与である（Ｂａｓｓｉら、２０１２；Ｂｅｔｔｓら、２０１５；Ｆｅｒｌｉｎｉら、２０１０；Ｈｕら、２０１０；Ｋｅｎｄａｌｌら、２０１２；Ｌｅｈｔｏら、２０１３；Ｍｏｕｌｔｏｎ及びＭｏｕｌｔｏｎ、２０１０；Ｍｕｍｃｕｏｇｌｕ、Ｓａｒｄａｎ、Ｔｅｋｉｎａｙ、Ｇｕｌｅｒ、及びＴｅｋｉｎａｙ、２０１５；Ｒｉｍｅｓｓｉら、２００９；Ｖｅｒｈａａｒｔ及びＡａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ、２０１２；Ｗａｎｇら、２０１３；Ｙｉｎら、２０１１）。カチオン性ＣＰＰなど、これらの方法のうちの一部は、凝集問題のために、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートＡＯＮ（２ＯＭｅＰＳ）など、アニオン性ＡＯＮへのコンジュゲーションに適さない。

全身への筋肉治療は、細胞特異的なターゲティング能を付与された化合物の全身送達（例えば、静脈内送達又は皮下送達）を使用することが理想的である。筋細胞ターゲティングの潜在的可能性を有する、一部の物質について記載されている。最初の報告は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、骨格筋及び心筋への結合を増強したペプチド配列であって、ランダムファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより同定されたペプチド配列についての報告である（Ｓａｍｏｙｌｏｖａ及びＳｍｉｔｈ、１９９９、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、２２、４６０～４６６）。しかし、この直鎖状ペプチドを、コンジュゲートされた化合物の、筋細胞へのｉｎ ｖｉｖｏターゲティングのために使用しうるのかどうかについては、示されなかった。また、ファージによるランダムペプチドライブラリーの、ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングの後で、ヒト骨格筋から回収された、多数の、直鎖状の、７ｍｅｒのペプチド配列についても記載されている（Ａｒａｐら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８、１２１～１２７）。心筋細胞への結合については、いかなる情報ももたらされなかった。また、これらのペプチドを、コンジュゲートされた化合物の、筋細胞へのｉｎ ｖｉｖｏターゲティングのために使用しうるのかどうかについても示されなかった。記載されている別の物質は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、骨格筋へと、選択的に輸送される、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦｖ部分である（Ｗｅｉｓｂａｒｔら、２００３、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９、７８３～７８９）。マウスｍＡｂの単鎖Ｆｖ断片を、マウスの尾静脈へと注射したところ、４時間後に、断片が、骨格筋細胞のうちの２０％において、主に、核に局在化して見出された。ｍＡｂは、骨格筋細胞の溶解物におけるタンパク質ミオシンＩＩｂに結合するが、心筋細胞の溶解物においては、いかなるタンパク質にも結合しないことが示された。したがって、この抗体は、骨格筋へのターゲティングには有用でありうるが、心筋へのターゲティングには有用でありえないであろう。ファージディスプレイ実験により同定された、直鎖状の、７ｍｅｒのペプチドは、接合させたオリゴヌクレオチドの組織レベルを、わずかな増大ではあるが、増強することが記載された（Ｊｉｒｋａ ＳＭＧら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．２０１４、２４、２５）。

国際公開第２００９／００８７２７号では、筋細胞をターゲティングするペプチドについて報告された。これらのペプチドは、ファージディスプレイライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．－７（商標）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）が、直鎖状の、７ｍｅｒのペプチドの少数のコピーを、ファージＰＩＩＩタンパク質のＮ末端において発現する技術を使用して同定された。この技法は、標的特異的なペプチドの同定について公知である（Ｓｍｉｔｈ、１９８５）が、この手法は、煩雑であり、多くの偽陽性ペプチドを同定しうることが周知である（Ｈｕａｎｇ、Ｒｕ、Ｌｉ、Ｌｉｎ、及びＧｕｏ、２０１０）。

リソソーム蓄積症の場合、酵素置換療法における問題は、治療用組換え酵素の、筋細胞への、ｉｎ ｖｉｖｏにおける取込み不良である。例えば、ポンペ病（ＩＩ型グリコーゲン蓄積症）では、臨床研究で必要とされた、組換えヒト酸α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）の用量は、ｒｈＧＡＡの、骨格筋への取込み不良のために、極めて高かった（Ｗｉｎｋｅｌら、２００４、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５５、４９５～５０２）。

上記に照らすと、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＡＯＮなどの薬剤の特異的な取込みを達成するのに、送達系のさらなる改善が必要であることが極めて明らかである。改善されたターゲティング部分が必要とされ続けている。

目的の、臓器又は組織又は細胞型、とりわけ、心臓を含む筋細胞をターゲティングする化合物、好ましくはペプチド又はペプチド模倣体を提供することが、本発明の目的である。診断用部分又は生物学的活性部分を、このようなターゲティング化合物へとカップリングさせることにより、前記部分を、特定の臓器又は組織又は細胞へとターゲティングする。

ファージディスプレイ実験のアウトカムを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）で解析することにより、成功の確率を改善することができる（’ｔ Ｈｏｅｎら、２０１２）。ＮＧＳは、単一のスクリーニングラウンドだけの使用を可能とすることから、パラサイトペプチド配列が、アウトカムを支配することを防止し、パラサイトペプチド配列の同定を、より容易でより信頼できるものとする。

環状の、７ｍｅｒのペプチドライブラリーである、Ｐｈ．Ｄ．－Ｃ７Ｃ（商標）は、市販されている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。このＣ７Ｃペプチドライブラリーは、直鎖状ライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．－７（商標））と、その特色を共有するが、ランダムな７ｍｅｒのペプチドの各末端に位置する、２つのシステインアミノ酸の間の、ジスルフィド架橋の形成により環化されたペプチドを発現する。これにより、提示されるペプチドに対して、環化によるコンフォメーション的制限が課される。

広範な調査研究の後、本発明者らは、心臓を含む筋細胞に選択的に結合し、これらにより取り込まれる、多数のアミノ酸配列を同定した。こうして、本発明は、例えば、治療用組換え酵素又は（アンチセンス）オリゴヌクレオチドの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける取込みを、このような酵素又はオリゴヌクレオチドの、筋肉特異的なペプチドへの、コンジュゲート又は他の形の連結により改善する必要を満たす。コンジュゲートは、ミオパチーの処置のためのアンチセンス療法、筋肉がタンパク質の産生のレザバーとして潜在的に用いられる疾患の遺伝子治療、並びに多種多様な診断剤又は薬物の、心臓及び筋細胞への送達において有用であるので有利である。

したがって、本発明は、配列番号１～６３、好ましくは、配列番号２４又は２５からなる群から選択されるターゲティング配列を含むか、又はこれらからなる、ペプチド又はペプチド模倣体に関する。配列番号１～６３を、表１に示す。好ましくは、ペプチドは、環状である。

本発明はまた、本発明に従う１又は複数のペプチドのコンジュゲートであって、本発明に従う前記ペプチドが、生物学的活性部分及び診断用部分から選択される、少なくとも１つの部分へと連結されたコンジュゲートにも関する。

医薬としての使用のための、上記で記載したコンジュゲートは、本発明の態様である。

本発明に従うペプチドと、ペプチドではないリンカー部分であって、本発明に従うペプチドを、生物学的活性部分又は診断用部分へと連結するためのリンカー部分とを含む分子は、本発明のさらなる態様である。

