JP2023518028A - 改良されたｉ－ｅ型ｃｒｉｓｐｒ系遺伝子サイレンシングのための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
ＣＲＩＳＰＲに基づく干渉は、遺伝回路から動的代謝制御への様々な適用において一般的になっている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、天然ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓｃａｄｅシステムを、ガイドＲＮＡアレイの発現とともにｃａｓ３ヌクレアーゼの欠失によってサイレンシングに利用することができ、単一の転写物から複数の遺伝子をサイレンシングすることができる。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９９０，１７２号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９９０，１７２号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦支援の研究に関する記載
本発明は、海軍研究局によって授与された１２０４３９５６の下およびＤＯＥ ＥＥＲＥによって授与されたＥＥ０００７５６３の下での政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、海軍研究局によって授与された１２０４３９５６の下およびＤＯＥ ＥＥＲＥによって授与されたＥＥ０００７５６３の下での政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表の参照
本出願は、２０２０年３月１０日に作成された４９１８６－４５＿ＳＴ２５．ｔｘｔとしてＡＳＣＩＩ形式で電子出願された配列表を含み、該配列表は、サイズが２８９４３バイトであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月１０日に作成された４９１８６－４５＿ＳＴ２５．ｔｘｔとしてＡＳＣＩＩ形式で電子出願された配列表を含み、該配列表は、サイズが２８９４３バイトであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
遺伝子サイレンシングは強力なツールであり、ＣＲＩＳＰＲ系の方法はこのアプローチの単純性を高めた（Ａｄｌｉ，Ｍ．Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏｏｌ ｋｉｔ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，１９１１（２０１８）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、遺伝子サイレンシングに使用するために、天然の多タンパク質Ｃａｓｃａｄｅ（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ）システムを操作することができ、これは、ヌクレアーゼ成分の欠失およびＣＲＩＳＰＲアレイの処理および標的ＤＮＡ結合を担う遺伝子の過剰発現を要した。改変Ｃａｓｃａｄｅシステムを使用する１つの利点は、複数のプロトスペーサを含有する単一の転写物の発現による複数の遺伝子のターゲティングであり、これはその後、個々のガイドＲＮＡにプロセシングされる（Ｌｕｏ，Ｍ．Ｌ．，Ｍｕｌｌｉｓ，Ａ．Ｓ．，Ｌｅｅｎａｙ，Ｒ．Ｔ．＆Ｂｅｉｓｅｌ，Ｃ．Ｌ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．４３ ６７４－６８１（２０１５））。
ＣＲＩＳＰＲ系の干渉は、遺伝回路から動的代謝制御への様々な適用で一般的になっている。Ｃａｓ１／２エンドヌクレアーゼが媒介するガイドアレイの不安定性は、場合によっては課題として特定されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、天然ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓｃａｄｅシステムを、ガイドＲＮＡアレイの発現とともにｃａｓ３ヌクレアーゼの欠失によってサイレンシングに利用することができ、単一の転写物から複数の遺伝子をサイレンシングすることができる。
一般的定義
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「発現ベクター」への言及は、単一の発現ベクターならびに同じ（例えば、同じオペロン）または異なる複数の発現ベクターを含み、「微生物」への言及は、単一の微生物ならびに複数の微生物を含む、などである。
本明細書で使用される「異種ＤＮＡ」、「異種核酸配列」などの用語は、以下のうちの少なくとも１つが真である核酸配列を指す：（ａ）核酸の配列は、所与の宿主微生物に対して外来性である（すなわち、天然で見出されない）；（ｂ）配列は、所与の宿主微生物において天然で見出され得るが、非天然（例えば、予想よりも多い）の量で見出され得る；または（ｃ）核酸の配列は、自然界で互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含む。例えば、例（ｃ）に関して、組換え産生される異種核酸配列は、遺伝子発現を駆動する非天然プロモーターなどの新たな機能性核酸を作製するように配置された無関係な遺伝子からの２つ以上の配列を有する。
