FR2801216A1

FR2801216A1 - Utilisation de derives d'indirubine pour la fabrication de medicaments

Info

Publication number: FR2801216A1
Application number: FR9914749A
Authority: FR
Inventors: Laurent Meijer; Gerhard Eisenbrand; Ralph Hoessel; Andrea Thommet
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-11-23
Filing date: 1999-11-23
Publication date: 2001-05-25
Also published as: AU2177001A; WO2001037819A3; WO2001037819A2; CA2387591A1; JP2003514850A; EP1231916A2

Abstract

L'invention vise l'utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de la GSK-3 de dérivés d'indirubine. Application pour le traitement de pathologies impliquant GSK-3 et CDK5.

Description

Utilisation de dérivés d'indirubine pour la fabrication de médicaments.

L'invention a pour objet une nouvelle utilisation en thérapeutique de dérivés d'indirubine.

L'indirubine appartient à la famille des indigoïdes. Le terme indigoïde est utilisé comme nom générique des colorants du groupe de l'indigo.Il s'agit de bis-indoles, dérivés de diverses sources naturelles par fermentation, oxydation et dimérisation en présence de lumière.

L'indirubine (ou isoindigotine), répond à la formule A :

Elle constitue le principe actif du Danggui Longhui Wan, utilisé en médecine traditionnelle chinoise dans le traitement de maladies chroniques, comme les leucémies.

Dans la demande EP 98 109 854. 2, dans laquelle certains des inventeurs de la demande sont co-inventeurs, on rapporte que des dérivés d'indigoïdes, parmi lesquels l'indirubine et ses dérivés, sont des inhibiteurs puissants des kinases cycline-dépendantes (CDKs en abrégé), avec des IC50 (dose inhibitrice à 50%) de 50 à 200 nM (voir également Hoessel et al., Nature Cell Biology, vol 1, n 1, mai 1999). Ces kinases sont des régulateurs clés du cycle cellulaire.

Les inhibiteurs entrent en compétition avec l'ATP pour se lier à la sous-unité catalytique de la kinase.

Ces propriétés inhibitrices de CDKs, qui entraînent un arrêt du cycle cellulaire, confèrent à ces dérivés d'indigoïdes un intérêt pour le traitement de pathologies liées à la perte du contrôle de la prolifération comme les cancers, le psoriasis, les maladies cardiovasculaires, les maladies infectieuses, la néphrologie, les maladies neurodégénératives et les infections virales.

De manière surprenante, les inventeurs ont à présent mis en évidence que, parmi ces dérivés d'indigoïdes, seuls les dérivés d'indirubine exerçaient en outre un effet inhibiteur sur une autre cible enzymatique, constituée par la glycogène synthase kinase-3p ou GSK-3 en abrégé.

Cette kinase est un élément essentiel de la voie de signaux WNT. Elle est impliquée dans de multiples processus physiologiques : du cycle cellulaire par contrôle de taux de cycline Dl et de -caténine, formation dorso-ventrale durant le développement, action de l'insuline sur la synthèse de glycogène, excroissance axonale, neurotoxicité de HIV-1 à médiation par Tat, et autres.

De plus, on sait que la GSK-3 et la CDK5 sont responsables pour une bonne part de l'hyperphosphorylation anormale de la protéine tau liant les microtubules comme observé dans les filaments appariés en hélice dans la maladie d'Alzheimer.

On mesure également l'intérêt de pouvoir disposer de dérivés inhibiteurs de l'activité de GSK-3 pour favoriser la division cellulaire.

Or, les seuls inhibiteurs de la GSK-3 connus à ce jour sont constitués par le lithium et certains dérivés de purine.

La sélectivité du lithium n'a pas été rapportée, mais étant donné la nature atomique du produit, il est vraisemblable qu'elle doit être très faible. De plus, le lithium n'agit qu'à des doses considérables (ICso autour de 10 mM) .

Il en est de même avec les dérivés de purine décrits dans la demande WO 98/16528, qui sont peu sélectifs et dont les IC50 sont autour de 10 uM.

L'invention apporte une solution à ces problèmes avec l'utilisation d'indirubines de grande efficacité avec des IC5o inférieures à 10 uM, et le plus généralement de l'ordre de 5 à 50 nM, pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3.

Conformément à l'invention, pour la fabrication desdits médicaments, on utilise des dérivés d'indirubine répondant à la formule générale I :

dans laquelle R et R , identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe méthylènehydroxy; un radical alcoyle ou alkyloxy ou méthylènealkoxy, à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18; un radical cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un radical aryle, aralkyle ou aryloxy, substitué ou non substitué, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe mono-, diou trialkylsilyle ayant 1 à 6 de carbone, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas, dans le groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée; un groupe mono-, di- ou

triarylsilyle, avec des groupes aryle substitués ou non, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas; un groupe trifluorométhyle ; un groupe-COM; -COOM ; ou -CH2COOM, avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cl à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, radicaux alkyle ou groupe alcoxy; un groupe

~NRllRlz dans lequel Rll et R12 , identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un

groupe acyle; un groupe méthylèneamino -CHz-NRllRI2, dans lequel R11 et R12 présentent les significations ci-dessus; un groupe benzyle, dans lequel le noyau benzène comprend, le cas échéant, un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un résidu d'acide aminé physiologique lié à l'azote, comme un amide ; un 0-glycoside ou un N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les disaccharides; ou un groupe méthylènesulfonate; R2, R3, R4,

R5, R 7, R8, R9 et R10, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène; d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe nitroso; un groupe nitro; un groupe alkoxy; un groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino; un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe aralkyle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe aryloxy, substitué ou non comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un

groupe méthylènearyloxy, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe cycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe trifluorométhyle; un groupe -COM; -COOM ; ou CH2COOM, avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cl à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, groupes alkyle ou groupes

alcoxy ; un groupe -NR"R 12 dans lequel Rit et R12, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, un groupe acyle, ou dans lequel l'atome d'azote fait partie d'un groupe cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou

plusieurs hétéroatomes; un groupe -CONRllR12, dans lequel Rll et R12 présentent les significations ci-dessus; un groupe hydroxylamino; un groupe phosphate; un groupe phosphonate; un groupe sulfate; un groupe sulfonate; un groupe

sulfonamide; un groupe -SOZNRllR12, dans lequel R11 et R12 présentent les significations données ci-dessus; un groupe azo -N=N-R13, dans lequel R13 représente un groupe aromatique, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, ou un groupe 0-glycoside ou N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les dissacharides ; ouR1 et R5, et R6 et R10, respectivement, forment ensemble, indépendamment l'un de l'autre, un cycle ayant 1 à 4 groupes CH2, le cas échéant substitué ; etX et Y,

identiques ou différents, représentent un atome d'oxygène; de soufre ; sélénium ; tellurium; un groupe -NR14, dans lequel R14 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, un groupe aralkyle, ou un groupe sulfonate ; ou-NOR14, dans lequel le groupe R14 présente les significations données ci-dessus, et les sels de ces dérivés physiologiquement acceptables.

Dans une disposition de l'invention, un ou plusieurs atomes d'un ou plusieurs cycles benzéniques sont remplacés par des atomes d'azote.

Dans une autre disposition, un ou plusieurs systèmes cycliques aromatiques ou non aromatiques, qui comprennent, le cas échéant, un ou plusieurs hétéroatomes indépendamment l'un de l'autre, sont condensés au système indirubine.

Dans encore une autre disposition, les dérivés d'indirubine de formule (I) sont liés à un ester de polyéthylèneglycol ou à un éther de polyéthylèneglycol par des liaisons, respectivement, ester ou éther.

L'invention vise plus spécialement les dérivés d'indirubine possédant une IC50 vis-à-vis de GSK-3(3 inférieure à 10 M et de préférence à 1 M, et notamment ceux avec une IC50 inférieure à 50 nM.

De manière préférée, dans de tels dérivés, X et Y, identiques ou différents, représentent un groupe = 0 ou = NOH.

Dans les familles correspondantes, les substituants R1, R3, R4 et R8 présentent avantageusement les significations suivantes:

R3 un atome d'hydrogène, d'halogène, un radical alkyle, un groupe -S03H, -SO:NH:, -SO2-N- (CH3) 2,

SO2-N-C,H;-OH, -S0-N- (CzHS-OH) z, -SOz-DIF-I-CH3, - R4 et R8, indépendamment l'un de l'autre : un atome d'hydrogène ou d'halogène, - R1: un radical alkyle ou aryle, les autres substituants donnés sur la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.

Dans une famille préférée selon l'invention, X = Y, ces deux substituants représentant un groupe = 0.

Des dérivés de cette famille constituant des inhibiteurs de GSK-3(3 de grande efficacité, avec des IC50 inférieures à 5 M, le plus généralement à 1 uM, voire à 50 nM, comprennent avantageusement des substituants R1, R3, R4 et R8 répondant aux significations suivantes : - R1: alkyle, notamment méthyle, et phényle, - R 3 : hydrogène, halogène (F, Cl, Br, I), NO2,

- S03H, -SO2NH2, -SOz-N (CH3) z, -SO2-N-C2H5-OH, -SOz-N- (C2H5- OH)2, -SO2-NHCH3, -R4 et R8: halogène, en particulier I ou Br, les autres substituants donnés dans la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.

Des dérivés particulièrement préférés sont choisis parmi l'indirubine, la 5-iodo-indirubine, la 5bromo-indirubine, la 5-chloro-indirubine, la 5-fluoroindirubine, la 5-méthyl-indirubine, la 5-nitro-indirubine, la 5-SO3H-indirubine, la 5'-bromo-indirubine, la 5-5'dibromo-indirubine ou l'acide 5'-bromo-indirubine 5sulfonique.

Dans une autre famille préférée selon l'invention, X représente un groupe = NOH et Y un groupe = 0.

Dans un groupe préféré de cette famille, R3 représente un atome d'halogène, notamment I, ou un groupe -S03Na.

Les dérivés correspondants présentent avantageusement une IC50 vis-à-vis de GSK-3p inférieure à 100 nM, et même pour nombre d'entre eux inférieure à 50 nM.

Des dérivés préférés de ce groupe sont choisis parmi l'indirubine-3'-monoxime, la 5-iodo-indirubine-3'monoxime et la 5-S03Na-indirubine-3'-monoxime.

