CN112538104B - 构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达及纯化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber‑2蛋白表达及纯化的方法。通过特定模板扩增Fiber‑2目的片段和PET‑32a‑T7‑TrxA载体片段，然后进行同源重组得到重组质粒PET‑32a‑T7‑TrxA‑Fiber2转化至Shuffle T7‑B感受态细胞进行Fiber‑2蛋白的表达，提高Fiber‑2蛋白的可溶性。并通过重组质粒上带有的his标签进行蛋白纯化并获得足够的蛋白量，为后续的亚单位疫苗的制备及免疫原性实验奠定基础。

Description

构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达及纯化的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达及纯化的方法。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAV)属于腺病毒科禽腺病毒属，根据群特异性抗原的不同分为3个群：I群禽腺病毒包括从不同禽类分离得到的各血清型毒株，具有相同的群特异性抗原，根据RELP技术可以将I群禽腺病毒分为A-E五个基因型，根据血清交叉中和反应可以分为12个血清型(血清型1-7、8a、8b、9-11)，其中血清1型、4型和8型的禽腺病毒在我国造成了严重的经济损失，血清1型禽腺病毒代表株为鸡胚致死孤儿病毒(CELOV)，血清4型禽腺病毒能导致心包积液综合征的，血清8型禽腺病毒可以导致严重的包涵体肝炎。Ⅱ群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒(HEV)、雉鸡大理石脾病病毒(MSDV)和禽类脾肿大病毒(AASV)Ⅲ群禽腺病毒包括减蛋综合征病毒(EDSV)。血清4型禽腺病毒为无囊膜，正二十面体对称的病毒粒子。病毒核衣壳有252个壳粒，其中有240个是六邻体，12个是五邻体。

Fiber-2蛋白是禽腺病毒表面重要结构蛋白，由尾部、茎部和头部组成，Fiber-2蛋白与细胞表面受体结合，以协助病毒粒子进入细胞，其对病毒毒力及组织拓扑性有着重要的影响。

又因多数的异源蛋白在大肠杆菌中高效表达时通常以包涵体的形式存在，因此需解决蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的一些问题。专利CN 108300728 A公开了一种TrxA和SUMO双促溶表达标签序列及应用。将SUMO和TrxA双促溶表达标签序列应用于原核表达载体的外源蛋白编码基因上游，作为促溶标签与外源基因同时融合表达，显著促进所表达的外源蛋白的正确折叠，可以显著促进所表达的外源蛋白的可溶性，提高了可溶性外源蛋白的回收效率。但该专利采用SUMO表达标签，且表达的目的蛋白不同，即便同样的标签也并不一定有同样的适用性，并采用T4连接法构建质粒，采用DH5α感受态细胞进行转化表达。专利CN109750036 A公开了一种核苷酸序列、使用其提高蛋白表达效率的方法及应用。将含所述蛋白基因的所述重组载体转化大肠杆菌进行表达。该专利破碎菌体后重悬取上清，未重新对破碎后沉淀中表达蛋白进行分析和对比，且所用质粒构建方法为T4连接法，优化蛋白表达采用目的蛋白序列前增加一段核苷酸序列，提高mRNA起始翻译效率，表达载体也显著不同。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达的方法。本发明方法进行了多方面的研究和尝试：1.优化培养条件降低目的蛋白的表达速率，促进其正确折叠；2.构建(TrxA、S-Tag)促溶基因，提高异源蛋白的可溶性，促进异源蛋白的溶解和折叠。本发明方法是利用在表达载体的质粒中引入了(TrxA、S-Tag)促溶基因以提高禽腺病毒蛋白Fiber-2在大肠杆菌中的可溶性表达。又通过纯化Fiber-2蛋白及测定蛋白浓度，为禽腺病毒亚单位疫苗的研制奠定基础。

本发明的另一目的在于提供上述蛋白的纯化方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达的方法，包括如下步骤：

(1)以PXMJ19-T7-his-Fiber2为模板，TrxA-Fiber-2-F，TrxA-Fiber-2-R为引物扩增Fiber-2目的片段；

(2)以PET-32a-T7-TrxA-VP2为模板，PET-32a-T7-TrxA-F，PET-32a-T7-TrxA-R为引物扩增PET-32a-T7-TrxA载体片段；

(3)将Fiber-2目的片段和PET-32a-T7-TrxA载体片段进行同源重组，得到重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2；

(4)将重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2转化至Shuffle T7-B感受态细胞进行Fiber-2蛋白的表达；

所述引物序列分别如下：

TrxA-Fiber-2-F：CTGCCGTAACTCGAGCACCACCAC；

TrxA-Fiber-2-R：CTCGAGTTACGGCAGGCTCGCC；

PET-32a-T7-TrxA-F：CTGCCGTAACTCGAGCACCACCAC；

PET-32a-T7-TrxA-R：CGCAGCATGATATCAGCCATGGCCTTG；

所述PXMJ19-T7-his-Fiber2的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，其质粒图谱如图1所示。

所述PET-32a-T7-TrxA-VP2的核苷酸序列为SEQ ID NO:7，其质粒图谱如图2所示。

进一步地，步骤(1)所得Fiber-2目的片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

进一步地，步骤(2)所得PET-32a-T7-TrxA载体片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。

进一步地，步骤(3)中所述同源重组条件为：

将Fiber-2目的片段和PET-32a-T7-TrxA载体片段按体积比为1:1加入到反应液中，摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min，然后放置4℃或冰上冷却，得到重组产物。

进一步地，步骤(3)所得重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2的核苷酸序列为SEQID NO:11，其质粒图谱如图3所示。

进一步地，所述将重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2转化至Shuffle T7-B感受态细胞的步骤为：取重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2加入到Shuffle T7-B感受态细胞混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min，加入SOC培养基，37℃及200-250rpm转速摇菌1h；将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热离心弃掉上清，用剩余培养基将菌体重悬，然后涂在有含氯霉素抗性的平板上，37℃培养箱中倒置培养12-16h。

进一步地，所述Fiber-2蛋白的表达步骤为：挑取转化培养后的单菌落，接种到带氯霉素抗性的LB固体培养基中，30℃，200rpm震荡培养细菌至对数生长期(OD600＝0.4-0.8)，加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，至摇床中16℃诱导15h。

进一步地，所述PXMJ19-T7-his-Fiber2模板质粒通过如下方法制备得到：

(a)以PET-21a-GX-1-fiber2质粒为模板，Fiber-2-F，Fiber-2-R为引物进行扩增，得到Fiber-2目的片段；

(b)以PXMJ19-C1786T-hexon(T7)质粒为模板，PXMJ19-T7-his-F，PXMJ19-T7-his-R为引物进行扩增，得到PXMJ19-C1786T-T7载体片段；

(c)将Fiber-2目的片段和PXMJ19-C1786T-T7载体片段进行同源重组，得到重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2；

所述引物序列分别如下：

Fiber-2-F：AAGAAGGAGATATAATGCTGCGTGCGC；

Fiber-2-R：AGCCGGATCTCATCAGTGGTGGTGG；

PXMJ19-T7-his-F：CCACCACCACTGATGAGATCCGGCT；

PXMJ19-T7-his-R：CACGCAGCATTATATCTCCTTCTTA；

所述PET-21a-GX-1-fiber2质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO:17，其质粒图谱如图13所示；

所述PXMJ19-C1786T-hexon(T7)质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO:18，其质粒图谱如图14所示(来源于CN 110951767 A，一种具有高拷贝能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法中的PXMJ19-C1786T质粒)。

进一步地，步骤(a)所得Fiber-2目的片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:19；步骤(b)所得PXMJ19-C1786T-T7载体片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:20。

上述表达蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

(1)将诱导表达后的菌体离心收集，加入无菌的PBS和EDTA，冰上超声波裂解，离心收集细菌裂解液；

(2)将细菌裂解液加入到平衡后的His标签蛋白纯化介质中进行纯化。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)构建一种含有(TrxA、S-Tag)促溶基因的重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2，提高Fiber-2蛋白的可溶性。

