FR2824327A1 - Particules pseudovirales de birnavirus - Google Patents

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Abstract

L'invention est relative à des protéines chimériques obtenues par fusion de la polyprotéine d'un birnavirus avec un polypeptide hétérologue.L'invention concerne également des particules pseudovirales de birnavirus résultant de l'association desdites protéines chimériques, ainsi que l'utilisation desdites particules pour l'obtention de vaccins.

Description

- tri des cellules marquées par les tétramères.
L' invention est relative à des particules
pseuJovirales de birnavirus et à leurs utilisations.
La famille des Birnaviridae regroupe 3 genres: les aquabirnavirus, pathagènes des poissons, représentés par le virus de la nécrose infectieuse pancréatique (IPNV), les avibirnavirus, pathogènes des oiseaux, représentés par le vicus de la bursite infectieuse (IBDV), et les entomobirnavirus représentés par le virus X de la drosophile
(DXV).
Le vicus IBDV est l' agent causal de la bursite infectieuse, également dénommoe maladie de Gumboro, maladie contagieuse qui cause des dommages importants dans les élevages de volaille. Le virus qui lnfecte les lymphocyLes B dans la bourse de Fabricius, entraîne une immunosuppression qui favorise les atteintes infectieuses, notamment
respiratoires et digestive.
Les birnavirus sont des virus à ARN double-brin,
qui se présentent sous forme de particules icosaédriques non-
enveloppées de 60 nm de diamètre environ. Le génome des birnavirus est constitué de 2 segments, A et B. Le segment B code pour une protéine de 100 kDa, dénommée VP1, qui possède une activité ARN polymérase. Le segment A code pour une polyprotéine qui est clivée en trois protéines: pVP2 (également dénommée VPX), VP3 et VP4. La protéine VP2 est
issue du clivage protéolytique de pVP2.
Dans le cas du virus IBDV, pVP2 correspond aux acides aminés 1 à 512 de la polyprotéine alors que la VP2 mature correspond aux acides aminés 1 à 441. VP4 correspond aux acides aminés 513 à 755 et VP3 aux acides aminés 756 à
1012.
VP2 (38 kDa) et VP3 (33 kDa) sont les constituants majeurs de la capside virale. VP4 est la protéase virale responsable du clivage de la polyprotéine et
ne semble pas associée aux particules virales.
VP2 porte les épitopes inducteurs d'anticorps
neutralisants alors que VP3 est associée à l'ARN génomique.
Les vaccins actuellement disponibles pour prévenir la bursite infectieuse sont dans la plupart des cas, constitués de virus vivants atténués. Ils possèdent toutefois les inconvénients classiques de ce type de vaccins, notamment le risque de motations qui peut donner naissance à des virus
plus virulents ou ayant perdu leur immucogénicité.
Des essais d'immunisation des poulets ont été
effectués avec la protéine VP2 produite par génie génétique.
Ils n'ont toutefois pas permis d'obtenir une protection satisfaisante, quel que soit le système d' expression utilisé
(E. coli, levure, baculavirus).
Une alternative à l'utilisation de vaccins vivants atténués ou de vaccins à base de sous-unités virales consiste en l'utilisation de particules pseuJovirales (également dénommées VLP pour " vicus-like-particles ", produites par autoassemblage des sous-unités constitutives de la capside virale. Ces particules imitent la structure et les propriétés antigéniques du virion natif, mais sont dépourvues d'acide nucléique et donc incapables de se répliquer. Il a ainsi été possible d'obtenir des particules pseudavirales pour certains virus, parmi lesquels on citera à titre d'exemple, les papillomavirus, le poliovirus, certains rétrovirus, le virus de l'hépatite B. les rotavirus, etc. Des particules pseudavirales ont été utilisées non seulement en tant que vaccins, mais également comme vecteurs de molécules d'intérêt biologique, notamment de peptides ou d'acides nucléiques. On citera notamment des particules pseudavirales dérivéss du virus HBV (KOLETZKI et al., Journal of General Virology, 78, 2049-2053, 1997), de papillomavirus (TOUZE et COURSAGET, Nucleic Acids Research., 26, 1317-1323, 1998), ou de rotavirus (Demande PCT/FR01/00676
au nom de l'INRA).
