ES2577712T3

ES2577712T3 - Moléculas para direccionar compuestos a varios órganos o tejidos seleccionados

Info

Publication number: ES2577712T3
Application number: ES08779023.4
Authority: ES
Inventors: Johannes Antonius Heemskerk; Judith Christina Theodora Van Deutekom; Petra Van Kuik-Romeijn; Gerardus Johannes Platenburg
Original assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC; Biomarin Technologies BV
Current assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC; Biomarin Technologies BV
Priority date: 2007-07-12
Filing date: 2008-07-14
Publication date: 2016-07-18
Anticipated expiration: 2028-07-14

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Moleculas para direccionar compuestos a varios organos o tejidos seleccionados Campo de la invencion

[0001] La presente divulgacion pertenece al campo del direccionamiento in vivo y proporciona moleculas que se dirigen a, se unen a y son absorbidas por varios organos o tejidos.

Antecedentes de la invencion

[0002] Muchos compuestos terapeuticos son transportados hasta el organo o tejido diana a traves de la circulacion. Sin embargo, en la mayorfa de los casos, el farmaco u otro tratamiento no solo dirigira su accion al organo o tejidos enfermos, sino que tambien sera absorbido por otros organos y tejidos del cuerpo.

Esto puede resultar en efectos secundarios no deseados debido a, por ejemplo, efectos toxicos generalizados en todo el cuerpo del paciente.

De este modo, serfa deseable dirigir la accion selectivamente sobre organos o tejidos diana especfficos.

Ademas, el acoplamiento de un compuesto terapeutico a una molecula dirigida puede mejorar las propiedades de absorcion del compuesto en el tejido o celulas diana, dando como resultado una molecula mas eficaz.

Por lo tanto, el acoplamiento a moleculas dirigidas produce compuestos que son mas eficaces y menos toxicos que el compuesto parental, ver Curnis et al., 2000, Nature Biotechnol. 18, 1185-1190.

Esto se puede aplicar a un vasto rango de compuestos, tales como peptidos, protefnas, agentes citostaticos, antibioticos y agentes antivfricos.

[0003] En el caso de enfermedades musculares tales como la distrofia muscular de Duchenne (DMD), la distrofia miotonica (DM) o la atrofia muscular espinal (AME), se pueden conjugar peptidos especfficos para musculos, por ejemplo oligonucleotidos antisentido (OAS) y ARN interferente pequeno (ARNip).

Los OAS y ARNip tienen un alto potencial para ser aplicados como nuevas clases de medicinas para el tratamiento de enfermedades especfficas mediante el bloqueo de la transcripcion de genes no deseados.

En el campo de los tratamientos para la DMD, el salto de exon inducido en antisentido esta ganando atencion como una herramienta nueva y prometedora para la correccion del marco de lectura de traduccion de la transcripcion de distrofina.

El objetivo es manipular el empalme de manera que el exon diana se salte (a traves de la union de los OAS a pre- ARNm) y se genere una transcripcion ligeramente mas corta pero dentro del marco de lectura.

Esto permitirfa la correccion del marco de lectura de traduccion, y la induccion de la sfntesis de una protefna de distrofina similar a la de la distrofia muscular de Becker (BMD) que puede mitigar significativamente la progresion de la enfermedad.

[0004] Diferentes informes han mostrado el potencial terapeutico de la estrategia del salto de exon para restaurar la produccion de distrofina en las celulas musculares derivadas de pacientes cultivadas in vitro (van Deutekom et al., 2001, Hum. Mol. Genet. 10, 1547-1554) y en tejido muscular de raton transgenico hDMD in vivo por inyecciones intramusculares (Bremmer-Bout et al., 2004, Mol. Ter. 10,232-240).

Sin embargo, el mayor obstaculo que hay que superar es la pobre absorcion muscular in vivo de estos OAS, especialmente en todo tipo de miopatfas como la distrofia miotonica (DM) y la atrofia muscular espinal (AME).

[0005] Un tratamiento eficaz para estas enfermedades de atrofia muscular requerira que esencialmente todos los musculos esqueleticos incluyendo los de los brazos y piernas y los musculos implicados en la respiracion asf como el musculo cardfaco sean identificados como dianas.

Ninguno de los mecanismos investigados hasta la fecha tiene la capacidad para llevar especfficamente oligonucleotidos (antisentido), menos aun genes enteros, a esencialmente todos los tejidos/celulas musculares simultaneamente por todo el cuerpo.

Los metodos para la administracion in vivo de genes u otros compuestos en el musculo que han sido publicados hasta el momento incluyen la inyeccion de ADN desnudo con o sin electrotransferencia, el uso de microburbujas (Lu et al. 2003, Gene Ther. 10, 396-405) y la administracion sistemica usando poloxamero (un hidroxipoli(oxi- etileno)poli(oxipropileno)).

Recientemente se demostro en ratones mdx que la administracion sistemica de OAS morfolino resulto en un aumento de la expresion de distrofina en diferentes musculos (Alter et al., 2006, Nature Med. 12, 1-3).

Sin embargo, incluso despues de una administracion repetida, la expresion de distrofina fue apenas detectable en el diafragma y no fue detectable en el musculo cardfaco.

Ademas, en estos ratones mdx los OAS se absorben bastante facilmente en los musculos debido a que las membranas musculares estan afectadas, el cual no es el caso de los musculos de, por ejemplo, los pacientes de Duchenne jovenes.

Asimismo, en otras enfermedades musculares como la AME y la DM, la administracion de AON es complicada debido al hecho de que en este caso las paredes celulares musculares no estan afectadas.

US6329501B divulga peptidos que son capaces de identificar como diana un tejido muscular sano.

No se sabe si estos peptidos podrfan dirigirse a un tejido muscular enfermo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0006] Idealmente, un tratamiento para los musculos del cuerpo entero usarfa la administracion sistemica (por ejemplo por via intravenosa o subcutanea) de un compuesto dotado con una capacidad de direccionamiento especffico celular.

Se han descrito algunas moleculas que tienen potencial para la identificacion como dianas de celula musculares.