(2)通过重组质粒上带有的his标签进行蛋白纯化并获得足够的蛋白量，为后续的亚单位疫苗的制备及免疫原性实验奠定基础。

(3)采用一种能提高外源基因拷贝数的质粒PXMJ19-C1786T-hexon(T7)(来源于CN110951767A，一种具有高拷贝能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法中的PXMJ19-C1786T质粒；具体改造后的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，质粒图谱如图2)作为载体，构建PXMJ19-T7-his-fiber2重组质粒，来增强Fiber-2目的片段的高效可溶性表达。

(4)采用特定的质粒模板分别扩增目的片段和载体片段，直接采用同源重组分别得到重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2和PET-32a-T7-TrxA-Fiber2；无需酶切及采用连接酶，减少操作步骤。

(5)本发明方法并不需要对Fiber-2目的片段进行优化或改变，而是采用突变一个碱基改造后的PXMJ19-C1786T-T7作为载体，提高目的蛋白的复制效率，相比对目的片段进行优化更简单而又降低异源序列造成的影响。

(6)通过设置不同的培养温度和时间，优化Fiber-2蛋白表达。

附图说明

图1为本发明模板质粒PXMJ19-T7-his-Fiber2的结构图；

图2为本发明模板质粒PET-32a-T7-TrxA-VP2的结构图；

图3为本发明所得重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2的结构图；

图4为实施例中重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2制备过程中Fiber-2目的片段扩增产物的凝胶电泳鉴定结果图；

图5为实施例中PET-32a-T7-TrxA载体片段扩增产物的凝胶电泳鉴定结果图；

图6为实施例中重组产物PET-32a-T7-TrxA-Fiber2的菌液鉴定结果图；

图7为实施例中重组产物PET-32a-T7-TrxA-Fiber2用NdeI、SacI双酶切后的凝胶电泳鉴定结果图；

图8为实施例中重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在不同感受态细胞中转化及在不同温度和时间下表达所得菌体经超声裂解后，菌液上清SDS-PAGE凝胶实验结果图；

图9为实施例中所得重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在不同感受态细胞中转化及在不同温度和时间下表达所得菌体经超声裂解后，菌液上清的Western blot表达结果图；

图10为所得重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在不同温度和时间下表达所得菌体经超声裂解后，菌液上清和沉淀SDS-PAGE凝胶实验结果图；

图11为收集重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在Shuffle细胞中培养上清及蛋白纯化后SDS-PAGE凝胶实验结果图；

图12为收集收集重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在Shuffle细胞中培养上清及蛋白纯化后Westerblot结果图；

图13为本发明模板质粒PET-21a-GX-1-fiber2的结构图；

图14为本发明模板质粒PXMJ19-C1786T-hexon(T7)的结构图；

图15为实施例中PXMJ19-T7-his-Fiber2模板质粒构建过程中Fiber-2目的片段扩增产物的凝胶电泳鉴定结果图；

图16为实施例中PXMJ19-C1786T-T7载体片段扩增产物的凝胶电泳鉴定结果图；

图17为实施例中重组产物PXMJ19-T7-his-Fiber2的菌液鉴定结果图；

图18为实施例中重组产物PXMJ19-T7-his-Fiber2用NdeI、SacI双酶切后的凝胶电泳鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中主要试剂及培养基参数及来源说明：

4S Red Plus核酸染色剂(BBI A606695)；琼脂糖.柱式DNA胶回收试剂盒(sangonSK8131)；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(SK8191 sangon)；DL-1000DNA Sizemaker；DL-2000DNA Size maker、DL-5000DNA Size maker、DL-8000DNA Size maker、DL-10000DNA Size maker、DL-15000DNA Size maker(全式金生物有限公司)；SDS-PAGE电泳液(Beyotime)；脱脂奶粉(美国BD公司)ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(Vazyme)；BHI肉汤；EPO培养基；LBHIS培养基；LB营养琼脂；PageRuler^TMPrestainedProtein Ladder(26619，Thermo)；BeyoBlue^TM考马斯亮蓝超快染色液(Beyotime)；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(Taraka)；2xRapid Taq Master Mix(Vazyme)；

Anti-HisMouse Monoclonal Antibody(TRANS)；

Goat Anti-Mouse IgG(H+L),HRPConjugate(TRANS)。

以下实施例中主要仪器型号及来源说明：

SMA4000微量分光光度计(merinton)；PCR反应扩增仪(BIO公司)；移液器(范围100-1000μl，20-200μl，0.5-10μl)(加拿大BBI公司)；电子天平(赛多利斯)；高速台式离心机；一恒生化培养箱；恒温培养摇床(一恒)；三孔电热恒温水槽(一恒)；脱色摇床(其林贝尔)；酶标仪(Thermo)；双控温干式恒温器(杭州米欧仪器有限公司)；HC-2518R高速冷冻离心机(安徽中科中佳仪器有限公司)；DYY-6C型稳压稳流电泳仪(北京六一)；H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；FR980凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)。

以下实施例中引物设计及来源说明：

根据SnapGene软件，采用同源重组技术设计基因Fiber-2、载体PET-32a-T7-TrxA及菌液鉴定的通用引物CX-F，并在生工生物工程(上海)股份有限公司合成，设计引物如下表1：

表1.引物组及序列

实施例

(1)Fiber-2目的片段的扩增：

以PXMJ19-T7-his-Fiber2(核苷酸序列为SEQ ID NO:6，其质粒图谱如图1所示)为模板，TrxA-Fiber-2-F，TrxA-Fiber-2-R为引物扩增Fiber-2片段，扩增PCR体系和程序分别如下表2和表3所示。

表2.Fiber-2扩增PCR体系

表3.Fiber-2扩增PCR程序

PCR扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图4所示。在1453bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。扩增产物核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

(2)载体片段PET-32a-T7-TrxA的扩增：

以PET-32a-T7-TrxA-VP2(核苷酸序列为SEQ ID NO:7，其质粒图谱如图2所示)为模板，PET-32a-T7-TrxA-F，PET-32a-T7-TrxA-R为引物进行扩增，扩增PCR体系和程序分别如下表4和表5所示。

表4.PET-32a-T7-TrxA的扩增PCR体系

表5 PET-32a-T7-TrxA的扩增PCR程序

PCR扩增结束后进行0.8％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图5所示。在5877bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。扩增产物核苷酸序列为SEQ ID NO:9。

(3)将Fiber-2目的片段和PET-32a-T7-TrxA载体片段进行同源重组：

胶回收结束后将目的片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置如表6的反应体系：

表6.同源重组体系

温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min，然后放置4℃或冰上冷却，得到重组产物。

1、对重组产物进行菌液PCR鉴定，具体步骤如下：

在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞shuffle-T7-B细胞，取10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μl SOC培养基，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。培养后，察看平板的菌落并挑取若干菌落至加有提前配好的含氯霉素抗性的LB培养基中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定，结果如图6所示，鉴定片段为2223bp，鉴定序列为SEQ ID NO:10。鉴定PCR体系如下表7所示：

表7.菌液鉴定的PCR体系

2、对重组产物进行酶切鉴定及测序，具体步骤如下：

a)重组质粒提取：

取鉴定阳性的菌液100uL于加有含氯霉素抗性的LB培养基的50mL离心管中进行大摇，过夜培养。取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入500μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。向离心管中加入700μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。将收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(使用前先进行柱平衡：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(先加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复PW漂洗步骤，然后将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中，即得重组质粒。

b)酶切鉴定及测序：

用ScaI、SapI双酶切，酶切体系共300uL，分成6管，每管50uL，体系如下表8：

表8酶切体系

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图7所示(M：依次是8000、5000、3000、1500、1000、500；1至4是PET-32a-T7-TrxA-fiber2酶切片段)。条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果为SEQ ID NO:11，所得重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2的结构图如图3所示。