種および他の系統発生的同定は、微生物学の当業者に知られる分類に従う。
酵素は、当業者に周知であるＵｎｉＰｒｏｔ識別番号を参照して、本明細書に列挙される。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＵｎｉＰｒｏｔ．ｏｒｇ／でアクセスすることができる。遺伝子産物、すなわち酵素の遺伝子改変が、特許請求の範囲を含めて本明細書で言及される場合、遺伝子改変は、所定の遺伝子産物、すなわち酵素を通常コードする、遺伝子などの、または遺伝子を含む核酸配列のものであることが理解される。
本明細書に記載の方法および工程が特定の順序で生じる特定の事象を示す場合、当業者は、特定の工程順序を変更することができ、そのような変更が本発明の変形例に従うことを認識するであろう。さらに、特定の工程は、可能であれば平行プロセスで同時に実行されてもよく、順次実行されてもよい。
略語の意味は、以下の通りである：使用法から明らかなように、「Ｃ」は、セ氏または度を意味し、ＤＣＷは、乾燥細胞重量を意味し、「ｓ」は、秒（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は、分（単数または複数）を意味し、「ｈ」、「ｈｒ」または「ｈｒｓ」は、時間（単数または複数）を意味し、「ｐｓｉ」は、平方インチ当たりのポンドを意味し、「ｎｍ」は、ナノメートルを意味し、「ｄ」は、日（単数または複数）を意味し、「μＬ」または「ｕＬ」または「ｕｌ」は、マイクロリットル（単数または複数）を意味し、「ｍＬ」は、ミリリットル（単数または複数）を意味し、「Ｌ」は、リットル（単数または複数）を意味し、「ｍｍ」は、ミリメートル（単数または複数）を意味し、「ｎｍ」は、ナノメートルを意味し、「ｍＭ」は、ミリモルを意味し、「μＭ」または「ｕＭ」は、マイクロモルを意味し、「Ｍ」は、モルを意味し、「ｍｍｏｌ」は、ミリモル（単数または複数）を意味し、「μｍｏｌ」または「μＭｏｌ」は、マイクロモル（単数または複数）を意味し、「ｇ」は、グラム（単数または複数）を意味し、「μｇ」または「ｕｇ」は、マイクログラム（単数または複数）を意味し、「ｎｇ」は、ナノグラム（単数または複数）を意味し、「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は、光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は、光子波長６００ｎｍで測定された光学密度を意味し、「ｋＤａ」は、キロダルトンを意味し、「ｇ」は、引力定数を意味し、「ｂｐ」は、塩基対（単数または複数）を意味し、「ｋｂｐ」は、キロベース対（単数または複数）を意味し、「％ｗ／ｖ」は、重量／体積パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は、体積／体積パーセントを意味し、「ＩＰＴＧ」は、イソプロピル－μ－Ｄ－チオガラクトピラノシドを意味し、「ａＴｃ」は、アンヒドロテトラサイクリンを意味し、「ＲＢＳ」は、リボソーム結合部位を意味し、「ｒｐｍ」は、毎分回転数を意味し、「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」は、ガスクロマトグラフィーを意味する。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本開示が属する技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
微生物
本明細書に記載され、特許請求される特徴は、本明細書のリストから選択される微生物、または別の適切な微生物で提供されてもよく、該微生物は１つ以上の天然、導入、もしくは強化された産物の生物産生経路も含む。したがって、いくつかの実施形態では、微生物は、内因性産物の産生経路（一部のそのような実施形態では、強化され得る）を含むが、他の実施形態では、微生物は内因性産物の産生経路を含まない。
本明細書に記載され、特許請求される特徴は、本明細書のリストから選択される微生物、または別の適切な微生物で提供されてもよく、該微生物は１つ以上の天然、導入、もしくは強化された産物の生物産生経路も含む。したがって、いくつかの実施形態では、微生物は、内因性産物の産生経路（一部のそのような実施形態では、強化され得る）を含むが、他の実施形態では、微生物は内因性産物の産生経路を含まない。
より具体的には、本明細書に記載の様々な基準に基づいて、化学製品の生物産生に適した微生物宿主には、一般に、方法の項に記載の生物が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書に記載される任意の遺伝子またはタンパク質の宿主微生物または供給源微生物は、微生物の以下のリストから選択され得る：シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）。いくつかの態様では、宿主微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物である。
発明態様の概要
一般に、不安定なガイドアレイは、欠失または変異した内因性ｃａｓ３ヌクレアーゼを特徴とする遺伝子改変微生物の使用によって排除され、Ｃａｓｃａｄｅオペロンは過剰発現し、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ ｇＲＮＡは、少なくとも１つの遺伝子の発現減少をもたらすように発現し得る。
