JP5545562B2 - 自己溶菌耐性細胞及びこれを用いた物質生産方法 - Google Patents
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Description
培養液中における溶菌は、細胞の内容物の放出を伴うものであり、特に細菌を用いた物質生産においては、放出された核酸やタンパク質など目的物以外の好ましくない物質が培養液中に大量に混入する原因となり、目的物の精製のために多大なコストが生じるなど大きな問題になっていた。
外来遺伝子は上記の活性酸素種応答タンパク質を発現できるような構成であれば、既知の利用可能な遺伝子情報などを適宜利用可能であるが、より好ましくは、
(1)活性酸素種応答に係るタンパク質をコードした遺伝子の塩基配列
(2)定常期に糖源として消費される糖(通常はグルコース)以外の糖をインデューサーとするオペロンのプロモーター・オペレーター塩基配列
の2種類の塩基配列を有する外来遺伝子で形質転換されたことを特徴とする、自己溶菌耐性細胞が好適である。(2)のプロモーター・オペレーターに対応するインデューサーを培養液に加えることにより、活性酸素種応答タンパク質の発現をコントロールすることも可能となる。
ここで、(1)活性酸素種応答に係るタンパク質とは、一般に活性酸素種と呼ばれるスーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル、過酸化水素等の分子の除去に係るタンパク質であり、スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼなどが好適な例としてあげられ、特にカタラーゼが好適である。
また上記(2)の塩基配列におけるオペロンとそのインデューサーの組み合わせの例としては、araBAD−アラビノース(オペロン名−インデューサー名、以下同じ)、ilvIH−アセト酪酸、gal−ガラクトース、lac−ラクトース、malXY−マルトース、manXYZ−マンノース、ful−フルクトース、fucAO−フコース、fucPIK−フコース、aga−N−アセチルグルコサミン、xyl−キシロース、mtlAD−マルトース、lct−酪酸、glvCBG−グルコシド、rhaBAD−ラムノース、malK−マルトース、treBC−トレハロースのいずれかより選択されるオペロンのプロモーター・オペレーター領域が好適である。ここでオペロンとは、一群の機能的に関連した構造遺伝子を染色体上にまとめた構造をもち、一括して発現調節される代謝に係る遺伝子群を指し、プロモーター・オペレーター領域はその構造遺伝子の調節に係る塩基配列の領域を指す。インデューサーは前記オペロンを活性化する物質である。インデューサーとして選択される糖は定常期に糖源として消費される糖とは別の糖であることが必要である。
また上記態様におけるプロモーター・オペレーターは、導入した遺伝子の発現を時期特異的にコントロールするために必要であり、前記活性酸素種応答タンパク質をコードした遺伝子の上流に、定常期に糖源として消費される糖(通常はグルコース)とは別の糖のオペロンにおけるプロモーター・オペレーター配列を有するよう設計し、プロモーター・オペレーターに対応するインデューサーを特定の時期に培養液に添加することにより、コントロールを容易にかつ確実にするものである。
本発明の自己溶菌耐性細胞を用いた有機化合物の製造方法としては、本発明の自己溶菌耐性細胞を培地で培養し、培養細胞や培養液等の培養物から所望の有機化合物を採取する方法であれば特に制限されるものではなく、上記自己溶菌耐性細胞に目的とする遺伝子を導入し、目的とする遺伝子を発現させることにより得られる、組換えペプチド・タンパク質や、抗生物質等の所望の有機化合物を効率的に製造することができる。これらのなかでも、実施例にも示すように、自己溶菌耐性細胞としてsodA、katE遺伝子導入株を用いた製造方法は、定常期における自己溶菌が抑制され、より効率的な有機化合物の製造が可能である。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