(4)将重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2转化至Shuffle T7-B感受态细胞进行Fiber-2蛋白的表达(并以重组质粒PXMJ19-T7-his-Fiber2及感受态细胞BL21作为比较)：

a)化学转化：

取重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2 10ng加入到100μl Shuffle T7-B感受态细胞作为实验组，同时取重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2 10ng加入到100μL BL21感受态细胞及重组质粒PXMJ19-T7-his-Fiber2 10ng加入到100μL Shuffle T7-B感受态细胞作为对照组，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μL SOC培养基，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。标记PET-32a-T7-TrxA-Fiber2质粒转化至感受态细胞Shuffle的板为A，转化至感受态细胞BL21的板为B，PXMJ19-T7-his-Fiber2转化至感受态细胞Shuffle的板为C。

b)蛋白表达：

1)在板A、B中挑取单菌落，分别接种到8mL带氯霉素抗性的LB培养基中，过夜培养抽取1mL添加30mL的氯霉素抗性的LB培养基中，分别标记为瓶1，瓶2；同时在板C中挑取单菌落，接种到含3ml带氯霉素抗性的LB培养基中，过夜培养抽取1mL至10mL的氯霉素抗性的LB培养基中，标记为瓶3；

2)30℃，200rpm震荡培养细菌至对数生长期(OD600＝0.4-0.8)；

3)把瓶1，瓶2菌液各等分成3瓶，每瓶均10mL，每瓶加入IPTG至终浓度为1mM，分别移至摇床中按30℃诱导4小时、诱导8小时、16℃诱导过夜(15h)进行实验；同时瓶3，按16℃诱导过夜(15h)进行实验；

4)诱导完成后，离心收集菌体；加入无菌的PBS和万分之一的EDTA；

5)超声波裂解，直至溶液清亮，12000rpm离心1min，分别收集包涵体沉淀和裂解上清；包涵体沉淀再用PBS重悬(含万分之一的EDTA)。

c)Fiber-2蛋白可溶性分析：

收集上清后分别加入等体积的SDS-PAGE(2x)上样缓冲液，95℃金属浴加热10min，通过SDS-PAGE及Western blot实验，对目的条带进行可溶性分析。

聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳具体步骤：

1)配胶

将吸水纸放在工作台上，玻璃板置于其上，喷适量70％乙醇后仔细清洁擦干，避免玻璃板有残存的胶。清洁好的玻璃板置于固定架上，注意两个玻璃板底部要齐平，固定好后放入橡胶槽内，使底部与橡胶条紧密贴合。用蒸馏水检漏后配置10％下层分离胶及4％上层浓缩胶。

配置完下层分离胶后，需在液面上加一层水将液面压平，静置30min以上，直至胶完全凝固后，弃去上层水，用滤纸小心吸干残留水分。加入浓缩胶后要迅速插入梳子，注意不要有气泡。室温静置lh使浓缩胶彻底凝固

2)加样

将配置好的胶板移至电泳槽内，倒入1xgel running buffer，在孔内加入样品及蛋白marker。

3)跑胶

采用恒压跑胶。起始电压为60V，当样品跑完浓缩胶，到达浓缩胶与分离胶的分界线时，将电压调整为120V。跑胶结束，将胶取出，切去多余部分后进行考马斯亮蓝快染20min，清水脱色。

Western blot具体步骤:

1)配胶，加样同上；

2)采用恒压跑胶。起始电压为60V，当样品跑完浓缩胶，到达浓缩胶与分离胶的分界线时，将电压调整为120V。跑胶结束，将胶取出，切去多余部分后然后根据胶的大小来裁剪滤纸和PVDF膜，膜要比胶略大，而滤纸要比膜再大一些。胶、膜和滤纸板都处理好后均浸泡于湿转缓冲液中。随后在湿转的托板上依次叠放滤纸、PVDF膜、胶和滤纸，每放一层，用转膜液润湿表面赶走气泡，再叠加下一层。放完最后一层滤纸后用刮板按刮最上层的滤纸，以将内部气泡赶走。固定好托板后放入转膜架内，置于湿转槽中，然后往槽内加入湿转缓冲液，连接好电极后开始转膜。转膜时采用300mA恒定电流，湿转2h。湿转结束后将PVDF膜取出，用小剪刀剪去多余的部分；

3)封闭：配置新鲜的封闭液，即5％的脱脂牛奶，然后把膜放入封闭液中，置于摇床上，室温封闭1h；

4)一抗孵育：1:10000稀释

Anti-His Mouse Monoclonal Antibody(TRANS),稀释液用TBST溶液。弃去封闭液后加入单抗稀释液，置于摇床上，4℃过夜，将一抗回收后，加入TBST，置于摇床上洗10min弃去溶液，重复洗3遍。二抗孵育：1:10000稀释HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)，稀释液用TBST溶液。加入稀释好的二抗，室温1h。将二抗回收后，加入TBST，置于摇床上洗10min弃去溶液，重复洗3遍。

5)显色：将上一步的二抗回收后，用TBST洗3遍，前两次10min每遍，最后一次洗15min。取等体积的化学发光试剂(ECL)A液和B液，混合都一起后涡旋振荡混匀，然后均匀的滴在PVDF膜上，在发光成像系统中进行曝光显色。

所得重组质粒培养上清SDS-PAGE凝胶实验结果如图8所示。从左至右分别是重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在Shuffle细胞中30℃培养4h、8h及16℃培养15h上清表达、PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在BL21细胞中30℃培养4h、8h及16℃培养15h上清表达；PXMJ19-T7-fiber2在Shuffle细胞中16℃培养15h上清表达、180KDa maker。

所得重组质粒培养上清的Western blot表达结果如图9所示。从左至右分别是PXMJ19-T7-fiber2在Shuffle细胞中16℃培养15h上清表达、重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在BL21细胞中30℃培养4h、8h及16℃培养15h上清表达、PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在Shuffle细胞中30℃培养4h、8h及16℃培养15h上清表达。

所得重组质粒培养上清和沉淀SDS-PAGE凝胶实验结果如图10所示。从左至右分别是180KDa maker、重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在Shuffle细胞中30℃培养4h、8h及16℃培养15h上清及沉淀表达。

由图8和图9结果得知：重组质粒PET-32a-T7-TrxA-fiber2在shuffle细胞中，菌液上清Fiber-2的蛋白表达，优于重组质粒在BL21中表达；重组质粒在shuffle细胞中，菌液上清Fiber-2的蛋白表达，也优于PXMJ19-T7-fiber2在Shuffle细胞中的表达；说明PET-32a-T7-TrxA-fiber2重组质粒在Shuffle细胞中，Fiber-2蛋白有更好的可溶性表达。

由图10结果得知：上清中的表达低于沉淀的表达，但上清的表达仍然可观，可用于后续Fiber-2蛋白纯化实验。

(5)Fiber-2蛋白的纯化：

1)冰上超声裂解后的细菌，4℃ 10,000g离心10min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上(上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度)。

2)取0.5ml混合均匀的50％BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin(耐还原螯合型)，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入0.25ml非变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复重复平衡2次，弃去液体。将约1ml细菌裂解液上清加入其中，4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。

3)将裂解液和BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin(耐还原螯合型)的混合物装入试剂盒提供的亲和层析柱空柱管中。

4)将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20uL穿流液作后续分析用。

5)洗柱5次，每次加入500uL非变性洗涤液，每次均收集约20uL穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。

6)洗脱目的蛋白6-10次，每次用50uL非变性洗脱液洗脱。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。

7)收集洗脱液后分别加入等体积的SDS-PAGE(2x)上样缓冲液，95℃金属浴加热10min，通过SDS-PAGE凝胶及Western blot实验，对目的条带进行分析，结果如图11和图12所示。

图11为收集PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在Shuffle细胞中培养上清及蛋白纯化后SDS-PAGE凝胶实验结果(从左至右分别是180KDa maker、穿流液、洗涤液、第一次洗脱(E1)、第二次洗脱(E2)、第三次洗脱(E3)、第四次洗脱(E4)、第五此洗脱(E5))。

图12为收集收集PET-32a-T7-TrxA-Fiber2在Shuffle细胞中培养上清及蛋白纯化后Wester blot结果(从左至右分别是穿流液、洗涤液、第一(E1)、二(E2)、三(E3)、四(E4)、五次洗脱(E5))。

