CN112899262B - 一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法 - Google Patents

一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法，包括如下步骤：(1)向赖氨酸营养缺陷型菌株中导入含赖氨酸脱羧酶基因的质粒，得到重组工程菌；(2)将步骤(1)所得重组工程菌于含赖氨酸的培养基中培养，通过测定OD600筛选表达赖氨酸脱羧酶的重组工程菌。本发明偶联了赖氨酸营养缺陷型菌株的生长状态与赖氨酸脱羧酶的酶活，无需检测底物及产物消耗，更加快速且高效，即实现了大肠杆菌生长状态与赖氨酸脱羧酶酶活偶联，对赖氨酸脱羧酶的定向进化具有深远意义。

Description

一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法。
背景技术
赖氨酸脱羧酶是一种专一对L-赖氨酸进行脱羧反应的生物酶，其催化特点：专一性高，在合适反应条件下具备非常高的酶活；但是存在反应pH范围窄、温度稳定性差等特点。因此，开发一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法对赖氨酸脱羧酶的定向进化具有现实意义。
CRISPR-Cas系统是一种细菌的免疫防御系统，由细菌在长期抵御外源DNA的过程中进化而形成，能够降解入侵的外源DNA(病毒或噬菌体等)，广泛存在于细菌和古细菌中。II型CRISPR-Cas9系统在目前基因编辑方面应用最为广泛。该系统主要由三部分组成：起靶向目的序列的crRNA、能够和crRNA配对连接的tracrRNA以及酶切目的序列的Cas9蛋白。CRISPR序列转录成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基互补配对，形成部分具有双链的RNA结构，进而和Cas9蛋白形成复合体，剪切外源DNA。研究者将crRNA和tracrRNA整合在同一条单链中，设计出了长度为20bp左右的单链引导RNA(single guide RNA，sgRNA)，sgRNA有两个功能，即可以与目的DNA序列互补配对，同时引导Cas9蛋白，实现基因的敲除等功能。近年来，CRISPR-Cas9技术已经广泛应用于微生物的基因组编辑和功能研究，尤其在细菌的基因编辑方面，取得了很大的进展。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法，包括如下步骤：
(1)向赖氨酸营养缺陷型菌株MG1655ΔlysA中导入含赖氨酸脱羧酶cadA基因的质粒ptrc-cadA，得到重组工程菌MG1655ΔlysA/ptrc-cadA(简称MGAA)；
(2)将步骤(1)所得重组工程菌于含赖氨酸的培养基中培养，通过测定OD600筛选表达赖氨酸脱羧酶的重组工程菌。
步骤(1)中，所述赖氨酸营养缺陷型菌株在无外源添加赖氨酸的培养基中不能正常生长。
步骤(1)中，所述赖氨酸营养缺陷型菌株的构建方法为将大肠杆菌工程菌株MG1655中的lysA基因敲除；优选地，利用CRISPR-Cas9编辑技术敲除大肠杆菌工程菌株MG1655中的lysA基因。
步骤(1)中，所述赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
步骤(1)中，含赖氨酸脱羧酶基因的质粒ptrc-cadA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
其中，所述含赖氨酸脱羧酶基因的质粒ptrc-cadA的构建方法为将PCR复制大肠杆菌工程菌株MG1655中的赖氨酸脱羧酶cadA与载体质粒ptrc(pTRC99a(ΔlacO))酶切后连接。
其中，PCR复制的引物中，上游引物带有Nco I酶切位点，下游引物带有BamH I酶切位点。
其中，所述载体质粒ptrc的构建方法为将pTRC99a的lacO部分碱基移除，所述载体质粒ptrc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
步骤(1)中，所述重组工程菌MG1655ΔlysA/ptrc-cadA在无外源添加赖氨酸的培养基中不能正常生长，且在含赖氨酸的培养基中生长受到限制(高活性脱羧酶会消耗赖氨酸，影响重组工程菌的生长；无脱羧酶活性的则没有影响)。
步骤(2)中，所述于含赖氨酸的培养基中培养为先在LB培养基中预培养4-8h，再转接到含赖氨酸的培养基中二次培养10-14h；优选地，所述预培养的时间为6h，所述二次培养的时间为12h。
步骤(2)中，所述培养基为赖氨酸与M9培养基的组合物。
其中，所述培养基中赖氨酸的浓度为0.1-2g/L。
步骤(2)中，所述预培养和培养的温度为34-44℃，优选为37℃。
步骤(2)中，所述通过测定OD600筛选赖氨酸脱羧酶是将MGAA的生长情况与赖氨酸脱羧酶的酶活耦合，因为，赖氨酸脱羧酶在不同酶活下，其对重组工程菌MGAA的生长具有线性影响；具体的，当赖氨酸脱羧酶酶活较高时，其会影响重组工程菌MGAA的生长，从而降低OD600，而当赖氨酸脱羧酶酶活较低时，其不会影响重组工程菌MGAA的生长，从而不会降低OD600。
步骤(2)中，本发明通过测定同一批次不同重组工程菌的OD600，选择1株OD600值最低的重组工程菌，即为能够表达最高酶活的赖氨酸脱羧酶的重组工程菌，或者，选择若干组OD600值较低的重组工程菌，即为能够表达较高酶活的赖氨酸脱羧酶的重组工程菌。通过本发明方法很容易从一批表达不同酶活的赖氨酸脱羧酶的重组工程菌中筛选出能够表达高酶活的赖氨酸脱羧酶的重组工程菌。
进一步地，本发明可以将表达高酶活的赖氨酸脱羧酶的重组工程菌培养，得到高酶活的赖氨酸脱羧酶。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
1、本发明基于赖氨酸营养缺陷型菌株MG1655ΔlysA来筛选赖氨酸脱羧酶，该菌构建简单，易于实现。
2、本发明中的表达赖氨酸脱羧酶质粒ptrc-cadA构建方法简单，且作为cadA定向进化的基础，减少了筛选步骤。
3、本发明偶联了赖氨酸营养缺陷型菌株的生长状态与赖氨酸脱羧酶的酶活，无需检测底物及产物消耗，更加快速且高效，即实现了大肠杆菌生长状态与赖氨酸脱羧酶酶活偶联，对赖氨酸脱羧酶的定向进化具有深远意义。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为验证赖氨酸营养缺陷型菌株MG1655ΔlysA构建胶图，为lysA基因成功敲除胶图。
图2为质粒ptrc-cadA构建示意图。
图3为重组大肠杆菌MG1655ΔlysA/ptrc(无cadA)和MG1655ΔlysA/ptrc-cadA(MGAA，有cadA)在添加赖氨酸的M9培养基中生长图。
图4为赖氨酸脱羧酶的酶活与细胞OD600的线性关系图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术，另外，使用的大肠杆菌MG1655、pTrc99a等材料都是商业化产品，可直接购买。
实施例1：赖氨酸营养缺陷型菌株MG1655ΔlysA的构建
利用CRISPR-Cas9编辑技术首先敲除大肠杆菌MG1655的中lysA基因，其敲除验证胶图如图1所示，获得了赖氨酸营养缺陷型菌株MG1655(ΔlysA)。
实施例2：质粒ptrc-cadA的构建
(1)以大肠杆菌MG1655全基因组为模板，通过常规PCR扩增大肠杆菌MG1655上的赖氨酸脱羧酶(cadA)编码序列。
其中，所用上游引物带有Nco I酶切位点，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物带有BamH I酶切位点，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：
CATGccatggATATGAACGTTATTGCAATATTGAATCAC(SEQ ID No.2)
CGCggatccTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACC(SEQ ID No.3)。
其中，反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃165s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。
(2)将步骤(1)所得序列与载体pTrc99aΔlacO用Takara公司的Nco I和BamH I酶切，酶切反应体系为：10×buffer H 2μL，Nco I 0.5μL，BamH I 0.5μL，基因片段及ptrc载体3μL，H2O 14μL。酶切体系于37℃条件下反应2小时。将酶切产物连接，反应体系为：10×Ligase buffer 1μL，T4 DNA Ligase(Takara)1μL，基因片段7μL，载体1μL。连接于25°反应3小时。
(3)将步骤(2)所得连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pTrc99a-rGCS并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。
(4)将阳性菌株接种至5mL LB/Amp液体培养基，LB/Amp液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒ptrc-cadA。其构建示意图如图2所示。
实施例3：重组大肠杆菌MG1655(ΔlysA)/ptrc-cadA的构建
分别取2μL ptrc-cadA质粒利用热激转化的方法转至赖氨酸氨酸营养缺陷型菌株MG1655ΔlysA中，获得重组大肠杆菌MG1655(ΔlysA)/ptrc-cadA(MGAA)。
实施例4：高通量筛选赖氨酸脱羧酶的实施
M9培养基组分：NH4Cl 10g/L，NaCl 0.5g/L，Na2HPO4·12H2O 17.1g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 0.12g/L，CaCl2 1.1×10-2g/L。
LB培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。
将赖氨酸营养缺陷型菌株MG1655(ΔlysA)/ptrc和重组工程菌MGAA挑取单点接入5mL LB培养基中，37℃预培养6h后，转接含不同浓度赖氨酸的M9培养基中，37℃培养12h后测定细胞生长(OD600)。
结果如图3所示，(1)赖氨酸营养缺陷型菌株MG1655(ΔlysA)在0-1g/L的赖氨酸中生长趋势与赖氨酸浓度一致。(2)当培养基中赖氨酸的浓度为0.5g/L和1g/L时，当cadA表达的赖氨酸脱羧酶有活性时，会消耗培养基中的赖氨酸，使得赖氨酸营养缺陷型菌株生长受到抑制，OD600降低。因此，当对cadA进行定性进化时，可以用上述方法判定突变的cadA的酶活高低。因为该方法只需要测定OD600，可通过酶标仪进行检测，实现高通量筛选。
实施例5：
过对赖氨酸脱羧酶随机突变后，导入MG1655(ΔlysA)后，得到重组工程菌；挑取单菌落接入含1g/L赖氨酸的M9培养基中，37℃培养12h后，测定OD600。分别取OD600为0.2、0.52、0.8、1.5和2的得到重组工程菌，单独培养后，生产赖氨酸脱羧酶并测定酶活，制得图4，其表明酶活与对应细胞OD600有较好的线性关系，可以用OD600来筛选赖氨酸脱羧酶。
其中，赖氨酸脱羧酶酶活定义：1个酶活力单位是指在37℃，pH 7.0下，在10分钟内能转化1毫摩尔底物的酶量。
本发明提供了一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2148
