CN101220370B - 双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方法和用途，属于基因工程领域。本发明所要解决的技术问题为提供新的高效，安全，能稳定表达的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体。本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，以pGEX-5x-1质粒为骨架，将pGEX-5x-1上的启动子Ptac替换为双歧杆菌的α-淀粉酶基因的启动子AmyO，还含有长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B序列。本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体能广泛适用于以双歧杆菌为受体菌的所有外源基因的表达及其基因工程产品的生产，为本领域的相关应用提供了一种新的载体工具，具有很好的应用前景。

Description

双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方法和用途。

背景技术

双歧杆菌质粒的研究相对较少。1982年，Sgortati等对1461株共24个种的双歧杆菌进行了质粒的检测，发现四个种(总菌株数的20％)的双歧杆菌即长双歧杆菌、球双歧杆菌、星状双歧杆菌以及印度双歧杆菌含有质粒。在GenBank中检索到双歧杆菌质粒的记录也只有16个[NC006843、NC004978、NC004770、NC004769、NC004768、NC004253、NC004252、NC00443、NC004943、NC002635、NC002133、NC003527、Y11549、E17316、X84655、DQ093580]但没有一个是可以直接用于外源基因表达的载体。由于自然界双歧杆菌质粒的稀有性，关于双歧杆菌表达质粒的研究无论从数量还是质量均很薄弱。

穿梭质粒是能在两种或两种以上宿主中复制的质粒，大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒是指在大肠杆菌和双歧杆菌中均能够复制的人工构建的质粒。以大肠杆菌为宿主，有利于转化和重组子的筛选，并能增加所需DNA克隆片段的检出率，利于保存和操作等优势。1990年Marteuzzi等从长双歧杆菌B2577菌株中分离出的隐性质粒pMB1，通过限制性内切酶将pMB1质粒酶切后连接到质粒载体上，对其复制区域的进行了研究，1994年Missich等将pMB1质粒经限制性酶切和连接酶作用，在体外与pcEM一5zf(+)质粒重组，成功地构建了大肠杆菌-长双歧杆菌的穿梭载体pRM1和pRM2^[3]。1996年Rossi，Marteuzzi等以pMB1复制子为基础，构建了大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体pDG7，这是最早关于双歧杆菌表达质粒的报道^[4]。1998年Rossi等以pDG7为基础进一步将此质粒载体改建为质粒pDLI41，pDGA7和pDCO7，分别用以表达荧光假单胞菌脂酶，芽胞杆菌淀粉酶和链霉菌胆固醇氧化酶^[5]，这是最早报道具有实用价值的双歧杆菌表达载体的例子。此后的双歧杆菌表达载体大多以此为骨架进行改造。1997年Matsumura H等以长双歧杆菌质粒为骨架构建了pBLES100表达载体^[6]，2002年TOSHIYUKINakamura等用它表达胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)基因用于实体瘤的基因治疗研究^[7]。

国内对大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体的研究非常有限。2006年韩庆旺等以质粒pDG7、pBCSK(+)、pET-9C为基础，构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pET-1128，并将人内皮抑素基因插入到新构建的表达载体中表达^[7]。2006年，侯鑫等以pMB1复制基因片段和hu启动子为元件，以pMD18-T为骨架，构建了大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pMB-HU，并表达了抑癌基因PTEN，但从源流上讲，与pET-1128一样，均属于pMB1质粒系列^[8]。至于2001年刘文华等报道的转内皮抑素基因双歧杆菌制剂对肺癌的疗效^[9]和任启伟等2004年报道的重组胞嘧啶脱氨酶基因的婴儿双歧杆菌表达胞嘧啶脱氨酶对鼠黑色素瘤B16一F10细胞的杀伤效应研究^[10]，质粒分别是大肠杆菌质粒pBV220和pGEX-1LambdaT，其复制元件均为pBR322的复制序列，稳定性差。虽然pMB1的复制序列来自双歧杆菌，使质粒的稳定性大大改善，但删除了pMB1的复制序列的复制起始位点^[8]，使质粒复制的调控受到影响，在一定程度上影响了质粒的稳定性。而且在上述的报道中，除侯鑫等以双歧杆菌的hu启动子构建的pMB1重组载体外，其余的载体均以大肠杆菌的LacZ或其衍生序列Tac[如pGEX系列载体]制成，需要用IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，异丙基-B-D硫代半乳糖苷)调控才能表达，而IPTG具有一定的毒性，这在很大程度上限制了它在基因治疗和口服疫苗研制中的应用。

