ES2674929T3 - Análogos oligonucleotídicos dirigidos a LMNA humana - Google Patents

Análogos oligonucleotídicos dirigidos a LMNA humana Download PDF

Info

Publication number
ES2674929T3
ES2674929T3 ES12805882.3T ES12805882T ES2674929T3 ES 2674929 T3 ES2674929 T3 ES 2674929T3 ES 12805882 T ES12805882 T ES 12805882T ES 2674929 T3 ES2674929 T3 ES 2674929T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
alkyl
case
oligonucleotide
independently
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12805882.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Ryszard Kole
Richard Keith Bestwick
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sarepta Therapeutics Inc
Original Assignee
Sarepta Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sarepta Therapeutics Inc filed Critical Sarepta Therapeutics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2674929T3 publication Critical patent/ES2674929T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Abstract

Un oligonucleótido de antisentido para reducir la expresión de ARNm de LMNA con corte y empalme anómalo, teniendo el oligonucleótido una estructura sustancialmente no cargada y estando compuesto de subunidades morfolino y uniones entre unidades que contienen fósforo que unen un nitrógeno de morfolino de una subunidad con un carbono 5'-exocíclico de una subunidad adyacente, que contiene 25-40 bases, y que comprende una secuencia de dirección que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 10, 11, 13, 14 y 16, en el que el oligonucleótido de antisentido se adhiere covalentemente a un péptido de penetración celular y resto conector, en el que el resto conector se selecciona de glicina, cisteína, prolina, ácido 6-aminohexanoico (Ahx), ß- alanina (B) y Ahx-B, y el péptido de penetración celular se selecciona de las SEQ ID NO: 39-54.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Análogos oligonucleotídicos dirigidos a LMNA humana
Antecedentes
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a compuestos de antisentido dirigidos a lamina A humana.
Descripción de la técnica relacionada
El síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS) es un trastorno genético infrecuente caracterizado por arteriesclerosis prematura y degeneración de las células del músculo liso vascular (SMC). El HGPS se manifiesta de forma muy destacable como envejecimiento prematuro en niños afectados. Los niños con HGPS tienen síntomas progresivos tales como retardo del crecimiento, alopecia, pérdida de grasa subcutánea y anomalías óseas. La esperanza de vida promedio es de 12 años, siendo la causa más común de muerte el infarto de miocardio o apoplejía.
La mayoría de los casos de HGPS están causados por una mutación puntual en el gen de la lamina A (LMNA), que provoca la generación de progerina, un mutante de corte y empalme truncado de lamina A. La mutación puntual es una sustitución silenciosa de novo (1824C>T, Gly608Gly) en el exón 11 del gen de la lamina A (LMNA). La sustitución activa un sitio donador de corte y empalme críptico, que da lugar a la producción de una proteína lamina A mutante negativa dominante con una eliminación interna de 50 aminoácidos. La proteína mutante, llamada progerina, se acumula en la membrana nuclear, causando vesiculación nuclear característica ((Scaffidi y Misteli 2005; Cao, Blair et al. 2011)).
Se sabe que el corte y empalme aberrante puede corregirse usando oligonucleótidos de fosforodiamidato morfolino (PMO), o más específicamente, oligonucleótidos de cambio de corte y empalme (SSO). Los SSO bloquean los sitios de corte y empalme aberrantes hibridando en o cerca de los sitios, evitando de ese modo el reconocimiento por la maquinaria celular de corte y empalme. Los SSO preferentes son resistentes a las nucleasas y la estructura bicatenaria resultante elimina la posibilidad de escisión del ARN por RNasa H. Se ha demostrado que los SSO reparan de forma eficaz el patrón de corte y empalme tanto in vitro como in vivo para talasemia y distrofia muscular de Duchenne. (Kinali, Arechavala-Gomeza et al. 2009; Svasti, Suwanmanee et al. 2009). Se ha demostrado que el corte y empalme aberrante de LMNA asociado con HGPS se reduce por corrección del evento de corte y empalme aberrante usando oligonucleótidos de antisentido modificados dirigidos al sitio de corte y empalme críptico activado tanto en cultivo celular (Scaffidi y Misteli 2005) y en un modelo animal oportuno (Osorio, Navarro et al. 2011).
Dada la función de LMNA en HGPS, se necesitan oligonucleótidos que modulen el corte y empalme del preARNm de LMNA para eliminar la expresión de progerina.
Fernando G. Osorio et al., "Splicing-Directed Therapy in a New Mouse Model of Human Accelerated Aging", Science Translational Medicine, American Association for the Advancement of Science, vol. 3, n.° 106, páginas 145-155 se refiere, en el contexto del síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS) a un tratamiento de antisentido basado en morfolino que evita el corte y empalme patógeno de Lmna, reduciendo la acumulación de progerina y sus defectos nucleares asociados.
El documento WO 2007/047913 A2 divulga compuestos, composiciones y métodos para modular la expresión de LMNA en una célula, tejido o animal.
Paola Scaffidi et al., "Reversal of the cellular phenotype in the premature aging disease Hutchinson-Gilford progeria syndrome", Nature Medicine, vol. 11, n.° 43, páginas 440-445 se refiere a la corrección del corte y empalme aberrante en el transcrito endógeno de lamina A en células HGPS.
Loren G. Fong et al., "Activating the synthesis of progerin, the mutant prelamin A in Hutchinson-Gilford progeria syndrome, with antisense oligonucleotides", Human Molecular Genetics, vol. 18, n.° 13, páginas 2462-2471 muestra que los oligonucleótidos de antisentido contra secuencias del exón 11 en dirección 3' desde el sitio donador de corte y empalme del exón 11 promueven un corte y empalme alternativo en fibroblastos tanto de tipo silvestre como HGPS, aumentando la síntesis de progerina.
Breve sumario
La presente invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un oligonucleótido de antisentido para reducir la expresión del ARNm de LMNA con corte y empalme anómalo, teniendo el oligonucleótido una estructura sustancialmente no
5
10
15
20
25
30
35
40
45
cargada y estando compuesto de subunidades morfolino y uniones entre unidades que contienen fósforo que unen un nitrógeno de morfolino de una subunidad con un carbono 5'-exocíclico de una subunidad adyacente, que contiene 25-40 bases, y
que comprende una secuencia de dirección que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 10, 11, 13, 14 y 16,
en el que el oligonucleótido de antisentido se adhiere covalentemente a un péptido de penetración celular y resto conector, en el que el resto conector se selecciona de glicina, cisteína, prolina, ácido 6-aminohexanoico (Ahx), p- alanina (B) y Ahx-B, y el péptido de penetración celular se selecciona de las SEQ ID NO: 39-54.
La presente invención también se refiere a un oligonucleótido de antisentido, en el que el oligonucleótido reduce la expresión del ARNm de LMNA con corte y empalme anómalo, comprendiendo el oligonucleótido una estructura, comprendiendo la estructura una secuencia de estructuras cíclicas de morfolino unidas por uniones entre subunidades, uniendo las uniones entre unidades un extremo 3' de una estructura cíclica de morfolino con un extremo 5' de una estructura cíclica de morfolino adyacente, en el que cada estructura cíclica de morfolino se une a un resto de emparejamiento de bases, de modo que el oligonucleótido puede unirse de una manera específica de secuencia a un ácido nucleico diana, que comprende una secuencia de dirección que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 10, 11, 13, 14 y 16, en el que las uniones entre subunidades tienen la siguiente estructura general (I):
imagen1
o una sal o isómero de la misma, y en el que cada una de las uniones (I) entre subunidades son independientemente unión (A) o unión (B):
en el que para la unión (A):
W es, en cada caso, independientemente S u O;
X es, en cada caso, independientemente -N(CH3)2, -NR1R2, -OR3 o;
imagen2
Y es, en cada caso, independientemente O o -NR2,
R1 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo;
R2 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o -LNR4R5R7;
R3 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6;
R4 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, metilo, -C(=NH)NH2, -Z-L-NHC(=NH)NH2 o - [C(O)CHR'NH]mH, donde Z es carbonilo (C(O)) o un enlace directo, R' es una cadena lateral de un aminoácido de origen natural o un homólogo de uno o dos carbonos del mismo, y m es de 1 a 6;
R5 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, metilo o un par de electrones;
R6 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo;
R7 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C6 o alcoxialquilo C1-C6;
L es un conector opcional de hasta 18 átomos de longitud que comprende grupos alquilo, alcoxi o alquilamino, o combinaciones de los mismos; y en el que para la unión (B):
W es, en cada caso, independientemente S u O;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
X es, en cada caso, independientemente -NR8R9 u -OR3; e Y es, en cada caso, independientemente O o -NR10, o Yy W son cada uno O,
R8 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C2-C12;
R9 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12, aralquilo C1-C12 o arilo;
R10 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12 o -LNr4R5R7;
en el que R8 y R9 pueden unirse para formar un heterociclo mono- o bicíclico de 5-18 miembros o R8, R9 o R3 pueden unirse con R10 para formar un heterociclo de 5-7 miembros, y en el que, cuando X es 4- piparazino, X tiene la siguiente estructura (III):
imagen3
en la que:
R11 es, en cada caso, independientemente alquilo C2-C12, aminoalquilo C1-C12, alquilcarbonilo C1-C12, arilo, heteroarilo o heterociclilo; y
R es, en cada caso, independientemente un par de electrones, hidrógeno o alquilo C1-C12; y
R12 es, en cada caso, independientemente, hidrógeno, alquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12, -NH2, -
13 14 13 14 15
NR R , -NR R R , alquilcarbonilo C1-C12, oxo, -CN, trifluorometilo, amidilo, amidinilo, amidinilalquilo, amidinilalquilcarbonil guanidinilo, guanidinilalquilo, guanidinilalquilcarbonilo, colato, desoxicolato, arilo, heteroarilo, heterociclo, -SR13 o alcoxi C1-C12, en la que R13, R14 y R15 son, en cada caso,
independientemente alquilo C1-C12;
en el que al menos una de las uniones entre subunidades es la unión (B), o en el que cada unión (B), si está presente, tiene la misma estructura en cada caso; y
en el que el oligonucleótido de antisentido se adhiere covalentemente a un péptido de penetración celular y resto conector, en el que el resto conector se selecciona de glicina, cisteína, prolina, ácido 6- aminohexanoico (Ahx), p-alanina (B) y Ahx-B, y el péptido de penetración celular se selecciona de las SEQ ID NO: 39-54. Se exponen realizaciones de la invención en las reivindicaciones dependientes y a continuación.
Dentro del contexto de la presente invención se divulgan composiciones que modulan el corte y empalme aberrante del preARNm de LMNA. Por ejemplo, dentro del contexto de la presente invención divulgada, se proporcionan oligonucleótidos de antisentido para su uso en la modulación del corte y empalmen aberrante de un preARNm de LMNA humana, estando compuestos los oligonucleótidos de subunidades morfolino y uniones entre unidades que contienen fósforo que unen un nitrógeno de morfolino de una subunidad con un carbono 5'-exocíclico de una subunidad adyacente, y:
(i) tienen una estructura resistente a nucleasa sustancialmente no cargada;
(ii) pueden captarse por células hospedadoras de mamífero;
(iii) contienen entre aproximadamente 12-40 bases nucleotídicas; y
(iv) tienen una secuencia de dirección de al menos aproximadamente 12 subunidades contiguas complementaria al exón 10, intrón 10, exón 11, o combinaciones de los mismos de un preARNm de LMNA humana.
En realizaciones más específicas, la secuencia de dirección del oligonucleótido es complementaria a bases en dirección 5' del sitio de corte y empalme críptico del exón 11 de un preARNm de LMNA humana. En otras realizaciones específicas, la secuencia de dirección es complementaria a bases en dirección 3' del sitio de corte y empalme críptico del exón 11 de un preARNm de LMNA humana. En otras realizaciones específicas más, la secuencia de dirección no solapa con el sitio de corte y empalme críptico del exón 11 del preARNm de LMNA humana.
En realizaciones adicionales, la secuencia de dirección en el oligonucleótido usado en los métodos de la invención no solapa con la mutación 1824C>T.
En otra realización específica, la base más 3' de la secuencia de dirección es complementaria a una base en el exón 11 de LMNA que está aproximadamente 1-30 bases en dirección 3' del sitio de corte y empalme críptico del exón 11 de un preARNm de LMNa humana.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En otra realización específica, la base más 3' de la secuencia de dirección es complementaria a una base en el exón 11 de LMNA que está aproximadamente 1-30 bases en dirección 3' del sitio de corte y empalme críptico del exón 11 de un preARNm de LMNa humana.
En otra realización específica más, la base más 3' de la secuencia de dirección es complementaria a una base en el exón 11 de LMNA que está aproximadamente 10-40 bases en dirección 5' del sitio de corte y empalme críptico del exón 11 de un preARNm de LMNA humana.
Dentro del contexto de la presente invención también se divulga en el presente documento que la base más 3' de la secuencia de dirección es complementaria a una base en el intrón 10 de LMNA que está aproximadamente 1-60 bases en dirección 5' del exón 11 de LMNA.
Dentro del contexto de la presente invención también se divulga en el presente documento que la base más 3' de la secuencia de dirección es complementaria a una base en el exón 10 de LMNA que está aproximadamente 1-30 bases en dirección 5' del intrón 10 de LMNA.
En otra realización específica más, la secuencia de dirección es complementaria a una región que solapa con la unión de corte y empalme de sitios donadores de corte y empalme (SD) o aceptadores de corte y empalme (SA) de los exones 10 y 11 del preARNm de LMNA, y es complementaria a una parte de una región exónica y una parte de una región intrónica del ARNm preprocesado.
La secuencia de dirección del oligonucleótido, en realizaciones incluso más específicas de la invención, es complementaria a al menos 12 bases contiguas de una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-34, o es al menos un 90 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-34, o comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-34, o consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-34.
La secuencia de dirección del oligonucleótido, en realizaciones incluso más específicas de la invención, es complementaria a al menos 12 bases contiguas de una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-7 o 14-16, o es al menos un 90 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-7 o 14-16, o comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-7 o 14-16, o consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-7 o 14-16.
La secuencia de dirección del oligonucleótido, en realizaciones incluso más específicas de la invención, es complementaria a al menos 12 bases contiguas de la SEQ ID NO: 4, o es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 4, o comprende la SEQ ID NO: 4, o consiste en la SEQ ID NO: 4.
La secuencia de dirección del oligonucleótido, en otras realizaciones más específicas de la invención, es complementaria a al menos 12 bases contiguas de la SEQ ID NO: 11, o es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 11, o comprende la SEQ ID NO: 11, o consiste en la SEQ ID NO: 11.
En otras realizaciones, el oligonucleótido es un oligonucleótido de fosforodiamidato morfolino (PMO), o un PMO que comprende una o más uniones entre subunidades que contienen piperazina (PMOplus), o un oligonucleótido PMO- X.
Las subunidades morfolino ejemplares, de acuerdo con determinadas realizaciones de la invención, se unen por uniones fosforodiamidato, de acuerdo con la siguiente estructura:
1
1 Z=P—X
1 Y,-
/ypj
1
en la que Z es S u O,
X = NR1R2 u OR6,
Y = O o NR7,
y cada una de dichas uniones se selecciona de:
(a) unión no cargada (a), en la que cada uno de R1, R2, R6, y R7 se selecciona independientemente de hidrógeno y alquilo inferior;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(b1) unión catiónica (b1), en la que X = NR1R2 e Y= O, y NR1R2 representa un grupo piperazino sustituido opcional, de modo que R1R2 = -CHRCHRN(R3)(R4)CHRCHR-, en el que cada R4 es H, CH3 o no existe, y
R3 se selecciona de H, alquilo inferior, C(=NH)NH2, Z-L-NHC(=NH)NH2, y [C(O)CHR'NH]mH, en el que cuando Z es carbonilo (C(O)) o un enlace directo, L es un conector opcional de hasta 18 átomos de longitud que tiene enlaces seleccionados de alquilo, alcoxi y alquilamino, R' es una cadena lateral de un aminoácido de origen natural o un homólogo de uno o dos carbonos del mismo, y m es de 1 a 6;
(b2) unión catiónica (b2), en la que X = NR1R2 e Y = O, R1 = H o CH3, y R2 = LNR3R4R5, en el que L, R3, y R4 se definen como anteriormente, y R5 es H, alquilo inferior o (alcoxi)alquilo inferior; y
(b3) unión catiónica (b3), en la que Y = NR7 y X = OR6, y R7 = lNr3R4R5, en el que L, R3, y R4 y R5 se definen como anteriormente, y R6 es H o alquilo inferior; y al menos una de dichas uniones se selecciona de uniones catiónicas (b1), (b2) y (b3).
En una realización más específica de la estructura anterior, cada uno de R1 y R2, en las uniones de tipo (a), es metilo.
En otra realización específica de la estructura anterior, al menos una unión es de tipo (b1), donde cada R es H, R4 es H, CH3, o un par de electrones, y R3 se selecciona de H, CH3, C(=NH)NH2, y C(O)-L-NHC(=NH)NH2.
En otra realización específica de la estructura anterior, al menos una unión es de tipo (b1), donde cada R es H, R4 es un par de electrones, y R3 se selecciona de C(=NH)NH2 y C(O)-L-NHC(=NH)NH2.
En otra realización específica más de la estructura anterior, al menos una unión es de tipo (b1), donde cada R es H, R4 es un par de electrones, y R3 se selecciona de C(=NH)NH2 y C(O)-L-NHC(=NH)NH2.
En otra realización específica más de la estructura anterior, R3 es C(O)-L-NHC(NH)NH2, y L es un hidrocarburo que tiene la estructura -(CH2)n-, donde n es de 1 a 12.
En otra realización específica de la estructura anterior, al menos una unión es de tipo (b1), donde cada R es H, y cada uno de R3 y R4 es independientemente H o CH3.
En otras realizaciones de la invención, el oligonucleótido de antisentido se adhiere covalentemente a un péptido de penetración celular, tal como un péptido rico en arginina. En una realización más específica, el péptido rico en arginina se adhiere en su extremo C al extremo 5' del oligonucleótido a través de un conector de uno o dos aminoácidos. Como alternativa, en otra realización, el péptido se adhiere en su extremo C al extremo 3' del oligonucleótido a través de un conector de uno o dos aminoácidos. En una realización preferente, el péptido de penetración celular se une al oligonucleótido a través de un aminoácido glicina.
En realizaciones adicionales de la invención, se proporciona un oligonucleótido que comprende una estructura, comprendiendo la estructura una secuencia de estructuras cíclicas de morfolino unidas por uniones entre subunidades, uniendo las uniones entre unidades un extremo 3' de una estructura cíclica de morfolino con un extremo 5' de una estructura cíclica de morfolino adyacente, en el que cada estructura cíclica de morfolino se une a un resto de emparejamiento de bases, de modo que el oligonucleótido puede unirse de una manera específica de secuencia a un ácido nucleico diana, que comprende una secuencia de dirección que es complementaria a al menos 12 bases de una secuencia expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-34, o que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-34, en el que las uniones entre subunidades tienen la siguiente estructura general (I):
W
II
imagen4
5’
(D
o una sal o isómero de la misma, y en el que cada una de las uniones (I) entre subunidades son independientemente unión (A) o unión (B):
en el que para la unión (A):
W es, en cada caso, independientemente S u O;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
X es, en cada caso, independientemente -N(CH3)2, -NR1R2, -OR3 o;
R6 R6
imagen5
(II)
Y es, en cada caso, independientemente O o -NR2,
R1 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo;
R2 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o -LNR4R5R7;
R3 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6;
R4 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C6, -C(=NH)NH2, -Z-L-NHC(=NH)NH2 o - [C(O)CHR'NH]mH, donde Z es carbonilo (C(O)) o un enlace directo, R' es una cadena lateral de un aminoácido de origen natural o un homólogo de uno o dos carbonos del mismo, y m es de 1 a 6;
R5 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, metilo o un par de electrones;
R6 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo;
R7 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C6 o alcoxialquilo C1-C6;
L es un conector opcional de hasta 18 átomos de longitud que comprende grupos alquilo, alcoxi o alquilamino, o combinaciones de los mismos; y
en el que para la unión (B):
W es, en cada caso, independientemente S u O;
X es, en cada caso, independientemente -NR8R9 u -OR3; e
Y es, en cada caso, independientemente O o -NR10,
R8 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C2-Ci2;
R9 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12, aralquilo C1-C12 o arilo;
R10 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12 o -lNr4R5R7;
en el que R y R pueden unirse para formar un heterociclo mono- o biciclico de 5-18 miembros o R , R o R pueden unirse con R10 para formar un heterociclo de 5-7 miembros, y en el que, cuando X es 4-piparazino, X tiene la siguiente estructura (III):
R12 R
\
R11
R12
(III)
en la que:
R11 es, en cada caso, independientemente alquilo C2-C12, aminoalquilo C1-C12, alquilcarbonilo C1-C12, arilo, heteroarilo o heterociclilo; y
R es, en cada caso, independientemente un par de electrones, hidrógeno o alquilo C1-C12; y R12 es, en cada caso, independientemente, hidrógeno, alquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12, -NH2, - NR13R14, -NR13R14R15, alquilcarbonilo C1-C12, oxo, -CN, trifluorometilo, amidilo, amidinilo, amidinilalquilo, amidinilalquilcarbonil guanidinilo, guanidinilalquilo, guanidinilalquilcarbonilo, colato, desoxicolato, arilo, heteroarilo, heterociclo, -SR13 o alcoxi C1-C12, en la que R13, R14 y R15 son, en cada caso, independientemente alquilo C1-C12; y en la que al menos una de las uniones es la unión (B).
En algunas realizaciones de la estructura anterior, al menos un 5 % de las uniones entre subunidades son uniones (B). En una realización relacionada, de un 10 % a un 50 % de las uniones entre subunidades son uniones (B). En otra realizaciones relacionada, cada unión (B) tiene la misma estructura en cada caso. En otra realización específica más de la estructura anterior, cada Y y cada W son O.
En el presente documento se divulga un oligonucleótido de antisentido que comprende una secuencia de dirección que es complementaria a una o más bases del exón 10 o el exón 11 en el gen de LMNA humana y que contiene al menos 12 bases contiguas complementarias a una secuencia expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-34.
imagen6
5
10
15
20
Realizaciones adicionales de la invención proporcionan un oligonucleótido de antisentido que comprende una estructura, comprendiendo la estructura una secuencia de estructuras cíclicas de morfolino unidas por uniones entre subunidades de tipo (A), (B) o combinaciones de las mismas, en el que cada estructura cíclica de morfolino mantiene un resto de emparejamiento de bases, de modo que el compuesto oligonucleotídico puede unirse de una manera específica de secuencia a un ácido nucleico diana, que comprende una secuencia diana que es complementaria a al menos 12 bases de las SEQ ID NO: 1-34, o que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-34, y en el que el oligonucleótido comprende un extremo 3', un extremo 5' y tiene la siguiente estructura (XVII):
imagen7
o una sal o isómero de la misma, y en el que para la unión (A):
W es, en cada caso, independientemente S u O;
X es, en cada caso, independientemente -N(CH3)2, -NR1R2, -OR3 o;
imagen8
Y es, en cada caso, independientemente O o -NR2,
R1 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo;
R2 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o -LNR4R5R7; R3 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
R4 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, metilo, -C(=NH)NH2, -Z-L-NHC(=NH)NH2 o - [C(O)CHR'NH]mH, donde Z es carbonilo (C(O)) o un enlace directo, R' es una cadena lateral de un aminoácido de origen natural o un homólogo de uno o dos carbonos del mismo, y m es de 1 a 6;
R5 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, metilo o un par de electrones;
R6 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo;
R7 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo Ci-C6 o alcoxialquilo Ci-C6;
L es un conector opcional de hasta 18 átomos de longitud que comprende grupos alquilo, alcoxi o alquilamino, o combinaciones de los mismos; y
en el que para la unión (B):
W es, en cada caso, independientemente S u O;
X es, en cada caso, independientemente -NR8R9 u -OR3; e Y es, en cada caso, independientemente O o -NR10,
R8 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C2-C12;
R9 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12, aralquilo C1-C12 o arilo;
R10 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo Ci-Ci2 o -LNR4R5R7;
en el que R y R pueden unirse para formar un heterociclo mono- o bicíclico de 5-18 miembros o R , R o R pueden unirse con R10 para formar un heterociclo de 5-7 miembros, y en el que, cuando X es 4-piparazino, X tiene la siguiente estructura (III):
R10 es, en cada caso, independientemente alquilo C2-C12, aminoalquilo C1-C12, alquilcarbonilo C1-C12, arilo, heteroarilo o heterociclilo; y
R es, en cada caso, independientemente un par de electrones, hidrógeno o alquilo C1-C12;