Comme indiqué plus haut, les dérivés définis cidessus, ont déjà été décrits comme inhibiteurs des CDKs, ainsi que d'autres indigoldes dérivés par exemple de l'indigo ou de l'isoindigo. Or de manière surprenante, seuls les dérivés d'indirubine exercent en outre un effet inhibiteur vis-à-vis de GSK-30.

Cet effet est le plus généralement du même ordre de grandeur vis-à-vis des CDKs et de la GSK-30.

Les médicaments fabriqués conformément à l'invention en utilisant les dérivés d'indirubine définis ci-dessus sont utilisables pour le traitement des pathologies dans lesquelles la GSK-3ss est impliquée.

Il en est ainsi par exemple des diabètes, où les inhibiteurs de GSK-3ss sont utilisables comme insulinomimétiques. On rappelle que l'insuline agit par une cascade d'évènements biochimiques conduisant à une inhibition de la GSK-3P et que cette inhibition est responsable de la réponse des cellules à l'insuline.

De même, ces médicaments présentent un grand intérêt pour le traitement de maladies neurodégénératives.

Comme démontré dans les exemples, l'hyperphosphorylation de la protéine tau provoquée par CDK5 et GSK-3P peut être en effet inhibée par les dérivés d'indirubine. En administrant les médicaments fabriqués selon l'invention, il est alors possible, grâce à leur effet inhibiteur à la fois de CDK5 et de GSK-3p, d'empêcher l'hyperphosphorylation de la protéine tau chez les malades d'Alzheimer et de lutter contre la neurodégénérescence.

Ces médicaments trouvent également une application de grand intérêt pour le traitement de maladies maniaco-dépressives.

On citera également leur utilisation pour le traitement de cancers où leur effet inhibiteur à la fois de GSK-3ss et de CDK5, qui se traduit par l'apoptose de la cellule tumorale, est avantageusement mis à profit.

Ces médicaments s'avèrent également efficaces pour le traitement de maladies provoquées par des parasites unicellulaires comme la malaria, les trypanosomes, les leishmanias, les toxoplasmes, les pneumocystis et autres, ou des parasites pluricellulaires, comme les champignons et les vers.

Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, utilisés en quantités thérapeutiquement efficaces, sont mélangés avec les véhicules pharmaceutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi.

Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments sont préparés sous forme de gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité.

Pour l'administration par voie injectable (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire), les médicaments se présentent sous forme de solutions stériles ou stérilisables. Les doses par unité de prise peuvent varier de 1 à 50 mg de principe actif. La posologie quotidienne est choisie de manière à obtenir une concentration finale d'au plus 100 uM en dérivé d'indirubine dans le sang du patient traité.

Afin d'illustrer l'invention, sans toutefois en limiter sa portée, on rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages.

Dans ces exemples, il sera fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent respectivement, - les figures 1A à 1C, les effets inhibiteurs d'indirubines utilisées selon l'invention vis-à-vis de GSK-3(3 , CDK5/p25 et CDK1/cycline B, - la figure 2, l'effet compétiteur avec ATP pour la fixation à GSK-30, et - la figure 3, l'effet inhibiteur par les indirubines, in vitro, de la phosphorylation de tau par GSK-30.

Caractérisation des indirubines
Les analyses élémentaires ont été effectuées à l'aide d'un appareil d'analyse élémentaire de CHN PerkinElmer 2400. Les spectres de RMN1H ont été enregistrés à 400 MHz, de RMN 13C à 100 MHz sur un appareil Bruker AMX 400, avec comme référence interne du tétraméthylsilane. s désigne un singulet, d, un doublet et m, un multiplet. Les spectres de masse ont été pris selon le mode d'ions positifs sous impact électronique (EI 70) et avec un appareil Finingan MAT 90.

. Exemples de synthèses d'indirubines indirubine L'indirubine est préparée selon Russell et al, J.Am.Chem.Soc.1969,91,3851-3859 (méthode modifiée) en utilisant 1,76 g (12,0 mmole) d'isatine et 2,00 g (11,4 mmole) d'indoxylacétate. Après filtration, le résidu est lavé 2 fois avec du méthanol, et plusieurs fois avec de l'eau froide,jusqu'à neutralité du filtrat. Le produit est séché sur KOH. On obtient 2,42 g (81,0%) de cristaux violet sombre Rf = 0,64 (acétate d'éthyle hexane 1/1 v/v); PF 341- 343 C : 1H-RMN (DMSO-d6) # 6, 91 (d, J = 8,1, C7H) , 7, 02 (m, C5H et C5'H), 7,26 (m,C6H), 7,42 (d, J = 8,1, C7'H),

7, 58 (m C6'H), 7, 66 (d, J = C4'H), 8, 77 (d, J = 7, 7, C4H) , 11,01 (s) et 10,88 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO -d6,

90 C) # 106,97 (s, C3) , 109, 57 (d, J = 162, 2, C7), 113,15 (d, J = 168,7, C7'), 119,37 (s, C3a'),121,21 (d, J = 162,1, Hz) et 121, 19 (d, J = 162,1 Hz) (C5 et C5'), 121,58 (s,C3a), 124,62 (d, J = 164,6, Hz) et 124,20 (d, J = 163,8, Hz) (C6 et C4'), 129,15 (d, J = 159,8, C4), 136,85 (d, J = 161,4, C6'), 138,48 (s, C7a), 141,07 (s, C7a'), 152,35 (s, C2'), 171,11 (s, C2) , 188,27 (s, C3' ) ; MS m/e 262 (M+,

100), 234 (43), 205 (25), 131 (4) . Anal. (C16H10N2O2) C, H, N.

5-iodoindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 655 mg de 5-iodoisatine (2,40 mmole) et de 399 mg d'indoxylacétate (2,28 mmole, la réaction conduit à 720 mg de produit brut. Par recristallisation à partir d'éthanol, on obtient 58 mg (6,2 %) de cristaux violet sombre ; Rf = 0,68 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v); PF 334-335 C : 1HRMN (DMSO-dô) # 6,75 (d, J = 8,1, C7H) , 7,04 1H (m, C5'H), 7, 42 (d, J = 8,1, C7'H), 7, 57 (m, C6H et C6'H), 7, 65 (d, J
7,5, C4'H), 9,11 (s, C4H), 11,00 (s) et 11,09 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO -d6, 90 C) # 83,73 (d, J = 16,9, C5) , 105,18 (s, C3), 111,85 (d, J = 164,6, C7) , 113,43 (d,J = 167,2, C7'), 119,27 (s, C3a'), 121,65 (d,J = 163,6, C5'), 124,03 (s, C3a), 124,44 (d, J = 163,9, Hz, C4'), 132,49 (d, J = 171,2, C6), 137,00 (d, J = 166,9, Hz) et 137,15 (d, J = 160,1 Hz) (C4 et C6'), 139,26 (s, C7a'), 140,44 (s,C7a), 152,41 (s, C2'), 170,48 (s,C2), 188,54 (s, C3' ) ; MS m/e 388 (M+, 100), 360 (3), 261 (6), 233 (16), 205 (16) . Anal.

(Cl6H9IN202) C, H, N.

5-bromoindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 1,30 g de 5-bromoisatine (5,75 mmole) et de 1,00 g d'indoxylacétate (5,71 mmole), le produit brut est recristallisé à partir de pyridine et conduit à 1,16 g (59,3 %) de cristaux noirs avec une nuance violette; Rf =

0,49 (acétate à'éthyle hexane 1/1 v/v) : 'H-RMN (DMSO-d6) # 6, 86 (d, J = 8,4, C7H) , 7, 05 (pt, C5'H) , 7, 41-7, 31 (m, C6H et C7'H), 7, 59 (m,C6'H), 7, 66 (d, J = 7, 5, C4'H), 8, 94 (s, C4H), 11,10 (s) et 11,00 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO d6, 90 C) # 104, 92 (s, C3) , 111, 24 (d, J = 165,1, C7), 112,89 (s, C5), 113,53 (d, J = 167,8, C7'), 118,92 (s,C3a'), 121, 64 (d, J = 164, 4, C5' ) , 123,41 (s, C3a) , 124,49 (d,J = 164,0, C4'), 126,60 (d, J = 171,3, C6) , 131,03 (d, 167,1, C4), 137,29 (d, J = 160,9, C6'), 139,16 (s, C7a'), 139,74 (s,C7a), 152,42 (s, C2'), 170,50 (s,C2), 188,77 (s, C3'); MS m/e 342 (M+, 100), 340 (M+, 100) 314

(18), 312 (18), 261 (7). Anal. (C16HBrN20z) C, H, N.

5-chloroindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 5-chloroisatine (2,75 mmole) et de 480 mg d'indoxylacétate (2,73 mmole), on obtient 766 mg (94,6 %) d'une poudre violette, Rf = 0,60 (acétate d'éthyle /hexane 1/1 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) # 6, 89 (d, J = 8, 3, C7H) , 7, 04 (m, C5'H), 7, 27 (d, J = 8, 3, C6'H), 7, 42 (d, J = 7, 8, C7'H), 7,58 (m, C6'H), 7,65 (d, J = 7,6, C4'H), 8,78 (s,C4H), 10, 99 (s) et Il,09 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) # 104, 95 (s, C3) , 110, 61 (d, J = 164, 6, C7) , 113, 50 (d, J = 168,6, C7'), 118,85 (s, C3a'), 121,54 (d, J = 165,4, C5'), 122,85 (s, C3a), 123, 76 (d, J= 170,2 Hz) et 124,41 (d, J = 163,8 Hz) (C6 et C4'),125,00 (s,C5), 128,16 (d, J = 167,0, C4) , 137, 21 (d, J = 159, 8, C6'), 139,10 (s) et 139, 31 (s) ( C7a et C7a'), 152, 39 (s, C2'), 170, 52 (s, C2) , 188, 72 (s, C3') ; MS m/e 296 (M+ , 100), 268 (39), 233 (35), 205 (50)

. Anal. (ClsH9CINZ02) C, H, N.