总体而言，大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体的构建和优化筛选仍然是双歧杆菌基因工程研究和发展的弱点和重点，上述穿梭载体转化大肠杆菌与双歧杆菌的效率不同，对双歧杆菌转化效率还有待于提高，稳定性也有所欠缺；而且目前的穿梭载体的来源单一，需要有使用新的思路和基本元件构建效率更高、更稳定的穿梭载体，为本领域提供新的载体工具。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种双歧杆菌大肠杆菌穿梭表达载体。

本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，以pGEX-5x-1质粒为骨架，含有双歧杆菌的α-淀粉酶基因的启动子AmyO，还含有长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B序列。

其中，所述双歧杆菌的α-淀粉酶基因的启动子AmyO替换了pGEX-5x-1上的启动子Ptac。

进一步的，上述的pGEX-5x-1质粒缺失了LacIq片段。

进一步的，上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步的，上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体还带有抗性筛选基因。比如：带有氨苄青霉素抗性筛选基因，能使转入上述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的重组菌在含有50μg/ml氨苄青霉素的MRS培养基上生长，用于筛选重组菌。

进一步的，上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体还含有可表达的外源基因。更进一步的，上述的外源基因为人产肠毒素大肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位基因。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种制备上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的方法，该方法包括以下步骤：

a、以双歧杆菌的α-淀粉酶基因的启动子AmyO替换pGEX-5x-1上的Ptac启动子；

b、将长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B序列酶切后连接到步骤a所得的质粒上，转化大肠杆菌，筛选，检测确认后即得。

进一步的，上述方法的步骤a中还要删除pGEX-5x-1质粒的LacIq片段。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供了含有上述所述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的宿主细胞。

进一步的，所述的宿主细胞为双歧杆菌或大肠杆菌。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供上述的宿主细胞在制备口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂中的用途。

本发明所要解决的第五个技术问题是提供一种口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂，该口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂是上述的宿主细胞添加药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的。

本发明中涉及使用的现有的核苷酸序列均能在已发表的本领域学术刊物及GenBank中检索而得，本领域普通技术人员均能在参考本领域教科书或试验手册的基础上完成本发明涉及的分子生物学和细胞生物学试验。

本发明的有益效果为：本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体创造性地采用双歧杆菌质粒pKJ36的复制子作为重组载体在双歧杆菌中稳定复制的基本复制元件，与现有技术中使用的pMB1系列相比，保留了复制起始位点的重复序列，重组质粒的复制受到严格的调控，因此，增加了重组质粒的稳定性，并同时具有双歧杆菌质粒的复制起始元件和大肠杆菌的复制起始元件。另外还创造性地使用双歧杆菌α-淀粉酶基因的启动子作为重组质粒驱动外源基因表达的启动子，一方面该启动子在双歧杆菌中广泛存在，是淀粉代谢的主要酶类，因此，在双歧杆菌中很容易使外源基因高效地表达；另一方面，该启动子不需要特殊的调控因子，很适合在体内表达外源基因，免去了调控因子的毒性(如ITPG)和增加的生产成本，具有良好的生物安全性。本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体中可以用来携带如人产肠毒素大肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位基因等各种外源基因在双歧杆菌或大肠杆菌中表达，使生产得到的重组工程菌具有更高的表达效率，表达量也更为稳定，能广泛应用于制备口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂中，为本领域的相关应用提供了一种新的载体工具，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为pGEX-5x-1，其中的ptac表示tac启动子，引物F表示正向引物，引物R表示正反引物，MCS表示多克隆位点，lacIq表示阻遏蛋白编码区。

图2为pBEX，其中的pAymO表示α-淀粉酶基因启动子，MCS表示多克隆位点，RepB表示长双歧杆菌复制子序列区，bla表示氨苄青霉素抗性基因编码区。

图3为MCS序列及酶切位点，

图4为pGEX-pAymO电泳图谱，其中的P表示质粒pGEX-pAymO(2.5kb)，M表示DNAmarker(lDNA/HindII)。

图5为pBEX电泳图谱，其中的P表示质粒pBEX(3.5kb)，M表示DNA marker(自制PCR产物Marker)。

图6为pBEX-LTB电泳图，其中的M表示DNA marker(自制PCR产物Marker)，1为ltB的PCR产物(390bp)，2为pBEX-LTB质粒与ltB的PCR产物的混合物，3为pBEX-LTB质粒。