ファージディスプレイによる選択実験及び候補ペプチドの同定についての概観を示す図である。 配列番号１４～２５のうちの１つを含む蛍光標識化ペプチドについての、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける評価を示す図である。２．２５μＭの、ＦＩＴＣで標識化された環状ペプチドと共に、３時間にわたりインキュベートされ、核を染色するように、ＤＡＰＩを含有するマウンティング培地に包埋された、ヒト対照筋管及び心筋細胞についての代表的顕微鏡写真である。ＩＤ＃＃とは、配列番号＃＃を指すので、例えば、ＩＤ１４とは、配列番号１４を指す。 蛍光標識化ペプチドについての、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける評価を示す図である。配列番号２４又は配列番号２５（それぞれ、ＩＤ２４又はＩＤ２５と表示される）を含む環状ペプチドを、２．２５μＭの用量でインキュベートし、スライドを、マウンティング培地（左パネルについて、ＤＡＰＩを含有する）に包埋し、顕微鏡法で解析した。図３Ａ：１又は３時間にわたりインキュベートされた、ヒト対照筋管である。図３Ｂ：３時間にわたりインキュベートされた、ヒト心筋細胞である。図３Ｃ：ヒト対照筋管又は心筋細胞と共に、１０分間にわたりインキュベートされた、配列番号２５を含む環状ペプチドである。図３Ｄ：ヒト対照筋管と共に、３時間にわたりインキュベートされた、配列番号２４を含む環状ペプチドである。代表的写真を示す。 蛍光標識化ペプチドについての、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける評価を示す図である。配列番号２４又は配列番号２５（それぞれ、ＩＤ２４又はＩＤ２５と表示される）を含む環状ペプチドを、２．２５μＭの用量でインキュベートし、スライドを、マウンティング培地（左パネルについて、ＤＡＰＩを含有する）に包埋し、顕微鏡法で解析した。図３Ａ：１又は３時間にわたりインキュベートされた、ヒト対照筋管である。図３Ｂ：３時間にわたりインキュベートされた、ヒト心筋細胞である。図３Ｃ：ヒト対照筋管又は心筋細胞と共に、１０分間にわたりインキュベートされた、配列番号２５を含む環状ペプチドである。図３Ｄ：ヒト対照筋管と共に、３時間にわたりインキュベートされた、配列番号２４を含む環状ペプチドである。代表的写真を示す。 蛍光標識化ペプチドについての、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける評価を示す図である。配列番号２４又は配列番号２５（それぞれ、ＩＤ２４又はＩＤ２５と表示される）を含む環状ペプチドを、２．２５μＭの用量でインキュベートし、スライドを、マウンティング培地（左パネルについて、ＤＡＰＩを含有する）に包埋し、顕微鏡法で解析した。図３Ａ：１又は３時間にわたりインキュベートされた、ヒト対照筋管である。図３Ｂ：３時間にわたりインキュベートされた、ヒト心筋細胞である。図３Ｃ：ヒト対照筋管又は心筋細胞と共に、１０分間にわたりインキュベートされた、配列番号２５を含む環状ペプチドである。図３Ｄ：ヒト対照筋管と共に、３時間にわたりインキュベートされた、配列番号２４を含む環状ペプチドである。代表的写真を示す。 蛍光標識化ペプチドについての、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける評価を示す図である。配列番号２４又は配列番号２５（それぞれ、ＩＤ２４又はＩＤ２５と表示される）を含む環状ペプチドを、２．２５μＭの用量でインキュベートし、スライドを、マウンティング培地（左パネルについて、ＤＡＰＩを含有する）に包埋し、顕微鏡法で解析した。図３Ａ：１又は３時間にわたりインキュベートされた、ヒト対照筋管である。図３Ｂ：３時間にわたりインキュベートされた、ヒト心筋細胞である。図３Ｃ：ヒト対照筋管又は心筋細胞と共に、１０分間にわたりインキュベートされた、配列番号２５を含む環状ペプチドである。図３Ｄ：ヒト対照筋管と共に、３時間にわたりインキュベートされた、配列番号２４を含む環状ペプチドである。代表的写真を示す。 ペプチド－ＡＯＮコンジュゲートについての、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける評価を示す図である。配列番号２５を含む環状ペプチドを、ヒトジストロフィンの第４５エクソン（ｈ４５ＡＯＮ）をターゲティングするＡＯＮへとコンジュゲートして、環状ペプチドのコンジュゲーションが、ＡＯＮの、エクソンスキッピングへの適用可能性に対して、影響を及ぼすのかどうかについて評価した。コンジュゲートを、ＩＤ２５－ｈ４５ＡＯＮと称する。バーは、平均値±ＳＤを表す。結果は、ヒト対照筋管を、トランスフェクション試薬を伴わずに、ＩＤ２５－ｈ４５ＡＯＮ（２μＭ）と共に、９６時間にわたりインキュベートした、二連の２つの独立の実験の平均を示す。 マウスジストロフィンの第２３エクソン（２３ＡＯＮ）をターゲティングするＡＯＮへとコンジュゲートされた、配列番号２４又は配列番号２５を含む環状ペプチドについての、ｉｎ ｖｉｖｏにおける評価を示す図である。コンジュゲートを、それぞれ、ＩＤ２４－２３ＡＯＮ及びＩＤ２５－２３ＡＯＮと称する。４週齢のｍｄｘマウス（群１つ当たり４～５匹）に、毎週４回ずつ、５０ｍｇ／ｋｇの２３ＡＯＮ、モル当量のＩＤ２４－２３ＡＯＮ、ＩＤ２５－２３ＡＯＮ、又は生理食塩水を、８週間にわたり皮下投与した。最終回の注射の一週間後に、目的の組織を単離した。バーは、平均値±ＳＤを表す。図５Ａ：ＲＮＡを単離し、単回のＲＴ－ＰＣＲにより、エクソンスキッピングレベルを評価し、ラボオンチップ解析により、半定量的に決定した。図５Ｂ：ジストロフィンタンパク質レベルは、ウェスタンブロットにより決定した。図５Ｃ：初回の注射の後、血液試料を、いくつかの時点及び屠殺時に採取して、血漿におけるＡＯＮレベルを決定した。図５Ｄ：ハイブリダイゼーション－ライゲーションアッセイを使用して、組織におけるＡＯＮレベルを決定した。有意であるＰ＜０．０５のための、事後検定（ボンフェローニ）を伴う一元ＡＮＯＶＡである。Ｇ＝腓腹筋、Ｑ＝大腿四頭筋、Ｔｉ＝前腓骨筋、Ｔｒ＝三頭筋、Ｈ＝心臓、Ｄ＝横隔膜、Ｌ＝肝臓、Ｋ＝腎臓である。 マウスジストロフィンの第２３エクソン（２３ＡＯＮ）をターゲティングするＡＯＮへとコンジュゲートされた、配列番号２４又は配列番号２５を含む環状ペプチドについての、ｉｎ ｖｉｖｏにおける評価を示す図である。コンジュゲートを、それぞれ、ＩＤ２４－２３ＡＯＮ及びＩＤ２５－２３ＡＯＮと称する。４週齢のｍｄｘマウス（群１つ当たり４～５匹）に、毎週４回ずつ、５０ｍｇ／ｋｇの２３ＡＯＮ、モル当量のＩＤ２４－２３ＡＯＮ、ＩＤ２５－２３ＡＯＮ、又は生理食塩水を、８週間にわたり皮下投与した。最終回の注射の一週間後に、目的の組織を単離した。バーは、平均値±ＳＤを表す。図５Ａ：ＲＮＡを単離し、単回のＲＴ－ＰＣＲにより、エクソンスキッピングレベルを評価し、ラボオンチップ解析により、半定量的に決定した。図５Ｂ：ジストロフィンタンパク質レベルは、ウェスタンブロットにより決定した。図５Ｃ：初回の注射の後、血液試料を、いくつかの時点及び屠殺時に採取して、血漿におけるＡＯＮレベルを決定した。図５Ｄ：ハイブリダイゼーション－ライゲーションアッセイを使用して、組織におけるＡＯＮレベルを決定した。有意であるＰ＜０．０５のための、事後検定（ボンフェローニ）を伴う一元ＡＮＯＶＡである。Ｇ＝腓腹筋、Ｑ＝大腿四頭筋、Ｔｉ＝前腓骨筋、Ｔｒ＝三頭筋、Ｈ＝心臓、Ｄ＝横隔膜、Ｌ＝肝臓、Ｋ＝腎臓である。 マウスジストロフィンの第２３エクソン（２３ＡＯＮ）をターゲティングするＡＯＮへとコンジュゲートされた、配列番号２４又は配列番号２５を含む環状ペプチドについての、ｉｎ ｖｉｖｏにおける評価を示す図である。コンジュゲートを、それぞれ、ＩＤ２４－２３ＡＯＮ及びＩＤ２５－２３ＡＯＮと称する。４週齢のｍｄｘマウス（群１つ当たり４～５匹）に、毎週４回ずつ、５０ｍｇ／ｋｇの２３ＡＯＮ、モル当量のＩＤ２４－２３ＡＯＮ、ＩＤ２５－２３ＡＯＮ、又は生理食塩水を、８週間にわたり皮下投与した。最終回の注射の一週間後に、目的の組織を単離した。バーは、平均値±ＳＤを表す。図５Ａ：ＲＮＡを単離し、単回のＲＴ－ＰＣＲにより、エクソンスキッピングレベルを評価し、ラボオンチップ解析により、半定量的に決定した。図５Ｂ：ジストロフィンタンパク質レベルは、ウェスタンブロットにより決定した。図５Ｃ：初回の注射の後、血液試料を、いくつかの時点及び屠殺時に採取して、血漿におけるＡＯＮレベルを決定した。図５Ｄ：ハイブリダイゼーション－ライゲーションアッセイを使用して、組織におけるＡＯＮレベルを決定した。有意であるＰ＜０．０５のための、事後検定（ボンフェローニ）を伴う一元ＡＮＯＶＡである。Ｇ＝腓腹筋、Ｑ＝大腿四頭筋、Ｔｉ＝前腓骨筋、Ｔｒ＝三頭筋、Ｈ＝心臓、Ｄ＝横隔膜、Ｌ＝肝臓、Ｋ＝腎臓である。 マウスジストロフィンの第２３エクソン（２３ＡＯＮ）をターゲティングするＡＯＮへとコンジュゲートされた、配列番号２４又は配列番号２５を含む環状ペプチドについての、ｉｎ ｖｉｖｏにおける評価を示す図である。コンジュゲートを、それぞれ、ＩＤ２４－２３ＡＯＮ及びＩＤ２５－２３ＡＯＮと称する。４週齢のｍｄｘマウス（群１つ当たり４～５匹）に、毎週４回ずつ、５０ｍｇ／ｋｇの２３ＡＯＮ、モル当量のＩＤ２４－２３ＡＯＮ、ＩＤ２５－２３ＡＯＮ、又は生理食塩水を、８週間にわたり皮下投与した。最終回の注射の一週間後に、目的の組織を単離した。バーは、平均値±ＳＤを表す。図５Ａ：ＲＮＡを単離し、単回のＲＴ－ＰＣＲにより、エクソンスキッピングレベルを評価し、ラボオンチップ解析により、半定量的に決定した。図５Ｂ：ジストロフィンタンパク質レベルは、ウェスタンブロットにより決定した。図５Ｃ：初回の注射の後、血液試料を、いくつかの時点及び屠殺時に採取して、血漿におけるＡＯＮレベルを決定した。図５Ｄ：ハイブリダイゼーション－ライゲーションアッセイを使用して、組織におけるＡＯＮレベルを決定した。有意であるＰ＜０．０５のための、事後検定（ボンフェローニ）を伴う一元ＡＮＯＶＡである。Ｇ＝腓腹筋、Ｑ＝大腿四頭筋、Ｔｉ＝前腓骨筋、Ｔｒ＝三頭筋、Ｈ＝心臓、Ｄ＝横隔膜、Ｌ＝肝臓、Ｋ＝腎臓である。 安全性の評価を示す図である。ｍｄｘマウスにおける最終回の注射の１週間後に、血液を採取し、安全性マーカーについて評価した。バーは、平均値±ＳＤを表す。ｍｄｘマウスについて、全てのマーカーは、正常な範囲にあった。図６Ａ：ＨＢ＝ヘモグロビン、図６Ｂ：尿素、図６Ｃ：ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、図６Ｄ：ＧＰＴ＝グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、図６Ｅ：ＧＯＴ＝グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、図６Ｆ：ＣＫ＝クレアチニンキナーゼである。 安全性の評価を示す図である。ｍｄｘマウスにおける最終回の注射の１週間後に、血液を採取し、安全性マーカーについて評価した。バーは、平均値±ＳＤを表す。ｍｄｘマウスについて、全てのマーカーは、正常な範囲にあった。図６Ａ：ＨＢ＝ヘモグロビン、図６Ｂ：尿素、図６Ｃ：ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、図６Ｄ：ＧＰＴ＝グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、図６Ｅ：ＧＯＴ＝グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、図６Ｆ：ＣＫ＝クレアチニンキナーゼである。 安全性の評価を示す図である。ｍｄｘマウスにおける最終回の注射の１週間後に、血液を採取し、安全性マーカーについて評価した。バーは、平均値±ＳＤを表す。ｍｄｘマウスについて、全てのマーカーは、正常な範囲にあった。図６Ａ：ＨＢ＝ヘモグロビン、図６Ｂ：尿素、図６Ｃ：ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、図６Ｄ：ＧＰＴ＝グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、図６Ｅ：ＧＯＴ＝グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、図６Ｆ：ＣＫ＝クレアチニンキナーゼである。 安全性の評価を示す図である。ｍｄｘマウスにおける最終回の注射の１週間後に、血液を採取し、安全性マーカーについて評価した。バーは、平均値±ＳＤを表す。ｍｄｘマウスについて、全てのマーカーは、正常な範囲にあった。図６Ａ：ＨＢ＝ヘモグロビン、図６Ｂ：尿素、図６Ｃ：ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、図６Ｄ：ＧＰＴ＝グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、図６Ｅ：ＧＯＴ＝グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、図６Ｆ：ＣＫ＝クレアチニンキナーゼである。 安全性の評価を示す図である。ｍｄｘマウスにおける最終回の注射の１週間後に、血液を採取し、安全性マーカーについて評価した。バーは、平均値±ＳＤを表す。ｍｄｘマウスについて、全てのマーカーは、正常な範囲にあった。図６Ａ：ＨＢ＝ヘモグロビン、図６Ｂ：尿素、図６Ｃ：ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、図６Ｄ：ＧＰＴ＝グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、図６Ｅ：ＧＯＴ＝グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、図６Ｆ：ＣＫ＝クレアチニンキナーゼである。 安全性の評価を示す図である。ｍｄｘマウスにおける最終回の注射の１週間後に、血液を採取し、安全性マーカーについて評価した。バーは、平均値±ＳＤを表す。ｍｄｘマウスについて、全てのマーカーは、正常な範囲にあった。図６Ａ：ＨＢ＝ヘモグロビン、図６Ｂ：尿素、図６Ｃ：ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、図６Ｄ：ＧＰＴ＝グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、図６Ｅ：ＧＯＴ＝グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、図６Ｆ：ＣＫ＝クレアチニンキナーゼである。

本発明は、診断用部分又は生物学的活性部分を、目的の、臓器又は組織又は細胞型、とりわけ、心臓を含む筋細胞へとターゲティングするための、ペプチド又はペプチド模倣体を提供する。

本発明の文脈におけるペプチドは、少なくとも７つのアミノ酸を含む。ペプチドは、天然に存在するＬ－アミノ酸から完全に構築される場合もあり、骨格及び／又は側鎖（複数可）に対する、１又は複数の修飾を含有する場合もある。これらの修飾は、天然のアミノ酸との類似性を示すアミノ酸模倣体の組込みにより導入することができる。アミノ酸の、１又は複数の模倣体を含む、上記で記載したペプチドの群を、ペプチド模倣体と称する。本発明の文脈では、アミノ酸の模倣体は、β２－及びβ３－アミノ酸、β２，２－、β２，３、及びβ３，３－二置換アミノ酸、α，α－二置換アミノ酸、アミノ酸のスタチン誘導体、Ｄ－アミノ酸、α－ヒドロキシ酸、α－アミノニトリル、Ｎ－アルキルアミノ酸などを含むがこれらに限定されない。加えて、ペプチドのＣ末端は、カルボン酸又はカルボキサミドの場合もあり、上記で言及したアミノ酸模倣体のうちの１つの組込みから生じる他のペプチド模倣体の場合もある。さらに、上記で記載したペプチドは、スルホンアミド、レトロアミド、アミノオキシ含有結合、エステル、アルキルケトン、α，α－ジフルオロケトン、α－フルオロケトン、ペプトイド結合（Ｎ－アルキル化グリシルアミド結合）を含むがこれらに限定されない基による、天然のペプチド結合の、１又は複数の置き換えを含有しうる。さらに、上記で言及したペプチドは、アミノ酸側鎖（対応する天然のアミノ酸の側鎖を指す）の置換、例えば、４－フルオロフェニルアラニン、４－ヒドロキシリシン、３－アミノプロリン、２－ニトロチロシン、Ｎ－アルキルヒスチジン、又はβ－分枝状アミノ酸、若しくは天然のキラリティーに対して、β－側鎖炭素原子におけるキラリティーを伴うβ－分枝状アミノ酸模倣体（例えば、アロ－トレオニン、アロ－イソロイシン、及び誘導体）を含有しうる。他の一実施形態では、上記で記載したペプチドの群は、アミノ酸又はアミノ酸模倣体の、近縁の、天然又は非天然の構造的類似体、例えば、リシンに代えて、オルニチン、フェニルアラニンに代えて、ホモフェニルアラニン又はフェニルグリシン、グリシンに代えて、β－アラニン、グルタミン酸に代えて、ピログルタミン酸、ロイシンに代えて、ノルロイシン、又はメチオニン及び／若しくはシステインの硫黄酸化バージョンを含有しうる。

好ましいペプチドは、配列番号１～６３（すなわち、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３）からなる群から選択される配列を含むか、又はこれらからなる。より好ましいペプチドは、配列番号２４又は２５を含むか、又はこれらからなる。したがって、また、群を、好ましいペプチドは、配列番号２４、２５、１～２３、２６～６３からなる群から選択される配列を含むか、又はこれらからなる、として規定することもできる。本特許では、上記で言及した、ペプチドの直鎖状形態及び環状形態のほか、これらのレトロ型、インベルソ型、及び／又はレトロインベルソ型類似体も対象とする。本発明に従う、好ましいペプチドは、環状である。当業者には、多くの、より緊密な変化形が、公知でありうるが、これらが、本明細書で言及されていないという事実は、本発明の範囲を限定しない。一実施形態では、本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体は、最大で３０アミノ酸の長さ、又は少なくとも２５アミノ酸若しくは２０アミノ酸若しくは１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、若しくは７アミノ酸の長さである。