一般に、不安定なガイドアレイは、欠失または変異した内因性ｃａｓ３ヌクレアーゼを特徴とする遺伝子改変微生物の使用によって排除され、Ｃａｓｃａｄｅオペロンは過剰発現し、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ ｇＲＮＡは、少なくとも１つの遺伝子の発現減少をもたらすように発現し得る。
いくつかの態様では、微生物および微生物を使用する任意の方法は、内因性ｃａｓ１遺伝子の欠失または変異を有する遺伝子改変微生物の使用を含み得る。
いくつかの態様では、微生物および微生物を使用する任意の方法は、ＰｈｏＢ活性化される誘導性プロモーターの制御下にあるＣａｓｃａｄｅオペロンによってさらに特徴付けられる遺伝子改変微生物の使用を含み得る。
いくつかの態様では、微生物および微生物を使用する任意の方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物である遺伝子改変微生物の使用を含み得る。
いくつかの態様では、微生物および微生物を使用する任意の方法は、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ１、ｇｌｔＡ２、ｕｄｈＡ、ｚｗｆ、またはそれらの組み合わせである遺伝子の発現を減少させるように機能し得る。
詳細な説明
不安定なガイドアレイは、Ｃａｓ１／２エンドヌクレアーゼ複合体の発現に起因し得る。ｃａｓ１の欠失は、ガイドアレイの不安定性を低減する。定常Ｃａｓ１／２エンドヌクレアーゼ活性は、ガイドアレイからのプロトスペーサの欠損をもたらす。その後、ガイドアレイは、選択によって増幅され得るサイレンシングにおいて効果的でなくなる可能性がある。Ｃａｓｃａｄｅ複合体発現を駆動する構成的プロモーターを厳密に制御される誘導性プロモーターに置き換えることにより、ガイドアレイの安定性が改善される。
不安定なガイドアレイは、Ｃａｓ１／２エンドヌクレアーゼ複合体の発現に起因し得る。ｃａｓ１の欠失は、ガイドアレイの不安定性を低減する。定常Ｃａｓ１／２エンドヌクレアーゼ活性は、ガイドアレイからのプロトスペーサの欠損をもたらす。その後、ガイドアレイは、選択によって増幅され得るサイレンシングにおいて効果的でなくなる可能性がある。Ｃａｓｃａｄｅ複合体発現を駆動する構成的プロモーターを厳密に制御される誘導性プロモーターに置き換えることにより、ガイドアレイの安定性が改善される。
内因性ｃａｓ３ヌクレアーゼ、Ｃａｓｃａｄｅオペロン、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ ｇＲＮＡの欠失または変異を特徴とする遺伝子改変微生物を提供することを含む、遺伝子改変微生物において遺伝子を条件付きサイレンシングする方法でも、不安定なガイドアレイは排除される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ ｇＲＮＡの発現により、遺伝子改変微生物の少なくとも１つの遺伝子の発現が減少する条件下で、遺伝子改変微生物を増殖させる工程を含む方法。本発明の微生物およびこれらの微生物を使用する方法は、内因性ｃａｓ３ヌクレアーゼ遺伝子の欠失もしくは選択的変異の任意の組み合わせ、またはＣａｓｃａｄｅオペロンの条件付き発現を含み得る。これらの条件の一方または両方は、ガイドアレイの安定性の向上をもたらす。
ガイドアレイは、アレイの条件付き発現時に単一遺伝子の転写サイレンシングの増加をもたらす単一ｇＲＮＡを含み得る。あるいは、ガイドアレイは、２つ以上の遺伝子の転写サイレンシングをもたらす２つ以上のｇＲＮＡを含み得る。単一のガイドアレイは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の遺伝子を同時に調節する手段を含むことができる。あるいは、遺伝子改変微生物は、２つ以上のガイドアレイを同時に含有してもよく、そのそれぞれが条件付きで発現してもよく、１つ以上の遺伝子の転写サイレンシングをもたらす。
一態様では、本方法は、内因性ｃａｓ１遺伝子の欠失または変異を有する遺伝子改変微生物の使用を含み得る。ｃａｓ１遺伝子の欠失または変異を両条件と組み合わせて、最適なガイドアレイ安定性を提供することができ、これは、内因性ｃａｓ３ヌクレアーゼ遺伝子の欠失もしくは選択的変異、またはＣａｓｃａｄｅオペロンの条件付き発現の両方と組み合わされる。しかしながら、これらの３つの要因（ｃａｓ３欠失／変異、ｃａｓ１欠失／変異、または条件付きＣａｓｃａｄｅオペロン発現）の任意の組み合わせは、実際にガイドアレイの安定性を高めることが理解される。
ｃａｓ３および／またはｃａｓ１内因性遺伝子の欠失または変異は、この内因性遺伝子の発現を不可能にする内因性遺伝子の任意の改変を指すにすぎない。欠失または変異は、遺伝子調節配列、または遺伝子自体のコード配列の改変、または遺伝子改変微生物の特定の内因性遺伝子の発現を防止する他の手段で生じ得る。
条件付きで発現する、条件付きで過剰発現する、誘導性プロモーター、または厳密に抑制される誘導性プロモーターという語句は、遺伝子発現を調節する手段を指す。遺伝子発現は、刺激の導入または必要な栄養素もしくは他の物質の除去によって条件付きで調節され得る。厳密に抑制されるプロモーター配列とは、プロモーターが記載の抑制条件下にある間は遺伝子発現の調節が厳密に起こらないという事実を指し、誘導性とは、プロモーターが外部から加えられたシグナルに応答し得るという事実を指す。
ガイドアレイは、標的に特異的なｇＲＮＡの発現を可能にする任意の構成を指す。この場合、その標的は、特定の条件下で転写サイレンシングされる遺伝子である。