R12 es, en cada caso, independientemente, hidrógeno, alquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12, -NH2, -NR13R14, - NR13R14R15, alquilcarbonilo C1-C12, -CN, trifluorometilo, amidilo, amidinilo, amidinilalquilo, amidinilalquilcarbonilo, guanidinilo, guanidinilalquilo, guanidinilalquilcarbonilo, colato, desoxicolato, arilo, heteroarilo, heterociclo, -SR13 o alcoxi C1-C12, en la que R13, R14 y R15 son, en cada caso, independientemente alquilo C1-C12; y R17 es, en cada caso, independientemente inexistente, hidrógeno o alquilo C1-C6;
R18 y R19 son, en cada caso, independientemente inexistentes, hidrógeno, un péptido de penetración celular, un aminoácido natural o no natural, alquilcarbonilo C2-C30, -C(=O)OR21 o R20;
R20 es, en cada caso, independientemente guanidinilo, heterociclilo, alquilo C1-C30, cicloalquilo C3-C8; arilo C6- C30, aralquilo C7-C30, alquilcarbonilo C3-C30, cicloalquilcarbonilo C3-C8, cicloalquilalquilcarbonilo C3-C8,
arilcarbonilo C7-C30, aralquilcarbonilo C7-C30, alquiloxicarbonilo C2-C30, cicloalquiloxicarbonilo C3-C8,
ariloxicarbonilo C7-C30, aralquiloxicarbonilo C8-C30 o -P(=O)(R22)2;
R21 es alquilo C1-C30 que comprende uno o más restos de oxígeno o hidroxilo o combinaciones de los mismos; cada R22 es independientemente ariloxi C6-C12;
B es un resto de emparejamiento de bases;
L1 es un conector opcional de hasta 18 átomos de longitud que comprende enlaces seleccionados de alquilo, hidroxilo, alcoxi, alquilamino, amida, éster, carbonilo, carbamato, fosforodiamidato, fosforoamidato, fosforotioato, piperazina y fosfodiéster; x es un número entero de 0 o mayor; y
18 19 20 17 18
en la que al menos uno de R o R es R y con la condición de que tanto R como R no estén ausentes.
Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes tras la referencia a la siguiente divulgación detallada. Para este fin, se exponen diversas referencias en el presente documento, que describen en más detalle determinada información antecedente, procedimientos, compuestos y/o composiciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A muestra una estructura ejemplar de oligómero de morfolino con una unión fosforodiamidato;
La figura 1B muestra un oligómero de morfolino como en la figura 1A, pero donde las uniones de la estructura contienen un grupo cargado positivamente en forma de una unión de fosforodiamidato (piperazino);
imagen9
(III)
en la que:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La figura 1C muestra un conjugado de un péptido rico en arginina y un oligómero de antisentido, de acuerdo con una realización de la invención;
Las figuras 1D-G muestran el segmento de subunidad repetitivo de oligonucleótidos morfolino ejemplares, denominado D a G.
La figura 2 muestra los resultados para el cribado de inmunofluorescencia de progerina y lamina A/C.
La figura 3 muestra los resultados para el análisis de Western de lamina A y progerina.
La figura 4 muestra los resultados para el análisis de RT-qPCR de lamina A y progerina.
La figura 5 muestra los resultados para el análisis de Western de lamina A, lamina C y progerina.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a oligonucleótidos como se describe en el presente documento, y una composición que contiene los mismos. Dentro del contexto de la presente invención también se divulgan métodos in vitro, en los que los oligonucleótidos muestran expresión del ARNm de la proteína LMNA mutante, por ejemplo, modulando el corte y empalme del preARNm de LMNa.
Definiciones
Salvo que definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado entendido normalmente por los expertos en la materia a la que pertenece la invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferentes. Para los fines de la presente invención, los términos siguientes se definen a continuación.
Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Por "aproximadamente" se entiende una magnitud, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía en tanto como un 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % respecto a una magnitud, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
Por "secuencia codificante" se entiende cualquier secuencia de ácido nucleico que contribuye a codificar el producto polipeptídico de un gen. Por el contrario, la expresión "secuencia no codificante" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que no contribuye a codificar el producto polipeptídico de un gen.
En toda esta memoria descriptiva, a no ser que el contexto requiera lo contrario, las palabras "comprenden", "comprende", y "que comprende" se entenderán como la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicados, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.
Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, lo que sea que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios y que no pueden estar presentes otros elementos. Por "que consiste esencialmente en" se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación de los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no materialmente a la actividad o acción de los elementos enumerados.
Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las normas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" es complementaria a la secuencia "T-C-A". La complementariedad puede ser "parcial," en que únicamente algunas de las bases de los ácidos nucleicos se acoplan de acuerdo con las normas de emparejamiento de bases. O puede haber complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre hebras de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficacia y la fuerza de hibridación entre hebras de ácido nucleico. Aunque a menudo se desea complementariedad perfecta, algunas realizaciones pueden incluir uno o más, pero preferentemente 6, 5, 4, 3, 2 o 1 emparejamientos incorrectos con respecto al ARN diana. Se incluyen variaciones en cualquier ubicación dentro del oligómero. En determinadas realizaciones, las variaciones en la secuencia cerca de los extremos de un oligómero generalmente son preferentes a variaciones en el interior y, si están presentes, normalmente están en aproximadamente 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótido del extremo 5' y/o 3'.
Las expresiones "péptido de penetración celular" o "CPP" se usan indistintamente y se refieren a péptidos catiónicos de penetración celular, también llamados péptidos de transporte, péptidos portadores o dominios de transducción peptídica. Los péptidos, como se muestra en el presente documento, tiene la capacidad de inducir la penetración celular en un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de las células de una población de cultivo celular
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
dada, incluyendo todos los números enteros entremedias, y permiten la traslocación macromolecular dentro de múltiples tejidos in vivo tras administración sistémica.
Las expresiones "oligómero de antisentido" o "compuesto de antisentido" u "oligonucleótido de antisentido" u "oligonucleótido" se usan indistintamente y hacen referencia a una secuencia de subunidades cíclicas, albergando cada una un resto de emparejamiento de bases, unidas por uniones entre subunidades que permiten que los restos de emparejamiento de bases hibriden con una secuencia diana en un ácido nucleico (normalmente un ARN) por emparejamiento de bases de Watson-Crick, para formar un heterodúplex de ácido nucleico:oligómero dentro de la secuencia diana. Las subunidades cíclicas pueden estar basadas en ribosa u otra azúcar pentosa o, en determinadas realizaciones, un grupo morfolino (véase la descripción de oligómeros de morfolino a continuación). También se contemplan ácidos peptidonucleicos (APN), ácidos nucleicos bloqueados (ANB) y oligonucleótidos 2'-O- metilo, y otros agentes de antisentido conocidos en la técnica.
Dicho oligómero de antisentido puede diseñarse para bloquear o inhibir la traducción del ARNm o para inhibir el procesamiento de corte y empalme del preARNm natural, o inducir la degradación de los ARNm diana, y puede decirse que está "dirigido a" o "dirigido contra" una secuencia diana con la que hibrida. En determinadas realizaciones, la secuencia diana es una región que rodea o incluye un codón de inicio AUG de un ARNm, un sitio de corte y empalme 3' o 5' de un ARNm preprocesado o un punto de ramificación. La secuencia diana puede estar dentro de un exón o dentro de un intrón o una combinación. La secuencia diana para un sitio de corte y empalme puede incluir una secuencia de ARNm que tiene su extremo 5' de 1 a aproximadamente 25 pares de bases en dirección 3' de una unión aceptadora de corte y empalme normal en un ARNm preprocesado. Una secuencia diana preferente para corte y empalme es cualquier región de un ARNm preprocesado que incluye un sitio de corte y empalme o está contenida completamente dentro de una secuencia que codifica un exón o abarca un sitio aceptador y donador de corte y empalme. Más en general se dice que un oligómero está "dirigido contra" una diana biológicamente pertinente tal como, en la presente invención, un preARNm del gen de LMNA humana que codifica la proteína lamina A, cuando está dirigido contra el ácido nucleico de la diana de la manera descrita anteriormente. Las secuencias de dirección ejemplares incluyen las SEQ ID NO: 3-34.
Se incluyen oligonucleótidos de antisentido que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una o más de las SEQ ID NO: 3-34. También se incluyen variantes de estos oligómeros de antisentido, incluyendo oligómeros variantes que tienen un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % (incluyendo todos los números enteros entremedias) de identidad de secuencia u homología de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-34 y/o variantes que difieren de estas secuencias en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos, preferentemente aquellas variantes que modulan la expresión de progerina en una célula. También se incluyen oligonucleótidos de una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 3-34, que comprenden una cantidad adecuada de uniones catiónicas u otras uniones modificadas, como se describe en el presente documento, por ejemplo, hasta aproximadamente 1 por cada 2-5 uniones no cargadas, tal como aproximadamente 4-5 por cada 10 uniones no cargadas, y/o que comprenden un péptido de transporte de penetración celular rico en Arg adherido a los mismos, como también se describe en el presente documento.
Las expresiones "oligómero de morfolino" o "PMO" (oligómero de fosforoamidato o fosforodiamidato morfolino) se refieren a un análogo oligonucleotídico compuesto de estructuras de subunidad morfolino, donde (i) las estructuras se unen juntas mediante uniones que contienen fósforo, de uno a tres átomos de longitud, preferentemente de dos átomos de longitud y preferentemente no cargadas o catiónicas, que unen el nitrógeno de morfolino de una subunidad a un carbono 5' exocíclico de una subunidad adyacente, y (ii) cada anillo de morfolino alberga una purina o pirimidina o un resto de emparejamiento de bases equivalente eficaz para unirse, por enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido. Pueden hacerse variaciones a esta unión siempre que no interfieran con la unión o la actividad. Por ejemplo, el oxígeno adherido al fósforo puede sustituirse con azufre (tiofosforodiamidato). El oxígeno 5' puede sustituirse con amino o amino sustituido con alquilo inferior. El nitrógeno colgante adherido al fósforo puede estar si sustituir, monosustituido o disustituido con alquilo inferior (opcionalmente sustituido). Véase también el análisis de uniones catiónicas a continuación. El resto de emparejamiento de bases de purina o pirimidina es normalmente adenina, citosina, guanina, uracilo, timina o inosina. La síntesis, estructuras y características de unión de los oligómeros de morfolino se detallan en las patentes de Estados Unidos n.° 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.521.063 y 5.506.337, y las solicitudes PCT n.° PCT/US07/11435 (uniones catiónicas) y US08/012804 (síntesis mejorada).
"PMO+" se refiere a oligómeros de fosforodiamidato morfolino que comprenden incontables uniones (1- piperazino)fosfinilideneoxi, (1-(4-(ui-guanidino-alcanoil))-piperazino)fosfinilideneoxi (A2 y A3) que se han descrito previamente (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO/2008/036127).
"PMO-X" se refiere a oligómeros de fosforodiamidato morfolino divulgados en el presente documento que comprenden al menos una unión (B) o al menos una de las modificaciones terminales divulgadas, y como se divulga en los documentos WO2011/150408 y US2012/0065169. Además, los oligómeros de fosforodiamidato morfolino PMO-X útiles en el presente documento pueden encontrarse en el documento US2014/0330006. Un grupo "fosforoamidato" comprende fósforo que tiene tres átomos de oxígeno adheridos y un átomo de nitrógeno adherido, mientras que un grupo "fosforodiamidato" comprende fósforo que tiene dos átomos de oxígeno adheridos y dos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
átomos de nitrógeno adheridos. En las uniones entre subunidades no cargadas o modificadas de los oligómeros descritos en el presente documento y en los documentos WO2011/150408 y US7.943.762, un nitrógeno siempre está colgante a la cadena estructural. El segundo nitrógeno, en una unión fosforodiamidato, normalmente es el nitrógeno del anillo en una estructura cíclica de morfolino.
Las uniones "tiofosforoamidato" o "tiofosforodiamidato" son uniones fosforoamidato o fosforodiamidato, respectivamente, en las que un átomo de oxígeno, normalmente el oxígeno colgante a la estructura, se remplaza con azufre.
"Unión entre subunidades" se refiere a la unión que conecta dos subunidades morfolino, por ejemplo la estructura (I).
"Cargado", "no cargado", "catiónico" y "aniónico", como se usan en el presente documento, se refieren al estado predominante de un resto químico a pH casi neutro, por ejemplo, de aproximadamente 6 a 8. Por ejemplo, el término puede hacer referencia al estado predominante del resto químico a pH fisiológico, es decir, de aproximadamente 7,4.
La expresión "análogo oligonucleotídico" se refiere a un oligonucleótido que tiene (i) una estructura central modificada, por ejemplo, una estructura diferente de la unión fosfodiéster convencional encontrada en oligo- y polinucleótidos naturales y (ii), opcionalmente, restos de azúcar modificados, por ejemplo, restos morfolino en lugar de restos de ribosa o desoxirribosa. Los análogos oligonucleotídicos mantienen bases que pueden formar enlaces de hidrógeno por emparejamiento de bases de Watson-Crick con bases polinucleotídicas convencionales, donde la estructura análoga presenta las bases de una manera que permite dichos enlaces de hidrógeno de una manera específica de secuencia entre la molécula análoga oligonucleotídica y las bases en un polinucleótido convencional (por ejemplo, ARN monocatenario o ADN monocatenario). Los análogos preferidos son aquellos que tienen una estructura sustancialmente no cargada, que contiene fósforo.
Una estructura sustancialmente no cargada, que contiene fósforo en un análogo oligonucleotídico es una en que una mayoría de las uniones de subunidades, por ejemplo, entre un 50-100 %, normalmente al menos de un 60 % a un 100 % o un 75 % o un 80 % de sus uniones, están sin cargar y contienen un único átomo de fósforo. Los oligonucleótidos de antisentido y los análogos oligonucleotídicos pueden contener entre aproximadamente 8 y 40 subunidades, normalmente aproximadamente 8-25 subunidades y preferentemente de aproximadamente 12 a 25 subunidades (incluyendo todos los números enteros e intervalos entremedias). En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos pueden tener complementariedad de secuencia exacta con la secuencia diana o casi complementariedad, como se define a continuación.
Una "subunidad" de un oligonucleótido se refiere a una unidad de nucleótido (o análogo nucleotídico). El término puede hacer referencia a la unidad de nucleótido con o sin la unión entre subunidades adherida, aunque, cuando se refiere a una "subunidad cargada", la carga normalmente reside dentro de la unión entre subunidades (por ejemplo, una unión fosfato o fosforotioato o una unión catiónica).
El resto de emparejamiento de bases de purina o pirimidina es normalmente adenina, citosina, guanina, uracilo, timina o inosina. También se incluyen bases tales como piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, seudouracilo, 2,4,6- trimetoxibenceno, 3-metiluracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5- alquiluridinas (por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6- alquilpirimidinas (por ejemplo, 6-metiluridina), propina, quesosina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, wybutosina, wybutoxosina, 4-acetiltidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, 5'-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluridina, p-D-galactosilqueosina, 1-metiladenosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 3- metilcitidina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metoxiaminometil-2- tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-metilcarbonilmetiluridina, 5-metiloxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6- isopenteniladenosina, p-D-manosilqueosina, ácido uridina-5-oxiacético, 2-tiocitidina, derivados de treonina y otros (Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090; Uhlman y Peyman, supra). Por "bases modificadas", en este aspecto, se entiende bases nucleotídicas diferentes de adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), como se ilustra anteriormente; dicha bases pueden usarse en cualquier posición en la molécula de antisentido. Los expertos en la materia apreciarán que, dependiendo de los usos de los oligómeros, las T y los U son intercambiables. Por ejemplo, con otros compuestos químicos de antisentido tales como oligonucleótidos 2'-O-metilo de antisentido que son más parecidos a ARN, las bases T pueden mostrarse como U (véase, por ejemplo, el listado de secuencias).
Una "subunidad de aminoácido" o "resto de aminoácido" puede hacer referencia a un resto de a-aminoácido (-CO- CHR-NH-) o un resto de p-aminoácido u otro (por ejemplo, -CO-(CH2)nCHR-NH-), donde R es una cadena lateral (que puede incluir hidrógeno) y n es de 1 a 7, preferentemente de 1 a 4.
La expresión "aminoácido de origen natural" se refiere a un aminoácido presente en proteínas encontradas en la naturaleza, tales como los 20 (L)-aminoácidos utilizados durante la biosíntesis de proteínas, así como otros tales como 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, homocisteína, citrulina y ornitina. La expresión "aminoácidos no naturales" se refiere a aquellos aminoácidos no presentes en proteínas encontradas en la naturaleza, cuyos ejemplos incluyen beta-alanina (p-Ala), ácido 6-aminohexanoico (Ahx) y ácido 6-aminopentanoico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplos adicionales de "aminoácidos no naturales" incluyen, sin limitación, (D)-aminoácidos, norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, etionina y similares, que son conocidos para los expertos en la materia.
Por "aislado" se entiende material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado natural. Por ejemplo, un "polinucleótido aislado" u "oligonucleótido aislado", como se usan en el presente documento, pueden hacer referencia a un polinucleótido que se ha purificado o retirado de las secuencias que lo flanquean en un estado de origen natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha retirado de las secuencias que están normalmente adyacentes al fragmento.
Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de oligómero de antisentido eficaz para modular la expresión de progerina in vitro.
Por "potencia" o "potenciación", o "aumentar" o "aumento", o "estimular" o "estimulación" se refiere en general a la capacidad de uno o más compuestos o composiciones de antisentido de producir o provocar una mayor respuesta fisiológica (es decir, efectos posteriores) en una célula, en comparación con la respuesta provocada por cualquier compuesto que no sea de antisentido o un compuesto de control. Una cantidad "aumentada" o "potenciada" es normalmente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los números enteros y puntos decimales entremedias y por encima de 1), por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la cantidad producida por compuestos que no es de antisentido (la ausencia de un agente) o un compuesto de control.
El término "reducir" o "inhibir" puede referirse en general a la capacidad de uno o más compuestos de antisentido de la invención de "disminuir" una respuesta fisiológica o celular pertinente, medida de acuerdo con técnicas rutinarias en la técnica de diagnóstico. Las respuestas fisiológicas o celulares pertinentes (in vivo o in vitro) serán evidentes para los expertos en la materia, y pueden incluir, por ejemplo, reducciones en la expresión de progerina medida por los niveles de ARNm y/o proteína. Una "disminución" en una respuesta puede ser "estadísticamente significativa" en comparación con la respuesta producida por un compuestos que no es de antisentido o una composición de control, y puede incluir un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %, incluyendo todos los números enteros entremedias.
La expresión "secuencia diana" se refiere a una parte del ARN diana contra el que está dirigido el oligonucleótido o agente de antisentido, es decir, la secuencia con la que hibridará el oligonucleótido por emparejamiento de bases de Watson-Crick de una secuencia complementaria. En determinadas realizaciones, la secuencia diana puede ser una región contigua de un preARNm que incluye secuencia diana tanto intrónica como exónica. En otras determinadas realizaciones, la secuencia diana consistirá exclusivamente de secuencias intrónicas o exónicas.
La expresión "secuencia de dirección" o "secuencia de dirección de antisentido" se refiere a la secuencia en un oligonucleótido u otro agente de antisentido que es complementaria (que significa, además, sustancialmente complementaria) a la secuencia diana en el genoma de ARN. La secuencia completa, o únicamente una parte, del compuesto de antisentido puede ser complementaria a la secuencia diana. Por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene 20-30 bases, aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 pueden ser secuencias de dirección que son complementarias a la región diana. Típicamente, la secuencia de dirección está formada de bases contiguas, pero puede estar formada, como alternativa, de secuencias no contiguas que cuando se sitúan juntas, por ejemplo, desde extremos opuestos del oligonucleótido, constituyen la secuencia que abarca la secuencia diana.
Las secuencias diana y de dirección se describen como "complementarias" entre sí cuando se produce hibridación en una configuración antiparalela. Una secuencia de dirección puede tener complementariedad "cercana" o "sustancial" con la secuencia diana y aún funcional para los fines de la presente invención, es decir, aún puede ser funcionalmente "complementaria". En determinadas realizaciones, un oligonucleótido puede tener como mucho un emparejamiento incorrecto con la secuencia diana de los 10 nucleótidos, y preferentemente como mucho un emparejamiento incorrecto de los 20. Como alternativa, un oligonucleótido puede tener al menos un 90 % de homología de secuencia, y preferentemente al menos un 95 % de homología de secuencia, con las secuencias de dirección de antisentido ejemplares descritas en el presente documento.
Un oligonucleótido "hibrida específicamente" con un polinucleótido diana si el oligómero hibrida con la diana en condiciones fisiológicas, con una Tm sustancialmente mayor de 45 °C, preferentemente al menos 50 °C y normalmente 60 °C-80 °C o mayor. Dicha hibridación preferentemente corresponde a condiciones de hibridación rigurosas. A una fuerza iónica y pH dados, la Tm es la temperatura a la que el 50 % de una secuencia diana hibrida con un polinucleótido complementario. De nuevo, dicha hibridación puede producirse con complementariedad "cercana" o "sustancial" del oligómero de antisentido a la secuencia diana, así como con complementariedad exacta.
"Homología" se refiere al porcentaje de la cantidad de aminoácidos que son idénticos o constituyen sustituciones conservativas. La homología puede determinarse usando programas de comparación de secuencias tales como GAP (Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). De esta manera, secuencias de una longitud
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
similares o sustancialmente diferente respecto a las indicadas en el presente documento podría compararse por inserción de huecos en la alineación, determinándose dichos huecos, por ejemplo, por el algoritmo de comparación usado por GAP.
Las expresiones "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprenden una "secuencia un 50 % idéntica a", como se usan en el presente documento, se refieren al grado al que las secuencias son idénticas en una base nucleótido por nucleótido o una base aminoácido por aminoácido sobre una ventana de comparación. Por lo tanto, un "porcentaje de identidad de secuencia" puede calcularse comparando dos secuencias alineadas de forma óptima sobre la ventana de comparación, determinando la cantidad de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el resto de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) aparece en ambas secuencias para producir la cantidad de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.
Las expresiones usadas para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptido incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es de al menos 8 o 10, pero frecuentemente de 15 a 18 y a menudo de al menos 25 unidades monoméricas, incluyendo nucleótidos y restos de aminoácido, de longitud. Como dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, únicamente una parte de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos se realizan normalmente comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en que se compara una secuencia con una secuencia de referencia de la misma cantidad de posiciones contiguas después de alinear de forma óptima las dos secuencias. La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de aproximadamente un 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias.
La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por implementaciones informáticas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA del Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE. UU.) o por inspección y la mejor alineación (es decir, que produce el porcentaje de homología más alto sobre la ventana de comparación) generada por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También puede hacerse referencia a la familia BLAST de programas como se divulga, por ejemplo, por Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Puede encontrarse un análisis detallado del análisis de secuencia en la unidad 19.3 de Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, capítulo 15.