5-fluroroindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 5-fluoroisatine (3,03 mmole) et de 530 mg d'indoxylacétate (3,00 mmole), on obtient 776 mg (92,4 %)d'une poudre violette, Rf = 0,32 (acétate d'éthyle/

hexane 1/2 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 3 6,87 (dd, J,S,N = 8, 3, Jx,x
4,7 C7H), 7,10-7,01 (m, C6H et C5'H), 7,42 (d, J = 8,2, C7'H), 7,58 (pt, C6'H), 7, 65 (d, J = 7,4, C4'H), 8, 56 (d, JF,H = 10,6, C4H), 11,00 (b,NlH et Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6)

5 105,93 (s, C3), 110,13 (dd, Jc,x = 163,5, Jc,F = 8,7, C7) , 111,34 (dd, JC,H = 169, 3, JC,F = 27, 6, C6) , 113, 57 (d, J = 162,0, C7'), 115,24 (dd, JC,H = 188,9, JC,F = 24, 7, C4)

118,98 (s,C3a'), 121, 64 (d, J = 164,2, C5' ) , 122, 41 (d, JC,F
10,8, C3a), 124,56 (d, J = 163,5, C4'), 137,31 (s, C7a) 137,36 (d, J = 162,8, C6'), 139,12 (s, C7a') 152,60 (s, C2'), 157,40 (d, JC,F = 233,2, C5), 171,02 (s, C2), 188,96 (s, C3') ; MS m/e 280 (M' , 100), 252 (73), 223 (32). Anal.

(ClsH3FN20z) C, H, N.

5-méthylindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 5-méthylisatine (3,10 mmole) et 540 mg d'indoxylacétate (3,07 mmole), on obtient 781 mg (92,0 %) d'une poudre violette, R/ = 0,44 (acétate d'éthyle/hexane 1/2 v/v): 'H-RMN (DMSO-d6) 8 2,33 (s, CH3), 7,08-7,0 (m, C6H et C5'H), 6,79 (d, J = 7, 9, C7H) , 7, 42 (d, J = 7, 9, C7'H), 7, 58 (pt, C6'H), 7, 64 (d, J = 7,6, C4'H), 8, 63 (s,C4H), 10,79 (s) et 11,00 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) # 20, 99 (q, J = 126, 5, CH3) , 106, 79 (s, C3) , 109,17 (d, J = 161,3, C7), 113,33 (d, J = 168,5, C7'), 119,94 (s, C3a'), 121,09 (d, J = 164,4 C5') 121,45 (s,C3a), 124, 19 (d, J = 163,7, C4'), 125,11 (d, J = 164,4, C6) , 129,72 (d, J = 157,4, C4), 129,72 (s, C5) 136,96 (d, J = 161,6, C6'), 138,08 (s) et 138,65 (s) (C7a et C7a'), 152,38(s, C2'), 171,93 (s, C2), 188,49 (s, C3') ; MS m/e 276 (M+ , 100) ,

261 (10), 248 (47), 247 (53) . Anal. (C17H12N202) C, H, N.

5-nitroindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 1,00 g de 5-nitroisatine (5,20 mmole) et 900 mg

d'indoxylacétate (5,14 mmole), on obtient 1,39 g (88,2 %) d'une poudre violette, Rf= 0,16 (d'éthyle acétate/hexane v/v): 'H-RMN (DMSO-d6) 8 7,01 (d, J = 8,7, C7H), 7,05 (pt, C5'H), 7, 40 (d, J = 8,1, C7'), 7, 58 (pt, C6'H), 7, 64 (d, J
7, 5, C4'H), 8, 13 (d, J = 8, 7, C6H) , 9, 60 (s, C4H) , 11, 15 (s) et 11,49 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) # 103,51 (s, C3) , 109, 27 (d, J = 167, 8, C7) , 113, 68 (d, J = 167,8, C7'), 118,83 (s, C3a'), 119,48 (d, J = 167,8 C6) 121,59 (s,C3a), 121,97 (d, J = 163,0, C5'), 124,60 (d) et 124,69 (d) (C4 et C4'), 137,37 (d, J = 161,6, C6'), 139,97 (s, C5) 136, 96 (d, J = 161, 6, C6'), 138, (s) et 138, 65 (s, C7a' ) , 141,63(s, C5), 145,71 (s, C7a), 152,38 (s, C2' ) , 170,93 (s, C2), 188,78 (s,C3') ; MS m/e 307 (M+, 100), 276 (10), 262

(100) , 234 (23) . Anal. (C16H9N3O4) C, H, N. acide indirubine-5-sulfonique (sel de sodium) On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 250 mg du sel de sodium dihydraté de l'acide isatine-5sulfonique (1,00 mmole) et de 170 mg d'indoxylacétate (0,971 mmole), on obtient 258 mg (70,8 %) d'un solide violet, R/ = 0,73 (éthanol) : 1H-RMN (DMSO-d6) # 6,84 (d, J = 8,0, C7H), 7,04 (m, C5'H), 7,43 (d, J = 8,0, C7'H), 7,54- 7,61 (m, C4'H et C6'H), 7,67 (d, J = 7,4, C6H), 9,13 (s,C4H), 10,99 (s) et 11,05 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) # 106,25 (s, C3), 108,20 (d, J = 163,3, C7), 113, 39 (d, J = 168, 6, C7'), 120, 50 (s) et 118, 98 (s) (C3a et C3a'), 121,28 (d, J = 157,9 C5') 122,57 (d, J = 169,4, C6), 124,27 (d, J= 165,6, C4'), 126,83 (d, J = 163, 3, C4) , 137, 02 (d, J = 161,0, C6'), 138, 45 (s, C5), 140,89 (s) et 141,64 (s) (C7a et C7a'), 152,39 (s,

C2'), 171,14 (s, C2), 188,33 (s, C3'). Anal. (C16H9NNaO5S 1, 5 H2O) C, H, N.

5'-bromoindirubine On opère comme décrit pour l' indirubine . En partant de 59 mg d'isatine (0,40 mmole) et de 100 mg de 5-bromo-

indoxylacétate (0,394 mmole), on obtient 123 mg (92,6 %) d'une poudre violette, R/ = 0,59 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v) : 'H-RMN (DMSO-d6) 5 6,89 (d, J = 7, 8, C7H) , 7, 02 (pt, C5H), 7,26 (pt, C6H), 7,39 (d, J = 8,5, C7'H), 7,71 (d, J = 8,5, C6'H), 7,76 (s,C4'H), 8,73 (d, J = 7,8, C4H), 10,89 (s) et 11,08 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 107,43 (s, C3), 109,54 (d, J= 161,4, C7), 112,63 (s, C5'), 115,49 (d, J = 169,4, C7'), 120,64 (s) et 121,20 (s) (C3a et C3a'), 121,20 (d, J = 160,0 C5) 124,69 (d, J = 154,5, C6) , 126, 31 (d, J = 163, 0, C4' ) , 129, 56 (d, J = 159, 0, C4) , 137,69 (s, C7a') 138,87 (d, J = 166,1, C6'), 141,05 (s, C7a), 151,23 (s, C2'), 170,64 (s, C2), 187,15 (s, C3'); MS m/e 342 (M+, 100), 340 (M+, 100) , 314 (16) , 312 (16), 261

(1), 233 (44) . Anal. (C16H9BrN202) H, N ,C: cale, 56,3; trouvé, 55,7.

5,5'-dibromoindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 89 mg de 5-bromoisatine (0,39 mmole) et de 100 mg de 5-bromoindoxylacétate (0,394 mmole), on obtient 154 mg (94,0 %) d'une poudre violette: 1H-RMN (DMSO-d6) # 6,84 (d, J = 8,1, C7H) , 7, 42-7, 36 (m, C6H et C7'H), 7, 71 (d, J = 8, 5, C6'H), 7,76 (s, C4'H), 8,88 (s, C4H), 11,01 (s) et 11,16 (s) (N1H et Nl'H); MS m/e 422 (M+, 47), 420 (M+,100), 418 (M+,48), 394 (3), 392 (7), 390 (3), 342 (25), 340 (25), 313 (15),

311 (15). Anal. (Ci6H8Br2N2O2) C, H, N. acide 5'-bromoindirubine-5-sulfonique (sel de sodium) On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 224 mg de sel de sodium dihydraté de l'acide isatine-5sulfonique (0,787 mmole) et de 190 mg de 5-bromoindoxylacétate(0,748 mmole), on obtient 204 mg (56,9 %) d'une poudre violette: 'H-RMN (DMSO-d6) 5 6, 82 (d, J = 8,0, C7H), 7,40 (d, J = 8,5, C7'H), 7,55 (d, J = 8,0, C6H), 7,73 (d, J = 8,5, C6'H), 7,79 (s,C4'H), 9,09 (s, C4H), 11,11

(b, N1H et Nl'H). Anal. (C15HHBrNNaO;SHO) H, N, C: calc, 40,1 ; trouvé 39, 6. indirubine-3'-monoxime On prépare ce composé comme décrit Farbwerke vorm. Meister Lucius & Brüning in Hoechst a.M. Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Indirubine. DRP 283726. Le produit brut est recristallisé à partir d'éthanol/eau (7/2, v/v). On obtient le composé recherché sous forme de cristaux rouge sombre, Rf = 0,55 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) # 6, 90 (d, J = 7, 9, C7H) , 7, 42 (d, J = 7, 9, C7'H), 7,58 (pt, C6'H), 7, 64 (d, J = 7,6, C7H) , 6, 95 (m, C5H) , 7, 03 (m,, C5'H), 7,13 (m, C6H), 7,41 (m, C6'H et C7'H), 8,24 (d, J= 7,2, C4H) , 8, 65 (d, J = 7, 2, C4H) 10, 72 (s) et 11,73 (s) (N1H et Nl'H), 13,48 (s, NOH) ; 13C-RMN (DMSO-d6) # 98,88 (s, C3) , 108,91 (d, J = 162,3, C7) , 111,52 (d, J = 165,8, C7'), 116,54 (s, C3a'), 120,43 (d, 160,2, C5'), 121,49 (d, J = 161,6 C5) 122,66 (s,C3a), 123,09 (d, J = 165,1, C6), 125,92 (d, J = 154,0, C4), 127,95 (d, J = 164, 4, C4'), 132, 02 (d, J = 159, 5, C6'), 138,34 (s, C7a), 144,83 (s, C7a'), 145,32 (s, C2' ) , 151,22 (s, C3'), 170,95 (s, C2) ; MS m/e 277 (M+, 100 %), 260 (87

%), 247 (24 %), 220 (14 %), 205 (11). Anal. (C16H11N302 0,25 HoO) C, H, N.

