KR102646799B1 - 다양하게 선택된 기관 또는 조직을 표적화하기 위한 물질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물학적 활성 모이어티에 연결되거나 진단적 모이어티에 연결되는 기관 또는 조직 표적화 모이어티를 포함하는, 접합체를 제공한다. 이러한 생물학적 활성 또는 진단적 모이어티는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 소형 간섭 RNA, 유전자, 바이러스, 단백질, 약물, 소 유기 분자, 제약, 또는 검출가능한 제제일 수 있다.

Description

다양하게 선택된 기관 또는 조직을 표적화하기 위한 물질
본 발명은 다양한 기관 또는 조직을 표적화(targeting)하고 이에 머무르고, 결합하고, 흡수되는 물질을 제공하는 분야에 관한 것이다.
대부분의 치료적 화합물은 순환을 통해 표적 기관 또는 조직에 전달된다. 그러나, 대부분의 경우 약물 또는 다른 치료는 질병에 걸린 기관 또는 조직을 표적화할 뿐 아니라, 신체의 다른 기관 및 조직에 의해 흡수된다. 이것은 예를 들어, 환자의 신체 전반의 일반화된 독성 효과로 인한, 바람직하지 않은 부작용을 초래할 수 있다. 그러므로, 특이적 기관 또는 조직을 선택적으로 표적화하는 것이 바람직하다. 추가로, 치료적 화합물을 표적화 모이어티(moeity)에 연결하는 것은 치료적 화합물의 표적화된 조직 또는 세포 내로의 흡수 특성을 개선할 수 있어, 더 효과적인 물질을 생성한다. 유사하게, 진단적 화합물을 표적화 모이어티에 연결하는 것은 치료적 화합물의 표적화된 조직 또는 세포 내로의 흡수 특성을 개선할 수 있어, 더 효과적인 물질을 생성한다. 그러므로, Curnis et al., 2000, Nature Biotechnol. 18, 1185-1190을 참고하면, 표적화 모이어티를 연결하는 것은 모 물질(parental substance)보다 더 효과적이고 독성이 덜한 물질을 생성한다. 이는 펩타이드, 단백질, 세포 증식 억제제(cytostatic agent), 항생제(antibiotic agent), 항체, 및 항바이러스제(antiviral agent)와 같은 넓은 범위의 물질에 응용될 수 있다.
뒤센 근육퇴행위축(Duchenne muscular dystrophy, DMD), 베커 근육퇴행위축(Becker Muscular Dystrophy, BMD), 근육긴장퇴행위축(myotonic dystrophy, DM) 또는 척수근위축증(spinal muscular atrophy, SMA)과 같은 근육 질병의 경우, 근육-특이적 펩타이드는 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드(AON) 뿐 아니라 단일-또는 이중 가닥 소형 간섭 RNA(siRNA), 합성 mRNA, 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)와 같은 다른 핵산-기반 치료제에 접합하거나, 또는 이와 같이 제제화될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 바람직하지 않은 유전자 발현을 조절함으로써 특이적 질병의 치료를 위한 새로운 종류의 의약으로 적용될 수 있는 높은 효능을 갖는다. DMD 치료의 분야에서 안티센스-유도 엑손 스킵핑(antisense-induced exon skipping)은 디스트로핀(dystrophin) 전사체의 번역 리딩 프레(translational reading frame)임을 교정하기 위한 유망한 도구로서 주목받고 있다. 목적은 표적화된 엑손이 (AON과 pre-mRNA의 결합을 통해) 스킵되는 방식으로 스플라이싱을 조작하고, 약간 더 짧지만 프레임 내 전사체가 생성되는 것이다. 이것은 질병의 진행을 현저히 완화시킬 수 있는 번역 리딩 프레임의 교정 및 베커 근육퇴행위축(BMD)-유사 디스트로핀 단백질의 합성의 유도를 허용할 것이다.
지난 십년 동안, 이 치료적 접근은 DMD의 유망한 치료법으로 등장했다(van Ommen et al., 2008; Yokota et al., 2007; van Deutekom et al., 2007; Goemans et al., 2011; Voit et al., 2014; Cirak et al., 2011). AON-유도 엑손 스킵핑은 돌연변이-특이적, 따라서 DMD 환자를 위한 개인맞춤화된(personalized) 치료적 접근을 제공한다. 다수의 돌연변이 클러스터(cluster)는 엑손 44에서 55 주변에 있으므로, 하나의 특이적 엑손의 스킵핑은 다른 돌연변이를 가지는 많은 환자들에게 치료적일 수 있다. 엑손 51의 스킵핑은 환자의 가장 큰 부분집합 (~13%)에 적용되며, 그것은 엑손 45 내지 50, 48 내지 50, 50, 또는 52의 삭제를 포함한다. 적용된 AON은 엔도뉴클라아제(endonucleases), 엑소뉴클라아제(exonucleases) 및 RNaseH에 저항하고 RNA 결합 및 이중나선 안정성을 촉진하기 위해 화학적으로 변형된다. 다른 AON 화학물질은 현재 DMD를 위한 교정적인 엑손 스킵핑 유도를 위하여 연구되고 있으며, 이는 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 RNA(2'-O-methyl phosphorothioate RNA)(2OMePS; Voit et al., 2014), 포스포로디아미데이트 모르폴리노(phosphorodiamidate morpholino)(PMO; Cirak et al., 2011), 트리사이클로 DNA(tcDNA; Goyenvalle et al, 2015), 및 펩타이드 핵산(PNA; Gao et al., 2015)을 포함한다. 비록 AON은 일반적으로 건강한 근육 섬유에 잘 흡수되지 않지만, DMD에서의 디스트로핀 결손, 그리고 활성화된 위성 세포(atellite cell) 및 손상되고 그에 따라 더 투과성인 섬유 막으로 특징되어지는, 병리학 결과는 실제로 더 나은 흡수를 촉진할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 핵산/올리고뉴클레오티드-기반 치료법의 임상적 적용가능성 및 치료적 지표를 향상시키기 위해, 이 분야는 체내의 근육 조직에의 전달 및 이에 의한 흡수가 개선된 올리고뉴클레오티드를 개발하는데 도전하고 있다.
근육 소모 질병(muscle wasting disease)을 위한 효율적인 치료법은 근본적으로 팔과 다리의 근육을 포함하는 모든 골격근과 호흡에 관여하는 근육 뿐 아니라 심장 근이 표적화되는 것을 요구한다. 지금까지 조사된 메커니즘 중 어느 것도 전체 유전자는 고사하고, 전신에 걸쳐 동시에 모든 근육 조직/세포에 본질적으로, (안티센스) 올리고뉴클레오티드를 특이적으로 전달할 수 있는 능력을 가지고 있지 않다. 지금까지 공개된 근육 내로의 유전자 또는 다른 화합물의 생체내 전달 방법은 예를 들어 전기이전법(electrotransfer)과 같은 네이키드 DNA(naked DNA) 주입, 미세 기포의 사용(Lu et al. 2003, Gene Ther. 10, 396-405) 및 폴록사머(폴리(옥시-에틸렌)폴리(옥시프로필렌)폴리(옥시-에틸렌) 트리블럭 공중합체(triblock copolymer))를 사용하는 체순환(systemic) 전달을 포함한다. 이 폴리옥사머와 함께 모르폴리노 AON의 체순환 전달이 몇몇의 근육에서 디스트로핀 발현을 증가시키는 결과가 mdx 마우스에서 나타났다(Alter et al., 2006, Nature Med. 12, 1-3). 그러나, 반복된 투여 이후에, 디스트로핀 발현은 횡격막(diaphragm)과 심장근에서 제한되었다. 뿐만 아니라, 이 mdx 마우스 안에서 AON은 근육 막이 훼손(compromised)되었기 때문에 근육 내로 적어도 부분적으로라도 흡수된다. SMA 및DM과 같은 다른 근육 질병들에서, 이 경우 근육 섬유 막이 유사하게 훼손되지 않았다는 사실로 인해 AON의 전달은 더 복잡하다.
근육-특이적이지 않은 AON의 전달을 향상시키기 위한 전략은, 세포 흡수를 강화시키기 위해 나노입자(nanoparticle), 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptides, CPPs) 접합(conjugation) 또는 첨가제 화합물의 공-투여(co-administration)의 사용이다(Bassi et al., 2012; Betts et al., 2015; Ferlini et al., 2010; Hu et al., 2010; Kendall et al., 2012; Lehto et al., 2013; Moulton & Moulton, 2010; Mumcuoglu, Sardan, Tekinay, Guler, & Tekinay, 2015; Rimessi et al., 2009; Verhaart & Aartsma-Rus, 2012; Wang et al., 2013; Yin et al., 2011). 양이온(cationic) CPPs와 같은, 이 방법들 중 일부는, 응집(aggregation) 이슈로 인해 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 AON(2OMePS)와 같은 음이온(anionic) AON으로의 접합에는 부적합하다.
이상적으로, 전-신체 근육 치료법은 세포 특이적 표적화 능력을 부여받은 화합물의 체순환 전달(예컨대, 정맥 내(intravenously) 또는 피하(subcutaneously))을 이용할 수 있다. 일부 물질은 근육 세포를 표적화하기 위한 잠재력(potential)을 가진 것으로 기술되어왔다. 첫 보고는 랜덤 파지 디스플레이 라이브러리(random phage display library)를 스크리닝(screening)하는 것에 의하여 확인된 생체내 골격근 및 심장근 결합이 향상된 펩타이드 서열이다(Samoylova and Smith, 1999, Muscle Nerve 22, 460-466). 그러나, 이 선형(linear) 펩타이드가 접합된 화합물의 근육 세포로의 생체내 표적화에 사용될 수 있을지 여부는 나타나지 않았다. 또한 생체내 랜덤 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝 이후 인간 골격근 세포로부터 회수된 다수의 7-량 펩타이드(linear 7-mer peptide) 서열이 기술되어왔다(Arap et al., 2002, Nature Medicine 8, 121-127). 심장근 세포에 결합에 대한 정보는 주어지지 않았다. 또한 여기서는 이들 펩타이드가 접합된 화합물의 근육 세포로의 생체내 표적화에 사용될 수 있을지 여부는 나타나지 않았다. 기술된 또다른 물질은 선별적으로 생체내에서 골격근으로 수송되는 단일클론 항체(monoclonal antibody, mAb)의 Fv 부분이다(Weisbart et al., 2003, Mol. Immunol. 39, 783-789). 쥐(murine) mAb의 단일 사슬 Fv 단편은 마우스의 꼬리 정맥으로 주사되고 4시간 후 단편은 주로 핵에 위치되고, 골격근 세포의 20%에서 찾아졌다. mAb가 골격근 세포의 용해물(lysate) 안의 미오신(myosin) IIb 단백질에 결합하나, 심장근 세포의 용해물 안의 어떤 단백질에도 결합하지 않는 것으로 나타났다. 그러므로, 이 항체는 골격근을 표적화하는데는 유용할 수 있으나, 심장근에는 그렇지 않다. 파지 디스플레이 실험을 통해 확인된, 선형 7-량 펩타이드는, 비록 대단하지 않은 증가지만, 그들이 부착된 올리고뉴클레오티드의 조직 수준을 향상시키는 것으로 기술되었다(Jirka SMG et al. Nucl. Acid Ther. 2014, 24, 25).
근육 세포를 표적화하는 펩타이드는 WO2009/008727에 보고되었다. 이러한 펩타이드는 파지의 PIII 단백질의 N- 말단에 선형 7-량 펩타이드의 몇 카피를 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리(Ph.D.-7TM, New England Biolabs) 기술을 사용하여 확인되었다. 이 기술은 표적-특이적 펩타이드를 확인하기 위한 것으로 알려져있으나(Smith, 1985), 이러한 접근은 번거로울 수 있으며 많은 거짓 양성(false positive) 펩타이드가 확인될 수 있음이 잘 알려져 있다(Huang, Ru, Li, Lin, & Guo, 2010).
리소좀축적병(lysosomal storage disease)의 경우 효소대체치료법(enzyme replacement therapy)의 문제점은 치료적 재조합 효소의 근육 세포 내로의 형편없는 생체내 흡수이다. 예를 들어 폼페 질병(Pompe's disease)(2형 글리코젠 축적병)에서, 인간 산 α-글루코시다아제(human acid α-glucosidase, rhGAA)의 골격근 내로의 불량한 흡수로 인해, 임상 연구에서 필요한 재조합 인간 산 a-글루코시다아제(rhGAA)의 투여량은 매우 높다(Winkel et al., 2004, Ann. Neurol. 55, 495-502).
상기한 관점에서, 생체내에서 AONs와 같은 제제의 특이적 흡수를 달성하려면 전달 시스템의 추가적인 개선이 필요하다는 것은 매우 명확하다. 개선된 표적화 모이어티에 대한 지속적인 필요성이 존재한다.
본 발명의 목적은 관심 기관 또는 조직 또는 세포 유형, 특히 심장을 포함하는 근육 세포를 표적하는 화합물, 바람직하게는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체pdeptidomimetic)를 제공하는 것이다. 진단적 모이어티 또는 생물학적 활성 모이어티를 상기 표적화 화합물에 커플링(coupling)함으로써, 상기 모이어티는 특이적 기관 또는 조직 또는 세포로 표적화된다.