本発明の別の態様は、内因性ｃａｓ３ヌクレアーゼ遺伝子の欠失もしくは選択的変異の任意の組み合わせ、またはこれらの特徴を欠く遺伝子改変微生物とは対照的なＣａｓｃａｄｅオペロンの条件付き発現を有する遺伝子改変微生物におけるガイドアレイ発現の比較によって記載される。これらの特徴は、ガイドアレイの安定性を強化し、したがって標的遺伝子の転写遺伝子サイレンシングを強化するのに役立つ。
一態様において、本方法は、ＰｈｏＢ活性化される誘導性プロモーターの制御下にあるＣａｓｃａｄｅオペロンによってさらに特徴付けられる遺伝子改変微生物の使用を含み得る。ＰｈｏＢ以外の任意の誘導性プロモーターが本発明に包含されることが理解される。
一態様では、本方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物である遺伝子改変微生物の使用を含み得る。しかしながら、調節、欠失または変異する遺伝子、ならびに発現するオペロンおよびガイドアレイは、任意の既知微生物に適用可能であることが理解される。
一態様では、本方法は、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ１、ｇｌｔＡ２、ｕｄｈＡ、ｚｗｆ、またはそれらの組み合わせである遺伝子の発現を減少させるように機能し得る。これらの遺伝子は、本明細書に記載の遺伝子改変微生物における遺伝子調節の候補として同定されているが、本方法および微生物は、選択的に調節されることが望ましいとして同定された任意の遺伝子に広く適用可能であることが理解される。例えば、
例
本開示の原理の理解を促進する目的で、好ましい実施形態を参照し、それを説明するために特定の文言が使用される。にもかかわらず、それによって本開示範囲の限定は意図されておらず、本明細書に示されるような本開示のかかる変更およびさらなる改変は、本開示が関する技術の当業者に通常想起されるように企図されることが理解されよう。
本開示の原理の理解を促進する目的で、好ましい実施形態を参照し、それを説明するために特定の文言が使用される。にもかかわらず、それによって本開示範囲の限定は意図されておらず、本明細書に示されるような本開示のかかる変更およびさらなる改変は、本開示が関する技術の当業者に通常想起されるように企図されることが理解されよう。
材料および方法
図２では、本発明の例示的なプラスミドが要約される。図３では、本発明の例示的な微生物株が要約される。図４では、例示的なｓｇＲＮＡガイド配列およびそれらを構築するために使用されるプライマーのリストが要約される。図５では、本発明の例示的な合成ＤＮＡが要約される。スペーサはイタリック体である。
試薬および培地：他に明記しない限り、すべての材料および試薬は可能な限り最高グレードのものであり、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。通常の株およびプラスミドの増殖、構築およびコロニー単離のために、低塩のルリア培地、レンノックス製剤を使用した。クロラムフェニコール、アンピシリン、およびテトラサイクリンを、それぞれ２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、および５μｇ／ｍＬの最終作用濃度で使用した。適切な選択のためのｐＨを維持するために５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０）を添加したＬＢを用いて、２００μｇ／ｍＬの最終作用濃度を使用してピューロマイシン選択を行った。
株およびプラスミド：以前に報告されたように、より小さなアレイのＰＣＲアセンブリを使用してｐＣＡＳＣＡＤＥアレイプラスミドを構築した。この研究で構築されたｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドについては、配列およびプライマーの詳細について図２～５を参照されたい。プラスミド、ｐＦＡＢＩを、強力な合成ＥＭ７プロモーターを使用してコドン最適化ｆａｂＩ遺伝子からの構成的発現を可能にするように構築した。プロモーターおよび遺伝子を含むプラスミドＤＮＡは、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンフランシスコ）から入手した。Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ株はＬｕｃｉｇｅｎから入手した。ＤＬＦ＿Ｚ００２５、ＤＬＦ＿Ｚ００４５およびＤＬＦ＿Ｚ００４７の株を以前に報告されたように作製した。この研究で作製した株はすべて、標準的な組換えを使用して構築した。組換えプラスミドｐＳＩＭ５およびｔｅｔ－ｓａｃＢ選択／対抗選択マーカーカセットは、Ｄｏｎａｌｄ Ｃｏｕｒｔ（ＮＣＩ，ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｃｏｕｒｔ－ｌａｂ．ｈｔｍｌ）からの親切な贈り物であった。ＤＬＦ＿Ｚ００４７ΔｓｂｃＤ：：ａｍｐＲを、直接組込みおよび適切な抗生物質マーカーを含む直鎖ドナーＤＮＡでの遺伝子置換によって構築した。ドナーは、プライマーｄｅｌ＿ｓｂｃＤ＿ｐ１およびｄｅｌ＿ｓｂｃＤ＿ｐ２．ＤＬＦ＿Ｚ００４７を含む合成アンピシリン耐性カセット（ａｍｐＲ２）のＰＣＲによって調製し、ｒｅｃＡ１：：ａｍｐＲを同様に構築したが、組込みは、欠失ではなくＧ１６０Ｄ変異をｒｅｃＡ遺伝子に組み込んだ。株のＤＬＦ＿Ｚ００４７Δｃａｓ１：：ｐｕｒＲおよびＤＬＦ＿Ｚ００４７Δｃａｓ２：：ｐｕｒＲを、直接組込みおよび直鎖ドナーＤＮＡによる遺伝子置換によって構築した。Ｃａｓｃａｄｅオペロンの前のｓｓｐＢ遺伝子およびプロモーターを置換するために再組み合わせおよびｔｅｔ－ｓａｃＢ系の選択対抗選択を使用して、株のＤＬＦ＿Ｓ００４７およびＤＬＦ＿Ｓ００２５を、それぞれＤＬＦ＿Ｚ００４７およびＤＬＦ＿Ｚ００２５から構築した。すべての遺伝子改変をＰＣＲおよび配列決定によって確認した。配列決定は、Ｇｅｎｅｗｉｚ（ノースカロライナ州モリスビル）またはＥｕｒｏｆｉｎｓ（ケンタッキー州ルーズビル）のいずれかによって行った。プラスミド形質転換を、標準的な方法を使用して達成した。
