CN116515791A - 具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体及其制备方法和应用，属于基因扩增技术领域。该Taq DNA聚合酶变体包含至少一种经过修饰的Taq DNA聚合酶，所述经过修饰的Taq DNA聚合酶包括将SEQ ID No.1所示的序列上507、520、537及578相对应位置的至少一个氨基酸残基进行取代，以及包括SEQ ID No.1所示的序列的N‑端缺失。本发明中制备的Taq DNA聚合酶变体兼具链置换活性和热稳定性，既可以用于等温扩增反应，也可以用于PCR扩增反应。

Description

具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因扩增技术领域，具体涉及一种具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体及其制备方法和应用。
背景技术
在分子生物学研究和医学诊断方面，序列特异性DNA扩增具有很多应用。例如，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA的指定片段(扩增子)，而PCR扩增通常依赖于Taq DNA聚合酶。在PCR扩增过程中，通过基于仪器的重复热循环，从模板核酸中生成扩增子，以启动三个扩增步骤：模板DNA的变性、在变性模板中特定位置进行引物退火、使用耐热DNA聚合酶延伸/延长扩增子，使样本DNA的数量呈指数级增加。
除PCR扩增外，还有越来越多的应用已经被开发出来。这些应用包括链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、环介导扩增(LAMP)等，这些扩增方法与PCR扩增最主要的区别在于DNA扩增所需的单温(等温)反应条件。等温扩增方法有时会利用初始高温孵育使模板变性，但在大多数情况下，DNA扩增发生在单一确定的温度下。
热稳定的Bst DNA聚合酶既表现出很强的链置换活性，又可以进行序列特异性等温扩增，通常情况下被用于大多数SDA和LAMP反应。Bst DNA聚合酶在63℃时具有最佳活性，适用于大多数目前已知的等温扩增方法的需求，因此，Taq DNA聚合酶并不是大多数等温扩增方法的最佳选择。与链置换反应不同的是，Taq DNA聚合酶是利用其强大的5'至3'核酸外切酶活性来降解其在复制过程中遇到的双链DNA，使其能够修复复制中的缺口和其他错误，并创建单个DNA链通道；因此，野生型Taq DNA聚合酶不适合用于链置换反应。目前，已有研究注意到某些突变可以使得Taq DNA聚合酶发挥链置换活性，这些突变通常与其他突变结合使核酸外切酶结构域失活或被消除，因此，可以成功地实施LAMP方法。
发明内容
为了研究其他Taq DNA聚合酶变体是否可以进行链置换反应，本发明中使用定点诱变产生了超过一千个的Taq DNA聚合酶变体，与LAMP反应使用的市售的DNA聚合酶直接比较后，发现其中有数十个突变体能够成功进行环介导等温扩增(LAMP)，与野生型Taq DNA聚合酶表现出明显的区别。由于环介导的扩增(LAMP)依赖于链置换活性来启动合成，因此可以得出结论，这些Taq DNA聚合酶变体能够进行链置换反应，且这些变体中的大多数变体在通过N-端缺失移除核酸外切酶结构域时的活性最佳。
本发明第一个目的是提供一种新的经过修饰的具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体。所述Taq DNA聚合酶变体包含至少一种经过修饰的Taq DNA聚合酶，所述经过修饰的Taq DNA聚合酶包括将SEQ ID No.1所示的序列上507、520、537及578相对应位置的至少一个氨基酸残基进行取代，以及包括SEQ ID No.1所示的序列的N-端缺失。
在优选的实施方案中，所述经过修饰的Taq DNA聚合酶包含至少一个选自E507K、E520K、E537K或D578R突变体的取代。
本发明第二个目的是提供编码上述任一项所述的具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体的基因。
本发明第三个目的是提供含有编码所述Taq DNA聚合酶变体的基因的重组表达载体。
本发明第四个目的是提供含有编码所述Taq DNA聚合酶变体的基因的表达盒。
本发明第五个目的是提供含有编码所述Taq DNA聚合酶变体的基因的重组宿主细胞。
本发明第六个目的是提供所述具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体的制备方法，包括以下步骤：将编码所述Taq DNA聚合酶变体的基因克隆至载体中，得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化至宿主细胞，经过细胞培养、诱导表达、纯化后得到所述TaqDNA聚合酶变体。
在优选的实施方案中，所述Taq DNA聚合酶变体的基因的C-端预先添加了His标签。
本发明第七个目的是提供所述具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体在基因扩增中作为Taq DNA聚合酶的应用。