차세대 서열분석(next generation sequencing, NGS)을 이용하여 파지 디스플레이 실험의 결과를 분석하는 것은 성공의 기회를 향상시킬 수 있다('t Hoen et al., 2012). NGS는 단지 단일 스크리닝 라운드의 사용으로도, 기생(parasitic) 펩타이드 서열이 결과를 지배하는 것을 예방하고 기생 펩타이드 서열의 확인을 더 쉽고 믿을만하게 만드는 것을 허용한다. 사이클릭(cyclic) 7-량 펩타이드 라이브러리, Ph.D.-C7CTM,가 사용 가능하다(New England Biolabs). 이 C7C-펩타이드 라이브러리는 선형 라이브러리(Ph.D.-7TM)와 특징을 공유하지만, 랜덤 7-량 펩타이드의 각 끝에 위치한 두 시스테인 아미노산 사이에 이황화물 브릿지(disulfide bridge)를 형성함으로써, 고리화된(cyclized) 펩타이드를 발현한다. 이것은 고리화를 통해 디스플레이된 펩타이드에 구조적 제한(conformational restriction)을 부과한다.
광범위한 연구 후에, 본 발명자들은 심장을 포함하여 근육 세포에 선별적으로 결합하고, 이에 의해 흡수되는 다수의 아미노산 서열을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 치료적 재조합 효소 또는 (안티센스) 올리고뉴클레오타이드의 생체내 흡수를, 이러한 효소 또는 올리고뉴클레오티드를 근육-특이적 펩타이드에 접합(conjugating) 또는 달리 결합시킴으로써, 개선시킬 필요성을 충족시킨다. 접합체(conjugation)는, 근병증(myopathy)의 치료용 안티-센스 치료법 방법, 근육이 잠재적으로 단백질 생산의 저장고 역할을 하는 질병의 유전자 치료법 및 심장 및 근육 세포에 광범위한 진단 또는 약물을 전달하는데 유리하게 유용하다.
따라서, 본 발명은 서열 번호: 1-63, 바람직하게는 서열 번호: 24 또는 25로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 표적화 서열을 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체에 관한 것이다. 서열 번호: 1-63이 표 1에 나타나있다. 바람직하게는, 펩타이드는 사이클릭이다.
[표 1] 7-량 서열 및 이들의 서열 번호(ID로 표시됨)
또한 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 펩타이드의 접합체에 관한 것이며, 본 발명에 따른 상기 펩타이드는 생물학적 활성 모이어티 및 진단적 모이어티로부터 선택되는 적어도 하나의 모이어티에 연결된다.
상기 접합체를 약제로서 사용하기 위한 상기 기술된 접합체는 본 발명의 한 가지 양태이다.
본 발명에 따른 펩타이드 및, 본 발명에 따른 펩타이드를 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티에 연결하기 위한, 펩타이드가 아닌, 링커(linker) 모이어티를 포함하는 분자가 본 발명의 추가의 양태이다.
본 발명은 진단적 모이어티 또는 생물학적 활성 모이어티를 관심 기관 또는 조직 또는 세포 유형, 특히 심장을 포함하는 근육세포로 표적화하기 위한 펩타이드 또는 펩타이드 모방체를 제공한다.
본 발명의 맥락 내의 펩타이드는 적어도 7개의 아미노산을 포함한다. 펩타이드는 자연적으로 발생하는 L-아미노산으로 완전히 구성될 수 있거나, 주쇄(backbone) 및/또는 측쇄에 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 이 변형들은 자연의 아미노산과 유사성을 나타내는 아미노산 모방체(amino acid mimetic)의 혼입으로써 도입될 수 있다. 하나 이상의 아미노산의 모방체를 포함하는 상기 기술된 펩타이드의 그룹은 펩타이드 모방체로 지칭된다. 본 발명의 맥락 내에서, 아미노산의 모방체는 β2- 및 β3-아미노산, β2,2-β2,3, 및 β3,3-이치환된(disubstituted) 아미노산, α,α-이치환된 아미노산, 아미노산의 스타틴(statine) 유도체, D-아미노산, α-히드록시산(α-hydroxyacid), α-아미노니트릴(α-aminonitrile), N-알킬아미노산 및 유사체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가로, 펩타이드의 C-말단은 카르복시산 또는 카르복사미드(carboxamide), 또는 상기 언급된 아미노산 모방체의 하나의 혼입으로부터의 다른 결과일 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 기술된 펩타이드는 설폰아미드(sulfonamide), 레트로아미드(retroamide), 아미노옥시-함유 결합(aminooxy-containing bond), 에스테르, 알킬케톤, α,α-디플루오로케톤(α,α-difluoroketone), α-플루오로케톤(α-fluoroketone), 펩토이드(peptoid) 결합(N-알킬레이트 글리실 아미드 결합(N-alkylated glycyl amide bond))을 포함하나, 이에 제한되지 않는 그룹과, 천연의 펩타이드 결합의 하나 이상의 치환을 함유할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 언급된 펩타이드는 예를 들어, 4-플루오로페닐알라닌(4-fluorophenylalanine), 4-히드록시라이신(4-hydroxylysine), 3-아미노프롤린(3-aminoproline), 2-니트로티로신(2-nitrotyrosine), N-알킬히스티딘(N-alkylhistidine) 또는 β-분지된(β-branched) 아미노산 또는 β-측쇄 탄소 원자에 자연의 키랄성(chirality)과 반대되는 키랄성을 갖는 β-분지된 아미노산 모방체(예컨대, 알로-트레오닌(allo-threonine), 알로-이소류신(allo-isoleucine ) 및 유도체)와 같은, 아미노산 측쇄(대응되는 자연의 아미노산의 측쇄를 지칭)의 치환을 함유할 수 있다. 하나의 다른 구현예에서, 상기 언급된 펩타이드의 그룹은 예를 들어 라이신을 대신하는 오르니틴, 페닐알라닌을 대신하는 호모페닐알라닌 또는 페닐글리신, 글리신을 대신하는 β-알라닌, 글루탐산을 대신하는 피로글루탐산, 류신 또는 황-산화된 버전의 메티오닌(sulfur-oxidized versions of methionine) 및/또는 시스테인을 대신하는 노르류신과 같은, 아미노산 또는 아미노산 모방체의 자연에 가까운 또는 비-자연의 구조적 유사체(analogue)를 함유할 수 있다.
바람직한 펩타이드는 서열 번호: 1-63(즉, 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 더 바람직한 펩타이드는 서열 번호: 24 또는 25를 포함하거나 이로 구성된다. 그룹은 서열 번호: 24, 25, 1-23, 26-63으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 구성되는 바람직한 펩타이드로 또한 정의될 수 있다. 그들의 레트로(retro), 인버소(inverso) 및/또는 레트로인버소(retroinverso) 유사체 뿐만 아니라, 상기 언급된 선형 또는 사이클릭 형태의 펩타이드는 이 특허에 의해 커버된다. 본 발명에 따른 바람직한 펩타이드는 사이클릭이다. 당업자에게 더 많은 가까운 변형체들이 알려져있을 수 있지만, 본원에 언급되어 있지 않은 사실이 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 하나의 구현에에서, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 최대로 30 아미노산 길이, 또는 적어도 25 아미노산 또는 20 아미노산 또는 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 또는 7 아미노산 길이이다.
바람직한 사이클릭 펩타이드는, 사이클릭 구조를 수득(yield)하기 위해 결합을 형성하는 것이 가능하도록, 서열 번호: 1-63으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열로 구성되거나 이를 포함하는 서열이 아미노산 잔기, 또는 다른 모이어티에 인접하는 사이클릭 펩타이드이다. 더 바람직한 사이클릭 펩타이드는 사이클릭 구조를 산출하기 위해 결합을 형성하는 것이 가능하도록, 서열 번호: 24 또는 25 를 포함하거나 이로 구성되는 서열이 아미노산 잔기, 또는 다른 모이어티에 인접하는 사이클릭 펩타이드이다. 상기 기술된 것과 같은 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 본원에서, 본 발명에 따른 펩타이드, 또는 오직 사이클릭 펩타이드 또는 사이클릭 펩타이드 모방체가 의도될 때의 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드, 또는 오직 선형 펩타이드 또는 선형 펩타이드 모방체가 의도될 때의 본 발명에 따른 선형 펩타이드를 지칭한다. 추가로 명시되지 않을 때, 본 발명에 따른 펩타이드는 사이클릭 및 선형 펩타이드 또는 펩타이드 모방체를 둘 다 포함한다.
본원의 서열 번호: 1-63으로 표시되는 서열은 표적화 서열로 지칭된다. 더 바람직한 서열은 서열 번호: 24 또는 25로 표시된다. 표적화 서열은 근육 세포 또는 근육 조직에 결합하거나, 또는 근육 세포 내로 또는 근육 조직 내로의 흡수를 증가시키는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체의 서열이다. 서열이 표적화 서열인지 결정하기 위한 바람직한 분석법은 실시예에서 제공된다. 예를 들어, 표적화 서열이 형광 라벨에 연결되었을 때 증가된 흡수가 형광 현미경검사(fluorescence microscopy)로 결정될 수 있다.
본원에서, 펩타이드라는 용어의 사용은 각 잔기가 자연적으로 발생한 단백질생산적(proteinogenic) 아미노산이 이의 이웃과 주쇄 아미드 결합으로 연결된 다른 특징이 없는 펩타이드 다음으로, 또한 비-자연의 아미노산, 펩타이드 모방체, 비전형적인(unconventional) 결합, 및 많은 보통의 변형체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이는 알킬레이트 결합, 반전된 결합(inverted bond), 또는 에스테르, 트리아졸(triazole), 카르바메이트(carbamamte), 요소(urea), 티오요소(thiourea), 이미드(imide), 이민(imine), 할로겐화된 결합(halogenated bond), 알파-할로게네이트(alpha-halogenated) 결합, 케톤, 또는 베타-아미노산을 포함하는 펩타이드, 다른 확장된 아미노산, 또는 잔기의 측쇄가 대응되는 알파 탄소 원자 대신 주쇄 아미드 결합에 부착된 펩토이드와 같은, 다른 타입의 결합, 또는 주쇄 기능적 그룹을 대신하는 측쇄에 관여하는 결합을 포함하는 펩타이드를 포함한다. 펩타이드는 L-아미노산 또는 D-아미노산 또는 이의 혼합물 같은, 임의의 키랄성 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 용어 '아미노산'은 상기에서 정의된 펩타이드에서 잔기를 구성할 수 있는 임의의 모이어티로 해석되어야 한다. 대부분의 경우, 아미노산은 분자 산이며, 바람직하게는 카르복실산을 특징으로 하며, 상기 아미노산은 카르복실산 다음의 알파-탄소에서 아민을 특징으로 한다. 대부분의 보통의 자연적으로 발생한 단백질생산적 아미노산 및 그들의 세-글자 축약형 및 한-글자 코드는 하기와 같다: 알라닌 (Ala, A); 아르기닌 (Arg, R), 아스파라긴 (Asn, N); 아스파르트산 (Asp, D); 시스테인 (Cys, C); 글루탐산 (Glu, E); 글루타민 (Gln, Q); 글리신 (Gly, G); 히스티딘 (His, H); 이소류신 (Ile, I); 류신 (Leu, L); 라이신 (Lys, K); 메티오닌 (Met, M); 페닐알라닌 (Phe, F); 프롤린 (Pro, P); 세린 (Ser, S); 트레오닌 (Thr, T); 티로신 (Tyr, Y); 트립토판 (Trp, W); 발린 (Val, V). 본 발명의 맥락에서, 자연적으로 발생한 아미노산은 자연의 아미노산으로도 불린다. 자연의 아미노산은 흔히 단백질생산적이며, 이는 이들이 기관에 의한 단백질의 생합성에 사용되는 것을 의미한다. 일부 경우에, 자연의 아미노산은 비-단백질생산적일 수도 있다. 자연의 아미노산은 그들의 역할 또는 기능을 추가로 제한하지 않으면서, 자연에서 발견될 수 있는 아미노산이다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 아미노산은 흔히 그들의 측쇄의 본성에 의해 특징된다. 염기성 아미노산으로 고려되는 아미노산은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이다. 산성 아미노산으로 고려되는 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산이다. 극성 비전하(polar uncharged) 아미노산으로 고려되는 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민이다. 소수성 아미노산으로 고려되는 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 프롤린 및 트립토판이다. 프롤린은 형태적 제한된(conformationally restrained) 아미노산으로 고려된다. 글리신은 아키랄성(achiral)이지만 D-펩타이드 및 L-펩타이드 둘 다의 부분이 될 수 있다. 본 발명의 구현예 내에서, 펩타이드는 더 큰 펩타이드, 또는 더 큰 물질에 포함될 수 있다. 펩타이드는 말단 아미드, 아세트아미드, 메틸 에스테르, 다른 말단화 에스테르, 또는 당업자에게 알려진 다른 말단 모이어티와 같은 캡핑(capping) 그룹을 포함하는 것이 가능하게 이해된다. 펩타이드는 추가로 아세틸, t-뷰틸 카르바메이트, 9-플루오레닐메틸 카르바메이트, 벤질 카르바메이트, 벤질 에스테르, t-뷰틸 에스테르, 메틸 에스테르, 또는 당업계에 알려진 다른 보호 그룹과 같은 보호 그룹 특징을 나타내는 것이 가능하게 이해된다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 (i) 서열 번호: 1-63으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 표적화 서열(targeting sequence)을 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체(peptidomimetic)의 접합체(conjugate)로서, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 (ii) 생물학적 활성 모이어티(moiety) 및 진단적 모이어티로부터 선택되는 모이어티에 연결되는, 접합체를 제공한다. 본원에서 이와 같은 접합체는 본 발명에 따른 접합체로 지칭된다. 바람직한 표적화 서열은 서열 번호: 24 또는 25를 포함하거나 이로 구성된다. 본 발명에 따른 접합체는 본 발명에 따른 펩타이드를 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티에 연결한다.