5-iodoindirubine-3'-oxime On opère comme décrit pour l'indirubine-3'-monoxime. En partant de 250 mg d'indirubine-3'-monoxime (0,644 mmole) et de 175 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine (2,52 mmole) dans 7,5 ml de pyridine, on obtient un précipité. Le produit brut est lavé avec de l'eau et recristallisé à partir d'éthanol. On obtient 119 mg (45,9 %) de cristaux rouge, Rf
8,50 (d'acétate éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 6,73 (d, J = 6,7, C7H), 7,09-7,01 (m, C5'H), 7,44-7,40 (m, C6, C6'H, et C7'H), 8, 26 (d, J = 7,6, C4'H), 8, 90 (s, C4H) , 10,79 (s) et 11,88 (s) (N1H et Nl'H), 13,68 (s, NOH); 13C-

RMN (DMSO-d6) # 83, 69 (s, C5) , 96, 59 (s, C3) , 110, 89 (d, C7), 111,51 (d, C7'), 116,44 (s, C3a'), 121,77 (d, C5') 125,40 (s,C3a), 127,42 (d, C4' ) , 130,00 (d, C6) , 131,52 (d, C6'), 133,40 (d, C4), 137,20 (s, C7a), 144,01 (s, C7a'), 146,68 (s, C2'), 151,52 (s, C3'), 170,25 (s, C2); MS m/e 403 (M*, 100), 387 (9), 373 (10), 276 (5), 260 (46). Anal.

(C17H12N2O2) C, H, N.

6-iodoindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 250 mg de 6-iodoisatine (0,92 mmole) et de 120 mg d'indoxylacétate (0,69 mmole), on obtient 182 mg (68,0 %) d'une poudre violette, R/ = 0,47 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) # 7,01 (pt, J = 7, 5, C5'H) , 7,19 (s, C7H) , 7, 38 (m, C5H et C7'H), 7, 56 (pt, J = 7, 3, C6'H), 7, 62 (d, J = 7,6, C4'H), 8, 49 (d, J = 8, 3, C4H) , 10, 93 (s) et 11,03 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 3 94, 60 (d, J
10,4, C6), 105,57 (s, C3), 113,71 (d, J = 169,5, C7'), 118,05 (d, J = 167,1, C4'), 119,17 (s, C3a'), 121,24 (s,C3a), 121,65 (d, J = 163,4, C7) , 124,56 (d, J = 163, 4, C5'), 126, 17 (d, J = 167,1, C4 ) , 129, 99 (d, J = 167,5, C5), 137,29 (d, J = 161,0, C6'), 139,07 (s, C7a'), 142,12 (s, C7a), 152,56 (s, C2'), 170,70 (s, C2),

188,83 (s, C3'); MS mule 388 (M* , 100) , 360 (9) , 261 (15) , 233 (53), 205 (53), 127 (2) . Anal. (Cl6H9IN202) H, N. C : cale, 49,5 %; trouvé 48,5 1-méthylindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 200 mg de 1-méthylisatine (1,24 mmole) et 217 mg d'indoxylacétate (1,24 mmole), le produit brut est recristallisé à partir de pyridine et sublimé (140 C, sous vide), on obtient 195 mg (56,9 %) de billes claires légèrement violettes violettes; Rf = 0,88 (acétate d' éthyle/hexane 3/2 v/v: 1H-RMN (DMSO-d6) 5 3,29 (s, CH3) , 7,02-7,12 (m, C5H, C7H, et C5'H), 7,35 (pt, C6H), 7,43 (d,J

8, 3, C7'H), 7, 59 (pt, C6'H), 7, 67 (d, J = 7,6, C4'H), 8, 81 (d,J = 7, 3, C4H) , 11, 07 (s, Nl' H) ; MS m/e 276 (M+, 100) ,

248 (25), 247 (54) . Anal. (C17H12NzOz) C, H, N.

1-phénylindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 1-phénylisatine (2,24 mmole) et de 334 mg d'indoxylacétate (1,90 mmole), on obtient 597 mg (92,6 %) d'une poudre violette, R/ = 0,92 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v) : 'H-RMN (DMSO-d6) # 6,83 (pt, J = 7, 3, C7H) , 7, 05 (pt, C5'H), 7,16 (pt, C5H), 7,29 (pt, C6H), 7,42 (d, J = 8,0, C7'H), 7,53-7,48 (m) et 7,64-7,58 (m) (C6'h et 5 phényl-H, 7,69 (d, J = 7,3, C4'H), 8,92 (d, J 7,6, C4H),11,17 (s, Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) # 104,96 (s,C3),108,71 (s, C7), 113,48 (s, C7'), 118,96 (s, C3a'), 120,80 (s, C3a), 121,50 (d, J = 159,1, Hz), et 122,34

(d, JC,H = 160, 8, Hz) , (C5 et C5' ) , 124, 44 (d) et 124, 56 (d) (C6 et C4'), 126,75 (d, J = 161,5, C3"et C5"), 127,93 (d, J = 161, 5, Hz) et 128, 99 (d, J = 160, 8 Hz) (C4 et C4"), 129,46 (d, J =161, 5, C2"et C6"), 137,18 (d, J = 161,6, C6'), 139,11 (s) et 133,97 (s) (C7a' et Cl"), 141,34 (s, C7a), 152,32 (s, C2'), 168,36 (s, C2) , 188,44 (s,C3') ; MS m/e 388 (M+, 100), 311 (13), 310 (58), 309 (39) Anal.

(C22Hl4N202) C, H, N. acide 3'-hydroxyiminoidirubine-5-sulfonique (sel de sodium) On opère selon Lucius et al ci-dessus (méthode modifiée) avec 500 mg de sel de sodium de l'acide indirubine-5sulfonique (0,644 mmole) et 400 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine (5,76 mmole) dans 15 ml de pyridine. Le précipité produit en ajoutant 100 ml d'acide chlorhydrique et 20 ml d'une solution saturé de chlorure de sodium au mélange réactionnel est combiné au précipité obtenu à partir du filtrat, qui a été produit en ajoutant 15 ml d'une solution saturé de chlorure de sodium. Ce produit brut est recristallisé à partir d'eau. On obtient 170 mg (34,0 %) de plaquettes noires à écailles, à nuance rouge,

RI = 0, 76 (éthanol) : 'H-RMN (DMSO-dr) 8 6, 82 (d, J = 8,1, C7H) , 7,10-6,97 (m, C5'H), 7, 41-7, 39 (m, C6' et C7'), 7, 48 (d, J = 7, 9, C6H), 8,26 (d, J = 7, 7, C4'H), 8, 92 (s, C4H) , 10, 82 (s) et Il,80 (s) (N1H et Nl'H), 13,79 (s, NOH) ; 13CRMN (DMSO-d6) 3 98, 64 (s, C3) , 107, 32 (d, J = 162, 3, C7) , 111, 36 (d, J = 165, 8, C7'), 116, 59 (s, C3a'), 120, 55 (d, J
167,2, C5'), 121,42 (d, J = 159,5, C6) , 121,65 (s, C3a) , 123,74 (d, J = 163,0, C4), 128,02 (d, J = 167,8, C4'), 131,84 (d, J = 158,8, C6'), 138,21 (s, C5), 140,87 (s, C7a), 144,53 (s, C7a'), 145,52 (s, C2'), 151,32 (s, C3'),

171,17 (s, C2) Anal. (Cl6HoN3Na0zS) C, H, N. indirubine-5-sulfonamide On opère comme décrit ci-dessus pour l'indirubine. En partant de 120 mg d'isatine-5-sulfonamide (0,530 mmole) et de 79 mg d'indoxylacétate (0,045 mmole), on obtient 79 mg (92,0 %) de 5- méthyl indirubine sous forme de poudre noire contenant 8% en masse d'indigo (l'indigo a été identifié

par DC et 'H-RMN); Rf = 0,79 (acétate d'éthyle): 1H-RMN (DMSO-d6) # 7,04-7,08 (m, C7H et C5'H), 7,23 (s,NH2), 7,44(d, J = 7,9, C7'H), 7, 60 (pt, C6'H), 7, 69 (d, J = 7, 4, C6H), 7,74 (d, J = 8,1, C4'H), 9, 31 (s, C4H) , Il,15 (s) et 11.25 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) # 104, 92 (s, C3), 113,56 (d, J = 159,9, C7'), 119,01 (s, C3a'), 121,13 (s, C3a), 121,72 (d, J = 165,2, C5'), 122,27 (d, J= 169,8, C6), 124,44 (d, J= 164,5, C4'), 126,98 (d, J= 159,2, C4), 109,22 (d, J= 165,2, C7), 137,24 (s, C5) , 137,24 (d, J= 160,5, C6'), 139,32 (s, C7a'), 142,99 (s, C7a), 152,45 (s, C2'), 170,98 (s, C2), 188,52 (s, C3'). diméthylamide de l'acide indirubine-5-sulfonique On opère comme décrit ci-dessus pour l'indirubine. En partant de 397 mg de diméthylamide de l'acide isatine 5sulfonique (1,56 mmole) et de 246 mg d'indoxylacétate (1,40 mmole), on obtient 240 mg (46,5 %) de l'acide recherché sous forme de poudre violette, Rf= 0,39 (acétate

d'éthyle/hexane 3/2 v/v) : 1H-RMN (DMSO-dJ 5 2, 65 (s, 2

CH3), 7,02-7,13 ',:n, C7H et C5'H), 7,44 (d, J= 8,1, C7'H), 7,57-7,72 (m, C6H, C4'H, et C6'H), 9,21 (s, C4H), 11,18 (s) et Il,33 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) # 37, 20 (q, J
139,4,CH3,)104,16 (s, C3), 109,11 (d, J = 165,8, C7), 113,22 (d, J= 167,2, C7'), 118,71 (s, C3 a'), 121,36 (d, J 165, l, C5'), 121, 48 (s, C3a) , 123, 18 (d, J = 172, 0, C6) , 124,22 (d, J = 163,7, C4'), 127,64 (s, C5), 128,06 (d, J = 166,5, C49,136,93 (d, J = 164,4, C6'), 139,34 (s, C7a'), 143,53 (s, C7a), 152,10 (s, C2'), 170,51 (s, C2), 188,37 (s, C3'); MS m/e 369 (M+, 83), 326 (6), 262 (84), 261

(100). Anal. (CIeHl5N304S) H, N; C: calc, 58.5 %; trouvé, 57. 8 %.