本发明更详细更具体的技术方案如下：
本发明提供一种具有链置换活性的Taq DNA聚合酶。所述Taq DNA聚合酶变体的链置换活性是通过至少取代Taq DNA聚合酶上与野生型Taq DNA聚合酶相对应位置的507、520、537和578位置上的氨基酸残基得到，并同时控制N-端缺失以降低5'-3'核酸外切酶活性。
具体地，本发明提供源自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的酶或其变体、修饰形式、同源物、融合蛋白、功能等价物或其功能片段。所述酶或其变体、修饰形式、同源物、融合蛋白、功能等价物或其功能片段在一个或多个位置具有一个或多个修饰，所述位置在结构上选自SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的507、520、537和578位点或者通过氨基酸序列同源性与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列上507、520、537和578的位置相对应。
为了增加酶的链置换活性，所述突变聚合酶可包含突变体，所述突变体可包含与野生型(WT)Taq DNA聚合酶Glu507对应的位置处的Lys；与WT Taq DNA聚合酶Glu520对应的位置处的Lys；与WT Taq DNA聚合酶Glu537对应的位置处的Lys；以及与WT Taq DNA聚合酶Asp578对应的位置处的Arg。可以在截短后的Taq DNA聚合酶中表达这些突变体，消除了聚合酶的5'-3'核酸外切酶的活性。
在优选的实施方式中，经过修饰的Taq DNA聚合酶还包括对与野生型Taq DNA聚合酶(SEQ ID No.1)的氨基酸序列上一个位置相对应的一个或多个位置进行取代，同时还存在N-端缺失以使5'-3'核酸外切酶的活性降低(SEQ ID No.2)。被取代的突变体选自以下任一个：E507、E520、E537、D578。
在优选的实施方式中，经过修饰的Taq DNA聚合酶还包括对与野生型Taq DNA聚合酶(SEQ ID No.1)的氨基酸序列上一个位置相对应的一个或多个位置进行取代，同时还存在N-端缺失以使5'-3'核酸外切酶的活性降低(SEQ ID No.2)。被取代的突变体选自以下任一个：E507K、E520K、E537K、D578R。
为了制备经过修饰的Taq DNA聚合酶，编码所述经过修饰的Taq DNA聚合酶的DNA可以根据已公开的序列进行化学合成，或者直接通过包含所述经过修饰的Taq DNA聚合酶的基因的宿主细胞得到(例如，通过cDNA文库筛选或PCR扩增得到)。所述经过修饰的TaqDNA聚合酶的基因可以被包含在表达盒中或/和通过标准的分子克隆技术克隆到合适的表达载体中。所述表达盒或表达载体通常包含辅助起始转录和终止转录的序列(例如，启动子和终止子)，还可能包含选择性标签。所述表达盒也可以包含正链或负链mRNA，所述表达盒的表达过程可能包含也可能不包含mRNA翻译前的扩增步骤。所述表达盒或表达载体可以引入表达宿主细胞中，通过表达宿主细胞来表达所述经过修饰的Taq DNA聚合酶的基因。尤其适合的表达宿主是细菌表达宿主属，包括大肠杆菌属(例如，大肠杆菌)、假单胞菌属(例如荧光假单胞菌或斯氏假单胞菌)、变形杆菌属(奇异变形杆菌)、雷尔氏菌属(例如富营养雷尔氏菌)、链霉菌属、葡萄球菌属(例如肉葡萄球菌)、乳球菌属(例如乳酸乳杆菌)、乳酸菌或芽孢杆菌属(枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等)。
在评估突变的变体时，上述克隆和表达所述经过修饰的Taq DNA聚合酶的基因的方法既适合工业规模表达，也适合于高通量筛选。
本发明中的经过修饰的Taq DNA聚合酶或其嵌合变体可以通过不同的方式构建。最容易的方式是通过基因重组，然后表达蛋白质。该蛋白质可以通过宿主细胞内的表达载体进行表达，所述表达载体包含所述经过修饰的Taq DNA聚合酶的基因。DNA克隆、操作方法和蛋白质的表达方法均是本领域的常规技术，详细的方法可以参考Sambrook等人编著的《分子克隆——实验室手册》(《Molecular cloning—A Laboratory Manual》)。
因此，本发明还提供编码所述Taq DNA聚合酶变体的DNA、包含该DNA的表达载体、包含该表达载体的宿主细胞和该宿主细胞的培养基以及制备所述Taq DNA聚合酶变体的方法。
如上所述，可以在多种表达系统中表达Taq DNA聚合酶蛋白，因此，必须选择适当的下游处理和纯化工序。目标蛋白可以分泌到细胞外或细胞周质空间中，也可以在胞内表达。
在本发明优选的实施例中，DNA聚合酶变体在微生物宿主中表达，并将目标蛋白分泌到细胞周质空间或细胞外。表达DNA聚合酶变体的宿主细胞可以通过本领域技术人员所熟知的方法保存，例如使用甘油原液保存。表达微生物的培养基采用标准发酵方法适量制备。
在本发明优选的实施例中，在合适的容器中，用于蛋白表达的培养基从甘油原液中接种，并且培养基体积连续增加。