图7为pBEX-LTB，其中的ltB表示ETEC-ltB编码区。

图8为pBEX-LTB在双歧杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图，其中的2表示蛋白质marker(上海生工)，1，3-5表示ltB基因在不同时间表达的LTB的产物(8h，4h)，6表示pBEX空白对照。

图9为pBEX-LTB口服活疫苗的保护性试验，其中的A为无重组载体双歧杆菌组大鼠经E44815攻毒后的结果，B为疫苗免疫组大鼠经E44815攻毒后的结果，可见A组较B组出现了严重的小肠涨气。

图10为本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建过程示意图。

图11为用本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体构建表达LTB基因的工程菌的流程图。

具体实施方式

以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。

实施例一本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建

一.以双歧杆菌的α-淀粉酶(amylase)基因(GenBank No：AY240946)的启动子AmyO(位置：599-690nt)替换pGEX-5x-1上的Ptac启动子(183-932)，同时用PCR方法删除pGEX-5x-1上的LacIq片段(位置：3301-4420nt)。

具体步骤如下：

1.用BamHI和SacII酶切切取由上海生物工程技术公司合成的α-淀粉酶基因AmyO(启动子)序列110个碱基对，其5’端添加了M13反向测序引物序列(taaaacgacggccagt)(SEQ IDNO.6)以便于测序。

其构建路线如下：

(1)双歧杆菌α-淀粉酶基因的启动子序列：599 ta aaataaacag catacgttcgcaatagtgca aacgctatca aagaagatga acccccgtta aagggattga agaaaaggaa taaaggagcc690(SEQ ID NO.7)；

(2)

ccgcgg-taaaacgacggccagt(SEQ ID NO.8)是加在599前的M13测序引物序列及SacII酶切位点(下划线)和保护碱基(方框)；

(3)在690号碱基后加BamHI酶切位点和保护碱基序列ggatcc

因此，最后合成的α-淀粉酶基因的启动子序列为：

tcgaccgcggtaaaacgacggccagttaaaataaacagcatacgttcgcaatagtgcaaacgctatcaaagaagatgaacccccgttaaagggattgaagaaaaggaataaaggagccggatccatc(127bp)(SEQ ID NO.9)

(如无特别标注，本发明中说明书中核苷酸序列的默认书写方式均为由从5’端到3’端的方向)。

2.以pGEX-5x-1质粒(序列如SEQ ID NO.2所示，结构简图见附图1)为模板，用高保真Taq DNA聚合酶通过PCR扩增获得载体基本骨架。

PCR引物F为pGEX-5x-1上的多克隆位点(MCS)序列，引物R为LacIq上游序列。是删除pGEX-5x-1上LacIq的的引物序列。

引物序列如下：pF1：

ggatccccgaatt cccg(SEQ ID NO.10)(位置：pGEX-5x-1 934-949，含BamHI酶切位点)；

pR1：

ccgcgg-attcaccaccctgaattgac(SEQ ID NO.11)(位置：pGEX-5x-13320-3301，添加SacII酶切位点)；

PCR扩增条件：95℃4min，(95℃40Sec、52℃30Sec、72℃1min)×30次循环。

结果：获得2387bp的pGEX-5x-1上包括氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌复制起始位点在内的骨架片段。(骨架片段序列如SEQ ID NO.3所示，过程示意图见附图10)

PCR产物用BamHI和SacII双酶切后与AmyO酶切产物连接转化，在氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳鉴定，命名pGEX-pAymO(见附图4)，本次改造所得的质粒明显要比第一步所得到的质粒pGEX-5x-1小1000多个碱基对，测序确认后以Aat II酶切备用。

第二步：

合成长双歧杆菌KJ36质粒(GenBank No：AF139129)的复制蛋白B序列(位置：SEQ IDNO.4所示，在两端添加Aat II酶切位点及保护碱基)，序列片段由上海生工合成，测序确认无误。用PCR大量扩增该序列，