Una molécula oligomérica (oligómero) "resistente a nucleasa" se refiere a una cuya estructura es sustancialmente resistente a escisión por nucleasa, en forma no hibridada o hibridada; por nucleasas extracelulares e intracelulares comunes en el organismo; es decir, el oligómero muestra poca o ninguna escisión por nucleasa en condiciones de nucleasa normales en el organismo al que se expone el oligómero.
Una agente se "capta activamente por células de mamífero" cuando el agente puede entrar en la célula por un mecanismo diferente de difusión pasiva a través de la membrana celular. El agente puede transportarse, por ejemplo, por "transporte activo", que se refiere al transporte de agentes a través de una membrana celular de mamífero por, por ejemplo, un mecanismo de transporte dependiente de ATP, o por "transporte facilitado", que se refiere al transporte de agentes de antisentido a través de la membrana celular por un mecanismo de transporte que requiere la unión del agente a una proteína de transporte, que entonces facilita el paso del agente unido a través de la membrana. Tanto para el transporte activo como para el transporte facilitado, los análogos oligonucleotídicos preferentemente tienen una estructura sustancialmente no cargada, como se define a continuación.
Un "heterodúplex" se refiere a un dúplex entre un oligonucleótido de antisentido y la parte complementaria de un ARN diana. Un "heterodúplex resistente a nucleasa" se refiere a un heterodúplex formado por la unión de un oligómero de antisentido con su diana complementaria, de modo que el heterodúplex es sustancialmente resistente a degradación in vivo por nucleasas intracelulares y extracelulares, tales como RNasaH, que pueden cortar complejos bicatenarios de ARN/ARN o ARN/ADN.
Como se usa en el presente documento, la expresión "líquido corporal" abarca una diversidad de tipos de muestra obtenidos de un sujeto, incluyendo orina, saliva, plasma, sangre, líquido cefalorraquídeo u otra muestra de origen biológico, tal como células de la piel o desechos dérmicos, y puede referirse a células o fragmentos celulares suspendidos en el mismo, o el medio líquido y sus solutos.
La expresión "cantidad relativa" se usa cuando se hace una comparación entre una medición de ensayo y una medición de control. La cantidad relativa de un reactivo que forma un complejo en una reacción es la cantidad que reacciona con una muestra de ensayo, en comparación con la cantidad que reacciona con una muestra de control. La muestra de control pude ejecutarse por separado en el mismo ensayo, o puede ser parte de la misma muestra 5 (por ejemplo, tejido normal que rodea un área maligna en una sección tisular).
Un gen o producto génico de tipo silvestre es el que se observa más frecuentemente en una población y, por tanto, se denomina arbitrariamente forma "normal" o "de tipo silvestre" del gen.
10 Los siguientes términos químicos tienen los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario:
"Amino" se refiere al radical -NH2.
"Ciano" o "nitrilo" se refiere al radical -CN.
"Hidroxi" o "hidroxilo" se refiere al radical -OH.
15 "Imino" se refiere al sustituyente =NH.
"Guanidinilo" se refiere al sustituyente -NHC(=NH)NH2.
"Amidinilo" se refiere al sustituyente -C(=NH)NH2.
"Nitro" se refiere al radical -NO2.
"Oxo" se refiere al sustituyente =O.
20 "Tioxo" se refiere al sustituyente =S.
"Colato" se refiere a la siguiente estructura:
25
imagen10
"Desoxicolato" se refiere a la siguiente estructura:
imagen11
"Alquilo" se refiere a un radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que está saturada o insaturada (es 30 decir, contiene uno o más dobles y/o triples enlaces), que tiene de uno a treinta átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo. Se incluyen alquilos que comprenden cualquier cantidad de átomos de carbono de 1 a 30. Un alquilo que comprende hasta 30 átomos de carbono se menciona como un alquilo C1-C30, asimismo, por ejemplo, un alquilo que comprende hasta 12 átomos de carbono es un alquilo C1-C12. Los alquilos (y otros restos definidos en el presente documento) que comprenden otras cantidades de átomos de carbono se 35 representan de forma similar. Los grupos alquilo incluyen, pero sin limitación, alquilo C1-C30, alquilo C1-C20, alquilo C1-C15, alquilo C1-C10, alquilo C1-C8, alquilo C1-C6, alquilo C1-C4, alquilo C1-C3, alquilo C1-C2, alquilo C2-C8, alquilo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
C3-C8 y alquilo C4-C8. Los grupos alquilo representativos incluyen, pero sin limitación, metilo, etilo, n-propilo, 1- metiletilo (/so-propilo), n-butilo, /'-butilo, s-butilo, n-pentilo, 1,1-dimetiletilo (í-butilo), 3-metilhexilo, 2-metilhexilo, etenilo, prop-1-enilo, but-1-enilo, pent-1-enilo, penta-1,4-dienilo, etinilo, propinilo, but-2-inilo, but-3-inilo, pentinilo, hexinilo y similares. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
"Alquileno" o "cadena de alquileno" se refiere a una cadena de hidrocarburo divalente lineal o ramificada que une el resto de la molécula a un grupo radical. Los alquilenos pueden estar saturados o insaturados (es decir, contiene uno o más dobles y/o triples enlaces). Los alquilenos representativos incluyen, pero sin limitación,alquileno C1-C12, alquileno C1-C8, alquileno C1-C6, alquileno C1-C4, alquileno C1-C3, alquileno C1-C2, alquileno C1. Los grupos alquileno representativos incluyen, pero sin limitación, metileno, etileno, propileno, n-butileno, etenileno, propenileno, n- butenileno, propinileno, n-butinileno y similares. La cadena de alquileno está unida al resto de la molécula a través de un enlace sencillo o doble y al grupo radical a través de un enlace sencillo o doble. Los puntos de unión de la cadena de alquileno al resto de la molécula y al grupo radical pueden ser a través de un carbono o dos carbonos cualesquiera dentro de la cadena. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, una cadena de alquileno puede estar opcionalmente sustituida como se describe a continuación.
"Alcoxi" se refiere a un radical de fórmula -ORa, donde Ra es un radical alquilo como se define. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo alcoxi puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
Alcoxialquilo" se refiere a un radical de fórmula -RbORa, donde Ra es un radical alquilo como se define y donde Rb es un radical alquileno como se define. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo alcoxialquilo puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
"Alquilcarbonilo" se refiere a un radical de fórmula -C(=O)Ra, donde Ra es un radical alquilo como se define anteriormente. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo alquilcarbonilo puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
"Alquiloxicarbonilo" se refiere a un radical de fórmula -C(=O)ORa, donde Ra es un radical alquilo como se define. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo alquiloxicarbonilo puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
"Alquilamino" se refiere a un radical de fórmula -NHRa o -NRaRa, donde cada Ra es, independientemente, un radical alquilo como se define anteriormente. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo alquilamino puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
"Amidilo" se refiere a un radical de fórmula -N(H)C(=O) Ra, donde Ra es un radical alquilo o arilo como se define en el presente documento. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo amidilo puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
"Amidinilalquilo" se refiere a un radical de fórmula -Rb-C(=NH)NH2, donde Rb es un radical alquileno como se define anteriormente. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo amidinilalquilo puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
"Amidinilalquilcarbonilo" se refiere a un radical de fórmula -C(=O)Rb-C(=NH)NH2, donde Rb es un radical alquileno como se define anteriormente. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo amidinilalquilcarbonilo puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
"Aminoalquilo" se refiere a un radical de fórmula -Rb-NRaRa, donde Rb es un radical alquileno como se define anteriormente, y cada Ra es independientemente un hidrógeno o un radical alquilo.
"Tioalquilo" se refiere a un radical de fórmula -SRa, donde Ra es un radical alquilo como se define anteriormente. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo tioalquilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Arilo" se refiere a un radical derivado de un sistema cíclico de hidrocarburo que comprende hidrógeno, de 6 a 30 átomos de carbono y al menos un anillo aromático. El radical arilo puede ser un sistema cíclico monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas cíclicos condensados o unidos por puentes. Los radicales arilo incluyen, pero sin limitación, radicales arilo derivados de los sistemas de hidrocarburo de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, fluoranteno, fluoreno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, fenaleno, fenantreno, pleyadeno, pireno y trifenileno. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, el término "arilo" o el prefijo "ar-" (tal como en "aralquilo") pretende incluir radicales arilo que están opcionalmente sustituidos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
"Aralquilo" se refiere a un radical de fórmula -Rb-Rc, donde Rb es una cadena de alquileno como se define anteriormente y Rc es uno o más radicales arilo como se define anteriormente, por ejemplo, bencilo, difenilmetilo, tritilo y similares. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo aralquilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Arilcarbonilo" se refiere a un radical de fórmula -C(=O)Rc, donde Rc es uno o más radicales arilo como se define anteriormente, por ejemplo, fenilo. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo arilcarbonilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Ariloxicarbonilo" se refiere a un radical de fórmula -C(=O)ORc, donde Rc es uno o más radicales arilo como se define anteriormente, por ejemplo, fenilo. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo ariloxicarbonilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Aralquilcarbonilo" se refiere a un radical de fórmula -C(=O)Rb-Rc, donde Rb es una cadena de alquileno como se define anteriormente y Rc es uno o más radicales arilo como se define anteriormente, por ejemplo, fenilo. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo aralquilcarbonilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Aralquiloxicarbonilo" se refiere a un radical de fórmula -C(=O)ORb-Rc, donde Rb es una cadena alquileno como se define anteriormente y Rc es uno o más radicales arilo como se define anteriormente, por ejemplo, fenilo. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo aralquiloxicarbonilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Ariloxi" se refiere a un radical de fórmula -ORc, donde Rc es uno o más radicales arilo como se define anteriormente, por ejemplo, fenilo. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo arilcarbonilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Cicloalquilo" se refiere a un anillo carbocíclico monocíclico o policíclico no aromático, estable, que puede incluir sistemas cíclicos condensados o unidos por puentes, que está saturado o insaturado, y unido al resto de la molécula por un enlace sencillo. Los cicloalquilos representativos incluyen, pero sin limitación, cicloalquilos que tienen de tres a quince átomos de carbono y de tres a ocho átomos de carbono. Los radicales ciclcoalquilo monocíclicos incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Los radicales policíclicos incluyen, por ejemplo, adamantilo, norbornilo, decalinilo y 7,7-dimetil-biciclo[2.2.1]heptanilo. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo cicloalquilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Cicloalquilalquilo" se refiere a un radical de fórmula -RbRd, donde Rb es una cadena de alquileno como se define anteriormente y Rd es un radical cicloalquilo como se define anteriormente. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo cicloalquilalquilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Cicloalquilcarbonilo" se refiere a un radical de fórmula -C(=O)Rd, donde Rd es un radical cicloalquilo como se define anteriormente. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo cicloalquilcarbonilo puede estar opcionalmente sustituido.
Cicloalquiloxicarbonilo" se refiere a un radical de fórmula -C(=O)ORd, donde Rd es un radical cicloalquilo como se define anteriormente. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo cicloalquiloxicarbonilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Condensado" se refiere a cualquier estructura cíclica descrita en el presente documento condensada a una estructura cíclica existente. Cuando el anillo condensado es un anillo heterociclilo o un anillo heteroarilo, cualquier átomo de carbono en la estructura cíclica existente que se vuelve parte del anillo heterociclilo condensado o el anillo heteroarilo condensado puede remplazarse por un átomo de nitrógeno.
"Guanidinilalquilo" se refiere un radical de fórmula -Rb-NHC(=NH)NH2, donde Rb es un radical alquileno como se define anteriormente. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo guanidinilalquilo puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
"Guanidinilalquilcarbonilo" se refiere a un radical de fórmula -C(=O)Rb-NHC(=NH)NH2, donde Rb es un radical alquileno como se define anteriormente. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo guanidinilalquilcarbonilo puede estar opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
"Halo" o "halógeno" se refiere a bromo, cloro, flúor o yodo.
"Haloalquilo" se refiere a un radical alquilo, como se define anteriormente, que está sustituido con uno o más radicales halo, como se define anteriormente, por ejemplo, trifluorometilo, difluorometilo, fluorometilo, triclorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 1,2-difluoroetilo, 3-bromo-2-fluoropropilo, 1,2-dibromoetilo y similares. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo haloalquilo puede estar opcionalmente sustituido.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
"Perhalo" o "perfluoro" se refiere a un resto en que cada átomo de hidrógeno se ha remplazado por un átomo de halógeno o átomo de flúor, respectivamente.
"Heterocidilo" o "anillo heterocíclico" se refiere a un radical cíclico no aromático estable de 3 a 24 miembros que comprende de 2 a 23 átomos de carbono y de uno a ocho heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, el radical heterociclilo puede ser un sistema cíclico monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas cíclicos condensados o unidos por puentes; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre en el radical heterociclilo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado; y el radical heterociclilo puede estar parcial o totalmente saturado. Los ejemplos de tales radicales heterociclilo incluyen, pero sin limitación, dioxolanilo, tienil[1,3]ditianilo, decahidroisoquinolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, octahidroindolilo, octahidroisoindolilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 2-oxopirrolidinilo, oxazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, pirazolidinilo, quinuclidinilo, tiazolidinilo, tetrahidrofurilo, tritianilo, tetrahidropiranilo, tiomorfolinilo, tiamorfolinilo, 1-oxo-tiomorfolinilo, 1,1-dioxo- tiomorfolinilo, 12-corona-4, 15-corona-5, 18-corona-6, 21-corona-7, aza-18-corona-6, diaza-18-corona-6, aza-21- corona-7 y diaza-21-corona-7. A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Heteroarilo" se refiere a un radical de sistema cíclico de 5 a 14 que comprende átomos de hidrógeno, de uno a trece átomos de carbono, de uno a seis heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre, y al menos un anillo aromático. Para los fines de la presente invención, el radical heteroarilo puede ser un sistema cíclico monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas cíclicos condensados o unidos por puentes; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre en el radical heteroarilo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, azepinilo, acridinilo, benzoimidazolilo, benzotiazolilo, benzindolilo, benzodioxolilo, benzofuranilo, benzooxazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzo[5][1,4]dioxepinilo, 1,4-benzodioxanilo, benzonaftofuranilo, benzoxazolilo, benzodioxolilo, benzodioxinilo, benzopiranilo, benzopiranonilo, benzofuranilo, benzofuranonilo, benzotienilo (benzotiofenilo), benzotriazolilo, benzo[4,6]imidazo[1,2-a]piridinilo, carbazolilo, cinolinilo, dibenzofuranilo, dibenzotiofenilo, furanilo, furanonilo, isotiazolilo, imidazolilo, indazolilo, indolilo, indazolilo, isoindolilo, indolinilo, isoindolinilo, isoquinolilo, indolizinilo, isoxazolilo, naftiridinilo, oxadiazolilo, 2-oxoazepinilo, oxazolilo, oxiranilo, 1- oxidopiridinilo, 1-oxidopirimidinilo, 1 -oxidopirazinilo, 1-oxidopiridazinilo, 1-fenil-IH-pirrolilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, pteridinilo, purinilo, pirrolilo, pirazolilo, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, quinolinilo, quinuclidinilo, isoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tiazolilo, tiadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, triazinilo y tiofenilo (es decir, tienilo). A menos que se indique otra cosa específicamente en la memoria descriptiva, un grupo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido.
Todos los grupos anteriores pueden estar sustituidos o sin sustituir. El término "sustituido", como se usa en el presente documento, significa que cualquiera de los grupos anteriores (es decir, alquilo, alquileno, alcoxi, alcoxialquilo, alquilcarbonilo, alquiloxicarbonilo, alquilamino, amidilo, amidinilalquilo, amidinilalquilcarbonilo, aminoalquilo, arilo, aralquilo, arilcarbonilo, ariloxicarbonilo, aralquilcarbonilo, aralquiloxicarbonilo, ariloxi, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilcarbonilo, cicloalquilalquilcarbonilo, cicloalquiloxicarbonilo, guanidinilalquilo, guanidinilalquilcarbonilo, haloalquilo, heterociclilo y/o heteroarilo), puede estar funcionalizado adicionalmente, en el que al menos un átomo de hidrógeno está remplazado por un enlace a un sustituyente de átomo que no es de hidrógeno. A menos que se indique específicamente en la memoria descriptiva, un grupo sustituido puede incluir uno o más sustituyentes seleccionados de: oxo, -CO2H, nitrilo, nitro, hidroxilo, tiooxi, alquilo, alquileno, alcoxi, alcoxialquilo, alquilcarbonilo, alquiloxicarbonilo, arilo, aralquilo, arilcarbonilo, ariloxicarbonilo, aralquilcarbonilo, aralquiloxicarbonilo, ariloxi, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloalquilcarbonilo, cicloalquilalquilcarbonilo,
cicloalquiloxicarbonilo, heterociclilo, heteroarilo, dialquilaminas, arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, N-óxidos, imidas y enaminas; un átomo de silicio en grupos tales como grupos trialquilsililo, grupos dialquilarilsililo, grupos alquildiarilsililo, grupos triarilsililo, perfluoroalquilo o perfluoroalcoxi, por ejemplo, trifluorometilo o trifluorometoxi. "Sustituido" también significa cualquiera de los grupos anteriores en que uno o más átomos de hidrógeno están remplazados por un enlace de orden superior (por ejemplo, un doble o triple enlace) a un heteroátomo tal como oxígeno en grupos oxo, carbonilo, carboxilo y éster; y nitrógeno en grupos tales como iminas, oximas, hidrazonas y nitrilos. Por ejemplo, "sustituido" incluye cualquiera de los grupos anteriores en que uno o más átomos de hidrógeno están remplazados con -NRgC(=O)NRgRh, -NRgC(=O)ORh, -NRgSO2Rh, -OC(=O)NRgRh, -ORg, -SRg, -SORg, -SO2Rg, -OSO2Rg, -SO2ORg, =NSO2Rg, y -SO2NRgRh. "Sustituido" también se refiere a cualquiera de los grupos anteriores en que uno o más átomos de hidrógeno están remplazados por -C(=O)Rg, -C(=O)ORg, -CH2SO2Rg, -CH2SO2NRgRh, - Sh, -SRg o -SSRg. En lo anterior, Rg y Rh son iguales o diferentes y son independientemente hidrógeno, alquilo, alcoxi, alquilamino, tioalquilo, arilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, haloalquilo, heterociclilo, /V-heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo, V-heteroarilo y/o heteroarilalquilo. Además, cada uno de los sustituyentes anteriores también puede estar sustituido opcionalmente con uno o más de los sustituyentes anteriores. Además, cualquiera de los grupos anteriores puede estar sustituido para que incluya uno o más átomos de oxígeno o azufre internos. Por ejemplo, un grupo alquilo puede estar sustituido con uno o más átomos de oxígeno internos para formar un grupo éter o poliéter. De manera similar, un grupo alquilo puede estar sustituido con uno o más átomos de azufre internos para formar un tioéter, disulfuro, etc. Los restos amidilo pueden estar sustituidos con hasta 2 átomos de halógeno, mientras que otros grupos anteriores pueden estar sustituidos con uno o más átomos de halógeno. Con la excepción
5
10
15
20
25
30
35
40
de los grupos alquilo, todos los demás grupos también pueden estar sustituidos con amino o monoalquilamino. Con la excepción de los grupos alquilo y alquilcarbonilo, todos los demás grupos también pueden estar sustituidos con guanidinilo o amidinilo. Los sustituyentes opcionales para cualquiera de los grupos anteriores también incluyen arilfosforilo, por ejemplo -RaP(Ar)3, en el que Ra es un alquileno y Ar es un resto arilo, por ejemplo, fenilo.
"Alquilo inferior" se refiere a un radical alquilo de uno a seis átomos de carbono, que se ilustran por metilo, etilo, n- butilo, i-butilo, t-butilo, isoamilo, n-pentilo e isopentilo. En determinadas realizaciones, un grupo "alquilo inferior" tiene de uno a cuatro átomos de carbono. En otras realizaciones, un grupo "alquilo inferior" tiene de uno a dos átomos de carbono; es decir, metilo o etilo. De forma análoga, "alquenilo inferior" se refiere a un radical alquenilo de dos a seis, preferentemente tres o cuatro, átomos de carbono, como se ilustra por alilo y butenilo.
Un sustituyente "no interferente" es uno que no afecta de forma adversa a la capacidad de un oligómero de antisentido, como se describe en el presente documento, de unirse a su diana pretendida. Dichos sustituyentes incluyen grupos pequeños y/o relativamente no polares tales como metilo, etilo, metoxi, etoxi o fluoro.
Dirección a LMNA
Los ejemplos incluyen oligonucleótidos de antisentido dirigidos a las SEQ ID NO: 1 y/o 2, tratadas a continuación.
Determinados oligonucleótidos de antisentido pueden comprender una secuencia de dirección que es complementaria a una o más bases del exón 11 en el gen de LMNA humana, incluyendo la secuencia de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) y/o la secuencia encontrada en pacientes con HGPS, como se muestra en la SEQ ID NO: 2. Estas secuencias diana se muestran en la tabla 1 a continuación:
T abla 1. Secuencias diana de LMNA ejemplares
NOMBRE
secuencia SEQ ID NO:
LMNA exón 11
GGCTCCCACTGCAGCAGCTCGGGGGACCCCGCTGA GTACAACCTGCGCTCGCGCACCGTGCTGTGCGGGA CCTGCGGGCAGCCTGCCGACAAGGCATCTGCCAGC GGCTCAGGAGCCCAGGTGGGCGGACCCATCTCCTC TGGCTCTTCTGCCTCCAGTGTCACGGTCACTCGCA GCTACCGCAGTGTGGGGGGCAGTGGGGGTGGCAGC TTCGGGGACAATCTGGTCACCCGCTCCTACCTCCT 1
GGGCAACTCCAGCCCCCGAACCCAG
HGPS exón 11
GGCTCCCACTGCAGCAGCTCGGGGGACCCCGCTGA GTACAACCTGCGCTCGCGCACCGTGCTGTGCGGGA CCTGCGGGCAGCCTGCCGACAAGGCATCTGCCAGC GGCTCAGGAGCCCAGGTGGGTGGACCCATCTCCTC TGGCTCTTCTGCCTCCAGTGTCACGGTCACTCGCA GCTACCGCAGTGTGGGGGGCAGTGGGGGTGGCAGC TTCGGGGACAATCTGGTCACCCGCTCCTACCTCCT GGGCAACTCCAGCCCCCGAACCCAG 2
Los ejemplos incluyen oligonucleótidos de antisentido que son completamente complementarios al exón 11 de LMNA (SEQ ID NO: 1 o 2), incluyendo aquellos que también son complementarios al sitio de corte y empalme críptico del exón 11 de LMNA subrayado en la SEQ ID NO: 1 y 2 en la tabla 1 (por ejemplo, CAGgTggGc/T). Determinados oligonucleótidos de antisentido pueden comprender una secuencia de dirección donde la base más 3' es complementaria a una base en el exón 11 de LMNA que está 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 bases en dirección 3' del sitio de corte y empalme críptico subrayado en la SEQ ID NO: 1 o 2 (véase la tabla 1), o que es complementaria a una base en el exón 11 de LMNA que está 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 en dirección 5' del sitio de corte y empalme críptico. Los oligonucleótidos ejemplares de este tipo están entre los enumerados a continuación como las SEQ ID NO: 3-16. Determinados oligonucleótidos de antisentido pueden comprender una secuencia de dirección donde la base más 3' es complementaria a una base en el intrón 10 de LMNA que está 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 bases en dirección 5' del exón 11 de LMNA en la SEQ ID NO: 1 o 2 (véase la tabla 1). Determinados oligonucleótidos de antisentido pueden comprender una secuencia de dirección donde la base más 3' es complementaria a una base en el exón 10 de LmNA que está 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 bases en dirección 5' del intrón 10 de LMNA. Determinadas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
realizaciones se refieren al uso de una combinación de estos agentes de antisentido. Las realizaciones específicas incluyen oligonucleótidos de antisentido que comprende todo o una parte (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 bases) de la SEQ ID NO: 1 y/o 2.
Los oligonucleótidos de antisentido también puede dirigirse contra, o ser complementarios a, una diversidad de regiones en un ARNm de LMNA preprocesado, tal como un exón, un intrón, una unión de exón-intrón o una unión de corte y empalme. Por ejemplo, determinados oligonucleótidos de antisentido pueden comprender una secuencia de dirección que es complementaria a una región (secuencia diana) que solapa con la unión de corte y empalme de un sitio donador de corte y empalme (SD) o un sitio aceptador de corte y empalme (SA) de los exones 10 y 11 del preARNm de LMNA, y es complementaria a una parte de una región exónica (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos) y una parte de una región intrónica (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos) del ARNm preprocesado. Las secuencias de dirección ejemplares de los tipos anteriores se enumeran a continuación con las sEq ID NO: 1734.