당업자에게 알려진 바와 같이, 접합체는 적어도 하나의 구별되는 두 번째 특징 부분에 연결되는 적어도 하나의 첫 번째 특징 부분를 포함한다. 비-제한적 예는 두 번째 부분으로서의 올리고뉴클레오티드에 연결된 첫 번째 부분으로서의 펩타이드, 두 번째 부분으로서의 구별되는 두 번째 펩타이드에 연결된 첫 번째 부분으로서의 펩타이드, 두 번째 부분으로서의 단백질에 연결된 첫 번째 부분으로서의 유기 소 분자 등 이다. 본 발명의 따른 접합체의 맥락에서, 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 추가로 생물학적 활성 모이어티 및 진단적 모이어티로부터 선택되는 모이어티에 연결된다. 생물학적 활성 또는 진단적 모이어티가 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 모방체에 공유적으로 연결되는 것이 필수적인 것은 아니다. 이는 정전기 상호작용(electrostatic interaction)을 통해 또한 연결될 수 있다. 연결은 본 발명에 따른 펩타이드와 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티 사이의 공유 결합과 같은 직접적 연결일 수 있다. 대안적으로, 링커 모이어티가 사용될 수 있다. 링커 모이어티는 당업계에 알려져있다. 본원에서 정의된 바와 같이, 및 당업자에게 알려진 바와 같이, Ahx는, 또한 Acp로 축약되는 용어인, 아미노카프로산(aminocaproic acid)으로 알려진, 6-아미노헥사노산(6-aminohexanoic acid)을 표시한다. Ahx는 두 개 초과의 모이어티를 함께 연결하는 링커 모이어티로 고려된다. Ahx에 추가로, 베타-알라닌(또한 베타-아미노프로피온산(beta-aminopropionic acid), bAla로 알려짐), 4-아미노뷰티르산(4-Aminobutyric acid)(또한 피페리딘산(piperidinic acid), 4Abu으로 알려짐), 3-아미노이소뷰티르산(3-aminoisobutyric acid)(bAib), 또는 당업계에 알려진 다른 링커 모이어티와 같으나, 이에 제한되지는 않는, 개별 아미노산 잔기를 대신하여 다른 링커 모이어티가 사용될 수 있다. 이들 링커 모이어티는 본 발명에 따른 펩타이드 내에 포함될 수 있으며, 또는 본 발명에 따른 접합체 내에 포함될 수 있으며, 또는 본 발명에 따른 분자 내에 포함될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체 및, 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티에 분자를 연결하기 위한, 펩타이드가 아닌, 링커(linker) 모이어티를 포함하는 분자와 또한 관련된다. 따라서, 본 발명은 또한:
- 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체, 및
- 상기 펩타이드 또는 펩타이드 모방체를 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티에 연결하기 위한, 펩타이드가 아닌, 링커 모이어티를 포함하는 분자를 제공한다.
이와 같은 분자는 본원에서 본 발명에 따른 분자로 지칭된다.
링커 모이어티는 예를 들어, 생물학적 활성 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드와 함께 복합체(complex)를 이루는 (폴리)양이온 그룹일 수 있다. 이와 같은 (폴리)양이온 그룹은 스페르민(spermine) 또는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-라이신 및 유도체 등일 수 있다. 링커 모이어티에 의해 영향받는 연결은 공유 결합, 초분자(supramolecular) 결합, 또는 접합체의 요소(componet)가 다른 것과 강하게 연합된 임의의 다른 결합일 수 있다. 연결의 비-제한적 예는 류신 지퍼(leucine zippers)와 같은 코일드 코일(coiled coil), 및 비오틴(biotin)을 포함하는 호스트-게스트 상호작용(host-guest interactions)이다.
본 발명에 따른 접합체를 제조하기 위하여, 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티를 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체에 커플링(coupling)하는 것은 화합물을 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하는 알려진 방법에 의해 발생할 수 있다. 보통의 방법은 모이어티를 펩타이드 또는 펩타이드 모방체의 자유(free) 아미노 그룹 또는 자유 히드록시 그룹 또는 자유 카르복시산 그룹 또는 자유 티올(thiol) 그룹에 연결하는 것이다. 보통의 접합 방법은 티올/말레이미드(maleimide) 커플링, 아미드 또는 에스테르 결합 형성, 또는 이종의(heterogeneous) 이황화물(disulfied) 형성을 포함한다. 당업자는 요구되는 커플링을 유발하는데 사용될 수 있는 표준 화학을 잘 알고 있다. 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체에 직접적으로 커플링되거나 또는 스페이서(spacer) 또는 링커 모이어티를 통하여 커플링될 수 있다. 적합한 링커의 예는 SMCC(숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실산(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)) 또는 BMPS((N-β-말레이미도프로피록시)숙신이미드 에스테르((N-β-maleimidopropyloxy)succinimide ester))의 사용으로부터의 결과이다.
하나의 구현예에서 언급된 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 생물학적 활성 모이어티에 연결된다. 예를 들어, 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 생물학적 활성 또는 치료적 펩타이드에 연결될 수 있으며 한 구현예에서는 심지어 펩타이드 또는 펩타이드 모방체의 기본 구조의 부분이 될 수 있다. 예를 들어, 치료적 펩타이드의 아미노- 또는 카르복시-말단은 상기 펩타이드를 포함하거나 이로 구성되는 서열을 통해 확장될 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체를 통해 확장된 이와 같은 펩타이드는 본 발명에 따른 접합체에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 펩타이드의 제조는 표준 아미노산 또는 펩타이드 커플링 절차를 통해 달성된다.
하나의 구현예에서 본 발명은 생물학적 활성 모이어티가 단백질 또는 폴리펩타이드인, 및 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 단백질 또는 폴리펩티드 주쇄(backbone)에 포함된, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 상기 접합체는 바람직하게는 생물학적 활성 단백질과 함께 펩타이드 또는 펩타이드 모방체의 재조합 발현에 의하여 제조된다. 바람직하게는 DNA 작제물(construct)은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 생물학적 활성 단백질의 말단, 바람직하게는 생물학적 활성 단백질으 C-말단에서 발현되도록 제조된다. 이러한 재조합 DNA 방법론에 의한 DNA 작제물의 제조 및 적합한 호스트에서의 발현은 당업자에게 일반적인 실시(practice)이다. 따라서 하나의 구현예에서 본 발명의 접합체는 본 발명에 따른 단백질의 융합(fusion) 단백질, 예컨대, 서열 번호: 1-63(바람직하게는 서열 번호: 24 또는 25)의 단백질과 치료적 활성 단백질, 예컨대, 항체, 또는 진단적(예컨대, 형광) 단백질 또는 둘 다, 선택적으로는 또한 NLS를 포함하는, 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질은 적절한 DNA 작제물을 발현시켜 제조될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체는 생물학적 활성 모이어티를 포함한다. 생물학적 활성 모이어티는(직접적 또는 간접적으로) 생물학적 기능, 바람직하게는 치료적 기능에 영향을 가하는 화합물이며, 따라서 바람직하게는 치료적 활성 화합물이다. 치료적 활성 화합물은 임의의 당업계에 알려져 있는 화합물 및 바람직하게는 세포 간(intercellural) 과정을 조절함으로서 치료적 효과를 가지는 화합물이 될 수 있다. (직접적) 조절 효과 또는 (직접적) 생물학적 기능을 가지는 치료적 활성 화합물은 예를 들어 임의의 단백질, 효소 저해제, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 유전자, 자연의 화합물, 약물 또는 약제일 수 있다. 임의의 생물학적 활성 화합물 또는 치료적 활성 화합물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩타이드 또는 펩타이드 모방체에 연결될 수 있거나 연결되기에 적합하도록 만들어질 수 있는 한 사용될 수 있다. 생물학적 활성 화합물 또는 치료적 활성 화합물은 본 발명에 따른 화합물 내의 모이어티가 된다. 당업자는 적합한 생물학적 활성 또는 치료적 활성 화합물을 확인하는 것이 가능할 것이다. 생물학적 활성 모이어티는 소형 유기 분자, 펩타이드, 뎁시펩타이드(depsipeptide), 아실뎁시펩타이드(acyldepsipeptide), 항생제(antibiotic), 살균제(antimicrobiotic), 폴리펩타이드, 단백질, 단백질 단편, 핵산, 핵산 유사체, 또는 이들의 부분, 화학요법(chemotherapeutic), 디코이(decoy) 분자, 또는 임의의 다른 실재(entity) 또는 이의 조합일 수 있다. 핵산은 DNA 분자, RNA 분자, PNA 분자, 올리고뉴클레오티드, 합성 mRNA, ss(단일 가닥) 또는 ds(이중 가닥) siRNA 분자, miRNA, 갭머(gapmer), 안티센스 분자, 리보자임, 앱타머, 및 스피겔머(spiegelmer)를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 생물학적 활성 모이어티는 치료적 효과를 주장할 수 있는 임의의 실재로 이해되는 약물, 또한 예방접종(vaccination)을 위한 것일 수 있는 약물일 수 있다.
하나의 구현예에서 생물학적 활성 화합물 또는 치료적 활성 화합물은 핵산 또는 이의 유사체를 포함하거나 이로 구성되는 화합물이다. 이러한 화합물은, 특히 단백질 생산 수준에서, 세포 내 유전적 기구(genetic machinery)를 조절함으로써, (간접적으로) 생물학적 기능에 영향을 가하는 것으로 고려될 수 있다. 핵산은 2'-F, 2'-O-알킬 또는 2'-O-알케닐 (알릴) or 2'-O-알키닐 뉴클레오티드, 예를 들어 2'-O-메틸-, 특히 2'-O-메틸 포스포로티오에이트(2OMePS; Voit et al., 2014), 포스포로디아미데이트 모르폴리노(phosphorodiamidate morpholino)(PMO; Cirak et al., 2011), 트리사이클로 DNA(tcDNA; Goyenvalle et al, 2015), 펩타이드 핵산(PNA; Gao et al., 2015), 2'-O-메톡시에틸-(MOE) 및 2'-O-알릴-뉴클레오티드, 브릿지된(bridged)/바이사이클릭(bicyclic) 핵산(BNAs, 예를 들어, LNA, 알파-L-LNA, 2'-아미노 LNA, 2'-N-치환된-2'-아미노 LNA, CBBN, ENA, CRN, cEt, BNANC[N-Me], tcDNA, 및 이의 유도체를 포함), 펩타이드 핵산(예컨대, WO2009/113828 CTI Bio 또는 WO2015/172889, WO2013/0131019 Ugichem에 기술된 것과 같은 유도체를 포함하는 PNAs), 에틸렌 브릿지된 핵산(ENAs), 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드(phosphorothioate modified nucleotides), 예컨대, 2'-O-메톡시에틸 포스포로티오에이트 RNA 뉴클레오티드 또는 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 RNA 뉴클레오티드, 또는 (WaVe Lifesciences, 또는 Ontorii 또는 Chiralgen에 의하여 제공되는 것과 같은) 키랄 정의된 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드(chirally defined phosphorothioate modified nucleotides), 모르폴리노 기반(based) 뉴클레오티드 (예를 들어 Sarepta Therapeutics 또는 AVI Biopharma 또는 Shire 또는 Nippon Shinyaku에 의해 제공되는 것과 같은 PMO, PMO+, PMO-X) 및 이의 조합 등과 같은 유사체 단량체를 포함하는 화합물과 같은, DNA, RNA 또는 이의 유사체일 수 있다. 핵산은 유전자, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 단일 또는 이중 가닥 소형 간섭 RNA, miRNa 또는 mRNA 및 유사체일 수 있다.