正向引物为：pR1：gcgacgtcgtacttagtacaaaagggga(SEQ ID NO.12)(1-20nt，添加Aat II酶切位点)。

反向引物为：pR2：gcgacgtcatgatgttcgcggttgcg(SEQ ID NO.13)(1020-1002nt，添加Aat II酶切位点)。

PCR扩增条件为：95℃3min，再经95℃50Sec、54℃40Sec、72℃1min的30次循环

pKJ36复制元件(rep B)序列如SEQ ID NO.4所示，其中第5～1018位碱基序列为载入本发明双歧杆菌大肠杆菌穿梭表达载体的序列。

PCR产物经Aat II酶切后连接到第一步所得的质粒对应的Aat II酶切位点。连接，转化，在氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳检测后测序确认，命名为pBEX(电泳检测结果见附图5)。

至此，本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体构建成功，命名为pBEX。全长3509bp(附图10中3个片段的核苷酸之和本应为120+1014+2387＝3521bp，因有2个酶切位点重复，所以应减去重复计算的酶切位点，即减去12个碱基，特此注明)，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。以sacII酶切位点起始序列记作1，该穿梭表达载体的主要特征如下：

(1)1-108bp为M13测序引物和α-淀粉酶基因的启动子序列区。

(2)114-150bp为多克隆位点，依次有BamHI，EcoRI，SmaI，SalI，XhoI和NotI五个单酶切位点。

(3)1569-2429bp为beta-lactamase(bla，氨苄青霉素酶)编码序列，作抗性筛选基因。

(4)559-1410bp为长双歧杆菌的RepB(复制蛋白B)的编码序列。

实施例二使用本发明双歧杆菌大肠杆菌穿梭表达载体构建表达LTB基因的工程菌

本实施例是将人产肠毒素大肠杆菌(缩写：ETEC，卫生部药品鉴定所菌种保藏号：EC44815)的不耐热肠毒素B亚单位(缩写为LTB)的基因(GenBank No：M17874；位置：79-391nt)连接到实施例一制备得到的双歧杆菌大肠杆菌穿梭表达载体pBEX中构建表达LTB基因的穿梭载体pBEX-LTB(见附图11)。显然，实施例一中制备得到的双歧杆菌大肠杆菌穿梭表达载体pBEX还可用于以双歧杆菌为受体菌的所有外源基因的表达及其基因工程产品的生产。

1、使用本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体构建表达LTB基因的工程菌的步骤如下

(1)用PCR扩增ETEC LTB基因并经测序证明无误后用BamHI和EcoRI双酶切后连接到双歧杆菌大肠杆菌穿梭表达载体pBEX的多克隆位点上，构建成转化载体。

PCR正向引物为：LTF：aaggtcgacggatccatgaataaagtaaaatg(SEQ ID NO.14)(加入了BamHI酶切位点)。

反向引物为LTR：acggagctcgaattcttagacatgcttttaaag(SEQ ID NO.15)(加入EcoRI酶切位点)。

PCR扩增条件为：95℃5min，(95℃50Sec、53℃30Sec、72℃1min)×30次循环。

PCR产物经Aat II酶切后连接到第一步所得的质粒对应的Aat II酶切位点。连接转化，在氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳检测后测序确认(见附图6)。

至此，本发明含ETEC LTB基因的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBEX-LTB构建成功，全长3881bp(结构简图如附图7所示)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

(2)以双歧杆菌为受体菌，经去离子水配制的灭菌10％甘油处理后，用电转化法将质粒载体转化到受体菌中。转化条件为：15KV、200Ω、25μF。

(3)将转化处理后的双歧杆菌先在无抗菌素的MRS液体培养基中复苏60-120min，然后在含50μg/ml氨苄青霉素的MRS固体培养基上厌氧培养，选择抗性菌落，从而获得转ETECLTB基因的双歧杆菌。

PCR和SDS-PAGE鉴定后的阳性克隆即为双歧杆菌-ETEC LTB重组载体的种子菌。如此反复接种培养至继代培养不低于15代时PCR检测证实LTB仍然阳性的克隆作为种子菌用于大规模液体接种扩增培养，培养物经离心浓缩，进一步制备成转ETEC LTB基因的双歧杆菌-ETEC LTB重组菌。

2、用SDS-PAGE电泳试验检测LTB是否在上述大规模液体接种扩增培养的双歧杆菌-ETECLTB重组菌中的稳定表达，结果见附图8。从附图8中可以看出LTB在受体双歧杆菌中能够稳定和高效率的表达。

实施例三使用本发明双歧杆菌-ETEC LTB重组菌制备口服活疫苗及该疫苗的药效验证

1、将实施例2制备的双歧杆菌-ETEC LTB重组菌制成乳酸发酵制剂、片剂和胶囊制剂的双歧杆菌-ETEC LTB重组载体口服活疫苗，用于预防和治疗ETEC引发腹泻性疾病。也可以作为所有口服疫苗的粘膜免疫佐剂。

