JP2019517804A - 伝染性喉頭気管炎ウイルスおよび伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの抗原をコードする組換え非病原性マレック病ウイルスコンストラクト - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下、2016年6月17日に出願された米国仮出願第62/351,471号の利益を主張するものであり、その内容はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明は、伝染性喉頭気管炎ウイルスおよび伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのタンパク質抗原をコードして発現する新規の組換え多価非病原性マレック病ウイルスコンストラクト、ならびに家禽ワクチンにおけるその使用の方法に関する。
ILTV gD遺伝子は、48,477ダルトンの分子量を持つ長さ434アミノ酸の糖タンパク質をコードするように見えるが、他者は下流の開始コドンが377アミノ酸残基のみを含むILTV gDタンパク質を導き、これが実際の開始コドンであることを示唆している[Wild et al.,Virus Genes 12:104−116(1996)]。ILTV gI遺伝子は、39,753ダルトンの分子量を持つ長さ362アミノ酸の糖タンパク質をコードする[U.S.6,875,856、参照により本明細書中に組み込まれる]。ILTV gDおよびILTV gIの天然および/または実験室由来のバリアントをコードする核酸は、目下、例示されるものを置換し得る。
プロモーターは、下流コーディング領域の転写を指示する生物のゲノム上の機能的領域である。それゆえ、プロモーターは、遺伝子コーディング領域の上流にある。プロモーターにより指示されるmRNA合成は、「転写開始部位」(TSS)から開始する。生産されたmRNAは、今度は、オープンリーディングフレーム中の第一のATG配列(mRNA中の第一のAUG)である遺伝子の開始コドンから始まってタンパク質へと翻訳される。典型的に、TSSは、開始コドンの30〜40ヌクレオチド上流に位置する。TSSは、遺伝子mRNAの5’末端を、例えばRACE技術によりシークエンスすることによって決定することができる。一般的に、プロモーターは、一般にA+1と表示される開始コドンのAの位置の約1000ヌクレオチド上流の範囲内に含まれ、大半のプロモーターはヌクレオチド−500からA+1の間にある。
本発明は、組換えMDVnpの使用、MDVnpを構築するために用いられる核酸分子もしくはそれらを増殖させるための宿主細胞、または任意のそれらの組み合わせに関し、これらは全て、家禽のためのワクチンの製造のための本発明によるものである。したがって、本発明は、本発明の多価組換えMDVnpを包含するワクチンおよび免疫原性組成物を提供する。かかるワクチンは、伝染性ファブリキウス嚢病(ガンボロ病)および/またはマレック病および/またはILTV感染に関連した病気の予防の援助および/または予防に用いることができる。本発明によるワクチンは、予防的処置のためおよび/または治療的処置のために用いることができ、それゆえに、疾患の感染および/またはその臨床症状の確立および/または進行を妨げることができる。
組換えHVT/ILTV/IBDVウイルスベクターの構築
伝染性喉頭気管炎ウイルスおよび伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス両方のタンパク質抗原をコードして発現する組換え多価非病原性マレック病ウイルスコンストラクトを調製した。本発明は、2つの組換えHVTワクチン、例えばInnovax(登録商標)−ILT(Merck Animal Healthにより販売)およびVaxxitek(登録商標)(Merialにより販売)が同じ動物に与えられたときに遭遇するワクチン干渉の問題を克服する。
組換えHVT/ILTV/IBDVウイルスベクターの構築
この方法によってヘルペスウイルスを作成することができることは、以前に仮性狂犬病ウイルスについて実証されている[van Zijl et al.,J.Virology 62:2191−2195(1988)]。その後に続いて、この手法を使って組換えHVTベクターが構築され[U.S.5,853,733を参照されたい。この文献は、組換えHVTベクターの構築に関して開示された方法論について、参照により本明細書中に組み込まれる]、これを用いて本発明の組換えHVT/ILTV/IBDVベクターが構築された。この方法において、HVTの全ゲノムは、標準的な組換えDNA技術を利用して構築されたいくつかの大きなオーバーラップするサブゲノム断片として、細菌ベクター内にクローニングされる[Maniatis et al.,(1982) Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York(1982);およびSambrook et al.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York(1989)]。HVT株FC126コスミドライブラリーは、コスミドベクターpWE15(Stratagene、現在はAgilent Technologies、Santa Clara,Calif.)内にクローニングされた剪断ウイルスDNAに由来するものであった。加えて、いくつかの大きなゲノムDNA断片を酵素BamHIでの制限消化により分離し、pWE15またはプラスミドベクターpSP64(Promega,Madison Wis.)のいずれかの中にクローニングした。U.S.5,853,733中に記載されるように、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)へのこれらの断片のコトランスフェクションは、オーバーラップする断片の領域を横断する相同的組換えにより媒介されるHVTゲノムの再生をもたらす。コトランスフェクションの前に挿入物が1以上のサブゲノム断片の中に入るように直接操作される場合、この手法は挿入物を含有するウイルスを高頻度にもたらす。5個のオーバーラップするサブゲノムクローンがHVT/FC126HVTを作成するために必要であり、全てのHVT/ILTV/IBDV組換えウイルスを作るための基礎として働いた。