好ましい環状ペプチドは、配列番号１～６３からなる群から選択される配列からなるか、又はこれらを含む配列が、環状構造をもたらすように、結合を形成することが可能な、アミノ酸残基又は他の部分に挟まれる環状ペプチドである。より好ましい環状ペプチドは、配列番号２４又は２５を含むか、又はこれらからなる配列が、環状構造をもたらすように、結合を形成することが可能な、アミノ酸残基又は他の部分に挟まれる環状ペプチドである。本明細書では、上記で記載したペプチド又はペプチド模倣体などのペプチド又はペプチド模倣体を、本発明に従うペプチドと称するか、又は環状ペプチド又は環状ペプチド模倣体だけを意図する場合は、本発明に従う環状ペプチドと称するか、又は直鎖状ペプチド又は直鎖状ペプチド模倣体だけを意図する場合は、本発明に従う直鎖状ペプチドと称する。さらに指定されない場合、本発明に従うペプチドは、環状ペプチド又は環状ペプチド模倣体及び直鎖状ペプチド又は直鎖状ペプチド模倣体の両方を包含する。

本明細書では、配列番号１～６３により表される配列を、ターゲティング配列と称する。より好ましい配列は、配列番号２４又は２５により表される。ターゲティング配列とは、筋細胞若しくは筋肉組織に結合するか、又は筋細胞若しくは筋肉組織への取込みを増大させる、ペプチド又はペプチド模倣体の配列である。配列がターゲティング配列であるのかどうかを決定するのに好ましいアッセイは、実施例で提示される。例えば、取込みの増大は、ターゲティング配列を、蛍光標識へと連結する場合、蛍光顕微鏡法により決定することができる。

本明細書では、ペプチドという用語の使用は、各残基が、その隣のアミノ酸へと、骨格のアミド結合により連結された、天然に存在するタンパク質形成性アミノ酸である、他の点では、特徴のないペプチドに次いで、また、非天然のアミノ酸、ペプチド模倣体、従来型ではない連結、及び多くの一般的な変化形を含むペプチドも包含されるように解釈されるべきである。これは、アルキル化結合、逆位結合、若しくはエステル、トリアゾール、カルバメート、ウレア、チオウレア、イミド、イミン、ハロゲン化結合、アルファ－ハロゲン化結合、ケトンなど、他の種類の結合を含むペプチド、又はベータ－アミノ酸、他の拡張アミノ酸を含むペプチド、又は残基の側鎖を、対応するアルファ炭素原子の代わりに、骨格アミド結合へと接合させたペプトイド、又は骨格の官能基の代わりに、側鎖に関与する結合を含む。ペプチドは、Ｌ－アミノ酸若しくはＤ－アミノ酸、又はこれらの混合物など、任意のキラリティーのアミノ酸を含みうる。したがって、本発明で使用される「アミノ酸」という用語は、上記で規定したペプチドにおける残基を構成しうる、任意の部分として解釈されるべきである。アミノ酸は、好ましくは、カルボン酸を特徴とする分子酸であることが最も多く、前記アミノ酸は、カルボン酸の隣のアルファ炭素におけるアミンを特徴とする。しかし、アミンはまた、カルボン酸から遠隔の場合もある。最も一般的な天然に存在するタンパク質形成性アミノ酸、並びにそれらの３文字式略号、及び１文字式コードは、以下：アラニン（Ａｌａ、Ａ）；アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）；システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）；グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）；グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）；イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）；ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）；リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）；メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）；プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）；セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）；トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）；チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）；トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）；バリン（Ｖａｌ、Ｖ）の通りである。本発明の文脈では、天然に存在するアミノ酸はまた、天然のアミノ酸とも呼ばれる。天然のアミノ酸は、タンパク質の生合成中の生物により使用されることを意味する、タンパク質形成性であることが多い。場合によって、天然のアミノ酸はまた、非タンパク質形成性でもありうる。天然のアミノ酸とは、天然において見出されうるアミノ酸であり、それらの役割又は機能を、さらに限定することを伴わない。当業者に公知である通り、アミノ酸は、それらの側鎖の性質を特徴とすることが多い。塩基性アミノ酸であると考えられるアミノ酸は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンである。酸性アミノ酸であると考えられるアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。極性非帯電アミノ酸であると考えられるアミノ酸は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンである。疎水性アミノ酸であると考えられるアミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、及びトリプトファンである。プロリンは、コンフォメーション的に拘束されたアミノ酸であると考えられる。グリシンは、非キラルであるが、Ｄ－ペプチド及びＬ－ペプチドの両方の一部でありうる。本発明の実施形態内では、ペプチドは、より大きいペプチド又はより大きい物質に含まれうる。ペプチドは、おそらく、末端の、アミド、アセトアミド、メチルエステル、他の末端エステル、又は当業者に公知の他の末端部分などのキャッピング基を含むことが理解される。ペプチドは、おそらく、アセチル、ｔ－ブチルカルバメート、９－フルオレニルメチルカルバメート、ベンジルカルバメート、ベンジルエステル、ｔ－ブチルエステル、メチルエステル、又は当技術分野で公知の他の保護基などの保護基を特徴とすることがさらに理解される。

第１の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号１～６３からなる群から選択されるターゲティング配列を含むか、又はこれらからなるペプチド又はペプチド模倣体のコンジュゲートであって、ペプチド又はペプチド模倣体が、（ｉｉ）生物学的活性部分及び診断用部分から選択される部分へと連結されたコンジュゲートを提供する。本明細書では、このようなコンジュゲートを、本発明に従うコンジュゲートと称する。好ましいターゲティング配列は、配列番号２４又は２５を含むか、又はこれらからなる。本発明に従うコンジュゲートは、本発明に従うペプチドを、生物学的活性部分又は診断用部分へと連結する。

当業者に公知である通り、コンジュゲートは、少なくとも顕著に異なる第２の特徴的部分へと連結された、少なくとも第１の特徴的部分を含む。非限定例は、第２の部分としてのオリゴヌクレオチドへと連結された、第１の部分としてのペプチド、第２の部分としての、顕著に異なる第２のペプチドへと連結された、第１の部分としてのペプチド、第２の部分としてのタンパク質へと連結された、第１の部分としての有機低分子などである。本発明に従うコンジュゲートの文脈では、ペプチド又はペプチド模倣体を、生物学的活性部分及び診断用部分から選択される、さらなる部分へと連結する。生物学的活性部分又は診断用部分を、本発明のペプチド又はペプチド模倣体へと、共有結合的に連結することは、必要ではない。生物学的活性部分又は診断用部分はまた、静電相互作用を介して連結することもできる。連結は、本発明に従うペプチドと、生物学的活性部分又は診断用部分との共有結合など、直接的連結でありうる。代替的に、リンカー部分を使用することもできる。リンカー部分は、当技術分野で公知である。本明細書で規定され、当業者に公知の通り、Ａｈｘは、６－アミノヘキサン酸を表すが、これはまた、Ａｃｐとして略記される、アミノカプロン酸としても公知である。Ａｈｘは、２つのさらなる部分を一体に連結するリンカー部分であると考えられる。Ａｈｘに加えて、個々のアミノ酸残基の代わりに、ベータ－アラニン（ベータ－アミノプロピオン酸、ｂＡｌａとしてもまた公知である）、４－アミノ酪酸（ピペリジン酸、４Ａｂｕとしてもまた公知である）、３－アミノイソ酪酸（ｂＡｉｂ）などであるがこれらに限定されない、他のリンカー部分を使用することもでき、当技術分野で公知の他のリンカー部分を使用することもできる。これらのリンカー部分は、本発明に従うペプチドに含まれる場合もあり、本発明に従うコンジュゲートに含まれる場合もあり、本発明に従う分子に含まれる場合もある。

一実施形態では、本発明はまた、本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体と、ペプチドではないリンカー部分であって、分子を、生物学的活性部分又は診断用部分へと連結するためのリンカー部分とを含む分子にも関する。したがって、本発明はまた、
本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体と、
前記ペプチド又はペプチド模倣体を、生物学的活性部分又は診断用部分へと連結するためのリンカー部分であって、ペプチドではないリンカー部分と
を含む分子も提供する。
本明細書では、このような分子を、本発明に従う分子と称する。

リンカー部分は、例えば、生物学的活性ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと複合体化する（ポリ）カチオン性基でありうる。このような（ポリ）カチオン性基は、スペルミン又はポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－リシン、及び誘導体などでありうる。リンカー部分によりなされる連結は、共有結合、超分子結合、又はコンジュゲートの構成要素を互いと強く会合させる、他の任意の結合でありうる。連結の非限定例は、ロイシンジッパーなどのコイルドコイル、及びビオチンを伴う相互作用などのホスト－ゲスト間相互作用である。

本発明に従うコンジュゲートを調製するために、生物学的活性部分又は診断用部分の、本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体へのカップリングは、化合物を、アミノ酸又はペプチドへとカップリングさせる、公知の方法を介してなされうる。一般的な方法は、部分を、ペプチド又はペプチド模倣体における、遊離アミノ基又は遊離ヒドロキシル基又は遊離カルボン酸基又は遊離チオール基へと連結することである。一般的なコンジュゲーション法は、チオール／マレイミドカップリング、アミド結合若しくはエステル結合の形成、又は不均一ジスルフィドの形成を含む。当業者は、要求されるカップリングをもたらすのに使用されうる、標準的な化学反応を承知している。生物学的活性部分又は診断用部分は、ペプチド又はペプチド模倣体へと、直接カップリングさせることもでき、スペーサー部分又はリンカー部分を介してカップリングさせることもできる。適切なリンカーの例は、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレートである）又はＢＭＰＳ（（Ｎ－β－マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステルである）の使用から得られるリンカーである。

一実施形態で言及される通り、本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体を、生物学的活性部分へと連結する。例えば、ペプチド又はペプチド模倣体は、生物学的活性ペプチド又は治療用ペプチドへと連結することができ、一実施形態ではなお、ペプチド又はペプチド模倣体の基本構造の一部でもありうる。例えば、治療用ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端を、上記で記載したペプチドを含むか、又はこれらからなる配列で伸長させることができる。本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体で伸長させたこのようなペプチドが、本発明に従うコンジュゲートに包含されることを理解されたい。このようなペプチドの調製は、標準的なアミノ酸手順又はペプチドカップリング手順を介して達成することができる。

一実施形態では、本発明は、生物学的活性部分が、タンパク質又はポリペプチドであり、ペプチド又はペプチド模倣体が、タンパク質又はポリペプチドの骨格に含まれる、本発明に従うコンジュゲートを提供する。前記コンジュゲートは、ペプチド又はペプチド模倣体の、生物学的活性タンパク質と併せた組換え発現により調製することが好ましい。本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体が、生物学的活性ペプチドの末端、好ましくは、生物学的活性ペプチドのＣ末端において発現するように、ＤＮＡ構築物を調製することが好ましい。組換えＤＮＡ法による、ＤＮＡ構築物のこのような調製、及び好適な宿主における発現は、当業者に一般的な慣行である。したがって、一実施形態では、本コンジュゲートは、本発明に従うペプチド、例えば、配列番号１～６３（好ましくは、配列番号２４又は２５）のペプチドの、治療的に活性であるタンパク質、例えば、抗体、若しくは診断用（例えば、蛍光）タンパク質、又はこれらの両方との融合タンパク質であり、任意選択でまた、ＮＬＳも含む。このような融合タンパク質は、適切なＤＮＡ構築物の発現により調製することができる。

好ましい実施形態では、本発明に従うコンジュゲートは、生物学的活性部分を含む。生物学的活性部分は、（直接的又は間接的に）生物学的機能好ましくは、治療的機能を果たす化合物であり、よって、好ましくは、治療用活性化合物である。治療用活性化合物は、当技術分野で公知である、任意の化合物であることが可能であり、好ましくは、細胞間過程をモジュレートすることにより、治療効果を及ぼす化合物である。（直接的な）モジュレート効果又は（直接的な）生物学的機能を有する、治療用活性化合物は、例えば、任意のタンパク質、酵素阻害剤、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、遺伝子、天然の化合物、薬物、又は医薬でありうる。本発明に従う少なくとも１つのペプチド又はペプチド模倣体へと連結されうるか、又は連結されるのに適するものとされうる限りにおいて、任意の生物学的活性化合物又は治療用活性化合物を使用することができる。こうして、生物学的活性化合物又は治療用活性化合物は、本発明に従う化合物の部分となる。当業者は、好適な、生物学的活性化合物又は治療用活性化合物を同定することが可能であろう。生物学的活性部分は、低分子有機分子、ペプチド、デプシペプチド、アシルデプシペプチド、抗生剤、抗微生物剤、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片、核酸、核酸類似体、又はこれらの部分、化学療法剤、デコイ分子、若しくは他の任意の実体、又はこれらの組合せでありうる。核酸は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、オリゴヌクレオチド、合成ｍＲＮＡ、ｓｓ（一本鎖）又はｄｓ（二本鎖）ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ、ギャップマー、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマー、及びシュピーゲルマーを含む群からから選択することができる。生物学的活性部分は、治療効果を及ぼしうる任意の実体であることが理解され、また、ワクチン接種のための実体でもありうる薬物でありうる。