El primer informe es de una secuencia peptfdica con union mejorada de musculo esqueletico y cardfaco in vivo, que fue identificada mediante seleccion de una biblioteca de peptidos representados sobre fagos aleatoria (Samoylova and Smith, 1999, Muscle Nerve 22, 460-466).

Sin embargo, todavfa no se ha demostrado si este peptido se puede usar o no para el direccionamiento in vivo de compuestos conjugados para celulas musculares.

Tambien se han descrito varias secuencias de peptidos de 7 aminoacidos que fueron recuperadas de musculo esqueletico humano despues de una seleccion in vivo de una biblioteca de peptidos representados sobre fagos aleatoria (Arap et al., 2002, Nature Medicine 8, 121-127).

No se proporciona ninguna informacion sobre la union a celulas de musculo cardfaco.

Asimismo, todavfa no se ha demostrado si estos peptidos se pueden usar o no para el direccionamiento in vivo de compuestos conjugados para celulas musculares.

Otra molecula que se ha descrito es un fragmento Fv de un anticuerpo monoclonal (mAb) que es selectivamente transportado hasta el musculo esqueletico in vivo (Weisbart et al., 2003, Mol. Immunol. 39, 783-789).

Se inyectaron fragmentos Fv monocatenarios del mAb murino en las venas de la cola de ratones y 4 horas mas tarde los fragmentos fueron descubiertos en el 20% de las celulas de los musculos esqueleticos, principalmente localizados en el nucleo.

Se mostro que el mAb se enlaza a la protefna miosina tipo Ilb en lisados de celulas de musculo esqueletico, pero no enlazo ninguna protefna en lisados de celulas de musculo cardfaco.

Por lo tanto, este anticuerpo puede ser util para la identificacion como dianas de musculos esqueleticos, pero no del musculo cardfaco.

[0007] En el caso de las enfermedades de almacenamiento lisosomal, un problema en el tratamiento de sustitucion enzimatica es la absorcion pobre in vivo de la enzima recombinante terapeutica en las celulas musculares.

Por ejemplo, en la enfermedad de Pompe (enfermedad de almacenamiento lisosomal de tipo II) las dosis de a- glucosidasa acida recombinante humana (rhGAA) que fueron necesitadas en estudios clfnicos fueron muy elevadas, debido a la absorcion pobre de la rhGAA en el musculo esqueletico Winkel et al., 2004, Ann. Neurol. 55, 495-502).

[0008] A consecuencia de lo anterior, esta muy claro que son necesarias otras mejoras en los sistemas de administracion para conseguir la absorcion especffica de agentes tales como OAS in vivo.

Resumen de la invencion

[0009] Es un objeto de la presente divulgacion proporcionar compuestos, preferiblemente peptidos o peptidos mimeticos, que se dirigen a un organo o tejido o tipo celular de interes, especialmente celulas musculares incluyendo las del corazon.

Mediante el acoplamiento de fracciones de diagnostico o de fracciones con una actividad biologica para tales compuestos dirigidos, dichas fracciones se dirigen a los organos o tejidos o celulas especfficos.

[0010] Despues de una investigacion extensa, los presentes inventores han identificado un numero de peptidos que se unen y son absorbidos selectivamente por las celulas musculares, incluyendo las del corazon.

Esta invencion satisface asf la necesidad de mejorar la absorcion in vivo de, por ejemplo, una enzima recombinante u oligonucleotidos (antisentido) terapeuticos, mediante la conjugacion de tal enzima o oligonucleotidos a peptidos especfficos para el musculo.

Las moleculas son ventajosamente utiles en los metodos de tratamiento antisentido para el tratamiento de miopatfas, de terapia genica para enfermedades en las que los musculos sirven potencialmente como depositos de produccion de protefna y en la administracion y transporte de una amplia variedad de diagnostics o farmacos al corazon y celulas musculares.

[0011] De este modo, la presente invencion se refiere a un peptido o peptido mimetico que comprende o consistente en la secuencia

LGAQSNF (SEC ID n.°: 100).

[0012] La presente divulgacion se refiere a un peptido o peptido mimetico que comprende una secuencia o que consiste en una secuencia seleccionada del grupo consistente en QLFTSAS (SEC ID N°: 3)

LYQDYSL (SEC ID N°: 85)

SPNSIGT STFTHPR

AAQTSTP YQDSAKT AVTINEP

ELSPSAP TVPQLTT QNAPPSL

TSFQPHR GNTPSRA LTQMSIS

STIHGST SAPRPLY

VTAATLS TYPAALL

YDIDNRR QTLLPSH

RLTLPMP GTAPPVH

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

HSPSKIP

HMATFHY

AHPQLAT

SNQLVEG

SLAAYLH

QPLSNAS

MPAVPHS

FPPSFTA

TSSTMNR

ASTLKWA

THLPWQT

IPTLPSS

EPLQLKM

SESMSIK

TALPPSY

HAIYPRH

FPHYPMS

LLATPTP

YAGP YQH

FSPSTPN

WSQMHFL

KPAYGST

SALLPSF

MQQGPRP

YKHTPTT

TWTFRIP

AHSMGTG

AFVSRQP

WSLQASH

LPWKPLG

VNSATHS

AMISAIH

ASHLEPS

AQPNKFK

HWEMWSY

ASSPVHR

SIPLLNH

ANYSVSI

THPPTTH

QKTALPL

GSWYQVP

SYMIQLS

FMSPLWT

SSLPLRK

TLWVPSR

QSPHTAP

LPLTPLP

AMTTKID

MPALLRS

QAPRLWS

SPHSASL

NQQFYIL

YSHTAAT

SNSIRPN

TYGTKIS

YYFPPFY

IQSPHFF

IVNTAPL

TYSTLGY

QGMHRGT

TPAHPNY

NQLPLHA

NLTRLHT

ATLTHPP

LPPEHPL

HTPNSTH

DQLPLIP

FESRLTA

QHPPWRV

ASVQQRG

SLKLLNQ

AYKPVGR

SVSPWGI

STFTKSP

VTYKTAS

SLLGSTP

TQTPLKQ

HVIANAG

[0013] El grupo anteriormente mencionado tiene los identificadores de secuencia SEC ID n.°: 1 - SEC ID n.°: 100.

