CN106011114B - 一种提高普鲁兰酶稳定性的发酵液处理方法 - Google Patents

一种提高普鲁兰酶稳定性的发酵液处理方法 Download PDF

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Abstract

一种提高普鲁兰酶稳定性的发酵液处理方法，属于酶工程和发酵工程技术领域。本发明采用一种10×发酵液处理溶液处理来源于重组菌解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980‑BdP的普鲁兰酶发酵液，经过处理的发酵液中普鲁兰酶酶活稳定性明显高于未经处理的发酵液。本发明所述方法在以重组菌解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980‑BdP为菌种发酵制备普鲁兰酶工艺的后提取阶段可以减少酶活损失。

Description

一种提高普鲁兰酶稳定性的发酵液处理方法
技术领域
本发明涉及一种提高普鲁兰酶稳定性的发酵液处理方法，属于酶工程和发酵工程技术领域。
背景技术
普鲁兰酶(Pullulanase，EC3.2.1.41)是一种水解支链淀粉α-1,6糖苷键的水解酶，在以淀粉为原料制取葡萄糖的工艺中可以提高葡萄糖得率。本课题组在前期工作中，以解淀粉芽孢杆菌为宿主菌构建了一株表达重组普鲁兰酶的重组菌：解淀粉芽孢杆菌/pUC980-BdP [孙娟娟 沈微 石贵阳 王正祥. 普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达. 工业微生物, 2011, 41(6): 18-22]。该重组菌具有较好的产普鲁兰酶的能力。
在工业酶制剂的发酵制备中，在发酵结束后，发酵液一般要经过固液分离、浓缩、添加酶稳定剂等过程方能获得性能比较稳定的成品酶。工业上酶的浓缩过程一般采用超滤法，很多情况下由于超滤设备价格较高，所以一次发酵得到的发酵液往往要经过比较长的时间才能全部完成超滤浓缩过程。在这一段时间内，由于一些尚不完全清楚的原因，有些酶液如果不进行冷藏处理，则容易发生酶的失活从而导致经济损失。
用重组菌解淀粉芽孢杆菌/pUC980-BdP制备的普鲁兰酶，在发酵结束、固液分离操作完成之后，若不能很快完成酶的浓缩并添加护酶剂则普鲁兰酶的酶活会有相当大的部分失活，因此这一阶段需要进行冷藏处理。不进行冷藏，则经过固液分离后的清液中的普鲁兰酶在常温下放置24h后，会有30%以上的酶活力损失。
发明内容
本发明的目的是减少发酵后普鲁兰酶逐步失活的问题，提供一种提高普鲁兰酶稳定性的发酵液处理方法，普鲁兰酶发酵上清液经过这种发酵液处理溶液在一定条件下的处理后，其酶活稳定性明显提高。
本发明的技术方案，一种提高普鲁兰酶稳定性的发酵液处理方法，采用10×发酵液处理溶液与9倍体积的普鲁兰酶发酵液的上清液混合，将混合液在60℃保温30min，即得到处理后的发酵液。
所述10×发酵液处理溶液具体为含200mM柠檬酸-柠檬酸钠、100mM EDTA-Na2、50mmol/L KCl，pH3.4-3.6的溶液。
所述的普鲁兰酶发酵液具体为采用重组解淀粉芽孢杆菌 BF7658/pUC980-BdP进行发酵获得的发酵液，再经过固液分离后得到的上清液。
（1）普鲁兰酶发酵及发酵液上清液的制备方法：将-70℃甘油管保藏的重组解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980-BdP在含20mg/L卡那霉素的LB平板上划线，挑取单菌落。接种于含20mg/L卡那霉素的LB液体培养基。在500mL三角瓶中装液量为100mL，一般同时做3瓶。34℃、200r/min摇瓶发酵24h，按10%接种量接种于预先装有已经灭菌的2.7L发酵液的5L发酵罐中。发酵过程用氨水控制pH在6.8-7.5。发酵结束后取发酵液于离心管中，12000rpm离心10min，上清液普鲁兰酶酶活一般在20-30U/mL。
（2）10×发酵液处理溶液配制方法：在1L容量瓶中加入800mL去离子水。加入EDTA-Na2·2H2O 37.2 g，无水柠檬酸30.5g，无水柠檬酸钠10.3g，氯化钾3.7g，pH 3.4-3.6，如果pH偏离则用NaOH或HCl调整pH至3.4-3.6，并加去离子水至1L。