<212> DNA
<213> 赖氨酸脱羧酶(cadA)
<400> 1
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgccatgg atatgaacgt tattgcaata ttgaatcac 39
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcggatcct tattttttgc tttcttcttt caatacc 37
<210> 4
<211> 4159
<212> DNA
<213> 质粒(ptrc)
<400> 4
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120
cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 600
cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 660
gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 720
ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat 780
gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt gcactctcag 840
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tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 960
ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 1020
aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagcaga tcaattcgcg cgcgaaggcg 1080
aagcggcatg catttacgtt gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 1140
gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg 1200
atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca 1260
gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca 1320
ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca 1380
cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 1440
atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 1500
aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 1560
tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 1620
ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc 1680
gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc 1740
cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca 1800
atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac 1860
aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc 1920
agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata 1980
tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca 2040
ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 2100
ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa 2160
ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 2220
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta 2280
agttagcgcg aattgatctg gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct 2340
tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca 2400
taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat 2460
aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa 2520
tgtgtggaat ttcacacagg aaacagacca tggaattcga gctcggtacc cggggatcct 2580
ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg gctgttttgg cggatgagag aagattttca 2640
gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg 2700
gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg 2760
ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa 2820
cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct 2880
ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga 2940
gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc 3000
ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actctttttg tttatttttc taaatacatt 3060
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 3120
ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 3180
gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 3240
tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 3300
ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 3360
tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 3420
atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 3480
gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 3540
caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 3600
ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 3660
ccacgatgcc tacagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 3720
ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 3780
ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 3840
gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 3900
ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 3960
taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 4020
agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 4080
atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 4140
aaaagatcaa aggatcttc 4159
<210> 5
<211> 6289
<212> DNA
<213> 含赖氨酸脱羧酶基因的质粒(ptrc-cadA)
<400> 5
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120
cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180
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ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360
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aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagcaga tcaattcgcg cgcgaaggcg 1080
aagcggcatg catttacgtt gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 1140
gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg 1200
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ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 6060
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tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 6180
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 6240
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttc 6289