Cependant, dans le cas de certains virus, l'autosssemblage des protéines de capside n'intervient pas, ou produit une structure différente de celle de la particule
virale native. C'est notamment le cas du virus IBDV.
MARTINEZ-TORRECUADRADA et al. Virology, 278, 322-331, (2000) ont ainsi observé que l' expression de la polyprotéine pVP2 VP4-VP3 de l'IBDV dans un système baculovirus ne génère pas efficacement de particules pseuJovirales, mais aboutit principalement à la formation de structures tubulaires
constituées de précurseur pVP2.
Les Inventeurs sont maintenant parvenus à obtenir des particules pseudavirales dérivées de birnavirus, et reproduisant la structure du virion natif. Ils ont en effet constaté que, de facon surprenante, lorsque la polyprotéine du vitus IBDV était fusionnce, à son extrémité Cterminale, à une séquence poptidique exogène, les protéines chimériques ainsi obtenues s'assemblaient entre elles pour reconstituer des particules pseuJovirales possédant la morphologie et les propriétés
antigéniques du virus IBDV natif.
La présente invention a pour objet une protéine chimérique comprenant la polyprotéine d'un birnavirus, liée à son extrémité C-terminale à un polypoptide X. La présente invention a également pour objet: - les séquences d'acide nucléique codant des protéines chimériques conformes à l' invention; - les cassettes d' expression, dans lesquelles une séquence d'acide nucléique codant une protéine chimérique conforme à l' invention est associée à des éléments appropriés de contrôle de la transcription, et éventuellement de la traduction; - les vecteurs recombinants comprenant au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l' invention; - les cellules-hôtes transformées par au moins une séquence d'acide nualéique conforme à l' invention, et
capables d'exprimer ladite séquence.
- les particules pseudovirales de birnavirus résultant de l'assemblage d'une ou plusieurs protéine(s) chimérique(s) conforme(s) à l' invention; l'utilisation desdites particules pseudovirales pour la préparation de médicaments, notamment de vaccins, ou en tant que vecteurs de molécules d'intérêt thérapeutique, notamment de peptides ou d'acides nucléiques, vers des
cellules cibles.
Selon un mode de réalisation préféré de la
présente invention, ledit birnavirus est le virus IBDV.
La tail le du polypeptide X peut varier de
quelques acides aminés à quelques centaines d'acides aminés.
Avantageusement, elle est comprise entre 5 et 2000 acides
aminés, de préférence entre 10 et 500 acides aminés.
Le polypoptide X peut être lié avec la polyprotéine de birnavirus directement ou bien par
l'intermédiaire d'un lieur poptidique.
La nature du polypeptide X dépend de l' usage envi sagé pour le s part icul es ps eudovi rale s résultant de l'autoassemblage de protéines de fusion conformes à
l' invention.
Si ces particules pseudovirales sont uniquement destinces à l'obtention de vaccins contre les infections à
birnavirus, la nature du polypeptide X est sans importance.
Il peut s'agir d'un polypeptide de séquence quelconque.
Pour utiliser ces particules pseuJovirales dans le cadre de vaccins divalents, destinés à protéger l'animal vacciné non seulement contre un burnavirus, mais également contre un autre pathogène, viral ou bactérien, le polypeptide
X sera constituée par un antigène dudit pathogène.
A titres d'exemples non-limitatifs: - pour obtenir un vaccin divalent permettant d'immuniser des poulets contre le virus IBDV et le virus de Marck, le polypeptide X pourra être constitué par l'une quelconque des protéines pp38, glycoprotéine B. Meq, ICP4 ou ICP 27 du virus de Marek, ou par un fragment immunogène de l'une de ces protéines, par exemple le fragment codé par le segment d'ADN situé entre les sites Eco47III-BamHI (nualéotides 1515-1800) du gène de la glycoprotéine B. - pour obtenir un vaccin divalent permettant d'immuniser des poulets contre le virus IBDV et le virus de la Bronchite Infectieuse, le polypeptide X pourra être constituée par l'une quelconque des protéines S ou N du virus de la Bronchite Infectieuse, ou par un fragment immunagène de l'une de ces protéines, par exemple le fragment S1 de la protéine S; - pour obtenir un vaccin divalent permettant d'immuniser des poulets contre le virus IBDV et le virus de Newcastle, le polypoptide X pourra être constituée par l'une queleanque des protéines HN ou F du virus de Newcastle, ou
par un fragment immunogène de l'une de celles-ci.
Si ces particules pseuJovirales sont destinées à être utilisées comme vecteurs d'une protéine active sur des fonctions cellulaires, par exemple une cytokine ou toute autre protéine modulant la réponse immunitaire, le polypeptide X pourra être constitué par ladite protéine active. Si ces particules pseuJovirales sont destinces à être utilisées comme vecteurs d'acide nucléique, le polypeptide X pourra être constituée par un polypeptide comprenant un domaine peptidique de liaison à un acide nueléique, capable de reconnaître spécifiquement une séquence d'ADN ou d'ARN, permettant ainsi la fixation à une protéine chimérique conforme à l' invention d'une séquence d'acide nucléique comprenant ladite séquence, et son encapsidation dans une particule pseudovirale résultant de l' assemblage de
protéines chimériques conformes à l'invention.
A titre d'exemples de polypeptides comprenant un domaine peptidique de liaison à un acide nucléique, et pouvant faire partie d'une protéine chimérique conforme à l' invention on citera notamment: - des protéines d'origine virale ou des fragments de celles-ci comprenant des séquences d'encapsidation. A titre d'exemples non-limitatifs de protéines d'origine virale comprenant un domaine de liaison à l'ARN, on peut citer la protéine de capside du phage MS2, la protéine N du virus de la rage, la protéine NCp7 des lentivirus, la protéine NSP3 des rotavirus. A titre d'exemples non limitatifs de protéines d'origine virale comprenant un domaine de liaison à l'ADN, on peut citer les protéines intervenant dans l'encapsidation d'un génome viral, telles que la protéine ICP 8 du virus Herpes simplex, la protéine gpNul du phage lambda,
ou la protéine de liaison à l'ADN des adénavirus.
- des facteurs de réqulation en trans de la transcription, ou des fragments de ceux- ci comprenant un domaine de liaison à l'ADN. On citera par exemple le trans-activateur du promoteur du gène lacI ou des doigts à zinc naturels ou artificiels [WU et al., Proccedings National
Academy Science USA, 92, 344-8, (1995)].
La fixation d'une séquence d'acide nueléique à une protéine chimérique conforme à l'invention comprenant un domaine peptidique de liaison à un acide nucléique peut s'effectuer: - dans le cas d'une séquence d'ARN, par co expression dans une même cellule-hôte, d'une séquence d'ADN codant ladite protéine chimérique, et d'une séquence d'ADN pouvant être transcrite en un ARN comprenant une séquence cible reconnue par le domaine peptidique de liaison à un acide nualéique de ladite protéine chimérique; ou - dans le cas d'une séquence d'ADN, par transfection avec ladite séquence, des cellules o sont assemblées les particules pseuJovirales, ou par assemblage in vi tro des protéines des
particules pseudovirales.
La présente invention englobe également des protéines chimériques, telles que définies ci-dessus, et dans lesquelles la séquence de la polyprotéine de birnavirus a été modifiée, au niveau de la séquence comprise, entre les acides aminés 1 à 512 de la protéine pVP2, pour introduire au moins un motif peptidique constituant un ligand pour un récepteur
cellulaire.