在本发明优选的实施例中，细胞在发酵罐中培养，并选择性地控制培养条件(如pH值、温度、氧气和/或营养物供给)。纯化的第一步包括利用沉积、微滤、离心、絮凝等方法中的一种或多种，从上清液中分离细胞。在进一步优选的实施方式中，采用的方法是微滤法。
对于细胞内表达，对细胞进行处理使蛋白从细胞内空间中释放。所述处理包括加压、酶促反应、渗透压冲击、冷冻、超声处理或其他处理，所述处理使得到的细胞提取物既可以进一步纯化，也可以无需进一步纯化。在优选的纯化方法中，通过金属螯合柱亲和层析法纯化带有亲和标记的蛋白，可以得到高纯度蛋白。该优选的纯化方法得到的蛋白纯度>30％，在进一步优选的方法中，蛋白纯度>50％、>60％、>70％、>80％或>90％；在更优选的方法中，蛋白纯度>95％，在最优选的方法中，蛋白纯度>98％。
此外，本发明还包括含有所述Taq DNA聚合酶变体和其他试剂的试剂盒，所述试剂盒适用于实验室实验。
本发明的有益效果是：本发明中制备的Taq DNA聚合酶变体兼具链置换活性和热稳定性，既可以用于PCR扩增，也可以用于等温扩增(例如LAMP等扩增)。
附图说明
图1为本发明的Taq DNA聚合酶变体和Bst DNA聚合酶分别用于LAMP扩增后对扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳得到的结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
本发明提供一种具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体。
具体地，所述Taq DNA聚合酶变体包含将SEQ ID No.1所示的野生型Taq DNA聚合酶的核酸外切酶缺失衍生物的氨基酸序列中至少一个氨基酸进行取代得到的序列。所述Taq DNA聚合酶变体或其同源物相对于天然的未经修饰的DNA聚合酶具有增强的链显示活性。可以通过US5405774、US5455170、US5466591和US5795762中公开的方法使所述Taq DNA聚合酶变体沿5'-3'方向的核酸外切酶的活性降低。
C-端包含His标签的野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列SEQ ID No.1：MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKEGSGSSGHHHHHH。
在优选的实施方案中，编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID No.3：atgcgcggtatgctgccgttatttgaaccgaaaggtcgtgtgctgctggttgatggtcatcacttagcatatcgtacctttcatgccctgaaaggcctgaccacctctcgcggcgaaccggttcaggcagtgtatggttttgccaaatcactgctgaaagcattaaaagaagatggcgatgcagtgattgttgtgtttgatgccaaagccccgagctttcgtcatgaagcctatggcggctacaaagcaggtcgcgccccgaccccggaagattttccgcgtcagctggccttaattaaagaattagttgacttgctgggcttagcacgtctggaagttccgggctatgaagcagatgatgttttagcctcactggccaaaaaagccgaaaaagaaggctatgaagttcgcattctgaccgcagataaggatctgtatcagctgctgagcgatcgtattcatgtgttacatccggaaggctatctgattaccccggcatggttatgggaaaaatatggtttacgtccggatcagtgggcagattatcgtgcactgaccggtgacgaatcagataatctgccgggcgttaaaggtattggtgaaaaaaccgcccggaaattattagaagaatggggtagtctggaagcattactgaaaaatctggatcgcctgaaaccggcaattcgcgaaaaaattttagcccacatggatgacttaaaactgtcttgggatctggccaaagtgcgtaccgatctgccgttagaagttgattttgccaaacgtcgcgaaccggatcgtgaacgcctacgagcctttctggaacgcttagaatttggctcactgttacatgaatttggcttactggaatctccgaaagcattagaagaagccccgtggccgccgccggaaggcgcctttgtgggctttgtgctgagtaggaaagaaccgatgtgggcagacttgctggccctggccgcagcacgcggcggtcgcgttcatcgtgccccggaaccgtacaaagccctgcgtgacctgaaagaagcacgcggcttattagccaaagacctgagtgttctggcattaagggaaggcttaggcctgccgccgggcgatgatccgatgctgctggcctatctgcttgacccgagtaataccaccccggaaggcgttgcacgtcgctatggcggcgagtggaccgaagaagcaggcgaacgtgcagccctgtcagaacgtctgtttgccaatctgtggggtcgcttagaaggcgaagaacgcttactgtggttatatcgtgaagtggaacgtccgctgagcgcagtgctggcacacatggaagccaccggtgtgcgcttagatgttgcatatctgcgtgccctgtctctggaagttgcagaagaaattgcacgcttagaagccgaagtttttcgcttagcaggtcatccgtttaacttaaatagtcgcgatcagctggaaagggttctgtttgatgaattaggcctgccggcaattggcaagaccgaaaaaaccggtaaacgctctacctcagccgcagttctggaagccctgcgcgaagcccatccgattgttgaaaaaattttacagtatcgtgaactgaccaaactgaaatctacctatattgatccgttaccggatctaattcatccgcgtaccggtcgcttacatacccgttttaatcagaccgccaccgccaccggtcgcttatcaagtagcgatccgaacttgcagaatattccggtgcgtaccccgttaggtcagcgcattcgtcgtgcctttattgcagaagaaggttggttattagttgcattagattatagtcagattgaactgcgtgtgttagcccatctgagcggcgacgaaaatctgattcgtgtgtttcaggaaggtcgcgatattcataccgaaaccgcctcttggatgtttggtgttccgcgcgaagcagttgatccgttaatgcgccgtgcagccaaaaccattaattttggtgtgctgtatggtatgagcgcacatcgcctgtcacaggaactggcaattccgtatgaagaagcacaggcctttattgaacgctattttcagtcttttccgaaagttcgcgcatggattgaaaaaaccttagaagaaggtcgtcgtcgcggctatgtggaaaccctgtttggtcgtcgtcgctatgttccggatctggaagcgagagttaaatcagtgcgtgaagccgccgaacgcatggcctttaatatgccggttcagggaacggcagctgaccttatgaaactggcaatggttaaactgtttccgcgcctggaagaaatgggtgcacgaatgctgttacaggttcatgatgaattagttctggaagccccgaaagaacgcgccgaagcagttgcacgtctggccaaagaagtgatggaaggtgtgtatccgttagcagttccgttagaagtggaagtgggtattggtgaagattggctgagcgccaaagaaggttctggcagttcaggtcatcaccaccatcatcactaa。
在可选的实施方式中，使得沿5'-3'方向的核酸外切酶活性降低的突变是N-端缺失(称为“截短的Taq DNA聚合酶”)，得到的突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
N-端缺失后且C-端包含His标签的野生型Taq DNA聚合酶(即“截短的Taq DNA聚合酶”)的氨基酸序列SEQ ID No.2：MSPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKEGSGSSGHHHHHH。
在优选的实施方案中，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQID No.4所示。
编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID No.4：atgtctccgaaagcattagaagaagccccgtggccgccgccggaaggcgcctttgtgggctttgtgctgagtaggaaagaaccgatgtgggcagacttgctggccctggccgcagcacgcggcggtcgcgttcatcgtgccccggaaccgtacaaagccctgcgtgacctgaaagaagcacgcggcttattagccaaagacctgagtgttctggcattaagggaaggcttaggcctgccgccgggcgatgatccgatgctgctggcctatctgcttgacccgagtaataccaccccggaaggcgttgcacgtcgctatggcggcgagtggaccgaagaagcaggcgaacgtgcagccctgtcagaacgtctgtttgccaatctgtggggtcgcttagaaggcgaagaacgcttactgtggttatatcgtgaagtggaacgtccgctgagcgcagtgctggcacacatggaagccaccggtgtgcgcttagatgttgcatatctgcgtgccctgtctctggaagttgcagaagaaattgcacgcttagaagccgaagtttttcgcttagcaggtcatccgtttaacttaaatagtcgcgatcagctggaaagggttctgtttgatgaattaggcctgccggcaattggcaagaccgaaaaaaccggtaaacgctctacctcagccgcagttctggaagccctgcgcgaagcccatccgattgttgaaaaaattttacagtatcgtgaactgaccaaactgaaatctacctatattgatccgttaccggatctaattcatccgcgtaccggtcgcttacatacccgttttaatcagaccgccaccgccaccggtcgcttatcaagtagcgatccgaacttgcagaatattccggtgcgtaccccgttaggtcagcgcattcgtcgtgcctttattgcagaagaaggttggttattagttgcattagattatagtcagattgaactgcgtgtgttagcccatctgagcggcgacgaaaatctgattcgtgtgtttcaggaaggtcgcgatattcataccgaaaccgcctcttggatgtttggtgttccgcgcgaagcagttgatccgttaatgcgccgtgcagccaaaaccattaattttggtgtgctgtatggtatgagcgcacatcgcctgtcacaggaactggcaattccgtatgaagaagcacaggcctttattgaacgctattttcagtcttttccgaaagttcgcgcatggattgaaaaaaccttagaagaaggtcgtcgtcgcggctatgtggaaaccctgtttggtcgtcgtcgctatgttccggatctggaagcgagagttaaatcagtgcgtgaagccgccgaacgcatggcctttaatatgccggttcagggaacggcagctgaccttatgaaactggcaatggttaaactgtttccgcgcctggaagaaatgggtgcacgaatgctgttacaggttcatgatgaattagttctggaagccccgaaagaacgcgccgaagcagttgcacgtctggccaaagaagtgatggaaggtgtgtatccgttagcagttccgttagaagtggaagtgggtattggtgaagattggctgagcgccaaagaaggttctggcagttcaggtcatcaccaccatcatcactaa。
在可选的实施方式中，所述Taq DNA聚合酶变体通过SEQ ID No.2所示的序列的N-端缺失的核酸外切酶结构域产生结构缺陷来制备。具体地，所述Taq DNA聚合酶变体包含将SEQ ID No.1所示的野生型Taq DNA聚合酶的507、520、537和578位置上至少一个氨基酸残基被取代得到的突变体。进一步地，所取代的突变体分别为507K、520K、537K和578R。这些经过修饰的DNA变体或者其同系物相对于其相应的“截短的Taq DNA聚合酶”因为N-端缺失而消除了5'-3'核酸外切酶活性，从而具有增强的链显示活性。
在可选的实施方式中，所述Taq DNA聚合酶变体适用于进行PCR、LAMP和PCDR方法扩增DNA。
本文中使用的术语“DNA模板”或“模板”是指聚合酶所使用的用于合成新互补核酸的核酸。
术语“DNA聚合酶变体”或“经修饰的DNA聚合酶”是指通过定点或随机突变、插入、缺失、重组和/或任何其他蛋白质工程方法获得的A型聚合酶家族中的任何DNA聚合酶，这些方法使得DNA聚合酶的氨基酸序列与对应的野生型DNA聚合酶不同。
术语“野生型DNA聚合酶”、“野生型酶”或“野生型”是指自然界中发现的一种具有某种氨基酸序列的DNA聚合酶或其片段。
术语“核酸分子”或“核酸”表示源于cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA、肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)的任何单链或双链核酸分子。
术语“变体”是指从其原始形式(亲本/野生型，WT)进行了修饰但至少保留了与野生型酶相同的酶功能特性的酶。具体地，本文中的“变体”表示相对于对应的天然存在的未修饰野生型DNA聚合酶，酶的链显示活性增加。
术语“突变”是指单个或多个核苷酸三联体的取代或替换；一个或多个密码子的插入或缺失；不同基因之间的同源或异源重组；在编码序列的任一端进行的附加编码序列的融合；附加编码序列的缺失或插入；或这些方法的任意组合，从而产生编码所需蛋白的多核苷酸序列。因此，术语“突变”还指由一种或多种上述变化修饰的多核苷酸序列编码的多肽序列的所有变化。氨基酸残基缩写为单字母或三字母常用氨基酸代码。