HVT/ILT/IBDV 1386−134.1−2のコスミド再建は、本質的にU.S.5,853,733[例えばU.S.5,853,733の図8;本明細書の図1中に少なくとも部分的に再描写]中に記載されるように実施した。FC126 HVTゲノムのUS領域内への組込みを可能にするため、U.S.5,853,733中でコスミドnr.378−50によりカバーされる領域を、ここでは3つのより小さいプラスミド:pSY640および556−60.6、ならびにこれら2つとオーバーラップしていて、US2遺伝子座内にIBDV/ILTV発現カセットを含有する1つのトランスファープラスミド(228509−ILT−435Vec6)から用意した。7個の直線化されたコンストラクトのセット:3個のコスミドおよび4個のプラスミドを全て一緒にCEF内に、標準的なCaCl2トランスフェクションプロトコールを用いてトランスフェクトし、得られたウイルスストックを2回プラーク精製した。
HVT/ILT/IBDV 1386−48.1.1.1のコスミド再建は、本質的にU.S.5,853,733[例えばU.S.5,853,733の図8;本明細書の図1中に少なくとも部分的に再描写]中に記載されるように実施した。FC126 HVTゲノムのUS領域内への組込みを可能にするため、U.S.5,853,733中でコスミドnr.378−50によりカバーされる領域を、ここでは3つのより小さいプラスミド:pSY640および556−60.6、ならびにこれら2つとオーバーラップしていて、US2遺伝子座内にIBDV/ILTV発現カセットを含有する1つのトランスファープラスミド(1333−85.B6)から用意した。7個の直線化されたコンストラクトのセット:3個のコスミドおよび4個のプラスミドを全て一緒にCEF内に、標準的なCaCl2トランスフェクションプロトコールを用いてトランスフェクトし、得られたウイルスストックを2回プラーク精製した。
HVT/ILT/IBDV 1386−48.3.1.7のコスミド再建は、本質的にU.S.Pat.No.5,853,733[例えばU.S.5,853,733の図8;本明細書の図1中に少なくとも部分的に再描写]中に記載されるように実施した。FC126 HVTゲノムのUS領域内への組込みを可能にするため、U.S.5,853,733中でコスミドnr.378−50によりカバーされる領域を、ここでは3つのより小さいプラスミド:pSY640および556−60.6、ならびにこれら2つとオーバーラップしていて、US2遺伝子座内にIBDV/ILTV発現カセットを含有する1つのトランスファープラスミド(1386−04.4#1)から用意した。7個の直線化されたコンストラクトのセット:3個のコスミドおよび4個のプラスミドを全て一緒にCEF内に、標準的なCaCl2トランスフェクションプロトコールを用いてトランスフェクトし、得られたウイルスストックを2回プラーク精製した。
HVT/ILT/IBDV 484のコスミド再建は、本質的にU.S.5,853,733[例えばU.S.5,853,733の図8;本明細書の図1中に少なくとも部分的に再描写]中に記載されるように実施した。FC126 HVTゲノムのUL54.5領域内への組込みを可能にするため、U.S.5,853,733中でコスミドnr.407−32.1C1によりカバーされる領域を、ここでは3つのより小さいプラスミド:672−01.A40および672−07.C40、ならびにこれら2つとオーバーラップしていて、UL54.5遺伝子座内にIBDV/ILTV発現カセットを含有する1つのトランスファープラスミド(484−1050−2641−10859)から用意した。7個の直線化されたコンストラクトのセット:4個のコスミドおよび3個のプラスミドを全て一緒にCEF内に、標準的なCaCl2トランスフェクションプロトコールを用いてトランスフェクトし、得られたウイルスストックを2回プラーク精製した。
サブゲノムクローン407−32.2C3
コスミド407−32.2C3は、およそ40,170塩基対のゲノムHVT DNA領域[左側の末端−位置39,754;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。この領域は、HVT BamHI断片F’、L、P、N1、E、D、および断片Bのうちの2,092塩基対を包含する。
プラスミド172−07.BA2は、25,931塩基対のゲノムHVT DNA領域を含有する。これは、HVT BamHI B断片[位置37,663から63,593;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]をプラスミドpSP64(Promega,Madison Wis.)内にクローニングすることにより構築した。
コスミド407−32.5G6は、39,404塩基対のゲノムHVT DNA領域[位置61,852〜101,255;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。この領域は、HVT BamHI断片H、C、Q、K1、M、K2、これにプラスして断片Bのうちの1,742塩基対および断片Jのうちの3,880塩基対を包含する。
コスミド407−31.1C1は、37,444塩基対のゲノムHVT DNA領域[位置96,095〜133,538;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。この領域は、HVT BamHI断片J、G、I、F、O、これにプラスして断片K2のうちの1,281塩基対および断片Aのうちの6,691塩基対を包含する。
コスミド378−50は、28,897塩基対のゲノムHVT DNA領域[U.S.5,853,733の図8を参照されたい;本明細書の図1中に少なくとも部分的に再描写]を含有する。この領域は、HVT BamHI断片Aを包含する。これは、HVT BamHI A断片[位置126,848〜155,744;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]をコスミドpWE15内にクローニングすることにより構築した。
サブゲノムクローン228059−ILT−435Vec6
挿入プラスミド228059−ILT−435Vec6は、プラスミドpSP64(Promega,Madison,WI.)内にクローニングされた7311塩基対のHVTユニークショート領域EcoRI断片[位置126880−144190;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。HVT US2遺伝子内の固有のStuI部位[位置140540/140541;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866、アミノ酸残基124と125の間]に挿入されるのは、2つのエレメント:mCMV IEプロモーター、IBDVの古典型F52/70、Faragher株のウイルスタンパク質2遺伝子(VP2)およびSV40ポリアデニル化シグナルからなる発現カセット、その後に糖タンパク質D(gD)および糖タンパク質I(gI)の完全長遺伝子、これにプラスして糖タンパク質Eからの部分的コーディング領域(アミノ酸1〜101)およびORF5(アミノ酸734〜985)をコードするILTVのNVSL Challenge株Lot #83−2からの3563塩基対のSalI−HindIII断片[位置10532〜14094;Wild et al.,Virus Genes 12:104−116(1996):Acc.#U28832]である。IBDV VP2、ILTV gDおよびILTV gI遺伝子は、HVT US2遺伝子に対して逆向きに転写される。