由图11和图12可见清晰单一的蛋白条带。

综上：纯化后的Fiber-2蛋白经大量制备后，可用于后续的亚单位疫苗的制备及免疫原性实验。

本实施例所使用的PXMJ19-T7-his-Fiber2模板质粒通过如下方法构建：

根据SnapGene软件，采用同源重组技术设计基因Fiber-2、载体PXMJ19-T7-his及菌液鉴定的通用引物L4440-F，在生工生物工程(上海)股份有限公司合成，设计引物如下表9：

表9.引物组及序列

引物名称	引物序列(5′-3′)
		Fiber-2-F	AAGAAGGAGATATAATGCTGCGTGCGC；(SEQ ID NO:12)
Fiber-2-R	AGCCGGATCTCATCAGTGGTGGTGG；(SEQ ID NO:13)
		PXMJ19-T7-his-F	CCACCACCACTGATGAGATCCGGCT；(SEQ ID NO:14)
PXMJ19-T7-his-R	CACGCAGCATTATATCTCCTTCTTA；(SEQ ID NO:15)
		L4440-F	AGCGAGTCAGTGAGCGAG；(SEQ ID NO:16)
Fiber-2-R	AGCCGGATCTCATCAGTGGTGGTGG；(SEQ ID NO:13)

(1)Fiber-2目的片段的扩增：

以PET-21a-GX-1-fiber2(核苷酸序列为SEQ ID NO:17，其质粒图谱如图13所示)为模板，Fiber-2-F，Fiber-2-R为引物扩增Fiber-2目的片段，扩增PCR体系和程序分别如下表10和表11所示。

表10.Fiber-2扩增PCR体系

成分	体积(UL)
		5×PrimeSTAR GXL Buffer	10
dNTP Mixture	4
		PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	1
Fiber-2-F	1
		Fiber-2-R	1
DNA模板	1
		ddH<sub>2</sub>O	32

表11.Fiber-2扩增PCR程序

PCR扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图15所示。在1505bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。扩增产物核苷酸序列为SEQ ID NO:19。

(2)载体片段PXMJ19-C1786T-T7的扩增：

以PXMJ19-C1786T-hexon(T7)质粒(核苷酸序列为SEQ ID NO:18，其质粒图谱如图14所示)为模板，PXMJ19-T7-his-F，PXMJ19-T7-his-R为引物扩增PXMJ19-C1786T-T7载体片段。扩增PCR体系和程序分别如下表12和表13所示。

表12.PXMJ19-C1786T-T7扩增PCR体系

表13.PXMJ19-C1786T-T7扩增PCR程序

PCR扩增结束后进行0.8％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图16所示。在6516bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。扩增产物核苷酸序列为SEQ ID NO:20。

(3)将Fiber-2目的片段和PXMJ19-C1786T-T7载体片段进行同源重组：

胶回收结束后将目的片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置如表14的反应体系。

表14.同源重组体系

温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min，然后放置4℃或冰上冷却，得到重组产物。

1、对重组产物进行菌液鉴定，具体步骤如下：

在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞shuffle-T7-B细胞，取10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μl SOC培养基，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置过夜(12-16h)培养。过夜培养后，查看平板的菌落并分别挑取其中9个菌落，置于加有含氯霉素抗性的LP培养基的2mL EP管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定，结果如图17所示，大小均为2389bp左右，与理论值大小相符合。鉴定PCR体系如下表15所示，扩增产物核苷酸序列为SEQ ID NO:21。

表15.菌液鉴定PCR体系

2、对重组产物进行酶切鉴定及测序，具体步骤如下：

a)重组质粒提取：

取鉴定阳性的菌液100uL于加有含氯霉素抗性的LP培养基的50mL离心管中进行大摇，过夜培养。取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1(天根DP103-03质粒小提试剂盒)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入500μl溶液P2(天根DP103-03质粒小提试剂盒)，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。向离心管中加入700μl溶液P3(天根DP103-03质粒小提试剂盒)，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。将收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3(使用前先进行柱平衡：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中)中12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(先加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复PW漂洗步骤，然后将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中，即得重组质粒。

b)酶切鉴定及测序：

用NdeI、SacI双酶切，酶切体系共300uL，分成6管，每管50uL，体系如下表16所示：

表16酶切体系

酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图18所示(M：依次是8000、5000、3000、1500、1000、500；1：NdeI、SacI双酶切片段)。片段大小分别为2714bp、5258bp，与理论值大小相符合。条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，与理论值完全相同。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

<120> 构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达及纯化的方法

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ctgccgtaac tcgagcacca ccac 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ctcgagttac ggcaggctcg cc 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ctgccgtaac tcgagcacca ccac 24

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cgcagcatga tatcagccat ggccttg 27

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gcccaacagt cccccggc 18

<210> 6

<211> 7972

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60

agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120

cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180

caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240

tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300

ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360

ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gcattgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420

gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480

gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540

tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 600

cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 660

gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 720

ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcaaaag tgctcatcat 780

tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 840

gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 900

tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 960

atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 1020

tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaaaga gtttgtagaa 1080

acgcaaaaag gccatccgtc aggatggcct tctgcttaat ttgatgcctg gcagtttatg 1140

gcgggcgtcc tgcccgccac cctccgggcc gttgcttcgc aacgttcaaa tccgctcccg 1200

gcggatttgt cctactcagg agagcgttca ccgacaaaca acagataaaa cgaaaggccc 1260

agtctttcga ctgagccttt cgttttattt gatgcctggc agttccctac tctcgcatgg 1320

ggagacccca cactaccatc ggcgctacgg cgtttcactt ctgagttcgg catggggtca 1380

ggtgggacca ccgcgctact gccgccaggc aaattctgtt ttatcagacc gcttctgcgt 1440

tctgatttaa tctgtatcag gctgaaaatc ttctctcatc cgccaaaaca gccaagctga 1500

attcgagctc ggtacccggg gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agctttaata 1560

cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat aattttgttt 1620

aactttaaga aggagatata atgctgcgtg cgccgaaacg ccgtcactct gaaaacggta 1680

aaccggaaac cgaagcgggt ccgtctccgg cgccgatcaa acgtgcgaaa cgtatggtgc 1740

gcgcgtctca gctggacctg gtttacccgt tcgattacgt ggcggacccg gttggcggcc 1800

tgaacccgcc gttcctgggt ggctctggcc cgctggttga ccagggcggc cagctgaccc 1860

tgaacgttac cgatccgatc atcattaaaa accgttccgt tgacctggct cacgatccgt 1920

ctctggatgt gaacgcgcag ggccagctgg cagtggctgt tgatccggaa ggcgcgctgg 1980

atatcacccc ggatggtctg gatgttaaag tggatggcgt taccgtgatg gttaacgacg 2040

attgggaact ggcggttaaa gttgacccgt ccggtggcct ggattctacc gcgggcggtc 2100

tgggtgtgtc tgttgatgac accctgctgg ttgatcaggg tgaactgggt gttcacctga 2160

accagcaggg cccgatcacg gcggattcta gcggcatcga cctggaaatc aacccgaaca 2220

tgttcaccgt gaacacctcc accggttccg gtgtgctgga actgaacctg aaagcccagg 2280

gcggtatcca ggcggcttct agcggtgttg gtgttagcgt tgatgaatct ctgcagattg 2340

ttaacaacac cctggaagtt aaaccagatc cgtctggtcc gctgaccgtt agcgcgaacg 2400

gtctcggcct gaaatatgac accaacaccc tggcggtgac cgcgggtgca ctgaccgtgg 2460

ttggcggtgg tagcgtttcc accccgatcg ccaccttcgt gtccggtagc ccgtctctga 2520

acacctacaa cgcaaccacc gttaactctt ccgctaacgc gttctcctgc gcgtactacc 2580

tgcagcagtg gaacatccag ggcctgctgg ttacctctct gtacctgaaa ctggactccg 2640

cgaccatggg taaccgtccg ggtgacctga actctgccaa cgcgaaatgg ttcaccttct 2700

gggttagcgc ctacctgcag cagtgcaacc cgtccggtat ccaggcgggt accgttagcc 2760

cgagcaccgc aaccctgacc gacttcgaac cgatggcgaa ccgtagcgtg accagcccgt 2820

ggacctactc tgcaaacggt tactacgaac cgtccatcgg cgaattccag gttttctctc 2880

cggttgttac cggcgcgtgg aacccaggta acattggtat ccgtgtgctg ccggtgccgg 2940

tgagcgcgag cggtgaacgt tacaccctgc tgtgctacag cctgcagtgc accaacgcga 3000

gcatcttcaa cccgaacaac tctggtacca tgatcgttgg tccggtgctg tactcttgcc 3060

cggcggcgag cctgccgaag cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactgat 3120

gagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc 3180

aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttggacacca 3240

tcgaatggtg caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag agtcaattca 3300

gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgttat acgatgtcgc agagtatgcc ggtgtctctt 3360

atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt ttctgcgaaa acgcgggaaa 3420

aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa ccgcgtggca caacaactgg 3480

cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag tctggccctg cacgcgccgt 3540

cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact gggtgccagc gtggtggtgt 3600

cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct gtaaagcggc ggtgcacaat cttctcgcgc 3660

aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc cgctggatga ccaggatgcc attgctgtgg 3720

aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt ctctgaccag acacccatca 3780

acagtattat tttctcccat gaagacggta cgcgactggg cgtggagcat ctggtcgcat 3840

tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag ttctgtctcg gcgcgtctgc 3900

gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat tcagccgata gcggaacggg 3960

aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat gcaaatgctg aatgagggca 4020

tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc gctgggcgca atgcgcgcca 4080

ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt agtgggatac gacgataccg 4140

aagacagctc atgttatatc ccgccgttaa ccaccatcaa acaggatttt cgcctgctgg 4200

ggcaaaccac gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca 4260

gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgccgggga tcagccccgg 4320

atgctttgga tacggtctat gagctggcag cgtatttgac cgatccggac acctgggata 4380

atgtgtggat tttgtcggat cagcttgagt aggacaaatc cgccgagctt cgacgagatt 4440

ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat 4500

atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta 4560

taaccagacc gttcagctgg atattacggc ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca 4620

caagttttat ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg atgaatgctc atccggagtt 4680

ccgtatggca atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat agtgttcacc cttgttacac 4740

cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt 4800

ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta 4860

tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca gccaatccct gggtgagttt 4920

caccagtttt gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc ttcgcccccg ttttcaccat 4980

gggcaaatat tatacgcaag gcgacaaggt gctgatgccg ctggcgattc aggttcatca 5040

tgccgtctgt gatggcttcc atgtcggcag aatgcttaat gaattacaac agtactgcga 5100

tgagtggcag ggcggggcgt aattttttta aggcagttat tggtgccctt cgaaatgacc 5160

gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa 5220

aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccaacaaca agacccatca tagtttgccc 5280

ccgcgacatt gaccataaat tcatcgcaca aaatatcgaa cggggtttat gccgctttta 5340

gtgggtgcga agaatagtct gctcattacc cgcgaacacc gccgcattca gatcacgctt 5400

agtagcgtcc ccatgagtag gcagaaccgc gtccaagtcc acatcatcca taacgatcat 5460

gcacggggtg gaatccacac ccagacttgc cagcacctca ttagcgacac gttgcgcagc 5520

ggccacgtcc ttagccttat ccacgcaatc gagaacgtac tgcctaaccg cgaaatcaga 5580

ctgaatcagt ttccaatcat cgggcttcac caaagcaaca gcaacgcggg ttgattcgac 5640

ccgttccggt gcttccagac cggcgagctt gtacagttct tcttccattt cacgacgtac 5700

atcagcgtct atgtaatcaa tgcccaaagc acgcttagcc ccacgtgacc aggacgaacg 5760

caggttttta gaaccaacct catactcacg ccaccgagcc accaaaacag cgtccatatc 5820

ctcgccggcg tcgctttgat cggccaacat atccaacatc tgaaacggcg tgtacgaccc 5880

cttagacgcg gttttagtag cggagccagt cagttcctga gacatgccct tagcgaggta 5940

ggttgccatt ttcgcagcgt ctccacccca ggtagacacc tgatcaagtt tgaccccgtg 6000

ctcacgcagt ggcgcgtcca taccggcctt aaccacacca gcagaccagc gggaaaacat 6060

ggaatcctca aacgccttga gttcatcgtc agacagtgga cgatccaaga acaacagcat 6120

gttgcggtgc aagtgccaac cgttcgccca agagtctgtg acctcatagt cactataggt 6180

gtgctccacc ccgtaccgtg cacgttcttt cttccactga gatgttttca ccatcgaaga 6240

gtacgcagtc ttaatacccg cttcaacctg cgcaaatgac tgtgagcggt tgtgtcgaac 6300

agtgcccaca aacatcatga gcgcgccacc cgccgccaag tgattcttag tagcaatagc 6360

cagctcaatg cggcgttcgc ccatgacttc caattcagcc agaggtgacc cccagcgaga 6420

gtgagagttt tgcagaccct caaactgcga agcaccgtta gacgaccagg acaccgcaac 6480

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<400> 9

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gtcgcgctcc agcgaaagcg gtcctcgccg aaaatgaccc agagcgctgc cggcacctgt 3660

cctacgagtt gcatgataaa gaagacagtc ataagtgcgg cgacgatagt catgccccgc 3720

gcccaccgga aggagctgac tgggttgaag gctctcaagg gcatcggtcg agatcccggt 3780

gcctaatgag tgagctaact tacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 3840

ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 3900

cgtattgggc gccagggtgg tttttctttt caccagtgag acgggcaaca gctgattgcc 3960

cttcaccgcc tggccctgag agagttgcag caagcggtcc acgctggttt gccccagcag 4020

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cattgcgccc agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc 4200

attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc cttcccgttc 4260

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cgccgagaca gaacttaatg ggcccgctaa cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac 4380

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tgtctggtca gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta gtgcaggcag cttccacagc 4500

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cacgctggca cccagttgat cggcgcgaga tttaatcgcc gcgacaattt gcgacggcgc 4680

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cgttttcgca gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg gaaacggtct gataagagac 4860

accggcatac tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc acattcacca ccctgaattg 4920

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ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg aaagagttcc tcgacgctaa 5700

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cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg gctgatatca tgctgcg 5877

<210> 10

<211> 2223

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 60

gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 120

aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 180

cgatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 240

ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gagcgataaa 300

attattcacc tgactgacga cagttttgac acggatgtac tcaaagcgga cggggcgatc 360

ctcgtcgatt tctgggcaga gtggtgcggt ccgtgcaaaa tgatcgcccc gattctggat 420

gaaatcgctg acgaatatca gggcaaactg accgttgcaa aactgaacat cgatcaaaac 480

cctggcactg cgccgaaata tggcatccgt ggtatcccga ctctgctgct gttcaaaaac 540

ggtgaagtgg cggcaaccaa agtgggtgca ctgtctaaag gtcagttgaa agagttcctc 600

gacgctaacc tggccggttc tggttctggc catatgcacc atcatcatca tcattcttct 660

ggtctggtgc cacgcggttc tggtatgaaa gaaaccgctg ctgctaaatt cgaacgccag 720

cacatggaca gcccagatct gggtaccgac gacgacgaca aggccatggc tgatatcatg 780

ctgcgtgcgc cgaaacgccg tcactctgaa aacggtaaac cggaaaccga agcgggtccg 840

tctccggcgc cgatcaaacg tgcgaaacgt atggtgcgcg cgtctcagct ggacctggtt 900

tacccgttcg attacgtggc ggacccggtt ggcggcctga acccgccgtt cctgggtggc 960

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attaaaaacc gttccgttga cctggctcac gatccgtctc tggatgtgaa cgcgcagggc 1080

cagctggcag tggctgttga tccggaaggc gcgctggata tcaccccgga tggtctggat 1140

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gacccgtccg gtggcctgga ttctaccgcg ggcggtctgg gtgtgtctgt tgatgacacc 1260

ctgctggttg atcagggtga actgggtgtt cacctgaacc agcagggccc gatcacggcg 1320

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ccagatccgt ctggtccgct gaccgttagc gcgaacggtc tcggcctgaa atatgacacc 1560