Las secuencias de dirección de antisentido seleccionadas pueden hacerse más cortas, por ejemplo, de aproximadamente 12 bases, o más largas, por ejemplo, de aproximadamente 40 bases, e incluyen una pequeña cantidad de emparejamientos incorrectos, siempre que la secuencia sea suficientemente complementaria para lograr el corte y empalme, y/u otra forma de inhibición tras la hibridación con la diana y forma, con el ARN diana, un heterodúplex que tiene una Tm de 45 °C o mayor.
En determinadas realizaciones, el grado de complementariedad entre la diana y la secuencia de dirección de antisentido es suficiente para formar un dúplex estable. La región de complementariedad de los oligómeros de antisentido con la secuencia de ARN diana puede ser tan corta como de 8-11 bases, pero es preferentemente de 1215 bases o más, por ejemplo, de 12-20 bases, de 12-25 o de 15-25 bases, incluyendo todos los números enteros e intervalos entre estos intervalos. Un oligómero de antisentido de aproximadamente 14-15 bases en general es suficientemente largo para que tenga una secuencia complementaria única en el ARNm diana. En determinadas realizaciones, puede requerirse una longitud mínima de complementariedad para conseguir la Tm de unión necesaria, como se analiza a continuación.
En determinadas realizaciones, pueden ser adecuados oligómeros tan largos como de 40 bases, donde al menos una cantidad mínima de bases, por ejemplo, 10-12 bases, son complementarias a la secuencia diana. En general, sin embargo, la captación facilitada o activa en las células se optimiza a longitudes de oligómero menores de aproximadamente 30. Para oligómeros PMO, descritos adicionalmente a continuación, se produce un equilibrio óptimo de estabilidad de unión y captación en general a longitudes de 18-30 bases. Se incluyen oligómeros de antisentido (por ejemplo, APN, aNb, 2'-OMe, MOE, PMO) que consisten en aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 bases, en que al menos aproximadamente 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 bases contiguas y/o no contiguas son complementarias a una secuencia diana descrita en el presente documento, incluyendo las secuencias diana de las SEQ ID NO: 1 y/o 2, o variantes de las mismas.
En determinadas realizaciones, los oligómeros de antisentido pueden ser un 100 % complementarias a la secuencia diana de ácido nucleico de preARNm de LMNA, o pueden incluir emparejamientos incorrectos, por ejemplo, para satisfacer las variantes, siembre que un heterodúplex formado entre el oligómero y la secuencia diana sea suficientemente estable para soportar la acción de las nucleasas celulares y otros modos de degradación o desplazamiento que puedan producirse in vivo. Las estructuras de oligómero que son menos susceptibles a escisión por las nucleasas se analizan a continuación. Los emparejamientos incorrectos, si estuvieran presentes, son menos desestabilizantes hacia las regiones finales del dúplex híbrido que en el centro. La cantidad de emparejamientos incorrectos permitidos dependerá de la longitud del oligómero, el porcentaje de pares de bases G:C en el dúplex y la posición del emparejamiento o emparejamientos incorrectos en el dúplex, de acuerdo con principios bien comprendidos de la estabilidad del dúplex. Aunque dicho oligómero de antisentido no es necesariamente un 100 % complementario a la secuencia diana, es eficaz para unirse de forma estable y específica a la secuencia diana, de modo que una actividad biológica de la diana de ácido nucleico, por ejemplo, la expresión de la proteína o proteínas progerina, se modula.
La estabilidad del dúplex formado entre un oligómero y una secuencia diana es una función de la Tm de unión y la susceptibilidad del dúplex a escisión enzimática celular. La Tm de un compuesto de antisentido con respecto al ARN de secuencia complementaria puede medirse por métodos convencionales, tales como los descritos por Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, pág. 107-108 o como se describe en Miyada C.G. y Wallace R.B., 1987, Oligonucleotide hybridization techniques, Methods Enzymol. vol. 154 pág. 94-107. En determinadas realizaciones, el oligómero de antisentido puede tener una Tm de unión, con respecto a un ARN de secuencia complementaria, mayor que la temperatura corporal y preferentemente mayor de 50 °C. Se prefieren Tm en el intervalo de 60-80 °C o mayores. De acuerdo con principios bien conocidos, la Tm de un compuesto oligomérico, con respecto a un híbrido de ARN de bases complementarias, puede aumentarse aumentando la relación de bases
emparejadas C:G en el dúplex y/o aumentando la longitud (en pares de bases) del heterodúplex. Al mismo tiempo, con el fin de optimizar la captación celular, puede ser ventajoso limitar el tamaño del oligómero. Por este motivo, los compuestos que muestra una elevada Tm (50 °C o mayor) a una longitud de 25 bases o menos son en general preferentes sobre los que requieren más de 25 bases para valores de Tm elevados.
5
En determinadas realizaciones, tales como oligómeros PMO, la actividad antisentido de un oligómero puede potenciarse usando una mezcla de uniones fosforodiamidato no cargadas y catiónicas, como se ilustra en la figura 1C. La cantidad total de uniones catiónicas en el oligómero puede variar de 1 a 10 (incluyendo todos los números enteros entremedias), y pueden estar intercaladas a lo largo de todo el oligómero. Preferentemente, la cantidad de 10 uniones cargadas es de al menos 2 y no más de la mitad de las uniones totales de la estructura, por ejemplo, entre 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 uniones cargadas positivamente y preferentemente cada unión cargada está separada a lo largo de la estructura por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 uniones no cargadas. Una unión catiónica preferente de la invención incluye la unión apn B10 como se muestra en la tabla 3.
15 Las secuencias de antisentido ejemplares para dirigirlas al preARNm de LMNA humana se muestran en la tabla 1 a continuación. Los oligonucleótidos de antisentido pueden comprender la totalidad o una parte de estas secuencias de dirección.
Tabla 2. Secuencias de dirección a HGPS ejemplares*
Nombre de PMO
Secuencia de dirección 5' - 3' SEQ ID NO:
Exo11.25.133
CCGCTGGCAGATGCCTTGTCGGCAG 3
Exo11.25.138
CTGAGCCGCTGGCAGATGCCTTGTC 4*
Exo11.25.142
GCTCCTGAGCCGCTGGCAGATGCCT 5*
Exo11.25.145
TGGGCTCCTGAGCCGCTGGCAGATG 6
Exo11.25.149
CACCTGGGCTCCTGAGCCGCTGGCA 7
Exo11.25.154
CCACCCACCTGGGCTCCTGAGCCGC 8
Exo11.25.158
GGGTCCACCCACCTGGGCTCCTGAG 9
Exo11.25.162
AGATGGGTCCACCCACCTGGGCTCC 10*
Exo11.25.166
GAGGAGATGGGTCCACCCACCTGGG 11*
Exo11.25.170
GCCAGAGGAGATGGGTCCACCCACC 12
Exo11.25.174
AAGAGCCAGAGGAGATGGGTCCACC 13*
Exo11.25.177
CAGAAGAGCCAGAGGAGATGGGTCC 14*
Exo11.25.181
GAGGCAGAAGAGCCAGAGGAGATGG 15
Exo11.25.185
ACTGGAGGCAGAAGAGCCAGAGGAG 16*
Exo10SD.25.69
ACGTGGTGGTGATGGAGCAGGTCAT 17
Exo10SD.25.73
ACTCACGTGGTGGTGATGGAGCAGG 18
Exo10SD.25.79
GCT ACCACT CACGTGGT GGT GAT GG 19
Exo10SD.25.84
CGGCGGCTACCACTCACGTGGTGGT 20
Exo10SD.25.87
CAGCGGCGGCTACCACTCACGTGGT 21
Exo10SD.25.90
CCTCAGCGGCGGCTACCACTCACGT 22
Exo10SD.25.92
GGCCTCAGCGGCGGCTACCACTCAC 23
Exo10SD.25.96
GCTCGGCCTCAGCGGCGGCTACCAC 24
Exo11SA.25.779
CGAGTCTGGGACTGACCACTCAGGC 25
Exo11SA.25.796
AGGCTCAGGCGGGACGGCGAGTCTG 26
Exo11SA.25.801
AGACAAGGCTCAGGCGGGACGGCGA 27
Exo11SA.25.805
AGGGAGACAAGGCT CAGGCGGGACG 28
Exo11SA.25.809
GGGAAGGGAGACAAGGCTCAGGCGG 29
Exo11SA.25.814
GCCCTGGGAAGGGAGACAAGGCTCA 30
Exo11SA.25.820
GTGGGAGCCCTGGGAAGGGAGACAA 31
5
10
15
20
25
30
Nombre de PMO
Secuencia de dirección 5' - 3' SEQ ID NO:
Exo11SA.25.828
CTGCTGCAGTGGGAGCCCTGGGMG 32
Exo11SA.25.830
AGCTGCTGCAGTGGGAGCCCTGGGA 33
Exo11SA.25.836
CCCCCGAGCTGCTGCAGTGGGAGCC 34
HsEx10
GCTACCACTCACGTGGTGGTGATGG-AcR6G 35
HsEx11
GGGTCCACCCACCTGGGCTCCTGAG-AcR6G 36
HsEx10-apn
GCaPnTACCACaPnTCACGaPnTGGTGGaPnTGATGG 37
HsEx11-apn
GGGaPnTCCACCCACCaPnTGGGCaPnTCCaPnTGAG 38
* cubierto por las reivindicaciones ** AcR6G se refiere a un transportador peptídico de penetración celular preferente (R6 acilado; SEQ ID NO: 45) conjugado con un conector de glicina al extremo 3' de una secuencia de dirección ejemplar. La apnT en las SEQ ID NO: 19 y 20 se refiere a una unión entre subunidades apn como se describe adicionalmente a continuación en la tabla 3, unión B10.
Compuestos oligonucleotídicos de antisentido
Los oligonucleótidos de antisentido de la presente invención normalmente (a) tienen la capacidad de captarse activamente por células de mamífero, y (b) una vez captados, forman un dúplex con el ARN diana con una Tm mayor de aproximadamente 45 °C. En determinadas realizaciones, la estructura del oligómero puede estar sustancialmente no cargada y, preferentemente, puede reconocerse como un sustrato para transporte activo o facilitado a través de la membrana celular. La capacidad del oligómero de formar un dúplex estable con el ARN diana también puede estar relacionada con otras características de la estructura del oligómero, incluyendo la longitud y el grado de complementariedad del oligómero de antisentido con respecto a la diana, la relación de emparejamiento de bases G:C a A:T y las posiciones de cualquier base emparejada incorrectamente. La capacidad del oligómero de antisentido de resistir las nucleasas celulares puede promover la supervivencia y finalmente el suministro del agente al citoplasma celular. Se incluyen oligómeros de antisentido compuestos de agentes químicos basados en PMO, PMO+ (PMOplus), PMO-X, ANB, APN y/o 2'O-Me, descritos en el presente documento. En general, los agentes químicos de APN y ANB utilizan oligómeros de dirección más cortos debido a su fuerza de unión a diana relativamente elevada en comparación con oligómeros PMO y 2'O-Me.
Los ácidos peptidonucleicos (APN) son análogos de ADN en que la estructura es estructuralmente homomorfa con una estructura de desoxirribosa, que consiste en unidades de N-(2-aminoetil) glicina a las que unen bases de pirimidina o purina. Los APN que contienen bases naturales de pirimidina y purina hibridan con oligonucleótidos complementarios que cumplen las normas de emparejamiento de bases de Watson-Crick e imitan el ADN en términos de reconocimiento de pares de bases (Egholm, Buchardt et al. 1993). La estructura de los APN se forma por enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster, que los hacen muy adecuados para aplicaciones de antisentido (véase la estructura a continuación). La estructura no está cargada, lo que produce dúplex de APN/ADN o APN/ARN que muestran estabilidad térmica mayor de la normal. Los APN no se reconocen por nucleasas o proteasas.
Los APN se producen sintéticamente usando cualquier técnica conocida en la técnica. El APN es un análogo de ADN en que una estructura de poliamida remplaza el anillo de fosfato y ribosa tradicional de ADN como se muestra a continuación.
imagen12
A pesar de un cambio estructural radical en la estructura natural del ARN o el ADN, el APN puede unirse de forma específica de secuencia en forma de hélice al ADN o el ARN. Las características del APN incluyen una alta afinidad 5 de unión a ADN o ARN complementario, un efecto desestabilizante causado por emparejamiento incorrecto de una única base, resistencia a nucleasas y proteasas, hibridación con ADN o ARN independiente de la concentración salina y formación de hélices triples con ADN de homopurina. Panagene™ ha desarrollado sus monómeros de APN patentados Bts (Bts; grupo benzotiazol-2-sulfonilo) y un proceso de oligomerización patentado. La oligomerización de APN usando monómeros de APN Bts está compuesta de ciclos repetitivos de desprotección, acoplamiento y 10 recubrimiento. Las patentes de Panagene para esta tecnología incluyen US 6969766, 7211668, 7022851, 7125994, 7145006 y 7179896. Las patentes de los Estados Unidos representativas que muestran la preparación de dichos compuestos de APN incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos n.° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Pueden encontrarse contenidos adicionales de compuestos de APN en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497.
15
Los compuestos oligonucleotídicos también pueden contener subunidades de "ácido nucleico bloqueado" (ANB). Las estructuras de ANB son conocidas en la técnica: por ejemplo, Wengel, et al., Chemical Communications (1998) 455; Tetrahedron (1998) 54, 3607 y Accounts of Chem. Research (1999) 32, 301); Obika, et al., Tetrahedron Letters (1997) 38, 8735; (1998) 39, 5401 y Bioorganic Medicinal Chemistry (2008)16, 9230. Se ilustran estructuras no 20 limitantes y ejemplares de ANB a continuación:
imagen13
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
imagen14
Los compuestos de la invención pueden incorporar uno o más ANB. Los métodos para la síntesis de subunidades nucleosídicas individuales de ANB y su incorporación en oligonucleótidos son conocidos en la técnica: patentes de Estados Unidos 7.572.582; 7.569.575; 7.084.125; 7.060.809; 7.053.207; 7.034.133; 6.794.499; y 6.670.461. Los conectores típicos entre subunidades incluyen restos fosfodiéster y fosforotioato; como alternativa, pueden emplearse conectores que no contienen fósforo. Una realización preferente es un ANB que contiene un compuesto donde la subunidad de ANB está separada por una subunidad de ADN (es decir, un nucleótido de desoxirribosa). Compuestos preferentes adicionales están compuestos de subunidades alternas de ANB y ADN, donde el conector entre subunidades es fosforotioato.
Una estructura de oligómero preferente emplea subunidades basadas en morfolino que albergan restos de emparejamiento de bases, unidos por uniones no cargadas, como se describe anteriormente. Se prefiere especialmente un oligómero de morfolino unido por fosforodiamidato (PMO) sustancialmente no cargado. Los oligonucleótidos de morfolino, incluyendo oligómeros de antisentido, se detallan, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.185.444, 5.521.063 y 5.506.337 del mismo propietario que la presente, y en la solicitud PCT n.° US08/088339.
Determinadas propiedades de las subunidades basadas en morfolino incluyen: la capacidad de unirse en una forma oligomérica por uniones de estructura no cargas y estables; la capacidad de mantener una base nucleotídica (por ejemplo, adenina, citosina, guanina o uracilo), de manera que el polímero formado puede hibridar con un ácido nucleico diana de bases complementarias, incluyendo ARN diana, con elevada Tm, incluso con oligómeros tan cortos como de 10-14 bases; la capacidad del oligómero de transportarse activamente en células de mamífero; y la capacidad del heterodúplex de oligómero:ARN de resistir la degradación con RNasa.
Las propiedades de las subunidades basadas en morfolino incluyen: 1) la capacidad de unirse en una forma oligomérica por uniones de estructura no cargadas o cargadas positivamente y estables; 2) la capacidad de mantener una base nucleotídica (por ejemplo, adenina, citosina, guanina, timidina, uracilo e hipoxantina), de manera que el polímero formado puede hibridar con un ácido nucleico diana de bases complementarias, incluyendo ARN diana, a valores de Tm por encima de aproximadamente 45 °C en oligonucleótidos relativamente cortos (por ejemplo, 10-15 bases); 3) la capacidad del oligonucleótido de transportarse de forma activa o pasiva en células de mamífero; y 4) la capacidad del heterodúplex de oligonucleótido de antisentido:ARN de resistir la degradación por RNasa y RNasaH, respectivamente.
Los ejemplos de oligonucleótidos de morfolino que tienen uniones de estructura que contienen fósforo se ilustran en las figuras 1A-1C. Un oligonucleótidos de morfolino unido por fosforodiamidato preferente se muestra en la figura 1C, que está modificado, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, para que contenga grupos cargados positivamente en preferentemente un 10 %-50 % de sus uniones de la estructura. Las estructuras centrales ejemplares para oligonucleótidos de antisentido de la presente materia reivindicada incluyen los tipos de subunidad morfolino mostrados en las figuras 1A-1C, cada una unida por una unión de subunidades que contiene fósforo, no cargada o cargada positivamente. La figura 1D muestra una unión que contiene fósforo que forma la estructura de unidad repetitiva de cinco átomos, donde los anillos de morfolino están unidos por una unión fosfoamida de 1 átomo. La figura 1E muestra una unión que produce una estructura de unidad repetitiva de 6 átomos. En esta estructura, el átomo Y que une el carbono 5' de morfolino al grupo fósforo puede ser azufre, nitrógeno, carbono o, preferentemente, oxígeno. El resto X colgante del fósforo puede ser flúor, un alquilo o alquilo sustituido, un alcoxi o alcoxi sustituido, un tioalcoxi o tioalcoxi sustituido, o nitrógeno sin sustituir, monosustituido o disustituido, incluyendo estructuras cíclicas, tales como morfolinas o piperidinas. Alquilo, alcoxi y tioalcoxi preferentemente incluyen 1-6 átomos de carbono. Los restos Z son azufre u oxígeno, y son preferentemente oxígeno.
Las uniones mostradas en las figuras 1F y 1G están diseñadas para estructuras de 7 átomos de longitud de unidad. En la figura 1F, el resto X es como en la figura 1E, y el resto Y puede ser metileno, azufre o, preferentemente, oxígeno. En la figura 1G, los restos X e Y son como en la figura 1E. Los oligonucleótidos de morfolino particularmente preferentes incluyen los compuestos de estructuras de subunidad morfolino de la forma mostrada en la figura 1E, donde X=NH2, N(CH3)2 o 1-piperazina u otro grupo cargado, Y=O y Z=O.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Como se indica anteriormente, el oligonucleótido sustancialmente no cargado puede modificarse, de acuerdo con un aspecto de la invención, para que incluya uniones cargadas, por ejemplo, hasta aproximadamente 1 por cada 2-5 uniones no cargadas, tal como aproximadamente 4-5 por cada 10 uniones no cargadas. En determinadas realizaciones, la mejora óptima en la actividad antisentido puede observarse cuando aproximadamente un 25 % de las uniones de la estructura son catiónicas. En determinadas realizaciones, la potenciación puede observarse con una cantidad pequeña, por ejemplo, un 10-20 % de uniones catiónicas, o cuando la cantidad de uniones catiónicas está en el intervalo de un 50-80 %, tal como aproximadamente un 60 %. La potenciación observada con cargas estructurales catiónicas añadidas puede, en algunos casos, potenciarse adicionalmente distribuyendo la mayor parte de las cargas cerca de las uniones de la estructura de la "región central" del oligonucleótido de antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido de 20 monómeros con 8 uniones de estructura catiónicas, que tiene al menos un 70 % de estas uniones cargadas ubicadas en las 10 uniones más centrales.
Los compuestos de antisentido de la invención pueden prepararse por síntesis en fase sólida por etapas, empleando métodos detallados en las referencias citadas anteriormente, y a continuación con respecto a la síntesis de oligonucleótidos que tienen una mezcla de uniones de estructura no cargadas y catiónicas. En algunos casos, puede ser deseable añadir agentes químicos adicionales al compuestos de antisentido, por ejemplo, para potenciar la farmacocinética o para facilitar la captura o detección del compuesto. Dicho resto puede adherirse covalentemente, normalmente a un extremo del oligómero, de acuerdo con métodos sintéticos convencionales. Por ejemplo, la adición de un resto de polietilenglicol u otro polímero hidrófilo, por ejemplo, uno que tiene 10-100 subunidades monoméricas, puede ser útil para potenciar la solubilidad. Uno o más grupos cargados, por ejemplo, grupos cargados aniónicos tales como un ácido orgánico, pueden potenciar la captación celular.
Un resto indicador, tal como fluoresceína o un grupo radiomarcado, puede adherirse con fines de detección. Como alternativa, el marcador indicador adherido al oligómero puede ser un ligando, tal como un antígeno o biotina, que puede unirse a un anticuerpo marcado o estreptavidina. En la selección de un resto para la adhesión o modificación de un compuesto de antisentido, en general es deseable, por supuesto, seleccionar compuestos químicos de grupos que son biocompatible y probablemente se toleren por un sujeto sin efectos secundarios indeseables.
Como se indica anteriormente, pueden construirse determinados compuestos de antisentido para que contengan una cantidad seleccionada de uniones catiónicas intercaladas con uniones no cargadas del tipo descrito anteriormente. Las uniones entre subunidades, tanto no cargadas como catiónicas, preferentemente son uniones que contienen fósforo, que tienen la estructura:
imagen15
donde
W es S u O, y es preferentemente O,
X = NR1R2 u OR6,
Y = O o NR7,
y cada una de dichas uniones en el oligómero se selecciona de:
(a) unión no cargada (a), donde cada uno de R1, R2, R6 y R7 se selecciona independientemente de hidrógeno y alquilo inferior;
(b1) unión catiónica (b1), donde X = NR R e Y = O, y NR R representa un grupo piperazino opcionalmente sustituido, de modo que R1R2 = -CHRCHRN(R3)(R4)CHRCHR-, donde cada R es independientemente H o CH3,
R4 es H, CH3, o un par de electrones, y
R3 se selecciona de H, alquilo inferior, por ejemplo, CH3, C(=NH)NH2, Z-L-NHC(=NH)NH2, y [C(O)CHR'NH]mH, donde: Z es C(O) o un enlace directo, L es un conector opcional de hasta 18 átomos de longitud, preferentemente de hasta 12 átomos y más preferentemente de hasta 8 átomos de longitud, que tienen enlaces seleccionados de alquilo, alcoxi y alquilamino, R' es una cadena lateral de un aminoácido de origen natural o un homólogo de uno o dos carbonos del mismo, y m es de 1 a 6, preferentemente de 1 a 4; (b2) unión catiónica (b2), donde X = NR1R2 e Y = O, R1 = H o CH3, y R2 = LNR3R4R5, donde L, R3, y R4 son como se definen anteriormente, y R5 es H, alquilo inferior o (alcoxi)alquilo inferior; y
(b3) unión catiónica (b3), donde Y = NR7 y X = OR6, y R7 = LnR3R4R5, donde L, R3, R4 y R5 son como se definen anteriormente, y R6 es H o alquilo inferior;
5
10
15
20
25
En determinadas realizaciones, un oligómero puede incluir al menos dos uniones consecutivas de tipo (a) (es decir, uniones no cargadas). En realizaciones adicionales, al menos un 5 % de las uniones en el oligómero son uniones catiónicas (es decir, de tipo (b1), (b2) o (b3)); por ejemplo, de un 10 % a un 60 % y preferentemente un 20-50 % de las uniones pueden ser uniones catiónicas.
En una realización, al menos una unión es de tipo (b1), donde, preferentemente, cada R es H, R4 es H, CH3, o un par de electrones, y R3 se selecciona de H, alquilo inferior, por ejemplo, CH3, C(=NH)NH2, y C(O)-L-NHC(=NH)NH2. Las dos últimas realizaciones de R3 proporcionan un resto guanidino, adherido directamente al anillo piperazina o colgante a un grupo conector L, respectivamente. Para facilitar la síntesis, la variable Z en R3 es preferentemente C(O) (carbonilo), como se muestra.
El grupo conector L, como se indica anteriormente, contiene enlaces en su estructura seleccionados de alquilo (por ejemplo, -CH2-CH2-), alcoxi (-C-O-) y alquilamino (por ejemplo, -CH2-NH-), con la condición de que los átomos terminales en L (por ejemplo, los adyacentes a carbonilo o nitrógeno) sean átomos de carbono. Aunque las uniones ramificadas (por ejemplo, -CH2-CHCH3-) son posibles, el conector preferentemente no está ramificado. En una realización, el conector es un conector de hidrocarburo. Dicho conector puede tener la estructura -(CH2)n-, donde n es 1-12, preferentemente 2-8 y más preferentemente 2-6.
Las subunidades morfolino pueden tener la estructura:
imagen16
donde Pi es un resto de emparejamiento de bases, y las uniones representadas anteriormente conectan el átomo de nitrógeno de (i) al carbono 5' de una subunidad adyacente. Los restos de emparejamiento de bases Pi pueden ser iguales o diferentes, y en general se diseñan para proporcionar una secuencia que se una a un ácido nucleico diana. El uso de realizaciones de los tipos de unión (b1), (b2) y (b3) anteriores para unir subunidades morfolino puede ilustrarse de forma gráfica de la siguiente manera:
imagen17
Preferentemente, todas las uniones catiónicas en el oligómero son del mismo tipo; es decir, todas de tipo (b1), todas de tipo (b2) o todas de tipo (b3).
5
En realizaciones adicionales, las uniones catiónicas se seleccionan de uniones (b1') y (b1'') como se muestra a continuación, donde (b1'') se menciona en el presente documento como unión "Pip" y (b1'') se menciona en el presente documento como unión "GuX":
10
imagen18
imagen19
En las estructuras anteriores, W es S u O, y es preferentemente O; cada uno de R1 y R2 se selecciona 15 independientemente de hidrógeno y alquilo inferior, y es preferentemente metilo; y A representa hidrógeno o un sustituyente no interferente en uno o más átomos de carbono en (b1') y (b1''). Preferentemente, los carbonos del anillo en el anillo de piperazina están sin sustituir; sin embargo, pueden incluir sustituyentes no interferentes, tales como metilo o flúor. Preferentemente, como mucho uno o dos átomos de carbono están sustituidos de esta manera. En realizaciones adicionales, al menos un 10 % de las uniones son de tipo (b1') o (b1''); por ejemplo, un 10 %-60 % 20 y preferentemente de un 20 % a un 50 %, de las uniones pueden ser de tipo (b1') o (b1'').
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En determinadas realizaciones, el oligómero no contiene uniones del tipo (b1') anterior. Como alternativa, el oligómero no contiene uniones de tipo (b1), donde cada R es H, R3 es H o CH3, y R4 es H, CH3, o un par de electrones.
Las subunidades morfolino también pueden unirse por uniones entre subunidades que no están basadas en fósforo, como se describe adicionalmente a continuación, donde al menos una unión está modificada con un grupo catiónico colgante como se describe anteriormente.
Podrían usarse otras uniones de análogos oligonucleotídicos que no están cargados en su estado sin modificar, pero que podrían albergar también un sustituyente amina colgante. Por ejemplo, podría emplearse un átomo de nitrógeno 5' en un anillo morfolino en una unión sulfamida o una unión urea (donde el fósforo está remplazado con carbono o azufre, respectivamente) y modificado de manera análoga al átomo de nitrógeno 5' en la estructura (b3) anterior.
Se proporcionan oligómeros que tienen incontables uniones catiónicas, incluyendo oligómeros completamente con uniones catiónicas. Preferentemente, sin embargo, los oligómeros están parcialmente cargados, que tienen, por ejemplo, un 10 %-80 %. En realizaciones preferentes, aproximadamente de un 10 % a un 60 %, y preferentemente de un 20 % a un 50 % de las uniones son catiónicas.