プラスミドpSY640は、BamHI 断片Aに由来するおよそ13,600塩基対のゲノムHVT DNA領域(位置126848〜140540;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。このプラスミドを作成するため、US2遺伝子の上流に位置し、US2遺伝子内に位置するStuI部位から始まってBamHI A断片の末端まで続くDNA領域を、プラスミドpSP64(Promega,Madison WI.)内にクローニングした。
プラスミド556−60.6は、BamHI 断片Aに由来するおよそ12,500塩基対のゲノムHVT DNA領域(おおよその位置143300〜155744;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。このプラスミドを作成するため、US2遺伝子の下流に位置するDNA領域(US2遺伝子内に位置するStuI部位から始まってBamHI A断片の末端まで続く)をpSP64(Promega,Madison WI.)内にクローニングし、次いでエンドヌクレアーゼで処理することでStuI部位から約150bpを「チューバック(chew back)」し、pBR322プラスミドベクター内に再クローニングした。
サブゲノムクローン1333−85.B6
挿入プラスミド1333−85.B6は、プラスミドpSP64(Promega,Madison,WI.)内にクローニングされた7311塩基対のHVTユニークショート領域EcoRI断片[位置126880〜144190;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。HVT US2遺伝子内の固有のStuI部位[位置140540/140541;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866、アミノ酸残基124と125の間]に挿入されるのは、2つのエレメント:糖タンパク質D(gD)および糖タンパク質I(gI)の完全長遺伝子、これにプラスして糖タンパク質Eからの部分的コーディング領域(アミノ酸1〜101)およびORF5(アミノ酸734〜985)をコードするILTVのNVSL Challenge株Lot #83−2からの3563塩基対のSalI−HindIII断片[位置10532〜14094;Wild et al.,Virus Genes 12:104−116(1996);Acc.#U28832]、ならびにニワトリβ−アクチンプロモーター、IBDVの古典型F52/70、Faragher株のウイルスタンパク質2遺伝子(VP2)およびネコヘルペスウイルス(FHV)糖タンパク質B遺伝子からのポリアデニル化シグナルからなる発現カセットである。ILTV gD、ILTV gIおよびIBDV VP2遺伝子は、HVT US2遺伝子に対して逆向きに転写される。
プラスミドpSY640は、BamHI 断片Aに由来するおよそ13,600塩基対のゲノムHVT DNA領域(位置126848〜140540;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。このプラスミドを作成するため、US2遺伝子の上流に位置し、US2遺伝子内に位置するStuI部位から始まってBamHI A断片の末端まで続くDNA領域を、プラスミドpSP64(Promega,Madison WI.)内にクローニングした。
プラスミド556−60.6は、BamHI 断片Aに由来するおよそ12,500塩基対のゲノムHVT DNA領域(おおよその位置143300〜155744;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。このプラスミドを作成するため、US2遺伝子の下流に位置するDNA領域(US2遺伝子内に位置するStuI部位から始まってBamHI A断片の末端まで続く)をpSP64(Promega,Madison WI.)内にクローニングし、次いでエンドヌクレアーゼで処理することでStuI部位から約150bpを「チューバック(chew back)」し、pBR322プラスミドベクター内に再クローニングした。
サブゲノムクローン1386−04.4#1
挿入プラスミド1386−04.4#1は、プラスミドpSP64(Promega,Madison,WI.)内にクローニングされた7311塩基対のHVTユニークショート領域EcoRI断片[位置126880〜144190;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。HVT US2遺伝子内の固有のStuI部位[位置140540/140541;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866、アミノ酸残基124と125の間]に挿入されるのは、2つのエレメント:糖タンパク質D(gD)および糖タンパク質I(gI)の完全長遺伝子、これにプラスして糖タンパク質Eからの部分的コーディング領域(アミノ酸1〜101)およびORF5(アミノ酸734〜985)をコードするILTVのNVSL Challenge株Lot #83−2からの3563塩基対のSalI−HindIII断片[位置10532〜14094;Wild et al.,Virus Genes 12:104−116(1996);Acc.#U28832]、ならびに、hCMV IEプロモーター、IBDVの古典型F52/70、Faragher株のウイルスタンパク質2遺伝子(VP2)および単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ遺伝子からのポリアデニル化シグナルからなる発現カセットである。ILTV gD、ILTV gIおよびIBDV VP2遺伝子は、HVT US2遺伝子に対して逆向きに転写される。