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ccgatcgcca ccttcgtgtc cggtagcccg tctctgaaca cctacaacgc aaccaccgtt 1680

aactcttccg ctaacgcgtt ctcctgcgcg tactacctgc agcagtggaa catccagggc 1740

ctgctggtta cctctctgta cctgaaactg gactccgcga ccatgggtaa ccgtccgggt 1800

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tgcaacccgt ccggtatcca ggcgggtacc gttagcccga gcaccgcaac cctgaccgac 1920

ttcgaaccga tggcgaaccg tagcgtgacc agcccgtgga cctactctgc aaacggttac 1980

tacgaaccgt ccatcggcga attccaggtt ttctctccgg ttgttaccgg cgcgtggaac 2040

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accctgctgt gctacagcct gcagtgcacc aacgcgagca tcttcaaccc gaacaactct 2160

ggtaccatga tcgttggtcc ggtgctgtac tcttgcccgg cggcgagcct gccgtaactc 2220

gag 2223

<210> 11

<211> 7300

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

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tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840

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aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140

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ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500

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caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860

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accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980

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gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540

tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600

atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720

gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780

tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840

cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900

tcggtatcgt cgtatcccac taccgagatg tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960

atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020

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cgatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 5160

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ctcgtcgatt tctgggcaga gtggtgcggt ccgtgcaaaa tgatcgcccc gattctggat 5340

gaaatcgctg acgaatatca gggcaaactg accgttgcaa aactgaacat cgatcaaaac 5400

cctggcactg cgccgaaata tggcatccgt ggtatcccga ctctgctgct gttcaaaaac 5460

ggtgaagtgg cggcaaccaa agtgggtgca ctgtctaaag gtcagttgaa agagttcctc 5520

gacgctaacc tggccggttc tggttctggc catatgcacc atcatcatca tcattcttct 5580

ggtctggtgc cacgcggttc tggtatgaaa gaaaccgctg ctgctaaatt cgaacgccag 5640

cacatggaca gcccagatct gggtaccgac gacgacgaca aggccatggc tgatatcatg 5700

ctgcgtgcgc cgaaacgccg tcactctgaa aacggtaaac cggaaaccga agcgggtccg 5760

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tacccgttcg attacgtggc ggacccggtt ggcggcctga acccgccgtt cctgggtggc 5880

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gacctgaact ctgccaacgc gaaatggttc accttctggg ttagcgccta cctgcagcag 6780

tgcaacccgt ccggtatcca ggcgggtacc gttagcccga gcaccgcaac cctgaccgac 6840

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tacgaaccgt ccatcggcga attccaggtt ttctctccgg ttgttaccgg cgcgtggaac 6960

ccaggtaaca ttggtatccg tgtgctgccg gtgccggtga gcgcgagcgg tgaacgttac 7020

accctgctgt gctacagcct gcagtgcacc aacgcgagca tcttcaaccc gaacaactct 7080

ggtaccatga tcgttggtcc ggtgctgtac tcttgcccgg cggcgagcct gccgtaactc 7140

gagcaccacc accaccacca ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag 7200

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<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

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<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

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<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ccaccaccac tgatgagatc cggct 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

cacgcagcat tatatctcct tctta 25

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

agcgagtcag tgagcgag 18

<210> 17

<211> 6861

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

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gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780

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tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900

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aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560

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<210> 18

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

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aactttaaga aggagatata atggctgcac taactccaga tttaacaact gctacaccca 1680

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ccaccaccga caacgaggaa aacaatgtct aacccactag ttctctttgc ccaccgtgac 7260

ccggtaaatg acgtgacgtt cgagtgcatt gagcacgcca cctacgacac actttcacac 7320

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tccaggcggc ttctagcggt gttggtgtta gcgttgatga atctctgcag attgttaaca 720

acaccctgga agttaaacca gatccgtctg gtccgctgac cgttagcgcg aacggtctcg 780

gcctgaaata tgacaccaac accctggcgg tgaccgcggg tgcactgacc gtggttggcg 840

gtggtagcgt ttccaccccg atcgccacct tcgtgtccgg tagcccgtct ctgaacacct 900

acaacgcaac caccgttaac tcttccgcta acgcgttctc ctgcgcgtac tacctgcagc 960

agtggaacat ccagggcctg ctggttacct ctctgtacct gaaactggac tccgcgacca 1020

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gcgcctacct gcagcagtgc aacccgtccg gtatccaggc gggtaccgtt agcccgagca 1140

ccgcaaccct gaccgacttc gaaccgatgg cgaaccgtag cgtgaccagc ccgtggacct 1200

actctgcaaa cggttactac gaaccgtcca tcggcgaatt ccaggttttc tctccggttg 1260

ttaccggcgc gtggaaccca ggtaacattg gtatccgtgt gctgccggtg ccggtgagcg 1320

cgagcggtga acgttacacc ctgctgtgct acagcctgca gtgcaccaac gcgagcatct 1380

tcaacccgaa caactctggt accatgatcg ttggtccggt gctgtactct tgcccggcgg 1440

cgagcctgcc gaagcttgcg gccgcactcg agcaccacca ccaccaccac tgatgagatc 1500

cggct 1505

<210> 20

<211> 6516

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

ccaccaccac tgatgagatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc 60

tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg 120

ttttttggac accatcgaat ggtgcaaaac ctttcgcggt atggcatgat agcgcccgga 180

agagagtcaa ttcagggtgg tgaatgtgaa accagtaacg ttatacgatg tcgcagagta 240

tgccggtgtc tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac caggccagcc acgtttctgc 300

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tgccattgct gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg ttatttcttg atgtctctga 660

ccagacaccc atcaacagta ttattttctc ccatgaagac ggtacgcgac tgggcgtgga 720

gcatctggtc gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta gcgggcccat taagttctgt 780

ctcggcgcgt ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc actcgcaatc aaattcagcc 840

gatagcggaa cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt tttcaacaaa ccatgcaaat 900

gctgaatgag ggcatcgttc ccactgcgat gctggttgcc aacgatcaga tggcgctggg 960

cgcaatgcgc gccattaccg agtccgggct gcgcgttggt gcggatatct cggtagtggg 1020

atacgacgat accgaagaca gctcatgtta tatcccgccg ttaaccacca tcaaacagga 1080

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gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccg 1200

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gcttcgacga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg agaaaaaaat cactggatat 1380

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gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta cggccttttt aaagaccgta 1500

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gctcatccgg agttccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg ggatagtgtt 1620

cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct ctggagtgaa 1680

taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc gtgttacggt 1740

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ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa cttcttcgcc 1860

cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat gccgctggcg 1920

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gactgcatgt gcatgcactg catgcagact aggtaaatat gagtatgtac gactagtaac 4020

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tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca 5040

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catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 5700

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cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 5820

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ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaaagagttt 5940

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tttatggcgg gcgtcctgcc cgccaccctc cgggccgttg cttcgcaacg ttcaaatccg 6060

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aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgatg cctggcagtt ccctactctc 6180

gcatggggag accccacact accatcggcg ctacggcgtt tcacttctga gttcggcatg 6240

gggtcaggtg ggaccaccgc gctactgccg ccaggcaaat tctgttttat cagaccgctt 6300

ctgcgttctg atttaatctg tatcaggctg aaaatcttct ctcatccgcc aaaacagcca 6360

agctgaattc gagctcggta cccggggatc ctctagagtc gacctgcagg catgcaagct 6420

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ttgtttaact ttaagaagga gatataatgc tgcgtg 6516

<210> 21

<211> 2389

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

agcgagtcag tgagcgagga agcaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 60