Cette modification permet de moduler le ciblage des particules pseudovirales conformes à l' invention, en en modifiant la spécificité, et/ou en élargissant l'éventail des cellules-cibles. Habituellement, les birnavicus IBDV et IPNV se lient à leurs cellules cibles, respectivement les lymphocytes B de la bourse de Fabricius ou leurs précurseurs cellulaires, et les cellules pancréatiques ou les cellules des muscles
striés par l'intermédiaire de la protéine VP2.
Pour cibler d'autres cellules, on peut introduire
par exemple:
- Le motif Arg-Gly-Asp, qui est un ligand des
intégrines présentes à la surface de nombreuses cellules.
- Un domaine immucogloduline d'une molécule d'adhésion; de tels domaines sont des ligands de différentes protéines présentéss à la surface de différents types de cellules. Le choix du domaine immucoglobuline dépendra du
type de cellule que l'on souhaite cibler.
Les particules pseuJovirales conformes à l' invention peuvent être constituées de protéines chimériques conformes à l' invention, identiques entre elles. Elles peuvent également être constituées de sous-unités différant entre elles par la nature de le polypeptide X et/ou par la présence, dans la polyprotéine, de motifs peptidiques ciblant
des cellules différentes.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de particules pseuJovirales conformes à l' invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'une cellule-hôte exprimant une séquence d'acide nuclélque codant une protéine chimérique conforme à l' invention, et la récupération des particules pseudovirales
à partir de la culture.
Des séquences d'acide nualéique, les cassettes d' expression, et les vecteurs recombinants permettant la production des protéines chimériques conformes à l' invention peuvent être obtenus par les techniques classiques du génie génétique, telles que celles décrites par SAMBROOK et al., [MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)].
Des éléments de contrôle de la transcription et de la traduction, ainsi que les vecteurs utilisables pour la construction de cassettes d' expression et de vecteurs recombinants conformes à l' invention seront choisis notamment
en fonction de la cellule-hôte que l' on souhaite utiliser.
. Des cellules-hôtes utilisables pour l' expression de protéines chimériques et la production de particules pseuJovirales conformes à l' invention, sont en particulier des cellules eucaryotes, et notamment des cellules d'insectes, par exemple des cellules de Spodoptera frugiperda. Des vecteurs utilisables dans ces cellules d'insectes sont notamment des vecteurs dérivés de baculevirus. Des méthodes de clonage et d' expression de protéines recombinantes dans un système baculovirus/cellules d'insectes, et des vecteurs utilisables pour la mise en _uvre de ces méthades sont connus de l'homme de l'art, et sont décrits par exemple dans BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL Freeman and Cie, New York, (1992). D'autres méthodes et d'autres vecteurs également utilisables sont décrits par exemple dans la Demande EP 0 345 152, dans la Demande EP 0 651 815, ou dans la Demande EP 0 638 647 aux noms de l'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE et du CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ainsi que dans
la Demande PCT WO 95/20672.
Des particules pseudovirales conformes à l' invention peuvent être utilisées pour la préparation de vaccins, notamment de vaccins permettant l'immunisation de poulets contre la bursite infectieuse. Elles peuvent également être utilisées pour administrer et véhiculer in vivo des molécules d'intérêt thérapeutique, notamment des protéines ou des acides nucléiques, en les mettant à l'abri de la dogradation dans les fluides biologiques, et de les
cibler sur les cellules souhaitées.