ガイド安定性試験：プラスミドＤＮＡミニプレップおよび配列決定を標準的な方法で行った。以下の２つのプライマーを使用して、ｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドのｇＲＮＡ－順方向：５’－ＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧ－３’（配列番号６０）、ｇＲＮＡ－逆方向：５’－ＣＧＣＡＧＴＣＧＡＡＣＧＡＣＣＧ－３’（配列番号６１）からガイドアレイを増幅したコロニーＰＣＲを下記の通りに行った：５μＬの２Ｘ ＥｃｏｎｏＴａｑ Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｌｕｃｉｇｅｎ）、１μＬの各プライマー（１０ｕＭ濃度）、３μＬのｄＨ２Ｏおよびコロニーの小部分からなる１０μＬのＰＣＲ反応で、２Ｘ ＥｃｏｎｏＴａｑ Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用した。ＰＣＲパラメータは、最初の９８℃、２分間の初期変性、続いて９４℃、３０秒、６０℃ ３０秒、および７２℃、３０秒の３５サイクル、最後の７２℃、５分間の最終伸長であった。次いで、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
ここで図１Ａ～図１Ｂを参照すると、ガイド欠損が疑われる最初のいくつかのガイドアレイプラスミドを配列決定した。例（図１Ａ）として、本発明者らは、プロトスペーサを含むガイドアレイプラスミドを、ＦａｂＩ（エノイル－ＡＣＰレダクターゼ）、ＧｌｔＡ（シトラートシンターゼ）およびＵｄｈＡ（可溶性トランスヒドロゲナーゼ）のタンパク質分解が可能なデグロンタグで操作された宿主株（ＤＬＦ＿Ｚ００４７）に形質転換して、ｇｌｔＡｐ１（Ｇ１）、ｇｌｔＡｐ２（Ｇ２）およびｕｄｈＡ（Ｕ）プロモーターをサイレンシングした。単一コロニーを選択し、５ｍＬ培養物（ルリア培地）に接種するために使用し、一晩増殖させた後、培養物をプレーティングして単一コロニーを単離し、２４個のクローンを単離し、ガイドアレイプラスミドを少量調製し、配列決定した。１７個のプラスミドは予想される配列を有し、３個すべてのプロトスペーサを保持した（図１Ｂ、最上部の配列）が、他の７個は変異を有し、中央のプロトスペーサＧ２に隣接する２個のプロトスペーサ（Ｇ１およびＵ）が欠損していた。これらの修飾クローンのうちの４つは、５’および３’隣接反復配列の両方を保持したが、他の３つはまた、Ｇ２プロトスペーサに隣接する５’または３’反復配列のいずれかを欠損していた。
図１Ｃに示すように、次の工程として、単一ガイド（Ｇ２）および３つの追加のガイドアレイ：ＦＧ２、ＦＧ１Ｇ２およびＦＧ１Ｇ２Ｕの安定性を評価し、「Ｆ」はｆａｂＩプロモーターを標的とするプロトスペーサである。再び、株ＤＬＦ＿Ｚ００４７を使用し、再び５ｍＬ培養物（ルリア培地）に接種するために使用される単一コロニーから開始する。一晩増殖させた後、培養物を播種して単一コロニーを単離した。この場合、４つの培養物のそれぞれから４つのクローンを単離し、配列決定ではなくコロニーＰＣＲを利用してガイドアレイの安定性を評価した。結果を図１Ｃに示す。この場合、単一のＧ２ガイドは安定であることが証明されたが、２～４個のプロトスペーサのより大きなアレイは不安定性の程度が異なり、１～３個のプロトスペーサの欠損と一致するアンプリコンを産生した。
ここで図１Ｄを参照すると、安定性を評価するためのツールとしてのＰＣＲの成功により、いくつかの異なる宿主株におけるガイドアレイのより大きな分類についてのガイドアレイ安定性の評価の次の工程が研究された。これらには、Ｆ、Ｇ１、Ｇ２およびＵプロトスペーサ、ならびにｚｗｆプロモーターＺを標的とするプロトスペーサＺが含まれた。評価した株には、市販のｒｅｃＡ１クローニング株（Ｌｕｃｉｇｅｎ）であるＥ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ、ならびに任意の代謝酵素のタンパク質分解デグロンタグを欠く２段階動的代謝制御に利用される対照宿主であるＤＬＦ＿Ｚ００２５、ＧｌｔＡおよびＵＤｈＡのデグロンタグを有するＤＬＦ＿Ｚ００４５、ＤＬＦ＿Ｚ００４７（上述のＦＧＵ）、ならびにｒｅｃＡ１変異体（ｒｅｃＡＧ１６０Ｄ）、ｓｂＣＤ遺伝子欠失（ガイドアレイに存在するヘアピンおよび回文配列を認識するＳｂｃＣＤエンドヌクレアーゼの成分）およびｃａｓ１およびｃａｓ２の欠失を含むＤＬＦ＿Ｚ００４７の誘導体が含まれた。結果を図１Ｄに示す。