En una realización, las uniones catiónicas están intercaladas a lo largo de la estructura. Los oligómeros parcialmente cargados preferentemente contienen al menos dos uniones no cargadas consecutivas; es decir, el oligómero preferentemente no tiene un patrón estrictamente alterno a lo largo de su longitud completa.
También se consideran oligómeros que tienen bloques de uniones catiónicas y bloques de uniones no cargadas; por ejemplo, un bloque central de uniones no cargadas puede estar flanqueado por bloques de uniones catiónicas, o viceversa. En una realización, el oligómero tiene regiones 5', 3' y centrales de aproximadamente la misma longitud, y el porcentaje de uniones catiónicas en la región central es mayor de aproximadamente un 50 %, preferentemente mayor de aproximadamente un 70 %.
Los oligómeros para su uso en aplicaciones antisentido generalmente varían en su longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 subunidades, más preferentemente de aproximadamente 10 a 30 subunidades, y normalmente de 15-25 bases. Por ejemplo, un oligómero de la invención que tiene 19-20 subunidades, una longitud útil para un compuesto de antisentido, puede tener de forma ideal de dos a diez, por ejemplo, de cuatro a ocho, uniones catiónicas, y el resto uniones no cargadas. Un oligómero que tiene 14-15 subunidades puede tener de forma ideal de dos a siete, por ejemplo, 3, 4 o 5, uniones catiónicas, y el resto uniones no cargadas.
Cada estructura cíclica de morfolino mantiene un resto de emparejamiento de bases, para formar una secuencia de restos de emparejamiento de bases que normalmente está diseñado para hibridar con una diana de antisentido seleccionada en una célula o en un sujeto que se está tratando. El resto de emparejamiento de bases puede ser una purina o pirimidina encontrada en ADN o ARN natural (por ejemplo, A, G, C, T o U) o un análogo, tal como hipoxantina (el componente de base del nucleósido inosina) o 5-metil citosina.
Como se indica anteriormente, determinadas realizaciones se refieren a oligómeros que comprenden uniones entre subunidades novedosas, incluyendo oligómeros PMO-X y aquellos que tienen grupos terminal modificados. En algunas realizaciones, estos oligómeros tienen mayor afinidad por ADN y ARN que los oligómeros no modificados correspondientes y demuestran mejoras en el suministro celular, la potencia y/o las propiedades de distribución tisular en comparación con oligómeros que tienen otras uniones entre subunidades. En una realización, los oligómeros comprenden al menos una unión entre subunidades de tipo (B) como se define en el presente documento. Los oligómeros también pueden comprender una o más uniones entre subunidades de tipo (A) como se define en el presente documento. Las características estructural y propiedades de los diversos tipos de unión y oligómeros se describen en más detalle en el siguiente análisis. La síntesis de estos oligómeros y oligómeros relacionados se describe en la solicitud de Estados Unidos n.° 13/118.298 del mismo propietario que la presente, que se incorpora por referencia en su totalidad.
Unión (A)
Los solicitantes han descubierto que la potenciación de la actividad antisentido, la biodistribución y/u otras propiedades deseables pueden optimizarse preparando oligómeros que tienen uniones entre subunidades. Por ejemplo, los oligómeros pueden comprender opcionalmente una o más uniones entre subunidades de tipo (A), y en determinadas realizaciones, los oligómeros comprenden al menos una unión de tipo (A). En algunas otras realizaciones, cada unión de tipo (A) tiene la misma estructura. Las uniones de tipo (A) pueden incluir uniones divulgadas en la patente de Estados Unidos n.° 7.943.762 del mismo propietario que la presente, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. La unión (A) tiene la siguiente estructura (I), en la que 3' y 5' indican el punto de adhesión a los extremos 3' y 5', respectivamente, del anillo morfolino (es decir, la estructura (i) analizada a continuación):
5
10
15
20
25
30
35
40
45
W
imagen20
JVNAAA.
5'
I
o una sal o isómero de la misma, en la que:
W es, en cada caso, independientemente S u O;
X es, en cada caso, independientemente -N(CH3)2, -NR1R2, -OR3 o;
imagen21
Y es, en cada caso, independientemente O o -NR2,
R1 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo;
R2 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o -LNR4R5R7;
R3 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6;
R4 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C6, -C(=NH)NH2, -Z-L-NHC(=NH)NH2 o - [C(=O)CHR'NH]mH, donde Z es -C(=O)- o un enlace directo, R' es una cadena lateral de un aminoácido de origen natural o un homólogo de uno o dos carbonos del mismo, y m es de 1 a 6;
R5 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, metilo o un par de electrones;
R6 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo;
R7 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C6 o alcoxialquilo C1-C6; y L es un conector opcional de hasta 18 átomos de longitud que comprende grupos alquilo, alcoxi o alquilamino, o combinaciones de los mismos.
En algunos ejemplos, el oligómero comprende al menos una unión de tipo (A). En algunas otras realizaciones, el oligómero incluye al menos dos uniones consecutivas de tipo (A). En realizaciones adicionales, al menos un 5 % de las uniones en el oligómero son de tipo (A); por ejemplo, en algunas realizaciones, un 5 %-95 %, de un 10 % a un 90 %, de un 10 % a un 50 % o de un 10 % a un 35 % de las uniones pueden ser la unión de tipo (A). En algunas realizaciones específicas, al menos una unión de tipo (A) es -N(CH3)2. En otras realizaciones, cada unión de tipo (A) es -N(CH3)2. En otras realizaciones, al menos una unión de tipo (A) es piperizin-1-ilo, por ejemplo, piperazin-1-ilo sin sustituir (por ejemplo, A2 o A3). En otras realizaciones, cada unión de tipo (A) es piperizin-1-ilo, por ejemplo, piperazin-1-ilo sin sustituir.
En algunas realizaciones, W es, en cada caso, independientemente S u O, y en determinadas realizaciones W es O.
En algunas realizaciones, X es, en cada caso, independientemente -N(CH3)2, -NR1R2, -OR3. En algunas realizaciones X es -N(CH3)2. En otros aspectos X es -NR1R2, y en otros ejemplos X es -OR3.
En algunas realizaciones, R1 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo. En algunas realizaciones, R1 es hidrógeno. En otras realizaciones X es metilo.
En algunas realizaciones, R2 es, en cada caso, hidrógeno. En otras realizaciones R2 es, en cada caso, -LNR4R5R7. En algunas realizaciones, R3 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6. En otras realizaciones, R3 es metilo. En otras realizaciones más, R3 es etilo. En algunas otras realizaciones, R3 es n-propilo o isopropilo. En algunas otras realizaciones, R3 es alquilo C4. En otras realizaciones, R3 es alquilo C5. En algunas realizaciones, R3 es alquilo C6.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En determinadas realizaciones, R4 es, en cada caso, independientemente hidrógeno. En otras realizaciones, R4 es metilo o etilo. En otras realizaciones más, R4 es -C(=NH)NH2, y en otras realizaciones, R4 es -Z-L-NHC(=NH)NH2. En otras realizaciones adicionales, R4 es -[C(=O)CHR'NH]mH. Z es -C(=O)- en una realización y Z es un enlace directo en otra realización. R' es una cadena lateral de un aminoácido de origen natural. En algunas realizaciones, R' es un homólogo de uno o dos carbonos de una cadena lateral de un aminoácido de origen natural.
m es un número entero de 1 a 6. m puede ser 1. m puede ser 2. m puede ser 3. m puede ser 4. m puede ser 5. m puede ser 6.
En algunas realizaciones, R5 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, metilo o un par de electrones. En algunas realizaciones, R5 es hidrógeno. En otras realizaciones, R5 es metilo. En otras realizaciones más, R5 es un par de electrones.
En algunas realizaciones, R6 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo. En algunas realizaciones, R6 es hidrógeno. En otras realizaciones, R6 es metilo.
En otras realizaciones, R7 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C6 o alcoxialquilo C2-C6. En algunas realizaciones, R7 es hidrógeno. En otras realizaciones, R7 es alquilo C1-C6. En otras realizaciones más, R7 es alcoxialquilo C2-C6. En algunas realizaciones, R7 es metilo. En otras realizaciones, R7 es etilo. En otras realizaciones más, R7 es n-propilo o isopropilo. En algunas otras realizaciones, R7 es alquilo C4. En algunas realizaciones, R7 es alquilo C5. En algunas realizaciones, R7 es alquilo C6. En otras realizaciones más, R7 es alcoxialquilo C2. En algunas otras realizaciones, R7 es alcoxialquilo C3. En otras realizaciones más, R7 es alcoxialquilo C4. En algunas realizaciones, R7 es alcoxialquilo C5. En otras realizaciones, R7 es alcoxialquilo C6.
El grupo conector L, como se indica anteriormente, contiene enlaces en su estructura seleccionados de alquilo (por ejemplo, -CH2-CH2-), alcoxi (por ejemplo, -C-O-C-) y alquilamino (por ejemplo, -CH2-NH-), con la condición de que los átomos terminales en L (por ejemplo, los adyacentes a carbonilo o nitrógeno) sean átomos de carbono. Aunque son posibles uniones ramificadas (por ejemplo, -CH2-CHCH3-), el conector generalmente no está ramificado. En una realización, el conector es un conector de hidrocarburo. Dicho conector puede tener la estructura (CH2)n-, donde n es 1-12, preferentemente 2-8 y más preferentemente 2-6.
Se proporcionan oligómeros que tienen incontables uniones de tipo (A). En algunas realizaciones, el oligómero no contiene uniones de tipo (A). En determinadas realizaciones, un 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 por ciento de las uniones son la unión (A). En realizaciones seleccionadas, de un 10 a un 80, de un 20 a un 80, de un 20 a un 60, de un 20 a un 50, de un 20 a un 40 o de un 20 a un 35 por ciento de las uniones son la unión (A).
Unión (B)
En algunas realizaciones, los oligómeros comprenden al menos una unión de tipo (B). Por ejemplo, los oligómeros pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más uniones de tipo (B). Las uniones de tipo (B) pueden estar adyacentes o pueden estar intercaladas por todo el oligómero. La unión de tipo (B) tiene la siguiente estructura (I):
W
imagen22
«AAAAA»
5’
(O
o una sal o isómero de la misma, en la que:
W es, en cada caso, independientemente S u O,
X es, en cada caso, independientemente -NR8R9 u -OR3; e Y es, en cada caso, independientemente O o -NR10,
R3 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6;
R8 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C2-C12;
R9 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12, aralquilo C1-C12 o arilo;
R10 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12 o -LNr4R5R7;
8 9 8 9 3
en el que R y R pueden unirse para formar un heterociclo mono- o bicíclico de 5-18 miembros o R , R o R pueden unirse con R10 para formar un heterociclo de 5-7 miembros, y en el que, cuando X es 4-piparazino, X tiene la siguiente estructura (III):
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
imagen23
en la que:
R11 es, en cada caso, independientemente alquilo C2-C12, aminoalquilo C1-C12, alquilcarbonilo C1-C12, arilo, heteroarilo o heterociclilo;
R es, en cada caso, independientemente un par de electrones, hidrógeno o alquilo C1-C12; y R12 es, en cada caso, independientemente, hidrógeno, alquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12, -NH2, -NR13R14, - NR13R14R15, alquilcarbonilo C1-C12, oxo, -CN, trifluorometilo, amidilo, amidinilo, amidinilalquilo,
amidinilalquilcarbonil guanidinilo, guanidinilalquilo, guanidinilalquilcarbonilo, colato, desoxicolato, arilo, heteroarilo, heterociclo, -SR13 o alcoxi C1-C12, en la que R13, R14 y R15 son, en cada caso, independientemente alquilo C1-C12.
En algunos ejemplos, el oligómero comprende una unión de tipo (B). En algunas otras realizaciones, el oligómero comprende dos uniones de tipo (B). En algunas otras realizaciones, el oligómero comprende tres uniones de tipo (B). En algunas otras realizaciones, el oligómero comprende cuatro uniones de tipo (B). En otras realizaciones adicionales, las uniones de tipo (B) son consecutivas (es decir, las uniones de tipo (B) están adyacentes entre sí). En otras realizaciones, al menos un 5 % de las uniones en el oligómero son de tipo (B); por ejemplo, en algunas realizaciones, un 5 %-95 %, de un 10 % a un 90 %, de un 10 % a un 50 % o de un 10 % a un 35 % de las uniones pueden ser la unión de tipo (B).
En otras realizaciones, R3 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6. En otras realizaciones más, R3 puede ser metilo. En algunas realizaciones, R3 puede ser etilo. En algunas otras realizaciones, R3 puede ser n-propilo o isopropilo. En otras realizaciones más, R3 puede ser alquilo C4. En algunas realizaciones, R3 puede ser alquilo C5. En algunas realizaciones, R3 puede ser alquilo C6.
En algunas realizaciones, R8 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C2-C12. En algunas realizaciones, R8 es hidrógeno. En otras realizaciones más, R8 es etilo. En algunas otras realizaciones, R8 es n- propilo o isopropilo. En algunas realizaciones, R8 es alquilo C4. En otras realizaciones más, R8 es alquilo C5. En otras realizaciones, R8 es alquilo C6. En algunas realizaciones, R8 es alquilo C7. En otras realizaciones más, R8 es alquilo C8. En otras realizaciones, R8 es alquilo Cg. En otras realizaciones más, R8 es alquilo C10. En algunas otras realizaciones, R8 es alquilo C11. En otras realizaciones más, R8 es alquilo C12. En algunas otras realizaciones, R8 es alquilo C2-C12 y el alquilo C2-C12 incluye uno o más dobles enlaces (por ejemplo, alqueno), triples enlaces (por ejemplo, alquino) o ambos. En algunas realizaciones, R8 es alquilo C2-C12 sin sustituir.
En algunas realizaciones, Rg es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12, aralquilo C1-C12 o arilo. En algunas realizaciones, Rg es hidrógeno. En otras realizaciones más, Rg es alquilo C1-C12. En otras realizaciones, Rg es metilo. En otras realizaciones más, Rg es etilo. En algunas otras realizaciones, Rg es n-propilo o isopropilo. En algunas realizaciones, Rg es alquilo C4. En algunas realizaciones, Rg es alquilo C5. En otras realizaciones más, Rg es alquilo Ce. En algunas otras realizaciones, Rg es alquilo C7. En algunas realizaciones, Rg es alquilo C8. En algunas realizaciones, Rg es alquilo Cg. En algunas otras realizaciones, Rg es alquilo C10. En algunas otras realizaciones, Rg es alquilo C11. En otras realizaciones más, Rg es alquilo C12.
En algunas otras realizaciones, Rg es aralquilo C1-C12. Por ejemplo, en algunas realizaciones, Rg es bencilo y el bencilo puede estar opcionalmente sustituido en el anillo fenilo o el carbono bencílico. Los sustituyentes a este respecto incluyen grupos alquilo y alcoxi, por ejemplo, metilo o metoxi. En algunas realizaciones, el grupo bencilo está sustituido con metilo en el carbono bencílico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, Rg tiene la siguiente estructura (XIV):
5
10
15
20
25
30
imagen24
En otras realizaciones, R9 es arilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R9 es fenilo, y el fenilo puede estar opcionalmente sustituido. Los sustituyentes a este respecto incluyen sustituyentes de grupos alquilo y alcoxi, por ejemplo, metilo o metoxi. En otras realizaciones, R9 es fenilo y el fenilo comprende un resto de éter corona, por ejemplo, un éter corona de 12-18 miembros. En una realización, el éter corona es de 18 miembros y puede comprender además un resto fenilo adicional. Por ejemplo, en una realización, R9 tiene una de las siguientes estructuras (XV) o (XVI):
imagen25
En algunas realizaciones, R10 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12 o -LNR4R5R7, en la que R4, R5 y R7 son como se definen anteriormente con respecto a la unión (A). En otras realizaciones, R10 es hidrógeno. En otras realizaciones, R10 es alquilo C1-C12, y en otras realizaciones R10 es -LNR4R5R7. En algunas realizaciones, R es metilo. En otras realizaciones más, R es etilo. En algunas realizaciones, R es alquilo C3. En
algunas realizaciones, R10 es alquilo C4. En otras realizaciones más, R10 es alquilo C5. En algunas otras 10 10 10 realizaciones, R es alquilo C6. En otras realizaciones, R es alquilo C7. En otras realizaciones más, R es alquilo
Ce. En algunas realizaciones, R10 es alquilo C9. En otras realizaciones, R10 es alquilo C10. En otras realizaciones más, R10 es alquilo C11. En algunas otras realizaciones, R10 es alquilo C12.
En algunas realizaciones, Re y R9 se unen para formar un heterociclo mono- o bicíclico de 5-18 miembros. En algunas realizaciones, el heterociclo es un heterociclo monocíclico de 5 o 6 miembros. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la unión (B) tiene la siguiente estructura (IV):
imagen26
En otras realizaciones, heterociclo es bicíclico, por ejemplo, un heterociclo bicíclico de 12 miembros. El heterociclo puede ser piperizinilo. El heterociclo puede ser morfolino. El heterociclo puede ser piperidinilo. El heterociclo puede ser decahidroisoquinolina. Los heterociclos representativos incluyen los siguientes:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
imagen27
y
imagen28
En algunas realizaciones, R11 es, en cada caso, independientemente alquilo C2-C12, aminoalquilo C1-C12, arilo, heteroarilo o heterociclilo.
En algunas realizaciones, R11 es alquilo C2-C12. En algunas realizaciones, R11 es etilo. En otras realizaciones, R11 es alquilo C3. En otras realizaciones más, R11 es isopropilo. En algunas otras realizaciones, R11 es alquilo C4. En otras realizaciones, R11 es alquilo C5. En algunas realizaciones, R11 es alquilo C6. En otras realizaciones, R11 es alquilo C7. En algunas realizaciones, R11 es alquilo C8. En otras realizaciones, R11 es alquilo Cg. En otras realizaciones más, R11 es alquilo C10. En algunas otras realizaciones, R11 es alquilo C11. En algunas realizaciones, R11 es alquilo C12.
En otras realizaciones, R11 es aminoalquilo C1-C12. En algunas realizaciones, R11 es metilamino. En algunas 11 11 11 realizaciones, R es etilamino. En otras realizaciones, R es aminoalquilo C3. En otras realizaciones más, R es
aminoalquilo C4. En algunas otras realizaciones, R11 es aminoalquilo C5. En otras realizaciones, R11 es aminoalquilo Ce. En otras realizaciones más, R11 es aminoalquilo C7. En algunas realizaciones, R11 es aminoalquilo C8. En otras realizaciones, R11 es aminoalquilo Cg. En otras realizaciones más, R11 es aminoalquilo C10. En algunas otras realizaciones, R11 es aminoalquilo C11. En otras realizaciones, R11 es aminoalquilo C12.
En otras realizaciones, R11 es alquilcarbonilo C1-C12. En otras realizaciones más, R11 es alquilcarbonilo C1. En otras realizaciones, R11 es alquilcarbonilo C2. En algunas realizaciones, R11 es alquilcarbonilo C3. En otras realizaciones más, R11 es alquilcarbonilo C4. En algunas realizaciones, R11 es alquilcarbonilo C5. En algunas otras realizaciones, R es alquilcarbonilo Ce. En otras realizaciones, R es alquilcarbonilo C7. En otras realizaciones más, R es alquilcarbonilo C8. En algunas realizaciones, R11 es alquilcarbonilo Cg. En otras realizaciones más, R11 es
alquilcarbonilo C10. En algunas otras realizaciones, R11 es alquilcarbonilo C11. En algunas realizaciones, R11 es
alquilcarbonilo C12. En otras realizaciones más, R11 es -C(=O)(CH2)nCO2H, donde n es de 1 a 6. Por ejemplo, en algunas realizaciones, n es 1. En otras realizaciones, n es 2. En otras realizaciones más, n es 3. En algunas otras realizaciones, n es 4. En otras realizaciones más, n es 5. En otras realizaciones, n es 6.
En otras realizaciones, R11 es arilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R11 es fenilo. En algunas realizaciones, el fenilo está sustituido, por ejemplo, con un grupo nitro.
En otras realizaciones, R11 es heteroarilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R11 es piridinilo. En otras realizaciones, R11 es pirimidinilo.
En otras realizaciones, R11 es heterociclilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R11 es piperidinilo, por ejemplo, piperidin-4-ilo.
En algunas realizaciones, R11 es etilo, isopropilo, piperidinilo, pirimidinilo, colato, desoxicolato o -C(=O)(CH2)nCO2H, donde n es de 1 a 6.
En algunas realizaciones, R es un par de electrones. En otras realizaciones, R es hidrógeno, y en otras realizaciones, R es alquilo C1-C12. En algunas realizaciones, R es metilo. En algunas realizaciones, R es etilo. En
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
otras realizaciones, R es alquilo C3. En otras realizaciones más, R es isopropilo. En algunas otras realizaciones, R es alquilo C4. En otras realizaciones más, R es alquilo C5. En algunas realizaciones, R es alquilo C6. En otras realizaciones, R es alquilo C7. En otras realizaciones más, R es alquilo C8. En otras realizaciones, R es alquilo Cg. En algunas realizaciones, R es alquilo C10. En otras realizaciones más, R es alquilo C11. En algunas realizaciones, R es alquilo C12.
En algunas realizaciones, R es, en cada caso, independientemente, hidrógeno, alquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12,
-NH2, -NR13R14
-nr13r14r15
oxo, -CN, trifluorometilo,
amidilo, amidinilo, amidinilalquilo, amidinilalquilcarbonil guanidinilo, guanidinilalquilo, guanidinilalquilcarbonilo, colato, desoxicolato, arilo, heteroarilo, heterociclo, -SR13 o alcoxi C1-C12, en la que R13, R14 y R15 son, en cada caso, independientemente alquilo C1-C12.
En algunas realizaciones, R12 es hidrógeno. En algunas realizaciones, R12 es alquilo C1-C12. En algunas realizaciones, R12 es aminoalquilo C1-C12. En algunas realizaciones, R12 es -NH2. En algunas realizaciones, R1"2 es -
13 14 12 13 14 15 12
NR R . En algunas realizaciones, R es -NR R R . En algunas realizaciones, R es alquilcarbonilo C1-C12. En algunas realizaciones, R12 es oxo. En algunas realizaciones, R12 es -CN. En algunas realizaciones, R12 es trifluorometilo. En algunas realizaciones, R12 es amidilo. En algunas realizaciones, R12 es amidinilo. En algunas realizaciones, R12 es amidinilalquilo. En algunas realizaciones, R12 es amidinilalquilcarbonilo. En algunas realizaciones, R12 es guanidinilo, por ejemplo, monometilguanidinilo o dimetilguanidinilo. En algunas realizaciones, R12 es guanidinilalquilo. En algunas realizaciones, R12 es amidinilalquilcarbonilo. En algunas realizaciones, R12 es colato. En algunas realizaciones, R12 es desoxicolato. En algunas realizaciones, R12 es arilo. En algunas realizaciones, R12 es heteroarilo. En algunas realizaciones, R12 es heterociclo. En algunas realizaciones, R12 es -
13 12 12
SR . En algunas realizaciones, R es alcoxi C1-C12. En algunas realizaciones, R es dimetilamina.
En otras realizaciones, R12 es metilo. En otras realizaciones más, R12 es etilo. En algunas realizaciones, R12 es
12 12
alquilo C3. En algunas realizaciones, R es isopropilo. En algunas realizaciones, R es alquilo C4. En otras realizaciones, R12 es alquilo C5. En otras realizaciones más, R12 es alquilo C6. En algunas otras realizaciones, R12 es alquilo C7. En algunas realizaciones, R12 es alquilo C8. En otras realizaciones más, R12 es alquilo Cg. En algunas realizaciones, R12 es alquilo C10. En otras realizaciones más, R12 es alquilo C11. En otras realizaciones, R12 es alquilo C12. En otras realizaciones más, el resto alquilo está sustituido con uno o más átomos de oxígeno para formar un resto éter, por ejemplo, un resto metoximetilo.
En algunas realizaciones, R12 es metilamino. En otras realizaciones, R12 es etilamino. En otras realizaciones más, R12 es aminoalquilo C3. En algunas realizaciones, R12 es aminoalquilo C4. En otras realizaciones más, R12 es aminoalquilo C5. En algunas otras realizaciones, R12 es aminoalquilo C6. En algunas realizaciones, R12 es aminoalquilo C7. En algunas realizaciones, R12 es aminoalquilo C8. En otras realizaciones más, R12 es aminoalquilo Cg. En algunas otras realizaciones, R12 es aminoalquilo C10. En otras realizaciones más, R12 es aminoalquilo C11. En otras realizaciones, R12 es aminoalquilo C12. En algunas realizaciones, el aminoalquilo es un dimetilaminoalquilo.
En otras realizaciones más, R12 es acetilo. En algunas otras realizaciones, R12 es alquilcarbonilo C2. En algunas realizaciones, R12 es alquilcarbonilo C3. En otras realizaciones más, R12 es alquilcarbonilo C4. En algunas realizaciones, R12 es alquilcarbonilo C5. En otras realizaciones más2 R12 es alquilcarbonilo C6. En algunas otras realizaciones, R12 es alquilcarbonilo C7. En algunas realizaciones, R12 es alquilcarbonilo C8. En otras realizaciones más, R12 es alquilcarbonilo Cg. En algunas otras realizaciones, R12 es alquilcarbonilo C10. En algunas realizaciones, R12 es alquilcarbonilo C11. En otras realizaciones, R12 es alquilcarbonilo C12. El alquilcarbonilo está sustituido con un resto carboxi, por ejemplo, el alquilcarbonilo está sustituido para formar un resto ácido succínico (es decir, un 3- carboxialquilcarbonilo). En otras realizaciones, el alquilcarbonilo está sustituido con un grupo -SH terminal.
En algunas realizaciones, R12 es amidilo. En algunas realizaciones, el amidilo comprende un resto alquilo que está sustituido adicionalmente, por ejemplo, con -SH, carbamato o combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, el amidilo está sustituido con un resto arilo, por ejemplo, fenilo. En determinadas realizaciones, R12 puede tener la siguiente estructura (IX):
imagen29
en la que R16 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, -CN, arilo o heteroarilo.
En algunas realizaciones, R12 es metoxi. En otras realizaciones, R12 es etoxi. En otras realizaciones más, R12 es
12 12
alcoxi C3. En algunas realizaciones, R es alcoxi C4. En algunas realizaciones, R es alcoxi C5. En algunas otras
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
realizaciones, R12 es alcoxi C6. En otras realizaciones, R12 es alcoxi C7. En algunas otras realizaciones, R12 es alcoxi C8. En algunas realizaciones, R12 es alcoxi Cg. En otras realizaciones, R12 es alcoxi C10. En algunas realizaciones, R12 es alcoxi C11. En otras realizaciones más, R12 es alcoxi C12.
En determinadas realizaciones, R12 es pirrolidinilo, por ejemplo, pirrolidin-1-ilo. En otras realizaciones, R12 es piperidinilo, por ejemplo, piperidin-1-ilo o piperidin-4-ilo. En otra realización, R12 es morfolino, por ejemplo, morfolin-4- ilo. En otras realizaciones, R12 es fenilo, y en realizaciones incluso adicionales, el fenilo está sustituido, por ejemplo, con un grupo nitro. En otras realizaciones adicionales, R12 es pirimidinilo, por ejemplo, pirimidin-2-ilo.