プラスミドpSY640は、BamHI 断片Aに由来するおよそ13,600塩基対のゲノムHVT DNA領域(位置126848〜140540;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。このプラスミドを作成するため、US2遺伝子の上流に位置し、US2遺伝子内に位置するStuI部位から始まってBamHI A断片の末端まで続くDNA領域を、プラスミドpSP64(Promega,Madison WI.)内にクローニングした。
プラスミド556−60.6は、BamHI 断片Aに由来するおよそ12,500塩基対のゲノムHVT DNA領域(おおよその位置143300〜155744;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。このプラスミドを作成するため、US2遺伝子の下流に位置するDNA領域(US2遺伝子内に位置するStuI部位から始まってBamHI A断片の末端まで続く)をpSP64(Promega,Madison WI.)内にクローニングし、次いでエンドヌクレアーゼで処理することでStuI部位から約150bpを「チューバック(chew back)」し、pBR322プラスミドベクター内に再クローニングした。
サブゲノムクローン484−1050−2641−10859
挿入プラスミド484−1050−2641−10859は、プラスミドpNEB193の誘導体(AatII−PvuIIを欠失)内にクローニングされた8636塩基対のゲノムHVTユニークロング領域[位置109489〜118124;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。これはAscI部位に隣接しており、HVT BamHI断片I、S、これにプラスして断片Gのうちの1337塩基対および断片Fのうちの1177塩基対を包含する。HVT UL54.5オープンリーディングフレーム内のXhoI部位[位置111240/111241;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866、アミノ酸残基21と22の間]に挿入されるのは、2つのエレメント:mCMV IEプロモーター、IBDVの古典型F52/70、Faragher株のウイルスタンパク質2遺伝子(VP2)およびSV40ポリアデニル化シグナルからなる発現カセット、その後に糖タンパク質D(gD)および糖タンパク質I(gI)の完全長遺伝子、これにプラスして糖タンパク質Eからの部分的コーディング領域(アミノ酸1〜101)およびORF5(アミノ酸734〜985)をコードするILTVのNVSL Challenge株Lot #83−2からの3563塩基対のSalI−HindIII断片[位置10532〜14094;Wild et al.,Virus Genes 12:104−116(1996):Acc.#U28832]である。IBDV VP2、ILTV gDおよびILTV gI遺伝子は、HVT UL54.5遺伝子に対して逆向きに転写される。
プラスミド672−01.A40は、プラスミドpNEB193の誘導体内にクローニングされた、ユニークロング領域由来の14,731塩基対のゲノムHVT DNA領域[位置96095〜110825;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。この領域は、HVT BamHI断片G、J、およびK2のうちの1281塩基対を包含する。
プラスミド672−07.C40は、プラスミドpNEB193の誘導体内にクローニングされた、ユニークロング領域由来の12,520塩基対のゲノムHVT DNA領域[位置116948〜129467;上のAfonso et al.,2001;Acc.#AF291866]を含有する。この領域は、HVT BamHI断片F、O、およびAのうちの2620塩基対を包含する。
2代目のCEFを6ウェル培養プレート上に播種し、38℃、5% CO2で24時間インキュベートし、コンフルエントな単層を形成させる。各ウェルについて総量0.5μg DNAのコスミドおよびプラスミドをHepesバッファー中で混合し、沈殿が今にも生じそうになるまで125mM CaCl2を滴下して加えた。この混合物をCEF細胞単層に加え、2から3時間インキュベートした。上清を除去し、15%グリセロールの上層を加え、細胞上で1分間維持した。次いでこれを除去し、PBSで洗浄し、新鮮な培地を加え、細胞を5日間インキュベートした。次に細胞をトリプシン処理により回収し、個々のプレートからの細胞を10cmプレート内のCEF細胞の新鮮な単層上に各々播種し、50〜90% CPEを達成するまでインキュベートした。次に増幅されたトランスフェクト細胞をトリプシン処理により回収し、10−2から10−4の希釈物を、CEF単層を有する10cmプレート上に播いてインキュベートした。翌日、プレートを寒天で覆い、HVT/ILTV/IBDVの多数の個々のプラークを分離してCEF上で増幅した。10cmプレート上のコンフルエントなCEF単層に10−2から10−4に希釈した1回目の精製ストックを感染させて細胞をインキュベートすることによって、各ウイルスストックの2回目のプラーク精製を行った。翌日、プレートを寒天で覆い、HVT/ILTV/IBDVの多数の個々のプラークを分離してCEF上で増幅した。
組換えHVT/ILTV/IBDVウイルスストックは、組織培養における連続継代の後、ILTおよびIBDVタンパク質の発現について表現型的に安定である
3つのコンストラクト、HVT/IBDV/ILT 1386−134.1−2を含む1つ目のもの、HVT/ILT/IBDV 1386−48.1.1.1を含む第二のもの、およびHVT/ILT/IBDV 1386−48.3.1.7を含む第三のものを2代目のCEF細胞上で14回より多く連続継代し、挿入されたILTVおよびIBDV遺伝子の発現を免疫蛍光アッセイにおいて評価した。HVT/ILT/IBDV 484.1−1A3A3と称する第四のコンストラクトを2代目のCEF細胞上で15回より多く連続継代し、挿入されたILTVおよびIBDV遺伝子の発現を免疫蛍光アッセイにおいて評価した[下の表1および2を参照されたい]。
各組織培養継代のため、10cmディッシュ上に播種されたコンフルエントな2代目のCEF単層に50〜100μLのウイルスストックを接種し、次いで38℃、5% CO2で2〜5日間、CPEが明らかになるまでインキュベートした。次に細胞をトリプシン処理により回収し、継代数1(P1)とした。このプロセスを繰り返してさらなる継代ストック(P2〜P15)を調製した。