La présente Invention sera mieux comprise à
l' aide du complément de description qui va suivre, qui se
réfère à des exemples de préparation et d'utilisation de particules pseuJovirales conformes à l'invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d' illustration de l'objet de l' Invention
dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1: CONSTRUCT I ON DE BACULOVIRUS RE COMB INANT S
EXPRIMANT LA POLYPROTEINE DU BIRNAVIRUS IBDV
Deux baculovirus recombinants ont été construits : l'un exprime la polyprotéine pVP2-VP4-VP3 codée par le segment génomique A du virus IBDV, le second exprime la même polyprotéine fusionnée en COOH avec la protéine eGFP (Grcen
Fluorescent protein).
Construction des vecteurs de transfert Obtention du plasmide pFBAIBDA La totalité du segment A (3261 paires de bases) du virus IBDV (souche CT, numéro d'accès GENBANK EMBL AJ310185) a été clonée dans le plasmide pUC19 au site EcoRI
pour donner le plasmide pUC19-IBDA.
L' insert EcoRI-EcoRI du plasmide pUC19-IBDA contenant le segment A a été sous-cloné dans le plasmide de transfert pFASTBAC=(GIBCO-BRL), en placant ia séquence codant pour la polyprotéine sous contrôle du promoteur polyhédrine de baculovirus porté par pFASTBAC_ pour obtenir
le plasmide pFBIBDA.
Une délétion de 114 bases, entre les nucléctides 6 à 120 situés dans la séquence 5' non codante du segment A, a été réalisée par cougure par PvuI et auto-ligation de
pFBIBDA. Le plasmide obtenu est dénommé pFBAIBDA.
Obtention du plasmide pFBAIBDA-GFP Un site de restriction unique NheI a été introduit par mutagénèse dirigée dans le plasmide pFBAIBDA pour détruire le codon stop de la séquence codant la polyprotéine du virus IBDV. Le plasmide obtenu est dénommé pFBAIBDANheI. La séquence codant pour la protéine EGFP-C a été récupérce à partir du plasmide pEGFP-C1 (CLONTECH) par couqure NheI-KpnI, puis clonée au site NheI-KpnI de pFBAIBDANheI, en phase avec la séquence codant pour la polyprotéine du virus IBDV. Le plasmide obtenu est dénommé
pFBAIBDA-GFP.
pFBAIBDA ou pFBAIBDA-GFP ont ensuite été introduits dans des cellules compétentes E. coli DHlOBac (GIBCO-BRL). Deux j ours plus tard, les colonies contenant des Bacmides_ recombinants ont été isolées, et les Bacmides_ recombinants de haut poids moléculaire ont été isolés, en suivant les instructions du manuel d'utilisation " BAC-TO-BAC_ Baculovirus expression systems ", et utilisés pour transfecter des cellules d'insectes de la lignce Sf9 de Spodeptera frugiperda pour produire des baculovirus
recombinants.
Deux baculovirus recombinants ont ainsi été obtenus: - BacAIBDA, qui exprime la polyprotéine pVP2-VP4-VP3 de IBDV seule; - BacAIBDA-GFP qui exprime la polyprotéine
pVP2-VP4-VP3 de IBDV fusionnée en COOH avec la protéine eGFP.
Ces baculavicusvirus recombinants sont amplifiés par passages successifs en cellules Sf9 pour générer des
stocks viraux d' environ 108 UFP (unités formant plaque) /ml.
EXEMPLE 2: PRODUCTION ET PURIFICATION DE PARTICULES
PSEUDOVIRALES DE BIRNAVIRUS
Des cellules Sf9 sont infectéss, à une multiplicité d' infection de 3 à 10 UFP par cellule, par le baculavicus recombinant BacAIBDA, ou par le baculavirus recombinant BacAIBDA-GFP. Après 1 h d'incuLation à 27 C pour permettre l'aUsorption des virus, l'inoculum est retiré et
remplacé par du milieu contenant 1% de sérum de veau f_tal.