따라서, 첫 번째 양태의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 생물학적 활성 모이어티가 2'-O-알킬, 특히 2'-O-메톡시에틸- 및 2'-O-메틸, 브릿지된(bridged)/바이사이클릭(bicyclic) 핵산 뉴클레오티드(LNA, ENA, cEt, CBBN, CRN, 알파-L-LNA, cMOE, 2'-아미노-LNA, 2'-(아실아미노)LNA, 2'-티오-LNA, BNANC[N-Me], BNANC[NH]), 트리사이클로-DNA(tcDNA), 펩타이드 핵산(PNA, PPNA), 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드(phosphorothioate modified nucleotides), 키랄 정의된 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드(chirally defined phosphorothioate modified nucleotides), 포스포릴구아니딘 변형된 올리고뉴클레오티드(PGOs), 모르폴리노 기반(based) 뉴클레오티드 (PMO, PMO+, PMO-X, PPMO) 및 이의 조합을 포함하는 화합물과 같은, DNA, RNA, 및 이의 유사체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 강하게 바람직한 구현예에서, 상기 기술된 것과 같은 이 DNA 또는 RNA 또는 이의 유사체는 안티센스 올리고뉴클레오티드(AON)이다. 바람직한 AON은 하기를 하나 이상 포함한다:
i) 2'-치환된 단량체, 바람직하게는 상기 2'-치환된 단량체는 2'-F 단량체, 2'-O-메틸 단량체, 2'-아미노 단량체, 또는 2'-O-(2-메톡시에틸) 단량체, 가장 바람직하게는 2'-O-메틸 단량체;
ii) 시토신 염기를 치환하는 적어도 하나의 5-메틸시토신 염기;
iii) 모든 시토신 염기를 치환하는 5-메틸시토신 염기;
iv) 우라실 염기를 치환하는 적어도 하나의 5-메틸우라실
v) 모든 우라실 염기를 치환하는 5-메틸우라실
vi) 포스포디에스테르 주쇄 결합을 치환하는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 주쇄 결합;
vii) 모든 포스포디에스테르 주쇄 결합을 치환하는 포스포로티오에이트 주쇄 결합;
viii) 상기 기술된 것과 같은 적어도 하나의 유사체 단량체
하기는 상기 기술된 대로 사용할 수 있는 DNA 또는 RNA 유사체에 대한 참고 문헌의 비-포괄적(non-exhaustive) 개요이다: cEt (2'-O,4'-C 구속된(constrained) 에틸) LNA (doi: 10.1021/ja710342q), cMOE (2'-O,4'-C 구속된 메톡시에틸) LNA (Seth et al., J. Org. Chem. 2010, 75, 1569-1581), 2',4'-BNANC(N-H), 2',4'-BNANC(N-Me), 에틸렌-브릿지된 핵산(ENA) (doi: 10.1093/nass/1.1.241), 2'-C-브릿지된 바이사이클릭 뉴클레오티드(예컨대, WO 2014/145356 (MiRagen Therapeutics)에 있는, CBBN), 헤테로사이클릭-브릿지된 LNA (예컨대, WO 2014/126229 (Mitsuoka Y et al.)에 있는), 아미노-브릿지된 LNA (예컨대, Yamamoto et al. Org. Biomol. Chem. 2015, 13, 3757에 있는), 요소-브릿지된 LNA (예컨대 Nishida et al. Chem. Commun. 2010, 46, 5283에 있는), 설폰아미드-브릿지된 LNA (예를 들어 WO 2014/112463 (Obika S et al.)에 있는), 바이사이클릭 카르보사이클릭 뉴클레오시드(bicyclic carbocyclic nucleosides) (예컨대, WO 2015/142910 (Ionis Pharmaceuticals)에 있는 것과 같은), 트리NA (Hanessian et al., J. Org. Chem., 2013, 78 (18), pp 9064-9075), α-L-TriNA, 바이사이클로(bicyclo) DNA (bcDNA) (Bolli et al., Chem Biol. 1996 Mar;3(3):197-206), F-bcDNA (DOI: 10.1021/jo402690j), 트리사이클로(tricyclo) DNA (tcDNA) (Murray et al., Nucl. Acids Res., 2012, Vol. 40, No. 13 6135-6143), F-tcDNA (doi: 10.1021/acs.joc.5b00184), 옥세탄(oxetane) 뉴클레오티드 단량체 (Nucleic Acids Res. 2004, 32, 5791-5799). 상기에 언급되어있지 않은 것들에 대해서는, WO 2011/097641 (ISIS/Ionis Pharmaceuticals) 및 WO2016/017422 (Osaka University)를 참조하며, 이들의 전체가 참고 문헌으로 포함된다.
생물학적 활성 모이어티로 사용될 수 있는 바람직한 AON은 AON이 전-mRNA 스플라이싱 조절을 유도하는 것인, 바람직하게는 상기 전-mRNA 스플라이싱 조절이 단백질의 생산 또는 조성을 변경하는 것인, 바람직하게는 엑손 스킵핑 또는 엑손 포함(inclusion)을 포함하는 것인, 상기 전-mRNA 스플라이싱 조절은 가장 바람직하게는 엑손 스킵핑을 포함하는 것인, AON이다. 이 전-mRNA 스플라이싱 조절은 바람직하게는 치료적이다.
전-mRNA 스플라이싱 조절의 목적은 단백질의 생산, 대부분 RNA가 암호화하는 단백질의 생산을 변경시키는 것일 수 있다. 이 생산은 상기 생산 수준의 증가 또는 감소를 통해 변경될 수 있다. 이 생산은 또한 예를 들어, 전-mRNA 스플라이싱 조절이 하나 이상의 엑손의 포함 또는 배제 및 다른 아미노산 서열을 갖는 단백질을 초래할 때, 실제로 생산되는 단백질의 조성을 변경하는 것을 통해 변경될 수 있다. 바람직하게는, 이와 같은 다른 아미노산 서열을 갖는 단백질은 질병 또는 상태(condition)의 결과로서 생산된 단백질과 비교하여 더 많은 기능성을 가지며, 또는 더 좋은 기능성을 가지거나, 또는 적어도 하나의 변경된 특성을 가진다.
DMD의 경우, 전-mRNA 스플라이싱 조절은 전사체의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 회복시키고 짧지만 (더) 기능적인 디스트로핀 단백질 발현을 유도하기 위해 디스트로핀 전-mRNA에서 하나 이상의 특이적 엑손을 스킵하는데 적용될 수 있으며, 궁극적인 목표는 질병의 진행을 방해할 수 있는 것이다. 유사한 전략이 BMD의 진행을 방해하는 것을 허용한다. SMA의 경우, SMN2 유전자의 엑손 7의 포함을 향상시키고 운동 뉴런(motor neuron)의 생존 수준을 증가시키는데 적용될 수 있으며, 이는 척수(spinal cord)의 운동 뉴런의 손실 및 이후의 수의근(voluntary muscle)의 위축증을 감소시킨다. 이와 같이, 바람직한 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 전-mRNA 스플라이싱 조절에 영향을 주며, 상기 조절은 질병 또는 대조군에 관련된 단백질의 생산을 변경시키며, 바람직하게는 상기 질병 또는 대조군은 뒤센 근육퇴행위축(DMD), 베커 근육퇴행위축(BMD), 또는 척수 근위축증(SMA)이다. 생물학적 활성 모이어티로 사용될 수 있는 다른 바람직한 AON은 인간 시스-요소 반복 불안정성 연관 유전 장애(human cis-element repeat instability associated genetic disorder)를 치료하는데 효과적이다. 이는 또한 이러한 장애로부터 고통 받는 대상에 있어 감퇴(decline)의 비율을 늦추는 것을 포함한다. 본원에서 확인된 인간 시스-요소 반복 불안정성 연관 유전 장애는 바람직하게는 신경근 장애(neuromuscular disorder)이다. 반복 장애를 위한 치료적 RNA 조절은 결합(또는 결합이 가능한), 표적, 혼성화(hybridizing)(또는 혼성화가 가능한) 및/ 또는 인간 시스-요소 반복 불안정성 연관 유전 신경근 장애에 관여하는 또는 연관된 유전자의 전사체의 특이적인 서열과 역 상보적인(reverse complementary) 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시예는 헌팅턴 질병(Huntington's disease, HD), 여러 유형의 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia, SCA), 프리드리히 실조증(Friedreich’s ataxia, FA), 근위축측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) 및 전두측두엽치매(Frontotemporal dementia, FTD)를 포함한다. 신경병증(neuropathy)의 아집단(subset)은 시스-요소 반복 불안정성으로 야기된다. 예를 들어, HD는 HTT 유전자의 엑손 1 내의 트리플렛 (CAG)n 반복 확장으로 야기된다.
바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 모이어티는 AON이며, 더 바람직하게는 인간 시스-요소 반복 불안정성 연관 유전 장애를 치료하기 위한, 또는 전-mRNA 스플라이싱 조절을 유도하기 위한 AON이며, 가장 바람직하게는 전-mRNA 스플라이싱 조절을 유도하기 위한 AON이다. 적합한 AON은 WO2013112053에 기술되어 있다. 본 맥락의 바람직한 AON은 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 본 맥락의 바람직한 AON은 50 뉴클레오티드 이하 또는 이의 유사체를 포함한다. 이와 같은 AON은 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되지 않는 추가적인 1, 2, 3, 4, 또는 5 뉴클레오티드 또는 이의 유사체를 선택적으로 포함한다; 바람직하게는, 이러한 추가적인 뉴클레오티드 또는 이의 유사체는 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 포함된다. 더 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 RNA 단량체를 포함하거나 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 RNA로 구성되고, 더 바람직하게는 5-메틸피리미딘(즉, 5-메틸시토신, 및/또는 5-메틸우라실) 및/또는 2,6-디아미노퓨린 염기를 포함하고, 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나를 포함하거나 이로 구성되는 뉴클레오티드 또는 염기 서열 또는 서열 번호: 83-330의 단편을 포함하거나 이로 구성되는 뉴클레오티드 또는 염기 서열로 표시된다. 맥락에서, "5-메틸피리미딘"은 적어도 하나의 5-메틸피리미딘을 의미한다. 따라서, "적어도 하나의 5-메틸피리미딘"은 적어도 하나의 5-메틸시토신 및/또는 적어도 하나의 5-메틸우라실을 의미한다. 맥락에서, 서열 번호의 단편은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33 뉴클레오티드 길이를 갖는 서열, 및 단편의 길이에 걸쳐 상기 서열 번호와 100% 서열 상동성을 갖는 서열을 지칭한다. 본 발명은 또한 생물학적 활성 모이어티가 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되며 하기한 것들 중 하나 이상 포함하는 AON인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다:
i) 2'-치환된 단량체, 바람직하게는 상기 2'-치환된 단량체는 2'-F 단량체, 2'-O-메틸 단량체, 2'-아미노 단량체, 또는 2'-O-(2-메톡시에틸) 단량체, 가장 바람직하게는 2'-O-메틸 단량체;
ii) 시토신 염기를 치환하는 적어도 하나의 5-메틸시토신 염기;
iii) 모든 시토신 염기를 치환하는 5-메틸시토신 염기;
iv) 우라실 염기를 치환하는 적어도 하나의 5-메틸우라실 염기;
v) 모든 우라실 염기를 치환하는 5-메틸우라실 염기;
vi) 포스포디에스테르 주쇄 결합을 치환하는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 주쇄 결합;
vii) 모든 포스포디에스테르 주쇄 결합을 치환하는 포스포로티오에이트 주쇄 결합;
viii) 본원에 이전에 기술된 것과 같은 적어도 하나의 유사체 단량체.
본 발명은 생물학적 활성 모이어티가 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되는 AON인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 모이어티가 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되며 적어도 하나의 유사체 단량체를 포함하는 AON인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
더 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 모이어티가 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되며 5'-메틸 피리미딘 단량체, 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 단량체, BNA 단량체, PMO 단량체, 및 PNA 단량체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유사체 단량체를 포함하는 AON인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
보다 더 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 모이어티가 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되며 단지 하나의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 단량체를 포함하는 AON인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
보다 더 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 모이어티가 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되며 적어도 하나의 5'-메틸 피리미딘 단량체를 포함하는 AON인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
보다 더 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 모이어티가 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되며 적어도 하나의 5'-메틸 피리미딘 단량체 및 적어도 하나의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 단량체를 포함하는 AON인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
보다 더 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 모이어티가 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되며 적어도 하나의 5'-메틸 피리미딘 단량체, 적어도 하나의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 단량체 및 적어도 하나의 BNA 단량체를 포함하는 AON인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
보다 더 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 모이어티가 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되며 PMO 단량체를 포함하거나 이로 구성되는 AON인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
보다 더 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 모이어티가 서열 번호: 84-330 중 임의의 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되며 PNA 단량체를 포함하거나 이로 구성되는 AON인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체는 진단적 모이어티를 포함한다. 진단적 모이어티는 검출하기 위한 방법을 사용하는 검출을 촉진하는 임의의 모이어티로 이해되며, 이러한 진단적 모이어티는 플루오레세인(fluorescein), 발색단(chromophore), 방사성 트레이서(radioactive tracer), 특이적 동위원소(specific isotope), 진단적 마커, 또는 바람직하게는 비오틴(biotin)인, 합텐(hapten)과 같은 형광단(fluorophore)이다. 바람직한 구현예에서, 진단적 모이어티는 바람직하게는 방사성 표지된 아미노산, 더 바람직하게는 방사성 표지된 아미노산이 삼중수소(tritium)-표지된 아미노산인, 아미노산을 혼입함으로써, 접합체가 방사성 표지되도록 한다. 진단적 모이어티는 생체내, 생체 외, 또는 시험관내의 진단적 목적일 수 있다. 일반적으로(commonly) 사용되는, 재조합 발현을 통해 가능한, 이미징 라벨, 방사성 라벨,또는 FAM, FITC, VIC, Cy3, Cy5, Cy5.5 및 유사체와 같은 형광 라벨, 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 다른 진단적 단백질은 진단적 모이어티로 사용될 수 있다. 바람직한 구현에에서, 진단적 모이어티는 파지 또는 파지의 부분이 아니며, 더 바람직하게는 파지가 아니다.