(2-hydroxyéthyl)-amide de l'acide indirubine-5 sulfonique On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 150 mg du (2-hydroxyéthyl)-amide de l'acide isatine-5sulfonique (0,630 mmole) et de 83 mg d'indoxylacétate (0,47 mmole), on obtient 143 mg (78,9 %) du composé recherché sous forme de poudre violette ; = 0,62 (méthanol/ acétate d'éthyle 1/20 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 8 2,84 (t, JYCH2, CH21}
6,5, visible en ajoutant D20, -N-CH2-), 3,40 (m, -CH2-O), 4, 67 (t, J = 4,6, OH) , 7, 07 (m, C7H et C5'H), 7,43 -7, 46 (m, C7'H et S02-NH-; en ajoutant D20: 7,44, d, J = 8,1, C7'H), 7,61 (pt, C6,H), 7,69-7,71 (m, C6H et C4'), 9,27 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,29 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSOd6) # 45,00 (t, J= 138,0, -NH-CH2), 59,85 (t, J= 141,1, - CH2-OH), 104,52 (s, C3), 109,44 (d, J= 165,9, C7), 113,60 (d, J= 168,5, C7'), 118,92 (s, C3a'), 121,36 (s, C3a), 121,74 (d, J= 164,0, C5'), 122,95 (d, J= 162,4, C6) , 124,52 (d, J= 159,6, C4'), 127,53 (d, 1JC,H = 165,9, C4), 133,20 (s, C5) , 137,29 (d, J= 163, 4, C6'), 139, 44 (s, C7a' ) , 143,32 (s, C7a), 152,46 (s, C2'), 170,87 (s, C2), 188,70 (s, C3'), MS m/e 385 (M+, 40), 355 (48), 325 (29), 262 (35), 261 (100). Anal. (C18H15N305S) C, H, N.

bis-(2-hydroxyé~hyl)-amide de l'acide indirubine-5- sulfonique On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 400 mg de bis-(2-hydroxyéthyl) amide de l'acide isatine-5sulfonique bis-(2-hydroxyéthyl) amide (1,27 mmole) et 167 mg d'indoxyl acétate (0,953 mmole),on obtient 355 mg (86,7 %) de l'amide mentionné ci-dessus sous forme de poudre violette, Rf - 0,51 (méthanol/ acétate d'éthyle 1/20 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 5 3, 20 (t, J = 6, 5, 2 -N-CHz) , 3, 56 (m, 2 - CH20-), 4,84 (t, J = 5,5, 2 -OH), 7,09-7,05 (m, C7H et C5'H), 7,72-7,68 (m, C6H et C4'), 7,45 (d, J= 8,0, C7'H), 7,61 (m, C6'), 9,26 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,32 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 51,32 (t, J= 135,0, 2-NH- CH2), 60,01 (t, J= 141, 0, 2 -CH-OH) , 104, 31 (s, C3) , 109,48 (d, J = 165,3, C7) , 113,62 (d, J = 168,5, C7'), 118,91 (s, C3a'), 121,69 (s, C3a), 121,79 (d, J = 164,0, C5'), 122,88 (d, J = 162,4, C6), 124,64 (d, J = 162,7, C4'), 127, 98 (d, J = 165, 2, C4), 131, 51 (s, C5 ) , 137, 32 (d, J = 160,1 Hz,C6'), 139,61 (s, C7a'), 143,59 (s, C7a), 152,48 (s, C2'), 170,81 (s, C2), 188,87 (s, C3'); MS m/e 429 (M+, 9), 369 (22), 365 (22), 355 (63), 261 (31), 43 (100). Anal. (C20H19N3O6S) C, H, N. méthylamide de l'acide indirubine-5-sulfonique On opère comme décrit ci-dessus pour l'indirubine. En partant de 380 mg du méthylamide de l'acide isatine-5sulfonique (1,58 mmole) et de 227 mg d'indoxylacétate (1, 30 mmole), on obtient 370 mg (80,1 %) de l'amide ci-dessus sous forme d'une poudre violette, Rf = 0,72 (acétate d' éthyle) : 'H-RMN (DMSO-d6) 5 2,46 (d, J= 5, 0, CH3) , 7,05- 7,09 (m, C7H et C5'H), 7,32 (q, NH-CH3) , 7,45 (d, J= 8,3, C7'H), 7,61 (m, C6'H), 7,67-7,71 (m, C6H et C4'), 9,27 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,30 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSOd6) # 28,65 (q, J = 13 8,7, CH3) , 104,48 (s, C3) , 109,41 (d, J= 165,7, C7), 113,58 (d, J= 165,7, C7'), 118,90

(s, C3a'), 121,42 (s, C3a), 121,73 (d, J = 171,0, C5'), 123, 13 (d, J = 164, 5, C6) , 124, 50 (d, J = 159, 8, C4' ) , 127,61 (d, J = 165, 7, C4),131,93 (s, C5) , 137, 28 (d, J= 160, 6, C6'), 139, 43 (s, C7a'), 143, 36 (s, C7a) , 152, 45 (s, C2'), 170,85 (s, C2), 188,68 (s, C3'); MS m/e 255 (M+, 15),

263 (18), 262 (100) , 261 (7). Anal. ( C 17 H uN J 0 4 S ) C, H, N.

5-iodoisatine On opère comme décrit par Roedig, Mueller E. (Hrsg.), Methoden der organishen Chemie (Houbeyn-Weyl), Stuttgart, Georg Thieme Verlag 1960,5/4,586, et Borsche et al Chem.Ber.1924, 1770-1775, Rf - 0,60 (acétone/éther de pétrole 40-70 1/1 v/v) ; PF 262 C: 'H-RMN (DMSO-d6) 8 6,75 (d, J = 8, 3, C7H), 7, 75 (s, C4H) , 7, 78 (d, J = 8,2, C6H) , Il,09 (b, N1H); 13C-RMN (DMSO-d6) # 85,39 (s, C5) , 114,59 (d, J= 167, 1, C7),119,89 (d, J= 7,2, C3a), 132,38

(d, J--170, 3 , C4), 145, 76 (d, J = 167, 1, C6) , 145, 76 (d, J = 167,1, C6), 149,95 (b, C7a), 158,66 (s, C2), 183,06 (s, C3) ; MS m/e 262 (M+, 100) , 234 (43). diméthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique On opère comme décrit par Haller, brevet DE 715760,1938, Rf - 0,18 (acétate d'éthyle/hexane 1 /1 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) # 2, 62 (s, 2 CH3) , 7,12 (d, J 8,2, C7H) , 7, 71 (s, C4H) , 7, 94 (d, J = 8,2, C6H) , Il,47. (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-de) # 182,89 (s, C3), 159,37 (s, C2), 153,60 (s, C7a), 136,98 (d, J = 167,32, C6), 128,62 (s, C5) , 123,27 (d, J = 169,2, C4), 118,05 (s, C3a), 112,68 (d, J= 169,2, C7), 37,48 (q, J= 140,1, 2 CH3) . Anal. (C10H10N2O4S) C, H, N. bis-(2-hydroxyéthyl)-amide de l' acide isatine-5-sulfonique On opère comme décrit par Haller ci-dessus en partant de

526 mg de bis-(2-hydroxyéhyl)-amine (5,00 mmole) et de 1,00 g de 3,3-dichloro-2-oxo-2.3-dihydroindol-5-sulfonyle ( voir

Haller ci-dessus) (3,34 mmole). Le précipité qui se forme est huileux et boueux. On décante le surnageant, puis on mélange le précipité et le surnageant avec 5 ml d'eau. On porte à reflux 2 h. En refroidissant, on obtient un précipité de cristaux rouge. Rendement : mg (45,3 %), Rf
0,51 (méthanol/acétate d'éthyle 1/20 v/v): 1H-RMN (DMSOd6) # 2,78 (t, J = 6,2, 2 -N-CH-) , 3,38 (t, J = 6,2, 2-CH2- 0-),7,08 (d, J = 8,2, C7), 7,78 (s, C4), 7,96 (d, J= 8,2, C6), 11,43 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) # 50, 73 (t, J = 138,8,2 -N-CH2-), 59,64 (t, J = 141,7, 2 -CH20H-),112,57 (d, J = 168, 6, C7) , 117, 91 (s, C3a) , 122, 78 (d, J= 169, 3, C4), 133,29 (s, C5), 136,44 (d, J= 166,4, C6) , 153,28 (s, C7a), 159,37 (s, C2),182,95 (s, C3) . Anal. ( C12H14N2O6S) C, H, N.

6-lodoisatine On opère comme décrit par Marvel et al , Organic Syntheses, Coll. Vol.l, 2nd ed.; Gilman,H Ed.; Wiley& Sons : York, 1941,327-330, en utilisant 1,50 g de 2-hydroxyimino-N-(3iodophényl)- acétamide (5,17 mmole) et 3,9 ml d'acide sulfurique concentré. Après filtration, le produit brut, formé d'un mélange de 4-et 6-iodoisatine et de sousproduits, est purifié selon Sadler, J. Org.Chem. 1956,21, 169-170 et Holt et al, Proc.R.Soc. London B 1958,148, 481- 494. On obtient 216 mg (15,0 %) de cristaux orange ; 255- 258 C; Rf = 0,76 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) # 7,25 (m, C4H et C7H), 7,45 (d, J= 7,6, C5H), 11,07 (s, N1H); 13C-RMN (DMSO-d6) 5 107,28 (d, J= 10,4, C6) , 117, 41 (s, C3a), 120, 83 (d, J = 170, 3, C7 ) , 125, 84 (d, J= 173,7, C4 ) , 131, 82 (d, J = 167,9, C5) , 151, 30 (s, C7a), 159, 35 (s, C2),183,79 (s, C3) . Anal. (C8H4INO2) C, H, N. isoindigo On opère comme décrit par Wahl et al,Compte rendus hebdomadaires des séances de l'académie des sciences, 1909, 716-19 et 4(5), 1039-43:Rf = 0,67 (acétate d'éthyle/hexane

1/1 v/v) : 'H-RMN (DMSO-d6) 8 6, 85 (d, J= 7, 7, C7H et C7'H), 6, 97 (pt, C5'H et C5'H), 7, 34 (pt, C6H et C6'H), 9, 07 (d, J= 8,0, C4H et C4'H), 10,90 (s, N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 109,42 (d, J = 162,5, C7 et C7'), 121,04 (d, J= 161,2, C5 et C5'), 121,58 (s, C3a et C3a'), 129,21 (d, J= 166,5, C6 et C6'), 132, 52 (d, J= 159, 9, C4 et C4' ) , 133,24 (s, C3 et C3'), 143,98 (s, C7a et C7a'), 168,88 (s, C2 et C2'); MS m/e 262 (M+, 100), 234 (85), 205 (18). Anal.