Expression de la GFP dans les cellules infectées par BacAIBDA-GFP Deux j ours post-infection les cellules infectées par BacAIBDA-GFP sont analysées par FACSCAN et par fluarescence directe, selon les protocoles suivants: 2 x 106 cellules Sf9 infectées sont reprises dans 500 microlitres de tampon phosphate (PBS) pour centrifugation à 500 x g pendant 10 min. Ees cellules sont reprises en paraformaldahyde 2,5% (300 microlitres) et incubses 20 min. à température ambiante. Après deux rinçages en PBS, les cellules sont resuspendues dans 500 microlitres de PBS et
analysses par FACS sur FACScan (Becton Dickinson).
Résultats: On observe que l'ensemble des cellules fluorescent, ce qui permet de vérifier l' expression de la GFP
dans les cellules Sf9 infectées par BacAIBDA-GFP.
Analyse des lysats cellulaires par immunoprécipitation: Deux j ours postinfection, les cellules ensemencées à 3 x 106 par puits sont reprises dans 1 ml de tampon de lyse (Tris 50 mM, pH 8, 150 mM NaCl, 2% Triton X complémenté par un cocktail anti-protéases) et le lysat clarifié par centrifugation à 13000 x g pendant 15 min. Le
surnageant est repris pour analyse en immunoprécipitation.
Les immunaprécipitations sont effectuces selon les protocoles suivants: 500 microlitres de lysat sont mis à agiter doucement en présence de 2 microlitres de liquide d'ascites d'anticorps anti-VP2/pVP2 ou anti-VP3 ou anti-VP4 et billes de protéine A Sepharose (PHARMACIA) pendant 2 heures à température ambiante. Les billes sont ensuite lavées 3 fois par aj out d'1 ml de tampon de lyse et centrifugation pour ôter le surnageant des billes. Les billes sont ensuite reprises dans 35 microlitres de tampon de charge dénaturant et réducteur pour solubi l i s e r le s ant igène s et le s ant icorps complexés aux billes par ébullition pendant 3 min. Après une courte centrifugation, le surnageant des billes est repris et
déposé sur gel SDS-PAGE.
Résultats: Pour BacAIBDA l'analyse par immunoprécipitation avec des anticorps monoalonaux révèle que l' expression de la
polyprotéine génère les produits de clivage pVP2, VP3 et VP4.
Il n'est pas observé de clivage de maturation de pVP2 en VP2.
Pour BaCAIBDA-GFP, l'analyse révèle les produits de clivage pVP2, VP3-GFP et VP4. On observe également le clivage de maturation de pVP2 en VP2. Environ 80% de la pVP2
est convertie en VP2.
Purification des particulespseudovirales: Le lysat cellulaire est traité selon le protocole suivant: Quatre j ours post-infection, 6 boîtes F150 ensemencées chacune avec 35 x 106 cellules Sf9 infectées à une multiplicité d' infection de 10 sont congelées à -20 C avec leurs surnageants de culture. Après décongélation, l'ensemble est clarifié à 5000 rpm pendant 10 min. à 4 C. Le surnageant est repris pour ultracentrifugation à 40000 rpm en 45Ti (BECKMAN) pendant 1 heure. Le culot est repris en Tris mM, pH 8, 250 mM NaC1, 5 mM EDTA avec un cocktail d'antiprotéases. Des extractions successives au Fréon à l'aide d'un broyeur POLYTRON sont réalisoes jusqu'à ce que le surnageant soit limpide. Du chlorure de céaium est ajouté au surnageant pour obtenir un indice de réfraction = 1,362, soit une densité de 1,30. Les gradients de chlorure de césium sont établis par centrifugation isopycnique à 35000 rpm en
SW55 (BECKMAN) à 4 C.
La concentration en protéines dans les bandes isolées à partir du gradient est mesurce par la méthode de
BRADFORD, avec comme référence la sérum albumine bovine.