바람직한 구현예에서, 이 양태는 생물학적 활성 모이어티가 치료적 활성 단백질이고/이거나 진단적 모이어티가 진단적 단백질인, 제1항에 따른 펩타이드와 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티의 융합(fusion) 단백질인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 이 양태는 핵 위치 신호(nuclear localization signal) 및/또는 세포 투과성(cell penetrating) 펩타이드를 추가로 포함하는, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체는 핵 위치 신호를 추가로 포함한다. 다른 더 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체는 세포 투과성 펩타이드를 추가로 포함한다. 세포-투과성 펩타이드는 화합물 그 자체, 또는 추가 화합물, 또는 접합체 또는 연결된 화합물의 세포 속으로의 진입을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 적합한 세포-투과성 펩타이드를 확인하는 것이 가능하다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 핵 위치 신호(NLS)와 결합한다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체는 NLS와 결합한다. 본 발명의 맥락에서, NLS는 예를 들어, 아마도 세포질(cytosolic) 핵 수송 수용체에 의한 인지를 통한, 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티를 세포 핵 속으로 지도(direct)하는 것처럼, 본원의 접합체를 지도하는 기능을 한다. NLS는 예를 들어, NLS의 아미노- 또는 카르복시-말단이 상기 기술된 펩타이드를 포함하거나 또는 이로 구성되는 서열으로 확장될 수 있는 것처럼, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체의 부분이 될 수 있다. 또한 NLS는 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티에 결합하는 위치와 다른 위치에 커플링될 수 있다. NLS 서열은 당업계에 알려져 있다. 전형적으로, NLS 신호는 예를 들어, (K)KKR(K), (K)KRS(K), (K)(S)RK(R)(K)로 구성되거나 이를 포함하는 NLS 처럼, 양으로 하전된(positively charged) 라이신 및/또는 아르기닌의 (몇 개의) 짧은 서열로 구성되거나 이를 포함한다. 알려진 NLS는 PKKKRKV, GKKRSKV, KSRKRKL이다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 서열 번호: 69-83으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 NLS와 결합한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체는 비-바이러스(non-viral) 유전자 전달 또는 비-바이러스 유전자 치료법의 도구로써 또한 사용될 수 있다. 접합체로서, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 유전자 작제물을 세포, 특히 근육 세포에 표적시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 유전자 작제물은 효소 대체 치료법에서 효소의 생산을 허용하거나 또는 유전자 작제물은 예를 들어, 인자 VIII(Factor VIII), 인자 IX(Factor IX), 인자 VII(Factor VII), 빌리루빈 UDP(bilirubin UDP), 글루쿠로노실전이효소(glucuronosyltransferase), 알파-글루코시다아제와 같은 모든 리소좀축적병 단백질, 또는 특히 알두라자임(Aldurazyme)®, 세레자임(Cerezyme)®, 파브라자임(Fabrazyme)® 또는 마이오자임(Myozyme)®과 같은 치료적 단백질의 생산을 허용한다.
본 발명의 한 구현예는 바이러스 또는 바이러스 입자(viral particle)를 세포로 표적화하는 것이다. 본 발명에 따른 접합체에서 바이러스 또는 바이러스 입자는 생물학적 활성 모이어티이다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는, 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 바이러스 또는 바이러스 입자의 외 표면(outer surface)에 발현되는, 바이러스의 게놈 내의 펩타이드 또는 펩타이드 모방체의 DNA/RNA 서열을 포함함으로써 바이러스 생물학적 활성 모이어티에 연결된다. 이러한 발현 관련을 유발하는 재조합 방법론은 당업자에게 잘 알려져 있다. 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 따라서 바이러스 또는 바이러스 입자를 특이적 세포/조직으로 표적화한다. 이는 표적화된 백신, 유전자 치료법, 유전자 대체 또는 바이러스 엑손 스킵핑 작제물을 위한 특정 관심에 관한 것이다(AAV vectors expressing antisense sequences fused to either U1 or U7 small nuclear RNA; Denti et al., 2006, Hum. Gene Ther. 17, 565-574).
본 발명에 따른 바람직한 펩타이드는 사이클릭 펩타이드이다. 이와 같이, 바람직한 구현예는, 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 사이클릭인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 사이클릭 펩타이드는 펩타이드의 주쇄 원자에 의해 형성된 사이클을 포함하는 펩타이드이다. 이러한 사이클은, 사이클이 열두 개 이상의 원자로 구성되는 사이클인, 매크로사이클(macrocycle)일 수 있다. 사이클은 바람직하게는, 본원에서 폐쇄 결합(closing bond)로 지칭되는, 결합으로 폐쇄(closed)된다. 바람직한 폐쇄 결합은 공유 결합이다. 사이클릭 펩타이드는 선형 펩타이드보다 더 안정할 수 있다. 선형 펩타이드와 비교하여, 사이클릭 펩타이드는 종종 더 적은 회전이성질체(rotamer)를 가진다.
폐쇄 결합은 본원에서 인접(flanking) 모이어티로 지칭되는 두 모이어티 사이에서 형성된다. 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드는, 인접 모이어티가 폐쇄 결합을 형성하기 위해 세트로 쌍을 이루기 때문에, 짝수 개의 인접 모이어티를 포함한다. 인접 모이어티와 관한 언급이 있을 때, 언급이 두 인접 모이어티의 매칭(matching) 세트에 관한 것인지, 또는 세트의 부분일 필요가 없는 개별 인접 모이어티에 관한 것인지는 맥락이 명확하게 할 것이다. 인접 모이어티의 세트 내에서, 개별 인접 모이어티는 아미노산 잔기 또는 다른 모이어티를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 인접 모이어티는 개별적으로 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성된다. 더 바람직하게는, 인접 모이어티는 개별적으로 하나의 아미노산 잔기를 포함한다. 비-제한적 예로서, 이는 시스테인과 같은 자연의 아미노산, 이의 ε-아민이 변형된 라이신과 같은 유도된 아미노산, 또는 알릴글리신(allylglycine)과 같은 비-자연의 아미노산일 수 있다.
폐쇄 결합은 표적화 서열(서열 번호: 1-63, 바람직하게는 서열 번호: 24 또는 25)에 인접한 두 인접 모이어티를 연결한다. 이와 같이, 본 발명은, 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 인접 모이어티를 포함하고, 상기 인접 모이어티가 표적화 서열과 인접한 아미노산 잔기 또는 다른 모이어티를 포함하거나 이로 구성되며, 상기 인접 모이어티가 서로 결합을 형성하는, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 바람직하게는, 이 결합은 공유 결합이다. 더 바람직하게는, 본 발명은, 사이클릭 펩타이드 또는 사이클릭 펩타이드 모방체가 인접 모이어티를 포함하고, 상기 인접 모이어티가 표적화 서열과 인접한 아미노산 잔기 또는 다른 모이어티를 포함하거나 이로 구성되고, 상기 인접 모이어티가 서로 결합을 형성하는, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 바람직하게는 이 결합은 공유 결합이다.
표적화 서열에 대해 이들 인접 모이어티의 위치는 달라질 수 있으며, 두 가지 경우에서 독립적으로, 말단 옆 또는 말단 옆이 아닐 수 있다; 예를 들어, 표적화 서열은 이황화물 브릿지 형성을 가능하게 하는 두 Cys 잔기에 의해 인접될 수 있으며; 이와 같은 Cys 잔기의 위치는 표적화 서열의 직접적인 옆(예를 들어, 아미노산 번호 X를 지칭하는 AaX와 함께 Cys-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Aa5-Aa6-Aa7-Cys; AaX 숫자 1 내지 7은 표적화 서열을 구성), 또는 펩타이드의 다른 위치(예를 들어, 랜덤 아미노산 숫자를 의미하는 RaX와 함께 Cys-Ra0-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Aa5-Aa6-Aa7-Ra8-Ra9-Ra10-Ra11-Cys; AaX 숫자 1 내지 7은 표적화 서열을 구성, RaX는 표적화 서열 및 인접 모이어티 사이의 링커 모이어티로 기능하는 아미노산 잔기)일 수 있다. 다른 아미노산 잔기 또는 화학 모이어티는 상기 예에서 두 개의 Cys 잔기를 치환할 수 있다.
또한 폐쇄 결합을 형성할 수 있는 다른 모이어티를 포함하는 상기 기술된 바와 같은 펩타이드가 본 발명에 포함된다. 이와 같은 모이어티의 예는 티올 및 말레이미드, 산 및 아민, 티올 및 α-할로아세틸(α-haloacetyl) 모이어티, 및 아자이드(azide) 및 알킨, 아자이드 및 긴장된(strained) 알킨, 알킨 및 테트라진(tetrazine), 알킨 및 니트론(nitrone), 테트라진 및 노보넨(norbornene) 또는 다른 긴장된 이중 또는 삼중 결합, 및 소위 '클릭(click)' 반응으로 당업자에게 알려진 다른 것과 같은 생물직교성(bioorthogonal) 반응에 관여할 수 있는 모이어티이다. 이러한 모이어티는 모이어티를 운반하는 비-자연의 아미노산의 사용, 또는 이러한 모이어티를 자연의 아미노산의 측쇄에 접합시키는 것을 통해 유도될 수 있다.
따라서, 이러한 고리화는 많은 형태를 가질 수 있으며, 이들 모두는 당업자에게 잘 알려져 있다. 비-제한적 예는 이황화물, 에스테르, 에테르, 카바마이트, 알킬아민, 아미드, 티오아실, 티오에스테르, 설폰, 설폭시드, 설폰아미드, 티오에테르(예컨대, 티올-말레이미드 커플링, PepScan으로부터의 CLIPS 테크놀로지, 네덜란드), 트리아졸(예컨대, 아자이드-알키닐 커플링), 알케닐(예컨대, 고리 폐쇄 복분해(metathesis))을 통한 고리화이다.
바람직한 인접 모이어티는 그들의 곁사슬을 통해 폐쇄 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 인접 모이어티가 이황화물 브릿지를 형성하는, 바람직하게는 인접 모이어티가 시스테인 잔기를 포함하거나 이로 구성되는, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
본 발명의 맥락에서, 두 개의 모이어티가 펩타이드에 포함되는 서열에 인접하는 경우, 두 개의 인접 모이어티는 상기 펩타이드에서 두 개의 잔기를 구성하고, 두 개중 하나의 잔기는 직전의 펩타이드와 같은 것 또는 상기 서열의 첫 번째 잔기 전과 다른 것, 또는 다시 말해서, 상기 서열과 관련하여 N-말단에 포함되며, 두 개중 다른 잔기는 직후의 펩타이드와 같은 것 또는 상기 서열의 마지막 잔기 후와 다른 것, 또는 다시 말해서, 상기 서열과 관련하여 C-말단에 포함된다. 바람직하게는, 인접 모이어티는 상기 서열으로부터 15 잔기 이하, 또는 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0 잔기 이하 만큼 분리되어 있다. 이는 인접 모이어티가 상기 서열에 인접하거나, 다시 말해서 두 개의 인접 모이어티 중 하나가 서열의 첫 번째 잔기 직전이고, 두 개의 인접 모이어티 중 다른 것이 서열의 마지막 잔기의 직후라는 것을 의미할 수 있다. 더 바람직하게는, 인접 모이어티는 상기 서열으로부터 4, 3, 2, 1, 또는 0 잔기 이하 만큼 분리되어 있다. 가장 바람직하게는, 인접 모이어티는 상기 서열에 인접하며, 그들이 상기 서열으로부터 0 잔기 만큼 분리되어 있다는 것을 의미한다. 맥락에서, 잔기가 6-아미노핵사노산(6-aminohexanoic acid, Ahx)과 같은 링커 모이어티에 의해 분리되어 있을 경우, 링커 모이어티는 그들 자체로 잔기로 해석될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 펩타이드에서, 인접 모이어티는 서열 번호: 1-63(바람직하게는 서열 번호: 24 또는 25)로 구성되는 그룹에서 선택되는 상기 서열로부터 4, 3, 2, 1, 또는 0 잔기 이하 만큼 분리되어 있고, 바람직하게는 인접 모이어티가 상기 서열에 인접한다. 그러므로 본 발명은 인접 모이어티가 표적화 서열으로부터 4, 3, 2, 1 또는 0 잔기만큼 분리되어 있는, 바람직하게는 인접 모이어티가 표적화 서열에 인접한, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 펩타이드 내에서, 폐쇄 결합은 이황화물 브릿지이다. 본 발명에 따른 펩타이드 내에서, 인접 모이어티는 바람직하게는 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 시스테인 또는 호모시스테인 잔기, 가장 바람직하게는 시스테인 잔기이다.
본 발명의 양태의 바람직한 구현예에서, 표적화 서열은 서열 번호: 1-25로 구성되는 그룹, 바람직하게는 서열 번호: 14-25로 구성되는 그룹, 더 바람직하게는 서열 번호: 24-25로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 접합체, 또는 본 발명에 따른 사용을 위한 접합체, 또는 본 발명에 따른 분자가 제공된다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 표적화 서열이 하기로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 제공된다:
LTLPWSK VKHKSLD FSHTYRV QLFPLFR TLQDQAT LLGHTNN IAWNKQG SLFKNSR RENTNHT QVRSNTT KTGHAHL TYSPTEV KYMSSHA LNSLFGS KDPRPAL RADFYTT WNEDHTW MQHSMRV
LPDAYHV SRFQLPQ LKSAGNN VSPSKSF YGTGNNY DPRTQPH
YETSKES
바람직하게는, 표적화 서열은 하기로 구성되는 그룹으로부터 선택된다:
FSHTYRV QLFPLFR TLQDQAT SLFKNSR RENTNHT QVRSNTT TYSPTEV LNSLFGS RADFYTT WNEDHTW MQHSMRV LLGHTNN
더 바람직하게는, 표적화 서열은 하기로 구성되는 그룹으로부터 선택된다:
LNSLFGS QLFPLFR
이 양태의 가장 바람직한 구현예에서,
(i) LNSLFGS인 표적화 서열을 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체의 접합체로서, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 (ii) 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티로부터 선택되는 모이어티에 연결되는 접합체가 제공된다. 바람직하게는, 상기 펩타이드는 사이클릭이고 인접 모이어티는 표적화 서열 LNSLFGS에 직접적으로 인접한 시스테인 잔기이며, 이황화물 브릿지를 형성한다.
이 양태의 가장 바람직한 다른 구현예에서,
(i) QLFPLFR인 표적화 서열을 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체의 접합체로서, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 (ii) 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티로부터 선택되는 모이어티에 연결되는 접합체가 제공된다. 바람직하게는, 상기 펩타이드는 사이클릭이고 인접 모이어티는 표적화 서열 QLFPLFR에 직접적으로 인접한 시스테인 잔기이며, 이황화물 브릿지를 형성한다.