[0014] Ademas, la presente invencion concierne conjugados de un peptido o peptidos mimeticos que comprenden o consisten en la secuencia LGAQSNF (SEC ID n.°: 100) y una fraccion seleccionada de una fraccion biologicamente activa y fraccion de diagnostico enlazada a ella.

[0015] Asimismo, la presente divulgacion concierne conjugados de un peptido o peptidos mimeticos que comprenden una secuencia o que consisten en una secuencia seleccionada del grupo consistente en QLFTSAS (SEC ID n.°: 3)

LYQDYSL (SEC ID n.°: 85)

SPNSIGT: STFTHPR STIHGST SAPRPLY

AAQTSTP: YQDSAKT AVTINEP VTAATLS TYPAALL

ELSPSAP: TVPQLTT QNAPPSL YDIDNRR QTLLPSH

TSFQPHR: GNTPSRA LTQMSIS RLTLPMP GTAPPVH

HSPSKIP: FPHYPMS ASHLEPS AMTTKID ATLTHPP

HMATFHY: LLATPTP AQPNKFK MPALLRS LPPEHPL

AHPQLAT: YAGPYQH HWEMWSY QAPRLWS HTPNSTH

SNQLVEG: FSPSTPN ASSPVHR SPHSASL DQLPLIP

SLAAYLH: WSQMHFL SIPLLNH NQQFYIL FESRLTA

QPLSNAS: KPAYGST ANYSVSI YSHTAAT QHPPWRV

MPAVPHS: SALLPSF THPPTTH SNSIRPN ASVQQRG

FPPSFTA: MQQGPRP QKTALPL TYGTKIS SLKLLNQ

TSSTMNR: YKHTPTT GSWYQVP YYFPPFY AYKPVGR

ASTLKWA: TWTFRIP SYMIQLS IQSPHFF SVSPWGI

THLPWQT: AHSMGTG FMSPLWT IVNTAPL STFTKSP

IPTLPSS: AFVSRQP SSLPLRK TYSTLGY VTYKTAS

EPLQLKM: WSLQASH TLWVPSR QGMHRGT

SESMSIK: LPWKPLG QSPHTAP TPAHPNY SLLGSTP

TALPPSY: VNSATHS LPLTPLP NQLPLHA TQTPLKQ

HAIYPRH: AMISAIH NLTRLHT HVIANAG

y una fraccion seleccionada de una fraccion biologicamente activa y una fraccion de diagnostico enlazada a ella.

[0016] Un conjugado tal y como se ha descrito anteriormente para ser usado como un medicamento es un aspecto de esta divulgacion.

Descripcion detallada de la invencion

[0017] La presente divulgacion proporciona peptidos o peptidos mimeticos para direccionar fracciones de diagnostico o fracciones biologicamente activas hasta un organo o tejido o tipo celular de interes, especialmente celulas musculares incluyendo las del corazon.

[0018] Un peptido en el contexto de esta invencion comprende al menos 7 aminoacidos.

El peptido puede estar completamente construido de L-aminoacidos de origen natural, o puede contener una o varias modificaciones a la(s) cadena(s) principal y/o lateral.

Estas modificaciones se pueden introducir por incorporacion de mimeticos de aminoacido que muestran un similitud al aminoacido natural.

El grupo de peptidos anteriormente descrito que comprende uno o varios mimeticos de aminoacido se denomina

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

peptidos mimeticos.

En el contexto de esta invencion, los mimeticos de aminoacidos incluyen, pero de forma no limitativa, p2- y p3-amino acidos, aminoacidos p2,2- p2,3, y p3,3-disustituidos, aminoacidos a,a-disustituidos, derivados de estatina de aminoacidos, D-amino acidos, a-hidroxiacidos, acidos a-aminonitrilos, N-alquilamino acidos y similares.

Ademas, el extremo C del peptido puede ser acido carboxflico o carboxamida, u otro resultante de la incorporacion de uno de los mimeticos de aminoacido anteriormente mencionados.

Ademas, los peptidos anteriormente descritos pueden contener uno o varios reemplazos de enlaces de peptido nativo con grupos que incluyen, pero no se limitan a, sulfonamida, retroamida, que contiene aminooxi, ester, alquil cetona, a,a-difluorocetona, a-fluorocetona, enlace de peptoide (enlace de amida N-alquilado glicil).

Ademas, los peptidos mencionados anteriormente pueden contener sustituciones en la cadena lateral de aminoacido (en referenda a la cadena lateral del aminoacido natural correspondiente), por ejemplo 4-fluorofenilalanina, 4- hidroxilisina, 3-aminoprolina, 2-nitrotirosina, N-alquilhistidina o aminoacidos? -ramificados o mimeticos p-

ramificados de aminoacido con quiralidad en el atomo de carbono de la cadena p-lateral en oposicion a la quiralidad natural (por ejemplo alo-treonina, alo-isoleuana y derivados).

En otra forma de realizacion, el grupo de peptidos anteriormente mencionado puede contener analogos estructurales cercanos de aminoaddos o mimeticos de aminoacidos, por ejemplo ornitina en vez de lisina, homofenilalanina o fenilglicina en vez de fenilalanina, p-alanina en vez de glicina, acido piroglutamico en vez de acido glutamico, norleucina en vez de leucina o las versiones oxidadas por azufre de la metionina y/o cistefna.

Las formas lineales y cfclicas de los peptidos mendonados anteriormente estan cubiertas por esta patente, al igual que su analogos retro, inversos y/o retroinversos.

Puede que muchas mas variaciones cercanas sean conocidas por los expertos en la tecnica, pero el hecho de que no se mencionen aquf no limita el alcance de la presente invencion.

En una forma de realizacion, un peptido o peptido mimetico segun la presente invencion es de como maximo 30 aminoacidos de longitud, o al menos de 25 aminoacidos o 20 aminoacidos o 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 o 7 aminoacidos de longitud.