一実施形態では、生物学的活性化合物又は治療用活性化合物は、核酸若しくはその類似体を含むか、又はこれらからなる化合物である。このような化合物は、細胞内の遺伝子機構をモジュレートすることにより、特に、タンパク質の産生レベルに対して、生物学的機能、好ましくは、治療的機能を果たす（間接的に）と考えることができる。核酸は、２’－Ｆヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキルヌクレオチド又は２’－Ｏ－アルケニル（アリル）ヌクレオチド又は２’－Ｏ－アルキニルヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル、詳細には、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート（２ＯＭｅＰＳ；Ｖｏｉｔら、２０１４）、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ；Ｃｉｒａｋら、２０１１）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ；Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら、２０１５）、ペプチド核酸（ＰＮＡ；Ｇａｏら、２０１５）、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）及び２’－Ｏ－アリルヌクレオチド、架橋／二環式核酸（例えば、ＬＮＡ、アルファ－Ｌ－ＬＮＡ、２’－アミノＬＮＡ、２’－Ｎ－置換－２’－アミノＬＮＡ、ＣＢＢＮ、ＥＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥｔ、ＢＮＡ^ＮＣ［Ｎ－Ｍｅ］、ｔｃＤＮＡ、及びこれらの誘導体を含むＢＮＡ）、ペプチド核酸（例えば、ＣＴＩ Ｂｉｏの国際公開第２００９／１１３８２８号、又はＵｇｉｃｈｅｍによる国際公開第２０１５／１７２８８９号、国際公開第２０１３／０１３１０１９号において記載されている誘導体を含むＰＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホロチオエート修飾のヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド若しくは２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド、又はキラルに規定されたホスホロチオエートヌクレオチド（ＷａＶｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、又はＯｎｔｏｒｉｉ若しくはＣｈｉｒａｌｇｅｎにより提供されているものなど）、モルホリノベースのヌクレオチド（例えば、Ｓａｒｅｐｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ又はＡＶＩ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ又はＳｈｉｒｅ又は日本新薬株式会社により提供されているものなどの、ＰＭＯ、ＰＭＯ＋、ＰＭＯ－Ｘ）、及びこれらの組合せなど、類似体の単量体を含む化合物など、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの類似体でありうる。核酸は、遺伝子、ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド、一本鎖若しくは二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍＲＮＡなどでありうる。

したがって、第１の態様についての好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分が、２’－Ｏ－アルキルヌクレオチド、特に、２’－Ｏ－メトキシエチル及び２’－Ｏ－メチル、架橋／二環式核酸のヌクレオチド（ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥｔ、ＣＢＢＮ、ＣＲＮ、アルファ－Ｌ－ＬＮＡ、ｃＭＯＥ、２’－アミノ－ＬＮＡ、２’－（アシルアミノ）ＬＮＡ、２’－チオ－ＬＮＡ、ＢＮＡ^ＮＣ［Ｎ－Ｍｅ］、ＢＮＡ^ＮＣ［ＮＨ］）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ、ＰＰＮＡ）、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、キラルに規定されたホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、ホスホリルグアニジン修飾オリゴヌクレオチド（ＰＧＯ）、モルホリノベースのヌクレオチド（ＰＭＯ、ＰＭＯ＋、ＰＭＯ－Ｘ、ＰＰＭＯ）、及びこれらの組合せを含む化合物など、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの類似体からなる群から選択される、本発明に従うコンジュゲートを提供する。高度に好ましい実施形態では、このＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は上記で記載した類似体などは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）である。好ましいＡＯＮは、以下：
ｉ）２’－Ｆ単量体、２’－Ｏ－メチル単量体、２’－アミノ単量体、又は２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）単量体、最も好ましくは、２’－Ｏ－メチル単量体であることが好ましい、２’－置換単量体；
ｉｉ）シトシン塩基を置換する、少なくとも１つの５－メチルシトシン塩基；
ｉｉｉ）全てのシトシン塩基を置換する、５－メチルシトシン塩基；
ｉｖ）ウラシル塩基を置換する、少なくとも１つの５－メチルウラシル塩基；
ｖ）全てのウラシル塩基を置換する、５－メチルウラシル塩基；
ｖｉ）ホスホジエステル骨格連結を置換する、少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結；
ｖｉｉ）全てのホスホジエステル骨格連結を置換する、ホスホロチオエート骨格連結；
ｖｉｉｉ）上記で記載した類似体の単量体など、少なくとも１つの類似体の単量体
のうちの１又は複数を含む。

以下は、上記で記載した通りに使用されうる、ＤＮＡ又はＲＮＡ類似体についての参考文献の、非網羅的な概観：ｃＥｔ（２’－Ｏ，４’－Ｃ拘束エチル）ＬＮＡ（ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ７１０３４２ｑ）、ｃＭＯＥ（２’－Ｏ，４’－Ｃ拘束メトキシエチル）ＬＮＡ（Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２０１０、７５、１５６９～１５８１）、２’，４’－ＢＮＡ^ＮＣ（Ｎ－Ｈ）、２’，４’－ＢＮＡ^ＮＣ（Ｎ－Ｍｅ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）（ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｓｓ／１．１．２４１）、２’－Ｃ架橋二環式ヌクレオチド（例えば、国際公開第２０１４／１４５３５６号（ＭｉＲａｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）におけるＣＢＢＮ）、ヘテロ環式架橋ＬＮＡ（例えば、国際公開第２０１４／１２６２２９号（Ｍｉｔｓｕｏｋａ Ｙら）における通り）、アミド架橋ＬＮＡ（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１５、１３、３７５７における通り）、尿素架橋ＬＮＡ（例えば、Ｎｉｓｈｉｄａら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０、４６、５２８３における通り）、スルホンアミド架橋ＬＮＡ（例えば、国際公開第２０１４／１１２４６３号（Ｏｂｉｋａ Ｓら）における通り）、二環系炭素環式ヌクレオシド（例えば、国際公開第２０１５／１４２９１０号（Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）における通り）、ＴｒｉＮＡ（Ｈａｎｅｓｓｉａｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２０１３、７８（１８）、９０６４～９０７５頁）、α－Ｌ－ＴｒｉＮＡ、ビシクロＤＮＡ（ｂｃＤＮＡ）（Ｂｏｌｌｉら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９６年３月；３（３）：１９７～２０６）、Ｆ－ｂｃＤＮＡ（ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊｏ４０２６９０ｊ）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）（Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０１２、４０巻、１３号、６１３５～６１４３）、Ｆ－ｔｃＤＮＡ（ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｏｃ．５ｂ００１８４）、オキセタンヌクレオチド単量体（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４、３２、５７９１～５７９９）である。上記で言及しなかった参考文献については、参照によりそれらの全体において組み込まれる、国際公開第２０１１／０９７６４１号（ＩＳＩＳ／Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及び国際公開第２０１６／０１７４２２号（大阪大学）を参照する。

生物学的活性部分として使用されうる、好ましいＡＯＮは、プレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションを誘導するＡＯＮであり、エクソンスキッピング又はエクソンインクルージョンを含むことが好ましい、前記プレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションは、好ましくは、タンパク質の産生又は組成を変更し、前記プレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションは、最も好ましくは、エクソンスキッピングを含む。このプレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションは、好ましくは、治療的である。

プレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションの目的は、ＲＮＡがコードするタンパク質であることが最も多い、タンパク質の産生を変更することでありうる。この産生は、前記産生のレベルの上昇又は低下により変更することができる。この産生はまた、例えば、プレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションが、１又は複数のエクソンの組入れ又は除外、及び異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を結果としてもたらす場合に、実際に産生されるタンパク質の組成の変更により変更することもできる。好ましくは、異なるアミノ酸配列を伴う、このようなタンパク質は、疾患又は状態の結果として産生されるタンパク質と比較して、より多くの機能性を有するか、又はより良好な機能性を有するか、又は少なくとも１つの変更された特性を有する。

ＤＭＤの場合、疾患の経過に干渉することが可能であることを究極の目標として、転写物のオープンリーディングフレームを回復し、短鎖ではあるが、（より）機能的なジストロフィンタンパク質の発現を誘導するために、プレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションを適用して、ジストロフィンプレｍＲＮＡにおける、１又は複数の特定のエクソンをスキップすることができる。同様な戦略は、ＢＭＤの経過への干渉も可能とする。ＳＭＡの場合、プレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションを適用して、第７エクソンの、ＳＭＮ２遺伝子への組入れを増強し、運動ニューロンタンパク質の生存レベルを上昇させ、これにより、脊髄における運動ニューロンの喪失と、その後における、随意筋の萎縮とを減殺することができる。したがって、好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、プレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションを行い、前記モジュレーションは、疾患又は状態と関連するタンパク質の産生を変更し、前記疾患又は状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）であることが好ましい。

生物学的活性部分として使用されうる、他の好ましいＡＯＮは、ヒトシスエレメントリピートの不安定性に関連する遺伝子障害を処置するために有効なＡＯＮである。これはまた、このような障害を患う対象の衰弱速度を緩徐化させることも包含する。本明細書で同定される、ヒトシスエレメントリピートの不安定性に関連する遺伝子障害は、好ましくは、神経筋障害である。リピート障害のための、治療用ＲＮＡによるモジュレーションは、ヒトシスエレメントリピートの不安定性と関連する遺伝性神経筋障害と関連するか、又はこれに関与することが公知の遺伝子の転写物の特定の配列に結合する（又はこれに結合することが可能である）、これをターゲティングする、これにハイブリダイズする（又はこれにハイブリダイズすることが可能である）、及び／又はこれと逆相補性であるオリゴヌクレオチドを伴う。例としては、ハンチントン病（ＨＤ）、いくつかの種類の脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）、フリードライヒ運動失調（ＦＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が含まれる。神経障害のサブセットは、シスエレメントリピートの不安定性により引き起こされる。例えば、ＨＤは、ＨＴＴ遺伝子の第１エクソンにおける、トリプレット（ＣＡＧ）_ｎリピートの拡大により引き起こされる。

好ましい実施形態では、生物学的活性部分は、ＡＯＮ、より好ましくは、ヒトシスエレメントリピートの不安定性に関連する遺伝子障害を処置するためのＡＯＮ、又はプレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションを誘導するためのＡＯＮ、最も好ましくは、プレｍＲＮＡのスプライシングモジュレーションを誘導するためのＡＯＮである。好適なＡＯＮについては、国際公開第２０１３１１２０５３号において記載されている。この文脈における、好ましいＡＯＮは、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなる。この文脈における、好ましいＡＯＮは、わずか５０のヌクレオチド又はその類似体を含む。このようなＡＯＮは、任意選択で、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表されない、１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つの、さらなるヌクレオチド、又はこれらの類似体を含むことが可能であり、好ましくは、このようなさらなるヌクレオチド又はその類似体は、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列の５’末端及び／又は３’末端に含まれる。より好ましいオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートＲＮＡ単量体を含むか、又は２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートＲＮＡからなり、より好ましくは、５－メチルピリミジン（すなわち、５－メチルシトシン、及び／又は５－メチルウラシル）塩基、及び／又は２，６－ジアミノプリン塩基を含み、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つを含むか、若しくはこれらからなる、ヌクレオチド若しくは塩基配列、又は配列番号８４～３３０の断片を含むか、若しくはこれらからなる、ヌクレオチド若しくは塩基配列により表される。この文脈では、「５－メチルピリミジン」とは、少なくとも１つの５－メチルピリミジンを意味する。したがって、「少なくとも１つの５－メチルピリミジン」とは、少なくとも１つの５－メチルシトシン及び／又は少なくとも１つの５－メチルウラシルを意味する。この文脈では、配列番号の断片とは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３ヌクレオチドの長さを有し、断片の長さにわたり、前記配列番号との、１００％の配列同一性を有する配列を指す。本発明はまた、生物学的活性部分が、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなり、以下：
ｉ）好ましくは、２’－Ｆ単量体、２’－Ｏ－メチル単量体、２’－アミノ単量体、又は２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）単量体、最も好ましくは、２’－Ｏ－メチル単量体である、２’－置換単量体；
ｉｉ）シトシン塩基を置換する、少なくとも１つの５－メチルシトシン塩基；
ｉｉｉ）全てのシトシン塩基を置換する、５－メチルシトシン塩基；
ｉｖ）ウラシル塩基を置換する、少なくとも１つの５－メチルウラシル塩基；
ｖ）全てのウラシル塩基を置換する、５－メチルウラシル塩基；
ｖｉ）ホスホジエステル骨格連結を置換する、少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結；
ｖｉｉ）全てのホスホジエステル骨格連結を置換する、ホスホロチオエート骨格連結；
ｖｉｉｉ）本明細書の前出で記載した類似体の単量体など、少なくとも１つの類似体の単量体
のうちの１又は複数を含むＡＯＮである、本発明に従うコンジュゲートも提供する。

本発明は、生物学的活性部分が、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなるＡＯＮである、本発明に従うコンジュゲートを提供する。好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分が、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなり、少なくとも１つの類似体の単量体を含むＡＯＮである、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

より好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分が、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなり、５－メチルピリミジン単量体、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート単量体、ＢＮＡ単量体、ＰＭＯ単量体、及びＰＮＡ単量体からなる群から選択される、少なくとも１つの類似体の単量体を含むＡＯＮである、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

さらにより好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分が、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなり、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート単量体だけを含むＡＯＮである、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

さらにより好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分が、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなり、少なくとも１つの５－メチルピリミジン単量体を含むＡＯＮである、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

さらにより好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分が、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなり、少なくとも１つの５－メチルピリミジン単量体と、少なくとも１つの２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート単量体とを含むＡＯＮである、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

さらにより好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分が、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなり、少なくとも１つの５－メチルピリミジン単量体と、少なくとも１つの２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート単量体と、少なくとも１つのＢＮＡ単量体とを含むＡＯＮである、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

さらにより好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分が、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなり、ＰＭＯ単量体を含むか、又はこれらからなるＡＯＮである、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

さらにより好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分が、配列番号８４～３３０のうちのいずれか１つにより表される配列を含むか、又はこれらからなり、ＰＮＡ単量体を含むか、又はこれらからなるＡＯＮである、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