10 W A W c
En otras realizaciones, R , R y R son, en cada caso, independientemente alquilo C1-C12. En algunas realizaciones, R , R o R es metilo. En otras realizaciones más, R , R o R es etilo. En otras realizaciones,

13 14 15 13 14 15 13 14
R , R o R es alquilo C3. En otras realizaciones más, R , R o R es isopropilo. En otras realizaciones, R , R

15 13 14 15 13 14
o R es alquilo C4. En algunas realizaciones, R , R o R es alquilo C5. En algunas otras realizaciones, R , R o

15 13 14 15 13 14 15
R es alquilo C6. En otras realizaciones, R , R o R es alquilo C7. En otras realizaciones más, R , R o R es

13 14 15 13 14 15
alquilo C8. En otras realizaciones, R , R o R es alquilo Cg. En algunas realizaciones, R , R o R es alquilo C10. En algunas realizaciones, R , R o R es alquilo C11. En otras realizaciones más, R , R o R es alquilo C12.
Como se indica anteriormente, en algunas realizaciones, R12 es amidilo sustituido con un resto arilo. A este respecto, cada caso de R16 puede ser igual o diferente. En algunas de estas realizaciones, R16 es hidrógeno. En otras realizaciones, R16 es -CN. En otras realizaciones, R16 es heteroarilo, por ejemplo, tretrazolilo. En otras determinadas realizaciones, R16 es metoxi. En otras realizaciones, R16 es arilo, y el arilo está opcionalmente sustituido. Los sustituyentes opcionales a este respecto incluyen: alquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, por ejemplo, metoxi; trifluorometoxi; halo, por ejemplo, cloro; y trifluorometilo.
En otras realizaciones, R16 es metilo. En otras realizaciones más, R16 es etilo. En algunas realizaciones, R16 es alquilo C3. En algunas otras realizaciones, R16 es isopropilo. En otras realizaciones más, R16 es alquilo C4. En otras realizaciones, R16 es alquilo C5. En otras realizaciones más, R16 es alquilo C6. En algunas otras realizaciones, R16 es alquilo C7. En algunas realizaciones, R16 es alquilo C8. En otras realizaciones más, R16 es alquilo Cg. En algunas otras realizaciones, R16 es alquilo C10. En otras realizaciones, R16 es alquilo C11. En algunas otras realizaciones, R16 es alquilo C12.
En algunas realizaciones, R16 es metoxi. En algunas realizaciones, R16 es etoxi. En otras realizaciones más, R16 es alcoxi C3. En algunas otras realizaciones, R16 es alcoxi C4. En otras realizaciones, R16 es alcoxi C5. En algunas otras realizaciones, R16 es alcoxi C6. En otras realizaciones más, R16 es alcoxi C7. En algunas otras realizaciones, R16 es alcoxi C8. En otras realizaciones más, R16 es alcoxi Cg. En algunas otras realizaciones, R16 es alcoxi C10. En algunas realizaciones, R16 es alcoxi C11. En algunas otras realizaciones, R16 es alcoxi C12.
En algunas otras realizaciones, R8 y Rg se unen para formar un éter corona de 12-18 miembros. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el éter corona es de 18 miembros, y en otras realizaciones, el éter corona es de 15 miembros. En determinadas realizaciones, R8 y Rg se unen para formar un heterociclo que tiene una de las siguientes estructuras (X) o (XI):
imagen30
En algunas realizaciones3 R8, Rg o R3 se unen con R10 para formar un heterociclo de 5-7 miembros. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R3 se une con R10 para formar un heterociclo de 5-7 miembros. En algunas realizaciones, el heterociclo es de 5 miembros. En otras realizaciones, el heterociclo es de 6 miembros. En otras realizaciones, el heterociclo es de 7 miembros. En algunas realizaciones, el heterociclo está representado por la siguiente estructura (XII):
imagen31
en la que Z' representa un heterociclo de 5-7 miembros. En determinadas realizaciones de la estructura (XI), R12 es hidrógeno en cada caso. Por ejemplo, la unión (B) puede tener una de las siguientes estructuras (B1), (B2) o (B3):
5
imagen32
En otras determinadas realizaciones, R12 es alquilcarbonilo C1-C12 o amidilo que está sustituido adicionalmente con un resto arilfosforilo, por ejemplo, un resto trifenilfosforilo. Los ejemplos de uniones que tienen esta estructura 10 incluyen B56 y B55.
En determinada realización, la unión (B) no tiene ninguna de las estructuras A1-A5. La tabla 3 muestra uniones representativas de tipo (A) y (B).
15
Tabla 3. Uniones entre subunidades representativas
N.°
Nombre Estructura
A1
PMO 0 \ 11 Y! /'y 1 ^ AAAAA. 1 5'
A2
PMO+ (forma no protonada representada) O r^\ ü H\j'\ 3 JWWV 1 5'
A3
PMO+ (+) O II / °\ 3 «AAAAA. 1 5'
A4
PMOmepip (m+) O r-'X 11 3 iA/VAAA» 1 5'
A5
PMOgux +nh2 H2N N N"^\ ^-----\ II H v"^wx /V/v* ir ^ S ° 1 5'
B1
PMOcp 0°>-nX5. u
N.°
Nombre Estructura
B2
PMOcps vx3' , <XPX^/5. u
B3
PMOcpr Vw 0'" T Ap u
B4
PMOShc ÍJ /? —\ » ir —\ / i r 3' o ( B % \ ^wwv SH | 5'
B5
PMOmorfolino (m) 0 ,____. 1 r^rf^ y «/vww 1 5*
B6
PMOtri (t) / O °\ /? II \XY'-0* °—X^s/ H / jv/wv/v. °\ -
B7
PMOhex (h) O X°< • «AAAAA» 1 5’
imagen33
imagen34
imagen35
imagen36
imagen37
imagen38
PMOdl
PMOd
B10
PMOapn (a)
B11
PMOpir (p)
B12
PMOpir (sal HCl)
B13
PMO
imagen39
imagen40
imagen41
imagen42
imagen43
imagen44
B14
PMOs
B15
pModimet'laPn
B16
PMO
etpip
B17
PMoiprpip
B18
PMOpirQMe
B19
PMOc
B20
PMOma
B21
PMObu
B22
PMObi
B23
PMOpip
B24
PMOodmb
imagen45
imagen46
imagen47
imagen48
imagen49
N.°
Nombre Estructura
B25
PMOtfb F3Cv / Y °-\Jl ¡ , ! o-VO^ •AAAAA* 1 5'
B26
PMOctfb Cl\ f!cAJ o ^ i (^VO^ - ,/wwv 1 5'
B27
PMOptft 4^ O v( P II CrVOíf' ywwv. 1 5’
B28
PMOdcb Cl CI'X-X /? » ^wwv 1 5'
N.°
Nombre Estructura
B29
PMOdmb \ X° VA _____ ? %3' JWVUV I 5’
B30
PMOhy \ X- o N X'-JV. / 0^ * JW\A/\. 1 5*
B31
PMO6ce ^ X) XrX-k X vwwv 1 5’
B32
PMOb O cÁ-^k * «AAAAA* 1 5'
N.°
Nombre Estructura
B33
PMOq O 11 rQ'<’ 1 / JWVW \ 1
5'
B34
PMOnpp O ryO'k > O2N rfWWV 5’
B35
PMOo 0 11 -0"<' ,/WVW 1
I 5'
B36
PMO4ce /-0 /° ^ \ 11 ( N—P^t5 °\ % 3 rfVWW. 5'
B37
PMO5ce /—0 0-' \--v O < VIL s y i 0—'
N.°
Nombre Estructura
B38
PMOf3p r-x ? jTYk , ^WWV 1 5'
B39
PMOCyp 0 !i jCYt* 3. */va/w\< i 5’
B40
PMOmop 0 II ryO'i* ■ V'^ 1 5’
B41
PMOpp 0 r~^ N"fy. r y * JWWX. 5*
B42
PMOdmepip O O"'!1'/ r x °< | / 5*
B43
PMONPpip o ryOX3’ «/vww 5*
N.°
Nombre Estructura
B44
PMOb¡p¡p O ryvJ »'< • 1 5’
B45
PMOsuc o o J[ f-—v II H0 y ir ^ s O «AAAAA» 0 1 5’
46
PMOgiutár¡c° 0 H0\ 11 l'rf'f' o S A 7WWV ° 1 5'
B47
PMOtet A \ Jy HN^\ vi irN^ S3' A «A/WVA. 0 1 5’
B48
PMO‘¡o1 (SH) O r rvf/ VN V <3 A jww\. ° 1 5*
N.°
Nombre Estructura
B49
PMOpras «AAAAA* 1 5'
B50
PMOprar /°\ = O A 1! ót*3' JWWV. 1 5'
B51
PMOtme O 11 xiAt/, % 1 «/wwv 1 5*
B52
PMOca O r-\ 11 r>iy «AAAAA# CA = Colato 5'
B53
PMOdca O ,_____ 11 rr¿* • dCA «AAAAA* dCA = Colato 5'
N.°
Nombre Estructura
B54
PMOguan (g) O NH ^ H «AAAAA. 1 5'
B55
PMO+fos O 11 V <3
B56
PMOapnfos o . . CravOi;- U i.
En las secuencias y el análisis siguientes, los nombres anteriores para las uniones se usan a menudo. Por ejemplo, una base que comprende una unión PMOapn se ilustra como apnB, donde B es una base. Otras uniones se denominan de forma similar. Además, pueden usarse denominaciones abreviadas, por ejemplo, pueden usarse las 5 denominaciones abreviadas en paréntesis anteriormente (por ejemplo, aB, se refiere a apnB). También pueden usarse otras abreviaturas fácilmente identificables.
Como se indica anteriormente, la presente divulgación también proporciona un oligómero que comprende grupos terminal modificados. Los solicitantes han descubierto que la modificación del extremo 3' y/o 5' del oligómero con 10 diversos restos químicos proporciona propiedades terapéuticas beneficiosas (por ejemplo, potenciación del suministro celular, la potencia y/o la distribución tisular, etc.) a los oligómeros. En diversas realizaciones, los grupos terminales modificados comprenden un resto hidrófobo, mientras que, en otras realizaciones, los grupos terminales modificados comprenden un restos hidrófilo. Los grupos terminales modificados pueden presentar o no las uniones descritas anteriormente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los oligómeros comprenden uno o más grupos 15 terminales modificados y uniones de tipo (A), por ejemplo, uniones en las que X es -N(CH3)2. En otras realizaciones, los oligómeros comprenden uno o más grupos terminales modificados y uniones de tipo (B), por ejemplo, uniones en las que X es 4-aminopiperidin-1-ilo (es decir, APN). En otras realizaciones más, los oligómeros comprenden uno o más grupos terminales modificados y una mezcla de uniones (A) y (B). Por ejemplo, los oligómeros pueden comprender uno o más grupos terminales modificados (por ejemplo, tritilo o trifenilacetilo) y uniones en las que X es 20 -N(CH3)2 y uniones en las que X es 4-aminopiperidin-1-ilo. Otras combinaciones de grupos terminales modificados y
uniones modificadas también proporcionan propiedades terapéuticas favorables a los oligómeros.
5
10
15
20
25
30
En una realización, los oligómeros que comprenden modificaciones terminales tienen la siguiente estructura (XVII):
imagen50
o una sal o isómero de la misma, en la que X, W e Y son como se definen anteriormente para cualquiera de las uniones (A) y (B) y:
R17 es, en cada caso, independientemente inexistente, hidrógeno o alquilo C1-C6;
R18 y R19 son, en cada caso, independientemente inexistentes, hidrógeno, un péptido de penetración celular, un aminoácido natural o no natural, alquilcarbonilo C2-C30, -C(=O)OR21 o R20;
R20 es, en cada caso, independientemente guanidinilo, heterociclilo, alquilo C1-C30, cicloalquilo C3-C8; arilo C6- C30, aralquilo C7-C30, alquilcarbonilo C3-C30, cicloalquilcarbonilo C3-C8, cicloalquilalquilcarbonilo C3-C8,
arilcarbonilo C7-C30, aralquilcarbonilo C7-C30, alquiloxicarbonilo C2-C30, cicloalquiloxicarbonilo C3-C8,
ariloxicarbonilo C7-C30, aralquiloxicarbonilo C8-C30 o -P(=O)(R22)2;
B es un resto de emparejamiento de bases;
L1 es un conector opcional de hasta 18 átomos de longitud que comprende enlaces seleccionados de alquilo, hidroxilo, alcoxi, alquilamino, amida, éster, carbonilo, carbamato, fosforodiamidato, fosforoamidato, fosforotioato, piperazina y fosfodiéster; y
x es un número entero de 0 o mayor; y en la que al menos uno de R o R es R ; y
18 19 20 17 18
en la que al menos uno de R o R es R y con la condición de que tanto R como R no estén ausentes.
Los oligómeros con grupos terminales modificados pueden comprender incontables uniones de los tipos (A) y (B). Por ejemplo, los oligómeros pueden comprender únicamente uniones de tipo (A). Por ejemplo, X en cada unión puede ser -N(CH3)2. Como alternativa, los oligómeros pueden comprender únicamente uniones (B). En determinadas realizaciones, los oligómeros comprenden una mezcla de uniones (A) y (B), por ejemplo, de 1 a 4 uniones de tipo (B) y siendo el resto de las uniones de tipo (A). Las uniones a este respecto incluyen, pero sin limitación, uniones en las que X es aminopiperidinilo para el tipo (B) y dimetilamino para el tipo (A).
En algunas realizaciones, R17 está ausente. En algunas realizaciones, R17 es hidrógeno. En algunas realizaciones, R17 es alquilo C1-C6. En algunas realizaciones, R17 es metilo. En otras realizaciones más, R17 es etilo. En algunas realizaciones, R17 es alquilo C3. En algunas otras realizaciones, R17 es isopropilo. En otras realizaciones, R17 es alquilo C4. En otras realizaciones más, R17 es alquilo C5. En algunas otras realizaciones, R17 es alquilo C6.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
18 18 18 En otras realizaciones, R está ausente. En algunas realizaciones, R es hidrógeno. En algunas realizaciones, R
es un péptido de penetración celular como se describe en más detalle a continuación. En algunas realizaciones, R18
es un aminoácido natural o no natural, por ejemplo, trimetilglicina. En algunas realizaciones, R18 es R20
En otras realizaciones, R19 está ausente. En algunas realizaciones, R19es hidrógeno. En algunas realizaciones, R19
es un péptido de penetración celular como se describe en más detalle a continuación. En algunas realizaciones, R19
es un aminoácido natural o no natural, por ejemplo, trimetilglicina. En algunas realizaciones, R19 es-C(=O)OR17, por
ejemplo, R19 puede tener la siguiente estructura:
imagen51
En otras realizaciones, R18 o R19 es alquilcarbonilo C2-C30, por ejemplo, -C(=O)(CH2)nCO2H, donde n es de 1 a 6, por ejemplo, 2. En otros ejemplos, R18 o R19 es acetilo.
En algunas realizaciones, R20 es, en cada caso, independientemente guanidinilo, heterociclilo, alquilo C1-C30, cicloalquilo C3-C8; arilo C6-C30, aralquilo C7-C30, alquilcarbonilo C3-C30, cicloalquilcarbonilo C3-C8,
cicloalquilalquilcarbonilo C3-C8, arilcarbonilo C6-C30, aralquilcarbonilo C7-C30, alquiloxicarbonilo C2-C30,
cicloalquiloxicarbonilo C3-C8, ariloxicarbonilo C7-C30, aralquiloxicarbonilo C8-C30, -C(=O)OR21, o -P(=O)(R22)2, en la que R21 es alquilo C1-C30 que comprende uno o más restos de oxígeno o hidroxilo o combinaciones de los mismos y cada R22 es ariloxi C6-C12.
19 21 18
En otras determinadas realizaciones, R es -C(=O)OR y R es hidrógeno, guanidinilo, heterociclilo, alquilo C1-C30, cicloalquilo C3-C8; arilo C6-C30, alquilcarbonilo C3-C30, cicloalquilcarbonilo C3-C8, cicloalquilalquilcarbonilo C3-C8, arilcarbonilo C7-C30, aralquilcarbonilo C7-C30, alquiloxicarbonilo C2-C30, cicloalquiloxicarbonilo C3-C8, ariloxicarbonilo C7-C30, aralquiloxicarbonilo C8-C30 o -P(=O)(R222)2, en la que cada R22 es ariloxi C6-C12.
En otras realizaciones, R20 es, en cada caso, independientemente guanidinilo, heterociclilo, alquilo C1-C30, cicloalquilo C3-C8; arilo C6-C30, alquilcarbonilo C3-C30, cicloalquilcarbonilo C3-C8, cicloalquilalquilcarbonilo C3-C8, arilcarbonilo C7-C30, aralquilcarbonilo C7-C30, alquiloxicarbonilo C2-C30, cicloalquiloxicarbonilo C3-C8, ariloxicarbonilo C7-C30, aralquiloxicarbonilo C8-C30 o -P(=O)(R22)2. Mientras que en otros ejemplos, R20 es, en cada caso, independientemente guanidinilo, heterociclilo, alquilo C1-C30, cicloalquilo C3-C8; arilo C6-C30, aralquilo C7-C30, cicloalquilcarbonilo C3-C8, cicloalquilalquilcarbonilo C3-C8, arilcarbonilo C7-C30, aralquilcarbonilo C7-C30,
alquiloxicarbonilo C2-C30, cicloalquiloxicarbonilo C3-C8, ariloxicarbonilo C7-C30, aralquiloxicarbonilo C8-C30 o - P(=O)(R22)2.
En algunas realizaciones, R20 es guanidinilo, por ejemplo, monometilguanidinilo o dimetilguanidinilo. En otras realizaciones, R20 es heterociclilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R20 es piperidin-4-ilo. En algunas realizaciones, el piperidin-4-ilo está sustituido con grupos tritilo o Boc. En otras realizaciones, R20 es cicloalquilo C3- C8. En otras realizaciones, R20 es arilo C6-C30.
En algunas realizaciones, R20 es arilcarbonilo C7-C30. Por ejemplo, En algunas realizaciones, R20 tiene la siguiente estructura (XVIII):
imagen52
en la que R23 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, halo, alquilo C1-C30, alcoxi C1-C30, alquiloxicarbonilo C1-C30, aralquilo C7-C30, arilo, heteroarilo, heterociclilo o heterociclalquilo, y en la que un R23 puede unirse con otro R23 para formar un anillo heterociclilo. En algunas realizaciones, al menos un R23 es hidrógeno, por ejemplo, en algunas realizaciones, cada R23 es hidrógeno. En otras realizaciones, al menos un R23 es alcoxi C1-C30, por ejemplo, en algunas realizaciones, cada R23 es metoxi. En otras realizaciones, al menos un R23 es heteroarilo, por ejemplo, en algunas realizaciones, al menos un R23 tiene una de las siguientes estructuras (XVIIIa) o (XVIIIb):
imagen53
En otras realizaciones adicionales, un R23 se une con otro R23 para formar un anillo heterociciMo. Por ejemplo, en una realización, R15 * * * * 20 es 5-carboxifluoresceína.
5
En otras realizaciones, R20 es aralquilcarbonilo C7-C30. Por ejemplo, en diversas realizaciones, R20 tiene una de las siguientes estructuras (XIX), (XX) o (XXI):
imagen54
10
o
imagen55
15 en la que R23 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, halo, alquilo C1-C30, alcoxi C1-C30, alquiloxicarbonilo
C1-C30, aralquilo C7-C30, arilo, heteroarilo, heterociclilo o heterociclalquilo, en la que un R23 puede unirse con otro R23
para formar un anillo heterociclilo, X es -OH o halo y m es un número entero de 0 a 6. En algunas realizaciones
específicas, m es 0. En otras realizaciones, m es 1, mientras que, en otras realizaciones, m es 2. En otras
realizaciones, al menos un R23 es hidrógeno, por ejemplo, en algunas realizaciones, cada R23 es hidrógeno. En
20 algunas realizaciones, X es hidrógeno. En otras realizaciones, X es -OH. En otras realizaciones, X es Cl. En otras
realizaciones, al menos un R23 es alcoxi C1-C30, por ejemplo, metoxi.
En otras realizaciones adicionales, R20 es aralquilo C7-C30, por ejemplo, tritilo. En otras realizaciones, R20 es metoxitritMo. En algunas realizaciones, R20 tiene la siguiente estructura (XXII):
imagen56
5
en la que R23 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, halo, alquilo C1-C30, alcoxi C1-C30, alquiloxicarbonilo C1-C30, aralquilo C7-C30, arilo, heteroarilo, heterociclilo o heterociclalquilo, y en la que un R23 puede unirse con otro R23 para formar un anillo heterociclilo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cada R23 es hidrógeno. En otras realizaciones, al menos un R23 es alcoxi C1-C30, por ejemplo, metoxi.
10
En otras realizaciones más, R20 es aralquilo C7-C30 y R20 tiene la siguiente estructura (XXIII):
imagen57
15 En algunas realizaciones, al menos un R23 es halo, por ejemplo, cloro. En algunas otras realizaciones, un R23 es cloro en la posición para.
En otras realizaciones, R20 es alquilo C1-C30. Por ejemplo, En algunas realizaciones, R20 es un alquilo C4-C20 y opcionalmente comprende uno o más dobles enlaces. Por ejemplo, En algunas realizaciones, R20 es un alquilo C4.10 20 que comprende un triple enlace, por ejemplo, un triple enlace terminal. En algunas realizaciones, R20 es hexin-6-ilo. En algunas realizaciones, R20 tiene una de las siguientes estructuras (XXIV), (XXV), (XXVI) o (XXVII):
5
10
15
20
25
imagen58
En otras realizaciones adicionales, R20 es un alquilcarbonilo C3-C30, por ejemplo, un alquilcarbonilo C3-C10. En algunas realizaciones, R20 es -C(=O)(CH2)pSH o -C(=O)(CH2)pSSHet, en la que p es un número entero de 1 a 6 y Het es un heteroarilo. Por ejemplo, p puede ser 1 o p puede ser 2. En otro ejemplo Het es piridinilo, por ejemplo, piridin-2-ilo. En otras realizaciones, el alquilcarbonilo C3-C30 está sustituido con un oligómero adicional, por ejemplo, en algunas realizaciones, el oligómero comprende un alquilcarbonilo C3-C30 en la posición 3' que une el oligómero a la posición 3' de otro oligómero. Dichas modificaciones terminales se incluyen dentro del alcance de la presente divulgación.
En otras realizaciones, R20 es un alquilcarbonilo C3-C30 que está sustituido adicionalmente con un resto arilfosforilo, por ejemplo, trifenilfosforilo. Los ejemplos de dichos grupos R20 incluyen la estructura 33 en la tabla 2.
En otros ejemplos, R20 es cicloalquilcarbonilo C3-C8, por ejemplo, alquilcarbonilo C5-C7. En estas realizaciones, R20 tiene la siguiente estructura (XXVIII):
imagen59
en la que R23 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, halo, alquilo C1-C30, alcoxi C1-C30, alquiloxicarbonilo C1-C30, aralquilo C7-C30, arilo, heteroarilo, heterociclilo o heterociclalquilo, y en la que un R23 puede unirse con otro R23 para formar un anillo heterociclilo. En algunas realizaciones, R23 es heterociclilalquilo, por ejemplo, en algunas realizaciones, R23 tiene la siguiente estructura:
imagen60
5
10
15
20
25
30
35
En algunas otras realizaciones, R20 es cicloalquMalquilcarbonilo C3-C8. En otras realizaciones, R20 es
alquiloxicarbonilo C2-C30. En otras realizaciones, R20 es cicloalquiloxicarbonilo C3-C8. En otras realizaciones, R20 es
ariloxicarbonilo C7-C30. En otras realizaciones, R20 es aralquiloxicarbonilo C8-C30. En otras realizaciones, R20 es - 22 22 6 12 20 P(=O)(R )2, en la que cada R es ariloxi C -C , por ejemplo, en algunas realizaciones, R tiene la siguiente
estructura (C24):
imagen61
O—P—O
1
vww*
I
(C24)
En otras realizaciones, R20 comprende uno o más átomos de halógeno. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R20 comprende un análogo perfluoro de cualquiera de los restos R20 anteriores. En otras realizaciones, R20 es p- trifluorometilfenilo, trifluorometiltritilo, perfluoropentilo o pentafluorofenilo.
En algunas realizaciones, el extremo 3' comprende una modificación y en otras realizaciones el extremo 5' comprende una modificación. En otras realizaciones, tanto el extremo 3' como el extremo 5' comprenden modificaciones. Por consiguiente, en algunas realizaciones, R está ausente y R es R . En otras realizaciones,
19 18 20 18 19 20
R está ausente y R es R . En otras realizaciones más, R y R son cada uno R .
En algunas realizaciones, el oligómero comprende un péptido de penetración celular además de una modificación 3' o 5'. Por consiguiente, en algunas realización, R19 es un péptido de penetración celular y R18 es R20 En otras realizaciones, R18 es un péptido de penetración celular y R19 es R20 En otras realizaciones de lo anterior, el péptido de penetración celular es un péptido rico en arginina.
En algunas realizaciones, el conector L1 que une el grupo 5' terminal (es decir, R19) al oligómero puede estar presente o ausente. El conector comprende incontables grupos funcionales y longitudes, con la condición de que el conector retenga su capacidad de unir el grupo 5' terminal al oligómero, y con la condición de que el conector no interfiera con la capacidad del oligómero de unirse a una secuencia diana de una manera específica de secuencia. En una realización, L comprende enlaces fosforodiamidato y piperazina. Por ejemplo, en algunas realizaciones, L tiene la siguiente estructura (XXIX):
imagen62
•AAAAA*
(XXIX)
en la que R24 es inexistente, hidrógeno o alquilo C1-C6. En algunas realizaciones, R24 está ausente. En algunas realizaciones, R24 es hidrógeno. En algunas realizaciones, R24 es alquilo C1-C6. En algunas realizaciones, R24 es metilo. En otras realizaciones, R24 es etilo. En otras realizaciones más, R24 es alquilo C3. En algunas otras realizaciones, R24 es isopropilo. En otras realizaciones más, R24 es alquilo C4. En algunas realizaciones, R24 es alquilo C5. En otras realizaciones más, R24 es alquilo C6.
En otras realizaciones más, R20 es alquilcarbonilo C3-C30 y R20 tiene la siguiente estructura (XXX):
5
10
15
imagen63
en la que R25 es hidrógeno o -SR26, en la que R26 es hidrógeno, alquilo C1-C30, heterociclilo, arilo o heteroarilo, y q es un número entero de 0 a 6.
En otras realizaciones de cualquiera de las anteriores, R23 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, halo, alquilo C1-C30, alcoxi C1-C30, arilo, heteroarilo, heterociclilo o heterociclalquilo.
En algunas otras realizaciones, únicamente el extremo 3' del oligómero se conjuga con uno de los grupos indicados anteriormente. En algunas otras realizaciones, únicamente el extremo 5' del oligómero se conjuga con uno de los grupos indicados anteriormente. En otras realizaciones, tanto el extremo 3' como el extremo 5' comprenden uno de los grupos indicados anteriormente. El grupo terminal puede seleccionarse de uno cualquiera de los grupos indicados anteriormente o cualquiera de los grupos específicos ilustrados en la tabla 4.
imagen64
imagen65
imagen66
Tabla 4. Grupos terminales representativos
Nombre
Estructura
Trimetoxibenzoílo
9-fluoreno-carboxilo
4-carbazolilbenzoílo
imagen67
imagen68
imagen69
imagen70
imagen71
imagen72
4-indazolilonebenzoílo
ClorodifenilacetMo
Farnesilo
Geranilo
Prenilo
Difenilacetilo
C10
Hidroxidifenilacetilo
imagen73
C11
Trifenilpropionilo
C12
Trifenilpropilo
C13
C14
Trifenilacetilo
Tritilo (Tr)
imagen74
imagen75
imagen76
imagen77
C15
Metoxitritilo (MeOTr)
C16
Metilsuccinimidilcidohexoílo
C17
Tioacetilo
C18
COCH2CH2SSPy
C19
Guanidinilo
imagen78
imagen79
imagen80
imagen81
imagen82
C20
T rimetilglicina
C21
Lauroílo
C22
Trietilenglicolilo (EG3)
C23
Succinicoacetilo
imagen83
imagen84
imagen85
imagen86
C24
Difenilfosforilo
C25
Piperidin-4-ilo
C26
Tritilpiperidin-4-ilo
C27
Boc-Piperidin-4-ilo
C28
Hexin-6-ilo
C29
5-carboxifluoresceína
imagen87
O—P—O
[
wwv
imagen88
imagen89
imagen90
imagen91
imagen92
C30
C31
p
Benzhidrilo
-Clorobenzhidrilo
imagen93
imagen94
imagen95
C32
Piperazinilo (pip)
C33
Trifenilfos
C34
Dimerizado
imagen96
Oligo = un oligómero adicional
Transportadores peptídicos