[0019] Una fraccion biologicamente activa es un compuesto que desempena (directa o indirectamente) una funcion biologica, preferiblemente una funcion terapeutica, por lo tanto es preferiblemente un compuesto terapeuticamente activo.

Un compuesto terapeuticamente activo puede ser cualquier compuesto conocido en la tecnica y es preferiblemente un compuesto que tiene un efecto terapeutico por la modulaaon de un proceso intercelular.

Un compuesto terapeuticamente activo que tiene un efecto de modulacion (directo) o funcion biologica (directa) puede ser por ejemplo cualquier protefna, inhibidor enzimatico, oligonucleotido ARNip, gen, o farmaceutico.

Cualquier compuesto biologicamente activo o compuesto terapeuticamente activo se puede usar siempre que se pueda enlazar o pueda hacerse adecuado para ser enlazado a un peptido o peptido mimetico segun la presente invencion.

El compuesto biologicamente activo o compuesto terapeuticamente activo, asf, se convierte en la fraccion del compuesto segun la presente invencion.

La persona experta sera capaz de identificar compuestos biologicamente activos o terapeuticamente activos adecuados.

[0020] En una forma de realizacion, el compuesto biologicamente activo o compuesto terapeuticamente activo es un compuesto que comprende o consiste en acidos nucleicos o sus analogos.

Se puede considerar que tales compuestos ejercen (indirectamente) una funcion biologica, preferiblemente una funcion terapeutica, al modular la maquinaria genetica de una celula, en particular al nivel de la produccion de protefnas.

El acido nucleico puede ser un ADN, ARN o sus analogos, tales como compuestos que comprenden nucleotidos de 2'-O-alquilo o 2'-O-alquenilo (alilo) o 2'-O-alquinilo, por ejemplo nucleotidos de 2'-O-metil-, 2'-O-metoxietil- (MOE) y 2'-O-alilo, acidos nucleicos bloqueados (ANB), acidos peptidonucleicos (APN), acidos nucleicos unidos por un puente de etileno (ENA), nucleotidos modificados con fosforotioato, por ejemplo nucleotidos de ARN de 2'-O- metoxietilo fosforotioato o nucleotidos de ARN de 2'-O-metilo fosforotioato, nucleotidos a base de morfolino y combinaciones de los mismos, etc. El acido nucleico pueden ser un gen, un polinucleotido o un oligonucleotido, ARN interferente pequeno y similares.

[0021] En una forma de realizacion, una fraccion de diagnostics se enlaza a los peptidos o peptidos mimeticos segun la presente invencion.

La fraccion de diagnostics puede ser para fines de diagnostico in vivo o in vitro.

Los marcadores de imagenologfa, radiologicos o fluorescentes comunmente usados tales como Cy3, Cy5, Cy5.5 y similares, o la protefna verde fluorescente (GFP) u otras protefnas de diagnostico, posiblemente mediante expresion recombinante, se pueden utilizar como fracciones de diagnostico.

[0022] Para preparar los conjugados segun la presente invencion, el acoplamiento de la fraccion biologicamente activa o fraccion de diagnostico a los peptidos o peptidos mimeticos segun la presente invencion ocurre a traves de metodos conocidos para acoplar compuestos a aminoacidos o peptidos.

Un metodo comun es la conexion de una fraccion a un grupo amino libre o grupo hidroxilo libre o grupo de acido carboxflico libre o grupo tiol libre en un peptido o peptido mimetico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los metodos de conjugacion comunes incluyen acoplamiento de tiol/maleimida, formacion de enlaces ester o amida, o formacion heterogenea de disulfuro.

La persona experta conoce la qufmica estandar que puede utilizarse para provocar el acoplamiento requerido.

La fraccion biologicamente activa o fraccion de diagnostico se puede acoplar directamente a un peptido o peptido mimetico o se puede acoplar mediante una molecula espaciadora o enlazadora.

No es necesario que la fraccion biologicamente activa o de diagnostico este enlazada de manera covalente al peptido o peptido mimetico de la invencion.

Tambien se puede conjugar a traves de interacciones electroestaticas.

En una forma de realizacion, la presente invencion tambien se refiere a una molecula que comprende un peptido o peptido mimetico segun la invencion y una parte de conexon, que no es un peptido, para conectar la molecula a una fraccion biologicamente activa o una fraccion de diagnostico.

La parte de conexion, por ejemplo, puede ser un grupo (poli)cationico que forma un complejo con un poli u oligonucleotido biologicamente activo.

Tal grupo (poli)cationico puede ser una espermina o polietilenoimina, polietilenglicol, poli-L-lisina y similares.

[0023] Tal y como se menciona en una forma de realizacion, el peptido o peptido mimetico segun la presente invencion se enlaza a una fraccion biologicamente activa.

Por ejemplo, el peptido o peptido mimetico se puede enlazar a un peptido biologicamente activo o terapeutico y en una forma de realizacion puede incluso formar parte de la estructura basica del peptido o del peptido mimetico.

Por ejemplo, el extremo amino o carboxi de un peptido terapeutico se puede extender con una secuencia que comprende o consiste en los peptidos anteriormente descritos.

Debe entenderse que tal peptido extendido con un peptido o peptido mimetico segun la invencion esta incluido en un conjugado segun la presente invencion.

La preparacion de tales peptidos se puede conseguir mediante procedimientos estandar de acoplamiento de aminoacidos o de peptidos.

[0024] En una forma de realizacion, el peptido o peptido mimetico segun la presente invencion se combina con una senal de localizacion nuclear (NLS).

En una forma de realizacion, un conjugado segun la presente invencion se combina con una NLS.

En el contexto de la presente invencion, la NLS funciona para dirigir los presentes conjugados, por ejemplo la fraccion biologicamente activa o una fraccion de diagnostico, hasta un nucleo celular, supuestamente mediante su reconocimiento por los receptores de transporte nuclear citosolicos.

La NLS puede formar parte del peptido o peptido mimetico segun la presente invencion, por ejemplo, el extremo amino o carboX de una NLS se puede extender con una secuencia que comprende o consiste en los peptidos anteriormente descritos.