2、口服活疫苗的药效验证

1)试验分组(20日龄雄性昆明大鼠30只，随机分成下述3组)：

疫苗免疫组、无重组载体的双歧杆菌对照组和PBS对照组。

2)昆明大鼠灌胃免疫试验(4.0×10⁹细菌/只)：

无重组载体的双歧杆菌对照组：用不含LTB的pBEX转化的双歧杆菌灌胃，在第0d，7d，14d和第21d灌胃共4次；

PBS对照组：用PBS分别灌胃，在第0d，7d，14d和第21d灌胃共4次；

疫苗免疫组：用上述双歧杆菌-ETEC LTB重组载体口服活疫苗(胶囊)灌胃，在第0d，7d，14d和第21d灌胃共4次；

第21d后用E44815大肠杆菌(4.0×10¹¹细菌/只)对疫苗免疫组、PBS对照组和无重组载体的双歧杆菌对照组的大鼠进行灌胃攻毒试验，24h后解剖观察。

3)试验结果：

无重组载体的双歧杆菌对照组和PBS对照组的大鼠100％出现了很严重的小肠涨气，且肠液分泌较多(由于种属差异，不产生腹泻症状)，而疫苗免疫组有明显的保护作用，小肠涨气均很轻微，100％没有明显的肠液分泌(对比结果见附图9)，证明本发明双歧杆菌-ETECLTB重组菌口服活疫苗对大肠杆菌产生的LT肠毒素产生了较好的免疫保护作用。

由上述实施例可见，本发明穿梭表达载体稳定性高，在双歧杆菌中很容易使外源基因高效地表达，免去了调控因子的毒性(如IPTG)和增加的生产成本，具有良好的生物安全性，在基因治疗和口服疫苗研制中有很好的应用前景，为相关领域的应用提供了新的选择。