好ましい実施形態では、本発明に従うコンジュゲートは、診断用部分を含む。診断用部分とは、このような診断用部分が、フルオレセインなどのフルオロフォア、発色団、放射性トレーサー、特定の同位元素、診断用マーカー、又はビオチンであることが好ましいハプテンである、検出のための方法を使用する検出を容易とする、任意の部分であると理解される。好ましい実施形態では、診断用部分は、トリチウムで標識化されたアミノ酸であることがより好ましい、放射性標識化されたアミノ酸を、好ましくは、組み込んでいることにより、コンジュゲートを、放射性標識化する。診断用部分は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける診断を目的とする診断用部分でありうる。一般に使用されるイメージング標識、放射性標識、又はＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＶＩＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５など、若しくは緑色タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光標識、或いはおそらく、組換え発現を介する、他の診断用タンパク質を、診断用部分として使用することができる。好ましい実施形態では、診断用部分は、ファージ又はファージの一部ではなく、より好ましくは、診断用部分は、ファージではない。

好ましい実施形態では、この態様は、請求項１に記載のペプチドと、生物学的活性部分又は診断用部分との融合タンパク質であり、生物学的活性部分が、治療的に活性であるタンパク質である、及び／又は診断用部分が、診断用タンパク質である、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

好ましい実施形態では、この態様は、核局在化シグナル及び／又は細胞透過性ペプチドをさらに含む、本発明に従うコンジュゲートを提供する。より好ましい実施形態では、本発明に従うコンジュゲートは、核局在化シグナルをさらに含む。他のより好ましい実施形態では、本発明に従うコンジュゲートは、細胞透過性ペプチドをさらに含む。細胞透過性ペプチドとは、化合物自体、又はさらなる化合物、又はコンジュゲート又は連結された化合物の、細胞への移入を促進するのに使用されうるペプチドである。当業者は、適切な細胞透過性ペプチドを同定することが可能であろう。

一実施形態では、本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体を、核局在化シグナル（Nuclearlocalisation signal又はnuclear localization signal、ＮＬＳ）と組み合わせる。一実施形態では、本発明に従うコンジュゲートを、ＮＬＳと組み合わせる。本発明の文脈では、ＮＬＳは、細胞質の核内輸送受容体によるその認識を介して、本コンジュゲート、例えば、生物学的活性部分又は診断用部分を、細胞核へと方向付けるように機能する。ＮＬＳは、本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体の一部であることが可能であり、例えば、ＮＬＳのアミノ又はカルボキシ末端を、上記で記載したペプチドを含むか、又はこれらからなる配列で伸長させることができる。ＮＬＳもまた、本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体の位置とは異なる位置において、生物学的活性部分又は診断用部分へとカップリングさせることができる。当技術分野では、ＮＬＳ配列が公知である。典型的には、ＮＬＳシグナルは、正に帯電したリシン及び／又はアルギニンの、（少数の）短い配列からなるか、又はこれらを含み、例えば、ＮＬＳは、（Ｋ）ＫＫＲ（Ｋ）、（Ｋ）ＫＲＳ（Ｋ）、（Ｋ）（Ｓ）ＲＫ（Ｒ）（Ｋ）からなるか、又はこれらを含む。公知のＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ、ＧＫＫＲＳＫＶ、ＫＳＲＫＲＫＬである。一実施形態では、本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体を、配列番号６９～８３からなる群から選択されるＮＬＳと組み合わせる。

一実施形態では、本発明に従うコンジュゲートはまた、非ウイルス性遺伝子送達又は非ウイルス性遺伝子治療のためのツールとしても使用することができる。コンジュゲートとして、本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体は、遺伝子構築物を、細胞、特に、筋細胞へとターゲティングすることができる。一実施形態では、遺伝子構築物は、酵素置換療法において、酵素の産生を可能とするか、又は遺伝子構築物は、例えば、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、ビリルビンＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ、アルファ－グルコシダーゼなど、全てのリソソーム蓄積症タンパク質、又は、特に、アルヅラザイム（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ）（登録商標）、セレザイム（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ）（登録商標）、ファブラザイム（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ）（登録商標）、若しくはミオザイム（Ｍｙｏｚｙｍｅ）（登録商標）などの治療用タンパク質の産生を可能とする。

本発明の一実施形態は、ウイルス又はウイルス粒子の、細胞へのターゲティングである。本発明に従うコンジュゲートでは、ウイルス又はウイルス粒子は、生物学的活性部分である。一実施形態では、ペプチド又はペプチド模倣体が、ウイルス又はウイルス粒子の外面において発現するように、ペプチド又はペプチド模倣体のＤＮＡ／ＲＮＡ配列を、ウイルスのゲノムに組み入れることにより本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体を、ウイルス性の生物学的活性部分へと連結する。当業者には、このような発現をもたらす組換え法が周知である。こうして、ペプチド又はペプチド模倣体は、ウイルス又はウイルス粒子を、特定の細胞／組織へとターゲティングする。これは、ターゲティングされたワクチン接種、遺伝子治療、遺伝子置換、又はウイルスエクソンスキッピング構築物に特に重要である（Ｕ１又はＵ７の低分子核ＲＮＡへと融合した、アンチセンス配列を発現するＡＡＶベクター；Ｄｅｎｔｉら、２００６、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７、５６５～５７４）。

本発明に従う好ましいペプチドは、環状ペプチドである。したがって、好ましい実施形態は、ペプチド又はペプチド模倣体が、環状である、本発明に従うコンジュゲートを提供する。環状ペプチドとは、ペプチドの骨格原子により形成される環を含むペプチドである。このような環は、１２又はこれを超える原子から構成される環である大員環でありうる。環は、本明細書では、閉鎖結合と称する結合により閉鎖されることが好ましい。好ましい閉鎖結合は、共有結合である。環状ペプチドは、直鎖状ペプチドより安定的でありうる。直鎖状ペプチドと比較して、環状ペプチドは、少数のロータマーを有することが多い。

閉鎖結合は、本明細書で、フランキング部分と称する、２つの部分の間で形成される。本発明に従う環状ペプチドは、フランキング部分は、セットで対をなして、閉鎖結合を形成するため、偶数のフランキング部分を含む。フランキング部分に言及する場合、２つのフランキング部分のセットのマッチングに言及するのか、必ずしも、セットの一部ではない、個々のフランキング部分に言及するのかは、文脈により明らかになる。フランキング部分のセット内で、個々のフランキング部分は、アミノ酸残基又は他の部分を含みうるか、又はこれらからなりうる。好ましくは、フランキング部分は、個別に、アミノ酸残基を含むか、又はこれらからなる。より好ましくは、フランキング部分は、個別に、１つのアミノ酸残基からなる。非限定例として述べると、これは、システインなど、天然のアミノ酸の場合もあり、そのε－アミンにおいて修飾されたリシンなど、誘導体化アミノ酸の場合もあり、アリルグリシンなど、非天然のアミノ酸の場合もある。

閉鎖結合は、ターゲティング配列（配列番号１～６３、好ましくは配列番号２４又は２５）を挟む、２つのフランキング部分を接続する。したがって、本発明は、ペプチド又はペプチド模倣体が、フランキング部分を含み、前記フランキング部分が、ターゲティング配列を挟むアミノ酸残基又は他の部分を含むか、又はこれらからなり、前記フランキング部分が、互いとの結合を形成する、本発明に従うコンジュゲートを提供する。好ましくは、この結合は、共有結合である。より好ましくは、本発明は、環状ペプチド又は環状ペプチド模倣体が、フランキング部分を含み、前記フランキング部分が、ターゲティング配列を挟むアミノ酸残基又は他の部分を含むか、又はこれらからなり、前記フランキング部分が、互いとの結合を形成する、本発明に従うコンジュゲートを提供する。好ましくは、この結合は、共有結合である。

ターゲティング配列に対する、これらのフランキング部分の位置は、変動する場合があり、いずれの場合も、独立に、末端の隣の場合もあり、そうでない場合もあり、例えば、ターゲティング配列を、ジスルフィド架橋の形成を可能とする、２つのＣｙｓ残基で挟むことができ；このようなＣｙｓ残基の位置は、ターゲティング配列の直接隣の場合（例えば、Ｃｙｓ－Ａａ１－Ａａ２－Ａａ３－Ａａ４－Ａａ５－Ａａ６－Ａａ７－Ｃｙｓをもたらし、ＡａＸは、アミノ酸番号Ｘを指し；アミノ酸番号Ｘ１～７は、ターゲティング配列を構成する）もあり、ペプチドにおける他の位置（例えば、Ｃｙｓ－Ｒａ０－Ａａ１－Ａａ２－Ａａ３－Ａａ４－Ａａ５－Ａａ６－Ａａ７－Ｒａ８－Ｒａ９－Ｒａ１０－Ｒａ１１－Ｃｙｓにおける通りであり、ＲａＸは、ランダムなアミノ酸番号Ｘを意味し；ＡａＸ番号Ｘ１～７は、ターゲティング配列を構成し；ＲａＸは、ターゲティング配列と、フランキング部分との間のリンカー部分として機能するアミノ酸残基である）の場合もある。他のアミノ酸残基又は化学的部分で、上記の例における、２つのＣｙｓ残基を置換することができる。

本発明にはまた、閉鎖結合を形成しうる他の部分を含む、上記で記載したペプチドも包含される。このような部分の例は、チオール及びマレイミド、酸及びアミン、チオール及びα－ハロアセチル部分、並びにアジド及びアルキン、アジド及び歪みアルキン、アルキン及びテトラジン、アルキン及びニトロン、テトラジン及びノルボルネン、又は他の歪み二重結合若しくは三重結合などの生体直交型反応、並びに当業者に公知の、他のいわゆる「クリック」反応に参与しうる部分である。このような部分は、非天然のアミノ酸保有部分の使用により導入することもでき、このような部分の、天然のアミノ酸の側鎖へのコンジュゲーションにより導入することもできる。

したがって、このような環化は、多くの形態を取ることが可能であり、当業者には、それらの全てが公知である。非限定例は、ジスルフィド、エステル、エーテル、カルバメート、アルキルアミン、アミド、チオアシル、チオエステル、スルホン、スルホキシド、スルホンアミド、チオエーテル（例えば、ＰｅｐＳｃａｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製のクリップステクノロジー（ＣＬＩＰＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である、チオール－マレイミドカップリング）、トリアゾール（例えば、アジド－アルキニルカップリング）、アルケニル（例えば、閉環メタセシス）を介する環化である。

好ましいフランキング部分は、それらの側鎖を介して、閉鎖結合を形成しうる、アミノ酸残基である。好ましい実施形態では、本発明は、フランキング部分が、ジスルフィド架橋を形成し、好ましくは、フランキング部分が、システイン残基を含むか、又はこれらからなる、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

２つの部分が、ペプチドに含まれる配列を挟む場合の、本発明の文脈では、２つのフランキング部分は、前記ペプチドにおける２つの残基を構成し、これらの２つの残基のうちの一方は、この同じペプチドの直前に含まれるか、又は、他の形で、前記配列の第１の残基の前に含まれるか、又は、言い換えれば、前記配列に対して、Ｎ末端に含まれ、これらの２つの残基のうちの他方は、この同じペプチドの直後に含まれるか、又は、他の形で、前記配列の最後の残基の後に含まれるか、又は、言い換えれば、前記配列に対して、Ｃ末端に含まれる。好ましくは、フランキング部分は、前記配列から、わずか１５残基、又はわずか１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０残基隔てられている。これは、フランキング部分が、前記配列と隣接しているか、又は、言い換えれば、２つのフランキング部分のうちの一方が、配列の第１の残基の直前にあり、２つのフランキング部分のうちの他方が、配列の最後の残基の直後にあることを意味しうる。より好ましくは、フランキング部分は、前記配列から、わずか４、３、２、１、又は０残基隔てられている。最も好ましくは、フランキング部分は、前記配列と隣接しており、これは、フランキング部分が、前記配列から、０残基隔てられていることを意味する。残基が、６－アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）などのリンカー部分により隔てられている場合の、この文脈では、このようなリンカー部分自体を、残基と解釈することができる。

したがって、本発明の好ましいペプチドでは、フランキング部分は、配列番号１～６３（好ましくは、配列番号２４又は２５）からなる群から選択される前記配列から、わずか４、３、２、１、又は０残基隔てられており、好ましくは、フランキング部分は、前記配列と隣接している。したがって、本発明は、フランキング部分が、ターゲティング配列から、４、３、２、１、又は０残基隔てられており、好ましくは、フランキング部分が、ターゲティング配列と隣接している、本発明に従うコンジュゲートを提供する。

好ましくは、本発明に従うペプチド内で、閉鎖結合は、ジスルフィド架橋である。本発明に従うペプチド内で、フランキング部分は、好ましくは、アミノ酸残基、より好ましくは、システイン残基又はホモシステイン残基、最も好ましくは、システイン残基である。

本発明の態様の、好ましい実施形態では、ターゲティング配列が、配列番号１～２５からなる群、好ましくは、配列番号１４～２５からなる群、より好ましくは、配列番号２４～２５からなる群から選択される、本発明に従うコンジュゲート、又は本発明に従う使用のためのコンジュゲート、又は本発明に従う分子が提供される。