Ademas, una NLS se puede acoplar en una posicion diferente de la del peptido o peptido mimetico segun la presente invencion a una fraccion biologicamente activa o una fraccion de diagnostico.

Las secuencias NLS se conocen en la tecnica. Tfpicamente, una senal NLS consiste en o comprende (unas cuantas) secuencias cortas de lisinas y/o argininas cargadas positivamente, por ejemplo una NLS consiste en o comprende (K)KKR(K), (K)KRS(K), (K)(S)RK(R)(K). Algunas NLS conocidas son PKKKRKV, GKKRSKV, KSRKRKL.

En una forma de realizacion, el peptido o peptido mimetico segun la presente invencion se combina con una NLS seleccionada del grupo consistente en SEC ID n.°: 101-115.

[0025] En una forma de realizacion, un conjugado segun la invencion en el que la fraccion biologicamente activa es una protefna o polipeptido y en el que el peptido o peptido mimetico esta comprendido en la protefna o esqueleto polipeptfdico se prepara por expresion recombinante del peptido o peptido mimetico junto con la protefna biologicamente activa.

Preferiblemente, se prepara un constructo de ADN de manera que el peptido o peptido mimetico segun la invencion se exprese en un extremo del peptido biologicamente activo, preferiblemente en el extremo C del peptido biologicamente activo.

Tal preparacion de constructos de ADN por metodologfa de ADN recombinante y expresion en un huesped adecuado es una practica comun para la persona experta.

De este modo, en una forma de realizacion, el presente conjugado es una protefna de fusion de un peptido segun la presente invencion, por ejemplo un peptido de SEC ID n.°: 1-100, con una protefna terapeuticamente activa, por ejemplo un anticuerpo, o una protefna (por ejemplo fluorescente) de diagnostico o ambos, opcionalmente tambien que comprenden una NLS.

Tal protefna de fusion se puede preparar por expresion del constructo de ADN apropiado.

[0026] La presente invencion, asf, proporciona peptidos o peptidos mimeticos para direccionar fracciones biologicamente activas tales como oligonucleotidos, genes, protefnas, farmacos y similares hacia varios organos o tejidos normales, especialmente celulas musculares y el corazon.

Asf la invencion tambien concierne el uso de un conjugado segun la invencion para la preparacion de un medicamento para el direccionar una fraccion activa biologica o una fraccion de diagnostico a una celula muscular.

En una forma de realizacion, el medicamento es para el tratamiento de un trastorno asociado a las celulas musculares, incluyendo los trastornos cardfacos.

Los trastornos asociados a las celulas musculares incluyen miopatfas, distrofia muscular y enfermedades de atrofia

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En una forma de realizacion, el medicamento es para el tratamiento de trastornos asociados a la miostatina.

La miostatina tambien ha sido asociada a la diabetes mellitus de tipo II y a la obesidad.

De este modo, en una forma de realizacion, el medicamento es para el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo II y/o la obesidad.

En otra forma de realizacion, el medicamento es para el tratamiento de un trastorno asociado a las celulas musculares, incluyendo trastornos cardfacos seleccionados del grupo consistente en distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular de cinturas, distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia miotonica, distrofia muscular oculofarfngea, distrofia muscular congenita, distrofia muscular distal, esclerosis lateral amiotrofica, atrofia muscular espinal infantil, atrofia muscular espinal (juvenil, intermedia y adulta), atrofia muscular bulboespinal, dermatomiositis, polimiositis, miositis por cuerpos de inclusion, miastenia grave, sfndrome miastenico de Lambert-Eaton, sfndrome miastenico congenito, miopatfa hipertiroidea, miopatfa hipotiroidea, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, ataxia de Friedreich, enfermedad de Dejerine-Sottas, miotonfa congenita (enfermedad de Thomsen y de Becker), paramiotonfa congenita, enfermedad del nucleo central, miopatfa nemalfnica, miopatfa miotubular (miopatfa centronuclear), paralisis periodica (tanto hipocalemica como hipercalemica), miopatfa mitocondrial y enfermedades musculares debidas a deficiencias en la carnitina y en las siguientes enzimas: fosforilasa, acio maltasa (enfermedad de Pompe), fosfofructoquinasa, enzima desramificadora (tambien conocida como Amilo-1,6-glucosidasa); una enfermedad de almacenamiento de glucogeno tambien conocida como enfermedad de Forbes, carnitina palmitoiltransferasa, fosfoglicerato cinasa, fosfoglicerato mutasa, lactato deshidrogenasa y mioadenilato desaminasa.

[0027] En una forma de realizacion, los presentes conjugados tambien pueden usarse como una herramienta para la administracion de genes no viral o para una terapia genica no viral.

A modo de conjugado, los presentes peptidos o petidomimeticos pueden direccionar constructos genicos hasta celulas, en particular celulas musculares.

En una forma de realizacion, el constructo genico permite la produccion de una enzima en una terapia de sustitucion enzimatica o el constructo genico permite la produccion de una protefna terapeutica tal como por ejemplo Factor VIII, Factor IX, factor VII, bilirrubina-UDP-glucuronosiltransferasa, todas las protefnas de trastorno de almacenamiento lisosomal tales como alfa-glucosidasa o en particular Aldurazyme®, Cerezyme®, Fabrazyme® o Myozyme®.

[0028] Una forma de realizacion de la invencion es el direccionamiento de un virus o partfcula viral hacia celulas.

En un conjugado segun la invencion, el virus o partfcula vfrica es la fraccion biologicamente activa.

En una forma de realizacion, el peptido o peptido mimetico segun la invencion se enlaza a la fraccion viral biologicamente activa mediante la inclusion la secuencia de ADN/ARN del peptido o peptido mimetico en el genoma de un virus de manera que el peptido o peptido mimetico se exprese en la superficie externa del virus o partfcula viral.

La metodologfa recombinante para obtener tal expresion es bien conocida por la persona experta.

De este modo, el peptido o peptido mimetico direcciona el virus o partfcula viral hacia celulas/tejido especfficos.