6ウェルプレートに2代目のCEF単層をまいた。この細胞に様々な継代レベル:P0〜P15で回収したウイルスストックを、または希釈剤のみを接種した。カウント可能な数のプラーク/ウェルを達成するためにプレートに複数の希釈で接種し、38℃、5% CO2でインキュベートした。5日間のインキュベーション後、上清をデカントし、CEF単層を100%メタノールで10〜15分間、15〜30℃で固定した。メタノールをデカントし、細胞を風乾させた後、ILTV gD(MAB #6)、ILTV gI(ポリクローナルウサギ抗gI)およびIBDV VP2(MCA GDV−R63)一次抗体で染色した。2時間のブロッキングステップの後、(PBS中5%の無脂肪乾燥乳)、2mL/ウェルをディッシュに加え、振動プラットフォーム上で15〜30℃でインキュベートし、一次抗体を適宜希釈し、2mL/ウェルで加え、次いで15〜30℃で3時間、振動プラットフォーム上でインキュベートした。抗体インキュベーション後、プレートをPBSで3回洗浄した。FITC標識した二次抗体溶液(ウサギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ)を1:100に調製し、各ウェルに2mLを加えた。プレートを1時間、15〜30℃で、振動プラットフォーム上でインキュベートした。インキュベーション後、プレートをPBSで3回洗浄し、蛍光視野下で調べた。ILT抗体で染色されたプラークを蛍光陽性(+)または陰性(−)について観察した。IBDV VP2タンパク質に対する一次抗体で染色された蛍光プラークをカウントした。プレートを次いで光学顕微鏡下で調べ、プラークを再度カウントした。各継代レベルにおける蛍光プラークのパーセンテージは下の表1および2中に提供され、並びに、IBDV VP2タンパク質発現およびベクター安定性の定性的な決定も提供する。
組換えHVT/ILTV/IBDVウイルスストックは、トリへのワクチン接種およびトリからの回収の後、ILTおよびIBDVタンパク質の発現について表現型的に安定である
3つのコンストラクト、HVT/IBDV/ILT 1386−134.1−2を含む1つ目のもの、HVT/ILT/IBDV 1386−48.3.1.7を含む別のもの、およびHVT/ILT/IBDV 484.1−1A3A3を含む第三のものを用いて、3群の15日齢のニワトリに皮下(subcutantious)経路により接種した。第4の群のトリに希釈剤のみをワクチン接種して、陰性対照群として機能させた。脾臓試料を接種7日後に採取し、ニワトリ胚線維芽細胞上でのウイルス分離のために処理した。接種細胞を2回継代して存在する何らかのウイルスを増やした。細胞変性効果がはっきりと視認できたとき、単層を回収してストックを凍結した。これらのストックを用いて2代目のCEFに接種し、プラークをILTV gD、ILTV gIおよびIBDV VP2タンパク質の発現について、各タンパク質に特異的な抗体を使用した免疫蛍光アッセイ(IFA)により分析した。
6ウェルプレートに2代目のCEF単層をまいた。この細胞に、回収したウイルス分離ストックまたは希釈剤のみを接種した。カウント可能な数のプラーク/ウェルを達成するためにプレートに複数の希釈で接種し、38℃、5% CO2でインキュベートした。5日間のインキュベーション後、上清をデカントし、CEF単層を100%メタノールで10〜15分間、15〜30℃で固定した。メタノールをデカントし、細胞を風乾させた後、ILTV gD(MAB #6)、ILTV gI(ポリクローナルウサギ抗gI)およびIBDV VP2(MCA GDV−R63)一次抗体で染色した。2時間のブロッキングステップの後、(PBS中5%の無脂肪乾燥乳)、2mL/ウェルをディッシュに加え、振動プラットフォーム上で15〜30℃でインキュベートし、一次抗体を適宜希釈し、2mL/ウェルで加え、次いで15〜30℃で3時間、振動プラットフォーム上でインキュベートした。抗体インキュベーション後、プレートをPBSで3回洗浄した。FITC標識した二次抗体溶液(ウサギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ)を1:100に調製し、各ウェルに2mLを加えた。プレートを、1時間15〜30℃で、振動プラットフォーム上でインキュベートした。インキュベーション後、プレートをPBSで3回洗浄し、蛍光視野下で調べた。ILTV抗体で染色されたプラークを蛍光陽性(+)または陰性(−)について観察した。IBDV VP2タンパク質に対する一次抗体で染色された蛍光プラークをカウントした。プレートを次いで光学顕微鏡下で調べ、プラークを再度カウントした。各継代レベルにおける蛍光プラークのパーセンテージは下の表3A中に提供される。この試験を、ウイルスが接種2週後に回収された場合を除いて本質的に繰り返した(下の表3Bを参照されたい)。
不成功のコンストラクト
組換えベクターワクチンウイルスは、定義によると外来遺伝子を保有して発現するように操作される。これらの外来(foregin)遺伝子の転写および発現が親ウイルスと比べて増殖の不都合を組換えウイルスに提供するならば、これらの遺伝子がワクチン生産の際に失われることがあり得る。この理由のため、ワクチン候補は、遺伝的および表現型的の両方の安定性について試験されなければならない。
1 表4B中のデータは、U.S.8,932,604 B2の審査の際に本出願の共同発明者の1名により署名された宣誓書において米国特許庁に提出された。
配列
以下の配列が例示的なrHVTコンストラクトにおいて用いられている。下に提供されるコード配列は個々の終止コドンを包含し、これは、コーディング配列がコードしているタンパク質抗原の特性を改変することなく代わりの終止コドンで容易に置き換えることができる。
atggaccgccatttatttttgaggaatgctttttggactatcgtactgctttcttccttcgctagccagagcaccgccgccgtcacgtacgactacattttaggccgtcgcgcgctcgacgcgctaaccataccggcggttggcccgtataacagatacctcactagggtatcaagaggctgcgacgttgtcgagctcaacccgatttctaacgtggacgacatgatatcggcggccaaagaaaaagagaaggggggccctttcgaggcctccgtcgtctggttctacgtgattaagggcgacgacggcgaggacaagtactgtccaatctatagaaaagagtacagggaatgtggcgacgtacaactgctatctgaatgcgccgttcaatctgcacagatgtgggcagtggactatgttcctagcacccttgtatcgcgaaatggcgcgggactgactatattctcccccactgctgcgctctctggccaatacttgctgaccctgaaaatcgggagatttgcgcaaacagctctcgtaactctagaagttaacgatcgctgtttaaagatcgggtcgcagcttaactttttaccgtcgaaatgctggacaacagaacagtatcagactggatttcaaggcgaacacctttatccgatcgcagacaccaatacacgacacgcggacgacgtatatcggggatacgaagatattctgcagcgctggaataatttgctgaggaaaaagaatcctagcgcgccagaccctcgtccagatagcgtcccgcaagaaattcccgctgtaaccaagaaagcggaagggcgcaccccggacgcagaaagcagcgaaaagaaggcccctccagaagactcggaggacgacatgcaggcagaggcttctggagaaaatcctgccgccctccccgaagacgacgaagtccccgaggacaccgagcacgatgatccaaactcggatcctgactattacaatgacatgcccgccgtgatcccggtggaggagactactaaaagttctaatgccgtctccatgcccatattcgcggcgttcgtagcctgcgcggtcgcgctcgtggggctactggtttggagcatcgtaaaatgcgcgcgtagctaa
配列番号2:ILTV gD糖タンパク質(377アミノ酸)
MDRHLFLRNAFWTIVLLSSFASQSTAAVTYDYILGRRALDALTIPAVGPYNRYLTRVSRGCDVVELNPISNVDDMISAAKEKEKGGPFEASVVWFYVIKGDDGEDKYCPIYRKEYRECGDVQLLSECAVQSAQMWAVDYVPSTLVSRNGAGLTIFSPTAALSGQYLLTLKIGRFAQTALVTLEVNDRCLKIGSQLNFLPSKCWTTEQYQTGFQGEHLYPIADTNTRHADDVYRGYEDILQRWNNLLRKKNPSAPDPRPDSVPQEIPAVTKKAEGRTPDAESSEKKAPPEDSEDDMQAEASGENPAALPEDDEVPEDTEHDDPNSDPDYYNDMPAVIPVEETTKSSNAVSMPIFAAFVACAVALVGLLVWSIVKCARS
配列番号3:ILTV gI糖タンパク質(1089bp)
Atggcatcgctacttggaactctggctctccttgccgcgacgctcgcacccttcggcgcgatgggaatcgtgatcactggaaatcacgtctccgccaggattgacgacgatcacatcgtgatcgtcgcgcctcgccccgaagctacaattcaactgcagctatttttcatgcctggccagagaccccacaaaccctactcaggaaccgtccgcgtcgcgtttcggtctgatataacaaaccagtgctaccaggaacttagcgaggagcgctttgaaaattgcactcatcgatcgtcttctgtttttgtcggctgtaaagtgaccgagtacacgttctccgcctcgaacagactaaccggacctccacacccgtttaagctcactatacgaaatcctcgtccgaacgacagcgggatgttctacgtaattgttcggctagacgacaccaaagaacccattgacgtcttcgcgatccaactatcggtgtatcaattcgcgaacaccgccgcgactcgcggactctattccaaggcttcgtgtcgcaccttcggattacctaccgtccaacttgaggcctatctcaggaccgaggaaagttggcgcaactggcaagcgtacgttgccacggaggccacgacgaccagcgccgaggcgacaaccccgacgcccgtcactgcaaccagcgcctccgaacttgaagcggaacactttacctttccctggctagaaaatggcgtggatcattacgaaccgacacccgcaaacgaaaattcaaacgttactgtccgtctcgggacaatgagccctacgctaattggggtaaccgtggctgccgtcgtgagcgcaacgatcggcctcgtcattgtaatttccatcgtcaccagaaacatgtgcaccccgcaccgaaaattagacacggtctcgcaagacgacgaagaacgttcccaaactagaagggaatcgcgaaaatttggacccatggttgcgtgcgaaataaacaagggggctgaccaggatagtgaacttgtggaactggttgcgattgttaacccgtctgcgctaagctcgcccgactcaataaaaatgtga
配列番号4:ILTV gI糖タンパク質(362アミノ酸)
MASLLGTLALLAATLAPFGAMGIVITGNHVSARIDDDHIVIVAPRPEATIQLQLFFMPGQRPHKPYSGTVRVAFRSDITNQCYQELSEERFENCTHRSSSVFVGCKVTEYTFSASNRLTGPPHPFKLTIRNPRPNDSGMFYVIVRLDDTKEPIDVFAIQLSVYQFANTAATRGLYSKASCRTFGLPTVQLEAYLRTEESWRNWQAYVATEATTTSAEATTPTPVTATSASELEAEHFTFPWLENGVDHYEPTPANENSNVTVRLGTMSPTLIGVTVAAVVSATIGLVIVISIVTRNMCTPHRKLDTVSQDDEERSQTRRESRKFGPMVACEINKGADQDSELVELVAIVNPSALSSPDSIKM
配列番号5:IBDV VP2(1362bp)
atgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatgccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgtctttttccctggattccctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactacaagttcgatcagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagctacaactactgcagactagtgagtcggagtctcacagtgaggtcaagcacactccctggtggcgtttatgcactaaacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactgacagatgttagctacaatgggttgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattgggaatgtcctggtaggggaaggggtcactgtcctcagcctacccacatcatatgatcttgggtatgtgaggcttggtgaccccattcccgctatagggcttgacccaaaaatggtagctacatgcgacagcagtgacaggcccagagtctacaccataactgcagccgatgattaccaattctcatcacagtaccaaccaggtggggtaacaatcacactgttctcagccaacattgatgctatcacaagcctcagcattgggggagagctcgtgtttcaaacaagcgtccaaggccttgtactgggcgccaccatctaccttataggctttgatgggactgcggtaatcaccagagctgtggccgcagataatgggctgacggccggcaccgacaatcttatgccattcaatcttgtcattccaaccaatgagataacccagccaatcacatccatcaaactggagatagtgacctccaaaagtggtggtcaggcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatccatggtggcaactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacaggatccgtcgttacggtcgctggggtgagtaacttcgagctgattccaaatcctgaactagcaaagaacctggttacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaactacacaaaattgatactgagtgagagggaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacactgattttcgtgagtacttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggcttcaaagacataatccgggctataaggaggtaa
配列番号6:IBDV VP2(453アミノ酸)
MTNLQDQTQQIVPFIRSLLMPTTGPASIPDDTLEKHTLRSETSTYNLTVGDTGSGLIVFFPGFPGSIVGAHYTLQSNGNYKFDQMLLTAQNLPASYNYCRLVSRSLTVRSSTLPGGVYALNGTINAVTFQGSLSELTDVSYNGLMSATANINDKIGNVLVGEGVTVLSLPTSYDLGYVRLGDPIPAIGLDPKMVATCDSSDRPRVYTITAADDYQFSSQYQPGGVTITLFSANIDAITSLSIGGELVFQTSVQGLVLGATIYLIGFDGTAVITRAVAADNGLTAGTDNLMPFNLVIPTNEITQPITSIKLEIVTSKSGGQAGDQMSWSASGSLAVTIHGGNYPGALRPVTLVAYERVATGSVVTVAGVSNFELIPNPELAKNLVTEYGRFDPGAMNYTKLILSERDRLGIKTVWPTREYTDFREYFMEVADLNSPLKIAGAFGFKDIIRAIRR
配列番号7:ILTV gDプロモーター(527bp)
aaacagctgtactacagagtaaccgatggaagaacatcggtccagctaatgtgcctgtcgtgcacgagccattctccggaaccttactgtcttttcgacacgtctcttatagcgagggaaaaagatatcgcgccagagttatactttacctctgatccgcaaacggcatactgcacaataactctgccgtccggcgttgttccgagattcgaatggagccttaataatgtttcactgccggaatatttgacggccacgaccgttgtttcgcataccgctggccaaagtacagtgtggaagagcagcgcgagagcaggcgaggcgtggatttctggccggggaggcaatatatacgaatgcaccgtcctcatctcagacggcactcgcgttactacgcgaaaggagaggtgcttaacaaacacatggattgcggtggaaaacggtgctgctcaggcgcagctgtattcactcttttctggacttgtgtcaggattatgcgggagcatatctgctttgtacgcaacgct
配列番号8:ILTV gIプロモーター(264bp)
tgactattacaatgacatgcccgccgtgatcccggtggaggagactactaaaagttctaatgccgtctccatgcccatattcgcggcgttcgtagcctgcgcggtcgcgctcgtggggctactggtttggagcatcgtaaaatgcgcgcgtagctaatcgagcctagaataggtggtttcttcctacatgccacgcctcacgctcataatataaatcacatggaatagcataccaatgcctattcattgggacgttcgaaaagc
配列番号9:ILTVインサート(3563bp)
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配列番号10:mCMV IEプロモーター(1391bp)
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配列番号11:ニワトリβ−アクチンプロモーター(692bp)
(注:「nnn」は高度にGCリッチな領域における不明瞭な配列を表す。3〜5個の「g」であり得る)
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配列番号12:AD169株からのhCMV IEプロモーター(301bp)
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配列番号13:FHV US−9ポリアデニル化シグナル(55bp)
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配列番号14:HSV TKポリアデニル化シグナル(370bp)