용도
본 발명은 올리고뉴클레오티드, 유전자, 단백질, 제약(pharmaceuticals) 등과 같은 생물학적 활성 모이어티의 다양한 기관 또는 조직, 특히 근육 세포 및 심장으로의 표적용인 펩타이드 또는 펩타이드 모방체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 약제로서, 바람직하게는 생물학적 모이어티 또는 진단적 모이어티의 근육 세포로의 표적용인, 사용하기 위한 본원에 따른 펩타이드, 또는 본원에 따른 접합체에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 두 번째 양태는, 약제로서 사용하기 위한, 본원에 따른 펩타이드를 제공한다. 이와 같이, 본 발명은, 약제로서 사용하기 위한, 서열 번호: 1-63(바람직하게는 서열 번호: 24 또는 25)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 표적화 서열을 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이러한 펩타이드는 본 발명에 따른 접합체에 포함된다. 따라서, 본 발명의 두 번째 양태는, 약제로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 사용하기 위한 이러한 펩타이드는 본원에서 본 발명에 따른 사용하기 위한 펩타이드를 지칭한다. 사용하기 위한 이러한 접합체는 본원에서 본 발명에 따른 사용하기 위한 접합체를 지칭한다. 이 양태의 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티의 근육 세포로의 표적용인, 본 발명에 따른 사용하기 위한 펩타이드를 제공한다. 이 양태의 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 생물학적 활성 모이어티 또는 진단적 모이어티의 근육 세포로의 표적용인, 본 발명에 따른 사용하기 위한 접합체를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 사용하기 위한 접합체 또는 본 발명에 따른 사용하기 위한 펩타이드는 전신계로(예컨대, 정맥 내 또는 피하로) 또는 근육 내로(intramuscularly) 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서 약제는 심장 장애를 포함하는 근육-세포 연관 장애의 치료용이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 이 양태는, 약제가 심장 장애를 포함하는 근육-세포 연관 장애의 치료용인, 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 이 양태는, 약제가 심장 장애를 포함하는 근육-세포 연관 장애의 치료용인, 본 발명에 따른 사용하기 위한 펩타이드를 제공한다. 근육-세포 연관 장애는 근병증(myopathy), 근육퇴행위축(muscular dystrophy), 또는 근육 소모 질병(muscle wasting disease)을 포함한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 이 양태는, 약제가 근병증, 근육퇴행위축, 근육 소모 질병의 치료용인, 본 발명에 따른 사용하기 위한 접합체를 제공한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 이 양태는 약제가 근병증, 근육퇴행위축, 근육 소모 질병의 치료용인, 본 발명에 따른 사용하기 위한 펩타이드를 제공한다. 하나의 구현예에서, 약제는 마이오스타틴(myostatin)과 연관된 장애의 치료용이다. 마이오스타틴은 또한 자가면역(autoimmune) 질병, 대사 장애(metabolic disorders), 비만(obesity) 또는 2형 당뇨병(diabetes mellitus type II)과 연관되어 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 약제는 자가면역 질병, 대사 장애, 비만 또는 2형 당뇨병의 치료용이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 이 양태는, 약제가 자가면역 질병, 대사 장애, 비만 또는 2형 당뇨병의 치료용인, 본 발명에 따른 사용하기 위한 접합체를 제공한다. 추가의 구현예에서, 이 양태는, 약제가 자가면역 질병, 대사 장애, 비만 또는 2형 당뇨병의 치료용인, 본 발명에 따른 사용하기 위한 펩타이드를 제공한다. 하나의 다른 구현예에서, 약제는, 뒤센 근육퇴행위축(Duchenne muscular dystrophy), 베커 근육퇴행위축(Becker Muscular Dystrophy), 에머리-드레이푸스 근육퇴행위축(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 사지연결근육퇴행위축(Limb-girdle muscular dystrophy), 얼굴어깨위팔근육퇴행위축(Facioscapulohumeral muscular dystrophy), 1형 근육긴장퇴행위축 (myotonic dystrophy type 1), 2형 근육긴장퇴행위축(myotonic dystrophy type 2), 눈인두근육퇴행위축(Oculopharyngeal muscular dystrophy), 선천성근육퇴행위축(Congenital muscular dystrophy), 원위근육퇴행위축(Distal muscular dystrophy), 근위축측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis), 영아형 척수 근위축증(Infantile spinal muscular atrophy), (소아형(Juvenile)-, 중간형(Intermediate)- 및 성인형(Adult)-) 척수 근위축증, 척수연수근위축증(Spinal bulbar muscular atrophy), 피부근육염(Dermatomyositis), 다발근육염(Polymyositis), 봉입체근육염(Inclusion body myositis), 중증근육무력증(Myasthenia gravis), 람베르트-이튼 근무력증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome), 에머리-드레이푸스 근육퇴행위축, 선천근무력증후군(Congenital myasthenic syndrome), 갑상선기능항진증성근병증(Hyperthyroid myopathy), 갑상선기능저하근병증(Hypothyroid myopathy), 샤르코-마리-투스질병(Charcot-Marie-Tooth disease), 프리드리히 실조증(Friedreich's ataxia), 데제린-소타스질병(Dejerine-Sottas disease), 선천성근육긴장증(Myotonia congenita) (톰센(Thomsen's) 및 베커 질병 모두), 선천성이상근육긴장증(Paramyotonia congenita), 중심코어질병(Central core disease), 네말린근병증(Nemaline myopathy), 근세관성근병증(Myotubular myopathy) (중심핵근병증(Centronuclear myopathy)), 주기적 마비(Periodic paralysis) (저칼륨성(Hypokalemic) 및 고칼륨성(Hyperkalemic) 모두), 미토콘드리아 근병증(Mitochondrial myopathy) 및 카르니틴(carnitine) 및 하기 효소의 결손으로 인한 근육 질병으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 심장 장애를 포함하는 근육-세포 연관 장애 치료용이다; 인산화효소(Phosphorylase), 산성 말타아제(Acid Maltase) (폼페 질병(Pompe's disease)), 포스포프룩토키나아제(Phosphofructokinase), 탈분지효소(Debrancher enzyme) (또한 아밀로-1,6 글루코시다제(Amylo-1,6-glucosidase)로 알려짐); 포브 질병(Forbes disease)으로 알려진 글리코젠축적병(a glycogen storage disease), 카르니틴 팔미틸 트렌스퍼라아제(Carnitine palmityl transferase), 포스포글리세레이트 키나아제(Phosphoglycerate kinase), 포스포글리세레이트 뮤타제(Phosphoglycerate mutase), 젖산 탈수소효소(Lactate dehydrogenase) 및 마이오아데닐레이트 디아미나아제(Myoadenylate deaminase).
또한 본 발명에 의해 포함되는 것은 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 서열로 구성되거나 이를 포함하는 DNA 및 이의 상보적인 DNA 서열 및 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 서열로 구성되거나 이를 포함하는 DNA 서열의 RNA 전사체 및 이의 상보적인 RNA 서열이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 접합체 및 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 약제학적 조성물에 관련된다. 이러한 조성물은 본원에서 이전에 정의된 것과 같이 약제로서 사용될 수 있다.
일반적 정의
본원에서, '물질'은 순수한 분자, 다중의 다른 분자들의 복합체, 올리고머, 중합체, 폴리펩타이드, 단백질, 입자, 또는 이의 단편으로 해석되어야 한다.
본원에서 사용된 용어 "인접한"은 다른 물질이 인접한 물질 사이에 없다는 것을 의미한다. 예를 들어, 단백질에서 인접한 잔기는 직접적으로 다른 하나의 옆이다. 비-제한적 예: 아미노산 잔기가 특정 서열의 아미노산 서열에 인접한 것으로 언급될 때, 잔기는 상기 서열에 접촉하며 직접적으로 연결된다.
본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 펩타이드, 및 본 발명에 따른 분자는 그들의 분자 구조에서 간단한 변형을 가질 수 있다. 가능한 치환체가 여기에 기술된다:
비치환 알킬 그룹은 일반식 CnH2n+1를 가지며 선형이거나 분지될 수 있다. 비치환 알킬 그룹은 또한 사이클릭 모이어티를 함유할 수 있으며, 따라서 일반식 CnH2n-1을 수반(concomitant)한다. 선택적으로, 알킬 그룹은 본 명세서에 추가로 열거된 하나 이상의 치환기로 치환된다. 알킬 그룹의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 2-프로필, t-부틸, 1-헥실, 1-도데실 등을 포함한다.
알킬 그룹 다음으로, 가능한 치환기는 할로겐, 아미노 그룹, 옥소(oxo) 및 실릴(silyl) 그룹이고, 상기 실릴 그룹은 화학식(R2)3Si-로 표시될 수 있으며, 상기 R2는 C1-C12 알킬 그룹, C2-C12 알케닐 그룹, C2-C12 알키닐 그룹, C3-C12 사이클로알킬 그룹, C1-C12 알콕시 그룹, C2-C12 알케닐옥시 그룹, C2-C12 알키닐옥시 그룹 및 C3-C12 사이클로알킬옥시 그룹으로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, 상기 알킬 그룹, 알케닐 그룹, 알키닐 그룹, 사이클로알킬 그룹, 알콕시 그룹, 알케닐옥시 그룹, 알키닐옥시 그룹 및 사이클로알킬옥시 그룹은 선택적으로 치환되며, 알키닐 그룹, 알콕시 그룹, 사이클로알킬 그룹 및 사이클로알콕시 그룹은 O, N 및 S로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로-원자에 의하여 선택적으로 차단된다.
구조식 또는 화학물 이름이 당업자에게 키랄 중심을 갖는 것으로 이해될 때, 키랄성이 나타나지 않는 경우, 각 키랄 중심 각각은 라세미 혼합물(racemic mixture), 순수한 R 이성질체, 및 순수한 S 이성질체 세 가지 모두와 관련한 사항이다.
물질의 파라미터가 본 발명의 맥락에서 논의될 때마다, 달리 명시되지 않는 한, 파라미터는 결정되고, 측정되고, 또는 물리적 조건 하에 명백해지는 것으로 가정한다. 물리적 조건은 당업자에게 알려져 있으며, 수성 용매(aqueous solvent) 시스템, 대기압, 6-8사이의 pH-값, 실온부터 약 37℃의 온도 범위(약 20℃ 부터 약 40℃), 및 완충 염 또는 다른 요소의 적합한 농도를 포함한다. 전하는 종종 평형과 연관된 것으로 이해된다. 전하를 운반하거나 가지는 것으로 언급된 모이어티는 그것이 이러한 전하를 가지지 않거나 운반하지 않는 것보다 이러한 전하를 가지거나 운반하는 상태로 더 자주 발견될 것이다. 이와 같이, 본 명세서에서 하전된 것으로 나타나는 원자는 특이적 조건 하에서 비-하전될 수 있으며, 중성 모이어티는 특이적 조건 하에서 하전될 수으며, 이는 당업자에게 이해된다.
본 발명의 맥락에서, 평가되는 파라미터의 감소 또는 증가는 그 파라미터에 대응되는 적어도 5%의 값의 변화를 의미한다. 더 바람직하게는, 값의 감소 또는 증가는 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 90%, 또는 100%의 변화를 의미한다. 후자의 경우, 파라미터와 연관된 검출가능한 값이 없는 경우가 있을 수 있다.
이 문서에 기술된 약제로서의 물질의 사용은 약제의 제조에서 상기 물질의 사용으로 이해될 수 있다. 유사하게, 물질이 치료용 또는 약제로서 사용될 때마다, 이것은 치료용 약제의 제조를 위하여 또한 사용될 수 있다. 치료용 물질은 치료 방법에 적합하다. 이러한 방법은 물질을 대상(subject)에게 투여하는 것을 포함하며, 바람직하게는 이러한 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 유효량의 물질을 투여하는 것을 포함한다. 대상은 인간 또는 비-인간일 수 있으며, 바람직한 대상은 포유류이다. 명세서 내에서, 발명의 다른 양태는 여러 구현예의 형식으로 더 자세하게 정의된다. 그렇게 정의된 구현예는 명확히 반대로 나타나지 않는 한 임의의 다른 구현예 또는 구현예들과 결합될 수 있다. 특히, 바람직한 것으로 또는 유리한 것으로 나타난 임의의 특징은 바람직한 것으로 또는 유리한 것으로 나타난 임의의 특징 또는 특징들과 결합될 수 있다.
이 문서 및 이의 청구항에서, 동사 "포함하는" 및 이의 활용은 단어 뒤의 항목이 포함되는 것을 의미하기 위해 비-제한된 의미로 사용되지만, 특별히 언급되지 않은 항목이 제외되는 것은 아니다. 추가로, 동사 "구성되는"은 "본질적으로 구성되는"으로 대체될 수 있으며, "본질적으로 구성되는"은 본원에서 정의된 산물 또는 조합물 또는 조성물이 특이적으로 확인된 하나 이상의 추가적인 요소(들)를 포함하는 것을 의미하며, 상기 추가적인 요소(들)는 발명의 독특한 특성을 변경시키지 않는다. 추가로, 부정 관사 "하나"("a" 또는 "an")에 의한 하나의 요소에 대한 언급은, 맥락이 명확하게 하나 및 오직 하나의 효소가 있어여 한다고 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재하는 가능성을 제외하지는 않는다. 부정 관사 "하나"("a" 또는 "an")는 따라서 "적어도 하나"를 의미한다. 달리 정의되지 않는 한, 기술적 및 과학적 용어를 포함하는, 본 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 추가 지침에 의해, 용어 정의가 본 발명의 교시를 더 잘 이해하기 위해 포함된다. 단어 "약" 또는 "대략"이 숫자 값(예컨대, 약 10)과 연관되어 사용될 때, 바람직하게는 그 값은 주어진 값(10의) 0.1% 더 많거나 작은 값일 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 하기의 실시예는 단지 예시적인 목적을 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 의도는 아니다.