したがって、好ましい実施形態では、ターゲティング配列が、
ＬＴＬＰＷＳＫ ＶＫＨＫＳＬＤ ＦＳＨＴＹＲＶ ＱＬＦＰＬＦＲ ＴＬＱＤＱＡＴ ＬＬＧＨＴＮＮ ＩＡＷＮＫＱＧ ＳＬＦＫＮＳＲ ＲＥＮＴＮＨＴ ＱＶＲＳＮＴＴ ＫＴＧＨＡＨＬ ＴＹＳＰＴＥＶ ＫＹＭＳＳＨＡ ＬＮＳＬＦＧＳ ＫＤＰＲＰＡＬ ＲＡＤＦＹＴＴ ＷＮＥＤＨＴＷ ＭＱＨＳＭＲＶ ＬＰＤＡＹＨＶ ＳＲＦＱＬＰＱ ＬＫＳＡＧＮＮ ＶＳＰＳＫＳＦ ＹＧＴＧＮＮＹ ＤＰＲＴＱＰＨ ＹＥＴＳＫＥＳ
からなる群から選択される、本発明に従うペプチド又はペプチド模倣体が提供される。
好ましくは、ターゲティング配列は、
ＦＳＨＴＹＲＶ ＱＬＦＰＬＦＲ ＴＬＱＤＱＡＴ ＳＬＦＫＮＳＲ ＲＥＮＴＮＨＴ ＱＶＲＳＮＴＴ ＴＹＳＰＴＥＶ ＬＮＳＬＦＧＳ ＲＡＤＦＹＴＴ ＷＮＥＤＨＴＷ ＭＱＨＳＭＲＶ ＬＬＧＨＴＮＮ
からなる群から選択される。
より好ましくは、ターゲティング配列は、
ＬＮＳＬＦＧＳ ＱＬＦＰＬＦＲ
からなる群から選択される。

態様の、最も好ましい実施形態では、（ｉ）ＬＮＳＬＦＧＳであるターゲティング配列を含むか、又はこれらからなるペプチド又はペプチド模倣体のコンジュゲートであって、ペプチド又はペプチド模倣体が、（ｉｉ）生物学的活性部分及び診断用部分から選択される部分へと連結されたコンジュゲートが提供される。好ましくは、前記ペプチドは、環状であり、フランキング部分は、ターゲティング配列であるＬＮＳＬＦＧＳと直接隣接し、ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基である。

態様の、他の最も好ましい実施形態では、（ｉ）ＱＬＦＰＬＦＲであるターゲティング配列を含むか、又はこれらからなるペプチド又はペプチド模倣体のコンジュゲートであって、ペプチド又はペプチド模倣体が、（ｉｉ）生物学的活性部分及び診断用部分から選択される部分へと連結されたコンジュゲートが提供される。好ましくは、前記ペプチドは、環状であり、フランキング部分は、ターゲティング配列であるＱＬＦＰＬＦＲと直接隣接し、ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基である。

使用
本発明は、オリゴヌクレオチド、遺伝子、タンパク質、医薬などの生物学的活性部分を、多様な臓器又は組織、とりわけ、筋細胞及び心臓へとターゲティングするための、ペプチド又はペプチド模倣体を提供する。したがって、本発明はまた、好ましくは、生物学的活性部分又は診断用部分を、筋細胞へとターゲティングするための、本発明に従うペプチド、又は本発明に従うコンジュゲートの、医薬としての使用にも関する。したがって、第２の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明に従うペプチドを提供する。こうして、本発明は、医薬としての使用のための、配列番号１～６３（好ましくは、配列番号２４又は２５）からなる群から選択される、ターゲティング配列を含むか、又はこれらからなる、ペプチド又はペプチド模倣体を提供する。好ましくは、本発明に従う、このようなペプチドは、本発明に従うコンジュゲートに含まれる。したがって、第２の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明に従うコンジュゲートを提供する。本明細書では、使用のためのこれらのペプチドを、本発明に従う使用のためのペプチドと称する。本明細書では、使用のためのこれらのコンジュゲートを、本発明に従う使用のためのコンジュゲートと称する。この態様についての、好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分又は診断用部分を、筋細胞へとターゲティングするための、本発明に従う使用のためのペプチドを提供する。この態様についての、好ましい実施形態では、本発明は、生物学的活性部分又は診断用部分を、筋細胞へとターゲティングするための、本発明に従う使用のためのコンジュゲートを提供する。

好ましい実施形態では、本発明に従う使用のためのコンジュゲート、又は本発明に従う使用のためのペプチドを、全身（例えば、静脈内、皮下）投与又は筋内投与する。

一実施形態では、医薬は、心障害を含む筋細胞関連障害の処置のための医薬である。したがって、好ましい実施形態では、この態様は、医薬が、心障害を含む筋細胞関連障害の処置のための医薬である、本発明に従う使用のためのコンジュゲートを提供する。さらに好ましい実施形態では、この態様は、医薬が、心障害を含む筋細胞関連障害の処置のための医薬である、本発明に従う使用のためのペプチドを提供する。筋細胞関連障害は、ミオパチー、筋ジストロフィー、及び筋肉消耗疾患を含む。したがって、好ましい実施形態では、この態様は、医薬が、ミオパチー、筋ジストロフィー、又は筋肉消耗疾患の処置のための医薬である、本発明に従う使用のためのコンジュゲートを提供する。さらに好ましい実施形態では、この態様は、医薬が、ミオパチー、筋ジストロフィー、又は筋肉消耗疾患の処置のための医薬である、本発明に従う使用のためのペプチドを提供する。一実施形態では、医薬は、ミオスタチンと関連する障害の処置のための医薬である。ミオスタチンはまた、自己免疫疾患、代謝性障害、肥満、及びＩＩ型糖尿病とも関連している。したがって、一実施形態では、医薬は、自己免疫疾患、代謝性障害、肥満、及び／又はＩＩ型糖尿病の処置のための医薬である。したがって、好ましい実施形態では、この態様は、医薬が、自己免疫疾患、代謝性障害、肥満、又はＩＩ型糖尿病の処置のための医薬である、本発明に従う使用のためのコンジュゲートを提供する。さらに好ましい実施形態では、この態様は、医薬が、自己免疫疾患、代謝性障害、肥満、又はＩＩ型糖尿病の処置のための医薬である、本発明に従う使用のためのペプチドを提供する。別の実施形態では、医薬は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリー－ドレフュス型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、１型筋強直性ジストロフィー、２型筋強直性ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、乳児型脊髄性筋萎縮症、（若年型、中間型、成人型）脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、皮膚筋炎、多発筋炎、封入体筋炎、重症筋無力症、ランバート－イートン筋無力症候群、エメリー－ドレフュス型筋ジストロフィー、先天性筋無力症候群、甲状腺機能更新性ミオパチー、甲状腺機能低下性ミオパチー、シャルコー－マリー－トゥース病、フリードライヒ運動失調、デジェリーヌ－ソッタス病、先天性ミオトニー（トムセン病及びベッカー病の両方）、先天性パラミオトニア、セントラルコア病、ネマリンミオパチー、ミオチュブラーミオパチー（中心核ミオパチー）、周期性四肢麻痺（低カリウム血性及び高カリウム血性の両方）、ミトコンドリア性ミオパチー、並びにカルニチン及び以下の酵素：ホスホリラーゼ、酸マルターゼ（ポンペ病）、ホスホフルクトキナーゼ、枝切り酵素（アミロ－１，６－グルコシダーゼとしてもまた公知である）の欠損に起因する筋疾患；フォーブズ病としてもまた公知のグリコーゲン蓄積症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、及びミオアデニル酸デアミナーゼの欠損に起因する筋疾患からなる群から選択される、心障害を含む筋細胞関連障害の処置のための医薬である。

本発明にはまた、本発明に従うペプチドをコードする配列、及びその相補的なＤＮＡ配列からなるか、又はこれらを含むＤＮＡ、並びに本発明に従うペプチドをコードする配列、及びその相補的なＲＮＡ配列からなるか、又はこれらを含むＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物も包含される。

本発明はまた、本発明に従うコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物にも関する。本明細書の前出で規定した通り、このような組成物は、医薬としての使用のための組成物でありうる。

一般的な定義
本出願では、「物質」とは、純粋な分子、複数の異なる分子の複合体、オリゴマー、ポリマー、ポリペプチド、タンパク質、粒子、又はこれらの断片として解釈されるべきである。

本明細書で使用される「隣接する」という用語は、隣接する物質の間に、他の物質が存在しないことを含意する。例えば、ペプチドにおいて隣接する残基とは、互いと直接隣り合う残基である。非限定例として述べると、アミノ酸残基が、アミノ酸の特定の配列と隣接するという場合、残基は、前記配列と連続し、直接連結されている。

本発明に従うコンジュゲート、本発明に従うペプチド、及び本発明に従う分子は、それらの分子的構造において、単純な変動を有しうる。ここで、可能な置換基について記載する：

非置換アルキル基は、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１を有し、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もある。非置換アルキル基はまた、環状部分も含有することが可能であるので、付随的な一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ－１も有する。任意選択で、アルキル基は、本明細書でさらに指定される、１又は複数の置換基によっても置換される。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、２－プロピル、ｔ－ブチル、１－ヘキシル、１－ドデシルなどを含む。

アルキル基に次いで、可能な置換基は、ハロゲン、アミノ基、オキソ、及びシリル基であり、この場合、シリル基は、式（Ｒ_２）_３Ｓｉ－［式中、Ｒ_２は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニルオキシ基、及びＣ３～Ｃ１２シクロアルキルオキシ基からなる群から、独立に選択され、この場合、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、及びシクロアルキルオキシ基は、任意選択で、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される、１又は複数のヘテロ原子により中断される、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基、及びシクロアルコキシ基で置換される］により表すことができる。

当業者により、構造式又は化学名が、キラル中心を有すると理解されるが、各キラル中心についてのキラリティーが表示されていない場合、ラセミ混合物、純粋なＲ光学異性体、及び純粋なＳ光学異性体の３つ全てに、個別の言及がなされる。

本発明の文脈で、物質のパラメータについて論じる場合はいつでも、そうでないことが指定されない限りにおいて、パラメータは、生理学的条件下で決定、測定、又は明示されることが仮定される。生理学的条件は、当業者に公知であり、水性溶媒系、大気圧、６～８の間のｐＨ値、室温～約３７℃（約２０℃～約４０℃）の範囲の温度、及び好適な濃度の緩衝塩又は他の成分を含む。電荷は、平衡と関連することが多いことが理解される。電荷を保有するか、又は持つといわれる部分は、このような電荷を持たないか、又は保有しない状態においてよりも、このような電荷を保持又は保有する状態において見出されることが多い部分である。したがって、当業者により理解される通り、本開示において帯電していることが指し示される原子が、特定の条件下で、帯電しない場合もあり、中性部分が、特定の条件下で帯電する場合もある。

本発明の文脈では、評価されるパラメータの減少又は増大は、このパラメータに対応する値の、少なくとも５％の変化を意味する。より好ましくは、値の減少又は増大は、少なくとも１０％、なおより好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、又は１００％の変化を意味する。この後者の場合は、パラメータと関連する検出可能な値が存在しない場合でありうる。

物質の、本明細書において記載される医薬としての使用はまた、前記物質の、医薬の製造における使用としても解釈することができる。同様に、処置のために、又は医薬として使用する場合はいつでも、物質はまた、処置のための医薬の製造のためにも使用することができる。処置のための物質は、処置法に適する。このような方法は、物質の、対象への投与を含むことが可能であり、このような方法は、それを必要とする対象への、有効量の物質の投与を含むことが好ましい。対象は、ヒトの場合もあり、非ヒトの場合もあるが、好ましい対象は、哺乳動物である。記載では、本発明の異なる態様を、いくつかの実施形態の形態で、より詳細に規定する。逆のことが明確に指し示されない限りにおいて、このように規定された各実施形態を、他の任意の、１又は複数の実施形態と組み合わせることができる。特に、好ましいか、又は有利であると指し示された、任意の特色を、好ましいか、又は有利であると指し示された、他の任意の、１又は複数の特色と組み合わせることができる。

本明細書及びその特許請求の範囲では、「～を含む」という動詞及びその活用形は、この語に後続する項目を含み、詳細には言及されない項目を除外しないことを意味するように、非限定的な意味で使用される。加えて、「～からなる」という動詞は、「～から本質的になる」で置き換えることができ、本明細書で規定される産物又は組合せ又は組成物が、詳細に同定されるもの以外のさらなる構成要素（複数可）を含むことが可能であり、前記さらなる構成要素（複数可）が、本発明の固有の特徴を変更しないことを意味する。加えて、不定冠詞「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」による、要素への言及は、文脈により、要素のうちの１つが存在し、１つだけが存在することが明確に要求されない限りにおいて、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。不定冠詞「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」は通例、「少なくとも１つの」を意味する。そうでないことが規定されない限りにおいて、本発明の開示において使用される、技術用語及び科学用語を含む、全ての用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味を有する。さらなる指針を目的として、本発明の教示を、十分に察知するように、用語の定義を組み入れる。数値と関連して使用される場合の「約」又は「およそ」（例えば、約１０）は、値が、所与の値（１０の値）より、値の０．１％大きい値又は小さい値でありうることを意味することが好ましい。

本明細書で引用される、全ての特許及び参考文献は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。以下の例は、例示的な目的だけで提示されるものであり、本発明の範囲を、いかなる形でも、限定することを意図するものではない。