（3）发酵液的处理：10×发酵液处理溶液与9倍体积的普鲁兰酶发酵液的上清液混合。混合液在60℃保温30 min。
（4）发酵液的酶活变化：将经过处理的发酵液在20℃室温放置，每间隔4h，取样检测普鲁兰酶酶活。
普鲁兰酶酶活测定：按文献[Bibel M, Brett C, Gosslar U, et al. Isolationand analysis of amylolytic enzyme of the hyperthermophilic bacteriumThermotoga maritime. FEMS Microbiol Lett, 1998, 158:9-15]方法进行。
LB培养基：在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。
发酵培养基：乳糖50g/L，豆饼粉30g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸铵10g/L，无水氯化钙0.5g/L，加去离子水配制。
本发明的有益效果：本发明实施后，在以重组解淀粉芽孢杆菌 BF7658/pUC980-BdP发酵制备普鲁兰酶的后提取阶段，可以提高普鲁兰酶的稳定性，减少普鲁兰酶酶活损失。
生物材料样品保藏：解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980-BdP，公开于[孙娟娟 沈微石贵阳 王正祥. 普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达. 工业微生物, 2011, 41(6): 18-22]。
附图说明
图1 普鲁兰酶发酵液上清液经不同处理后的酶活稳定性。
A：90 mL上清液与10 mL双蒸水混合后常温放置30 min。
B：90 mL上清液与10 mL双蒸水混合后60℃放置30 min。
C：90 mL上清液与10 mL10×发酵液处理溶液混合后60℃放置30 min。
具体实施方式
通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：普鲁兰酶发酵液不同处理方法对酶活稳定性的影响
取5L发酵罐发酵制取的普鲁兰酶发酵液上清液，三份各90mL，分别标记为A、B和C。其中A和B中加入双蒸水10mL，C中加入10×发酵液处理溶液10mL。混合后A在常温下放置，B和C在60℃保温30min，上述获得的酶液即为经过预处理的普鲁兰酶A、B和C。取出后于20℃水中降温10min，然后将上述三种溶液在室温20℃下检测普鲁兰酶酶活。
加入双蒸水后未经保温的酶液的酶活为100%。在后24h内每隔4h检测一次普鲁兰酶酶活，结果如图1所示。由图1可知，在20℃放置的24h内，未经60℃保温处理的上清液A的酶活下降幅度最大，超过50%；经60℃保温处理的上清液B的酶活下降幅度比A略小，但也接近50%；加入了10×发酵液处理溶液并经过60℃保温30min的C上清液的普鲁兰酶酶活下降幅度相比A、B明显要小，大约是19%，其在最初的12 h内酶活下降幅度小于10%，而A和B在相应的时间内酶活下降幅度均超过30%。
由此可见，解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980-BdP发酵制备的普鲁兰酶发酵液经固液分离后得到的上清液，在用10×发酵液处理溶液处理后，上清液中的普鲁兰酶酶活稳定性明显提高。若酶的浓缩过程时间较长，未经同样处理的发酵液上清液中普鲁兰酶酶活会有较大损失，而经过处理的上清液的酶活损失相对较小。

Claims (1)

1.一种提高普鲁兰酶稳定性的发酵液处理方法，其特征在于：采用10×发酵液处理溶液与9倍体积的普鲁兰酶发酵液的上清液混合，将混合液在60℃保温30min，即得到处理后的发酵液；
所述10×发酵液处理溶液具体为含200mM柠檬酸-柠檬酸钠、100mM EDTA-Na2、50mmol/LKCl，pH3.4-3.6的溶液；
所述的普鲁兰酶发酵液具体为采用重组解淀粉芽孢杆菌 BF7658/pUC980-BdP进行发酵获得的发酵液，再经过固液分离后得到的上清液。
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