本文所使用的“链置换活性”是指酶(如DNA聚合酶)在与模板依赖性核酸合成结合并接近模板依赖性核酸合成的情况下，导致配对核酸与其互补链沿5'→3'方向解离的现象。链置换在配对核酸序列的5'端处开始，因此酶可以进行核酸合成。新合成的核酸和经置换的核酸通常具有相同的核苷酸序列，所述核苷酸序列与模板核酸链互补。链置换活性可存在于与赋予核酸合成活性，特别是DNA合成活性的分子相同的分子上。
本文所使用的DNA聚合酶的“较强链置换活性”允许使用酶进行LAMP反应，其方式类似于Bst聚合酶的大片段。
本文中称为“截短后的”Taq DNA聚合酶并显示出5'-3'外切酶活性降低的DNA聚合酶的衍生物可以是截短形式的WT酶，即天然酶的N端最多缺失280个氨基酸。US5436149中介绍了这种突变酶的具体实施方式。
在以下实施例中，提供了本发明中的Taq DNA聚合酶变体和制备方法，还提供了通过该方法制备的Taq DNA聚合酶变体的催化特性的测定方法。这些实施例仅仅是用来证明本发明的目的，不得解释为以任何方式来限制本发明的保护范围。就所有目的而言，本文所引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用完整地纳入本文中。
以下为本发明涉及的突变酶和Taq DNA聚合酶变体的检测方法：
本发明中的Taq DNA聚合酶变体是具有较强的链置换活性的突变的热稳定性DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶变体既适用于等温扩增也适用于PCR扩增。所述Taq DNA聚合酶变是通过Taq DNA聚合酶设计得到，并具有5′-3′聚合酶和5′-3′链置换活性。通过截短TaqDNA聚合酶的N-端核酸外切酶结构域，可以降低5′-3′核酸外切酶活性，同时通过取代一个或多个氨基酸来实现5′-3′链置换活性。
编码截短的(核酸外切酶缺失)Taq DNA聚合酶的核酸由美国Twist Bioscience公司合成，并克隆至pUC19质粒(购自美国New England Biolabs公司)中。为了更容易纯化，在C-端添加了His标签。对得到的质粒载体pUC19-Taq Truncated进行纯化，并通过测序验证编码聚合酶的核苷酸序列。根据推荐的突变形成方案，采用美国Eton Bioscience公司的引物和美国New England Biolabs公司的Q5热启动超保真2×Master Mix通过PCR方法将单个突变引入pUC19-Taq Truncated载体。PCR产物转化至T7 Express Competent E.coli(HighEfficiency)(购自美国New England Biolabs公司)感受态细胞中。对克隆得到的菌落进行单个测序，以验证与所需的突变的序列的一致性。
温启动Bst 2.0DNA聚合酶、市售的Taq DNA聚合酶、λ-DNA均购自美国New EnglandBiolabs公司。dNTPs购自美国Gold Biotechnology公司。
LAMP反应使用LAMP引物进行。所述LAMP引物购自美国Eton Bioscience公司(根据已公开的技术(Tanner NA,Zhang Y,Evans TC Jr.Visual detection of isothermalnucleic acid amplification using pH-sensitive dyes.Biotechniques.2015Feb 1；58(2):59-68.Doi:10.2144/000114253.PMID:25652028.)设计)。
如上所述，这些实施例仅仅用于证明本发明的技术方案，并非用于限制本发明的保护范围。本发明中没有特别说明的方法、试剂配制、溶液等等诸如此类，均可参考Sambrook等人编著的《Molecular cloning—ALaboratory Manual》。除非另有说明，本发明中的溶液均为水溶液，并采用无菌去离子水配制。
实施例1
本实施例提供了一种Taq DNA聚合酶变体的制备方法，包括以下步骤：
S1、细胞转化和培养
参考《High efficiency transformation of E.coli by high voltageelectroporation》(Nucleic Acids Research,Volume 16,Issue 13,11July 1988,Pages6127–6145,https://doi.org/10.1093/nar/16.13.6127)中的方法，采用质粒pUC19-TaqWT(或其变体)转化T7 Express Competent E.coli(High Efficiency)感受态细胞。在37℃下，转化细胞在15mL LB培养基(含150μg/mL氨苄青霉素)中培养至吸光度值A600nm＝0.3。
S2、诱导表达
用1mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导编码野生型或变体Taq DNA聚合酶的基因表达。在37℃下，将转化细胞继续培养10～12小时。通过离心收集细胞。
S3、蛋白纯化