一般的な細胞培養
全ての細胞を、３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて培養した。ヒト対照筋芽細胞（ファージディスプレイバイオパニングのために使用される７３０４－１細胞（Ｚｈｕら、２００７））を、細胞培養（Ｎｕｔａｃｏｎ Ｂ．Ｖ．Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のための、精製ウシ皮膚コラーゲン（コラーゲン）でコーティングされたフラスコの、グルタマックスＩ（ＧｌｕｔａＭａｘ－Ｉ）、２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（全てＧｉｂｃｏ－ＢＲＬ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）を補充した、ナットミックスＦ－１０（ＮｕｔＭｉｘ Ｆ－１０）（Ｈａｍ’ｓ）培地において増殖させた。細胞を、コラーゲンでコーティングしたペトリディッシュに播種し、９０％コンフルエンスまで増殖させてから、分化培地（２％のＦＢＳ、１％のＰ／Ｓ、２％のグルタマックス、及び１％のグルコース（全てＧｉｂｃｏ－ＢＲＬ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）を伴う（フェノールレッドを伴わない）ダルベッコ培地）へと切り替えた。細胞を、７～１４日間にわたり分化させた。

ヒト対照筋芽細胞（Ｋｍ１５５．ｃ２５細胞、（Ｚｈｕら、２００７））を、コーティングされていないフラスコの、追加の１５％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を補充した骨格筋細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｃ－２３１６０）において、７０～８０％コンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞を、分化の４８時間前に、０．５％のゼラチンでコーティングされたスライドガラス（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を伴う６ウェルプレートに、ウェル１つ当たりの細胞１×１０^５個の密度で播種した。９０％コンフルエンスに達したら、培地を、分化培地（２％のＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、２％のグルタマックス、及び１％のグルコース（全てＧｉｂｃｏ－ＢＲＬ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）を伴う（フェノールレッドを伴わない）ダルベッコ培地）へと切り替えた。細胞を、３～５日間にわたり分化させた。

不死化ヒト心筋細胞（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｃａｎａｄａ）を、コラーゲンでコーティングしたフラスコの、１０％のＦＢＳ、及び１％のＰ／Ｓを補充したＰｒｉｇｒｏｗ Ｉ培地においてにおいて増殖させた。実験の前に、細胞を、６ウェルプレートの、コラーゲンでコーティングしたスライドガラスに播種し、コンフルエンスまで増殖させた。

実施例１：ファージディスプレイによる選択及びシーケンシング
ファージディスプレイによる選択実験及び候補ペプチドの同定についての概観（図１）
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるバイオパニング

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるバイオパニングは、’ｔ Ｈｏｅｎらにより既に記載されている通りに実施した（’ｔ Ｈｏｅｎら、２０１２）。分化させたヒト対照筋芽細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、３回にわたり洗浄し、３７℃、５％ＣＯ_２で、１時間にわたり、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＤＭＥＭと共にインキュベートした。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、Ｐｈ．Ｄ．－Ｃ７Ｃ（商標）ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（Ｐｈ．Ｄ．－Ｃ７Ｃ（商標）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に由来するファージ２×１０^１１個と共に、１分間当たり７０回転で振盪しながら、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を、０．１％のＢＳＡを含有する、５ｍｌの氷冷ＤＭＥＭと共に、５分間インキュベートすることにより、６回にわたり洗浄した。その後、細胞を、０．１ＭのＨＣｌ（ｐＨ２．２）３ｍｌと共に、氷上で１０分間にわたりインキュベートして、細胞表面結合ファージを溶出させ、これを、０．５Ｍのトリス０．６ｍｌの添加により中和した。細胞会合ファージを回収するために、細胞を、氷上、３０ｍＭのトリスＨＣｌ ３ｍｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８において、１時間にわたり溶解させた。製造元の指示書（ＮＥＢ）に従い、各画分に由来するファージを、滴定及び増幅した。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるバイオパニング

合計３匹のｍｄｘマウスに、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける第１ラウンドである、細胞表面結合ファージ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞会合ファージ（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏにおける第２の選択ラウンド）、又はナイーブのＰｈ．Ｄ．－Ｃ７Ｃ（商標）ライブラリー（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏにおける第１の選択ラウンド）に由来するファージ２×１０^１１個を、静脈内（ＩＶ）注射した。ファージを、１時間にわたり循環させ、その後、マウスを灌流した。左右の大腿四頭筋、心臓、及び肝臓を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける選択に由来するファージを注射されたマウスから摘出した。腓腹筋及び大腿四頭筋、心臓、肝臓、並びに腎臓を、ナイーブライブラリーを注射されたマウスから摘出した。製造元の指示書（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従い、マグナライザー（ＭａｇＮａｌｙｚｅｒ）を使用して、ＴＢＳ緩衝液において、組織をホモジナイズした。ファージを、製造元の指示書（ＮＥＢ）に従い、滴定及び増幅した（本明細書の後出では、濃縮されたファージライブラリーと称する）。

ＤＮＡの単離及び次世代シーケンシング
全ファージＤＮＡを、単一のラウンドの細菌増幅の後で、濃縮された全てのファージライブラリー、ナイーブ非選択ライブラリー、及びナイーブライブラリーから単離した。濃縮された各ファージライブラリーから、ファージ粒子２×１０^１１個を、１．５ｍｌのチューブの、５００μｌのＬＢ増殖培地へと添加した。ファージを、２００μｌのＰＥＧ ８０００／ＮａＣｌにより、室温で、３～４時間にわたり沈殿させた。ファージをペレット化し、ＤＮＡを、製造元の指示書に従い単離した。最終的なペレット（ファージＤＮＡ）を、ミリキュー（ｍｉｌｌｉＱ）水に溶解させ、ＤＮＡ濃度を、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。ファージＤＮＡを、以下のプライマー（^＊は、ホスホロチオエート結合である）：
順方向：ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＡＣ ＡＣＴ ＴＣＣ ＴＴＴ ＡＧＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＴＴ ＣＴＡ ＴＴＣ ＴＣ＊Ａ（配列番号６４）
逆方向：ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧＡ ＧＡＴ ＣＧＧ ＸＸＸ ＸＸＸ ＸＸＸ ＡＴＧ ＧＧＡ ＴＴＴ ＴＧＣ ＴＡＡ ＡＣＡ ＡＣＴ ＴＴ＊Ｃ（配列番号６５）
を使用するＰＣＲにより増幅した。

ファージＤＮＡを増幅するのに使用されるＰＣＲプライマーは、２７ヌクレオチド長の未知のインサート配列（２つのシステインを含む）を挟む配列、あらゆる濃縮されたファージライブラリーについて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のフローセル及び固有のバーコード（下線を付した）への結合に必要なアダプターを認識した部分配列を含有する。適用されるＰＣＲプロトコールは、以下の通りであった：１ｎｇのファージＤＮＡを、２．６２５Ｕ高忠実度Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、１５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する、１倍濃度の高忠実度ＰＣＲ緩衝液における、２０ｐＭのプライマーと共にインキュベートし、各々が、９４℃で３０秒間、６７℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間にわたるインキュベーションからなる、２０サイクルにわたり増幅した。ＰＣＲは、指数増殖期に停止させて、ＰＣＲにより誘導される配列バイアスを緩和した。最終ＰＣＲ産物は、キアクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）により精製した。ＰＣＲ産物の濃度並びに正確な長さは、アジレント２１００バイオアナライザーＤＮＡ １０００アッセイ（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ａｓｓａｙ）により確立した。濃縮されたファージライブラリーに由来する、全てのＰＣＲ産物を、単一のレーンにおいて組み合わせた。ナイーブ非選択ライブラリー（増幅を伴うライブラリー及び増幅を伴わないライブラリー）に由来するファージ画分を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のフローセルの別のレーンにおいて、一体に組み合わせた。両方のプールを、製造元の仕様（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従い、クラスターステーションにおける固相増幅にかけた。未知のインサート配列（ＡＣＡ ＣＴＴ ＣＣＴ ＴＴＡ ＧＴＧ ＧＴＡ ＣＣＴ ＴＴＣ ＴＡＴ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＣ＊Ｔ：配列番号６６）の最初の位置で始まる、カスタムのシーケンシングプライマーを使用して、最大で５０サイクルの単一末端シーケンシングを実施した。シーケンシングは、イルミナハイセック２０００ウィズｖ３フローセルアンドリエージェント（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００ ｗｉｔｈ ｖ３ ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｒｅａｇｅｎｔｓ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により実施した。

次世代シーケンシング解析
イルミナカサバ１．８．２ソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＣＡＳＡＶＡ １．８．２ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢＣＬファイルから、ｆａｓｔｑファイルを抽出し、個々の試料バーコードに基づき、データを分割した。さらなる解析のために、配列が、以下の基準を満たさない場合、配列にフィルターをかけた：配列は、ＧＣＴ ＴＧＴで始まり、（ＮＮＫ）_７を後続させ、ＴＧＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＴで終わり、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｋは、Ｇ又はＴである。その後、従来のアミノ酸コドン表を使用する、カスタムのｐｅｒｌスクリプトにより、配列を、アミノ酸配列へと翻訳した。終止コドンであるＴＡＧに遭遇したら、製造元の指示書（ＮＥＢ）に従い、これを、ＣＡＧコドン（アミノ酸グルタミン）へと変化させた。カバレッジについての概観を、表２及び図１に示す。シーケンシングされた全てのファージライブラリーデータは、カウントデータにおける分散を安定化させるのに一般に適用されるデータ変換である、ライブラリーにおけるカウント数に対する平方根変換により正規化した（’ｔ Ｈｏｅｎら、２００８ａ）。その後、パラサイト配列を除外した。パラサイト配列は、増幅されたナイーブライブラリーにおける頻度カウントから、増幅されていないナイーブライブラリーにおける頻度カウントを減じた値が、２より大きい配列として規定した。次に、２つの別個の解析を実施した。第１に、肝臓及び／又は腎臓において、頻度カウントが２より大きな配列を、濃縮された骨格筋ライブラリー及び心筋ライブラリーから除外した。骨格筋ライブラリー及び心筋ライブラリーにおける配列を、ライブラリーごとに、頻度カウントによりランクづけし、重要な候補配列を、２つの群、すなわち、「骨格筋」及び「心筋」に分けた。第２に、肝臓ライブラリー及び腎臓ライブラリーについての閾値を無視し、骨格筋ライブラリー及び心筋ライブラリーを、頻度カウントに基づきランクづけした。肝臓及び／又は腎臓において、カウントが、骨格又は心筋と比較して高頻度のペプチド配列を除去した。

実施例２：蛍光標識化された環状ペプチドについての、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける評価
蛍光標識化されたペプチドは、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を使用して標識化し、Ｐｅｐｓｃａｎ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得た。ＦＩＴＣ標識を、ペプチドのＮ末端へと付加された、Ａｈｘ（６－アミノヘキサン酸）スペーサーへと接合させ、Ｃ末端の一部をアミド化し、ペプチドを、ジスルフィド環化により、環状とした。本発明に従うペプチドは、システインによるフランキング部分を有し、フランキング部分は、ターゲティング配列である、配列番号１４～２５と直接隣接した。

ヒト対照筋管及びヒト心筋細胞を、ＰＢＳで、２回にわたり洗浄し、２．２５μＭの、ＦＩＴＣで標識化されたペプチドと共に、血清遊離培地において、３７℃及び５％ＣＯ_２で、３時間にわたりインキュベートした。細胞を、ＰＢＳで、３回にわたり洗浄し、低温メタノール（－２０℃）で、５分間（ヒト対照筋管）又は１０分間（ヒト心筋細胞）にわたり固定した。その後、スライドガラスを、短時間にわたり通気乾燥させ、ベクターシールドハードセットウィズ４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）マウンティング培地（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｈａｒｄ ｓｅｔ ｗｉｔｈ ４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、顕微鏡スライドに包埋した。３０分間にわたる解析の後、スライドを、ＣＣＤカメラ（ライカＤＦＣ ３６０ ＦＸ（Ｌｅｉｃａ ＤＦＣ ３６０ ＦＸ））を使用する、蛍光顕微鏡法（ライカＤＭ５５００ Ｂ（Ｌｅｉｃａ ＤＭ５５００ Ｂ））により解析した。代表的写真を示す。細胞において最も明るい蛍光が、配列番号２４及び配列番号２５を含むペプチドについて見られる（図２）。

配列番号２４又は配列番号２５を含む、ＦＩＴＣで標識化されたペプチドを、２．２５μＭの用量でインキュベートし、スライドを、ＤＡＰＩを含有するマウンティング培地に包埋し、ＣＣＤカメラ（ライカＤＦＣ ３６０ ＦＸ（Ｌｅｉｃａ ＤＦＣ ３６０ ＦＸ））を使用する、Ｌｅｉｃａ製の顕微鏡法により、ヒト対照筋管を、１又は３時間にわたり（図３Ａ）にわたり解析し、ヒト心筋細胞を、３時間にわたり（図３Ｂ）解析した。結果は、いずれの細胞株についても、インキュベーションの１及び３時間後の、細胞全体及び核において、明らかな蛍光を示す。配列番号２５を含むペプチドもまた、ヒト対照筋管又は心筋細胞（図３Ｃ）と共に、１０分間にわたりインキュベートしたところ、両方の細胞株について、１０分間後に、既に、陽性の蛍光を示した。

実施例３：環化の効果
Ｃｙｓ残基を、Ａｌａ残基で置き換えた、配列番号２４又は配列番号２５を含むペプチドの直鎖バージョンを、上記で記載した通りに標識化し、ヒト対照筋管と共に、３時間にわたりインキュベートした（図３Ｄ）。これらの変化形は、蛍光を示さない。