参考文献

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SEQUENCE LISTING

<110>重庆医科大学

<120>双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方法和用途

<130>A080009K

<160>15

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>3509

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>1

ccgcggtaaa acgacggcca gttaaaataa acagcatacg ttcgcaatag tgcaaacgct     60

atcaaagaag atgaaccccc gttaaaggga ttgaagaaaa ggaataaagg agccggatcc    120

ccgaattccc gggtcgactc gagcggccgc atcgtgactg actgacgatc tgcctcgcgc    180

gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt    240

gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg    300

ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat aattcttgaa    360

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt    420

cttagacgtc gtacttagta caaaagggga gcgaacttag tacaaaaggg gagcgaactt    480

agtacaaaag gggagcgaac ttagtacaaa aggggagcga acttagtaaa taaataaact    540

ttgtactagt atggagtcat gtccaatgag atcgtgaagt tcagcaacca gttcaacaac    600

gtcgcgctga agaagttcga cgccgtgcac ctggacgtgc tcatggcgat cgcttcaagg    660

gtgagggaga agggcacggc cacggtggag ttctcgttcg aggagctgcg cggcctcatg    720

cgattgagga agaacctgac caacaagcag ctggccgaca agatcgtgca gacgaacgcg    780

cgcctgctgg cgctgaacta catgttcgag gattcgggca agatcatcca gttcgcgctg    840

ttcacgaagt tcgtcaccga cccgcaggag gcgactctcg cggttggggt caacgaggag    900

ttcgcgttcc tgctcaacga cctgaccagc cagttcacgc gcttcgagct ggccgagttc    960

gccgacctca agagcaagta cgccaaggag ttctacaggc gcgccaagca gtaccgcagc    1020

tcgggaatct ggaagatcag ccgcgatgag ttctgccgac tgcttggcgt atccgattcc    1080

acggcaaaat ccaccgccaa cctgaacagg gtcgtgctga agacgatcgc cgaagagtgt    1140

gggcctctcc ttggcctgaa gatcgagcgc cagtacgtga aacgcaggct gtcgggcttc    1200

gtgttcacgt tcgcccgcga gacccctccg gtgatcgacg ccaggcccgt ggaggcgagg    1260

aagacggacg gcgacggcaa gggccattgg acgagcgtgg cggggtacgg cgaggtgttc    1320

acgaccacgg agctgttcga cgtgacggcc gcgcgtgacc acttcgacgg caccgtggag    1380

gccggggaat gccgtttcct gcgcgtttga cgcgcgcaac cgcgaacatc atgacgtcag    1440

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt    1500

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa    1560

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt    1620

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt    1680

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt    1740

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg    1800

tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga    1860

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa    1920

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga    1980

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa    2040

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca    2100

ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta    2160

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac    2220

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc    2280

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag    2340

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga    2400

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt    2460

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata    2520

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag    2580

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa    2640

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt    2700

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc    2760

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa    2820

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa    2880

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc    2940

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa    3000

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa    3060

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg    3120

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc    3180

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg    3240

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg    3300

agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg    3360

aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc    3420

gcataaattc cgacaccatc gaatggtgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc    3480

cggaagagag tcaattcagg gtggtgaat                                      3509

<210>2

<211>4972

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>2

agcttatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg     60

gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt    120

tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc    180

tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca    240

cacaggaaac agtattcatg tcccctatac taggttattg gaaaattaag ggccttgtgc    300

aacccactcg acttcttttg gaatatcttg aagaaaaata tgaagagcat ttgtatgagc    360

gcgatgaagg tgataaatgg cgaaacaaaa agtttgaatt gggtttggag tttcccaatc    420

ttccttatta tattgatggt gatgttaaat taacacagtc tatggccatc atacgttata    480

tagctgacaa gcacaacatg ttgggtggtt gtccaaaaga gcgtgcagag atttcaatgc    540

ttgaaggagc ggttttggat attagatacg gtgtttcgag aattgcatat agtaaagact    600

ttgaaactct caaagttgat tttcttagca agctacctga aatgctgaaa atgttcgaag     660

atcgtttatg tcataaaaca tatttaaatg gtgatcatgt aacccatcct gacttcatgt     720

tgtatgacgc tcttgatgtt gttttataca tggacccaat gtgcctggat gcgttcccaa     780

aattagtttg ttttaaaaaa cgtattgaag ctatcccaca aattgataag tacttgaaat     840

ccagcaagta tatagcatgg cctttgcagg gctggcaagc cacgtttggt ggtggcgacc     900

atcctccaaa atcggatctg atcgaaggtc gtgggatccc cgaattcccg ggtcgactcg     960

agcggccgca tcgtgactga ctgacgatct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa    1020

acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga    1080

gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga    1140

cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata attcttgaag acgaaagggc ctcgtgatac    1200

gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt    1260

ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt    1320

atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta    1380

tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg    1440

tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac    1500

gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg    1560

aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc    1620

gtgttgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg    1680

ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat    1740

gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg    1800

gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg    1860

atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc    1920

ctgcagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt    1980

cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct    2040

cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc    2100

gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca    2160

cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct    2220

cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt    2280

taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga    2340

ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca    2400

aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac    2460

caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg    2520

taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag    2580

gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac    2640

cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt    2700

taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg    2760

agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc    2820

ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc    2880

gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc    2940

acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa    3000

acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt    3060

tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg    3120

ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag    3180

agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcataaatt    3240

ccgacaccat cgaatggtgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga    3300

gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg    3360

gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa    3420

cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac    3480

aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc    3540

acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg    3600

tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc    3660

ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca    3720

ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga    3780

cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc    3840

tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg    3900

cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag    3960

cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga    4020

atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa    4080

tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg    4140

acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc    4200

gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga    4260

agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata    4320

cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt    4380

cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag    4440

gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga    4500

taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg gattcactgg ccgtcgtttt    4560

acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc    4620

ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt    4680

gcgcagcctg aatggcgaat ggcgctttgc ctggtttccg gcaccagaag cggtgccgga    4740

aagctggctg gagtgcgatc ttcctgaggc cgatactgtc gtcgtcccct caaactggca    4800

gatgcacggt tacgatgcgc ccatctacac caacgtaacc tatcccatta cggtcaatcc    4860

gccgtttgtt cccacggaga atccgacggg ttgttactcg ctcacattta atgttgatga    4920

aagctggcta caggaaggcc agacgcgaat tatttttgat ggcgttggaa tt            4972

<210>3

<211>2387

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>3

ggatccccga attcccgggt cgactcgagc ggccgcatcg tgactgactg acgatctgcc     60

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca    120

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    180

ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtataatt    240

cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa    300

tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt    360

tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc    420

ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc    480

ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa    540

aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg    600

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag     660

ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc     720

gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta     780

cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg     840

cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca     900

acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac     960

caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat    1020

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg    1080

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata    1140

aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta    1200

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa    1260

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag    1320

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg    1380

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact    1440

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg    1500

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc    1560

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata    1620

ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta    1680

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc    1740

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg    1800

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac    1860

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg    1920

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt    1980

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct    2040

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg    2100

ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata    2160

accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca    2220

gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc    2280

tgtgcggtat ttcacaccgc ataaattccg acaccatcga atggtgcaaa acctttcgcg    2340

gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaat                  2387

<210>4

<211>1020

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>第5～1018位碱基序列为载入本发明双歧杆菌大肠杆菌穿梭表达载体的序列

<400>4

ggccgacgtc gtacttagta caaaagggga gcgaacttag tacaaaaggg gagcgaactt      60

agtacaaaag gggagcgaac ttagtacaaa aggggagcga acttagtaaa taaataaact     120

ttgtactagt atggagtcat gtccaatgag atcgtgaagt tcagcaacca gttcaacaac     180

gtcgcgctga agaagttcga cgccgtgcac ctggacgtgc tcatggcgat cgcttcaagg     240

gtgagggaga agggcacggc cacggtggag ttctcgttcg aggagctgcg cggcctcatg     300

cgattgagga agaacctgac caacaagcag ctggccgaca agatcgtgca gacgaacgcg     360

cgcctgctgg cgctgaacta catgttcgag gattcgggca agatcatcca gttcgcgctg     420

ttcacgaagt tcgtcaccga cccgcaggag gcgactctcg cggttggggt caacgaggag     480

ttcgcgttcc tgctcaacga cctgaccagc cagttcacgc gcttcgagct ggccgagttc     540

gccgacctca agagcaagta cgccaaggag ttctacaggc gcgccaagca gtaccgcagc     600

tcgggaatct ggaagatcag ccgcgatgag ttctgccgac tgcttggcgt atccgattcc     660

acggcaaaat ccaccgccaa cctgaacagg gtcgtgctga agacgatcgc cgaagagtgt     720

gggcctctcc ttggcctgaa gatcgagcgc cagtacgtga aacgcaggct gtcgggcttc     780

gtgttcacgt tcgcccgcga gacccctccg gtgatcgacg ccaggcccgt ggaggcgagg     840

aagacggacg gcgacggcaa gggccattgg acgagcgtgg cggggtacgg cgaggtgttc     900

acgaccacgg agctgttcga cgtgacggcc gcgcgtgacc acttcgacgg caccgtggag     960

gccggggaat gccgtttcct gcgcgtttga cgcgcgcaac cgcgaacatc atgacgtcgc    1020

<210>5

<211>3881

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>第115～500位碱基序列为LTB基因序列

<220>

<221>gene

<222>(115)..(500)