De acuerdo con la invención, el presente oligómero se conjuga con un resto transportador peptídico de penetración 5 celular, que es eficaz para potenciar el transporte del oligómero a las células. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el resto transportador peptídico es un péptido rico en arginina. En realizaciones adicionales, el resto transportador se adhiere al extremo 5' o 3' del oligómero. Cuando dicho péptido se conjuga con cualquier extremo, el extremo opuesto entonces está disponible para conjugación adicional con un grupo terminal modificado como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones de los anterior, el resto transportador peptídico comprende de 6 a 16 subunidades seleccionadas de subunidades X', subunidades Y' y subunidades Z',
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
donde
(a) cada subunidad X' representa independientemente lisina, arginina o un análogo de arginina, siendo dicho análogo un a-aminoácido catiónico que comprende una cadena lateral de la estructura R33N=C(NH2)R34, donde
OO ^ 0/1 oc 1 1 oc ' '
R es H o R; R es R, NH2, NHR o NR34, donde R es alquilo inferior o alquenilo inferior y puede incluir adicionalmente oxígeno o nitrógeno; R33 y R34 pueden formar juntos un anillo; y la cadena lateral se une a dicho aminoácido mediante R33 o R34;
(b) cada subunidad Y' representa independientemente un aminoácido neutro -C(O)-(CHR)n-NH-, donde n es de 2 a 7 y cada R es independientemente H o metilo; y
(c) cada subunidad Z' representa independientemente un a-aminoácido que tiene una cadena lateral aralquilo neutra;
en la que el péptido comprende una secuencia representada por uno de (X'Y'X')p, (X'Y')m, y (X'Z'Z')p, donde p es de 2 a 5 y m es de 2 a 8.
En realizaciones seleccionadas, para cada X', el resto de la cadena lateral es guanidilo, como en la subunidad de aminoácido arginina (Arg). En realizaciones adicionales, cada Y' es -CO-(CH2)n-CHR-NH-, donde n es de 2 a 7 y R es H. Por ejemplo, cuando n es 5 y R es H, Y' es una subunidad de ácido 6-aminohexanoico, abreviado en el presente documento como Ahx; cuando n es 2 y R es H, Y' es una subunidad de p-alanina.
En determinadas realizaciones, los péptidos de este tipo incluyen aquellos que comprenden dímeros de arginina que alternan con subunidades Y' individuales, donde Y' es Ahx. Los ejemplos incluyen péptidos que tienen la fórmula (RY'R)p o la fórmula (RRY')p, donde Y' es Ahx. En una realización, Y' es una subunidad de ácido 6-aminohexanoico, R es arginina y p es 4.
En una realización adicional, cada Z' es fenilalanina, y m es 3 o 4.
En algunas realizaciones, el péptido conjugado se une a un extremo del oligómero mediante un conector Ahx-B, donde Ahx es una subunidad de ácido 6-aminohexanoico y B es una subunidad de p-alanina.
En realizaciones seleccionadas, para cada X', el resto de la cadena lateral se selecciona independientemente del grupo que consiste en guanidilo (HN=C(NH2)NH-), amidinilo (HN=C(NH2)C-), 2-aminodihidropirimidilo, 2- aminotetrahidropirimidilo, 2-aminopiridinilo y 2-aminopirimidonilo, y se selecciona preferentemente de guanidilo y amidinilo. En una realización, el resto de la cadena lateral es guanidilo, como en la subunidad de aminoácido arginina (Arg).
En algunas realizaciones, las subunidades Y' están contiguas, porque ninguna subunidad X' se interpone entre las subunidades Y', o se intercalan individualmente entre las subunidades X'. Sin embargo, en algunas realizaciones, la unión de subunidades puede ser entre subunidades Y'. En una realización, las subunidades Y' están en un extremo del transportador peptídico; en otras realizaciones, están flanqueadas por subunidades X'. En realizaciones adicionales, cada Y' es -CO-(CH2)n-CHR-NH-, donde n es de 2 a 7 y R es H. Por ejemplo, cuando n es 5 y R es H, Y' es una subunidad de ácido 6-aminohexanoico, abreviado en el presente documento como Ahx. En realizaciones seleccionadas de este grupo, cada X' comprende un resto de cadena lateral guanidilo, como en una subunidad de arginina. Los péptidos ejemplares de este tipo incluyen aquellos que comprenden dímeros de arginina que alternan con subunidades Y' individuales, donde Y' es preferentemente Ahx. Los ejemplos incluyen péptidos que tienen la fórmula (RY'R)4 o la fórmula (RRY')4, donde Y' es preferentemente Ahx. En algunas realizaciones, el análogos de ácido nucleico se une a una subunidad Y' terminal, preferentemente en el extremo C. En otras realizaciones, el conector es de la estructura AhxB, donde Ahx es una subunidad de ácido 6-aminohexanoico y B es una subunidad de p-alanina.
Los restos transportadores peptídicos como se describe anteriormente han demostrado potenciar enormemente la entrada en la célula de oligómeros adheridos, respecto a la captación del oligómero en ausencia del resto de transporte adherido, y respecto a la captación de un resto transportador adherido que carece de las subunidades Y' hidrófobas. Dicha captación potenciada puede evidenciarse por un aumento de al menos dos veces, o en otras realizaciones, un aumento de cuatro veces, en la captación del compuesto en células de mamífero respecto a la captación del agente por un resto de transporte adherido que carece de las subunidades Y' hidrófobas. En algunas realizaciones, la captación se potencia al menos veinte veces o al menos cuarenta veces, respecto al compuesto no conjugado.
Un beneficio adicional del resto de transporte peptídico es su capacidad esperada de estabilizar un dúplex entre un oligómero de antisentido y su secuencia de ácido nucleico diana. Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, esta capacidad de estabilizar un dúplex puede resultar de la interacción electrostática entre el resto de transporte cargado positivamente y el ácido nucleico cargado negativamente. En algunas realizaciones, la cantidad de subunidades cargadas en el transportador es de menos de 14, como se indica anteriormente, o en otras realizaciones entre 8 y 11, ya que una cantidad demasiado alta de subunidades cargadas puede dar lugar a una reducción en la especificidad de secuencia.
5
10
15
20
25
30
35
La presente divulgación también incorpora conjugados de restos de transporte peptídico y análogos de ácido nucleico. Como se indica anteriormente, los restos de transporte peptídico en general son eficaces para potenciar la penetración celular de los análogos de ácido nucleico. Los solicitantes también han descubierto que incluir una subunidad de aminoácido glicina (G) o prolina (P) entre el análogo de ácido nucleico y el resto del resto de transporte peptídico (por ejemplo, en el extremo carboxi o amino del péptido portador) reduce la toxicidad del conjugado, mientras la eficacia permanece igual o se mejora respecto a conjugados con diferentes uniones entre el resto de transporte peptídico y el análogo de ácido nucleico. Por tanto, los conjugados actualmente divulgados tienen una mejor ventana terapéutica y son candidatos de fármaco más prometedores que otros conjugados de péptido-oligómero.
Además de la toxicidad reducida, se cree que la presencia de una subunidad de aminoácido glicina o prolina entre el análogo de ácido nucleico y el péptido portador proporciona ventajas adicionales. Por ejemplo, la glicina es barata y se acopla fácilmente al análogo de ácido nucleico (o conector opcional) sin ninguna posibilidad de racemización. De manera similar, la prolina se acopla fácilmente sin racemización y también proporciona péptidos portadores que no forman hélices. La hidrofobicidad de la prolina también puede conferir determinadas ventajas con respecto a la interacción del péptido portador con la bicapa lipídica de las células, y los péptidos portadores que comprenden múltiples prolinas (por ejemplo, en determinadas realizaciones) pueden resistir la formación de G cuádruple. Finalmente, en determinadas realizaciones, cuando el resto de prolina está adyacente a una subunidad de aminoácido arginina, el resto de prolina confiere estabilidad metabólica a los conjugados, ya que el enlace amida entre arginina-prolina no se puede escindir por las endopeptidasas comunes.
En algunas realizaciones, la conjugación de péptidos a oligonucleótidos de antisentido es como se describe en la publicación PCT WO2012/1150960. En una realización particular, por ejemplo, un oligonucleótido conjugado a péptido utiliza glicina como conector entre el CPP y el oligonucleótido de antisentido. Por ejemplo, los oligonucleótidos de antisentido de la invención pueden acoplarse a un péptido rico en arginina, tal como (Arg)6Gly (6 argininas y 1 glicina unidas a un oligonucleótido). Como ejemplo, este péptido puede conjugarse a un PMO y se conoce como "R6-G-PMO".
Los transportadores peptídicos de penetración celular ricos en arginina ejemplares adicionales que comprenden diversos conectores (C, G, P, Ahx, B) se dan a continuación en la tabla 5. Como se divulga en la tabla 2 anterior, un transportador peptídico de penetración celular preferente es la SEQ ID NO: 45 conjugada con un PMO en el extremo 3' mediante un conector de glicina (R6G). La unión de R6G al extremo 5' también es una realización preferente.
Tabla 5. Transportadores peptídicos de penetración celular ricos en arginina
NOMBRE (DENOMINACIÓN)
SECUENCIA SEQ ID NO.a
rTAT
RRRQRRKKR 39
Tat
RKKRRQRRR 40
R9F2
RRRRRRRRRFF 41
R5F2R4
RRRRRFFRRRR 42
R4
RRRR 43
R5
RRRRR 44
R6
RRRRRR 45
R7
RRRRRRR 46
R8
RRRRRRRR 47
r9
RRRRRRRRR 48
(RX)8
RXRXRXRXRXRXRXRX 49
(RAhxR)4; (P007)
RAhxRRAhxRRAhxRRAhxR 50
(RAhxR)5; (CP04057)
RAhxRRAhxRRAhxRRAhxRRAhxR 51
(RAhxRRBR)2; (CPO0O02)
RAhxRRBRRAhxRRBR 52
(RAR)4F2
RARRARRARRARFFC 53
(RGR)4F2
RGRRGRRGRRGRFFC 54
ALas secuencias asignadas a las SEQ ID NO no incluyen la parte de unión (por ejemplo, C, G, P, Ahx, B, AhxB donde Ahx y B se refieren a ácido 6-aminohexanoico y beta-alanina, respectivamente).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Métodos de uso in vitro
En otro aspecto, dentro del contexto de la presente invención divulgada se divulgan métodos de uso de los oligonucleótidos de antisentido dirigidos a LMNA y/o HGPS descritos en el presente documento para tratar una célula o tejido in vitro para reducir la expresión de una o más isoformas de ARNm y/o proteínas mutantes de una manera beneficiosa. Las células o tejido que pueden modularse por los oligonucleótidos de antisentido de la presente invención son preferentemente células de mamífero, o más preferentemente células humanas. Dichas células puede ser de un estado sano o de un estado patológico, tal como células que expresan progerina. En determinados aspectos, la célula es una célula que expresa progerina, que provoca una laminopatía progeroide.
Dentro del contexto de la presente invención se divulgan, por lo tanto, métodos en general para reducir la expresión de ARNm de LMNA con corte y empalme anómalo in vitro, que comprende poner en contacto una célula con uno o más oligonucleótidos de antisentido descritos en el presente documento, o una composición que contiene los mismos, reduciendo de ese modo la expresión de progerina. Estos métodos y métodos relacionados pueden usarse para reducir la expresión de una cualquiera o más isoformas de ARNm de LMNA mutante descritas en el presente documento y conocidas en la técnica.
Los métodos in vitro pueden emplear composiciones que comprenden oligonucleótidos en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del criterio médico razonable, adecuados para su uso en contacto con células y/o tejidos sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcionado con una relación beneficio/riesgo razonable.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, auxiliar de fabricación (por ejemplo, lubricante, talco, estearato de magnesio, calcio o cinc, o ácido esteárico), o material de encapsulación de disolvente. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para la célula o tejido que se pone en contacto.
Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua apirógena; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Aunque la invención anterior se ha descrito con algo de detalle a modo de ilustración y ejemplos a efectos de claridad de comprensión, resultará fácilmente evidente para un experto en la materia ante los contenidos de la presente invención que puedan realizarse determinados cambios y modificaciones a la misma dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración únicamente y no a modo de limitación. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una diversidad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para producir resultados esencialmente similares.
TABLA DEL LISTADO DE SECUENCIAS
NOMBRE
SECUENCIA SEQ ID NO:
LMNA exón 11
GGCTCCCACTGCAGCAGCTCGGGGGACCCCGCTGAGTA CAACCTGCGCTCGCGCACCGTGCTGTGCGGGACCTGCG GGCAGCCTGCCGACAAGGCATCTGCCAGCGGCTCAGGA GCCCAGGTGGGCGGACCCATCTCCTCTGGCTCTTCTGC CTCCAGTGTCACGGTCACTCGCAGCTACCGCAGTGTGG GGGGCAGTGGGGGTGGCAGCTTCGGGGACAATCTGGTC ACCCGCTCCTACCTCCTGGGCAACTCCAGCCCCCGAAC CCAG 1
NOMBRE
SECUENCIA SEQ ID NO:
HGPS exón 11
GGCTCCCACTGCAGCAGCTCGGGGGACCCCGCTGAGTA CAACCTGCGCTCGCGCACCGTGCTGTGCGGGACCTGCG GGCAGCCTGCCGACAAGGCATCTGCCAGCGGCTCAGGA GCCCAGGTGGGTGGACCCATCTCCTCTGGCTCTTCTGC CTCCAGTGTCACGGTCACTCGCAGCTACCGCAGTGTGG GGGGCAGTGGGGGTGGCAGCTTCGGGGACAATCTGGTC ACCCGCTCCTACCTCCTGGGCAACTCCAGCCCCCGAAC CCAG 2
Exo11.25.133
CCGCTGGCAGATGCCTTGTCGGCAG 3
Exo11.25.138
CTG AGCCGCTGG C AG ATGCCTTGTC 4*
Exo11.25.142
GCTCCTGAGCCGCTGGCAGATGCCT 5*
Exo11.25.145
TGGGCTCCTGAGCCGCTGGCAGATG 6
Exo11.25.149
CACCTGGGCTCCTGAGCCGCTGGCA 7
Exo11.25.154
CCACCCACCTGGGCTCCTGAGCCGC 8
Exo11.25.158
GGGTCCACCCACCTGGGCTCCTGAG 9
Exo11.25.162
AGATGGGTCCACCCACCTGGGCTCC 10*
Exo11.25.166
GAGGAGAT GGGTCCACCCACCTGGG 11*
Exo11.25.170
GCCAGAGGAGATGGGTCCACCCACC 12
Exo11.25.174
AAGAGCCAGAGGAGATGGGTCCACC 13*
Exo11.25.177
CAGAAGAGCCAGAGGAGAT GGGT CC 14*
Exo11.25.181
GAGGCAGAAGAGCCAGAGGAGATGG 15
Exo11.25.185
ACT GGAGGCAGAAGAGCCAGAGGAG 16*
Exo10SD.25.69
ACGTGGTGGTGATGGAGCAGGTCAT 17
Exo10SD.25.73
ACTCACGTGGTGGTGATGGAGCAGG 18
Exo10SD.25.79
GCTACCACTCACGTGGTGGTGATGG 19
Exo10SD.25.84
CGGCGGCTACCACTCACGTGGTGGT 20
Exo10SD.25.87
CAGCGGCGGCTACCACTCACGTGGT 21
Exo10SD.25.90
CCTCAGCGGCGGCTACCACTCACGT 22
Exo10SD.25.92
GGCCTCAGCGGCGGCTACCACTCAC 23
Exo10SD.25.96
GCTCGGCCTCAGCGGCGGCTACCAC 24
Exo11SA.25.779
CGAGTCTGGGACTGACCACTCAGGC 25
Exo11SA.25.796
AGGCTCAGGCGGGACGGCGAGTCTG 26
Exo11SA.25.801
AGACAAGGCTCAGGCGGGACGGCGA 27
Exo11SA.25.805
AGGGAGACAAGGCTCAGGCGGGACG 28
Exo11SA.25.809
GGGAAGGGAGACAAGGCTCAGGCGG 29
Exo11SA.25.814
GCCCTGGGAAGGGAGACAAGGCTCA 30
Exo11SA.25.820
GTGGGAGCCCTGGGAAGGGAGACAA 31
Exo11SA.25.828
CTGCT GCAGT GGGAGCCCT GGGAAG 32
Exo11SA.25.830
AGCTGCTGCAGTGGGAGCCCTGGGA 33
Exo11SA.25.836
CCCCCGAGCTGCTGCAGTGGGAGCC 34
HsEx10
GCTACCACTCACGTGGTGGTGATGG-AcR6G 35
HsEx11
GGGTCCACCCACCTGGGCTCCTGAG-AcRgG 36
HsEx10-apn
GCaPnTACCACaPnTCACGaPnTGGTGGaPnTGATGG 37
HsEx11-apn
GGGaPnTCCACCCACCaPnTGGGCaPnTCCaPnTGAG 38
5
10
15
20
25
30
35
40
NOMBRE
SECUENCIA SEQ ID NO:
rTAT
RRRQRRKKR 39*
Tat
RKKRRQRRR 40*
R9F2
RRRRRRRRRFF 41*
R5F2R4
RRRRRFFRRRR 42*
R4
RRRR 43*
R5
RRRRR 44*
R6
RRRRRR * LO
R7
RRRRRRR 46*
Re
RRRRRRRR 47*
R9
RRRRRRRRR * OO
(RX)e
RXRXRXRXRXRXRXRX 49*
(RAhxR)4; (P007)
RAhxRRAhxRRAhxRRAhxR * O LO
(RAhxR)s; (CP04057)
RAhxRRAhxRRAhxRRAhxRRAhxR 51*
(RAhxRRBR)2; (CP06062)
RAhxRRBRRAhxRRBR * CM LO
(RAR)4F2
RARRARRARRARFFC 53*
(RGR)4F2
RGRRGRRGRRGRFFC en *
* cubierto por las reivindicaciones
Ejemplos
EJEMPLO 1
TRATAMIENTO DE CÉLULAS HGPS USANDO OLIGONUCLEÓTIDOS DE ANTISENTIDO, DIRIGIDOS A LMNA
Se usaron dos líneas primarias de fibroblastos, fibroblastos HGPS (HGADFN167) y fibroblastos de control (HGFDFN168). Se sembraron células HGPS y de control en una placa de 24 pocillos a la densidad de aproximadamente 10 000 células/pocillo. Se introdujeron individualmente oligonucleótidos de morfolino dirigidos a los exones 11 y/o 10 del preARNm de lamina A en células HGPS cultivadas por captación libre o por nucleofección (Amaxa, por ejemplo). Para la captación libre, las células se cultivaron durante 1-2 semanas en un medio que contenía 25 pM o 50 pM o 80 uM de oligonucleótidos PMO. Esas células entonces se cribaron por inmunofluorescencia con anticuerpos antiprogerina o antilamina A/C. Las intensidades de fluorescencia de la tinción de progerina se cuantificaron usando un microscopio de fluorescencia Zeiss y un programa SPOT. Los experimentos se realizaron por triplicado, y los PMO que mostraron efectos en la regulación por disminución de progerina se seleccionaron para análisis adicional. El análisis incluía RT-PCR cuantitativa con cebador específico de progerina y análisis de transferencia de Western con anticuerpos antiprogerina.
EJEMPLO 2
TINCIÓN DE INMUNOFLUORESCENCIA DE CÉLULAS HGPS DESPUÉS DE TRATAMIENTO CON OLIGONUCLEÓTIDOS DE ANTISENTIDO DIRIGIDOS A LMNA
Tinción de inmunofluorescencia: Para la inmunofluorescencia, las células se sembraron en portaobjetos de cámara de 4 pocillos. Después de fijación en paraformaldehído al 4 %/PBS a temperatura ambiente durante 15 min, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 %/PBS a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de una incubación durante una noche en la solución de bloqueo a 4 °C (solución de bloqueo: BSA al 4 %/TBS). Las células se tiñeron con anticuerpo de ratón monoclonal antilamina A/C (MAB3211, Chemicon) y de conejo policlonal antiprogerina (anticuerpo peptídico personalizado, Yenzm) durante 3 horas a temperatura ambiente en el siguiente día. Los anticuerpos primarios se detectaron con anticuerpos secundarios marcados con Alexa Fluor (Invitrogen). Los portaobjetos montados con medio de montaje Vectashield que contenía DAPI se observaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss. Los tiempos de exposición y los ajustes de adquisición se establecieron al inicio de cada serie de experimentos y se mantuvieron constantes para todos los tratamientos. Los resultados de los experimentos se exponen en la figura 2. Varios oligonucleótidos regularon por disminución la progerina de forma significativa.
EJEMPLO 3
SDS-PAGE Y ANÁLISIS DE TRANSFERENCIA DE WESTERN DE CÉLULAS HGPS DESPUÉS DE TRATAMIENTO CON OLIGONUCLEÓTIDOS DE ANTISENTIDO DIRIGIDOS A LMNA
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western: Se recogieron las células tratadas, se aclararon dos veces en PBS y después se lisaron en tampón de carga de SDS-PAGE de Laemmli. Las muestras se calentaron durante 15 minutos a 95 °C y después se cargaron en geles al 10 % de SDS-PAGE. En cuanto al análisis de transferencia de Western, las proteínas se transfirieron a las membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con leche al 5 %/TBST a 4 °C durante una noche y se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en BSA al 4 %/TBST a temperatura ambiente durante 1-3 horas. Después de lavados con TBST, las membranas se incubaron en anticuerpos secundarios diluidos a 1:5000 en leche al 1 %/TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. La quimioluminiscencia se detectó con un kit de detección de transferencia de Western ECL (Pierce). Los anticuerpos primarios usados incluyen anticuerpo de ratón monoclonal antilamina A/C (MAB3211, Chemicon), de conejo policlonal antiprogerina (anticuerpo peptídico personalizado, Yenzm) y de conejo policlonal antiactina (Pan-actin, Cell Signaling). Los resultados de los experimentos se exponen en la figura 3. El oligonucleótido correspondiente a 699 (SEQ ID NO: 4) mostró regulación por disminución significativa de progerina en el experimento, a pesar de retirarse de y no solapar con el sitio de corte y empalme críptico del exón 11 de LMNA.
EJEMPLO 4
ANÁLISIS DE RT-PCR CUANTITATIVA DE CÉLULAS HGPS DESPUÉS DE TRATAMIENTO CON OLIGONUCLEÓTIDOS DE ANTISENTIDO DIRIGIDOS A LMNA
RT-PCR cuantitativa: Los experimentos de RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) se realizaron para medir los niveles de expresión de progerina, lamina A y p-actina en 164 fibroblastos (p13, HGPS clásico) después de tratamiento con oligonucleótido 699 (SEQ ID NO: 4) y 706 (SEQ ID NO: 11). Todas las reacciones se realizaron por triplicado en un sistema rápido de PCR en tiempo real 7900HT de Applied Biosystems usando mezcla SYBR Green (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 1 ciclo de 2 min a 50 °C; 1 ciclo de 15 min a 95 °C; y 40 ciclos de 15 s a 95 °C, 1 min a 57 °C y 45 s a 72 °C. La secuencia del cebador directo de p-actina es TCTTTGCAGCCACATTCCCG y el cebador inverso es GGCTTGCGGGTGTTAAAAGC. La secuencia del cebador directo para amplificar progerina/lamina A es GCAACAAGTCCAATGAGGACCA. Los cebadores inversos específicos de progerina y lamina A se diseñaron de acuerdo con la estrategia del sistema de mutación resistente a amplificación, introduciendo una mutación en la penúltima base para aumentar la especificidad. La secuencia cebadora específica de progerina es CATGATGCTGCAGTTCTGGGGGCTCTGGAC, y para lamina A es CATGATGCTGCAGTTCTGGGGGCTCTGGAT. Los resultados de los experimentos se exponen en la figura 4.
EJEMPLO 5
SDS-PAGE Y ANÁLISIS DE TRANSFERENCIA DE WESTERN DE CÉLULAS HGPS DESPUÉS DE TRATAMIENTO CON OLIGONUCLEÓTIDOS DE ANTISENTIDO DIRIGIDOS A LMNA
SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western: Se recogieron las células tratadas, se aclararon dos veces en PBS y después se lisaron en tampón de carga de SDS-PAGE de Laemmli. Las muestras se calentaron durante 15 minutos a 95 °C y después se cargaron en geles al 10 % de SDS-PAGE. En cuanto al análisis de transferencia de Western, las proteínas se transfirieron a las membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con leche al 5 %/TBST a 4 °C durante una noche y se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en BSA al 4 %/TBST a temperatura ambiente durante 1-3 horas. Después de lavados con TBST, las membranas se incubaron en anticuerpos secundarios diluidos a 1:5000 en leche al 1 %/TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. La quimioluminiscencia se detectó con un kit de detección de transferencia de Western ECL (Pierce). Los anticuerpos primarios usados incluyen anticuerpo de ratón monoclonal antilamina A/C (MAB3211, Chemicon), de conejo policlonal antiprogerina (anticuerpos peptídico personalizado, Yenzm) y antiactina conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (Sigma). Los resultados de los experimentos se exponen en la figura 5. El oligonucleótido 699 (SEQ ID NO: 4) dio lugar a regulación por disminución de progerina y regulación por aumento de lamina A, a pesar de retirarse de y no solapar con el sitio de corte y empalme críptico del exón 11 de LMNA.
REFERENCIAS
Cao, K., C. D. Blair, et al. (2011). "Progerin and telomere dysfunction collaborate to trigger cellular senescence in normal human fibroblasts." J Clin Invest.
Egholm, M., O. Buchardt, et al. (1993). "PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson- Crick hydrogen-bonding rules." Nature 365(6446): 566-8.
Kinali, M., V. Arechavala-Gomeza, et al. (2009). "Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, dose-escalation, proof-of- concept study." Lancet Neurol 8(10): 918-28.
Osorio, F. G., C. L. Navarro, et al. (2011). "Splicing-directed therapy in a new mouse model of human accelerated aging." Sci Transl Med 3(106): 106ra107.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Scaffidi, P. y T. Misteli (2005). "Reversal of the cellular phenotype in the premature aging disease Hutchinson-Gilford progeria syndrome." Nat Med 11(4): 440-5.
Svasti, S., T. Suwanmanee, et al. (2009). "RNA repair restores hemoglobin expression in IVS2-654 thalassemic mice." Proc Natl Acad Sci U S A 106(4): 1205-10.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Sarepta Therapeutics, Inc.
<120> ANÁLOGOS OLIGONUCLEOTÍDICOS DIRIGIDOS A LMNA HUMANA
<130> 120178.494WO
<150> US 61/568.590 <151>
<160> 54
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 <211> 270 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana de LMNA ejemplar <400> 1
ggctcccact
gcagcagctc gggggacccc gctgagtaca acctgcgctc gcgcaccgtg 60
ctgtgcggga
cctgcgggca gcctgccgac aaggcatctg ccagcggctc aggagcccag 120
gtgggcggac
ccatctcctc tggctcttct gcctccagtg tcacggtcac tcgcagctac 180
cgcagtgtgg
ggggcagtgg gggtggcagc ttcggggaca atctggtcac ccgctcctac 240
ctcctgggca
actccagccc ccgaacccag 270
<210> 2 <211> 270 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana de LMNA ejemplar <400> 2