実施例４：ペプチドの、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）とのコンジュゲーション
５’－カルボキシレートリンカーホスホルアミダイトは、Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｌｌｓｈｉｌｌ、ＵＫ）から購入した。全ての溶媒及び試薬は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）又はＡｃｒｏｓ（Ｇｅｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から得、そうでないことが指し示されない限りにおいて、受領した状態で使用した。観察された分子量は、参照標準値に照らして補正した。環状ペプチドは、ＰｅｐＳｃａｎ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）又はＢａｃｈｅｍ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により合成し、Ｃ末端にアミデートを含有し、Ｎ末端におけるＡｈｘ（６－アミノヘキサン酸）残基の付加を伴った。
ＡＯＮの合成

５’－カルボキシレートリンカーで修飾された、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートＡＯＮを、最後のカップリングのための、Ｃｌｔで保護されたアミダイト（改変カップリング条件下で、１５当量、２０分間にわたる）と、Ｃｌｔ基の最終的な除去とを使用する、標準的なホスホルアミダイト化学反応プロトコールにより調製した。切断／脱保護（ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ４／１（ｖ／ｖ）における、０．１ＭのＮａＯＨ、５５℃で、１８時間にわたる）、ＮａＣｌの添加、及びＦＰＬＣによる脱塩、及び凍結乾燥により、所望のＡＯＮをもたらした。
ペプチド－ＡＯＮコンジュゲートの合成

典型的な小スケール手順：ヒト第４５エクソンをスキップするための、５’－カルボキシレート修飾されたＡＯＮ ｈ４５（配列５’－ＵＧＣＣＧＣＵＧＣＣＣＡＡＵＧＧＧＡＵＣＣＵＧ－３’、配列番号６７、１μｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（０．４ｍＬ）における、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）（２．３当量）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（２当量）の溶液へと添加し、室温（ＲＴ）で、３分間にわたる振盪により、あらかじめ活性化させた。システイン残基を、ターゲティング配列と直接隣接するフランキング部分として伴う、本発明に従う環状ペプチド（０．１ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）において、２μｍｏｌ及び２．３当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤｉＰＥＡ））を添加し、反応混合物を、室温で、１時間にわたり振盪した。逆相（ＲＰ）－ＨＰＬＣによる精製に続き、小過剰量のＮａＣｌを添加し、ＦＰＬＣにより脱塩し、コンジュゲートを、ミリキューから、乾燥するまで、３回にわたり蒸留し、配列番号２５を含む環状ペプチドの、ｈ４５とのコンジュゲート（ＩＤ２５－ｈ４５と称する；収量：０．３μｍｏｌ（３１％）、分子量（ＥＳＩ）の計算値：９２１１．９、実測値：９２１１．５）をもたらした。ｉｎ ｖｉｖｏで評価される、２つのコンジュゲートは、マウス第２３エクソンをスキップするためのＡＯＮ ｍ２３（配列５’－ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＵＣＧＧＣＵＵＡＣＣＵ－３’、配列番号６８を伴う）：ＩＤ２４－ｍ２３（収量：３８μｍｏｌ（３７％）、分子量（ＥＳＩ）の計算値：８００５．８、実測値：８００６．５）及びＩＤ２５－ｍ２３（収量：３８μｍｏｌ（３６％）、分子量（ＥＳＩ）の計算値：８１８９．１、実測値：８１８８．７）を使用して、６つの別個にプールされた合成から、同様の手順により、大スケールで得た。

実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ペプチド－ＡＯＮコンジュゲートの評価
環状ペプチドのコンジュゲーションが、ＡＯＮのエクソンスキッピング能に影響を及ぼすのかどうかを決定するために、ＩＤ２５－ｈ４５コンジュゲートを、活性について評価し、トランスフェクション試薬を伴わないヒト対照筋管（２μＭ）と共に、９６時間にわたりインキュベートした（図４）。結果は、二連の２つの独立の実験の平均を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるコンジュゲーションの、否定的な影響を指し示さない。

実施例６：全身投与の後における、ペプチド－ＡＯＮコンジュゲートについての評価
４週齢のｍｄｘマウス（群１つ当たりのｎ＝４～５）に、毎週４回ずつ、５０ｍｇ／ｋｇのｍ２３、モル当量のＩＤ２４－ｍ２３、ＩＤ２５－ｍ２３、又は生理食塩水を、８週間にわたり皮下投与した。最終回の注射の一週間後に、目的の組織を単離した。ＲＮＡを単離し、単回のＲＴ－ＰＣＲにより、エクソンスキッピングレベルを評価し（図５Ａ）、ラボオンチップ解析により、半定量的に決定した。ジストロフィンタンパク質レベルは、ウェスタンブロットにより決定した（図５Ｂ）。初回の注射の後、血液試料を、いくつかの時点及び屠殺時に採取して、血漿におけるＡＯＮレベルを決定した（図５Ｃ）。ハイブリダイゼーション－ライゲーションアッセイを使用して、組織におけるＡＯＮレベルを決定した（図５Ｄ）。バーは、平均値±ＳＤを表す。有意であるＰ＜０．０５のための、事後検定（ボンフェローニ）を伴う一元ＡＮＯＶＡである。Ｇ＝腓腹筋、Ｑ＝大腿四頭筋、Ｔｉ＝前腓骨筋、Ｔｒ＝三頭筋、Ｈ＝心臓、Ｄ＝横隔膜、Ｌ＝肝臓、Ｋ＝腎臓である。

いずれのペプチド－ｍ２３コンジュゲートについても、組織レベルが改善された。ＮＴ ｍｄｘマウスと対比した、いずれのペプチド－ＡＯＮ群においても、筋損傷についてのマーカーである、クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）のレベルは、低下することが見出された（図６Ｆ）。

加えて、最終回の注射の１週間後に、血液を採取し、いくつかの安全性マーカーについて評価した（図６；バーは、平均値±ＳＤを表す）。ｍｄｘマウスについて、全てのマーカーは、正常な範囲にあった。ＨＢ＝ヘモグロビン（図６ａ）；尿素（図６ｂ）；ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ（図６ｃ）；ＧＰＴ＝グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（図６ｄ）；ＧＯＴ＝グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（図６ｅ）である。
発明の態様及び実施形態
第一の態様
第一の形態は、（ｉ）配列番号２４、２５、１～２３、２６～６３からなる群から選択されるターゲティング配列を含むか、又はこれらからなるペプチド又はペプチド模倣体のコンジュゲートであって、前記ペプチド又はペプチド模倣体が、（ｉｉ）生物学的活性部分及び診断用部分から選択される部分へと連結されたコンジュゲート（実施形態１）を提供する。
実施形態１における好ましいコンジュゲートにおいて、前記生物学的活性部分が、２’－Ｏ－アルキル、特に、２’－Ｏ－メトキシエチル及び２’－Ｏ－メチル、架橋／二環式核酸のヌクレオチド（ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥｔ、ＣＢＢＮ、ＣＲＮ、アルファ－Ｌ－ＬＮＡ、ｃＭＯＥ、２’－アミノ－ＬＮＡ、２’－（アシルアミノ）ＬＮＡ、２’－チオ－ＬＮＡ、ＢＮＡ ^ＮＣ ［Ｎ－Ｍｅ］、ＢＮＡ ^ＮＣ ［ＮＨ］）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ、ＰＰＮＡ）、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、キラルに規定されたホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、ホスホリルグアニジン修飾オリゴヌクレオチド（ＰＧＯ）、モルホリノベースのヌクレオチド（ＰＭＯ、ＰＭＯ＋、ＰＭＯ－Ｘ、ＰＰＭＯ）、及びこれらの組合せを含む化合物など、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの類似体からなる群から選択される（実施形態２）。
本態様の実施形態１又は２における好ましいコンジュゲートは、実施形態１のペプチドと、前記生物学的活性部分又は前記診断用部分との融合タンパク質であり、前記生物学的活性部分が、治療的に活性であるタンパク質である、及び／又は前記診断用部分が、診断用タンパク質である（実施形態３）。
本態様の実施形態１～３のいずれかにおける好ましいコンジュゲートは、核局在化シグナル又は細胞透過性ペプチドをさらに含む（実施形態４）。
本態様の実施形態１～４のいずれかにおける好ましいコンジュゲートは、前記ペプチド又はペプチド模倣体が、環状である（実施形態５）。より好ましくは、前記ペプチド又は前記ペプチド模倣体が、フランキング部分を含み、前記フランキング部分が、前記ターゲティング配列を挟むアミノ酸残基又は他の部分を含むか、又はこれらからなり、前記フランキング部分が、互いとの結合を形成する（実施形態６）。さらに好ましくは、前記フランキング部分が、ジスルフィド架橋を形成し、好ましくは、前記フランキング部分が、システイン残基を含むか、又はこれらからなる（実施形態７）。
本態様の実施形態６又は７における好ましいコンジュゲートにおいて、前記フランキング部分が、前記ターゲティング配列から、４、３、２、１、又は０残基隔てられており、好ましくは、前記フランキング部分が、前記ターゲティング配列と隣接している（実施形態８）。
本態様の実施形態１～８のいずれかにおける好ましいコンジュゲートは、医薬としての使用のためである（実施形態９）。より好ましくは、前記生物学的活性部分又は前記診断用部分を、筋細胞へとターゲティングするためである（実施形態１０）。
本態様の実施形態９又は１０における好ましいコンジュゲートは、心障害を含む筋細胞関連障害の処置のため（実施形態１１）、又は、自己免疫疾患、代謝性障害、肥満、又はＩＩ型糖尿病の処置のための医薬である（実施形態１２）。
本態様の実施形態９～１１のいずれかにおける好ましいコンジュゲートは、ミオパチー、筋ジストロフィー、又は筋肉消耗疾患の処置のためである（実施形態１３）。
本態様の実施形態１～８のいずれかにおける好ましいコンジュゲートにおいて、前記ターゲティング配列が、配列番号１～２５からなる群から選択され（実施形態１４）、より好ましくは、配列番号１４～２５からなるから選択され（実施形態１５）、さらに好ましくは配列番号２４～２５からなる群から選択される（実施形態１６）。
本態様の実施形態９～１３のいずれかにおける好ましいコンジュゲートにおいて、前記ターゲティング配列が、配列番号１～２５からなる群から選択され（実施形態１７）、より好ましくは、配列番号１４～２５からなるから選択され（実施形態１８）、さらに好ましくは配列番号２４～２５からなる群から選択される（実施形態１９）。
第二の態様
本発明の第二の態様において、第一の態様の実施形態１～８のいずれかで定義されたペプチド又はペプチド模倣体と、前記ペプチド又はペプチド模倣体を、生物学的活性部分又は診断用部分へと連結するためのリンカー部分であって、ペプチドではないリンカー部分とを含む分子を提供する（第二の態様の実施形態１）。
第二の態様の実施形態１の好ましい分子において、前記ターゲティング配列が、配列番号１～２５からなる群から選択され（第二の態様の実施形態２）、より好ましくは、配列番号１４～２５からなるから選択され（第二の態様の実施形態３）、さらに好ましくは配列番号２４～２５からなる群から選択される（第二の態様の実施形態４）。

Claims (13)

1. （ｉ）配列番号２４及び２５からなる群から選択されるターゲティング配列を含むペプチド又はペプチド模倣体のコンジュゲートであって、前記ペプチド又はペプチド模倣体が、環状であり、かつ、最大で３０アミノ酸の長さを有し、前記ペプチド又はペプチド模倣体が、（ｉｉ）生物学的活性部分、検出用部分及び診断用マーカーから選択される部分へと連結されたコンジュゲート。
2. 前記生物学的活性部分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの類似体からなる群から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
3. 前記生物学的活性部分が、２’－Ｏ－アルキル、架橋／二環式核酸のヌクレオチド、トリシクロＤＮＡ、ペプチド核酸、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、キラルに規定されたホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、ホスホリルグアニジン修飾オリゴヌクレオチド、モルホリノベースのヌクレオチド、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載のコンジュゲート。
4. 請求項１に記載のペプチドと、前記生物学的活性部分、前記検出用部分又は前記診断用マーカーとの融合タンパク質であり、前記生物学的活性部分が、治療的に活性であるタンパク質である、及び／又は前記診断用マーカーが、診断用タンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
5. 核局在化シグナル又は細胞透過性ペプチドをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
6. 前記ペプチド又は前記ペプチド模倣体が、フランキング部分を含み、前記フランキング部分が、前記ターゲティング配列を挟むアミノ酸残基又は他の部分を含むか、又はこれらからなり、前記フランキング部分が、互いとの結合を形成する、請求項１～５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
7. 前記フランキング部分が、ジスルフィド架橋を形成する、請求項６に記載のコンジュゲート。
8. 前記フランキング部分が、前記ターゲティング配列から、４、３、２、１、又は０残基隔てられている、請求項６又は７に記載のコンジュゲート。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、前記生物学的活性部分、前記検出用部分又は前記診断用マーカーを、筋細胞へとターゲティングするための医薬組成物。
10. 請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、心障害を含む筋細胞関連障害の処置のための医薬組成物。
11. ミオパチー、筋ジストロフィー、又は筋肉消耗疾患の処置のための、請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
12. 請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、自己免疫疾患、代謝性障害、肥満、又はＩＩ型糖尿病の処置のための医薬組成物。
13. 請求項１～８のいずれか一項に記載のペプチド又はペプチド模倣体と、
    前記ペプチド又はペプチド模倣体を、生物学的活性部分、検出用部分又は診断用マーカーへと連結するためのリンカー部分であって、ペプチドではないリンカー部分と
    を含む分子。

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