取5g步骤S2收集的细胞悬浮于1mL缓冲液A(200mmol/L NaCl，20mmol/L磷酸钾，10％甘油)中，用超声波破碎仪以80W功率破碎细胞壁30秒，用冰块冷却。然后以12000rpm转速离心悬浮液，丢弃沉淀。将上清液转入96孔深孔板的指定孔中，使用Thermo Fisher推荐的耗材在Kingfisher Flex纯化系统(Thermo Fisher Scientific，美国)上进行纯化。用于His标签纯化的磁珠(钴螯合Beaver Beads)购自苏州海狸生物医学工程有限公司。经过缓冲液A和缓冲液B(10mmol/L咪唑，10mmol/L pH＝7.5的Tris-HCl，500mmol/L KCl，10％甘油)双重洗涤步骤之后，再用100μL洗脱缓冲液(250mmol/L咪唑，10mmol/L pH＝7.5的Tris-HCl)将蛋白从磁珠上洗脱。通过Pierce Assay方法(Thermo Scientific，美国)测定蛋白浓度，在蛋白样品中中添加甘油使其最终浓度达到50％，然后将其置于-20℃保存。
实施例2
本实施例比较了Taq DNA聚合酶变体和温启动Bst 2.0DNA聚合酶分别用于LAMP反应时的链置换活性和热稳定性。
通过LAMP反应来比较每个变体、野生型截短的Taq聚合酶以及市售的Bst DNA聚合酶的链置换活性。
使用λ-DNA和表1中所列出的引物进行LAMP扩增。引物预先按照如下浓度混合(10×引物混合物)：2μM引物B3，2μM引物F3，16μM引物FIP，6μM引物BIP，4μM引物LoopF和2μM引物LoopB。
表1λ-DNA的引物
引物名称 引物序列
FIP cagccagccgcagcacgttcgctcataggagatatggtagagccgc
BIP gagagaatttgtaccacctcccaccgggcacatagcagtcctagggacagt
F3 ggcttggctctgctaacacgtt
B3 ggacgtttgtaatgtccgctcc
LoopF ctgcatacgacgtgtct
LoopB accatctatgactgtacgcc
LAMP反应体系(25μL)如下：1μg Taq DNA聚合酶(变体或野生型)或16U温启动Bst2.0DNA聚合酶，200nmo/L引物B3，200nmo/L引物F3，1.6μmol/L引物FIP，1.6μmol/L引物BIP，200nmo/L引物LoopF，200nmo/L引物LoopB，1mmol/L dNTPs，20mmol/L pH＝8.8的Tris-HCl，10mmol/L(NH4)2SO4，50mmol/L KCl，7mmol/L MgSO4，0.1％20和200μmol/L BSA，用水补至20μL；将前述反应液升温至65℃，加入5μL模板混合物(4μL水和1μL 1ng/μLλ-DNA)。
所有反应体系在65℃下孵育90min，然后在95℃下变性5min，再向每个反应体系加入5μL终止液(120mmol/L EDTA，30％甘油，50mmol/L pH＝8.0的Tris-HCl，0.0125％溴酚蓝，0.1％SDS和5×Gel Red Nucleic Acid Stain(购自美国加利福尼亚Biotium公司))。
从每个含有终止染料的最终反应体液中取5μL，采用2％琼脂糖凝胶在180V下电泳30min，然后使用紫外透射进行可视化处理，得到的结果如图1所示。从图1中可以看出，本发明中制备的突变的酶变体在LAMP反应中具有与温启动Bst 2.0DNA聚合酶相似的链置换活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶变体包含至少一种经过修饰的Taq DNA聚合酶，所述经过修饰的Taq DNA聚合酶包括将SEQ ID No.1所示的序列上507、520、537及578相对应位置的至少一个氨基酸残基进行取代，以及包括SEQ ID No.1所示的序列的N-端缺失。
2.根据权利要求1所述的具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体，其特征在于，所述经过修饰的Taq DNA聚合酶包含至少一个选自E507K、E520K、E537K或D578R突变体的取代。
3.编码权利要求1或2所述的具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体的基因。
4.含有权利要求3所述的基因的重组表达载体。
5.含有权利要求3所述的基因的表达盒。
6.含有权利要求3所述的基因的重组宿主细胞。
7.权利要求1或2所述的具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将编码所述Taq DNA聚合酶变体的基因克隆至载体中，得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化至宿主细胞，经过细胞培养、诱导表达、纯化后得到所述TaqDNA聚合酶变体。
8.权利要求1或2所述的具有链置换活性的Taq DNA聚合酶变体在基因扩增中作为TaqDNA聚合酶的应用。
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