L'analyse du contenu protéique de chaque bande
est effectuce par SDS-10% PAGE en présence de 5% beta-
mercaptoethanol suivie de coloration au Bleu de Coomassie, et par transfert immuncélectrophorétique sur membrane IMMOBILON à 50V pendant 1 heure. Après rinçage et saturation de la
membrane, des dilutions d'anticorps monoalonaux anti-
pVP2/VP2, anti-VP3, anti-VP4 et anti-GFP sont utilisés pour révéler spécifiquement les antigènes. La révélation de la fixation des anticorps est réalisée avec le système ECL
(AMERSHAM).
Résultats: Cellules infectées par BacAIBDA Dans le cas des cellules infectées par le baculovirus recombinant BacAIBDA, on observe une bande majeure, correspondant à une densité de 1,3. Son observation en microscopie électronique révèle la présence d'un grand nombre de tuLules d' environ 60 nm de diamètre ainsi que quelques particules pseudovirales et quelques tuLules d' environ 25 nm de diamètre. L'analyse par SDS-PAGE révèle une bande de 48 kDa très majoritaire. L'analyse par transfert immunoélectrophorétique montre que la bande de 48 kDa correspond à la protéine pVP2. Il apparaît donc que l' expression de la polyprotéine sauvage d'IBDV en système baculovirus n'aboutit pas à la production efficace de particules pseuJovirales, mais résulte en l' assemblage de
pVP2 en tubules.
Cellules infectées par BACAIBDA-GFP Dans le cas des cellules infectées par BACAIBDA-GFP, une bande majeure a été identifiée, à une densité de 1, 3. Son observation en microscopie électronique montre qu'elle contient une très grande proportion de particules, d' environ 60 nm de diamètre, de structure icosahédrique et de morphologie identique à celle des virions IBDV de type sauvage. L' observation par microscopie optique
montre que ces particules sont fluorescentes.
L'analyse par SDS-PAGE et coloration par Bleu de
Coomassie révèle des bandes de 60 kDa, 48 kDa et 38 kDa.
L'analyse par transfert immuncélectrophorétique montre que ces bandes correspondent respectivement aux protéines
VP3-GFP, pVP2 et VP2 mature.
Ces résultats montrent que l'addition d'une séquence polypeptidique à l'extrémité COOH de la polyprotéine permet l' assemblage des protéines pVP2 et VP3 en particules
pseuJovirales, et la maturation finale de pVP2 en VP2.

Claims (12)

REVENDI CAT IONS
1) Protéine chimérique comprenant la polyprotéine d'un birnavirus, lice à son extrémité C-terminale à un polypoptide X. 2) Protéine chimérique selon la revendication 1, caractérisce en ce que la tail le du polypept ide est comprise entre 5 et 2000 acides aminés, de préférence entre
et 500 acides aminés.
3) Protéine chimérique selon une quelconque des
revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit
birnavirus est le vicus IBDV.
4) Particule pseuJovirale de birnavirus caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une protéine
chimérique selon une quelconque des revendications 1 à 3.
5) Séquence d'acide nucléique codant une protéine
chimérique selon une quelconque des revendications 1 à 3.
6) Cassette d' expression comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 5, associce à des
éléments appropriés de contrôle de la transcription.
7) Vecteur recombinant comprenant au moins une
séquence d'acide nucléique selon la revendication 5.
8) Cellule-hôte transformoe par au moins une
séquence d'acide nucléique selon la revendication 5.
9) Cellule hôte selon la revendication 8,
caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule d'insecte.
) Procédé d'obtention de particules pseudovirales selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'une cellule-hôte selon
une quelconque des revendications 8 ou 9, et la récupération
des particules pseudovirales à partir de la culture.
11) Utilisation de particules pseuJovirales selon
la revendication 4, pour l'obtention d'un médicament.
12) Utilisation selon la revendication 11,
caractérisée en ce que ledit médicament est un vaccin.
13) Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit vaccin est destiné à
l'immunisation de poulets contre la bursite infectieuse.
14) Utilisation selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit médicament est un vecteur permettant de transporter une molecule d'intérêt
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