(C16H12N2O2) C, H, N.

2,2'-bisindole On opère comme décrit parBergman et al, Tetrahedron 1995, 51 (19), 563-42,Rf = 0,82 (UV, acétate d'éthyle/hexane 1/1) : GC/MS Rt= 14,1 min, m/e 232 (M+, 100) ; #max, (éthanol) 221 (4,78), 271 (4,00), 333 (4,80), 351 (4, 79) . Anal.

(C16H12N2) C, H, N.

3,3'-diphényl-2.2'-bisindole On opère comme décrit par Fürstner et al, An gewandte Chemie, 1995,107 (6), 725-8. La recristallisation à partir d'acétate d'éthyle/ éther de pétrole (40-70) 115 v/v conduit à des cristaux incolores (55.8 %), Rf - 0,50 (UV, acétate d'éthyle/ éther de petrole (40-70) 115 v/v): GC/MS Rt= 19, 0 min, m/e 384 (M+, 100) . isatin-5-sulfonamide On refroidit au préalable une solution aqueuse à 25 % d'ammoniaque (5,0 ml) à 0-5 C avant d'ajouter un échantillon de 0,50 g de chlorure de 3,3-dichloro-2-oxo- 2,3-dihydroindol-5-sulfonyle ( voir Haller ci-dessus), (1,7 mmole), par portions, en agitant et en refroidissant à nouveau. Après 2h, on ajoute une petite quantité de glace pilée et 20 % d'acide chlorhydrique jusqu'à réaction acide du mélange. Le solvant est éliminé sous vide et le résidu orange est séché sur KOH. La poudre jaune obtenue est extraite 3 fois avec 35 ml d'acétone. L' acétone est éliminée sous vide, ce qui conduit à 140 mg (36,4 %) de poudre orange, Rf= 0,73 (acétate d'éthyle): 1H-RMN (DMSO-

d@) 8 7, 05 (d, J = 8,2, C7) , 7. 41 (s, NH), 7, 85 (s, C4), 7, 98 (d, J = 8,2, C6) , Il,39 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-dJ # 112,12 (d, J= 168,3, C7), 117,73 (s, C3a), 121,67 (d, J= 166,8, C4) , 134, 97 (d, J= 165,4, C6) , 138,36 (s, C5) , 152,56 (s, C7a), 159,50 (s, C2), 184,22 (s, C3); MS m/e 226 (M+, 28) , 198 (100) .

(2-hydroxyéthyl)-amide de l'acide isatine-5-sulfonique On opère selon Haller ci-dessus, en partant de 295 mg de 2aminoéthanol (4,83 mmole, 0,300 ml), 5,1 ml d'éthanol et 0,900 mg de chlorure 3.3-dichloro-2-oxo-2,3-dihydroindol-5- sulfonyl (Haller) (3,01 mmole). Après 30 min d'agitation, on ajoute à nouveau 0,100 ml de 2-aminoéthanol, et 15 min plus tard 20 g de glace pilée et 0,900 ml d'acide chlorhydrique à 20 %. En réchauffant à la température ambiante, on obtient une masse huileuse qui se dépose au fond du récipient. On laisse décanter le surnageant et le solvant restant est éliminé sous vide. L'huile jaune obtenue est portée à reflux dans l'eau.pendant 2 h. En refroidissant, la solution orange obtenue précipite 374 mg (45,8 %) de cristaux jaune, Rf = 0,52 (méthanol /acétate d'éthyle 1/20 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) # 2,73- 2,82

(m,N-CH2-), 3,38 (t, J = 6.1 1 Hz, -CH-0-) 7, 07 (d, J = 7, 6, C7), 7,66 (t, J = 5,7 Hz,-SO2-NH-) , 7,81 (s, C4), 7,96 (d, J= 8,4, C6) , 11,42 (s, NI H) . méthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique On opère selon Haller ci-dessus, en partant de 0,572 ml d'une solution aqueuse à 40 % de méthylamine (6,62 mmole), 5,6 ml d'éthanol et 1,00 g de chlorure de 3,3-dichloro-2oxo-2,3-dihydroindol-5-sulfonyle (Haller) (3,34 mmole). Le précipité qui se forme est éliminé par filtration et on porte à reflux dans l'eau pendant 2 h. Par refroidissement, la solution précipite (cristaux jaune). Rendement : 420 mg (52,3 %), Rf = 0,29 (acétate d'éthyle/hexane 2/1 v/v): 1HRMN (DMSO-d6) # 2,41 (d, J= 5,0, CH3), 7,08 (d, J= 8,3,

C7), 7,48 (q, J= 5,0, NH2) , 7,77 (s, C4) , 7,95 (d, J= 8, 3, C6) , Il,42 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-d,) 5 28,52 (q, J= 139,2, CH3), 112,40 (d, J= 168,9, C7), 118,04 (s, C3a), 122,48 (d, J= 169,2, C4), 133,13 (s, C5) , 136,15 (d, J= 166,0, C6) , 153,44 (s, C7a), 159,44 (s, C2), 183,04 (s, C3).

2-hydroxyimino-N-(3-iodophényl)-acétamide On opère comme décrit par Marvel et Hiers ci-dessus et on purifie le produit obtenu en procédant selon Holt and Sadler ci-dessus ; PF 152-154 C; Rf = 0,29 (acétate

d' éthyle /hexane 1/1 v/v) : 1H-RMN (DMSO-ds) 8 7,12 (pt, J = 8,1, C5'H), 7,44 (pt, J = 7,9, C4'H ou C6'H), 7,63 (s, C2H), 7,65 (pt, J= 8,2, C4'H ou C6'H), 8,16 (Pt, J = 1,7, C2'H), 10,27 (s, NH) , 12,27 (s, C2NOH) ; 13C-RMN (DMSO-d6) # 94,69 (d, J = 11,7, C3'), 119,32 (d, J = 165,7, C6'), 128,22 (d, J = 168,0, C2' ) , 130,95 (d, J = 162,8, C5) , 132, 57 (d, J = 168,1, C4'), 140, 06 (s, CI'), 144, 05 (d, J = 171,5, C2), 160,67 (s, Cl).

Tampons Les tampons utilisés ont les compositions suivantes: Tampon d'homogénéisation : - 60 mM de P-glycérophosphate, 15 mM de p-nitrophénylphosphate, 25 mM de Mops (pH 7,2), 15 mM d'EGTA, 15 mM de MgCl2/ 1 mM de DTT, 1 mM vanadate de sodium, 1 mM de NaF, 1 mM de phénylphosphate, 10 ug de leupeptine/ml, 10 ug d'aprotinine/ml, 10 g d'inhibiteur de trypsine de soja/ml et 100 uM de benzamidine.

Tampon A : 10 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, 1 mM de DTT, 25 mM de Tris-HCl pH 7,5,50 ug d'héparine/ml.

Tampon C : tampon d'homogénéisation, mais renfermant 5 mM d'EGTA, et dépourvu de NaF et d'inhibiteurs de protéase.

Tris-tampon salin de Tween-20 (TBST) : 50 mM de Tris pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20'.

Tampon de lyse hypotonique (HLB) : 50 mM de Tris-HCl ph 7,4,120 mM de NaCl, 10% de glycérol, 1% de Nonidet-P40, 5 mM de DTT, 1 mM d'EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM d'orthovanadate, 5 pM de microcystine, 100 pg/ml de chacun des produits suivants : leupeptine, aprotinine, pepstatine.

Préparations de kinases et déterminations des activités Les activités des kinases ont été déterminées dans le tampon A ou C (à moins d'indications contraires), à 30 C, à une concentration finale en ATP de 15 M. Les valeurs des essais à blanc ont été soustraites et les activités calculées en pmoles de phosphate incorporé pour une incubation de 10 min. Les valeurs des activités sont généralement exprimées en % de l'activité maximale, c'est- à-dire, en l'absence d'inhibiteurs.

Des essais témoins ont été réalisés à l'aide de dilutions appropriées de MeSO. Dans quelques cas, comme indiqué ci-après, la phosphorylation des substrats est déterminée par autoradiographie après SDS-PAGE.

La GSK-3P utilisée est soit l'enzyme purifiée à partir du muscle de lapin ou exprimée et purifiée à partir de cellules d'insecte Sf9 (Hughes et al, 1992, Eur. J. Biochem., 203 : 305,311). Les déterminations ont été effectuées avec une dilution à 1/100 dans 1 mg de BSA/ml de DTT 10 mM, avec 5 l de GS-1 40 uM comme substrat, dans le tampon A, en présence de 15 M [[gamma]32P] ATP (3000 Ci/moles ; 1 mCi/ml) dans un volume final de 30 l. Après 30 minutes d'incubation à 30 C, des aliquotes de 25 l de surnageant ont été appliqués sur des bandes de papier de phosphocellulose Whatman P81, de 2,5 x 3 cm, et 20 secondes plus tard, les filtres ont été lavés 5 fois (pendant au moins 5 min. à chaque fois), dans une solution de 10 ml

d'acide phosphorique/1 d'eau. Les filtres humides ont fait l'objet de comptage en présence de 1 ml de fluide de scintillation ACS (Amersham).

La CDK1/cycline B utilisée a été extraite à l'aide d'un tampon d'homogénéisation à partir d'ovocytes d'étoiles de mer (Marthasterias glacialis) et purifiée par chromatographie d'affinité sur des billes de p9CKShs1~ Sépharose à partir desquelles le produit a été élué par du p9CKShs1 libre, comme décrit par Meij er et al., 1997, (Methods in Enzymology, vol 283 : 113-128), et Borgne et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 : 11977-11986.