ggctcccact gcagcagctc gggggacccc gctgagtaca acctgcgctc gcgcaccgtg 60

ctgtgcggga cctgcgggca gcctgccgac aaggcatctg ccagcggctc aggagcccag 120

gtgggtggac ccatctcctc tggctcttct gcctccagtg tcacggtcac tcgcagctac 180

cgcagtgtgg ggggcagtgg gggtggcagc ttcggggaca atctggtcac ccgctcctac 240

ctcctgggca actccagccc ccgaacccag 270
<210> 3 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 3
ccgctggcag atgccttgtc ggcag 25
<210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 4
ctgagccgct ggcagatgcc ttgtc 25
<210> 5 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 5
gctcctgagc cgctggcaga tgcct 25
<210> 6 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 6
tgggctcctg agccgctggc agatg 25
<210>7 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencias de dirección a HGPS ejemplares <400> 7
cacctgggct cctgagccgc tggca 25
<210>8 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 8
ccacccacct gggctcctga gccgc 25
<210>9 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400>9
gggtccaccc acctgggctc ctgag 25
<210> 10 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 10
agatgggtcc acccacctgg gctcc 25
<210> 11 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 11
gaggagatgg gtccacccac ctggg 25
<210> 12 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 12
gccagaggag atgggtccac ccacc 25
<210> 13 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 13
aagagccaga ggagatgggt ccacc 25
<210> 14 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 14
cagaagagcc agaggagatg ggtcc 25
<210> 15 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 15
gaggcagaag agccagagga gatgg 25
<210> 16 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 16
actggaggca gaagagccag aggag 25
<210> 17 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 17
acgtggtggt gatggagcag gtcat 25
<210> 18 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 18
actcacgtgg tggtgatgga gcagg 25
<210> 19 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 19
gctaccactc acgtggtggt gatgg 25
<210> 20 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 20
cggcggctac cactcacgtg gtggt 25
<210> 21 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 21
cagcggcggc taccactcac gtggt 25
<210> 22 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 22
cctcagcggc ggctaccact cacgt 25
<210> 23 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 23
ggcctcagcg gcggctacca ctcac 25
<210> 24 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 24
gctcggcctc agcggcggct accac 25
<210> 25 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 25
cgagtctggg actgaccact caggc 25
<210> 26 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 26
aggctcaggc gggacggcga gtctg 25
<210> 27 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 27
agacaaggct caggcgggac ggcga 25
<210> 28 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 28
agggagacaa ggctcaggcg ggacg 25
<210> 29 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 29
gggaagggag acaaggctca ggcgg 25
<210> 30 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 30
gccctgggaa gggagacaag gctca 25
<210> 31 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 31
gtgggagccc tgggaaggga gacaa 25
<210> 32 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 32
ctgctgcagt gggagccctg ggaag 25
<210> 33 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 33
agctgctgca gtgggagccc tggga 25
<210> 34 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <400> 34
cccccgagct gctgcagtgg gagcc 25
<210> 35 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <220>
<221> misc_feature <222> (26)..(26)
<223> n = un transportador peptídico de penetración celular preferente <400> 35
gctaccactc acgtggtggt gatggn 26
<210> 36 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <220>
<221> misc_feature <222> (26)..(26)
<223> n = un transportador peptídico de penetración celular preferente <400> 36
gggtccaccc acctgggctc ctgagn 26
<210> 37 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> n = unión entre subunidades apn <220>
<221> misc_feature <222> (9)..(9)
<223> n = unión entre subunidades apn
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<221> misc_feature <222> (14)..(14)
<223> n = unión entre subunidades apn <220>
<221> misc_feature <222> (20)..(20)
<223> n = unión entre subunidades apn <400> 37
gcnaccacnc acgnggtggn gatgg 25
<210> 38 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de dirección a HGPS ejemplar <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> n = unión entre subunidades apn <220>
<221> misc_feature <222> (14)..(14)
<223> n = unión entre subunidades apn <220>
<221> misc_feature <222> (19)..(19)
<223> n = unión entre subunidades apn <220>
<221> misc_feature <222> (22)..(22)
<223> n = unión entre subunidades apn <400> 38
gggnccaccc accngggcnc cngag 25
<210> 39 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <400> 39
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 1 5
<210> 40 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5
<210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <400> 41
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Phe Phe 15 10
<210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <400> 42
Arg Arg Arg Arg Arg Phe Phe Arg Arg Arg Arg 15 10
<210> 43 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportadores peptídicos de penetración celular ricos en arginina <400> 43
Arg Arg Arg Arg 1
<210> 44 <211>5 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <400> 44
Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
<210> 45 <211>6 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 '
<210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <400> 46
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 "
<210> 47 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <400> 47
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 "
<210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <400> 48
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 "
<210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2)
<223> Xaa = Acp
<220>
<221> MOD_RES <222> (4)..(4)
<223> Xaa = Acp
<220>
<221> MOD_RES <222> (6)..(6)
<223> Xaa = Acp
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<220>
<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa = Acp
<220>
<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Xaa = Acp
<220>
<221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Xaa - Acp
<220>
<221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Xaa = Acp
<220>
<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Xaa = Acp
<400> 49
Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa 15 10 15
<210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2)
<223> Xaa - ácido 6-aminohexanoico <220>
<221> MOD_RES <222> (5)..(5)
<223> Xaa = ácido 6-aminohexanoico <220>
<221> MOD_RES <222> (8)..(8)
<223> Xaa = ácido 6-aminohexanoico <220>
<221> MOD_RES <222> (11)..(11)
<223> Xaa = ácido 6-aminohexanoico <400> 50
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg 15 10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210>51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2)
<223> Xaa = ácido 6-aminohexanoico <220>
<221> MOD_RES <222> (5)..(5)
<223> Xaa = ácido 6-aminohexanoico <220>
<221> MOD_RES <222> (8)..(8)
<223> Xaa = ácido 6-aminohexanoico <220>
<221> MOD_RES <222> (11)..(11)
<223> Xaa = ácido 6-aminohexanoico <220>
<221> MOD_RES <222> (14)..(14)
<223> Xaa = ácido 6-aminohexanoico <400> 51
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg 15 10 15
<210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2)
<223> Xaa = ácido 6-aminohexanoico <220>
<221> MOD_RES <222> (5)..(5)
<223> Xaa = beta-alanina
<220>
<221> MOD_RES <222> (8)..(8)
<223> Xaa = ácido 6-aminohexanoico <220>
<221> MOD_RES <222> (11)..(11)
<223> Xaa = beta-alanina
5
10
15
20
25
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg 15 10
<210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador de penetración celular rico en arginina <400> 53
Arg Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ala Arg Phe Phe Cys 15 10 15
<210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> transportador peptídico de penetración celular rico en arginina <400> 54
Arg Gly Arg Arg Gly Arg Arg Gly Arg Arg Gly Arg Phe Phe Cys 15 10 15

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    1. Un oligonucleótido de antisentido para reducir la expresión de ARNm de LMNA con corte y empalme anómalo, teniendo el oligonucleótido una estructura sustancialmente no cargada y estando compuesto de subunidades morfolino y uniones entre unidades que contienen fósforo que unen un nitrógeno de morfolino de una subunidad con un carbono 5'-exocíclico de una subunidad adyacente,
    que contiene 25-40 bases, y
    que comprende una secuencia de dirección que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 10, 11, 13, 14 y 16,
    en el que el oligonucleótido de antisentido se adhiere covalentemente a un péptido de penetración celular y resto conector, en el que el resto conector se selecciona de glicina, cisteína, prolina, ácido 6-aminohexanoico (Ahx), p- alanina (B) y Ahx-B, y el péptido de penetración celular se selecciona de las SEQ ID NO: 39-54.
  2. 2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que las subunidades morfolino en el oligonucleótido se unen por uniones que contienen fósforo, de acuerdo con la siguiente estructura:
    imagen1
    en la que Z es S u O,
    X = NR1R2 u OR6,
    Y = O o NR7,
    Pj es un resto de emparejamiento de bases de purina o pirimidina, y cada una de dichas uniones se selecciona de:
    (a) unión no cargada (a), en la que cada uno de R1, R2, R6, y R7 se selecciona independientemente de hidrógeno y alquilo inferior;
    (b1) unión catiónica (b1), en la que X = NR1R2 e Y= O, y NR1R2 representa un grupo piperazino sustituido opcional, de modo que R1R2 = -CHRCHRN(R3)(R4)CHRCHR-, en la que cada R4 es H, CH3 o no existe, y
    R3 se selecciona de H, alquilo inferior, C(=NH)NH2, Z-L-NHC(=NH)NH2, y [C(O)CHR'NH]mH, en el que cuando Z es carbonilo (C(O)) o un enlace directo, L es un conector opcional de hasta 18 átomos de longitud que tiene enlaces seleccionados de alquilo, alcoxi y alquilamino, R' es una cadena lateral de un aminoácido de origen natural o un homólogo de uno o dos carbonos del mismo, y m es de 1 a 6;
    (b2) unión catiónica (b2), en la que X = NR1R2 e Y = O, R1 = H o CH3, y R2 = LNR3R4R5, en la que L, R3, y R4 se definen como anteriormente, y R5 es H, alquilo inferior o (alcoxi)alquilo inferior; y
    (b3) unión catiónica (b3), en la que Y = NR7 y X = OR6, y R7 = LNR3R4R5, en la que L, R3, y R4 y R5 se definen como anteriormente, y R6 es H o alquilo inferior; y al menos una de dichas uniones se selecciona de uniones catiónicas (b1), (b2) y (b3).
  3. 3. El oligonucleótido de la reivindicación 2, donde
    (i) cada uno de R1 y R2, en las uniones de tipo (a), es metilo;
    (ii) al menos una unión es de tipo (b1), donde cada R es H, R4 es H, CH3, o un par de electrones, y R3 se selecciona de H, CH3, C(=NH)NH2, y C(O)-L-NHC(=NH)NH2;
    (iii) al menos una unión es de tipo (b1), donde cada R es H, R4 es un par de electrones, y R3 se selecciona de
    C(=NH)NH2 y C(O)-L-NHC(=NH)NH2; 4 3
    (iv) al menos una unión es de tipo (b1), donde cada R es H, R4 es un par de electrones, y R3 se selecciona de C(=NH)NH2 y C(O)-L-NHC(=NH)NH2, y opcionalmente donde R3 es C(O)-L-NHC(NH)NH2, y L a un hidrocarburo que tiene la estructura -(CH2)n-, donde n es de 1 a 12; o
    (v) al menos una unión es de tipo (b1), donde cada R es H, y cada uno de R3 y R4 es independientemente H o CH3.
  4. 4. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el péptido de penetración celular se
    adhiere en su extremo C al extremo 5' o extremo 3' del oligonucleótido a través del resto conector.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
  5. 5. Un oligonucleótido de antisentido, en el que el oligonucleótido reduce la expresión del ARNm de LMNA con corte y empalme anómalo, comprendiendo el oligonucleótido una estructura, comprendiendo la estructura una secuencia de estructuras cíclicas de morfolino unidas por uniones entre subunidades, uniendo las uniones entre unidades un extremo 3' de una estructura cíclica de morfolino con un extremo 5' de una estructura cíclica de morfolino adyacente, en el que cada estructura cíclica de morfolino se une a un resto de emparejamiento de bases, de modo que el oligonucleótido puede unirse de una manera específica de secuencia a un ácido nucleico diana, que comprende una secuencia de dirección que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 10, 11, 13, 14 y 16, en el que las uniones entre subunidades tienen la siguiente estructura general (I):
    imagen2
    (1)
    o una sal o isómero de la misma, y en el que cada una de las uniones (I) entre subunidades son independientemente unión (A) o unión (B):
    en el que para la unión (A):
    W es, en cada caso, independientemente S u O;
    X es, en cada caso, independientemente -N(CH3)2, -NR1R2, -OR3 o;
    imagen3
    Y es, en cada caso, independientemente O o -NR2,
    R1 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo;
    R2 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o -LNR4R5R7;
    R3 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6;
    R4 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, metilo, -C(=NH)NH2, -Z-L-NHC(=NH)NH2 o - [C(O)CHR'NH]mH, donde Z es carbonilo (C(O)) o un enlace directo, R' es una cadena lateral de un aminoácido de origen natural o un homólogo de uno o dos carbonos del mismo, y m es de 1 a 6;
    R5 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, metilo o un par de electrones;
    R6 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o metilo;
    R7 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C6 o alcoxialquilo C1-C6;
    L es un conector opcional de hasta 18 átomos de longitud que comprende grupos alquilo, alcoxi o alquilamino, o combinaciones de los mismos; y
    en el que para la unión (B):
    W es, en cada caso, independientemente S u O,
    X es, en cada caso, independientemente -NR8R9 u -OR3; e
    Y es, en cada caso, independientemente O o -NR10, o Yy W son cada uno O,
    R8 es, en cada caso, independientemente hidrógeno o alquilo C2-C12;
    R9 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12, aralquilo C1-C12 o arilo;
    R10 es, en cada caso, independientemente hidrógeno, alquilo C1-C12 o -LNr4R5R7;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    8 9 8 9 3
    en el que R y R pueden unirse para formar un heterociclo mono- o bicíclico de 5-18 miembros o R , R o R pueden unirse con R10 para formar un heterociclo de 5-7 miembros, y en el que, cuando X es 4-piparazino, X tiene la siguiente estructura (III):
    R12
    imagen4
    R12
    (III)
    en la que:
    R11 es, en cada caso, independientemente alquilo C2-C12, aminoalquilo C1-C12, alquilcarbonilo C1-C12, arilo, heteroarilo o heterociclilo; y
    R es, en cada caso, independientemente un par de electrones, hidrógeno o alquilo C1-C12; y R12 es, en cada caso, independientemente, hidrógeno, alquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12, -NH2, -NR13R14, - NR13R14R15, alquilcarbonilo C1-C12, oxo, -CN, trifluorometilo, amidilo, amidinilo, amidinilalquilo,
    amidinilalquilcarbonil guanidinilo, guanidinilalquilo, guanidinilalquilcarbonilo, colato, desoxicolato, arilo, heteroarilo, heterociclo, -SR13 o alcoxi C1-C12, en la que R13, R14 y R15 son, en cada caso, independientemente alquilo C1-C12;
    en el que al menos una de las uniones entre subunidades es la unión (B), o en el que cada unión (B), si está presente, tiene la misma estructura en cada caso; y
    en el que el oligonucleótido de antisentido se adhiere covalentemente a un péptido de penetración celular y resto conector, en el que el resto conector se selecciona de glicina, cisteína, prolina, ácido 6-aminohexanoico (Ahx), p-alanina (B) y Ahx-B, y el péptido de penetración celular se selecciona de las SEQ ID NO: 39-54.
  6. 6. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la secuencia de dirección consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 10, 11, 13, 14 y 16.
  7. 7. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia de dirección es la SEQ ID NO: 4.
  8. 8. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia de dirección es la SEQ ID NO: 5.
  9. 9. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia de dirección es la SEQ ID NO: 10.
  10. 10. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia de dirección es la SEQ ID NO: 11.
  11. 11. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia de dirección es la SEQ ID NO: 13.
  12. 12. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia de dirección es la SEQ ID NO: 14.
  13. 13. El oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia de dirección es la SEQ
    ID NO: 16.
ES12805882.3T 2011-12-08 2012-12-07 Análogos oligonucleotídicos dirigidos a LMNA humana Active ES2674929T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161568590P 2011-12-08 2011-12-08
US201161568590P 2011-12-08
PCT/US2012/068606 WO2013086441A2 (en) 2011-12-08 2012-12-07 Oligonucleotide analogues targeting human lmna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2674929T3 true ES2674929T3 (es) 2018-07-05

Family

ID=47429038

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12805882.3T Active ES2674929T3 (es) 2011-12-08 2012-12-07 Análogos oligonucleotídicos dirigidos a LMNA humana
ES18159070T Active ES2935606T3 (es) 2011-12-08 2012-12-07 Análogos de oligonucleótidos dirigidos a LMNA humana

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18159070T Active ES2935606T3 (es) 2011-12-08 2012-12-07 Análogos de oligonucleótidos dirigidos a LMNA humana

Country Status (15)

Country Link
US (7) US9066967B2 (es)
EP (3) EP3399038B1 (es)
JP (7) JP6132849B2 (es)
CY (1) CY1120495T1 (es)
DK (1) DK2788487T3 (es)
ES (2) ES2674929T3 (es)
HR (1) HRP20181022T1 (es)
HU (1) HUE038369T2 (es)
LT (1) LT2788487T (es)
PL (1) PL2788487T3 (es)
PT (1) PT2788487T (es)
RS (1) RS57467B1 (es)
SI (1) SI2788487T1 (es)
TR (1) TR201809173T4 (es)
WO (2) WO2013086444A2 (es)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
KR102182663B1 (ko) 2010-05-28 2020-11-25 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 변형된 서브유니트간 결합 및/또는 말단 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체
WO2012031243A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Avi Biopharma, Inc. dsRNA MOLECULES COMPRISING OLIGONUCLEOTIDE ANALOGS HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/OR TERMINAL GROUPS
WO2013074834A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Sarepta Therapeutics, Inc. Functionally-modified oligonucleotides and subunits thereof
TR201809173T4 (tr) 2011-12-08 2018-07-23 Sarepta Therapeutics Inc İnsan LMNA'sını hedef alan oligonükleotid analogları.
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
CA2922838A1 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
WO2015097600A2 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Sentiss Pharma Private Limited Topical brimonidine tartrate ophthalmic solution
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10675356B2 (en) * 2015-05-19 2020-06-09 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
WO2016196670A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon exclusion in type vii collagen
US11020417B2 (en) 2015-06-04 2021-06-01 Sarepta Therapeutics, Inc Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions
JP7042255B2 (ja) * 2016-04-29 2022-03-25 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヒトｌｍｎａを標的にするオリゴヌクレオチド類縁体
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CA3039928A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 President And Fellows Of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
JP7048574B2 (ja) * 2017-03-10 2022-04-05 国立研究開発法人国立成育医療研究センター アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
EP3626821A4 (en) * 2017-05-18 2021-03-03 Kyoto University COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF SPINOCEREBELLOUS ATAXIA TYPE 36
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
JP6884268B2 (ja) * 2018-03-09 2021-06-09 第一三共株式会社 糖原病Ｉａ型治療薬
WO2020051360A1 (en) * 2018-09-05 2020-03-12 The Broad Institute, Inc. Base editing for treating hutchinson-gilford progeria syndrome
MX2021003866A (es) 2018-10-05 2021-09-08 Xenotherapeutics Inc Productos y metodos de xenotransplante.
US10883084B2 (en) 2018-10-05 2021-01-05 Xenotherapeutics, Inc. Personalized cells, tissues, and organs for transplantation from a humanized, bespoke, designated-pathogen free, (non-human) donor and methods and products relating to same
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
KR20230019843A (ko) 2020-05-08 2023-02-09 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 두 가닥의 동시 편집을 위한 방법 및 조성물

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH445129A (fr) 1964-04-29 1967-10-15 Nestle Sa Procédé pour la préparation de composés d'inclusion à poids moléculaire élevé
US3459731A (en) 1966-12-16 1969-08-05 Corn Products Co Cyclodextrin polyethers and their production
US3453257A (en) 1967-02-13 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin with cationic properties
US3426011A (en) 1967-02-13 1969-02-04 Corn Products Co Cyclodextrins with anionic properties
US3453259A (en) 1967-03-22 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin polyol ethers and their oxidation products
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
EP0215942B1 (en) 1985-03-15 1995-07-12 Antivirals Inc. Polynucleotide assay reagent and method
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US4794499A (en) 1988-02-16 1988-12-27 Ott John N Grounding device for lamp with shielded electrodes
KR0166088B1 (ko) 1990-01-23 1999-01-15 . 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
JPH07501204A (ja) 1991-06-28 1995-02-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 局所的オリゴヌクレオチド療法
AU4769893A (en) 1992-07-17 1994-02-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
IL115849A0 (en) 1994-11-03 1996-01-31 Merz & Co Gmbh & Co Tangential filtration preparation of liposomal drugs and liposome product thereof
US6245747B1 (en) 1996-03-12 2001-06-12 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Targeted site specific antisense oligodeoxynucleotide delivery method
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
WO1999042091A2 (en) 1998-02-19 1999-08-26 Massachusetts Institute Of Technology Use of polycations as endosomolytic agents
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
CN102180924A (zh) 1999-05-04 2011-09-14 桑塔里斯制药公司 L-核糖-lna类似物
US7163695B2 (en) 1999-12-29 2007-01-16 Mixson A James Histidine copolymer and methods for using same
US7070807B2 (en) 1999-12-29 2006-07-04 Mixson A James Branched histidine copolymers and methods for using same
WO2003020739A2 (en) 2001-09-04 2003-03-13 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
KR20030084444A (ko) 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
US7211668B2 (en) 2003-07-28 2007-05-01 Panagene, Inc. PNA monomer and precursor
US8258109B2 (en) * 2005-10-20 2012-09-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of LMNA expression
AU2007297861A1 (en) 2006-05-10 2008-03-27 Avi Biopharma, Inc. Oligonucleotide analogs having cationic intersubunit linkages
WO2009005793A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Avi Biopharma, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
US20100016215A1 (en) * 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
US8076476B2 (en) 2007-11-15 2011-12-13 Avi Biopharma, Inc. Synthesis of morpholino oligomers using doubly protected guanine morpholino subunits
CA2704261C (en) 2007-11-15 2015-05-26 Avi Biopharma, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
AU2008345033B2 (en) 2007-12-28 2014-04-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunomodulatory agents and methods of use
KR20190079702A (ko) * 2008-10-24 2019-07-05 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 Dmd를 위한 다중 엑손 스키핑 조성물
DE102009046261B4 (de) 2009-10-30 2012-05-16 GLOBALFOUNDRIES Dresden Module One Ltd. Liability Company & Co. KG Verfahren zur Herstellung von Transistoren mit Metallgateelektrodenstrukturen mit großem ε, die vor den Drain/Source-Gebieten auf der Grundlage eines Opferkohlenstoffabstandshalters hergestellt werden
US8697858B2 (en) * 2009-11-13 2014-04-15 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
US8012804B1 (en) 2009-12-23 2011-09-06 Western Digital (Fremont), Llc Method and system for mounting lasers on energy assisted magnetic recording heads
KR102182663B1 (ko) 2010-05-28 2020-11-25 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 변형된 서브유니트간 결합 및/또는 말단 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체
CN103384932A (zh) 2011-02-23 2013-11-06 日本瑞翁株式会社 二次电池用负极、二次电池、负极用浆料组合物及二次电池用负极的制造方法
WO2012150960A1 (en) 2011-05-05 2012-11-08 Avi Biopharma, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
WO2013074834A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Sarepta Therapeutics, Inc. Functionally-modified oligonucleotides and subunits thereof
TR201809173T4 (tr) 2011-12-08 2018-07-23 Sarepta Therapeutics Inc İnsan LMNA'sını hedef alan oligonükleotid analogları.

Also Published As

Publication number Publication date
US10398721B2 (en) 2019-09-03
JP6596032B2 (ja) 2019-10-23
US11071749B2 (en) 2021-07-27
JP2019129848A (ja) 2019-08-08
EP3399038A2 (en) 2018-11-07
JP2015505839A (ja) 2015-02-26
PL2788487T3 (pl) 2018-10-31
US9833468B2 (en) 2017-12-05
US20160102307A1 (en) 2016-04-14
JP7277503B2 (ja) 2023-05-19
EP2788487A2 (en) 2014-10-15
JP2015501817A (ja) 2015-01-19
US9066967B2 (en) 2015-06-30
JP2021104052A (ja) 2021-07-26
WO2013086441A3 (en) 2013-08-01
HRP20181022T1 (hr) 2018-08-24
CY1120495T1 (el) 2019-07-10
PT2788487T (pt) 2018-07-03
JP2017101080A (ja) 2017-06-08
EP3399038B1 (en) 2022-11-16
JP6132849B2 (ja) 2017-05-31
US9682097B2 (en) 2017-06-20
EP2788488A2 (en) 2014-10-15
DK2788487T3 (en) 2018-07-23
US20140024698A1 (en) 2014-01-23
US20140024821A1 (en) 2014-01-23
HUE038369T2 (hu) 2018-10-29
WO2013086444A2 (en) 2013-06-13
LT2788487T (lt) 2018-09-10
EP2788487B1 (en) 2018-04-04
JP6581132B2 (ja) 2019-09-25
US10076536B2 (en) 2018-09-18
JP6132848B2 (ja) 2017-05-31
US20170051278A1 (en) 2017-02-23
US20180092938A1 (en) 2018-04-05
US20200147119A1 (en) 2020-05-14
US9326992B2 (en) 2016-05-03
WO2013086441A2 (en) 2013-06-13
EP3399038A3 (en) 2019-02-13
TR201809173T4 (tr) 2018-07-23
JP2017099416A (ja) 2017-06-08
WO2013086444A3 (en) 2013-08-01
SI2788487T1 (sl) 2018-09-28
US20180271893A1 (en) 2018-09-27
ES2935606T3 (es) 2023-03-08
JP2019172691A (ja) 2019-10-10
EP2788488B1 (en) 2018-03-21
RS57467B1 (sr) 2018-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2674929T3 (es) Análogos oligonucleotídicos dirigidos a LMNA humana
US11225662B2 (en) Peptide oligonucleotide conjugates
AU2011367230B2 (en) Peptide oligonucleotide conjugates
ES2876939T3 (es) Péptidos penetradores de células que tienen un dominio hidrófobo central
RU2759022C2 (ru) Вещества для нацеливания на различные выбранные органы или ткани
ES2750689T3 (es) Señuelos oligonucleotídicos para el tratamiento del dolor