도 1 - 파지 디스플레이 선별 실험 및 후보(candidate) 펩타이드 확인의 도식적인 개요.
도 2 - 서열 번호: 14-25 중 하나를 포함하는 형광 표지된 단백질의 시험관내 평가. 2.25μM의 FITC-표지된 사이클릭 펩타이드와 함께 3시간 동안 배양하고, 핵을 염색하기 위한 DAPI를 함유하는 봉입제(mounting media)에 매몰된(imbedded), 인간 대조군 근관(myotube) 및 심근세포(cardiomyocytes)의 대표적인 현미경 사진. ID##은 서열 번호:##을 지칭하며, 그러므로 예를 들어, ID14는 서열 번호: 14를 지칭한다.
도 3 - 형광 표지된 단백질의 시험관내 평가. 서열 번호: 25 또는 서열 번호: 25(각각 ID24 또는 ID25로 표시됨)를 포함하는 사이클릭 펩타이드를 2.25μM의 투여량으로 배양하고, 슬라이드를 봉입제에 매몰시키고(왼쪽 패널에는 DAPI 함유), 현미경으로 분석하였다. A) 1또는 3시간 동안의 인간 대조군 근세포 B) 3시간 동안의 인간 심근세포 C) 인간 대조군 근관 또는 심근세포와 10분 동안 배양된 서열 번호: 25를 포함하는 사이클릭 펩타이드 D) 인간 대조 근세포와 3시간 동안의 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 25를 포함하는 선형 펩타이드. 대표 사진을 나타냈다.
도 4 - 펩타이드-AON-접합의 시험관내 평가. 서열 번호: 25를 포함하는 사이클릭 펩타이드를 사이클릭 펩타이드의 접합이 AON의 엑손 스킵핑 이용가능성에 영향력을 가지는지 평가하기 위하여 인간 디스트로핀 엑손 45(h45AON) 표적화 AON에 접합하였다. 접합체는 ID25-h45AON로 지칭된다. 막대는 평균±SD를 표시한다. 결과는, 인간 대조군 근관을 ID25-h45AON(2μM)와 임의의 형질감염 시약 없이 96시간 동안 배양한, 2회의 독립적인 이중 실험의 평균을 표시한다.
도 5 - 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 25를 포함하는 사이클릭 펩타이드의 쥐 디스트로핀 엑손 23 표적화 AON(23AON)에의 접합의 생체내 평가. 접합체는 각각 ID24-23AON 및 ID25-23AON로 지칭된다. 4 주령의 mdx 마우스(그룹 당 4-5)에 주 당 4회씩 피하로 50mg/kg의 23AON, 같은 몰의(equimolar) ID24-23AON, ID25-23AON, 또는 식염수를 8주간 투여하였다. 마지막 주입으로부터 1 주 후 관심 조직을 분리하였다. 막대는 평균±SD를 표시한다. A) RNA를 분리하고 엑손 스킵핑 수준을 단일-RT-PCR에 의해 평가하고 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)에 의해 반-정량적(semi- quantitatively)으로 결정하였다. B) 디스트로핀 단백질 수준을 웨스턴 블롯(wester blot)을 통해 결정하였다. C) 첫 번째 주입 이후, 혈장 내의 AON 수준을 결정하기 위해, 혈액 샘플을 여러 시점 및 희생 시점에서 채취하였다. D) 조직 내의 AON 수준을 결정하기 위해 혼성화-연결 분석(hybridization-ligation assay)을 사용하였다. 유의한 P<0.05에 대한 사후(post-hoc) 테스트(본페로니(Bonferroni))를 사용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA).G = 장딴지근(Gastrocnemius), Q = 대퇴사두근(Quadriceps), Ti = 전경골근(Tibialis Anterior), Tr = 삼두근(Triceps), H = 심장(Heart), D = 횡격막(Diaphragm), L = 간(Liver), K = 신장(Kidney).
도 6 - 안정성 평가; 마지막 주입으로부터 한 주 후, mdx 마우스에서 혈액을 채취하고 안정성 마커를 평가하였다. 막대는 평균±SD를 표시한다. 모든 마커는 mdx 마우스에서 정상 범위였다. A) HB = 헤모글로빈(hemoglobin), B) 오줌(urea), C) ALP = 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), D) GPT = 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제(glutamate pyruvate transaminase), E) GOT = 글루타민산 옥살로초산 트란스아미나제(glutamic oxaloacetic transaminase), F) CK = 크레아틴 키나아제(creatine kinase).
실시예
일반적인 세포 배양
모든 세포는 37℃ 및 5% CO2의 배양기(incubator) 안에서 배양했다. 인간 대조 근아세포(myoblasts)(파지 디스플레이 바이오패닝(biopanning)에 사용하기 위한, 7304-1 세포 (Zhu et al., 2007))는, 세포 배양을 위한 정제된 소피부콜라겐(bovine dermal collagen)으로 코팅된 플라스크(Nutacon B.V. 네덜란드)에서, 글루타맥스-I(GlutaMax-I), 20% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)(모두 Gibco-BRL, 네덜란드)이 첨가된 넛믹스 F-10(NutMix F-10)(Ham's) 배지에서 성장시켰다. 세포를 콜라겐 코팅된 페트리-접시에 플레이팅(plating)하고 분화(differentiation) 배지(2% FBS, 1% P/S, 2% 글루타맥스 및 1% 글루코스가 포함된 둘베코 배지(Dulbecco's medium)(페놀레드 제외)(모두 Gibco-BRL, 네덜란드))로 바꾸기 전 90% 합류(confluence)될 때까지 성장시켰다. 세포를 7-14일 동안 분화하도록 허용하였다.
인간 대조 근아세포(Km155.c25 cells, (Zhu et al., 2007))는, 코팅되지 않은 플라스크에서, 추가의 15% FBS(Gibco, 네덜란드) 및 50μg/ml 젠타마이신(gentamicin) (PAA Laboratories)이 첨가된 골격근세포 성장 배지((Promocell, C-23160))에서 70%-80% 합류에 도달하기 전까지 성장하였다. 세포는 0.5% 젤라틴 코팅된 유리 슬라이드(Sigma Aldrich, 네덜란드)와 함께 6 웰(well) 플레이트에, 웰 당 1x105 세포의 밀도로, 분화 48시간 전에 플레이팅되었다. 90% 합류에 도달하면, 배지를 분화 배지(2% FBS, 50μg/ml 젠타마이신, 2% 글루타맥스 및 1% 글루코스가 포함된 둘베코 배지(Dulbecco's medium)(페놀레드 제외)(모두 Gibco-BRL, 네덜란드))로 바꿨다. 세포를 3-5일 동안 분화하도록 허용하였다.
무한증식된(immortalized) 인간 심근세포(응용 생물학적 재료, 캐나다)는 콜라겐 코팅된 플라스크에서, 10% FBS 및 1% P/S 첨가된 프리그로우 I(Prigrow I) 배지에서 성장하였다. 세포는 6 웰 플레이트 안의 콜라겐 코팅된 유리 슬라이드에 플레이팅되고 실험 전 합류 될때까지 성장하였다.
실시예 1
파지 디스플레이 선별 실험 및 후보(candidate) 단백질 확인의 도식적인 개요(도 1).
시험관내 바이오패닝(Biopanning)
시험관내 바이오패닝은 't Hoen et al. ('t Hoen et al., 2012)에 이전에 기술된 것과 같은 방식으로 수행되었다. 분화된 인간 대조 근아세포를 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS))로 3회 세척하고 0.1% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 첨가된 DMEM과 함께, 37℃, 5% CO2에서 한 시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 Ph.D.-C7CTM 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리 키트(New England Biolabs (NEB), Beverly, Maryland)로부터의 2x1011 개의 파지와 함께 3ml DMEM 배지에서, 37℃에서 1분당 70 회전의 진탕(shaking)과 동시에 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 0.1% BSA를 함유하는 5ml의 얼음 냉각된 DMEM으로, 5분간 배양하는 것을 통해 6회 부드럽게 세척하였다. 그 뒤에, 세포-표면에 결합한 파지를 용출시키기 위하여 세포를 얼음에서 3ml의 0.1M HCl (pH 2.2)와 함께 10분간 배양하고 0.6ml의 0.5M Tris을 첨가하여 중화하였다. 세포-연관된 파지를 회수하기 위하여, 세포를 3ml의 30mM Tris.HCl, 1mM EDTA, pH 8, 얼음에서 1 시간 동안 용해시켰다. 각 절편으로부터의 파지를 제조업자의 지시(NEB)에 따라 적정하고 증폭하였다.
생체내 바이오패닝
총 3 마리의 mdx 마우스에 첫 라운드의 시험관내 세포-표면 결합 파지, 시험관내 세포-연관 파지(즉, 두 번째 생체내 선별 라운드)와 같은, 또는 천연 Ph.D.-C7CTM 라이브러리(즉, 첫 번째 생체내 선별 라운드)의 2x1011 파지를 정맥 내(IV)로 주사하였다. 파지를 한 시간 동안 순환시킨 후 마우스를 관류(perfused)시켰다. 시험관내 선별으로부터의 파지가 주사된 마우스로부터 좌우 대퇴사두근(quadriceps muscles), 심장 및 간을 분리했다. 천연 라이브러리로 주사된 마우스로부터 장딴지근 및 대퇴사두근, 심장, 간 및 신장을 분리하였다. 조직을 제조업자의 지시(Roche Diagnostics)에 따라 MagNalyzer를 사용하여 TBS 완충액 내에서 균질화(homogenizing)시켰다. 파지를 제조업자의 지시(NEB)에 따라 적정하고 증폭시켰다(여기에서 농축된 파지 라이브러리로 지칭됨).
DNA 단리(isolation) 및 차세대 서열분석(Next Generation Sequencingd)
총 파지 DNA는 모든 농축된 파지 라이브러리로부터, 단일 라운드의 박테리아 증폭 이후의 천연의 비선별된 라이브러리 및 천연의 라이브러리로부터 단리되었다. 각 농축된 파지 라이브러리로부터, 2x1011 파지 입자를 1.5 ml 튜브 내의 500μl LB 성장 배지에 첨가하였다. 파지를 실온에서 200μl PEG 8000/NaCl로 3-4시간 동안 침전(precipitated)시켰다. 파지를 펠릿화(pelleted)하였고 DNA를 제조업자의 지시에 따라 분리하였다. 최종 펠릿(파지 DNA)을 milliQ 수용액에 용해시키고 DNA 농도를 Nanodrop (Thermo scientific)으로 결정하였다. 파지 DNA를 하기와 같은 프라이머를 사용한 PCR을 통해 증폭시켰다(*은 포스포로티오에이트 결합임):
전방향(Forward): AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT TCC TTT AGT GGT ACC TTT CTA TTC TC*A (서열 번호: 64)
역방향(Reverse): CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG XXX XXX XXX ATG GGA TTT TGC TAA ACA ACT TT*C (서열 번호: 65)
파지 DNA를 증폭하는데 사용된 PCR 프라이머는 모든 농축된 파지 라이브러리에서 27 뉴클레오티드 길이의 미지의 삽입 서열(두 개의 시스테인 포함), 일루미나(Illumina) 흐름 세포(flow cell)에 결합하기 위해 필수적인 어댑터(adapter) 및 독특한 바코드(밑줄 친)를 인식하는 서브서열을 함유한다. 적용된 PCR 프로토콜은 하기와 같다: 1ng 의 파지 DNA를 2.625U 고충실도(high fidelity) Taq 중합효소(Roche Diagnostics, The Netherlands), 15mM MgCl2를 함유하는 1x 고충실도 PCR 완충액 내의 20pM의 프라이머와 함께 배양하고, 각각 94℃에서 30초, 67℃에서 30초, 72℃에서 30초 배양하는 것으로 구성되는 20 사이클로 증폭시켰다. PCR은 PCR-유도된 서열 편향(PCR-induced sequence biases)을 완화시키기 위해 지수 증식기(exponential phase)에 중단하였다. 최종 PCR 산물을 Qiaquick PCR 정제 키트(Qiagen, Valencia, CA)로 정제하였다. PCR 산물의 정확한 길이 뿐만 아니라 농도를 Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 분석법으로 확인하였다. 농축된 파지 라이브러리로부터의 모든 PCR 산물을 단일 레인에서 합쳤다. 천연의 비선별된 라이브러리로부터의 파지 단편(증폭된 또는 되지 않은)은 일루미나 흐름 세포의 다른 레인에서 합쳐졌다. 두 풀 모두 제조업자(Illumina, San Diego, CA)의 설명서에 따라 클러스터 스테이션에서 고체상 증폭하였다. 미지의 삽입 서열 (ACA CTT CCT TTA GTG GTA CCT TTC TAT TCT CAC TC * T - 서열 번호: 66)의 첫 번째 위치에서 정확하게 시작된 맞춤 서열분석 프라이머를 사용하여 최대 50 사이클의 단일 종단 서열분석(single end sequencing)을 수행하였다. 서열분석은 v3 플로우 셀 및 시약(Illumina, San Diego, CA)을 사용하여 Illumina HiSeq 2000으로 수행되었다.