L'activité kinase a été déterminée dans le tampon C, avec 1 mg d'histone Hl/ml, en présence de 15 M de [[gamma]32P] ATP ((3000 Ci/mmol ; mCi/ml) dans un volume final de 30 ul.

Après 10 minutes d'incubation à 30 C, des aliquotes de 25 l de surnageant ont été déposés sur des papiers de phosphocellulose P81 et traités comme décrit cidessus.

La CDK5/p25 a été reconstituée en mélangeant des quantités égales de CDK5 et de p25 de mammifère recombinantes, exprimées dans E.coli sous forme de protéine de fusion GST (Glutathione-S-transférase) et purifiées par chromatographie d'affinité sur glutathione-agarose p25 est une version tronquée de p35, l'activateur de CDK5 de 35kDa.

Son activité a été déterminée dans le tampon C comme décrit pour CDKl/cycline B.

. Phosphorylation in vitro et in vivo de tau :
Cellules et virus : on a cultivé les cellules Sf9 (InVitrogen, San Diego, CA) à 27 C dans un milieu de Grace de culture en monocouche (Gibco BRL, Gaithersburg, MD),

supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal et 50 ug de gentamycine/ml et 2,5 ug d'amphotéricine/ml. BaculoGold a été obtenu auprès de PharMingen (San Diego, CA),et pVL1392 de InVitrogen.

La transfection de tau : on a excisé, à partir d'un vecteur d'expression bactérien pNG2 (Biernat et al., 1993,Neuron 11 : 153-163) et le gène codant pour htau23, l'isoforme tau humain le plus court, avec XbaI et BamHI. Le gène a été inséré dans le vecteur de transfert de baculovirus pVL1392 découpé avec les mêmes endonucléases. Le système BaculoGold a été utilisé pour la construction du vecteur contenant le baculovirus tau. L'ADN de BaculoGold est un type modifié de baculovirus contenant une délétion léthale.

La co-transfection de l'ADN de BaculoGold avec un vecteur de transfert de baculovirus complément permet de récupérer la délétion léthale de cet ADN viral et de reconstituer des particules de virus viables portant la séquence codant pour htau23.

L'ADN plasmidique utilisé pour les transfections a été purifié en utilisant des cartouches de QIAGEN (Hilden, Allemagne).

Les cellules Sf9 cultivées en monocouches (2x106 cellules dans un récipient de culture cellulaire de 60 mm) ont été co-transfectées avec de l'ADN de baculovirus (0,5 ug d'ADN de BaculoGold) et avec les dérivés de pVL1392 (2 ug) en utilisant la méthode de co-précipitation au phosphate de calcium. La présence de protéine recombinante a été examinée dans les cellules infectées 5 jours après l'infection par SDS-PAGE et Western blot.

Phosphorylation de tau dans les cellules Sf9.

Pour déterminer les effets des inhibiteurs de kinase sur la phosphorylation de tau, les cellules Sf9 infectées par le baculovirus exprimant htau23 ont été traitées 36 heures après l'infection, avec 50 uM d'indirubine-3'-monoxime pendant 5 heures avant d'être recueillies. Pour obtenir des échantillons de tau témoins avec une phosphorylation plus élevée, les cellules Sf9 exprimant htau23 ont été traitées avec 0,2 M d'acide okadaïque pendant 5 heures avant récolte.

Western blot de tau :
Les cellules Sf9 ont été infectées avec un virus recombinant à une MOI de 1 à 5.

Les lysats cellulaires ont été préparés dans le tampon de lyse hypotonique (HLB).

Après 15 minutes de centrifugation à 16000 g, le surnageant a été récupéré et sa concentration en NaCl augmentée jusqu'à 500 mM. Le surnageant a été ensuite soumis à ébullition pendant 10 min. et recentrifugé à 16000 g pendant 15 min. Les protéines (3 ug) ont été résolues par SDS-PAGE, transférées sur une membrane de PVDF et étudiées avec un Western blot avec les anticorps suivants : AT-8 (1: 2000), AT-180 (1: 1000), AT-100 (1: 500), PHF-1 (1: 600) et l'anticorps polyclonal anti-tau K9JA.

La phosphorylation de tau in vitro a été effectuée en utilisant de la GSK-30 purifiée et la protéine tau-32 humaine recombinante en tant que substrat. Après 30 minutes d'incubation en présence de différentes concentrations d'indirubine-3'-monoxime, dans les conditions d'étude de la GSK-3pdécrite ci-dessus, la réaction de la kinase a été arrêtée par addition de tampon

Laemmli. La protéine tau a été résolue en SDS-PAGE à 10% et son taux de phosphorylation visualisé par autoradiographie.

Exemple 1 : Etude de l'inhibition de GSK-3, de CDK5/p25 et de CDK1/cycline B par les indirubines.

Les activités kinases ont été déterminées avec un substrat approprié (GSK-3ss: GS1 peptide ; CDKs: histone Hl) en présence de 15 M d'ATP et à des concentrations croissantes en dérivés testés.

Les valeurs de ICso ont été calculées à partir des courbes dose/réponse et sont données dans le tableau 1.

Tableau 1

<tb>
<tb> Composés <SEP> GSK3 <SEP> CDK1 <SEP> CDK5
<tb>

5-iodo-indirubine-3' -monoxime "Q/O:'j:'/:: 0,025 0,020 indirubine-3 ' -monoxime Qt 022 0,180 0,100 5-SO2 hydroxyéthylamide indirubine i$,,t,$M,,*,,, 0,065 0,050 5-S03NHz-indirubine O/,p':g:i: 0,110 0,075 S-nitro-indirubine ;tll:!I:I'1 0,250 0,380 5-chloro-indirubine Il!IIII 0,280 0,230 5-bromo-indirubine !j.;ilj:'III1 0,230 0,250 5-méthyl-indirubine g g62 ' 0,280 0,210 5-iodo-indirubine .$, ,,f$flr 0,220 0,200 5-fluoro-indirubine 9-f07%jj 0 350 0,750 5-So3Na-indirubine 3' -monoxime Ój:'I'lj!::n:::':'I':I'::':Hil'!:I" 5-S0z-méthylamide-indirubine 0, 110 OÛSÛ 0/02

<tb>
<tb> 6-iodo-indirubine <SEP> 0,130 <SEP> 0,800 <SEP> 1,500
<tb> 5-SO2 <SEP> diméthylamide-indirubine <SEP> 0,180 <SEP> 0,100 <SEP> 0,060
<tb> 5-5'-dibromo-indirubine <SEP> 0,250 <SEP> 600 <SEP> 200
<tb>

5-SO H-indirubine 0 280 nGi::JJ51:::"::}O:,\:: 3 , ""W"""""""""'"'''''' "";<"""'

<tb>
<tb> 5'-bromo-indirubine <SEP> 0,350 <SEP> 0,510 <SEP> 4
<tb> 5-S02 <SEP> dihydroxyéthylamide-indirubine <SEP> 0,400 <SEP> 0,150 <SEP> 0,150
<tb> Indirubine <SEP> 0,600 <SEP> 10,000 <SEP> 5,500
<tb>

ar-i Ho ' #hfTn#i n ri nihi Tio#oil -Frim eyii,-4 4.000 ' H "# TiÛti" -tt-ftf-Sm

a - - - -- - -~-~~~~ ~ ~ ~ -- --- - - -- - - ..1. J;,;,;,;,;,;,;,:""::,:;-:,.,;:-;,:,;;:,,.:,.,:t:., "-;-".,:....::;,:..x*..=.':1
Les déterminations effectuées à titre comparatif avec d'autres indigoïdes, comme les dérivés d'isatine ou d'indigo, donnent les résultats rapportés dans le tableau 2.

Tableau 2

<tb>
<tb> Composés <SEP> GSK3 <SEP> CDK1 <SEP> CDK5
<tb> isatine-5-sulfonique <SEP> acide-dihydroxyéthylamide <SEP> 29 <SEP> 600 <SEP> 800
<tb> 3-indoxylacétate <SEP> 70 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> 6-iodo-isatine <SEP> 75 <SEP> 600 <SEP> 800
<tb> acide <SEP> isatine-5-sulfonique-diméthylamide <SEP> 85 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> 3,3'-diphényl-2,2'-bisindol <SEP> 180 <SEP> 500 <SEP> 500
<tb> 1-phényl-indirubine <SEP> 200 <SEP> 500 <SEP> 800
<tb> acide <SEP> indigo-5,5',7,-trisulfonique <SEP> (sel <SEP> K3) <SEP> 280 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> 5-nitro-isatine <SEP> 310 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> iso-indigo <SEP> 320 <SEP> 40 <SEP> 130
<tb> acide <SEP> indigo-5,5',7,7'-tétrasulfonique <SEP> (sel <SEP> K4) <SEP> 350 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> indigo <SEP> carmine <SEP> 360 <SEP> 400 <SEP> >1000
<tb> 2-(2indolyl)indole <SEP> 380 <SEP> 700 <SEP> 300
<tb> S-bromo-3-indoxylacétate <SEP> 400 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> Indigo <SEP> 550 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> 5-iodo-isatine <SEP> >1000 <SEP> 300 <SEP> 800
<tb> 5-bromo-isatine <SEP> >1000 <SEP> 600 <SEP> >1000
<tb> 1-méthyl-indirubine <SEP> >1000 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> Isatine <SEP> >1000 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> 5-fluoro-isatine <SEP> >1000 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> 5-chloro-isatine <SEP> >1000 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> 5-méthyl-isatine <SEP> >1000 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> acide <SEP> 5-sulfonique <SEP> isatine, <SEP> sel <SEP> de <SEP> sodium <SEP> >1000 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> 1-méthyl-isatine <SEP> >1000 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb> 1-phényl-isatine <SEP> >1000 <SEP> >1000 <SEP> >1000
<tb>

L' examen de ces 2 tableaux montre que, parmi les indigoïdes, seuls les dérivés d'indirubine exercent à la fois un effet inhibiteur vis-à-vis de GSK-3pet de CDKs. Il ressort en effet clairement de ces résultats que ni l'isatine, ni l'indigo ou leurs dérivés, n'exercent d'effet significatif sur l'une de ces 3 kinases.