Esto es de interes particular para la vacunacion direccionada, terapia genica, sustitucion genica o constructos de salto de exon virales (vectores AAV que expresan secuencias antisentido de expresion fusionados o bien a ARN nuclear pequeno U1 o U7; Denti et al., 2006, Hum. Gene Ther. 17, 565-574).

[0029] En una forma de realizacion de la invencion, el peptido o peptido mimetico segun la invencion es seleccionado del grupo consistente en YQDSAKT, VTYKTAS, EPLQLKM' WSLQASH, TLWVPSR, QGMHRGT, LYQDYSL SESMSIK, LPWKPLG' QSPHTAP, TPAHPNY, SLLGSTP, TALPPSY, VNSATHS, LPLTPLP, NQLPLHA GNTPSRA' TQTPLKQ, AMISAIH, NLTRLHT, HVIANAG, HAIYPRH y LGAQSNF.

[0030] En otra forma de realizacion de la divulgacion, el peptido o peptido mimetico segun la invencion es seleccionado del grupo consistente en SPNSIGT, STFTHPR, QLFTSAS, STIHGST, SAPRPLY, AAQTSTP, YQDSAKT, EPLQLKM, TLWVPSR, LYQDYSL, LPWKPLG, TPAHPNY, TALPPSY, LPLTPLP, HAIYPRH y GNTPSRA.

[0031] En otra forma de realizacion de la divulgacion, el peptido o peptido mimetico segun la invencion es seleccionado del grupo consistente en YQDSAKT, EPLQLKM, TLWVPSR, LYQDYSL, LPWKPLG, TPAHPNY, TALPPSY, LPLTPLP, HAIYPRH y GNTPSRA

[0032] En una forma de realizacion de la divulgacion, el peptido o peptido mimetico segun la invencion es seleccionado del grupo consistente en YQDSAKT y GNTPSRA

[0033] En una forma de realizacion de la divulgacion, el peptido o peptido mimetico segun la invencion es seleccionado del grupo consistente en QLFTSAS, LYQDYSL y LGAQSNF.

[0034] Tambien se incluye en la presente invencion el ADN consistente en o que comprende una secuencia que codifica un peptido segun la presente invencion y la secuencia de ADN complementaria de la misma y la transcripcion de ARN de una secuencia de ADN consistente en o que comprende una secuencia que codifica de un peptido segun la presente invencion y la secuencia de ARN complementaria de la misma.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

[0035] La presente invencion tambien se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden un conjugado segun la invencion y un portador farmaceuticamente aceptable.

Ejemplos

Ejemplo de referencia

Eiemplo 1: seleccion in vitro de peptidos contra mioblastos y miotubos

[0036] Una biblioteca de fagos de peptidos pre elaborada que contiene 2 billones de fagos que expresan peptidos de 7 aminoacidos aleatorios (New England Biolabs Inc.) ha sido seleccionada para identificar peptidos especfficos para musculos.

Brevemente, la biblioteca de peptidos representados sobre fagos fue incubada con celulas colocadas en frascos de cultivo. Despues de retirar los fagos no ligados, los fagos ligados especfficamente o interiorizados fueron eluidos y amplificados. Despues de una serie de diferentes pasos de bioseleccion in vitro, incluyendo tanto rondas de seleccion positiva como negative en miotubos y fibroblastos de humano o de raton respectivamente, el caldo fue enriquecido para la union de secuencias que podfan ser caracterizadas por secuenciacion de ADN.

Por lo tanto, se identificaron peptidos especfficos para musculos que enlazaran con y seran interiorizados por las celulas diana. Las secuencias peptfdicas especfficas que fueron descubiertas se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: secuencias peptfdicas encontradas despues de la seleccion in vitro de miotubos de humano y de raton

SPNSIGT1: STFTHPR1 QLFTSAS1 STIHGST1 SAPRPLY1

AAQTSTP1: YQDSAKT1 AVTINEP VTAATLS TYPAALL

ELSPSAP: TVPQLTT QNAPPSL YDIDNRR QTLLPSH

TSFQPHR: GNTPSRA LTQMSIS RLTLPMP GTAPPVH

HSPSKIP: FPHYPMS ASHLEPS AMTTKID ATLTHPP

HMATFHY: LLATPTP AQPNKFK MPALLRS LPPEHPL

AHPQLAT: YAGPYQH HWEMWSY QAPRLWS HTPNSTH

SNQLVEG: FSPSTPN ASSPVHR SPHSASL DQLPLIP

SLAAYLH: WSQMHFL SIPLLNH NQQFYIL FESRLTA

QPLSNAS: KPAYGST ANYSVSI YSHTAAT QHPPWRV

MPAVPHS: SALLPSF THPPTTH SNSIRPN ASVQQRG

FPPSFTA: MQQGPRP QKTALPL TYGTKIS SLKLLNQ

TSSTMNR: YKHTPTT GSWYQVP YYFPPFY AYKPVGR

ASTLKWA: TWTFRIP SYMIQLS IQSPHFF SVSPWGI

THLPWQT: AHSMGTG FMSPLWT IVNTAPL STFTKSP

IPTLPSS: AFVSRQP SSLPLRK TYSTLGY

'1 secuencia encontrada mas de una vez

[0037] Dos de los peptidos que surgieron frecuentemente despues de la seleccion en miotubos tanto de raton como humanos, SPNSIGT y QLFTSAS, fueron sintetizados con un marcador fluorescente (FAM) y se evaluo su absorcion en celulas musculares diferenciadas (miotubos) de humano y de raton.

Los miotubos fueron obtenidos de cultivos de mioblastos humanos confluyentes KM109 durante 7-14 dfas de deprivacion de suero.

El cultivo fue posteriormente incubado con peptidos marcados con FAM y fotografiados con un microscopio de fluorescencia invertida, sin fijacion previa.

Se observo una absorcion significative de estos peptidos en los miotubos cultivados.

[0038] El peptido QLFTSAS fue sintetizado con un marcador fluorescente (FAM) y posteriormente conjugado a un oligonudeotido antisentido (AON) de 2'O-metil osforotioato de 21 aminoacidos.