<223>第115～500位碱基序列为LTB基因序列

<400>5

ccgcggtaaa acgacggcca gttaaaataa acagcatacg ttcgcaatag tgcaaacgct      60

atcaaagaag atgaaccccc gttaaaggga ttgaagaaaa ggaataaagg agccggatcc     120

atgaataaag taaaatttta tgttttattt acggcgttac tatcctctct atgtgcacac     180

ggagctcctc agtctattac agaactatgt tcggaatatc acaacacaca aatatatacg     240

ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc     300

attaatttaa gagcggcgca acatttcagg tcgaagtccc gggcagtcaa catatagact     360

cccaaaaaaa agccattgaa aggatgaagg acacattaag aatcacatat ctgaccgaga     420

ccaaaattga taaattatgt gtatggaata ataaaacccc caattcaatt gcggcaatca     480

gtatggaaaa ctaggaattc ccgggtcgac tcgagcggcc gcatcgtgac tgactgacga     540

tctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga     600

cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag     660

cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt     720

ataattcttg aagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga     780

taataatggt ttcttagacg tcgtacttag tacaaaaggg gagcgaactt agtacaaaag     840

gggagcgaac ttagtacaaa aggggagcga acttagtaca aaaggggagc gaacttagta     900

aataaataaa ctttgtacta gtatggagtc atgtccaatg agatcgtgaa gttcagcaac     960

cagttcaaca acgtcgcgct gaagaagttc gacgccgtgc acctggacgt gctcatggcg    1020

atcgcttcaa gggtgaggga gaagggcacg gccacggtgg agttctcgtt cgaggagctg    1080

cgcggcctca tgcgattgag gaagaacctg accaacaagc agctggccga caagatcgtg    1140

cagacgaacg cgcgcctgct ggcgctgaac tacatgttcg aggattcggg caagatcatc    1200

cagttcgcgc tgttcacgaa gttcgtcacc gacccgcagg aggcgactct cgcggttggg    1260

gtcaacgagg agttcgcgtt cctgctcaac gacctgacca gccagttcac gcgcttcgag    1320

ctggccgagt tcgccgacct caagagcaag tacgccaagg agttctacag gcgcgccaag    1380

cagtaccgca gctcgggaat ctggaagatc agccgcgatg agttctgccg actgcttggc    1440

gtatccgatt ccacggcaaa atccaccgcc aacctgaaca gggtcgtgct gaagacgatc    1500

gccgaagagt gtgggcctct ccttggcctg aagatcgagc gccagtacgt gaaacgcagg    1560

ctgtcgggct tcgtgttcac gttcgcccgc gagacccctc cggtgatcga cgccaggccc    1620

gtggaggcga ggaagacgga cggcgacggc aagggccatt ggacgagcgt ggcggggtac    1680

ggcgaggtgt tcacgaccac ggagctgttc gacgtgacgg ccgcgcgtga ccacttcgac    1740

ggcaccgtgg aggccgggga atgccgtttc ctgcgcgttt gacgcgcgca accgcgaaca    1800

tcatgacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt    1860

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat    1920

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt    1980

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg    2040

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga    2100

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc    2160

tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac    2220

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg    2280

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca    2340

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg    2400

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg    2460

acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg    2520

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag    2580

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg    2640

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct    2700

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac    2760

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact    2820

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga    2880

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt    2940

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct    3000

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc    3060

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc    3120

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc    3180

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg    3240

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agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg    3420

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gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt    3600

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta    3660

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt    3720

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg    3780

gtatttcaca ccgcataaat tccgacacca tcgaatggtg caaaaccttt cgcggtatgg    3840

catgatagcg cccggaagag agtcaattca gggtggtgaa t                        3881

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>artificial

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<223>artificial

<400>6

taaaacgacg gccagt                                                    16

<210>7

<211>92

<212>DNA

<213>artificial

<220>

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taaagggatt gaagaaaagg aataaaggag cc                                  92

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<223>artificial

<400>8

tcgaccgcgg taaaacgacg gccagt                                                     26

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<211>127

<212>DNA

<213>artificial

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<223>artificial

<400>9

tcgaccgcgg taaaacgacg gccagttaaa ataaacagca tacgttcgca atagtgcaaa     60

cgctatcaaa gaagatgaac ccccgttaaa gggattgaag aaaaggaata aaggagccgg    120

atccatc                                                              127

<210>10

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<212>DNA

<213>artificial

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<223>artificial

<400>10

attaggatcc ccgaattccc g                                                          21

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<212>DNA

<213>artificial

<220>

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tcgaccgcgg attcaccacc ctgaattgac                                                 30

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<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>12

gcgacgtcgt acttagtaca aaagggga                                                   28

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>artificial

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<223>artificial

<400>13

gcgacgtcat gatgttcgcg gttgcg                                                     26

<210>14

<211>32

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

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aaggtcgacg gatccatgaa taaagtaaaa tg                                              32

<210>15

<211>33

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>15

acggagctcg aattcttaga catgctttta aag                                             33

Claims (10)

1.一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于：以缺失了LacIq片段的pGEX-5x-1质粒为骨架，将pGEX-5x-1上的启动子Ptac替换成双歧杆菌的α-淀粉酶基因的启动子AmyO；还含有长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B的编码序列和抗性筛选基因序列；其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于：其固有的多克隆位点还连接有可表达的外源基因。

3.根据权利要求2所述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于所述的外源基因为人产肠毒素大肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位。

4.含有权利要求1所述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的宿主细胞。

5.含有权利要求2所述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的含有双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为双歧杆菌或大肠杆菌。

7.含有权利要求3所述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的宿主细胞。

8.根据权利要求7所述的含有双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为双歧杆菌或大肠杆菌。

9.权利要求7或8所述的宿主细胞在制备口服疫苗中的用途。

10.一种口服疫苗，其特征在于：是由权利要求7或8所述的宿主细胞添加药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的。

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