차세대 서열분석 분석
Illumina BCL 파일에서 fastq 파일을 추출하고 개별 샘플 바코드를 기반으로 데이터를 분할하는 데 Illumina CASAVA 1.8.2 소프트웨어를 사용하였다. 추가 분석을 위하여, 하기의 기준을 충족하지 않으면 필터링하였다: 서열은 (NNK)7에 이어 GCT TGT로 시작하여 TGC GGT GGA GGT로 끝나야 하며, N은 임의의 뉴클레오티드이고 K는 G 또는 T이다. 그 후, 서열을 통상의 아미노산 코돈표(codon table)를 사용한 맞춤형 펄 스크립트(perl script)를 통해 아미노산 서열로 번역하였다. 정지 코돈 TAG가 발생하면 제조업자의 지시(NEB)에 따라 CAG 코돈(아미노산 글루타민)으로 바꿨다. 적용 범위에 대한 개요를 표 2 및 도 1에 나타냈다. 모든 서열분석된 파지 라이브러리 데이터를 라이브러리의 카운트 수에 대한 제곱근 변환, 카운트 데이터의 분산을 안정화하기 위해 일반적으로 적용되는 데이터 변환으로 정규화하였다('t Hoen et al., 2008a). 그 후에, 기생 서열은 제외하였다. 기생 서열을 천연의 증폭된 라이브러리의 빈도 카운트에서 증폭되지 않은 천연의 라이브러리의 빈도 카운트를 뺀 것이 2보다 큰 서열로 정의하였다. 다음으로, 2개의 분리된 분석을 수행하였다. 첫째, 간 및 신장에서 빈도 카운트가 2보다 높은 서열을 농축된 골격근 및 심장근 라이브러리에서 제거하였다. 골격근 및 심장근 라이브러리의 서열은 라이브러리당, 빈도 카운트에 따라 순위가 매겨졌으며, 흥미로운 후보를 2 개의 그룹, 즉 '골격근' 및 '심장근'으로 나누었다. 둘째, 간과 신장에 대한 역치 값은 무시하고 골격근 및 심장근 라이브러리를 빈도 카운트를 기준으로 정렬하였다. 골격근 또는 심장근과 비교하여 간 및 신장에서의 빈도가 높은 펩타이드 서열을 제거하였다.
[표 2] 파지 서열분석 범위의 분석
실시예 2: 형광 표지된 사이클릭 펩타이드의 시험관내 평가
형광 표지된 펩타이드를 플루오레신이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)를 사용하여 표지하였고 Pepscan (Lelystad, 네덜란드)에서 수득하였다. FITC-표지를 펩타이드의 N-말단에 첨가된 Ahx(6-아미노헥사노산) 스페이서에 부착시키고, C-말단 부분을 아미드화시키고, 펩타이드를 이황화물 고리화에 의해 원형으로 만들었다. 본 발명에 따른 펩타이드는, 인접 모이어티가 서열 번호: 14-25 표적화 서열에 직접적으로 인접한, 시스테인 인접 모이어티를 갖는다.
인간 대조군 근관 및 초기 인간 심근세포를 PBS로 2회 세척하고 2.25μM의 FITC-표지된 펩타이드와 함께 무 혈청 배지, 37℃ 및 5% CO2 에서 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 차가운 메탄올(-20℃)로 5분(인간 대조군 근관) 또는 10분(인간 심근세포)동안 고정시켰다. 그 후, 유리 슬라이드를 짧게 공기 건조하고, 4',6-디아미노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 봉입제(Vector laboratories)로 벡타쉴드 하드 세팅(Vectashield hard set)된 현미경 슬라이드에 박았다. 30분 건조 후, 슬라이드를 CCD 카메라(Leica DFC 360 FX)를 사용한 형광 현미경(Leica DM5500 B)으로 분석하였다. 대표 사진을 나타냈다. 세포에서 가장 밝은 형광은 서열 번호: 24 및 서열 번호: 25를 포함하는 펩타이드에서 나타난다(도 2).
서열 번호: 24 또는 서열 번호: 25를 포함하는 FITC-표지된 펩타이드를 2.25μM의 투여량에서 배양하고, 슬라이드를 DAPI 함유 봉입제에 매몰하고 CCD 카메라를 사용하는 Leica 현미경으로 분석하였다(Leica DFC 360 FX); 1 또는 3시간 배양한 인간 대조군 근관(도 3a) 및 3시간 동안 배양한 인간 심근세포(도 3b). 결과는 양 세포주에 대해 배양 1시간 및 3시간일 때 세포 및 핵에서의 명확한 형광을 나타낸다. 서열 번호: 25를 포함하는 펩타이드 또한 인간 대조군 근관 또는 심근세포와 10분 동안 배양되었으며(도 3c) 이미 두 세포주 모두에 대해 10분 후에 양성 형광이 나타났다.
실시예 3: 고리화의 효과
Cys 잔기가 Ala 잔기로 치환된, 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 25를 포함하는 선형 버전의 펩타이드를 상기 기술한 바와 같이 표지하고 인간 대조군 근관과 함께 3시간 동안 배양하였다(도 3d). 그들은 형광을 나타내지 않았다.
실시예 4: 안티센스 올리고뉴클레오티드(AON)에의 펩타이드의 접합
5'-카르복실화 링커 포스포로아미다이트(phosphoramidite)는 Link Technologies (Bellshill, UK)에서 구입하였다. 모든 용매 및 시약은 Sigma Aldrich (Zwijndrecht, The Netherlands) 또는 Acros (Geel, Belgium)에서 수득되었으며 다르게 표시되지 않는 한 수령한 대로 사용하였다. 관측된 분자량을 기준 표준 값에 대해 보정하였다. 사이클릭 펩타이드는 PepScan (Lelystad, The Netherlands) 또는 Bachem (Bubendorf, Switzerland)에 의해 합성되었으며 아미데이트 C-말단 및 N-말단의 Ahx(6-아미노헥사노산)잔기를 함유한다.
AON 합성
5'-카르복실화 링커로 변형된 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 AON을, 마지막 커플링을 위해 Clt-보호된 아미다이트(15eq, 20분의 변형 커플링 조건) 및 Clt 그룹의 최종 제거를 사용한, 표준 포스포로아미다이트 화학 프로토콜을 통해 제조하였다. 갈라짐/보호기제거(Cleavage/deprotection) (0.1M NaOH in MeOH/H2O 4/1 (v/v), 18h, 55℃), NaCl 첨가 및 FPLC에 의한 탈염(desalting), 및 동결건조(lyophilization)로 원하는 AON을 생산하였다.
펩타이드-AON 접합체 합성
전형적인 작은 규모 절차: 인간 엑손 45 스킵을 위한 5'-카르복실화 변형된 AON h45 (서열 5'-UGCCGCUGCCCAAUGGGAUCCUG-3', 서열 번호: 67, 1μmol)를 DMSO (0.4mL) 내의 O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU)(2.3eq) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)(2eq)에 첨가하여 실온(RT)에서 전활성화하기 위해 3분간 진탕하였다. 인접 모이어티가 직접적으로 표적화 서열에 인접한 시스테인 잔기를 가지는 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드(0.1mL의 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 내의 2μmol 및 2.3eq N,N-디이소프로필에틸아민(DiPEA))를 첨가하고 RT에서 반응 혼합물을 진탕시켰다. 소량의 NaCl 첨가, FPLC에 의한 탈염 이후 역상(Reverse phase, RP)-HPLC 정제가 이루어졌으며 접합체를 MilliQ로부터 3회 증발시켜, h45와 서열 번호: 25를 포함하는 사이클릭 펩타이드의 접합체를 생산했다(ID25-h45로 지칭됨; 0.3μmol 생산 (31%) , MW (ESI) 계산치. 9211.9, 관측치. 9211.5). 생체내에서 평가된 두 접합체를, 쥐 엑손 23 스킵을 위한 AON m23(5'-GGCCAAACCUCGGCUUACCU-3', 서열 번호: 68 포함)을 사용한, 6개의 분리된 풀 합성으로부터 더 큰 규모로 비슷한 절차를 통해 수득하였다: ID24-m23 (38μmol (37%) 생산, MW (ESI) 계산치. 8005.8, 실측치. 8006.5) 및(ID25-m23 (38μmol (36%) 생산, MW (ESI) 계산치. 8189.1, 실측치. 8188.7)
실시예 5: 펩타이드-AON 접합체의 생체내 평가
사이클릭 펩타이드의 접합이 AON의 엑손 스킵핑 능력에 영향을 끼치는지 결정하기 위해 ID25-h45 접합체의 활성을 평가하고 인간 대조군 근관(2μM에서)과 함께 형질감염 시약 없이 96시간 동안 배양하였다(도 4). 결과는 2개의 독립적인 이중 실험의 평균을 나타내며 생체내 접합의 부정적인 효과가 없다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 체순환 투여 이후 펩타이드-AON 접합체의 평가
4 주령의 mdx 마우스(그룹 당 4-5)에 주 당 4회씩 피하로 50mg/kg의 m23, 몰당량의 ID24-m23, ID25-m23, 또는 식염수를 8주간 투여하였다. 마지막 주입으로부터 한 주 후 관심 조직을 분리하였다. RNA를 분리하고 엑손 스킵핑 수준을 단일-RT-PCR에 의해 평가하고(도 5a) 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)에 의해 반-정량적(semi- quantitatively)으로 결정하였다. 디스트로핀 단백질 수준을 웨스턴 블롯(wester blot)을 통해 결정하였다(도 5b). 첫 번째 주입 이후, 혈장 내의 AON 수준을 결정하기 위해, 혈액 샘플을 여러 시점 및 희생 시점에서 채취하였다(도 5c). 혼성화-연결 분석(hybridization-ligation assay)을 조직 내의 AON 수준을 결정하기 위해 사용하였다(도 5d). 막대는 평균±SD를 표시한다. 유의한 P<0.05에 대한 사후(post-hoc) 테스트(본페로니(Bonferroni))를 사용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA).G = 장딴지근(Gastrocnemius), Q = 대퇴사두근(Quadriceps), Ti = 전경골근(Tibialis Anterior), Tr = 삼두근(Triceps), H = 심장(Heart), D = 횡격막(Diaphragm), L = 간(Liver), K = 신장(Kidney).
두 펩타이드-m23 접합체 모두에서, 조직 수준은 향상되었다. 근육 손상의 마커인, 크레아틴 키나아제(CK)의 수준은 NT mdx 마우스 대 펩타이드-AON 그룹 모두에서 감소된 것으로 나타났다(도 6f).
마지막 주입으로부터 1 주 후, 혈액을 채취하고 안정성 마커를 평가하였다(도 6, 막대는 평균±SD를 표시한다). 모든 마커는 mdx 마우스에서 정상 범위였다. HB - 헤모글로빈(hemoglobin)(도 6a); 오줌(urea)(도 6b); ALP = 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase)(도 6c); GPT = 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제(glutamate pyruvate transaminase)(도 6d); GOT = 글루타민산 옥살로아세틱 트랜스아미나제(glutamic oxaloacetic transaminase)(도 6e)
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Claims (15)

  1. (i) 서열 번호: 24 및 25로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 표적화 서열(targeting sequence)을 포함하는 펩타이드의 접합체(conjugate)로서, 상기 펩타이드가 사이클릭(cyclic)이고 최대 30개 아미노산 길이이며, 상기 펩타이드가 (ii) 생물학적 활성 모이어티(moiety)에 링커 모이어티를 통해 연결되고, 여기서
    상기 생물학적 모이어티가 하나 이상의 디스트로핀 엑손을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고,
    상기 링커 모이어티가 6-아미노헥사노산(6-aminohexanoic acid, Ahx), 베타-알라닌(bAla), 4-아미노뷰티르산(4-Aminobutyric acid, 4Abu), 3-아미노이소뷰티르산(3-aminoisobutyric acid, bAib), 스페르민(spermine), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리에틸렌글리콜, 및 폴리-L-라이신으로 구성된 군으로부터 선택되고,
    상기 접합체가 생물학적 활성 모이어티를 근육 세포로 표적화하는데 적합한 것인, 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 제1항에 따른 펩타이드와 생물학적 활성 모이어티의 융합(fusion) 단백질인, 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 펩타이드가 인접(flanking) 모이어티를 포함하되, 상기 인접 모이어티가 표적화 서열에 직접 인접하고 이황화물 브릿지(disulfide bridge)를 형성하는 시스테인 잔기를 포함하는, 접합체.
  4. 제3항에 있어서, 인접 모이어티가 표적화 서열으로부터 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개 잔기만큼 분리되어 있는, 접합체.
  5. 제4항에 있어서, 인접 모이어티가 표적화 서열에 인접한, 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 근육 세포-연관 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 근육 세포-연관 장애가 근병증 및 근육퇴행위축으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 약제(medicament)로서 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 생물학적 활성 모이어티를 근육 세포로 표적화하기 위한, 약제학적 조성물.
  9. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 정의된 펩타이드, 및
    (b) 상기 펩타이드를 생물학적 활성 모이어티에 연결하기 위한, 펩타이드가 아닌, 링커(linker) 모이어티를 포함하는 분자로서,
    상기 생물학적 모이어티가 하나 이상의 디스트로핀 엑손을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고,
    상기 링커 모이어티가 6-아미노헥사노산(Ahx), 베타-알라닌(bAla), 4-아미노뷰티르산(4Abu), 3-아미노이소뷰티르산(bAib), 스페르민, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌글리콜, 및 폴리-L-라이신으로 구성된 군으로부터 선택되고,
    상기 분자가 생물학적 활성 모이어티를 근육 세포로 표적화하는데 적합한 것인, 분자.
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KR1020197016928A 2016-11-16 2017-11-15 다양하게 선택된 기관 또는 조직을 표적화하기 위한 물질 KR102646799B1 (ko)

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