Se obtuvieron miotubos de cultivos de mioblastos confluyentes humanos KM109 durante 7-14 dfas de deprivacion de suero.

El cultivo fue posteriormente incubado con el conjugado marcado con FAM y fotografiado con un microscopio de fluorescencia invertida, sin fijacion previa.

Las fotograffas mostraron que el conjugado se absorbe en las celulas musculares diferenciadas (miotubos) humanas cultivadas.

Ejemplo 2: seleccion de peptidos en ratones mdx

[0039] Para la realizacion de experimentos en ratones mdx, la biblioteca fue inyectada a traves de la vena de la cola. Despues de 10 a 20 minutos, los ratones fueron sacrificados y perfundidos, despues de lo cual el corazon y diferentes grupos musculares fueron aislados. Los fagos ligados y/o interiorizados fueron recuperados de los tejidos homogeneizados, amplificados, y reaplicados a ratones mdx. Se seleccionaron y se caracterizaron mas secuencias

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

enriquecidas. Las secuencias peptfdicas especfficas que fueron descubiertas se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Secuencias peptfdicas encontradas despues de cuatro rondas de seleccion in vivo en ratones mdx, en

musculo esqueletico y el corazon

YQDSAKT1,2: VTYKTAS EPLQLKM1 WSLQASH TLWVPSR1

QGMHRGT: LYQDYSL1 SESMSIK LPWKPLG1 QSPHTAP

TPAHPNY1: SLLGSTP TALPPSY1 VNSATHS LPLTPLP1

NQLPLHA: GNTPSRA1,2 TQTPLKQ AMISAIH NLTRLHT

HVIANAG: LGAQSNF HAIYPRH 1

1 Secuencia encontrada mas de una vez 2 Secuencia tambien encontrada despues de la seleccion in vitro (ver tabla 1)

[0040] Tres de los peptidos que fueron descubiertos despues de cuatro ciclos de seleccion in vivo fueron sintetizados con un marcador fluorescente (FAM) y se evaluo en cultivo celular su absorcion en miotubos humanos como se describe en el ejemplo 1. Las fotograffas muestran que los tres peptidos fueron absorbidos por miotubos humanos cultivados.

Ejemplo 3: coloracion in vivo de fibras musculares despues de inyeccion intramuscular

[0041] Los peptidos que mostraron absorcion en mioblastos y miotubos humanos cultivados fueron sintetizados con un marcador fluorescente (FAM) e inyectados en el gastrocnemio (musculo de la pantorrilla) de ratones mdx de cuatro semanas.

Los peptidos QLFTSAS marcados con FAM (5 nmol inyectados), LiQDiSL (2,5 nmol inyectados) y LGAQSNF (2,5 nmol inyectados) fueron analizados.

Despues de tres dfas, los ratones fueron sacrificados y los musculos fueron congelados instantaneamente.

Se cortaron secciones transversales, se fijaron con acetona y se prepararon para el analisis con un microscopio de fluorescencia.

Las secciones transversales fueron cortadas y fotografiadas con un microscopio de fluorescencia (camara CCD).

[0042] Las fotograffas mostraron que los peptidos QLFTSAS, LYQDYSL y LGAQSNF fueron absorbidos en un area grande de fibras musculares y todavfa eran visibles despues de 3 dfas.

Se vefa claramente que las fibras enteras estaban manchadas homogeneamente, y que a veces se observaba una coloracion de la membrana mas intensa.

[0043] La absorcion de los peptidos marcados con FAM QLFTSAS y LGAQSNF fue tambien evaluada en el musculo de un raton saludable.

Se inyectaron 5 nmol de cada peptido en el musculo gastrocnemio.

Despues de 3 dfas los ratones fueron sacrificados y se evaluo la cantidad de coloracion.

Las muestras fueron fotografiadas con un microscopio de fluorescencia invertida.

Aunque las celulas musculares de estos ratones no tienen membranas afectadas como las celulas musculares de los ratones mdx, aun asf se observo un area significativa de absorcion de los peptidos QLFTSAS y LGAQSNF en las miofibras del musculo inyectado, como fue mostrado en las fotograffas.

Ejemplo 4: salto de exon in vivo por conjugados de peptidos-AON

[0044] Los peptidos QLFTSAS y LGAQSNF fueron conjugados al oligonucleotido antisentido (AON) de 2'O-metilo fosforotioato de 20 aminoacidos. Se ha demostrado que este AON es capaz de inducir salto el salto del exon 23, tanto en cultivo celular como en el modelo de raton mdx (Lu et al., 2003, Nature Med. 9, 1009-1014). Los conjugados fueron inyectados en el musculo gastrocnemio de ratones mdx. Los ratones recibieron dos inyecciones, con un intervalo de 24h, de 2,9 nmol de conjugado y fueron sacrificados despues de 10 dfas. Posteriormente, se realizo un analisis RT-PCR de ARNm de distrofina en el musculo.

En la tabla 3 se muestran los porcentajes de salto en el musculo para AON M23 conjugado a los peptidos QLFTSAS y LGAQSNF. Ambos conjugados fueron capaces de inducir un salto del exon 23 en el musculo de los ratones mdx en el mismo rango que el oligonucleotido solo.

Tabla 3: salto de exon en ratones mdx por conjugados peptido-AON despues de inyeccion intramuscular

Ratones mdx

AON-(conjugado): porcentaje de salto

AON desnudo: 10 %

QLFTSAS-AON: 7.5 %

LGAQSNF-AON: 9.5 %

[0045] Se realizo el mismo experimento con ambos conjugados peptido-AON en ratones saludables.

Los musculos de estos ratones no tienen membranas afectadas como los musculos de ratones mdx.