ガイドアレイは、クローニング株において安定であった。この結果は、これらの構築物が元来Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇを使用して構築され、プロトスペーサの欠損がない元のプラスミドが配列決定によって確認されたため、意外ではなかった。プロトスペーサの欠損は、アレイの小グループについてＤＬＦ＿Ｚ００２５で最初に認められた。ＤＬＦ＿Ｚ００２５は、Ｃａｓｃａｄｅオペロンの構成的発現のために改変されている（図１Ａ）。宿主株のＤＬＦ＿Ｚ００４５およびＤＬＦ＿Ｚ００４７では、不安定性の増加が検出された。ｒｅｃＡ１変異の組込みもｓｂｃＤの欠失も、ＤＬＦ＿Ｚ００４７バックグラウンドにおけるプロトスペーサの欠損を減少させなかった。ｒｅｃＡの場合、これは、２０ｂｐの相同性のみが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での組換えを可能にするが、有意な組換えには５０ｂｐを超える相同配列が必要であることを示す以前の研究と一致し、プロトスペーサは３０ｂｐ長である。対照的に、ｃａｓ１またはｃａｓ２の欠失はアレイ安定性を向上させ、ｃａｓ１の欠失では最小のプロトスペーサ欠損を有する。
ｃａｓ１欠失の結果は、Ｃａｓ１／２エンドヌクレアーゼがプロトスペーサ欠損の原因であり、Ｃａｓ１がヌクレアーゼ成分であることと一致する。この活性は、プロトスペーサ獲得における以前に報告された活性と一致する。Ｃａｓ１変異で非常に低いプロトスペーサ欠損が依然として観察されたという事実により、プロトスペーサ欠損の第２の代替機構の可能性、または本発明者らのＰＣＲアッセイにおける不正確が示される。しかしながら、図１Ｄに見られるように、Ｆプロトスペーサを含むガイドアレイは、そうでないものよりも著しく不安定であった。このプロトスペーサ特異性は、一般化されたエンドヌクレアーゼ活性と一致せず、Ｆ含有アレイはプロトスペーサ欠損の傾向が増加しているが、さらなる調査を促す。
ＦａｂＩは厳密に必須の酵素である可能性があり、ガイドアレイが誘導可能な発現下にあるという事実にもかかわらず、漏出性発現は増殖阻害をもたらし、Ｆプロトスペーサを欠損する該ガイドアレイは、Ｃａｓｃａｄｅオペロン（ｃａｓ１およびｃａｓ２を含む）が過剰発現する株で選択的利点を有するであろう。これはまた、ガイドアレイプラスミドのＦプロトスペーサによる形質転換が他のアレイよりも低いコロニー数をもたらすという一般的な観察と一致している。本発明者らは、Ｆプロトスペーサによってサイレンシングされない代替構成的プロモーターからＦａｂＩの発現を可能にするプラスミド（ｐＦＡＢＩ、図１Ｅ）を構築した。次いで、本発明者らは、コロニー数ならびにアレイ安定性におよぼすＦプロトスペーサを含有するガイドアレイプラスミドによるｐＦＡＢＩの同時形質転換の影響を評価した。図１Ｆ～１Ｇに見られるように、ｐＦＡＢＩの同時形質転換は、コロニー数ならびにアレイ安定性を増加させた。これらのデータは、ｆａｂＩの漏出性サイレンシングによる増殖阻害と一致しており、その結果、Ｆプロトスペーサが欠損するアレイの選択的利点と一致している。
まとめると、上記で考察した結果は、定常Ｃａｓ１／２エンドヌクレアーゼ活性がガイドアレイからのプロトスペーサの欠損をもたらすモデルを支持する。必須遺伝子を標的とするプロトスペーサを有するサイレンシングアレイは、Ｃａｓｃａｄｅオペロンが過剰発現した場合、たとえわずかであっても、ガイドの漏出性発現により、増殖阻害をもたらし得る。毒性プロトスペーサを欠くアレイは、日常的な培養での選択によって増幅することができる。アレイの安定性を向上させるためのいくつかの選択肢がある。第１に、単純にｃａｓ１の欠失は、安定性を向上するはずであり、Ｃａｓ１はＣａｓｃａｄｅオペロンのサイレンシング機能に必要ではないため、遺伝子サイレンシングは影響を受けないはずである。このアプローチは、将来のサイレンシング株に対する２つの改変、ｃａｓ３およびｃａｓ１の欠失を必要とするであろう（図１Ａ）。しかしながら、定常ｆａｂＩサイレンシングの場合に観察された毒性に照らして、本発明者らはまた、第２の選択肢を評価し、ここで、本発明者らは、ｃａｓ３を欠失させ、最初に報告された構成的プロモーター（Ｂｉｏｂｒｉｃｋ Ｊ２３１００）ではなく、厳密に制御された低ホスファート誘導性プロモーターを使用してＣａｓｃａｄｅオペロンを発現させた。このアプローチを実施および試験するために、本発明者らは、ＦａｂＩ、ＧｌｔＡおよびＵｄｈＡにデグロンタグを含む、ＤＬＦ＿Ｚ００４７と同一のＤＬＦ＿Ｓ００４７を構築したが、構成的Ｊ２３１００プロモーター（図１Ａ）は、強力な合成転写ｔＺターミネーターが先行する、厳密に制御された低ホスファート誘導性修飾ｙｉｂＤ遺伝子プロモーターによって置き換えられた。図１Ｄに見られるように、アレイの不安定性は、ＤＬＦ＿Ｓ００４７を使用して排除された。また、動的代謝制御のための将来の工学用の新しい安定株としてＤＬＦ＿Ｓ００２５を構築した。
ＣＲＩＳＰＲ干渉のためのＣａｓｃａｄｅの利用は、ｃａｓ１／２の欠失ではないとしても、Ｃａｓｃａｄｅオペロン（ｃａｓ１／２）の発現より厳密な制御、または少なくともガイド安定性の評価から利益を得るであろう。
開示された実施形態は非限定的である
本発明の様々な実施形態を本明細書で示し説明してきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることが強調される。その様々な実施形態において、本明細書の本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換を行うことができる。具体的には、いかなる理由であれ、他に明記しない限り、リスト、表、もしくは他の分類で、本明細書に記載もしくは他の方法で提示される化合物、核酸配列、機能性酵素、代謝経路酵素もしくは中間体を含む特定のタンパク質を含むポリペプチド、要素、もしくは他の組成物、もしくは濃度の任意の分類、または他の分類について、そのような各分類は、様々なサブセット実施形態の基礎を提供し、それを特定するのに役立つことを意図し、その最も広い範囲のサブセット実施形態は、それぞれ記載される分類の１つ以上のメンバー（またはサブセット）を除外することによって、そのような分類のすべてのサブセットを含む。さらに、本明細書に任意の範囲が記載されている場合、他に明記しない限り、その範囲は、その中のすべての値およびその中のすべての部分範囲を含む。