Claims (9)

1.一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向赖氨酸营养缺陷型菌株中导入含赖氨酸脱羧酶基因的质粒，得到重组工程菌；
(2)将步骤(1)所得重组工程菌于含赖氨酸的培养基中培养，通过测定OD600筛选表达赖氨酸脱羧酶的重组工程菌；
步骤(1)中，所述赖氨酸营养缺陷型菌株的构建方法为将大肠杆菌工程菌株MG1655中的lysA基因敲除。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含赖氨酸脱羧酶基因的质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含赖氨酸脱羧酶基因的质粒的构建方法为将PCR复制大肠杆菌工程菌株MG1655中的赖氨酸脱羧酶与载体质粒ptrc酶切后连接。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR复制的引物中，上游引物带有Nco I酶切位点，下游引物带有BamH I酶切位点。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述载体质粒ptrc的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含赖氨酸的培养基中赖氨酸的浓度为0.1-2g/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养为先在LB培养基中预培养4-8h，再转接到含赖氨酸的培养基中二次培养10-14h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养的温度为34-44℃。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102925398A (zh) * 2011-08-09 2013-02-13 中国科学院大连化学物理研究所 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸营养缺陷型大肠杆菌的构建及其应用
CN103789292B (zh) * 2013-12-26 2015-10-21 南京工业大学 一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用
KR20160097691A (ko) * 2015-02-09 2016-08-18 씨제이제일제당 (주) 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법
CN104878034B (zh) * 2015-04-17 2018-04-27 上海工业生物技术研发中心 L-赖氨酸基因工程生产菌
CN108795912B (zh) * 2017-05-05 2022-08-02 上海凯赛生物技术股份有限公司 赖氨酸脱羧酶突变体及其应用
CN108796619A (zh) * 2017-05-05 2018-11-13 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 赖氨酸脱羧酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法
CN109652356A (zh) * 2019-02-15 2019-04-19 山东寿光巨能金玉米开发有限公司 一种赖氨酸脱羧酶菌株及其在戊二胺生产中的应用
CN112210521B (zh) * 2019-07-11 2022-06-03 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用

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