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 120

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 180

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 240

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 300

gaatgtattt agaaaaataa acaaaagagt ttgtagaaac gcaaaaaggc catccgtcag 360

gatggccttc tgcttaattt gatgcctggc agtttatggc gggcgtcctg cccgccaccc 420

tccgggccgt tgcttcgcaa cgttcaaatc cgctcccggc ggatttgtcc tactcaggag 480

agcgttcacc gacaaacaac agataaaacg aaaggcccag tctttcgact gagcctttcg 540

ttttatttga tgcctggcag ttccctactc tcgcatgggg agaccccaca ctaccatcgg 600

cgctacggcg tttcacttct gagttcggca tggggtcagg tgggaccacc gcgctactgc 660

cgccaggcaa attctgtttt atcagaccgc ttctgcgttc tgatttaatc tgtatcaggc 720

tgaaaatctt ctctcatccg ccaaaacagc caagctgaat tcgagctcgg tacccgggga 780

tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag ctttaatacg actcactata ggggaattgt 840

gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataat 900

gctgcgtgcg ccgaaacgcc gtcactctga aaacggtaaa ccggaaaccg aagcgggtcc 960

gtctccggcg ccgatcaaac gtgcgaaacg tatggtgcgc gcgtctcagc tggacctggt 1020

ttacccgttc gattacgtgg cggacccggt tggcggcctg aacccgccgt tcctgggtgg 1080

ctctggcccg ctggttgacc agggcggcca gctgaccctg aacgttaccg atccgatcat 1140

cattaaaaac cgttccgttg acctggctca cgatccgtct ctggatgtga acgcgcaggg 1200

ccagctggca gtggctgttg atccggaagg cgcgctggat atcaccccgg atggtctgga 1260

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tggtaccatg atcgttggtc cggtgctgta ctcttgcccg gcggcgagcc tgccgaagct 2340

tgcggccgca ctcgagcacc accaccacca ccactgatga gatccggct 2389

<210> 22

<211> 2714

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

tatgagttag tagctcgcac gggggtttgt cttgtctagg gactattaat ttttagtggt 60

gtttggtggc cgcctagctt ggctatgcgt gccagcttac ccgtactcaa tgttaaagat 120

ttgcatcgac atgggagggt tacgtgtccg atacctaggg ggggtatccg cgactaggtg 180

ccccggtgct cactgtctgt accggcgggg caagccccac accccgcatg gacagggtgg 240

ctccgccccc tgcaccccca gcaatctgca tgtacatgtt ttacacatta gcacgacatg 300

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ggagcactgc acataatgaa tgagttgcag gacaatgttt gctacgcatg cgcatgacat 420

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ctacaagaag ctcaacaggc actacaggcg cagcaagcgc aggcacaagc caccatcgaa 540

gcactagaag cgcaggcaaa ggctaagccc gtcgtggtca ccgcacgcgt tcctttggca 600

ctacgtgagg acatgaagcg cgcaggcatg cagaacggtg aaaacctcca agagttcatg 660

atcgccgcgt ttaccgagcg gctagaaaag ctcaccacca ccgacaacga ggaaaacaat 720

gtctaaccca ctagttctct ttgcccaccg tgacccggta aatgacgtga cgttcgagtg 780

cattgagcac gccacctacg acacactttc acacgctaaa gaccagatca ccgcccaaat 840

gcaagcccta gacgaagaag ccgccctact gccctaatgg gtgtttcatg ggtgtttccc 900

tagtgtttca tggtgttttc acctaagcta gggaattgcg cgagaagtct cgcaaaaatc 960

agcaaccccc ggaaccacac agttcacggg ggttcttcta tgccagaaat cagaaagggg 1020

aaccagtgaa cgaccccgaa tggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag 1080

ttcttcgccc accccaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 1140

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 1200

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 1260

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ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 1380

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 1440

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 1500

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acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 1620

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agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 1740

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 1800

agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 1860

cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 1920

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atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 2040

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 2100

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 2160

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 2220

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aaagagtttg 2280

tagaaacgca aaaaggccat ccgtcaggat ggccttctgc ttaatttgat gcctggcagt 2340

ttatggcggg cgtcctgccc gccaccctcc gggccgttgc ttcgcaacgt tcaaatccgc 2400

tcccggcgga tttgtcctac tcaggagagc gttcaccgac aaacaacaga taaaacgaaa 2460

ggcccagtct ttcgactgag cctttcgttt tatttgatgc ctggcagttc cctactctcg 2520

catggggaga ccccacacta ccatcggcgc tacggcgttt cacttctgag ttcggcatgg 2580

ggtcaggtgg gaccaccgcg ctactgccgc caggcaaatt ctgttttatc agaccgcttc 2640

tgcgttctga tttaatctgt atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacagccaa 2700

gctgaattcg agct 2714

<210> 23

<211> 5258

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagctttaat acgactcact 60

ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag 120

aaggagatat aatgctgcgt gcgccgaaac gccgtcactc tgaaaacggt aaaccggaaa 180

ccgaagcggg tccgtctccg gcgccgatca aacgtgcgaa acgtatggtg cgcgcgtctc 240

agctggacct ggtttacccg ttcgattacg tggcggaccc ggttggcggc ctgaacccgc 300

cgttcctggg tggctctggc ccgctggttg accagggcgg ccagctgacc ctgaacgtta 360

ccgatccgat catcattaaa aaccgttccg ttgacctggc tcacgatccg tctctggatg 420

tgaacgcgca gggccagctg gcagtggctg ttgatccgga aggcgcgctg gatatcaccc 480

cggatggtct ggatgttaaa gtggatggcg ttaccgtgat ggttaacgac gattgggaac 540

tggcggttaa agttgacccg tccggtggcc tggattctac cgcgggcggt ctgggtgtgt 600

ctgttgatga caccctgctg gttgatcagg gtgaactggg tgttcacctg aaccagcagg 660

gcccgatcac ggcggattct agcggcatcg acctggaaat caacccgaac atgttcaccg 720

tgaacacctc caccggttcc ggtgtgctgg aactgaacct gaaagcccag ggcggtatcc 780

aggcggcttc tagcggtgtt ggtgttagcg ttgatgaatc tctgcagatt gttaacaaca 840

ccctggaagt taaaccagat ccgtctggtc cgctgaccgt tagcgcgaac ggtctcggcc 900

tgaaatatga caccaacacc ctggcggtga ccgcgggtgc actgaccgtg gttggcggtg 960

gtagcgtttc caccccgatc gccaccttcg tgtccggtag cccgtctctg aacacctaca 1020

acgcaaccac cgttaactct tccgctaacg cgttctcctg cgcgtactac ctgcagcagt 1080

ggaacatcca gggcctgctg gttacctctc tgtacctgaa actggactcc gcgaccatgg 1140

gtaaccgtcc gggtgacctg aactctgcca acgcgaaatg gttcaccttc tgggttagcg 1200

cctacctgca gcagtgcaac ccgtccggta tccaggcggg taccgttagc ccgagcaccg 1260

caaccctgac cgacttcgaa ccgatggcga accgtagcgt gaccagcccg tggacctact 1320

ctgcaaacgg ttactacgaa ccgtccatcg gcgaattcca ggttttctct ccggttgtta 1380

ccggcgcgtg gaacccaggt aacattggta tccgtgtgct gccggtgccg gtgagcgcga 1440

gcggtgaacg ttacaccctg ctgtgctaca gcctgcagtg caccaacgcg agcatcttca 1500

acccgaacaa ctctggtacc atgatcgttg gtccggtgct gtactcttgc ccggcggcga 1560

gcctgccgaa gcttgcggcc gcactcgagc accaccacca ccaccactga tgagatccgg 1620

ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag 1680

cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttggacacc atcgaatggt 1740

gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga 1800

atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg 1860

tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag 1920

cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac 1980

agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg 2040

tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag 2100

aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca 2160

gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct 2220

gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta 2280

ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc 2340

agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg 2400

gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact 2460

ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca 2520

ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt 2580

ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct 2640

catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca 2700

cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg aagggcaatc agctgttgcc 2760

cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggcgccgggg atcagccccg gatgctttgg 2820

atacggtcta tgagctggca gcgtatttga ccgatccgga cacctgggat aatgtgtgga 2880

ttttgtcgga tcagcttgag taggacaaat ccgccgagct tcgacgagat tttcaggagc 2940

taaggaagct aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg 3000

gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac 3060

cgttcagctg gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta 3120

tccggccttt attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct catccggagt tccgtatggc 3180

aatgaaagac ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca 3240

tgagcaaact gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt 3300

tctacacata tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa 3360

agggtttatt gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt 3420

tgatttaaac gtggccaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata 3480

ttatacgcaa ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtctg 3540

tgatggcttc catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca 3600

gggcggggcg taattttttt aaggcagtta ttggtgccct tcgaaatgac cgaccaagcg 3660

acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc 3720

ttcggaatcg ttttccggga cgccaacaac aagacccatc atagtttgcc cccgcgacat 3780

tgaccataaa ttcatcgcac aaaatatcga acggggttta tgccgctttt agtgggtgcg 3840

aagaatagtc tgctcattac ccgcgaacac cgccgcattc agatcacgct tagtagcgtc 3900

cccatgagta ggcagaaccg cgtccaagtc cacatcatcc ataacgatca tgcacggggt 3960

ggaatccaca cccagacttg ccagcacctc attagcgaca cgttgcgcag cggccacgtc 4020

cttagcctta tccacgcaat cgagaacgta ctgcctaacc gcgaaatcag actgaatcag 4080

tttccaatca tcgggcttca ccaaagcaac agcaacgcgg gttgattcga cccgttccgg 4140

tgcttccaga ccggcgagct tgtacagttc ttcttccatt tcacgacgta catcagcgtc 4200

tatgtaatca atgcccaaag cacgcttagc cccacgtgac caggacgaac gcaggttttt 4260

agaaccaacc tcatactcac gccaccgagc caccaaaaca gcgtccatat cctcgccggc 4320

gtcgctttga tcggccaaca tatccaacat ctgaaacggc gtgtacgacc ccttagacgc 4380

ggttttagta gcggagccag tcagttcctg agacatgccc ttagcgaggt aggttgccat 4440

tttcgcagcg tctccacccc aggtagacac ctgatcaagt ttgaccccgt gctcacgcag 4500

tggcgcgtcc ataccggcct taaccacacc agcagaccag cgggaaaaca tggaatcctc 4560

aaacgccttg agttcatcgt cagacagtgg acgatccaag aacaacagca tgttgcggtg 4620

caagtgccaa ccgttcgccc aagagtctgt gacctcatag tcactatagg tgtgctccac 4680

cccgtaccgt gcacgttctt tcttccactg agatgttttc accatcgaag agtacgcagt 4740

cttaataccc gcttcaacct gcgcaaatga ctgtgagcgg ttgtgtcgaa cagtgcccac 4800

aaacatcatg agcgcgccac ccgccgccaa gtgattctta gtagcaatag ccagctcaat 4860

gcggcgttcg cccatgactt ccaattcagc cagaggtgac ccccagcgag agtgagagtt 4920

ttgcagaccc tcaaactgcg aagcaccgtt agacgaccag gacaccgcaa cagcttcgtc 4980

cctgcgccac ctatggcacc ccgccagagc cttactattg gtgatcttgt acatgacgtt 5040

ttgcctacgc cacgccctag cgcgagtgac cttagaaccc tcattgacct gcggttcctt 5100

agaggtgttc acttctattt cagtgttact cagtgttacc tagacccgat gttgtgcggg 5160

gttgcgcagt gcgagtttgt gcgggtgttg tgcccgttgt cttagctagt gctatggttg 5220

tcaattgaaa ccccttcggg ttatgtggcc cccgtgca 5258

Claims (9)

1.一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)以PXMJ19-T7-his-Fiber2为模板，TrxA-Fiber-2-F，TrxA-Fiber-2-R为引物扩增Fiber-2目的片段；

(2)以PET-32a-T7-TrxA-VP2为模板，PET-32a-T7-TrxA-F，PET-32a-T7-TrxA-R为引物扩增PET-32a-T7-TrxA载体片段；

(3)将Fiber-2目的片段和PET-32a-T7-TrxA载体片段进行同源重组，得到重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2；

(4)将重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2转化至Shuffle T7-B感受态细胞进行Fiber-2蛋白的表达；

所述引物序列分别如下：

TrxA-Fiber-2-F：CTGCCGTAACTCGAGCACCACCAC；

TrxA-Fiber-2-R：CTCGAGTTACGGCAGGCTCGCC；

PET-32a-T7-TrxA-F：CTGCCGTAACTCGAGCACCACCAC；

PET-32a-T7-TrxA-R：CGCAGCATGATATCAGCCATGGCCTTG；

所述PXMJ19-T7-his-Fiber2的核苷酸序列为SEQ ID NO:6；

所述PET-32a-T7-TrxA-VP2的核苷酸序列为SEQ ID NO:7；

所述PXMJ19-T7-his-Fiber2模板质粒通过如下方法制备得到：

(a)以PET-21a-GX-1-fiber2质粒为模板，Fiber-2-F，Fiber-2-R为引物进行扩增，得到Fiber-2目的片段；

(b)以PXMJ19-C1786T-hexon(T7)质粒为模板，PXMJ19-T7-his-F，PXMJ19-T7-his-R为引物进行扩增，得到PXMJ19-C1786T-T7载体片段；

(c)将Fiber-2目的片段和PXMJ19-C1786T-T7载体片段进行同源重组，得到重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2；

所述引物序列分别如下：

Fiber-2-F：AAGAAGGAGATATAATGCTGCGTGCGC；

Fiber-2-R：AGCCGGATCTCATCAGTGGTGGTGG；

PXMJ19-T7-his-F：CCACCACCACTGATGAGATCCGGCT；

PXMJ19-T7-his-R：CACGCAGCATTATATCTCCTTCTTA；

所述PET-21a-GX-1-fiber2质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO:17；

所述PXMJ19-C1786T-hexon(T7)质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO:18。

2.根据权利要求1所述的一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达的方法，其特征在于：步骤(1)所得Fiber-2目的片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

3.根据权利要求1所述的一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达的方法，其特征在于：步骤(2)所得PET-32a-T7-TrxA载体片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。

4.根据权利要求1所述的一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达的方法，其特征在于：步骤(3)中所述同源重组条件为：

将Fiber-2目的片段和PET-32a-T7-TrxA载体片段按体积比为1:1加入到反应液中，摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min，然后放置4℃或冰上冷却，得到重组产物。

5.根据权利要求1所述的一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达的方法，其特征在于：步骤(3)所得重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2的核苷酸序列为SEQ ID NO:11。

6.根据权利要求1所述的一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达的方法，其特征在于：所述将重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2转化至Shuffle T7-B感受态细胞的步骤为：取重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2加入到Shuffle T7-B感受态细胞混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min，加入SOC培养基，37℃及200-250rpm转速摇菌1h；将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热离心弃掉上清，用剩余培养基将菌体重悬，然后涂在有含氯霉素抗性的平板上，37℃培养箱中倒置培养12-16h。

7.根据权利要求6所述的一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达的方法，其特征在于所述Fiber-2蛋白的表达步骤为：挑取转化培养后的单菌落，接种到带氯霉素抗性的LB固体培养基中，30℃，200rpm震荡培养细菌至对数生长期，加入终浓度为1mM的IPTG，至摇床中16℃诱导15h。

8.根据权利要求1所述的一种构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达的方法，其特征在于：步骤(a)所得Fiber-2目的片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:19；步骤(b)所得PXMJ19-C1786T-T7载体片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:20。

9.权利要求1～8任一项表达蛋白的纯化方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将诱导表达后的菌体离心收集，加入无菌的PBS和EDTA，冰上超声波裂解，离心收集细菌裂解液；

(2)将细菌裂解液加入到平衡后的His标签蛋白纯化介质中进行纯化。

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