Como se muestra en tabla 4, tambien en estos ratones saludables ambos conjugados fueron capaces de inducir un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Tabla 4: salto de exon en ratones saludables por conjugados peptido- AON despues de inyeccion intramuscular

Ratones sanos

AON-(conjugado): porcentaje de salto

AON desnudo: 3 %

QLFTSAS-AON: 3 %

LGAQSNF-AON: 2 %

Ejemplo 5: absorcion in vivo de coniuaados peptido-AON

[0046] El AON M23 solo y el AON M23 conjugado a los peptidos QLFTSAS y LGAQSNF fue inyectado por vfa intravenosa en ratones mdx. Los ratones recibieron 3 inyecciones, con un intervalo de 48 h, de 50 mg/kg de AON solo o del conjugado y fueron sacrificados despues de l0 dfas. Posteriormente, el nivel de AON M23 en el musculo del cuadrfceps y en el musculo cardfaco fue medido con una tecnica ELISA de ligamiento-hibridacion especffica para AON M23.

En la tabla 5 la absorcion de los conjugados AON M23-peptido en el cuadrfceps y en el musculo cardfaco se muestra como un porcentaje de la absorcion de AON M23 solo (la absorcion de AON M23 solo se fija en 100 %). Se puede observar que la absorcion de los conjugados en el musculo del cuadrfceps es mas de dos veces mayor y en el musculo cardfaco mas de tres veces mayor que con el AON M23 solo.

Tabla 5: absorcion de conjugados peptido-AON en el cuadrfceps y musculo cardfaco despues de administracion sistemica, con respecto a la absorcion de AON desnudo (fijada en 100 %)

: cuadriceps corazon

AON desnudo: 100 % 100 %

QLFTSAS-AON: 201 % 333 %

LGAQSNF-AON: 231 % 331 %

Ejemplo 6: objetivo de direccionamiento in vivo despues de administracion sistemica

[0047] El peptido LGAQSNF fue sintetizado con el marcador fluorescente Cy5.

Este marcador se puede detectar con una sensibilidad alta por un sistema de formacion de imagenes por fluorescencia (NightOWL, Berthold Technologies) despues de una inyeccion sistemica (intravenosa o subcutanea) en un raton.

Esto permite controlar la distribucion del compuesto a traves de los diferentes organos de un raton vivo despues de la inyeccion.

De este peptido, se inyectaron subcutaneamente 71 nmol en la espalda de un raton mdx y despues de 48 horas se tomo una imagen con el sistema de formacion de imagenes.

La Figura 1 muestra la distribucion del peptido LGAQSNF marcado con Cy5 48 horas despues de la inyeccion subcutanea en un raton mdx.

El raton esta tumbado sobre su espalda, y primero se afeitaron las patas posteriores y un area del abdomen debido a que los pelos de la piel perjudicaban la deteccion de la senal.

Se podia detectar una senal clara en la espalda, las patas anteriores y la cola.

La senal en la area afeitada del abdomen procede posiblemente del musculo abdominal.

Este resultado indica que el peptido, que fue inyectado en la espalda, es absorbido por el musculo abdominal y por musculos de las patas traseras, pies y cola del raton.

Ejemplo 7: direccionamiento de proteinas a celulas musculares

[0048] Para examinar la capacidad de los peptidos LGAQSNF y QLFTSAS para transportar una protefna hasta celulas musculares, se prepararon constructos de ADN en los que la secuencia peptfdica fue fusionada a la secuencia proteica.

Los siguientes constructos fueron preparados y expresados utilizando un vector de expresion bacteriano:

LGAQSNF - NLS - 3F5 - GFP LGAQSNF-3F5 - GFP QLFTSAS - NLS - 3F5 - GFP QLFTSAS - 3F5 - GFP

NLS: secuencia de localizacion nuclear KKRK VHH 3F5: anticuerpo derivado de llama GFP: protefna verde fluorescente

[0049] Mioblastos Immortomouse IM2 fueron incubados con protefna LGAQSNF-NLS-3F5-GFP purificada durante toda la noche.

El dfa siguiente, se llevo a cabo una obtencion de imagenes por fluorescencia para valorar la absorcion del constructo de protefna en las celulas.

Las imageries mostraron que la protefna fue absorbida en la citoplasma de las celulas.

Esto indica que los peptidos dirigidos son capaces de transportar una protefna grande hasta celulas musculares.

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACI ONES

1. Conjugado de un peptido o peptido mimetico que comprende o consiste en la secuencia LGAQSNF (SEC ID n.°: 100) enlazada a una fraccion seleccionada de una fraccion biologicamente activa y una fraccion de diagnostico.
2. Conjugado segun la reivindicadon 1, donde la fraccion biologicamente activa es seleccionada del grupo consistente en ADN, ARN o sus analogos, tales como compuestos que comprenden nucleotidos de 2'-O-alquilo, en particular 2'-O-mehoxetilo y 2'-O-metilo, o 2'-O-alquenilo (alilo) o nucleotidos de 2'-O-alquinilo, acidos nucleicos bloqueados (ANB), acidos peptidonucleicos (APN), acidos nucleicos unidos por un puente de etileno (ENA), nucleotidos modificados con fosforotioato, nucleotidos a base de morfolino y combinaciones de los mismos
3. Conjugado segun la reivindicacion 1 o 2 que es una protefna de fusion de un peptido de la SEC ID n°: 100 con una protefna terapeuticamente activa y/o una protefna de diagnostico.
4. Conjugado segun la reivindicacion 3 que comprende ademas una senal de localizacion nuclear.
5. Uso de un conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la preparacion de un medicamento para el direccionamiento de una fraccion activa biologica o de una fraccion de diagnostico a una celula muscular.
6. Uso segun la reivindicacion 5 donde el medicamento es para el tratamiento de un trastorno asociado a las celulas musculares, incluyendo trastornos cardfacos.
7. Uso segun la reivindicacion 5 donde el medicamento es para el tratamiento de una miopatfa, distrofia muscular o enfermedad de atrofia muscular.
8. Uso segun la reivindicacion 5 donde el medicamento es para el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo II o la obesidad.
9. Molecula que comprende un peptido o peptido mimetico que comprende o consiste en la secuencia LGAQSNF (SEC ID n.°: 100)

y una parte de enlace que no es un peptido para enlazar la molecula a una fraccion biologicamente activa o una fraccion de diagnostico.