本発明の様々な実施形態を本明細書で示し説明してきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることが強調される。その様々な実施形態において、本明細書の本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換を行うことができる。具体的には、いかなる理由であれ、他に明記しない限り、リスト、表、もしくは他の分類で、本明細書に記載もしくは他の方法で提示される化合物、核酸配列、機能性酵素、代謝経路酵素もしくは中間体を含む特定のタンパク質を含むポリペプチド、要素、もしくは他の組成物、もしくは濃度の任意の分類、または他の分類について、そのような各分類は、様々なサブセット実施形態の基礎を提供し、それを特定するのに役立つことを意図し、その最も広い範囲のサブセット実施形態は、それぞれ記載される分類の１つ以上のメンバー（またはサブセット）を除外することによって、そのような分類のすべてのサブセットを含む。さらに、本明細書に任意の範囲が記載されている場合、他に明記しない限り、その範囲は、その中のすべての値およびその中のすべての部分範囲を含む。
また、より一般的には、本明細書の開示、考察、例および実施形態によれば、当技術の範囲内で、従来の分子生物学、細胞生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，’’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，’’Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１（ｖｏｌｕｍｅｓ １－３），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６を参照のこと。これらの公開された情報源は、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の公開された情報源は、本明細書に記載された本発明と併せて役立つ説明のために、参照により本明細書に組み込まれ、例えば、糖源からの化学製品の工業的生物産生の方法、およびまた、そのような変換を達成するために使用され得る産業システムである（生物学的反応器の設計については、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，２ｎｄ Ｅｄ．Ｊ．Ｅ．Ｂａｉｌｅｙ ａｎｄ Ｄ．Ｆ．Ｏｌｌｉｓ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６、例えばＣｈａｐｔｅｒ９，ｐａｇｅｓ５３３－６５７；例えば、プロセスおよび分離技術の分析については、Ｕｎｉｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ｌ．ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９３；例えば分離技術の教示については、Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｓｔａｇｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｐ．Ｃ．Ｗａｎｋａｔ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ ＵＳＡ，１９８８）。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
配列表１～８ ＜２２３＞合成ガイドアレイ構築体
配列表９ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表１０～１１ ＜２２３＞合成プライマー
配列表１２ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表１３～１６ ＜２２３＞合成プライマー
配列表１７ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表１８～２１ ＜２２３＞合成プライマー
配列表２２ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表２３～２６ ＜２２３＞合成プライマー
配列表２７ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表２８～３１ ＜２２３＞合成プライマー
配列表３２ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表３３～３６ ＜２２３＞合成プライマー
配列表３７ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表３８～４１ ＜２２３＞合成プライマー
配列表４２ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表４３～４６ ＜２２３＞合成プライマー