Les figures 1A à 1D donnent les courbes doseréponse pour la 5-iodo-indirubine-3'-monoxime (A), la 5,5'dibromoindirubine (B), l'acide 5-sulfonique indirubine-3'monoxime (C) et l'indirubine-3'-monoxime (D). L'inhibition de GSK-30 et des CDKs est déterminée comme indiqué plus haut.

L'activité est exprimée en % de l'activité maximale (sans inhibiteurs).

Exemple 2 : Etude du mécanisme d'action des indirubines
On procède à cet effet à des expériences de cinétique en faisant varier à la fois les niveaux d'ATP et les concentrations en indirubine-3' -monoxime.

Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 2 (1/V en fonction de 1/ATP).

Les concentrations en ATP dans le mélange réactionnel varient de 0,05 à 0,25 mM, la concentration de GS-1 étant maintenue constante à 6,7 uM. Dans l'encadré, on a reporté les pentes en fonction des concentrations à partir du premier tracé. La constante d'inhibition apparente (K1) est indiquée par une flèche.

On constate que l'indirubine-3' -monoxime agit en compétition avec l'ATP pour se fixer.

La linéarité de la pente dans l'encadré de la figure montre qu'il s'agit d'un inhibiteur linéaire.

La constante apparente d'inhibition K. est de 50 nM.

Exemple 3 : Etude de l'inhibition par les indirubines, in vitro et in vivo, de la phosphorylation de tau par GSK-3
On rapporte les résultats obtenus avec l'indirubine-3' -monoxime sur la phosphorylation d'un substrat physiologique, constitué par la protéine tau liant des microtubules.

On utilise une protéine tau humaine recombinante exprimée dans une bactérie. La protéine est phosphorylée in vitro par GSK-30 en présence des concentrations croissantes en indirubine-3' -monoxime. On procède ensuite à une résolution par SDS-PAGE, suivie d'une autoradiographie.

La figure 3 donne les résultats obtenus et montre que la phosphorylation est inhibée de manière dosedépendante par l'indirubine-3' -monoxime, avec une IC50 autour de 100 nM.

Des études in vivo ont été également effectuées.

Les cellules Sf9 exprimant htau23 ou bien n'ont pas subi de traitement (-) ou ont été exposées à 0,2 uM d'acide okadaïque (OA), ou à 50 M d'indirubine-3' monoxime ou à NG-97 pendant 5h.

Les lysats cellulaires (3 ug de htau23) ont été résolus par SDS-PAGE, colorés au bleu de Coomassie ou mis à réagir avec divers anticorps. K9JA (anticorps pan-tau) reconnaît toutes les préparations renfermant tau. AT8, AT 180 et PHF1 sont spécifiques pour différents motifs phosphorylés SP ou TP à savoir, respectivement, Ser 202 ; Thr 205, Thr 231 ; 235 et Ser 396 ; Ser 404 (numérotation dans htau 40, qui correspond à l'isoforme le plus long de la protéine tau humaine). AT 100 reconnaît la

protéine tau phosphorylée à T 212 et S214 (réaction très spécifique de la protéine tau chez la maladie d'Alzheimer, mais qui se produit également dans les cellules Sf9, si les 2 sites sont phosphorylés).

La disparition du signal AT100 après traitement avec l'indirubine-3'- monoxime montre que ce dérivé est bien capable d'inhiber une activité de type GSK-3ss dans les cellules Sf9.

Exemple 4 : Etude de l'inhibition par les indirubines, in vitro et in vivo, de la phosphorylation de DARPP-32 par CDK5/p25
La protéine neuronale DARPP-32 a été identifiée comme substrat physiologique de CDK5/p25. DARPP-32 devient un inhibiteur de kinase cAMP-dépendante (PKA) lorsqu'il est phosphorylé par CDK5/p25 sur Thr 75.

Cette protéine a été utilisée comme substrat pour la phosphorylation in vitro par CDK5/p25.

On constate que l'indirubine-3'-monoxime inhibe cette phosphorylation de manière concentration-dépendante, avec une IC50 autour de 100 nM.

La phosphorylation de DARPP-32 par CDK5/p25 peut être contrôlée avec un anticorps phosphospécifique dirigé contre DARPP-32 phospho-Thr 75.

On n'observe pas de phosphorylation in vivo sur ce site dans le tissu p35/. On constate une inhibition par l'indirubine-3' -monoxime, ce qui montre que les indirubines sont capables d'inhiber CDK5 in vivo.

Claims

REVENDICATIONS

1. Utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de la GSK-3ss de dérivés d'indirubine répondant à la formule générale I : @

dans laquelle R1 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe méthylènehydroxy; un radical alcoyle ou alkyloxy ou méthylènealkoxy, à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18; un radical cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un radical aryle, aralkyle ou aryloxy, substitué ou non substitué, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe mono-, diou trialkylsilyle ayant 1 à 6 de carbone, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas, dans le groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée; un groupe mono-, di- ou triarylsilyle, avec des groupes aryle substitués ou non, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas; un groupe trifluorométhyle; un groupe-COM; -COOM; ou -CH2COOM, avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cl à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, radicaux alkyle ou groupe alcoxy; un

groupe -NRnR12, dans lequel Rll et Ruz, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical

alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe acyle; un groupe méthylèneamino -CH2-NR11R12, dans lequel R11 et R12 présentent les significations ci-dessus; un groupe benzyle, dans lequel le noyau benzène comprend, le cas échéant, un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un résidu d'acide aminé physiologique lié à l'azote, comme un amide ; un 0-glycoside ou un N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les disaccharides ; ou un groupe méthylènesulfonate; R2, R3, R4, R5, R7, R8, R9 et R10, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ; d'halogène;un groupe hydroxy; un groupe nitroso; un groupe nitro; un groupe alkoxy; un groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino; un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes ; un groupe aralkyle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe aryloxy, substitué ou non comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènearyloxy, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe cycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes ; un groupe trifluorométhyle; un groupe-COM; -COOM ; ou CH2COOM, avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cl à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, pouvant être substitué par un ou

sulfonamide; un groupe -S02NR"R 12 , dans lequel R11 et R 12 présentent les significations données ci-dessus; un groupe azo -N=N-R13, dans lequel R13 représente un groupe aromatique, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, ou un groupe 0-glycoside ou N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les dissacharides ; ouR1 et R5, et R6 et R10, respectivement, forment ensemble, indépendamment l'un de l'autre, un cycle ayant 1 à 4 groupes CH2, le cas échéant substitué; et X et Y, identiques ou différents, représentent un atome d'oxygène; de soufre ; sélénium ; tellurium; un groupe -NR14, dans lequel R14 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, un groupe aralkyle, ou un groupe sulfonate ; ou-NOR14, dans lequel le groupe R14 présente les significations données ci-dessus, et les sels de ces dérivés physiologiquement acceptables.

alcoxy ; un groupe -NR11R, dans lequel R11 et Rlz, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, un groupe acyle, ou dans lequel l'atome d'azote fait partie d'un groupe cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe -CONR11R12, dans lequel R11 et R12 présentent les significations ci-dessus; un groupe hydroxylamino ; un groupe phosphate; un groupe phosphonate; un groupe sulfate; un groupe sulfonate; un groupe

plusieurs atomes d'halogène, groupes alkyle ou groupes

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans lesdits dérivés d'indirubine, un ou plusieurs atomes d'un ou plusieurs cycles benzéniques sont remplacés par des atomes d'azote.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que dans lesdits dérivés d'indirubine, un ou plusieurs systèmes cycliques aromatiques ou non aromatiques, qui comprennent, le cas échéant, un ou plusieurs hétéroatomes indépendamment l'un de l'autre, sont condensés au système indirubine.

4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les dérivés d'indirubine sont liés à un ester de polyéthylèneglycol ou à un éther de polyéthylèneglycol par des liaisons, respectivement, ester ou éther.

5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que, dans lesdits dérivés d'indirubine, X et Y, identiques ou différents, représentent un groupe = 0 ou = NOH.

6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que les substituants R1, R3, R4 et R8 desdits dérivés d'indirubine présentent les significations suivantes : - R3: un atome d'hydrogène, d'halogène, un

radical alkyle, un groupe -S03H, -S02NH2, -SOZ-N- (CH3) 2, -SO2-N-C2H5-OH, -S02-N-(C2H5-OH)2, -S02-NH-CH3, - R4 et R8, indépendamment l'un de l' autre : un atome d'hydrogène ou d'halogène, - R1: un radical alkyle ou aryle, les autres substituants donnés sur la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.

7. Utilisation selon l'une quelccnque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que dans lesdits dérivés d'indirubine, X = Y, ces deux substituants représentant un groupe = 0.

8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que les substituants R1, R3, R4 et R8, dans lesdits dérivés d'indirubine, répondent aux significations suivantes : - R1: alkyle, notamment méthyle, et phényle - R3: hydrogène, halogène (F, Cl, Br, I), N02,

- S03H, -S02NH2, -SOZ-N (CH3) 2, -SOz-N-CZHS-OH, -SOz-N- (C2H5- OH) 2, -S02-NHCH3, -R4 et R8 : halogène, en particulier I ou Br, les autres substituants donnés dans la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.

9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que lesdits dérivés sont choisis parmi l'indirubine, la 5-iodo-indirubine, la 5-bromo-indirubine, la 5-chloro-indirubine, la 5-fluoro-indirubine, la 5méthyl-indirubine, la 5-nitro-indirubine, la 5-S03Hindirubine, la 5'-bromo-indirubine, la 5-5'-dibromoindirubine ou l'acide 5'-bromo-indirubine 5-sulfonique.

10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que, dans lesdits dérivés d'indirubine, X représente un groupe = NOH et Y un groupe = 0.

11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que R3 représente un atome d'halogène, notamment I, ou un groupe -S03Na .

12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que lesdits dérivés sont choisis parmi

l'indirubine-3'-monoxime, la 5-iodo-indirubine-3'-monoxime et la 5-S03Na-indirubine-3'-monoxime.

13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie orale, sous forme de gélules, comprimés, dragées ou capsules.

14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie injectable, sous forme de solution.

15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour le traitement de pathologies impliquant GSK-3p et CDK5.