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配列番号15:228509−ILT−435Vec6(mCMV IEpro−VP2−SV40pA/ILT/HVT)(14113bp)
(HVT EcoRI#7断片中のIBDV+ILT遺伝子カセット。ウイルスno.HVT/IBDV/ILT 1386−134)
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配列番号16:1333−85.B6(ILT/ニワトリβ−アクチン pro−VP2−FHV US9pA/HVT)(13064bp)
(HVT EcoRI#7断片中のILT+IBDV遺伝子カセット)
ウイルスno.HVT/ILT/IBDV 1386−48.1.1.1
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配列番号17:1386−04.4#1(ILT/hCMV IEpro−VP2−HSV TKpA/HVT)(13017bp)
(HVT EcoRI#7断片中のILT+IBDV遺伝子カセット。
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配列番号18:484−1050−2641−10859(mCMV IEpro−VP2−SV40pA/ILT/HVT)(15252bp)
(HVT AscI断片中のIBDV+ILT遺伝子カセット) ウイルスno.HVT/IBDV/ILT 484
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配列番号19:SV40ポリアデニル化シグナル(199bp)
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Claims (17)
- 組換え非病原性マレック病ウイルス(rMDVnp)であって、rMDVnpゲノム内の第一の非必須部位の中に位置する第一の異種核酸およびrMDVnpゲノム内の第二の非必須部位の中に位置する第二の異種核酸を含み;
第一の異種核酸は、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質D(ILTV gD)をコードするヌクレオチド配列および伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質I(ILTV gI)をコードするヌクレオチド配列の両方を含み;
第二の異種核酸は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質2(IBDV VP2)をコードするヌクレオチド配列を含み;
第一の非必須部位および第二の非必須部位は、同じであるかまたは異なるかのいずれかであり;そして、第一の非必須部位および第二の非必須部位が異なるときは、一方はUS2部位であり他方はUL54.5部位である、前記組換え非病原性マレック病ウイルス。 - 第一の非必須部位および第二の非必須部位がUS2部位である、請求項1のrMDVnp。
- ILTV gDタンパク質をコードするヌクレオチド配列が作動的に第一のプロモーターの制御下にあり、ILTV gIタンパク質をコードするヌクレオチド配列が作動的に第二のプロモーターの制御下にあり、そして、IBDV VP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列が作動的に第三のプロモーターの制御下にある、請求項1または2のrMDVnp。
- 第一のプロモーター、第二のプロモーターおよび第三のプロモーターが全て異なるものである、請求項3のrMDVnp。
- 第一のプロモーターが内在性ILTV gDプロモーターであり、第二のプロモーターが内在性ILTV gIプロモーターであり、そして、第三のプロモーターが、マウスサイトメガロウイルス最初期1遺伝子(mCMV−IE1)プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期1遺伝子(hCMV−IE1)プロモーターおよびニワトリβ−アクチンプロモーターよりなる群から選択される、請求項4のrMDVnp。
- rMDVnpが組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(rHVT)である、請求項1〜5のいずれかのrMDVnp。
- rMDVnpが組換えマレック病ウイルス血清型2型(rMDV2)である、請求項1、2、3、4または5のrMDVnp。
- 5’から3’方向に次の順番で、
(i)マウスサイトメガロウイルス最初期(mCMV IE)プロモーター;
(ii)伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質2(IBDV VP2)のコーディング配列;
(iii)転写終結配列;
(iv)伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質D(ILTV gD)プロモーター;
(v)ILTV gDタンパク質のコーディング配列;
(vi)伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質I(ILTV gI)プロモーター;および
(vii)ILTV gIタンパク質のコーディング配列、を含む、組換え核酸。 - 配列番号:15のヌクレオチド配列を含む、請求項8の組換え核酸。
- 非必須部位内に挿入された請求項8または9の組換え核酸を含む、組換え非病原性マレック病ウイルス(rMDVnp)。
- 非必須の挿入部位がUS2およびUL54.5よりなる群から選択される、請求項10のrMDVnp。
- 組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(rHVT)である、請求項10または11のrMDVnp。
- 請求項1、2、3、4、5、6、7、10、11または12のrMDVnpを含む、免疫原性組成物。
- rMDVnpが組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(rHVT)である、請求項13の免疫原性組成物。
- rMDVnpが組換えマレック病ウイルス血清型2型(rMDV2)である、請求項13の免疫原性組成物。
- 請求項13、14または15の免疫原性組成物を含む、ワクチン。
- 請求項16のワクチンを投与することを含む、ILTVおよびIBDVに対するニワトリの防御を援助する方法。
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