図1に、katE破壊株におけるOD600(図1a)とCFU(図1b)の時間変化を対照と比較して示した。図1a中、縦軸はOD600値を、横軸は培養開始からの時間経過(時間)を表し、―○―は対照を、―●―はkatE破壊株をそれぞれ表す。図1bでは縦軸がCFUの値(log CFU/ml)を、横軸は培養開始後の時間経過(時間)を表し、シンボルは1aと共通である。グラフが示すとおり、katE破壊株は対照に比べ、OD600値が24時間以降から減少するが、CFUに関してはそれ以前の12時間後から減少しており、活性酸素種応答が働かない細胞ではコロニー形成能を失った細胞が溶菌に先立って現れることが示された。一方、この期間における自己溶菌を培養液に溶出するタンパク質に着目して比較したのが図1c、dであり、図1cは対照の培養液中に溶出したタンパク質のSDS−PAGEの結果であり、図1dはkatE破壊株の培養液中に溶出したタンパク質のSDS−PAGEの結果である。レーンMはマーカー(左隣の数字が分子量kDaを示す)、レーン12,36,60はそれぞれ培養開始後の時間経過(サンプリング時間)を表す。これらの図が示す通り、katE破壊株では60時間後に大量のタンパク質が培養液中に溶出しており、katEの破壊により細胞内の酸化ストレス因子が除去されずに蓄積し、これが自己溶菌へと繋がったことが示された。
図3aは、OD600値を対照(―○―)、sodA導入細胞(―●―)、katE導入細胞(―△―)で比較したもので、縦軸はOD600値を、横軸は時間経過を表す。グラフが示すとおり、培養液中の全細胞数の指標であるOD600値にはほとんど変化が見られなかった。
図3bは、CFUの値を対照(―○―)、sodA導入細胞(―●―)、katE導入細胞(―△―)で比較したもので、縦軸はCFUのlog値を、横軸は時間経過を表す。グラフが示すとおり、コロニー形成能を有する細胞の割合についても対照とsodA、katE導入細胞の間で差は見られなかった。
図3c−eは、培養開始後12時間、36時間、60時間後において培養液中に溶出したタンパク質をSDS−PAGEにて可視化したものである。各々の電気泳動像でレーンMは分子量マーカー(kDa)を、各数字はそれぞれ経過時間を表している。グラフcは対照を、dはsodA導入細胞を、eはkatE導入細胞をそれぞれ示す。電気泳動の結果が示す様に、対照では12時間後から自己溶菌に伴うタンパク質の溶出が観察され、36、60と時間を追うごとにタンパク質の溶出量も増大し、自己溶菌が起こっている様子が観察されたが、sodA、katE導入細胞ではタンパク質の溶出が低く抑えられており、特にkatE導入細胞ではほとんどタンパク質の溶出が観察されなかった。
これらの結果から、sodA、katE導入細胞では、定常期においてコロニー形成能を失う細胞は対照と同じように現れるものの、対照においては速やかに自己溶菌へと進むこれらの細胞が自己溶菌を起こさず、結果として自己溶菌に対して抵抗性を有するようになった事が示された。
図4に、比較の結果を表す。図4aは対照、bはsodA導入細胞、cはkatE導入細胞の結果で、線グラフ(―○―)はOD600値の推移を、棒グラフは細胞内ROSレベルの相対値(対照の9時間=100)をそれぞれ示している。グラフ横軸は培養開始後の時間経過を表す。対照の結果が示すとおり、培養開始後6時間から8時間の間にROSレベルは急上昇し、9時間でこのレベルがピークとなり、その後12時間にかけて減少するものの、12時間後にはこれを引き金に細胞の自己溶菌が起こる(図3c参照)という流れが示された。一方、sodA、katE導入細胞においては、細胞内ROSレベルは9時間後においても対照の20%程度しかなく、アラビノースにより誘導されたsodA、katEが細胞内ROSを除去し、これらの細胞が自己溶菌を起こさないという事が示された。
これらの結果から、大腸菌において、活性酸素種応答遺伝子とアラビノースプロモーターとを含む外来遺伝子で形質転換した場合、自己溶菌に対して抵抗性を有する細胞を作製することができる事が示された。
Claims (4)
- 大腸菌(Escherichia coli)において、カタラーゼまたはスーパーオキシドディスムターゼのいずれかをコードした塩基配列を有する外来遺伝子で形質転換されたことを特徴とする、自己溶菌耐性細胞。
- 大腸菌(Escherichia coli)において、
(1)araBAD、ilvIH、gal、lac、malXY、manXYZ、ful、fucAO、fucPIK、aga、xyl、mtlAD、lct、glvCBG、rhaBAD、malK−lamB、treBCのうちいずれかより選択されるオペロンのプロモーター・オペレーターをコードした塩基配列、及び
(2)カタラーゼまたはスーパーオキシドディスムターゼいずれかをコードした塩基配列の2種類の塩基配列を有する外来遺伝子で形質転換されたことを特徴とする、請求項1に記載の自己溶菌耐性細胞。 - 自己溶菌が高温ストレスによって引き起こされる自己溶菌である、請求項1または請求項2に記載の自己溶菌耐性細胞。
- 請求項1から請求項3のうちいずれか1項に記載の自己溶菌耐性細胞を用いることを特徴とする、物質の生産方法。
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