配列表４７ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表４８～５１ ＜２２３＞合成プライマー
配列表５２～５４ ＜２２３＞合成プラスミド
配列表５５～５６ ＜２２３＞合成配列
配列表５７～５９ ＜２２３＞合成プラスミド
配列表６０～６１ ＜２２３＞合成
配列表９ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表１０～１１ ＜２２３＞合成プライマー
配列表１２ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表１３～１６ ＜２２３＞合成プライマー
配列表１７ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表１８～２１ ＜２２３＞合成プライマー
配列表２２ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表２３～２６ ＜２２３＞合成プライマー
配列表２７ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表２８～３１ ＜２２３＞合成プライマー
配列表３２ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表３３～３６ ＜２２３＞合成プライマー
配列表３７ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表３８～４１ ＜２２３＞合成プライマー
配列表４２ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表４３～４６ ＜２２３＞合成プライマー
配列表４７ ＜２２３＞合成ｓｇＲＮＡガイド配列
配列表４８～５１ ＜２２３＞合成プライマー
配列表５２～５４ ＜２２３＞合成プラスミド
配列表５５～５６ ＜２２３＞合成配列
配列表５７～５９ ＜２２３＞合成プラスミド
配列表６０～６１ ＜２２３＞合成
Claims (11)
- 遺伝子改変微生物であって、
内因性ｃａｓ３ヌクレアーゼが、欠失または変異し、
Ｃａｓｃａｄｅオペロンの条件付き過剰発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結されたＣａｓｃａｄｅオペロン、および
少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ ｇＲＮＡが条件付きで発現され得るガイドアレイであって、前記ガイドアレイの発現が、少なくとも１つの遺伝子の発現減少をもたらす、ガイドアレイ、
内因性ｃａｓ３ヌクレアーゼの欠失もしくは変異またはＣａｓｃａｄｅオペロンの条件付き発現を欠く遺伝子改変微生物と比較した場合、前記ガイドアレイの安定性の向上を特徴とする、遺伝子改変微生物。 - 内因性ｃａｓ１遺伝子が、欠失または変異している、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- Ｃａｓｃａｄｅオペロンが、厳密に抑制される誘導性プロモーターの制御下で過剰発現する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 厳密に抑制される誘導性プロモーターが、ＰｈｏＢ活性化される、請求項３に記載の遺伝子改変微生物。
- 遺伝子改変微生物が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物である、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 発現減少遺伝子が、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ１、ｇｌｔＡ２、ｕｄｈＡ、およびｚｗｆからなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 遺伝子改変微生物において遺伝子を条件付きでサイレンシングする方法であって、
内因性ｃａｓ３ヌクレアーゼの欠失または変異；
Ｃａｓｃａｄｅオペロン；および
少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ ｇＲＮＡを含む少なくとも１つのガイドアレイ
を特徴とする遺伝子改変微生物を提供することと、
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ ｇＲＮＡの発現が、前記遺伝子改変微生物の少なくとも１つの遺伝子の発現減少をもたらす条件下で、前記遺伝子改変微生物を増殖させることと、
を含む、方法。 - 遺伝子改変微生物が、内因性ｃａｓ１遺伝子の欠失または変異をさらに含む、請求項７に記載の方法。
- 遺伝子改変微生物が、ＰｈｏＢ活性化される誘導性プロモーターの制御下にあるＣａｓｃａｄｅオペロンによってさらに特徴付けられる、請求項７に記載の方法。
- 遺伝子改変微生物が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物である、請求項７に記載の方法。
- 発現減少遺伝子が、ｆａｂＩ、ｇｌｔＡ１、ｇｌｔＡ２、ｕｄｈＡ、およびｚｗｆからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
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